JPH0231697A - 被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物 - Google Patents
被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、試験試料中の所定濃度の被分析物の存在を測
定する分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
問題の濃度以上の被分析物の存在を予め選択した分光光
度の応答の出現、例えば発色によって示すような測定に
関する。したがって、このような測定は、対照又は標準
が不必要な自己表示型である。別の態様では、本発明は
、有意な被分析物濃度範囲にわたって指示薬応答の色の
分解の最適化を必要とする目視分析に関する。
定する分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
問題の濃度以上の被分析物の存在を予め選択した分光光
度の応答の出現、例えば発色によって示すような測定に
関する。したがって、このような測定は、対照又は標準
が不必要な自己表示型である。別の態様では、本発明は
、有意な被分析物濃度範囲にわたって指示薬応答の色の
分解の最適化を必要とする目視分析に関する。
問題の被分析物と適切な試薬／指示薬系との間の化学反
応によって生じる分光光度の応答に基づいて、液体試験
試料中の被分析物の濃度を測定する試験方法は、周知で
ある。分光光度の応答は、通常、機器で又は肉眼で測定
される変色である。
応によって生じる分光光度の応答に基づいて、液体試験
試料中の被分析物の濃度を測定する試験方法は、周知で
ある。分光光度の応答は、通常、機器で又は肉眼で測定
される変色である。
従来の試験は、既知濃度の被分析物によって生じる標準
的応答に対する試験応答の比較によって試料中の被分析
物の量又は濃度を定量する。また、比較を分光光度計を
用いて又はカラーチャートとの目視比較によって行うこ
とができる。
的応答に対する試験応答の比較によって試料中の被分析
物の量又は濃度を定量する。また、比較を分光光度計を
用いて又はカラーチャートとの目視比較によって行うこ
とができる。
試薬ストリップがこれらの分析方法を実施するだめの試
験具の共通の形態である。これらの試験具は、乾燥状態
で試薬／指示薬成分を混入した担体材料又はマトリック
ス、例えば濾紙、ポリマーフィルム等を結合する把手又
は支持手段を有する。
験具の共通の形態である。これらの試験具は、乾燥状態
で試薬／指示薬成分を混入した担体材料又はマトリック
ス、例えば濾紙、ポリマーフィルム等を結合する把手又
は支持手段を有する。
液体試験試料との接触は、試験組成物を再水和し、分析
反応を開始する。担体材料から発生する分光光度の応答
を、次に、標準と相関させて、試験する試料中の被分析
物の濃度を示す。
反応を開始する。担体材料から発生する分光光度の応答
を、次に、標準と相関させて、試験する試料中の被分析
物の濃度を示す。
これらの試験方法及び試験具は、液体試料中の物質の定
量又は定性的測定が重要である場合に種々の分野で有用
である。医学及び獣医学的目的の生物学的流体、食物及
び飲料、環境水及び廃水の試験が代表的である。試薬ス
） ＩＪツブは、糖尿病患者による血中グルコース濃度
の自己監視から診療室及び臨床実験室における常用の尿
代謝産物スクリーニング及び定量的血液化学分析まで、
医学的診断に有用な手段として特に良く知られている。
量又は定性的測定が重要である場合に種々の分野で有用
である。医学及び獣医学的目的の生物学的流体、食物及
び飲料、環境水及び廃水の試験が代表的である。試薬ス
） ＩＪツブは、糖尿病患者による血中グルコース濃度
の自己監視から診療室及び臨床実験室における常用の尿
代謝産物スクリーニング及び定量的血液化学分析まで、
医学的診断に有用な手段として特に良く知られている。
これらの従来方法及び試験具によって得られる試験結果
は、有用な分析手段として利用するのに充分に定量的で
あり、試薬ストリップの形状は、その簡単さ並びに貯蔵
及び使用の容易さから特に魅力的であるが、このような
試験の精度は標準と比較する必要によって制限される。
は、有用な分析手段として利用するのに充分に定量的で
あり、試薬ストリップの形状は、その簡単さ並びに貯蔵
及び使用の容易さから特に魅力的であるが、このような
試験の精度は標準と比較する必要によって制限される。
特に、応答が変色であり、比較を肉眼で行う場合には、
ヒトの目には色の僅かな差異を分解する能力に限りがあ
り、これが定量に不所望の誤差要因となりうる。
ヒトの目には色の僅かな差異を分解する能力に限りがあ
り、これが定量に不所望の誤差要因となりうる。
さらに、問題の被分析物濃度範囲にわたって指示薬反応
によって発生する色が色相において高度に飽和されてお
り、定量のための目視分解は最適レベルより著しく低く
なることがある。
によって発生する色が色相において高度に飽和されてお
り、定量のための目視分解は最適レベルより著しく低く
なることがある。
文献には、自己表示型の定量的試験システムを考案する
試みが多数ある。このシステムは、所定の被分析物濃度
で比較的に明白なイエス／ノ一応答又は表示を生じる試
験システムを意味する。したがって、プログラムした指
示薬応答、例えば発色の目視検出が観察される場合、被
分析物が所定濃度以上で存在することが示される。自己
表示の原理は周知であるが、従来は、実際に自己表示型
であるのに充分に明白なイエス／ノ一応答を生じる試験
システムを創成する実際的アプローチに欠けている。
試みが多数ある。このシステムは、所定の被分析物濃度
で比較的に明白なイエス／ノ一応答又は表示を生じる試
験システムを意味する。したがって、プログラムした指
示薬応答、例えば発色の目視検出が観察される場合、被
分析物が所定濃度以上で存在することが示される。自己
表示の原理は周知であるが、従来は、実際に自己表示型
であるのに充分に明白なイエス／ノ一応答を生じる試験
システムを創成する実際的アプローチに欠けている。
自己表示型試験システムを作製する極めて早期のアプロ
ーチでは、指示薬に作用して所定の被分析物濃度以下で
発色を防止する拮抗物質を組成物中に使用した（米国特
許第２．８９３．８４４号明細書）。
ーチでは、指示薬に作用して所定の被分析物濃度以下で
発色を防止する拮抗物質を組成物中に使用した（米国特
許第２．８９３．８４４号明細書）。
拮抗物質と反応しやすい指示薬は、試料中の多数の非特
異性環境因子、例えば妨害物質によっても影響されるで
あろう。したがって、このようなシステムは、定量試験
としては充分には信頼性を有しない。他の早期のアプロ
ーチは、試験組成物中の指示薬の量を制限する原理を使
用する（米国特許第３，００６，７３５号明細書）か又
は半透膜によって試験組成物に到達する被分析物の量を
物理的に制限する原理を使用した（米国特許第３，７２
３，０６４号明細書）。
異性環境因子、例えば妨害物質によっても影響されるで
あろう。したがって、このようなシステムは、定量試験
としては充分には信頼性を有しない。他の早期のアプロ
ーチは、試験組成物中の指示薬の量を制限する原理を使
用する（米国特許第３，００６，７３５号明細書）か又
は半透膜によって試験組成物に到達する被分析物の量を
物理的に制限する原理を使用した（米国特許第３，７２
３，０６４号明細書）。
さらに最近になって、多数の異なるアプローチが示唆さ
れた。米国特許第３，９６４，８７１号、同第４．０４
２，３２９号及び同第４，０５９，４０７号明細書は、
異なる濃度の被分析物に対して検出可能な応答を与える
ために複数の試験領域を配列した自己表示型試験具が望
ましいことを強調している。しかしながら、自己表示型
応答を達成するため提示された反応図は、著しい欠点を
有する。提案された主な反応図は、試料の妨害物質の問
題を起こす指示薬拮抗物質又は滴定物質を従来公知のと
おりに使用することに基づくものである。指示薬は、環
境因子に対して益々安定な化合物に向かって発展してき
た。その結果、現在好ましいとされている指示薬は、上
記の文献に提案されたような拮抗化合物によってはほと
んど滴定できない。提案されている別のアプローチは、
被分析物を錯体化して指示薬系との反応を防止すること
である。提案された系は、被分析物に対して比較的に非
特異的であり、あるものは可逆的な錯体を形成し、ある
ものは不所望の沈殿物を生じる。また、データはなく、
系は全く精製されていない。
れた。米国特許第３，９６４，８７１号、同第４．０４
２，３２９号及び同第４，０５９，４０７号明細書は、
異なる濃度の被分析物に対して検出可能な応答を与える
ために複数の試験領域を配列した自己表示型試験具が望
ましいことを強調している。しかしながら、自己表示型
応答を達成するため提示された反応図は、著しい欠点を
有する。提案された主な反応図は、試料の妨害物質の問
題を起こす指示薬拮抗物質又は滴定物質を従来公知のと
おりに使用することに基づくものである。指示薬は、環
境因子に対して益々安定な化合物に向かって発展してき
た。その結果、現在好ましいとされている指示薬は、上
記の文献に提案されたような拮抗化合物によってはほと
んど滴定できない。提案されている別のアプローチは、
被分析物を錯体化して指示薬系との反応を防止すること
である。提案された系は、被分析物に対して比較的に非
特異的であり、あるものは可逆的な錯体を形成し、ある
ものは不所望の沈殿物を生じる。また、データはなく、
系は全く精製されていない。
さらに最近、米国特許第４，２３４，３１３号明細書に
は、被分析物と反応すると、有色から無色に移行する指
示薬の使用が提案されている。このアプローチは、検出
可能な変色が起こるには指示薬の完全な消費が必要であ
るため、限定された量の指示薬の使用を要するという主
要な欠点を有する。その結果、指示薬の反応速度は遅い
。さらに、無色の結果が陽性の結果を示すことは、実験
室において典型的技術者の慣習とは逆である。
は、被分析物と反応すると、有色から無色に移行する指
示薬の使用が提案されている。このアプローチは、検出
可能な変色が起こるには指示薬の完全な消費が必要であ
るため、限定された量の指示薬の使用を要するという主
要な欠点を有する。その結果、指示薬の反応速度は遅い
。さらに、無色の結果が陽性の結果を示すことは、実験
室において典型的技術者の慣習とは逆である。
米国特許第４，６５４，３１０号明細書は、Ｉ旨示薬反
応とは競合的であって、種々の濃度の被分析物で指示薬
応答の速度を有効に減少させる非応答性反応の使用を提
案している。この文献は、指示薬反応から競合的量の被
分析物を有効に除去するため、触媒で制御される二次反
応の使用を教示している。
応とは競合的であって、種々の濃度の被分析物で指示薬
応答の速度を有効に減少させる非応答性反応の使用を提
案している。この文献は、指示薬反応から競合的量の被
分析物を有効に除去するため、触媒で制御される二次反
応の使用を教示している。
触媒量が変動し、応答、例えば色を生じる指示薬反応の
能力が存在する被分析物の量に左右される程度に過剰量
の二次反応の反応体を使用して数個の試験領域を提供す
る。このアプローチの最も顕著な制限は、指示薬及び二
次反応が被分析物に対して速度論的に競合するので、指
示薬応答曲線の勾配が、被分析物の全ての濃度で指示薬
応答を区別する能力に対する有害な影響により低下する
。
能力が存在する被分析物の量に左右される程度に過剰量
の二次反応の反応体を使用して数個の試験領域を提供す
る。このアプローチの最も顕著な制限は、指示薬及び二
次反応が被分析物に対して速度論的に競合するので、指
示薬応答曲線の勾配が、被分析物の全ての濃度で指示薬
応答を区別する能力に対する有害な影響により低下する
。
したがって、試験試料中の妨害物質に対して抵抗性であ
り、安定で、本質的に不可逆的な指示薬応答を生じ、か
つ分解能を犠牲にしない自己表示型試験システムが引き
続いて求められている。
り、安定で、本質的に不可逆的な指示薬応答を生じ、か
つ分解能を犠牲にしない自己表示型試験システムが引き
続いて求められている。
さらに、試薬ストリップ試験具の制限は、分析的に有意
な被分析物濃度の全範囲にわたって均一に良好な機器又
は目視分解を一般的に欠くことである。濃度範囲の下限
での分解は、しばしば全く良好であるが、範囲の上限で
の機器又は目視による定量は悪化する。この現象の共通
の原因は、高濃度の被分析物における指示薬応答、例え
ば色の過飽和である。
な被分析物濃度の全範囲にわたって均一に良好な機器又
は目視分解を一般的に欠くことである。濃度範囲の下限
での分解は、しばしば全く良好であるが、範囲の上限で
の機器又は目視による定量は悪化する。この現象の共通
の原因は、高濃度の被分析物における指示薬応答、例え
ば色の過飽和である。
したがって、さらに、問題の被分析物濃度範囲内で指示
薬応答の最適な分解を行うように調節することのできる
、肉眼で評価するか又は機器で読み取る試験システムが
求められている。
薬応答の最適な分解を行うように調節することのできる
、肉眼で評価するか又は機器で読み取る試験システムが
求められている。
発明の概要
本発明は、極めて有利な自己表示型試験システムを提供
し、所望の被分析物濃度範囲内で最適な色の分解を生じ
るように比色試験システムを調節する手段を提供するも
のである。これらの特質は、指示薬反応を実施する前に
化学量論的な被分析物特異性Ｍ１反応を有効に実施する
ことにより生じるものである。試験試料中の被分析物の
所定量の消費を制御して、所定の指示薬応答を生じる被
分析物濃度を予め選択して自己表示特性を生じうるよう
に指示薬応答曲線を移動させる。また、応答曲線の移動
、特に目視評価指示薬反応の応答曲線の移動を使用して
所望の被分析物濃度範囲内での指示薬の応答の分解を最
適にすることができる。
し、所望の被分析物濃度範囲内で最適な色の分解を生じ
るように比色試験システムを調節する手段を提供するも
のである。これらの特質は、指示薬反応を実施する前に
化学量論的な被分析物特異性Ｍ１反応を有効に実施する
ことにより生じるものである。試験試料中の被分析物の
所定量の消費を制御して、所定の指示薬応答を生じる被
分析物濃度を予め選択して自己表示特性を生じうるよう
に指示薬応答曲線を移動させる。また、応答曲線の移動
、特に目視評価指示薬反応の応答曲線の移動を使用して
所望の被分析物濃度範囲内での指示薬の応答の分解を最
適にすることができる。
本質的に指示薬反応が起こる前に反応系から被分析物を
差し引くことによって、指示薬応答によって検出可能な
被分析物の量を有効に減少することができる。？：ｌ１
ｉｔ反応を制御して反応混合物中の被分析物の所定量を
消費させる場合に、その点で特定レベルの応答、例えば
発色を制御することができる。減量反応の制御は、反応
混合物中の被分析物に対して特異的で、調節共反応体、
例えば減量反応において被分析物と共に消費される補助
基質が関係する酵素反応又は反応列を使用する。ことに
よって達成される。反応混合物中に存在する共反応体の
初期量を、被分析物の所望量の消費に化学量論的に充分
であるように選択する。
差し引くことによって、指示薬応答によって検出可能な
被分析物の量を有効に減少することができる。？：ｌ１
ｉｔ反応を制御して反応混合物中の被分析物の所定量を
消費させる場合に、その点で特定レベルの応答、例えば
発色を制御することができる。減量反応の制御は、反応
混合物中の被分析物に対して特異的で、調節共反応体、
例えば減量反応において被分析物と共に消費される補助
基質が関係する酵素反応又は反応列を使用する。ことに
よって達成される。反応混合物中に存在する共反応体の
初期量を、被分析物の所望量の消費に化学量論的に充分
であるように選択する。
実質的な指示薬反応の前に被分析物を化学量論的に差し
引くことは、減量後に残る被分析物の量に対する指示薬
応答に影響しないという主要な利点を有する。したがっ
て、指示薬応答曲線の勾配は、その曲線自体が所定の被
分析物濃度で移動しはじめても変化しない。勾配が変化
しないので、自己表示システムにおける閾値レベルで又
は、例えば、目視評価システムにおける被分析物濃度の
全範囲での応答の分解を、使用する指示薬系に対して最
適レベルに維持することができる。従来のアプローチは
、いずれもこの特長を提示していない。
引くことは、減量後に残る被分析物の量に対する指示薬
応答に影響しないという主要な利点を有する。したがっ
て、指示薬応答曲線の勾配は、その曲線自体が所定の被
分析物濃度で移動しはじめても変化しない。勾配が変化
しないので、自己表示システムにおける閾値レベルで又
は、例えば、目視評価システムにおける被分析物濃度の
全範囲での応答の分解を、使用する指示薬系に対して最
適レベルに維持することができる。従来のアプローチは
、いずれもこの特長を提示していない。
被分析物は、それ自体が分析上興味のある物質又は−次
反応で興味ある主要物質の反応によって形成される中間
生成物であってもよい。本明細書に使用する場合、被分
析物とは、減量及び指示薬反応が作用する物質であり、
実際の試験システムにおいてしばしば分析上、興味ある
主物質ではなく、むしろ中間生成物、例えば多数の有用
な指示薬反応及び減量反応に関与する酵素基質又は補助
因子、例えばＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ，グリセリン、ＡＴ
Ｐ又は過酸化水素である。
反応で興味ある主要物質の反応によって形成される中間
生成物であってもよい。本明細書に使用する場合、被分
析物とは、減量及び指示薬反応が作用する物質であり、
実際の試験システムにおいてしばしば分析上、興味ある
主物質ではなく、むしろ中間生成物、例えば多数の有用
な指示薬反応及び減量反応に関与する酵素基質又は補助
因子、例えばＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ，グリセリン、ＡＴ
Ｐ又は過酸化水素である。
化学量論的減量反応を使用することから多数の利点が生
じる。
じる。
１、化学量論的：／ｌｉ量は、最適分解範囲の程度、す
なわちその位置を変更しない。したがって、怒度（用量
応答曲線の勾配）は、速度論的分配の場合と同様に変動
しない。これにより生じる試薬性能では、系の最適分解
範囲が、系に加えた減量試薬の量に直接依存する漸進的
に増加する被分析物濃度に不連続約２、騰で移動する。
なわちその位置を変更しない。したがって、怒度（用量
応答曲線の勾配）は、速度論的分配の場合と同様に変動
しない。これにより生じる試薬性能では、系の最適分解
範囲が、系に加えた減量試薬の量に直接依存する漸進的
に増加する被分析物濃度に不連続約２、騰で移動する。
この方法で示される試験システムは、それぞれ、基本的
指示薬応答化学が許す有用な範囲だけを有する試験列、
例えば多数の試薬ストリップバッド又はキュベツトを含
む。パッド又はキュベツトの総合システムだけが延長さ
れた範囲を有する。
指示薬応答化学が許す有用な範囲だけを有する試験列、
例えば多数の試薬ストリップバッド又はキュベツトを含
む。パッド又はキュベツトの総合システムだけが延長さ
れた範囲を有する。
２、 自己表示試験（゛′イエスーノー°”試験）に使
用されるような“悉無“表示は、極めて鮮明であること
を示すことができる。この場合に、最適分解範囲は、例
えば、極めて高い分子吸光係数を有する指示薬を用いる
ことによって起こるように極めて狭いであろう。したが
って、被分析物の所定の閾値レベルを超えたことを測定
するために、極めて僅かな判断を必要とするにすぎない
であろう。
用されるような“悉無“表示は、極めて鮮明であること
を示すことができる。この場合に、最適分解範囲は、例
えば、極めて高い分子吸光係数を有する指示薬を用いる
ことによって起こるように極めて狭いであろう。したが
って、被分析物の所定の閾値レベルを超えたことを測定
するために、極めて僅かな判断を必要とするにすぎない
であろう。
３、本明細書に記載するような化学的減量の酵素的性質
は、単純な化学的錯体形成図よりはるかに優れている特
異性を与える。したがって、他の場合に起こるより妨害
の起こるのが少ないことが予測され、試験システムの信
頼性及び精度が一般的に改良されるであろう。
は、単純な化学的錯体形成図よりはるかに優れている特
異性を与える。したがって、他の場合に起こるより妨害
の起こるのが少ないことが予測され、試験システムの信
頼性及び精度が一般的に改良されるであろう。
４、 本明細書に記載するように化学的減量が化学量論
的であるので、温度の変動はシステムに極めて少ししか
影響しないであろう。二つの競合反応の間の速度論的分
配によるＭｌは、単に速度の相違に基づくものであるか
ら、再現性であるには、極めて注意深（制御された条件
を必要とする。温度の変動は、交互の通路に流す被分析
物又は被分析物の均等物の割合を変動すると予測される
。したがって、速度論的分配は、化学量論的減量はど本
来的に信頼性のあるものではない。
的であるので、温度の変動はシステムに極めて少ししか
影響しないであろう。二つの競合反応の間の速度論的分
配によるＭｌは、単に速度の相違に基づくものであるか
ら、再現性であるには、極めて注意深（制御された条件
を必要とする。温度の変動は、交互の通路に流す被分析
物又は被分析物の均等物の割合を変動すると予測される
。したがって、速度論的分配は、化学量論的減量はど本
来的に信頼性のあるものではない。
好ましい実施態様の説明
本発明が作用する原理は、第１図〜第３図を参照して最
も良く理解することができる。これらの図面は、指示薬
応答曲線を説明するグラフである。
も良く理解することができる。これらの図面は、指示薬
応答曲線を説明するグラフである。
自己表示の原理
第１図において、被分析物濃度の増加に対する標準指示
薬応答を上向き勾配を有する破線Ｘ１として示す。説明
の目的で、指示薬応答は変色とする。指示薬応答のＲ１
レベルは検出可能性の閾値レベル、例えば発色を肉眼で
検出しうる点である。
薬応答を上向き勾配を有する破線Ｘ１として示す。説明
の目的で、指示薬応答は変色とする。指示薬応答のＲ１
レベルは検出可能性の閾値レベル、例えば発色を肉眼で
検出しうる点である。
Ｃ１の試験試料中の被分析物濃度は、この閾値指示薬応
答を生じる。標準指示薬応答線を使用すると、Ｃ２及び
Ｃ３の被分析物濃度を定量する能力は、色Ｒ２及びＲ１
を正確に区別する目の能力に左右される。Ｒ２及びＲ３
の応答が、飽和された色応答のためにほとんど区別でき
ない場合には、被分析物濃度Ｃ２及びＣ３の分解は極め
て誤差を起こしやすくなる。
答を生じる。標準指示薬応答線を使用すると、Ｃ２及び
Ｃ３の被分析物濃度を定量する能力は、色Ｒ２及びＲ１
を正確に区別する目の能力に左右される。Ｒ２及びＲ３
の応答が、飽和された色応答のためにほとんど区別でき
ない場合には、被分析物濃度Ｃ２及びＣ３の分解は極め
て誤差を起こしやすくなる。
上向き勾配を有する実線Ｙ１及びＺｌは、本発明により
２つの異なる減量反応によって移動された指示薬応答線
を示す。これらの応答線は、減量反応に被分析物のＮｃ
ｚ’及び０３′が消費されたことから生じる。減量反応
の結果として、Ｃ２及びＣ３は、それぞれＲ１閾値指示
薬応答を得るのに必要な試料中の被分析物の里となる。
２つの異なる減量反応によって移動された指示薬応答線
を示す。これらの応答線は、減量反応に被分析物のＮｃ
ｚ’及び０３′が消費されたことから生じる。減量反応
の結果として、Ｃ２及びＣ３は、それぞれＲ１閾値指示
薬応答を得るのに必要な試料中の被分析物の里となる。
したがって、移動した指示薬応答線Ｙ１を使用して、発
色の観察は、試験試料中に被分析物がＣ２以上の濃度で
存在することを意味する。応答線ＺＩ及び被分析物濃度
Ｃ３についても同様の関係がある。
色の観察は、試験試料中に被分析物がＣ２以上の濃度で
存在することを意味する。応答線ＺＩ及び被分析物濃度
Ｃ３についても同様の関係がある。
指示薬応答線Ｙ、及びＺｌを用いて別個の分析（被分析
物の量Ｃ２′及びＣ３°を減量する別々の反応を行うこ
とによって達成される）を行い、単に発色の有無を観察
する（イエス／ノー観察）場合には、濃度レベルＣ２及
びＣ３を容易に区別することができる。これは、標準指
示薬応答線ｘＩを使用し、色Ｒ２及びＲ３を分解するこ
とを試みて可能な低い分解能とは対照的である。さらに
、最高の分解能は閾値検出レベルにある（目は色の異な
る色相を区別するより発色をより良く分解することがで
きる）。この検出レベルＲ１が、選択した全被分析物濃
度（例えばＣ２及びＣ１）での減量−移動指示薬応答線
を用いる定量の基礎であるから、本発明の自己表示型試
験システムは、選択した指示薬系を使用する最高の精度
を有する。
物の量Ｃ２′及びＣ３°を減量する別々の反応を行うこ
とによって達成される）を行い、単に発色の有無を観察
する（イエス／ノー観察）場合には、濃度レベルＣ２及
びＣ３を容易に区別することができる。これは、標準指
示薬応答線ｘＩを使用し、色Ｒ２及びＲ３を分解するこ
とを試みて可能な低い分解能とは対照的である。さらに
、最高の分解能は閾値検出レベルにある（目は色の異な
る色相を区別するより発色をより良く分解することがで
きる）。この検出レベルＲ１が、選択した全被分析物濃
度（例えばＣ２及びＣ１）での減量−移動指示薬応答線
を用いる定量の基礎であるから、本発明の自己表示型試
験システムは、選択した指示薬系を使用する最高の精度
を有する。
改良された分解の原理
本発明は、自己表示手段を備えると共に、さらに一つの
指示薬反応を用いて被分析物濃度範囲にわたって定量を
改善する手段を提供するものである。
指示薬反応を用いて被分析物濃度範囲にわたって定量を
改善する手段を提供するものである。
第２図には、被分析物の濃度の増加に対する標準指示薬
応答線を上向きの勾配を有する破線ｘ２として示す。標
準指示薬応答が、レベルＲ４及びＲ２でほとんど飽和さ
れた色を生じる場合、被分析物濃度Ｃ４及びＣ２は区別
困難であるか又は区別不可能でさえある。このような最
適以下の濃度又は被分析物濃度範囲０４〜Ｃ３内で分解
能を生じない指示薬応答を、本発明により、問題のこの
濃度範囲にわたって最適分解能を提供するように調節す
ることができる。試料中の被分析物のＣ４＋量を消費す
る化学量論的減量反応を実施することによって、応答曲
線は実線Ｙ２に移動して、問題の被分析物濃度範囲０４
〜Ｃ５にわたってＲ５からＲ７への指示薬応答を生じる
。指示薬応答のＲ６−Ｒ７の範囲は、変色の最適分解領
域を示す。本発明によれば、被分析物の量Ｃ４’ を控
除することによってこのような最適分解能の利点が得ら
れるように指示薬応答を移動させる。
応答線を上向きの勾配を有する破線ｘ２として示す。標
準指示薬応答が、レベルＲ４及びＲ２でほとんど飽和さ
れた色を生じる場合、被分析物濃度Ｃ４及びＣ２は区別
困難であるか又は区別不可能でさえある。このような最
適以下の濃度又は被分析物濃度範囲０４〜Ｃ３内で分解
能を生じない指示薬応答を、本発明により、問題のこの
濃度範囲にわたって最適分解能を提供するように調節す
ることができる。試料中の被分析物のＣ４＋量を消費す
る化学量論的減量反応を実施することによって、応答曲
線は実線Ｙ２に移動して、問題の被分析物濃度範囲０４
〜Ｃ５にわたってＲ５からＲ７への指示薬応答を生じる
。指示薬応答のＲ６−Ｒ７の範囲は、変色の最適分解領
域を示す。本発明によれば、被分析物の量Ｃ４’ を控
除することによってこのような最適分解能の利点が得ら
れるように指示薬応答を移動させる。
従来法との比較
第３図は、米国特許筒４，６５４，３１０号明細書に教
示されている自己表示に関する反応速度競合法を示す。
示されている自己表示に関する反応速度競合法を示す。
指示薬系の標準応答を線Ｘ３として示す。
種々の量の触媒及び過剰量の二次反応体を添加すること
によって別々の反応混合物中で競合的二次反応を起こさ
せて、指示薬反応の間に被分析物の消費を進行させる。
によって別々の反応混合物中で競合的二次反応を起こさ
せて、指示薬反応の間に被分析物の消費を進行させる。
競合的反応により非反応性生成物が生じ、これが指示薬
応答の勾配を低下させる。指示薬応答線Ｙ３及びＺ３は
、指示薬反応混合物中の触媒の２種の異なるレベルの存
在から生じる応答を示す。その結果、被分析物が濃度Ｃ
６で存在すると、指示薬応答線Ｘ３を示す反応において
は閾値発色Ｒ１１だけを示すので、自己表示システムが
得られる。同様に、被分析物が濃度Ｃ７で存在する場合
には、反応Ｘ３及びＹ３（しかし、Ｚ、ではない）で色
が見られる。最後に、被分析物濃度ＣＩ＋は三つの反応
系すべてにおいて発色を生じる。しかしながら、容易に
見られる問題は、Ｚ３反応系における閾値指示薬応答Ｒ
３の出現の測定は、指示薬応答の勾配が低下するので、
誤差を増加することである。応答Ｒ３の出現の検出にお
ける僅かな誤差は、定量における大きい誤差を生じる。
応答の勾配を低下させる。指示薬応答線Ｙ３及びＺ３は
、指示薬反応混合物中の触媒の２種の異なるレベルの存
在から生じる応答を示す。その結果、被分析物が濃度Ｃ
６で存在すると、指示薬応答線Ｘ３を示す反応において
は閾値発色Ｒ１１だけを示すので、自己表示システムが
得られる。同様に、被分析物が濃度Ｃ７で存在する場合
には、反応Ｘ３及びＹ３（しかし、Ｚ、ではない）で色
が見られる。最後に、被分析物濃度ＣＩ＋は三つの反応
系すべてにおいて発色を生じる。しかしながら、容易に
見られる問題は、Ｚ３反応系における閾値指示薬応答Ｒ
３の出現の測定は、指示薬応答の勾配が低下するので、
誤差を増加することである。応答Ｒ３の出現の検出にお
ける僅かな誤差は、定量における大きい誤差を生じる。
Ｒ３の領域における被分析物濃度範囲が広いと、はとん
ど区別できない指示薬応答を生じる。第１図と比較する
と、本発明は、高い被分析物濃度、例えばＣ３でさえ、
標準指示薬応答の分解能を維持する。
ど区別できない指示薬応答を生じる。第１図と比較する
と、本発明は、高い被分析物濃度、例えばＣ３でさえ、
標準指示薬応答の分解能を維持する。
減量反応
本発明の化学量論的減量反応は、例えば指示薬反応の実
施によって指示薬の応答を測定する前に試験試料中の被
分析物の所定量を消費するものである。酵素で触媒され
、被分析物と共反応体の少なくとも１種を含む反応の使
用によって被分析物の消費を制御し、支持する。このよ
うな共反応体は、消費される被分析物の量が存在する共
反応体の量に左右され、減量反応における被分析物に対
する化学量論的関係に左右されるので、本明細書におい
ては調節共反応体と言う。減量反応は、ただ一つの酵素
反応又はその少なくとも一つが酵素反応である反応列で
あってよく、好ましくは最初の反応が被分析物に作用し
、その反応のうちの一つで反応体が調節共反応体として
作用することができる。
施によって指示薬の応答を測定する前に試験試料中の被
分析物の所定量を消費するものである。酵素で触媒され
、被分析物と共反応体の少なくとも１種を含む反応の使
用によって被分析物の消費を制御し、支持する。このよ
うな共反応体は、消費される被分析物の量が存在する共
反応体の量に左右され、減量反応における被分析物に対
する化学量論的関係に左右されるので、本明細書におい
ては調節共反応体と言う。減量反応は、ただ一つの酵素
反応又はその少なくとも一つが酵素反応である反応列で
あってよく、好ましくは最初の反応が被分析物に作用し
、その反応のうちの一つで反応体が調節共反応体として
作用することができる。
減量反応は、減量反応が開始したときに存在し、その後
に完全に消費される共反応体の量と化学量論的に同等な
被分析物の量を消費する。したがって、最も簡単に言え
ば、本発明は下記の説明図で示すことができる： 分析的に重要な物質 検出可能な指示薬応答 減量反応の特徴 本発明の減量反応の主な特徴は、指示薬応答を測定する
前又は指示薬反応を実施する前に減量反応が実質的に完
了していることである。この方法では、被分析物の減量
は、化学量論的であり、速度論ではなく、したがって、
指示薬応答の勾配は本質的に影響されない。顕著な指示
薬応答が起こる前に完了するようにＮｆｆ１反応を実施
する方法が多数あることは明らかである。
に完全に消費される共反応体の量と化学量論的に同等な
被分析物の量を消費する。したがって、最も簡単に言え
ば、本発明は下記の説明図で示すことができる： 分析的に重要な物質 検出可能な指示薬応答 減量反応の特徴 本発明の減量反応の主な特徴は、指示薬応答を測定する
前又は指示薬反応を実施する前に減量反応が実質的に完
了していることである。この方法では、被分析物の減量
は、化学量論的であり、速度論ではなく、したがって、
指示薬応答の勾配は本質的に影響されない。顕著な指示
薬応答が起こる前に完了するようにＮｆｆ１反応を実施
する方法が多数あることは明らかである。
一つのアプローチは、指示薬反応の試薬の１種以上又は
全部の不存在でｉ％ＸＩ反応を実施することである。減
量反応が完了したら、不足の指示薬試薬を添加して指示
薬反応を開始させる。１種以上の指示薬試薬が指示薬反
応において不活性な変性された形で存在する場合、指示
薬反応の試薬の全部を存在させて減量反応を実施するこ
とによって同じ効果を得ることができる。１ｌｆｆｔ反
応が完了したら、変性された指示薬試薬を適切に活性形
に変換させて指示薬反応を開始させる。この目的で指示
薬試薬を不活性にする変性は、マイクロカプセル化、化
学的誘導体化又は錯体形成及び従来公知の同様の技法を
包含する。
全部の不存在でｉ％ＸＩ反応を実施することである。減
量反応が完了したら、不足の指示薬試薬を添加して指示
薬反応を開始させる。１種以上の指示薬試薬が指示薬反
応において不活性な変性された形で存在する場合、指示
薬反応の試薬の全部を存在させて減量反応を実施するこ
とによって同じ効果を得ることができる。１ｌｆｆｔ反
応が完了したら、変性された指示薬試薬を適切に活性形
に変換させて指示薬反応を開始させる。この目的で指示
薬試薬を不活性にする変性は、マイクロカプセル化、化
学的誘導体化又は錯体形成及び従来公知の同様の技法を
包含する。
通常、減量反応の実施と同時に反応混合物中にすべての
指示薬試薬が完全に活性な形で存在するのが好ましい。
指示薬試薬が完全に活性な形で存在するのが好ましい。
本発明の目的は、この場合、指示薬反応が相当程度まで
進行する前に本質的に完了しているのに充分に迅速な減
量反応を使用することによって達成される。減量反応は
酵素で触媒されるので、生じる減量反応が指示薬反応に
比べて極めて速くなるように充分に高い回転率及び／又
は反応混合物中で容易に超えられるに、を有する酵素に
基づいて酵素反応図を選択する。酵素で触媒される減量
反応における共反応体は、Ｋ、より過剰、通常Ｋ。の２
倍以上、好ましくはに４の５倍以上で存在し、及び／又
は存在する触媒量は、迅速な反応速度を生じるのに充分
に高いレベルである。
進行する前に本質的に完了しているのに充分に迅速な減
量反応を使用することによって達成される。減量反応は
酵素で触媒されるので、生じる減量反応が指示薬反応に
比べて極めて速くなるように充分に高い回転率及び／又
は反応混合物中で容易に超えられるに、を有する酵素に
基づいて酵素反応図を選択する。酵素で触媒される減量
反応における共反応体は、Ｋ、より過剰、通常Ｋ。の２
倍以上、好ましくはに４の５倍以上で存在し、及び／又
は存在する触媒量は、迅速な反応速度を生じるのに充分
に高いレベルである。
さらに、減量反応を実施する反応混合物中で被分析物に
対して有効に特異的であることが、減量反応の主な特徴
である。減量反応が特異的であることから、被分析物の
化学量論的減量が著しい試料妨害を起こさないことが確
保される。この方法で、減量反応によって消費される被
分析物の量は、存在する調節共反応体の量によって定量
的かつ再現可能に制御される。
対して有効に特異的であることが、減量反応の主な特徴
である。減量反応が特異的であることから、被分析物の
化学量論的減量が著しい試料妨害を起こさないことが確
保される。この方法で、減量反応によって消費される被
分析物の量は、存在する調節共反応体の量によって定量
的かつ再現可能に制御される。
減量反応の特異性は、このような反応を触媒する酵素の
特異性によって本質的に説明される。この点で、本発明
に必要な特異性は、性質において他のすべての物質に対
する絶対的特異性ではなく、むしろ反応混合物に存在す
る他の物質に対する特異性であることを理解すべきであ
る。被分析物は、本質的には、反応混合物中の、共反応
体との酵素反応によって消費されうる唯一の物質である
ことだけが必要である。したがって、Ｍ１反応として選
択される酵素反応は、試料中に通常存在する他の物質又
は反応のための被分析物と実質的に競合しうる他の分析
試薬が存在しないことを尽準として選択される。
特異性によって本質的に説明される。この点で、本発明
に必要な特異性は、性質において他のすべての物質に対
する絶対的特異性ではなく、むしろ反応混合物に存在す
る他の物質に対する特異性であることを理解すべきであ
る。被分析物は、本質的には、反応混合物中の、共反応
体との酵素反応によって消費されうる唯一の物質である
ことだけが必要である。したがって、Ｍ１反応として選
択される酵素反応は、試料中に通常存在する他の物質又
は反応のための被分析物と実質的に競合しうる他の分析
試薬が存在しないことを尽準として選択される。
減量反応の別の特徴は、被分析物に作用するが、指示薬
反応生成物には作用しないことである。被分析物とは、
減量反応及び指示薬反応の両方に共通の反応体として作
用する物質と理解される。し７たがって、若干の場合に
は、被分析物は分析において現実に分析上興味のある物
質ではなく、むしろ最終的に測定すべき物質と一次反応
によって形成される中間生成物であってもよい。被分析
物が中間生成物である場合には、これは種々の潜在的に
有用な減量反応及び指示薬反応系における゛反応体とし
て公知の物質であるのが好ましい。この方法では、被分
析物に対して最適な減量及び指示薬反応図を多くの分析
に使用することができる。このような反応図は、特異的
な一次反応によって被分析物を包含する生成物に変換さ
れうる物質を測定するのに有用である。この意味で使用
する場合、被分析物は、中心的又は共通の基質と言うこ
とができ、ヌクレオシドリン酸エステル類、すなわち、
ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びその還元
型（ＮＡＤＨ） 、ニコチンアミドジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ）及びその還元型（ＮＡＤＰＨ）、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ） 、フラビンモノ
ヌクレオチド（ＦＭＮ） 及びアデノシンリン酸エステ
ル［（ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰ）、過酸化水素、グリ
セリンなどのような物質を包含するが、これらに制限さ
れるものではない。
反応生成物には作用しないことである。被分析物とは、
減量反応及び指示薬反応の両方に共通の反応体として作
用する物質と理解される。し７たがって、若干の場合に
は、被分析物は分析において現実に分析上興味のある物
質ではなく、むしろ最終的に測定すべき物質と一次反応
によって形成される中間生成物であってもよい。被分析
物が中間生成物である場合には、これは種々の潜在的に
有用な減量反応及び指示薬反応系における゛反応体とし
て公知の物質であるのが好ましい。この方法では、被分
析物に対して最適な減量及び指示薬反応図を多くの分析
に使用することができる。このような反応図は、特異的
な一次反応によって被分析物を包含する生成物に変換さ
れうる物質を測定するのに有用である。この意味で使用
する場合、被分析物は、中心的又は共通の基質と言うこ
とができ、ヌクレオシドリン酸エステル類、すなわち、
ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びその還元
型（ＮＡＤＨ） 、ニコチンアミドジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ）及びその還元型（ＮＡＤＰＨ）、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ） 、フラビンモノ
ヌクレオチド（ＦＭＮ） 及びアデノシンリン酸エステ
ル［（ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰ）、過酸化水素、グリ
セリンなどのような物質を包含するが、これらに制限さ
れるものではない。
減量反応の別の主な特徴は、生じる生成物が実質的に指
示薬応答を示さないことである。本質的特徴は、減量反
応が実質的指示薬応答を生じることなく、さらに指示薬
応答又はその発生を実質的に妨害することなく所定量の
被分析物を消費することである。指示薬反応及びＭ１反
応にそれぞれ使用する反応図を示し、評価する際には上
記のことを考慮に入れる必要がある。
示薬応答を示さないことである。本質的特徴は、減量反
応が実質的指示薬応答を生じることなく、さらに指示薬
応答又はその発生を実質的に妨害することなく所定量の
被分析物を消費することである。指示薬反応及びＭ１反
応にそれぞれ使用する反応図を示し、評価する際には上
記のことを考慮に入れる必要がある。
また、減量反応が、検出可能な応答を生じる指示薬反応
に必要な時間にわたっ本質的に不可逆的であることは特
に好ましい。そうでなければ、復帰反応によって再生さ
れる被分析物の量を補償するか又はファクターとするこ
とが必要となる。前向きの減量反応によって消費される
被分析物の量を時間とともに逆転させないことが最適で
ある。
に必要な時間にわたっ本質的に不可逆的であることは特
に好ましい。そうでなければ、復帰反応によって再生さ
れる被分析物の量を補償するか又はファクターとするこ
とが必要となる。前向きの減量反応によって消費される
被分析物の量を時間とともに逆転させないことが最適で
ある。
不可逆性は、反応生成物の形成の際に自由エネルギーの
大きい変化を生じる入手可能な手段によって達成するこ
とができる。これは、例えば、ｉｔ反応の生成物の一つ
がガス、酸化−還元生成物又は他の顕著な分子変形であ
る場合に、達成されうる。生成物が任意の復帰反応に関
与するのを有効に阻止する媒染剤又は他の錯体形成剤を
使用することも考えられる。不可逆性は、また、反応体
の一つ、例えば、水が大過剰で存在する減量反応を使用
することによって有効に得ることもできる。
大きい変化を生じる入手可能な手段によって達成するこ
とができる。これは、例えば、ｉｔ反応の生成物の一つ
がガス、酸化−還元生成物又は他の顕著な分子変形であ
る場合に、達成されうる。生成物が任意の復帰反応に関
与するのを有効に阻止する媒染剤又は他の錯体形成剤を
使用することも考えられる。不可逆性は、また、反応体
の一つ、例えば、水が大過剰で存在する減量反応を使用
することによって有効に得ることもできる。
酵素反応が関与する場合、前進反応のに、が、酵素が前
進反応の基質と有効に結合するような復帰反応よりはる
かに小さい系を選択することができる。
進反応の基質と有効に結合するような復帰反応よりはる
かに小さい系を選択することができる。
Ｍｌ及び指示薬反応を含む分析系の具体例を次に記載す
る。
る。
Ａ、ＮＡＤＨのピルビン酸塩／ Ｌ Ｄ Ｈ減量ＮＡＤ
Ｈは、分析上興味ある物質の酵素測定における共通の中
間生成物である。特に有用な１ｌｆｆｉ反応は、 これをさらに変性して、Ｎ Ａ Ｄ Ｈの２１ｔを下記
の反応によって本質的に不可逆的にすることができる。
Ｈは、分析上興味ある物質の酵素測定における共通の中
間生成物である。特に有用な１ｌｆｆｉ反応は、 これをさらに変性して、Ｎ Ａ Ｄ Ｈの２１ｔを下記
の反応によって本質的に不可逆的にすることができる。
ここで、ＬＤＨは乳酸デヒドロゲナーゼであり、ＬＯＸ
は乳酸２−モノオキシゲナーゼである。好ましい条件を
与えると、ｉ量反応全体としては、ピルビン酸塩から生
成すると同時に乳酸塩を除去することができ、こうして
ＬＤＨ反応の逆転を阻止することができる。
は乳酸２−モノオキシゲナーゼである。好ましい条件を
与えると、ｉ量反応全体としては、ピルビン酸塩から生
成すると同時に乳酸塩を除去することができ、こうして
ＬＤＨ反応の逆転を阻止することができる。
分析上興味のある特定の物質の存在の乾燥としてＮ Ａ
Ｄ Ｈを生成する多数の一次反応を、本発明の目的で
この減量系と結合することができる。例えば、 グルコノラクトン （式中ＧＤＨはグルコースデヒドロゲナーゼである。） コレステロール＋Ｎ Ａ Ｄ ”−−一→Ｎ Ａ Ｄ
）−１＋コレステノン （式中ＣＥＨはコレステロールエステルヒドロラーセテ
アリ、ＣＤＨはコレステロールデヒドロゲナーゼである
。） 遊離脂肪酸 ｇ−Ｚ グリセリン−３−リン酸＋ＡＤＰ ＣＰ Ｄ Ｈ グリセリン−３−リン酸＋ＮＡＤ” −−→ＮＡＤＨ
＋ジヒドロキシアセトン−３−リン酸（式中Ｇ Ｐ Ｄ
ｉ（はグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼであ
る。） アセトアルデヒド 同様に、ＮＡＤＨは、ｓｉｔ反応からの残留物に対して
作用しうる多数の有用な指示薬反応に関与する。ＮＡＤ
Ｈ指示薬は、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Ｉ
ＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ
）及びジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を包含す
る。ＮＡＤＨを下記の反応を含むリポアミド系によって
測定することもできる。
Ｄ Ｈを生成する多数の一次反応を、本発明の目的で
この減量系と結合することができる。例えば、 グルコノラクトン （式中ＧＤＨはグルコースデヒドロゲナーゼである。） コレステロール＋Ｎ Ａ Ｄ ”−−一→Ｎ Ａ Ｄ
）−１＋コレステノン （式中ＣＥＨはコレステロールエステルヒドロラーセテ
アリ、ＣＤＨはコレステロールデヒドロゲナーゼである
。） 遊離脂肪酸 ｇ−Ｚ グリセリン−３−リン酸＋ＡＤＰ ＣＰ Ｄ Ｈ グリセリン−３−リン酸＋ＮＡＤ” −−→ＮＡＤＨ
＋ジヒドロキシアセトン−３−リン酸（式中Ｇ Ｐ Ｄ
ｉ（はグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼであ
る。） アセトアルデヒド 同様に、ＮＡＤＨは、ｓｉｔ反応からの残留物に対して
作用しうる多数の有用な指示薬反応に関与する。ＮＡＤ
Ｈ指示薬は、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Ｉ
ＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ
）及びジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を包含す
る。ＮＡＤＨを下記の反応を含むリポアミド系によって
測定することもできる。
Ｌ Ａ Ｄ Ｈ
リポアミド（ジスルフィド）＋ＮＡＤＨ−−→還元型リ
ポアミド＋ＮＡＤ” 還元型リポアミド＋ジスルフィド指示薬 →リポアミド
十色 （式中Ｌ Ａ Ｄ Ｈはリポアミドデヒドロゲナーゼで
あり、ジスルフィド指示薬はジチオ−（ビス−ニトロベ
ンゼン）（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）氏試薬）のような
試薬又はこの種の他の常用の指示薬を包含する。
ポアミド＋ＮＡＤ” 還元型リポアミド＋ジスルフィド指示薬 →リポアミド
十色 （式中Ｌ Ａ Ｄ Ｈはリポアミドデヒドロゲナーゼで
あり、ジスルフィド指示薬はジチオ−（ビス−ニトロベ
ンゼン）（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）氏試薬）のような
試薬又はこの種の他の常用の指示薬を包含する。
Ｂ、ＮＡＤＨのα−ケトグルタル酸塩／グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼｉｔ この減量系は下記の反応に基づくものである。
ヒドロゲナーゼｉｔ この減量系は下記の反応に基づくものである。
α−ケトグルタル酸塩十Ｎ Ａ Ｄ Ｈ＋ Ｎ Ｈ。
過剰のＮＨ４”の存在では、この反応は本質的に不可逆
的になりうる。さらに、不可逆性は、下記の反応を付加
することによって得ることもできる。
的になりうる。さらに、不可逆性は、下記の反応を付加
することによって得ることもできる。
上記の（Ａ）に記載した一次反応及び指示薬反応は、こ
のＭｌ系にそのまま適用される。
のＭｌ系にそのまま適用される。
Ｃ１ＮＡＤＨのリポアミド／リポアミドデヒドロゲナー
ゼ減量 Ｎ Ａ Ｄ Ｈの別の有用な減量反応は、リポアミド（
ＤＬ−６，８−チオクチツクアセトアミド）反応連鎖に
基づくものである： リポアミド（還元型） この反応は、リポアミドをその酸化型に変換することに
よって不可逆的にすることができる。例えば、 リポアミド（還元型）＋ジスルフィド受容体→リポアミ
ド（酸化型）土受容体（還元型）ジスルフィド受容体は
、リポアミドから変色を生じることなく電子当量を受容
する化合物、例えば２，２′−ジチオ−ビス（ピリジン
−Ｎ−オキシド）（ＤＴＰＯ）から選択される。
ゼ減量 Ｎ Ａ Ｄ Ｈの別の有用な減量反応は、リポアミド（
ＤＬ−６，８−チオクチツクアセトアミド）反応連鎖に
基づくものである： リポアミド（還元型） この反応は、リポアミドをその酸化型に変換することに
よって不可逆的にすることができる。例えば、 リポアミド（還元型）＋ジスルフィド受容体→リポアミ
ド（酸化型）土受容体（還元型）ジスルフィド受容体は
、リポアミドから変色を生じることなく電子当量を受容
する化合物、例えば２，２′−ジチオ−ビス（ピリジン
−Ｎ−オキシド）（ＤＴＰＯ）から選択される。
同様の反応は、グルタチオンレダクターゼの存在でのグ
ルタチオンとＮ Ａ Ｄ Ｈとの反応である。
ルタチオンとＮ Ａ Ｄ Ｈとの反応である。
Ｄ、ＮＡＤＨのグリセルアルデヒド−３−リン酸／α−
グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ減量さらに、下記の
経路でＮＡＤＨを減量することもできる。
グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ減量さらに、下記の
経路でＮＡＤＨを減量することもできる。
ジヒドロキシアセトンリン酸＋ＮＡＤＨ−−→ＮＡＤ”
＋α−グリセリンリン酸 酸中中−Ｇ ｌ） Ｄはα−グリセリンリン酸デヒドロ
ゲナーゼである。上記の反応は、さらに下記の反応によ
って改善して不可逆性にすることができる。
＋α−グリセリンリン酸 酸中中−Ｇ ｌ） Ｄはα−グリセリンリン酸デヒドロ
ゲナーゼである。上記の反応は、さらに下記の反応によ
って改善して不可逆性にすることができる。
グリセリン＋無機リン酸塩
また、前記の（Ａ）に記載したようにＮＡＤＨを製造し
、検出する予備反応及び指示薬反応はそれぞれこの減量
系に適用される。
、検出する予備反応及び指示薬反応はそれぞれこの減量
系に適用される。
Ｅ、グルコースのＡ Ｔ Ｐ ／ヘキソキナーゼ減量被
分析物としてのグルコースに直接適用することのできる
Ｎｆｉｔ反応は、下記のとおりである：６−リン酸＋Ａ
ＤＰ ヘキソキナーゼをグルコキナーゼで置換することもでき
る。ＡＤＰの存在が全分析系において可能な妨害物質を
生じうる場合には、これを下記の反応によって有効に除
去することができる。
分析物としてのグルコースに直接適用することのできる
Ｎｆｉｔ反応は、下記のとおりである：６−リン酸＋Ａ
ＤＰ ヘキソキナーゼをグルコキナーゼで置換することもでき
る。ＡＤＰの存在が全分析系において可能な妨害物質を
生じうる場合には、これを下記の反応によって有効に除
去することができる。
ＡＭＰはＡＴＰ依存性の反応、例えばバイオルミネッセ
ンスには、通常、非反応性である。次にグルコースに対
する指示薬反応を下記のように行い、ＮＡＤＨを前記の
指示薬反応によって検出する。
ンスには、通常、非反応性である。次にグルコースに対
する指示薬反応を下記のように行い、ＮＡＤＨを前記の
指示薬反応によって検出する。
ラクトン
Ｆ、ＡＴＰのグルコース／ヘキソキナーゼＪｆｆｉ直前
の減量系の逆転、すなわち、調節共反応体としてのグル
コースでＡＴＰを減量することを使用することもできる
。
の減量系の逆転、すなわち、調節共反応体としてのグル
コースでＡＴＰを減量することを使用することもできる
。
分析上興味のある特定の物質の関数としてＡＴＰを生成
し、この減量反応に結合しうる予備反応は、下記のもの
を包含する： （ａ） ホスホ〔エノール］ピルビン酸塩＋ＡＤＰ（
ｂ） オキサロ酢酸塩＋ＡＤＰ＋ホスフェートＡＴＰ
に対する指示薬反応は、周知のバイオルミネッセンス図
並びに発色系を包含する。例えば６−リン酸＋ＡＤＰ ＮＡＤＨ＋−６−ホスホグルコン酸 ＮＡＤＨ→ 前記のような発色 Ｇ、ＡＴＰのグリセリン／グリセリンキナーゼ減量 ＡＴＰを減量する別のアプローチは、下記の反応に基づ
（ものである： α−グリセリンリン酸＋ＡＤＰ Ｈ，グリセリンのＡＴＰ／グリセリンキナーゼ減量 グリセリンの減量は、上記の（Ｆ）に示した反応により
達成することができる。グリセリンは、予備反応におい
てトリグリセリドから生成され、前記のようなグリセリ
ンデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤ Ｈ指示薬系によって検出
することができる。
し、この減量反応に結合しうる予備反応は、下記のもの
を包含する： （ａ） ホスホ〔エノール］ピルビン酸塩＋ＡＤＰ（
ｂ） オキサロ酢酸塩＋ＡＤＰ＋ホスフェートＡＴＰ
に対する指示薬反応は、周知のバイオルミネッセンス図
並びに発色系を包含する。例えば６−リン酸＋ＡＤＰ ＮＡＤＨ＋−６−ホスホグルコン酸 ＮＡＤＨ→ 前記のような発色 Ｇ、ＡＴＰのグリセリン／グリセリンキナーゼ減量 ＡＴＰを減量する別のアプローチは、下記の反応に基づ
（ものである： α−グリセリンリン酸＋ＡＤＰ Ｈ，グリセリンのＡＴＰ／グリセリンキナーゼ減量 グリセリンの減量は、上記の（Ｆ）に示した反応により
達成することができる。グリセリンは、予備反応におい
てトリグリセリドから生成され、前記のようなグリセリ
ンデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤ Ｈ指示薬系によって検出
することができる。
指示薬応答は、本質的には、分析により検出しうる応答
、特に化学的又は電気的性質の応答であってよい。被分
析物又は指示薬反応の反応生成物の化学的性質は、通常
、指示薬応答、特に物理化学的性質、例えば化合物の光
学的又は電気化学的性質として使用される。有用な光学
的性質は、蛍光、特に可視及び紫外範囲での吸光度、肉
眼で検出しうる変色、例えば、発色又は色相の変化ある
いは飽和及びルミネッセンス、例えば化学ルミネッセン
ス又はバイオルミネジセンスである。指示薬応答の検出
は、応答の性質に左右されるであろう。機器による検出
、例えば蛍光計、光度計、分光光度計、比色計などを用
いる検出がしばしば使用される。変色の肉眼での観察並
びに可視及び／又は紫外範囲における吸光度の変化の機
器による測定、特に反射光度計による測定は、特に本発
明によって向上される。
、特に化学的又は電気的性質の応答であってよい。被分
析物又は指示薬反応の反応生成物の化学的性質は、通常
、指示薬応答、特に物理化学的性質、例えば化合物の光
学的又は電気化学的性質として使用される。有用な光学
的性質は、蛍光、特に可視及び紫外範囲での吸光度、肉
眼で検出しうる変色、例えば、発色又は色相の変化ある
いは飽和及びルミネッセンス、例えば化学ルミネッセン
ス又はバイオルミネジセンスである。指示薬応答の検出
は、応答の性質に左右されるであろう。機器による検出
、例えば蛍光計、光度計、分光光度計、比色計などを用
いる検出がしばしば使用される。変色の肉眼での観察並
びに可視及び／又は紫外範囲における吸光度の変化の機
器による測定、特に反射光度計による測定は、特に本発
明によって向上される。
本発明の方法の自己表示型態様に有用な比色指示薬応答
に関して、被分析物の所望のレベルに対する閾値発色の
相対的位置を調節するため減量反応を使用すると、指示
薬生成物を広範な材料から選択することが可能となる。
に関して、被分析物の所望のレベルに対する閾値発色の
相対的位置を調節するため減量反応を使用すると、指示
薬生成物を広範な材料から選択することが可能となる。
他の場合には高い分子吸光係数を有するため定量に使用
するのは適当でない色素又は指示薬は、本発明の自己表
示法には全く有用になり、実際、好ましい。このような
材料は、被分析物に応答して強い色を生じるので、閾値
発色は、全く容易に検出可能となり、したがって、分析
結果の精度が改良される。
するのは適当でない色素又は指示薬は、本発明の自己表
示法には全く有用になり、実際、好ましい。このような
材料は、被分析物に応答して強い色を生じるので、閾値
発色は、全く容易に検出可能となり、したがって、分析
結果の精度が改良される。
本発明の方法は別個の指示薬反応を使用して指示薬応答
を示す生成物を生じる分析系において顕著な利点をもた
らすことが考えられるが、若干の場合には、指示薬応答
としての被分析物自体の物理的性質を測定することが可
能となる。これは、特に、被分析物が特徴的吸収性によ
って直接測定されうる中間生成物、例えばＮＡＤ、ＮＡ
ＤＨｌＮＡＤＰ又はＮＡＤＰＨである場合に適用するこ
とができる。
を示す生成物を生じる分析系において顕著な利点をもた
らすことが考えられるが、若干の場合には、指示薬応答
としての被分析物自体の物理的性質を測定することが可
能となる。これは、特に、被分析物が特徴的吸収性によ
って直接測定されうる中間生成物、例えばＮＡＤ、ＮＡ
ＤＨｌＮＡＤＰ又はＮＡＤＰＨである場合に適用するこ
とができる。
分析方法及び試験構造体
本発明の方法を実施する際には、まず減量反応を実質的
に完了するまで実施し、その後、１旨示薬反応を行う。
に完了するまで実施し、その後、１旨示薬反応を行う。
前記のように、これは、減量反応が完了するまで指示薬
試薬の添加又は接触を実際に遅延させるか又は相対的速
度により反応を有効に逐次進行させる条件及び反応図を
選択することによって行われる。減量試薬及び指示薬試
薬の時間的に逐次添加すると、もちろん、この目的が達
成されるが、試験試料を単一の試験組成物又は試験具と
接触させればよいように、反応経路を設計するのが好ま
しい。
試薬の添加又は接触を実際に遅延させるか又は相対的速
度により反応を有効に逐次進行させる条件及び反応図を
選択することによって行われる。減量試薬及び指示薬試
薬の時間的に逐次添加すると、もちろん、この目的が達
成されるが、試験試料を単一の試験組成物又は試験具と
接触させればよいように、反応経路を設計するのが好ま
しい。
前記のように、反応経路に対する便利なアプローチは、
同時に開始したときに、指示薬反応が相当な程度に進行
する前に減量反応が本質的に完了している程度に充分に
迅速であるように、減量反応及び指示薬反応を選択する
ことである。減量反応と指示薬反応との間のこの関係に
基づく分析系は、広範な試験組成物及び試験具の形で提
示することができるが、特に試薬ストリップに使用する
のに適当である。このような試験具は、従来公知のよう
に減量試薬及び指示薬試薬を混入した担体材料又はマト
リックスを含む。試験試料と接触させると、反応が開始
され、最終的な検出可能な指示薬応答は本発明の特徴に
よって特性決定される。
同時に開始したときに、指示薬反応が相当な程度に進行
する前に減量反応が本質的に完了している程度に充分に
迅速であるように、減量反応及び指示薬反応を選択する
ことである。減量反応と指示薬反応との間のこの関係に
基づく分析系は、広範な試験組成物及び試験具の形で提
示することができるが、特に試薬ストリップに使用する
のに適当である。このような試験具は、従来公知のよう
に減量試薬及び指示薬試薬を混入した担体材料又はマト
リックスを含む。試験試料と接触させると、反応が開始
され、最終的な検出可能な指示薬応答は本発明の特徴に
よって特性決定される。
別の好ましいアプローチは、試薬の区画化を含む。多く
の試験具は、試験試料及び生じる反応混合物が減量試薬
及び指示薬試薬と接触する順序を整理するため利用され
る。一般原則として、このような試験具は、流体流動接
触で試薬の別々の区間を含み、これによって接触の順序
及び、したがって反応を制御することができる。区画は
、例えば、毛細管又は他の液体導通手段などによって連
結された特定の液体用量を維持しうる室であってよい。
の試験具は、試験試料及び生じる反応混合物が減量試薬
及び指示薬試薬と接触する順序を整理するため利用され
る。一般原則として、このような試験具は、流体流動接
触で試薬の別々の区間を含み、これによって接触の順序
及び、したがって反応を制御することができる。区画は
、例えば、毛細管又は他の液体導通手段などによって連
結された特定の液体用量を維持しうる室であってよい。
区画化に基づく特に有用な試験具は、それぞれの試薬を
混入した別々の帯域を有する担体マトリックスを含む試
薬ストリップである。一つの形態では、このような試験
具は、試薬を混入した多くの吸収性又は多孔性の層を含
む。試薬と接触する上層は、減量反応の要素を含み、残
りの反応混合物が拡散する下層は指示薬反応の要素を含
む。別の形態では、試験具は、接触させるため所望の順
序で試薬を混入した別個の部分を有する長い吸収性担体
マトリックスを含む。マトリックスの選択された端部を
試験試料と接触させると、場合により展開流体を用いて
、試験具に沿って毛細管により液体が流れるにしたがっ
て反応を進行する。本発明の目的を達成するため多くの
試験具が可能であり、当業者には明らかであることは容
易に理解されるであろう。
混入した別々の帯域を有する担体マトリックスを含む試
薬ストリップである。一つの形態では、このような試験
具は、試薬を混入した多くの吸収性又は多孔性の層を含
む。試薬と接触する上層は、減量反応の要素を含み、残
りの反応混合物が拡散する下層は指示薬反応の要素を含
む。別の形態では、試験具は、接触させるため所望の順
序で試薬を混入した別個の部分を有する長い吸収性担体
マトリックスを含む。マトリックスの選択された端部を
試験試料と接触させると、場合により展開流体を用いて
、試験具に沿って毛細管により液体が流れるにしたがっ
て反応を進行する。本発明の目的を達成するため多くの
試験具が可能であり、当業者には明らかであることは容
易に理解されるであろう。
本発明方法の利点は、指示薬反応の前に試験試料から所
定量の被分析物を制御可能に減量しうろことによる。減
量反応は、被分析物と共に共反応体が関与する酵素触媒
反応を使用することによって制御される。減量反応の開
始時に存在する共反応体の量及び反応における共反応体
と被分析物との間の化学量論的関係は、消費される被分
析物の鼠を決定する。所定の減量反応に望ましい共反応
体の量は、通常、実験により決定される。与えられた試
験組成物又は試験系に対して共反応体の臨界的量が決定
されれば、このような組成物又は試験具の製造にそのよ
うな量を定量的にかつ再現可能に添加することは比較的
簡単なことである。
定量の被分析物を制御可能に減量しうろことによる。減
量反応は、被分析物と共に共反応体が関与する酵素触媒
反応を使用することによって制御される。減量反応の開
始時に存在する共反応体の量及び反応における共反応体
と被分析物との間の化学量論的関係は、消費される被分
析物の鼠を決定する。所定の減量反応に望ましい共反応
体の量は、通常、実験により決定される。与えられた試
験組成物又は試験系に対して共反応体の臨界的量が決定
されれば、このような組成物又は試験具の製造にそのよ
うな量を定量的にかつ再現可能に添加することは比較的
簡単なことである。
試験組成物中の共反応体の量の選択は、分析における所
望の効果に左右される。基本的には、二つの効果があり
、その一つは、本発明のｄｆｆｉｆｆ−自己表示及び改
良された目視分解によって得られる。自己表示の場合に
は、共反応体の量を、試料中に被分析物が予め選択した
濃度以上に存在しない限り特定の指示薬応答の発生を阻
止するのに充分な被分析物の量を消費するように選択す
る。
望の効果に左右される。基本的には、二つの効果があり
、その一つは、本発明のｄｆｆｉｆｆ−自己表示及び改
良された目視分解によって得られる。自己表示の場合に
は、共反応体の量を、試料中に被分析物が予め選択した
濃度以上に存在しない限り特定の指示薬応答の発生を阻
止するのに充分な被分析物の量を消費するように選択す
る。
使用者のイエス／ノー決定に対するカットオフとして役
立つ指示薬応答は、目又は使用する機器によって検出可
能な閾値応答である。しかしながら、カットオフ応答を
、このような閾値以上の選択したレベルの応答、例えば
、肉眼で観察する場合にはある色相の発生又は色の飽和
、また、機器で色を検出する場合にはあるレベルの吸光
度に設定することができる。
立つ指示薬応答は、目又は使用する機器によって検出可
能な閾値応答である。しかしながら、カットオフ応答を
、このような閾値以上の選択したレベルの応答、例えば
、肉眼で観察する場合にはある色相の発生又は色の飽和
、また、機器で色を検出する場合にはあるレベルの吸光
度に設定することができる。
１種の自己表示試験組成物を使用すると、被分析物が一
つの予め設定した被分析物濃度以上に存在するか否かだ
けを使用者に知らせる。広範な定量を行うには、様々な
里の調節共反応体を含む試験組成物列を用いて、多数の
子め設定した被分析物濃度でイエス／ノー指示薬応答を
提供する。任意の数の試験具は、それだけの情報を示す
。例え・ば、被分析物の濃度を増加したときにカン１〜
オフレベルの指示薬応答、例えば閾値の検出可能な色を
与える試験組成物は、試験試料中の被分析物の量が増加
するにしたがって数字又は他の幾何学的形状が現れるよ
うに適応させることができる。例えば、予め選択した最
初の被分析物濃度を、試験具上に数字゛１゛の形で着色
部分を形成させるのに充分にすることができ、第二の被
分析物濃度を数字′ビ及び２″′の形で着色部分を形成
させるのに充分にすることができる（米国特許筒４．０
４２，３２９号明細書）。さらに例えば、増加する被分
析物濃度に対して感受性のある自己表示試験組成物を、
試験具上でピンホイール又は温度計効果を与えるように
適合することができる（米国特許筒４，６５４，３１０
号明細書）。
つの予め設定した被分析物濃度以上に存在するか否かだ
けを使用者に知らせる。広範な定量を行うには、様々な
里の調節共反応体を含む試験組成物列を用いて、多数の
子め設定した被分析物濃度でイエス／ノー指示薬応答を
提供する。任意の数の試験具は、それだけの情報を示す
。例え・ば、被分析物の濃度を増加したときにカン１〜
オフレベルの指示薬応答、例えば閾値の検出可能な色を
与える試験組成物は、試験試料中の被分析物の量が増加
するにしたがって数字又は他の幾何学的形状が現れるよ
うに適応させることができる。例えば、予め選択した最
初の被分析物濃度を、試験具上に数字゛１゛の形で着色
部分を形成させるのに充分にすることができ、第二の被
分析物濃度を数字′ビ及び２″′の形で着色部分を形成
させるのに充分にすることができる（米国特許筒４．０
４２，３２９号明細書）。さらに例えば、増加する被分
析物濃度に対して感受性のある自己表示試験組成物を、
試験具上でピンホイール又は温度計効果を与えるように
適合することができる（米国特許筒４，６５４，３１０
号明細書）。
改良された分解効果は、消費する必要のある被分析物の
量を見つけるため試験組成物中の共反応体の量を変動さ
せて、被分析物濃度の所望の範囲にわたる最適分解領域
に指示薬応答を移動させることによって得られる。この
ような試験組成物によって得られる定量は、一つの試験
組成物を使用する状態について向上し、定量は、指示薬
応答の分解レヘル、例えば色飽和の程度に左右される。
量を見つけるため試験組成物中の共反応体の量を変動さ
せて、被分析物濃度の所望の範囲にわたる最適分解領域
に指示薬応答を移動させることによって得られる。この
ような試験組成物によって得られる定量は、一つの試験
組成物を使用する状態について向上し、定量は、指示薬
応答の分解レヘル、例えば色飽和の程度に左右される。
次に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
に制限されるものではない。
に制限されるものではない。
実施例１
この例は、下記、のＮＡＤＨ減量反応の直線性を証明す
るものである： ＮＡＤＨは、診断上重要な被分析物、例えばグルコース
の関与する酵素反応の共通の生成物である。
るものである： ＮＡＤＨは、診断上重要な被分析物、例えばグルコース
の関与する酵素反応の共通の生成物である。
したがって、このような減量反応は、本発明による自己
表示又は改良された分解試験システムの製造に有用な手
段として役立つ。
表示又は改良された分解試験システムの製造に有用な手
段として役立つ。
ＮＡＤｏ、５’７ｍＭ、ＮＡＤＨＯ，１５μＭ、ピルビ
ン酸ナトリウムＯ〜０．１６７ｍＭ、ジアホラーゼ０．
６７単位／ ｍｌ、ＬＤＨＯ〜６７単位／ ｍｌ単位口
−ドニトロテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）０．５ｍ
Ｍ及びｐＨ７，５のＨＥ Ｐ Ｅ Ｓ ０．１ Ｍ緩衝
液を総量３ｍｉ中に含む混合物を２５°Ｃでインキュベ
ーションし、その間、ヒューレント・パンカード・ダイ
オード・アレー・スペク］・ロフォトメータ（Ｉｌｅｗ
ｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）、 ８４５
１Ａ型で５０４ｎｍ（セルの路長１ｃｍ）で吸光度を監
視した。
ン酸ナトリウムＯ〜０．１６７ｍＭ、ジアホラーゼ０．
６７単位／ ｍｌ、ＬＤＨＯ〜６７単位／ ｍｌ単位口
−ドニトロテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）０．５ｍ
Ｍ及びｐＨ７，５のＨＥ Ｐ Ｅ Ｓ ０．１ Ｍ緩衝
液を総量３ｍｉ中に含む混合物を２５°Ｃでインキュベ
ーションし、その間、ヒューレント・パンカード・ダイ
オード・アレー・スペク］・ロフォトメータ（Ｉｌｅｗ
ｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）、 ８４５
１Ａ型で５０４ｎｍ（セルの路長１ｃｍ）で吸光度を監
視した。
減量剤の不存在で発生するように設定した後、３種の異
なる特定濃度のＬＤＨ（０，６７，６，７及び６７単位
／ ｍｌ ）を含む混合物にピルビン酸ナトリウムの量
を増加させて添加した。５分インキユベーシゴンした後
の吸光度をＭｆｆｌ剤の不存在で得られた吸光度から控
除し、その差をピルビン酸塩濃度の関数としてプロット
した（第４図）。
なる特定濃度のＬＤＨ（０，６７，６，７及び６７単位
／ ｍｌ ）を含む混合物にピルビン酸ナトリウムの量
を増加させて添加した。５分インキユベーシゴンした後
の吸光度をＭｆｆｌ剤の不存在で得られた吸光度から控
除し、その差をピルビン酸塩濃度の関数としてプロット
した（第４図）。
第４図は前記の液体分析計の応答に対する減量剤（ピル
ビン酸塩）の量を増加する効果を説明するものである。
ビン酸塩）の量を増加する効果を説明するものである。
縦座標は、発色反応（［Ｎ Ｔがホルマザンに変換され
る）によって達成されるプラトー吸光度の減少を示す。
る）によって達成されるプラトー吸光度の減少を示す。
減量応答は、２００単位のＬ Ｄ Ｈを用いると、明ら
かに綿状である。分析混合物中のＬ Ｄ Ｈの総量を２
単位（ジアホラーゼ活性に対して１：１比）に減少する
と、減量用量応答の直線性は極めて悪化した。第４図に
おけるＬ Ｄ Ｈ２００単位曲線から得られる勾配は、
理論的効率の約４５．３％の減量に相当する。
かに綿状である。分析混合物中のＬ Ｄ Ｈの総量を２
単位（ジアホラーゼ活性に対して１：１比）に減少する
と、減量用量応答の直線性は極めて悪化した。第４図に
おけるＬ Ｄ Ｈ２００単位曲線から得られる勾配は、
理論的効率の約４５．３％の減量に相当する。
実施例２
この例は、本質的に不可逆的な減量反応を使用する利点
を証明するものである。不可逆性は、実施例１に使用し
たピルビン酸塩／ＬＤＨ減量反応に更に下記の反応を実
施することによって得られる： 実施例１の反応条件によるが、この実験においてはピル
ビン酸塩濃度を０．１ｍＭとし、ＬＤＨに対するＬＯＸ
Ｏ量及び比を第１表に示すように変更した。
を証明するものである。不可逆性は、実施例１に使用し
たピルビン酸塩／ＬＤＨ減量反応に更に下記の反応を実
施することによって得られる： 実施例１の反応条件によるが、この実験においてはピル
ビン酸塩濃度を０．１ｍＭとし、ＬＤＨに対するＬＯＸ
Ｏ量及び比を第１表に示すように変更した。
第１表 （単位／ ３ ｍｌ ）
反応 ＮＡＤＨピルビン ＬＤＩ−Ｉ ＬＯＸ
目的欣−酸塩− １一対照 ２ ＋ −ＮＡＤＨ対照３
＋ −ＮＡＤＨ対照４＋
＋ ２−’１１１ｍ ５ ＋ ± ２０ − 減量６ ＋
＋ ２００ − 減量７＋＋２００
２ 不可逆減量 ８ ＋ ＋２００ ２０ 不可逆減量９
＋ ＋ ２００２００ 不可逆減量
結果を第５図及び第６図に示す。ＬＯＸの不存在では、
ＬＤＨレベルが高い程、プラトー吸光度値の上方移動が
増加した（反応４〜６）。この移動は、おそらく、最初
の減量反応後に発色反応が残りを消費すると、ＬＤＨ反
応が逆転して付加的Ｎ Ａ Ｄ Ｈを生じることによっ
て起こったものである。しかし、ＬＯＸｆｉ度が増加す
ると、この傾向に反作用し、移動を減少した（第６図、
反応７〜９）。
目的欣−酸塩− １一対照 ２ ＋ −ＮＡＤＨ対照３
＋ −ＮＡＤＨ対照４＋
＋ ２−’１１１ｍ ５ ＋ ± ２０ − 減量６ ＋
＋ ２００ − 減量７＋＋２００
２ 不可逆減量 ８ ＋ ＋２００ ２０ 不可逆減量９
＋ ＋ ２００２００ 不可逆減量
結果を第５図及び第６図に示す。ＬＯＸの不存在では、
ＬＤＨレベルが高い程、プラトー吸光度値の上方移動が
増加した（反応４〜６）。この移動は、おそらく、最初
の減量反応後に発色反応が残りを消費すると、ＬＤＨ反
応が逆転して付加的Ｎ Ａ Ｄ Ｈを生じることによっ
て起こったものである。しかし、ＬＯＸｆｉ度が増加す
ると、この傾向に反作用し、移動を減少した（第６図、
反応７〜９）。
実施例３
自己表示分析
この例は、自己表示結果を生じるためグルコースに関す
る液体分析システムの調製を説明するものである。
る液体分析システムの調製を説明するものである。
適切なＮＡＤ （０，１〜１．０ｍＭ） 、種々の濃度
のピルビン酸ナトリウム、所望の時間間隔（０，５〜５
分）以内に終点を表示するのに充分な量のグルコースデ
ヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ、顕著な発色を起こす
前に減量を完了するのに充分な大過剰のＬＤＨ（ジアホ
ラーゼ活性に比べて）、ＬＤＨの少なくとも２倍単位の
乳酸モノオキシゲナーゼ、０．１〜１．０ｍＭヨードニ
トロテトラゾリウムクロリド及び適切な緩衝液（例えば
０． Ｉ ＨＥ Ｐ ＥＳ、ｐ）１７．５）を含む反応
混合物を調製した。ピルビン酸塩濃度を、予め選択した
グルコース濃度列と同等なＮＡＤＨの量を除去するのに
適切であるように調節した。
のピルビン酸ナトリウム、所望の時間間隔（０，５〜５
分）以内に終点を表示するのに充分な量のグルコースデ
ヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ、顕著な発色を起こす
前に減量を完了するのに充分な大過剰のＬＤＨ（ジアホ
ラーゼ活性に比べて）、ＬＤＨの少なくとも２倍単位の
乳酸モノオキシゲナーゼ、０．１〜１．０ｍＭヨードニ
トロテトラゾリウムクロリド及び適切な緩衝液（例えば
０． Ｉ ＨＥ Ｐ ＥＳ、ｐ）１７．５）を含む反応
混合物を調製した。ピルビン酸塩濃度を、予め選択した
グルコース濃度列と同等なＮＡＤＨの量を除去するのに
適切であるように調節した。
この分析管列を調製する便利な方法は、すべての成分を
２．５ ｍｌの流体容量に混合することである。
２．５ ｍｌの流体容量に混合することである。
次に、グルコース含有流体の試料（０，５ｍｌ１）を６
管に添加して総量を３． Ｏｔｒｄｌにする。混合し、
室温で３０秒〜５分インキュベーションした後、６管に
おいて赤色の有無を観察する。肉眼で測定して顕著な発
色の存在は、試料中のグルコース濃度がその与えられた
管について予め選択した値を超えていることを示す。
管に添加して総量を３． Ｏｔｒｄｌにする。混合し、
室温で３０秒〜５分インキュベーションした後、６管に
おいて赤色の有無を観察する。肉眼で測定して顕著な発
色の存在は、試料中のグルコース濃度がその与えられた
管について予め選択した値を超えていることを示す。
代表的結果を以下に示す。
管Ｎｏ、１２３ ４ ５ ６ ７ ８（グル
コース）１ 色 ＋２ ＋ ＋ ＋ 注ｌ：ピルビン酸塩濃度によって測定した、予め選択し
た濃度 注２： 十”は、観察された発色が目視検出に対する閾
値を超えていることを意味し、“−°は管はほとんど無
・色に見えることを意味する。
コース）１ 色 ＋２ ＋ ＋ ＋ 注ｌ：ピルビン酸塩濃度によって測定した、予め選択し
た濃度 注２： 十”は、観察された発色が目視検出に対する閾
値を超えていることを意味し、“−°は管はほとんど無
・色に見えることを意味する。
前記の結果から、試料中のグルコース濃度が７５〜１０
０ｍｇ／ｄ１であると結論される。予め選択されたグル
コース濃度値は、所望の広さの判別範囲を生じるように
選択することができる。
０ｍｇ／ｄ１であると結論される。予め選択されたグル
コース濃度値は、所望の広さの判別範囲を生じるように
選択することができる。
実施例４
改良された分解分析
この例は、リポアミド／リポアミドデヒドロゲナーゼ／
ＤＴＰＯＮ量反応を使用して臨床的グルコーススケール
の異なる部分に最適目視分解領域をいかにして移動させ
うるかを示すものである。
ＤＴＰＯＮ量反応を使用して臨床的グルコーススケール
の異なる部分に最適目視分解領域をいかにして移動させ
うるかを示すものである。
３層のゼラチン基質フィルムを用いてグルコース試験ス
トリップを製造した。フィルムに下記の化学反応を組み
込んだ： ＋ＮＡＤＨ ＬＡｒｅｄ ＋ＤＴＰＯｏｘ ＬＡｏｘ
＋ＤＴＰＯｒｅｄＧＤＨ−グルコースデヒドロゲナーゼ ＬＡ、、＝リポアミド（酸化型） ＬＡｒ−ａ＝リポアミド（還元型） ＬＡＤＨ＝リポアミドデヒドロゲナーゼＤＴＰＯ＝２．
２’−ジチオ−ビス（ピリジンＮ−オキシド） ＩＮＴ＝２−（Ｔ）−インドフェニル）−３（ｐ−ニト
ロフェニル）−５−フェニ ルテトラゾリウムクロリド フィルム内で一次反応が起こる間、試料中に存在するグ
ルコースは、グルコースデヒドロゲナーゼの存在でＮＡ
Ｄ”と反応してＮＡＤ’Ｈ及びグルコノラクトンを生成
する。生成したＮＡＤＨは、次に減量反応でリポアミド
と反応するか又はＩＮＴ及びジアホラーゼと反応して発
色することができる。フィルム内に存在するＤＴＰＯの
濃度は、肉眼及び機器で観察される色レベルの移動を決
定する。
トリップを製造した。フィルムに下記の化学反応を組み
込んだ： ＋ＮＡＤＨ ＬＡｒｅｄ ＋ＤＴＰＯｏｘ ＬＡｏｘ
＋ＤＴＰＯｒｅｄＧＤＨ−グルコースデヒドロゲナーゼ ＬＡ、、＝リポアミド（酸化型） ＬＡｒ−ａ＝リポアミド（還元型） ＬＡＤＨ＝リポアミドデヒドロゲナーゼＤＴＰＯ＝２．
２’−ジチオ−ビス（ピリジンＮ−オキシド） ＩＮＴ＝２−（Ｔ）−インドフェニル）−３（ｐ−ニト
ロフェニル）−５−フェニ ルテトラゾリウムクロリド フィルム内で一次反応が起こる間、試料中に存在するグ
ルコースは、グルコースデヒドロゲナーゼの存在でＮＡ
Ｄ”と反応してＮＡＤ’Ｈ及びグルコノラクトンを生成
する。生成したＮＡＤＨは、次に減量反応でリポアミド
と反応するか又はＩＮＴ及びジアホラーゼと反応して発
色することができる。フィルム内に存在するＤＴＰＯの
濃度は、肉眼及び機器で観察される色レベルの移動を決
定する。
フィルムを下記のようにして製造した。
−一一戒分一一 旦」■Ｌ第１層：ゼラチ
ン（２０％）、ｐＨ５，２３，０ＰＶＰ （２０％）１
．０ オリン（Ｏｌｉｎ） ＬＯＧ （４％）０．５水
５．５ＩＮＴ
Ｏ，０６５ＰＶＰ＝ポリビ
ニルビロリドン オリン１０Ｇ＝アルキルフェノールアルコキシレート表
面活性剤〔アメリカ合衆国コネチカット州スタンフォー
ドのオリン・コーポレーション（Ｏｌｉｎ Ｃｏｒｐ、
） ） 湿潤厚１００μで注型 第２層：ゼラチン（２０％）、ｐＨ５，２３，０ＰＶＰ
（２０％）１．０ オリンＩＯＧ Ｏ，５ ＭＥＳ緩衝液、Ｉ Ｍ、 ｐＨ６，５２，５水
３．０ＧＤＨ１６４単位
／■ ０．０６０ＮＡＤ
Ｏ，０６０ＢＳＡ Ｏ，０４
ＯＬＡＤＨ，１３２単位／ｍｇ ０．２００ジアホ
ラーゼ、３．６単位／ｍｇ ０．２００リポアミド及
びＤＴＰＯ フィルムＡ＝ＬＡＯ，Ｏ、ＤＴＰＯｏ、０フィルムＢ＝
ＬＡ０．０８０ ｇ ； ＤＴＰＯｏ、０フィルムＣ＝
ＬＡ０．０５０ｇ； ＤＴＰＯｏ、０１０ｇ フィルムＤ＝ＬＡ０．０５０ ｇ ： ＤＴＰＯｏ、０２０ｇ フィルムＤ＝ＬＡ０．０５０ ｇ ； ＤＴＰＯｏ、０３０ｇ ＭＥＳ＝２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン 湿潤厚１００μで注型 第３層：カルポジイミド Ｏ，ｌ ２５オ
リンｌ０Ｇ（４％） ０．２５０水
９．６２５カルボジイミド＝
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド 湿潤厚２４μで注型 第１層の成分をフラスコ中で与えられた順序で４０〜４
５°Ｃで混合し、少なくとも１５分攪拌した。次いで、
溶液を脱気し、ＰＥＴフィルム基材〔アグファーゲベー
ルト・アクチェン・ゲゼルシャフト（Ａｇｆａ−Ｇｅｖ
ａｅｒｔ Ａ、 Ｇ、） 、西ドイツ国しバークゼン〕
上に湿潤厚１００μで被覆した。フィルムを４０°Ｃの
乾燥器で乾燥した。同様に、第２溶液を混合し、脱気し
、湿潤厚ｌＯＯμで第１層上に被覆した。次いで、フィ
ルムを４０゛Ｃの乾燥器で乾燥した。第３層は、次に、
試料をフィルムの表面から除去することを可能にするゼ
ラチンを架橋する。フィルムをストリップに切断し、次
に、グルコース試料と１５秒反応させた。その表面から
試料を除去した後、ストリップを分析のためマクベス（
Ｍａｃｂｅｔｈ） １５００／プラス・クイック・キー
・カラー（Ｐｌｕｓ Ｑｕｉｃｋ Ｋｅｙ Ｃｏ１ｏｒ
）分光光度計〔コルモーガン・コーポレーション（Ｋｏ
ｌｌｉｏｒｇａｎ Ｃｏｒｐ、）、アメリカ合衆国ニュ
ーヨーク州ニューバーグ）に載せた。
ン（２０％）、ｐＨ５，２３，０ＰＶＰ （２０％）１
．０ オリン（Ｏｌｉｎ） ＬＯＧ （４％）０．５水
５．５ＩＮＴ
Ｏ，０６５ＰＶＰ＝ポリビ
ニルビロリドン オリン１０Ｇ＝アルキルフェノールアルコキシレート表
面活性剤〔アメリカ合衆国コネチカット州スタンフォー
ドのオリン・コーポレーション（Ｏｌｉｎ Ｃｏｒｐ、
） ） 湿潤厚１００μで注型 第２層：ゼラチン（２０％）、ｐＨ５，２３，０ＰＶＰ
（２０％）１．０ オリンＩＯＧ Ｏ，５ ＭＥＳ緩衝液、Ｉ Ｍ、 ｐＨ６，５２，５水
３．０ＧＤＨ１６４単位
／■ ０．０６０ＮＡＤ
Ｏ，０６０ＢＳＡ Ｏ，０４
ＯＬＡＤＨ，１３２単位／ｍｇ ０．２００ジアホ
ラーゼ、３．６単位／ｍｇ ０．２００リポアミド及
びＤＴＰＯ フィルムＡ＝ＬＡＯ，Ｏ、ＤＴＰＯｏ、０フィルムＢ＝
ＬＡ０．０８０ ｇ ； ＤＴＰＯｏ、０フィルムＣ＝
ＬＡ０．０５０ｇ； ＤＴＰＯｏ、０１０ｇ フィルムＤ＝ＬＡ０．０５０ ｇ ： ＤＴＰＯｏ、０２０ｇ フィルムＤ＝ＬＡ０．０５０ ｇ ； ＤＴＰＯｏ、０３０ｇ ＭＥＳ＝２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン 湿潤厚１００μで注型 第３層：カルポジイミド Ｏ，ｌ ２５オ
リンｌ０Ｇ（４％） ０．２５０水
９．６２５カルボジイミド＝
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド 湿潤厚２４μで注型 第１層の成分をフラスコ中で与えられた順序で４０〜４
５°Ｃで混合し、少なくとも１５分攪拌した。次いで、
溶液を脱気し、ＰＥＴフィルム基材〔アグファーゲベー
ルト・アクチェン・ゲゼルシャフト（Ａｇｆａ−Ｇｅｖ
ａｅｒｔ Ａ、 Ｇ、） 、西ドイツ国しバークゼン〕
上に湿潤厚１００μで被覆した。フィルムを４０°Ｃの
乾燥器で乾燥した。同様に、第２溶液を混合し、脱気し
、湿潤厚ｌＯＯμで第１層上に被覆した。次いで、フィ
ルムを４０゛Ｃの乾燥器で乾燥した。第３層は、次に、
試料をフィルムの表面から除去することを可能にするゼ
ラチンを架橋する。フィルムをストリップに切断し、次
に、グルコース試料と１５秒反応させた。その表面から
試料を除去した後、ストリップを分析のためマクベス（
Ｍａｃｂｅｔｈ） １５００／プラス・クイック・キー
・カラー（Ｐｌｕｓ Ｑｕｉｃｋ Ｋｅｙ Ｃｏ１ｏｒ
）分光光度計〔コルモーガン・コーポレーション（Ｋｏ
ｌｌｉｏｒｇａｎ Ｃｏｒｐ、）、アメリカ合衆国ニュ
ーヨーク州ニューバーグ）に載せた。
マクベス分光光度計は、１６の異なる波長で反応したス
トリップの反射データを集める。これらのデータを次に
各ストリップについて三次元カラースペース座標に変換
する。次いで、各色をカラースペース座標Ｌ９、ａｏ及
びｂ＊で表すことができる。ＣＩＥＬＡＢカラースペー
スじカラー・イン・ビジネス、サイエンス・アンド・イ
ンダストリ４ （ｃｏｌｏｒ ｉｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ
、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｙ）”、
第三版、シュド（Ｊｕｄｄ）及びワイゼキイ（Ｗｙｓｚ
ｅｃｋｉ） （１９７５） 、３２０頁〕における二つ
の色の距離は、下記の式： 〔式中Ｌ ”１％ ａ”ｌ及びｂｅｌは試料１のカラー
座標であり、Ｌ１□、ａ“２及びｂ０□は試料２のカラ
ー座標である。〕で表される。したがって、ΔＥの値が
大きくなる程、２つの色の差は大きくなる。
トリップの反射データを集める。これらのデータを次に
各ストリップについて三次元カラースペース座標に変換
する。次いで、各色をカラースペース座標Ｌ９、ａｏ及
びｂ＊で表すことができる。ＣＩＥＬＡＢカラースペー
スじカラー・イン・ビジネス、サイエンス・アンド・イ
ンダストリ４ （ｃｏｌｏｒ ｉｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ
、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｙ）”、
第三版、シュド（Ｊｕｄｄ）及びワイゼキイ（Ｗｙｓｚ
ｅｃｋｉ） （１９７５） 、３２０頁〕における二つ
の色の距離は、下記の式： 〔式中Ｌ ”１％ ａ”ｌ及びｂｅｌは試料１のカラー
座標であり、Ｌ１□、ａ“２及びｂ０□は試料２のカラ
ー座標である。〕で表される。したがって、ΔＥの値が
大きくなる程、２つの色の差は大きくなる。
−船釣に言って、はとんどの観察者が色の差を区別する
には、少なくとも５単位のΔＥが必要である。しかし、
これは、色及び観察者によって変動する。
には、少なくとも５単位のΔＥが必要である。しかし、
これは、色及び観察者によって変動する。
このΔＥの認識に基づいて、下記の第２表には上記の各
フィルムに関するグルコースレベルの間の色の差を示す
。この表は、最良の目視分解領域をＤＴＰＯ成分の濃度
増加の関数として移動させる方法を示す。リポアミド及
びＬＡＤＨが存在するが、ＤＴＰＯが存在しない場合、
フィルムＢの目視分解の移動はない。したがって、リポ
アミド、ＬＡＤＨ及びＤＴＰＯ：＄ｉ量法を用いて、最
良の目視分解領域を、臨床的グルコース範囲の異なる領
域に移動することができる。これをさらに第７図に示す
。このグラフにおいて、各フィルムに関するスペクトル
反応性曲線を示す。初期ＩＮＴ曲線（フィルムＡ）及び
リポアミド曲線（フィルムＢ）は同様の経路をとること
が判る。ＤＴＰＯをリポアミド及びＬＡＤＨと共に添加
すると、スペクトル曲線の移動が見られる（フィルムＣ
，Ｄ、Ｅ）。
フィルムに関するグルコースレベルの間の色の差を示す
。この表は、最良の目視分解領域をＤＴＰＯ成分の濃度
増加の関数として移動させる方法を示す。リポアミド及
びＬＡＤＨが存在するが、ＤＴＰＯが存在しない場合、
フィルムＢの目視分解の移動はない。したがって、リポ
アミド、ＬＡＤＨ及びＤＴＰＯ：＄ｉ量法を用いて、最
良の目視分解領域を、臨床的グルコース範囲の異なる領
域に移動することができる。これをさらに第７図に示す
。このグラフにおいて、各フィルムに関するスペクトル
反応性曲線を示す。初期ＩＮＴ曲線（フィルムＡ）及び
リポアミド曲線（フィルムＢ）は同様の経路をとること
が判る。ＤＴＰＯをリポアミド及びＬＡＤＨと共に添加
すると、スペクトル曲線の移動が見られる（フィルムＣ
，Ｄ、Ｅ）。
さらに、この系は不可逆性になった。このｍｕ化学法は
、初期反応の一つにおいてＮＡＤＨを生成する他の被分
析物に適用することができる。
、初期反応の一つにおいてＮＡＤＨを生成する他の被分
析物に適用することができる。
第２表
フィルムの比較
グルコース ΔＥのグルコースレベルレベル
フィルム １１しｅ屹ル −八 −旦 」−ｐ−−旦０〜２０
■」 幻しユ ６．０ ５．０ ４．
６２０〜４０ 」Ｊ 皿 ３．５ ２．９
２．９４０〜７０ 記 ９．４ ６．４
４．９ ５．１７０〜１１０ ６．４
７．４ ７．６ ５．０ １．６１１０〜１
４０ ５．０ ５．９ 刊、９ ３．９
３．１１４０〜１８０ ３．０ ３．３
ｕ ３．５ ３．６１８０〜２５０
５．６ ４．９ １２６ ７．９ ６．８２５
０〜３２５ ４．３ ２．６ ５．１ １
３．９ ５．２３２５〜４００ ６．０
１．６ ２．９ 月しユ Ｌし１４００〜６００
２．０ ２．７ ０．９ ９．９ １４
．１６００〜８００ １．５ １．５ ０
．３ ４．５ ７．２下線を付けたΔＥは、最適目
視分解を示す。
フィルム １１しｅ屹ル −八 −旦 」−ｐ−−旦０〜２０
■」 幻しユ ６．０ ５．０ ４．
６２０〜４０ 」Ｊ 皿 ３．５ ２．９
２．９４０〜７０ 記 ９．４ ６．４
４．９ ５．１７０〜１１０ ６．４
７．４ ７．６ ５．０ １．６１１０〜１
４０ ５．０ ５．９ 刊、９ ３．９
３．１１４０〜１８０ ３．０ ３．３
ｕ ３．５ ３．６１８０〜２５０
５．６ ４．９ １２６ ７．９ ６．８２５
０〜３２５ ４．３ ２．６ ５．１ １
３．９ ５．２３２５〜４００ ６．０
１．６ ２．９ 月しユ Ｌし１４００〜６００
２．０ ２．７ ０．９ ９．９ １４
．１６００〜８００ １．５ １．５ ０
．３ ４．５ ７．２下線を付けたΔＥは、最適目
視分解を示す。
本発明を具体的に説明し、上記の実施例について記載し
た。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく本発明の
変形及び変更を他に多数行いうることは明らかである。
た。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく本発明の
変形及び変更を他に多数行いうることは明らかである。
第１図は本発明の自己表示原理を説明するグラフ、第２
図は本発明の改良された分解原理を説明するグラフ、第
３図は自己表示の従来の反応速度法の原理を説明するグ
ラフ、第４図は実施例にさらに詳述した本発明に有用な
特定の減量反応の直線性を示すグラフ、第５図及び第６
図は実施例にさらに詳述した特定の減量反応における不
可逆性の効果を示すグラフ、第７図は発色試薬ストリ・
ンブの目視分解に対する本発明の減量反応の効果の研究
結果を示すグラフである。 減量反応の直線性 ０．１ ０゜２ ０．３ ０．４ ０．５ ピルビン酸塩濃度（ｐｍｏｌ／分析） ５゜ １ｏ○ 時間（秒）
図は本発明の改良された分解原理を説明するグラフ、第
３図は自己表示の従来の反応速度法の原理を説明するグ
ラフ、第４図は実施例にさらに詳述した本発明に有用な
特定の減量反応の直線性を示すグラフ、第５図及び第６
図は実施例にさらに詳述した特定の減量反応における不
可逆性の効果を示すグラフ、第７図は発色試薬ストリ・
ンブの目視分解に対する本発明の減量反応の効果の研究
結果を示すグラフである。 減量反応の直線性 ０．１ ０゜２ ０．３ ０．４ ０．５ ピルビン酸塩濃度（ｐｍｏｌ／分析） ５゜ １ｏ○ 時間（秒）
Claims (64)
- （１）指示薬の応答を測定することによって試験試料中
の所定濃度の被分析物の存在を測定する分析方法におい
て、 （ａ）試験試料と共に形成した反応混合物中の被分析物
が調節共反応体との酵素触媒反応に関与して、実質的な
指示薬応答を示さず、前記指示薬応答又はその発生を実
質的に妨害しない生成物を形成する減量酵素反応を行い
、その際、反応混合物中に存在する前記の調節共反応体
の初期量を、前記減量反応によって所定量の被分析物を
消費するのに化学量論的に充分なものとし、 （ｂ）その後、減量反応後に試験試料中に残留する被分
析物と指示薬反応を行って、前記の検出可能な指示薬応
答を示す生成物を形成させ、その際減量反応に消費され
る被分析物の前記の所定量を、波分析物が試験試料中に
前記の所定濃度以上で存在しない限り、前記の検出可能
な指示薬応答の発生を防止するのに充分なものとし、 （ｃ）前記の指示薬反応が前記の検出可能な指示薬応答
を生じるか否かを測定する 工程を含む被分析物の存在を測定する分析方法。 - （２）前記の減量反応が本質的に不可逆的である請求項
１記載の方法。 - （３）減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析物に対
して本質的に特異的である請求項１記載の方法。 - （４）被分析物が試験試料中の測定すべき主物質の反応
によって形成される中間生成物である請求項１記載の方
法。 - （５）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨ、Ｎ
ＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＦＡＤ、ＦＭＮ、グリセリン又は過
酸化水素である請求項４記載の方法。 - （６）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨであ
り、前記の減量反応が乳酸デヒドロゲナーゼの存在でＮ
ＡＤＨと調節共反応体としてのピルビン酸塩とが反応し
てＮＡＤと乳酸塩を生成する反応及び乳酸オキシダーゼ
の存在で酸素と乳酸塩とが反応して酢酸塩と二酸化炭素
を生成する反応を含む請求項４記載の方法。 - （７）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨであ
り、前記の減量反応がグルタル酸デヒドロゲナーゼの存
在でＮＡＤＨと調節共反応体としてのα−ケトグルタル
酸塩及びアンモニアとが反応してグルタミン酸塩を生成
する反応及びグルタミン酸デカルボキシラーゼの存在で
グルタミン酸塩が反応してアミノ酪酸塩及び二酸化炭素
を生成する反応を含む請求項４記載の方法。 - （８）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨであ
り、前記の減量反応がリポアミドデヒドロゲナーゼの存
在でＮＡＤＨとリポアミド（酸化型）とが反応してＮＡ
Ｄ及びリポアミド（還元型）を生成する反応及びリポア
ミド（還元型）とジスルフィド受容体とが反応してリポ
アミド（酸化型）及び還元された受容体を生成する反応
を含む請求項４記載の方法。 - （９）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨであ
り、前記の減量反応がα−グリセリンリン酸デヒドロゲ
ナーゼの存在でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンリン酸
とが反応してＮＡＤ及びα−グリセリンリン酸を生成す
る反応及び酸性又はアルカリ性ホスファターゼの存在で
α−グリセリンリン酸と水とが反応してグリセリン及び
無機リン酸塩を生成する反応を含む請求項４記載の方法
。 - （１０）減量反応及び指示薬反応に関与する物質を試験
試料と実質的に同時に接触させ、その際減量反応が、顕
著な指示薬反応が起こる前に前記所定量の被分析物が減
量反応に消費されるのに充分に迅速である請求項１記載
の方法。 - （１１）試験試料を分析試料列に分割し、反応混合物中
に存在する共反応体の初期量を分析試料列にわたって変
動させる以外は、各分析試料について実質的に同一に工
程（ａ）〜（ｃ）を実施し、これにより所定濃度範囲に
わたって試験試料中の被分析物を検出できるようにする
請求項１記載の方法。 - （１２）指示薬応答が肉眼で検出される発色であり、指
示薬反応は発色生成物を生成するが、減量反応で形成さ
れる生成物は本質的に無色である請求項１記載の方法。 - （１３）指示薬応答が機器で測定される請求項１記載の
方法。 - （１４）指示薬応答が反射率によって測定される可視又
は紫外領域の吸光度の変化である請求項１３の方法。 - （１５）液体試験試料中の、ＮＡＤＨを生成する化学反
応に関与しうる所定濃度の被分析物を分光光度により測
定するため、 （ａ）試験試料の存在で、被分析物が関与してＮＡＤＨ
を生成する前記反応を起こし、 （ｂ）ＬＤＨの存在でＮＡＤＨ及びピルビン酸塩が反応
してＮＡＤ及び乳酸塩を生成する減量酵素反応を実施し
、その際、反応の開始時に存在するピルビン酸塩の量を
、前記所定濃度で試験試料中に存在する測定すべき被分
析物の量に、工程（ａ）で消費される被分析物１モルに
対する生成ＮＡＤＨのモル数の化学量論的比を乗じた量
に等しくし、（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＨが関与する指
示薬反応の生成物の吸光度を測定することによって工程
（ａ）からの反応混合物中にＮＡＤＨが残留するか否か
を測定する 工程を含む被分析物の分光光度測定のための分析方法。 - （１６）残留ＮＡＤＨを３４０ｎｍでの吸光度測定によ
って測定する請求項１５記載の方法。 - （１７）残留ＮＡＤＨを肉眼又は機器で検出される有色
指示薬生成物を生成する酸化還元反応によって測定し、
その際、反応混合物中に存在するＬＤＨの量を、酸化還
元指示薬反応によって色が発生する前に存在するピルビ
ン酸塩が減量反応に実質的に全部消費されるのに充分な
量とする請求項１５記載の方法。 - （１８）減量酵素反応が酸素及び乳酸オキシダーゼの存
在での乳酸塩の本質的に不可逆的酵素変換を含む請求項
１５記載の方法。 - （１９）特定の指示薬応答の測定によって試験試料中の
所定濃度の被分析物の存在を測定するための試験組成物
において、（ｉ）被分析物が調節共反応体との酵素触媒
反応に関与して、実質的な指示薬応答を示さず、かつ前
記指示薬応答又はその生成を実質的に妨害しない生成物
を形成する減量酵素反応を形成する試薬及び（ｉｉ）被
分析物と指示薬反応を行って、前記の検出可能な指示薬
応答を示す生成物を形成させる試薬を含み、その際、減
量反応試薬中に存在する前記の調節共反応体の量が化学
量論的に充分であり、試験試料と試験組成物との接触に
より被分析物と共に行われる減量反応が充分に速くて、
顕著な指示薬反応が起こる前に試験試料中の被分析物の
所定量までが非反応性生成物に変換され、減量反応にお
いて非反応性生成物に変換される被分析物の前記所定量
が、被分析物が試験試料中に前記の所定濃度以上に存在
しない限り、前記の検出可能な指示薬応答の発生を防止
するのに充分なものである被分析物の存在を測定する試
験組成物。 - （２０）前記の減量反応が本質的に不可逆的である請求
項１９記載の試験組成物。 - （２１）減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析物に
対して本質的に特異的である請求項１９記載の試験組成
物。 - （２２）被分析物が試験試料中の測定すべき主物質の反
応によって形成される中間生成物である請求項１９記載
の試験組成物。 - （２３）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨ、
ＮＡＤＰＨ、グリセリン、ＡＴＰ又は過酸化水素である
請求項２２記載の試験組成物。 - （２４）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応が乳酸デヒドロゲナーゼの存在で
ＮＡＤＨと調節共反応体としてのピルビン酸塩とが反応
してＮＡＤと乳酸塩を生成する反応及び乳酸オキシダー
ゼの存在で酸素と乳酸塩とが反応して酢酸塩と二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項２２記載の試験組成物。 - （２５）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がグルタル酸デヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨと調節共反応体としてのα−ケトグルタ
ル酸塩及びアンモニアとが反応してグルタミン酸塩を生
成する反応及びグルタミン酸デカルボキシラーゼの存在
でグルタミン酸塩が反応してアミノ酪酸塩及び二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項２２記載の試験組成物。 - （２６）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がリポアミドデヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨとリポアミド（酸化型）とが反応してＮ
ＡＤ及びリポアミド（還元型）を生成する反応及びリポ
アミド（還元型）とジスルフィド受容体とが反応してリ
ポアミド（酸化型）及び還元された受容体を生成する反
応を含む請求項２２記載の試験組成物。 - （２７）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がα−グリセリンリン酸デヒドロ
ゲナーゼの存在でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンリン
酸とが反応してＮＡＤ及びα−グリセリンリン酸を生成
する反応及び酸性又はアルカリ性ホスファターゼの存在
でα−グリセリンリン酸と水とが反応してグリセリン及
び無機リン酸塩を生成する反応を含む請求項２２記載の
試験組成物。 - （２８）指示薬応答が肉眼で検出される発色であり、指
示薬反応は有色生成物を生成するが、減量反応で形成さ
れる生成物は本質的に無色である請求項２２記載の試験
組成物。 - （２９）指示薬応答が機器で測定可能である請求項１９
記載の試験組成物。 - （３０）指示薬応答が反射率によって測定される可視又
は紫外領域の吸光度の変化である請求項２９の試験組成
物。 - （３１）［１］請求項１９記載の試験組成物及び［２］
前記試験組成物を混入した担体材料を含む、試験試料中
の所定濃度の被分析物の存在を測定する試験具。 - （３２）担体材料に減量反応試薬と指示薬反応試薬との
混合物が混入されている請求項３１記載の試験具。 - （３３）担体材料が、それぞれ減量反応試薬と指示薬反
応試薬とを混入した別個の帯域を有する請求項３１記載
の試験具。 - （３４）［１］支持体材料、［２］支持体材料に結合し
た複数の担体材料及び［３］各担体材料に混入される前
記共反応体の量が変動し、これにより試験試料中の被分
析物を所定の濃度範囲にわたって測定しうる各担体材料
に混入した請求項１９記載の試験組成物を含む、試験試
料中の所定濃度の被分析物の存在を測定する試験具。 - （３５）試験試料中の選択された濃度範囲内の被分析物
を測定するため、前記の選択された問題の濃度範囲内の
被分析物から発生する応答の過飽和による準最適分解能
を生じる応答発生指示薬反応を使用する分析方法におい
て、減量反応が試験試料からの所定量の被分析物を消費
するが、実質的に指示薬応答を示さない生成物を形成す
るのに充分な程度に前記指示薬反応が進行する前に試験
試料を含む反応混合物中で減量反応を実施し、減量反応
に消費される前記所定量の被分析物を、所定の指示薬応
答が指示薬反応によって発生する被分析物の閾値濃度を
指示薬の応答の分解が所定の被分析物濃度範囲にわたっ
て最適である点に移動させるのに充分とすることから成
る改良分析方法。 - （３６）指示薬応答が肉眼で検出される発色であり、所
定の指示薬応答が検出可能な発色である請求項３５記載
の方法。 - （３７）指示薬応答が機器で測定される請求項３５記載
の方法。 - （３８）指示薬応答が反射率によって測定される可視又
は紫外領域の吸光度の変化である請求項３７の方法。 - （３９）被分析物が調節共反応体との酵素触媒反応に関
与し、その際、反応混合物中に存在する前記の調節共反
応体の初期量を、減量反応によって所定量の被分析物を
消費するのに化学量論的に充分なものとする請求項３５
記載の方法。 - （４０）前記の減量反応が本質的に不可逆的である請求
項３９記載の方法。 - （４１）減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析物に
対して本質的に特異的である請求項３９記載の方法。 - （４２）被分析物が試験試料中の測定すべき主物質の反
応によって形成される中間生成物である請求項３９記載
の方法。 - （４３）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨ、
ＮＡＤＰＨ、グリセリン、ＡＴＰ又は過酸化水素である
請求項４２記載の方法。 - （４４）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応が乳酸デヒドロゲナーゼの存在で
ＮＡＤＨと調節共反応体としてのピルビン酸塩とが反応
してＮＡＤと乳酸塩を生成する反応及び乳酸オキシダー
ゼの存在で酸素と乳酸塩とが反応して酢酸塩と二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項４２記載の方法。 - （４５）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がグルタル酸デヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨと調節共反応体としてのα−ケトグルタ
ル酸塩及びアンモニアとが反応してグルタミン酸塩を生
成する反応及びグルタミン酸デカルボキシラーゼの存在
でグルタミン酸塩が反応してアミノ酪酸塩及び二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項４２記載の方法。 - （４６）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がリポアミドデヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨとリポアミド（酸化型）とが反応してＮ
ＡＤ及びリポアミド（還元型）を生成する反応及びリポ
アミド（還元型）とジスルフィド受容体とが反応してリ
ポアミド（酸化型）及び還元された受容体を生成する反
応を含む請求項４２記載の方法。 - （４７）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がα−グリセリンリン酸デヒドロ
ゲナーゼの存在でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンリン
酸とが反応してＮＡＤ及びα−グリセリンリン酸を生成
する反応及び酸性又はアルカリ性ホスファターゼの存在
でα−グリセリンリン酸と水とが反応してグリセリン及
び無機リン酸塩を生成する反応を含む請求項４２記載の
方法。 - （４８）減量反応及び指示薬反応に関与する物質を試験
試料と実質的に同時に接触させ、その際減量反応が、顕
著な指示薬反応が起こる前に前記所定量の被分析物が減
量反応に消費されるのに充分に迅速である請求項３９記
載の方法。 - （４９）選択された問題の濃度範囲内の被分析物から発
生する応答の過飽和による準最適分解能を生じる応答発
生指示薬反応の試薬を含む、試験試料中の選択された濃
度範囲内の被分析物を測定する試験組成物において、試
験試料からの所定量の被分析物を消費するが、本質的に
無色の生成物を形成する減量反応の試薬を含み、減量反
応に消費される前記所定量の被分析物が、肉眼で見える
色が指示薬反応によって発生する被分析物の閾値濃度を
色の分解が選択された被分析物濃度範囲にわたって最適
である点に移動させるのに充分とすることから成る改良
試験組成物。 - （５０）指示薬応答が肉眼で検出される発色であり、所
定の指示薬応答が検出可能な発色である請求項４９記載
の試験組成物。 - （５１）指示薬応答が機器で測定される請求項４９記載
の試験組成物。 - （５２）指示薬応答が反射率によって測定される可視又
は紫外領域の吸光度の変化である請求項４９記載の試験
組成物。 - （５３）被分析物が調節共反応体との酵素触媒反応に関
与し、その際、試験組成物中に存在する前記の調節共反
応体の初期量が、減量反応によって所定量の被分析物を
消費するのに化学量論的に充分である請求項４９記載の
試験組成物。 - （５４）前記の減量反応が本質的に不可逆的である請求
項５３記載の試験組成物。 - （５５）減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析物に
対して本質的に特異的である請求項５３記載の試験組成
物。 - （５６）被分析物が試験試料中の測定すべき主物質の反
応によって形成される中間生成物である請求項５３記載
の試験組成物。 - （５７）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨ、
ＮＡＤＰＨ、グリセリン、ＡＴＰ又は過酸化水素である
請求項５６記載の試験組成物。 - （５８）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応が乳酸デヒドロゲナーゼの存在で
ＮＡＤＨと調節共反応体としてのピルビン酸塩とが反応
してＮＡＤと乳酸塩を生成する反応及び乳酸オキシダー
ゼの存在で酸素と乳酸塩とが反応して酢酸塩と二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項５６記載の試験組成物。 - （５９）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がグルタル酸デヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨと調節共反応体としてのα−ケトグルタ
ル酸塩及びアンモニアとが反応してグルタミン酸塩を生
成する反応及びグルタミン酸デカルボキシラーゼの存在
でグルタミン酸塩が反応してアミノ酪酸塩及び二酸化炭
素を生成する反応を含む請求項５６記載の試験組成物。 - （６０）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がリポアミドデヒドロゲナーゼの
存在でＮＡＤＨとリポアミド（酸化型）とが反応してＮ
ＡＤ及びリポアミド（還元型）を生成する反応及びリポ
アミド（還元型）とジスルフィド受容体とが反応してリ
ポアミド（酸化型）及び還元された受容体を生成する反
応を含む請求項５６記載の試験組成物。 - （６１）中間生成物として生じる被分析物がＮＡＤＨで
あり、前記の減量反応がα−グリセリンリン酸デヒドロ
ゲナーゼの存在でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンリン
酸とが反応してＮＡＤ及びα−グリセリンリン酸を生成
する反応及び酸性又はアルカリ性ホスファターゼの存在
でα−グリセリンリン酸と水とが反応してグリセリン及
び無機リン酸塩を生成する反応を含む請求項６０記載の
試験組成物。 - （６２）［１］請求項４９記載の試験組成物及び［２］
前記試験組成物を混入した担体材料を含む、試験試料中
の選択された濃度範囲の被分析物の存在を測定する試験
具。 - （６３）担体材料に減量反応試薬と指示薬反応試薬との
混合物が混入されている請求項６２記載の試験具。 - （６４）担体材料が、それぞれ減量反応試薬と指示薬反
応試薬とを混入した別個の帯域を有する請求項６２記載
の試験具。
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| US15422588A | 1988-02-10 | 1988-02-10 | |
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