MXPA02009469A - Reactivos y metodos para detectar un cofactor reducido. - Google Patents

Abstract

Se proveen sistemas de produccion de se+- al, composiciones de reactivo, tiras de prueba y equipos de los mismos, como tambien metodos para su uso en la deteccion de un analito en una muestra; los sistemas de produccion de se+- al en cuestion se caracterizan por tener al menos un primer y segundo agentes de transferencia de electrones y un indicador de redox, en donde en muchas modalidades preferidas los sistemas incluyen un agente de transferencia de electrones proteinaceo y no proteinaceo, por ejemplo, un compuesto de fenazina y una diaforasa; en muchas modalidades preferidas, los sistemas y equipos en cuestion ademas incluyen al menos uno de y con frecuencia ambos cofactores de enzima y una enzima que tiene una actividad de oxidacion de analito, por ejemplo, un analito deshidrogenasa; los sistemas, composiciones de reactivos, tiras de prueba y equipos en cuestion encuentran uso en la deteccion de una amplia variedad de analitos en una muestra, tal como una muestra fisiologica, por ejemplo, sangre o una fraccion de la misma.

Description

REACTIVOS Y MÉTODOS PARA DETECTAR UN COFACTOR REDUCIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de esta invención es la detección de analitos, particularmente sistemas de reactivos para utilizarse en la detección de anaiitos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección de analitos en fluidos fisiológicos, por ejemplo, sangre o productos derivados de la sangre, es de una importancia cada vez mayor para la sociedad actual. Las pruebas de detección de analitos encuentran utilidad en una variedad de aplicaciones, incluyendo los análisis clínicos de laboratorio, análisis caseros, etc., en donde los resultados de dichos análisis juegan un papel importante en el diagnóstico y manejo de una variedad de condiciones. Los analitos de interés incluyen, alcohol, formaldehído, glucosa, ácido glutámico, glicerol, beta-hidroxibutirato, L-lactato, leucina, ácido málico, ácido pirúvico, esferoides, etc. En respuesta a esta importancia creciente de la detección de analitos, una variedad de protocolos de detección de analitos y dispositivos tanto para uso clínico como en casa se han desarrollado. Muchos de los protocolos y dispositivos que se han desarrollado hasta la fecha emplean un sistema de producción de señales para identificar la presencia del analito interés en una muestra fisiológica, tal como sangre. Un tipo de sistema de producción de señal que encuentra uso en la detección de una variedad de diferentes analitos es uno en el cual una deshidrogenasa oxida el analito de interés y reduce de manera concomitante un cofactor de enzima, tal como NAD(P)+. La forma reducida del cofactor por ejemplo, NAD(P)H, entonces se detecta a través de una reacción subsecuente con un agente de oxidación del cofactor, por ejemplo, metosulfato de fenazina o una diaforasa, que transfiere un electrón a un indicador de redox, tal como una sal de tetrazolio, para producir un producto detectable. Aunque una variedad de dichos sistemas de producción de señal se han desarrollado hasta la fecha para utilizarse en la detección de una amplia variedad de diferentes analitos, continúa habiendo una necesidad de un desarrollo adicional para dichos sistemas. Por ejemplo, un sistema para producción de señal que provea una velocidad de reacción mejorada y un costo disminuido sería de mayor interés.

LITERATURA RELEVANTE La patentes de E.U.A. de interés incluyen 4,629,697; 5,126,247 y 5,902,731. Véase también Raap et al., Histochem. J. (1983) 15:881-893.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los sistemas de producción de señal, composiciones de reactivo, tiras de prueba y equipos de los mismos, como también métodos para su uso en la detección de un analito en una muestra, se proveen. Los sistemas de producción de señal en cuestión se caracterizan por tener al menos un primer y segundo agentes de transferencia de electrones y un indicador de redox, en donde en muchas modalidades preferidas los sistemas incluyen un agente de transferencia de electrones proteináceo y no proteináceo, por ejemplo un compuesto de fenazina y una diaforasa. En muchas modalidades preferidas, los sistemas y equipos en cuestión además incluyen tanto un cofactor de enzima como una enzima que tiene una actividad de oxidación de analito, por ejemplo, un analito deshidrogenasa. Los sistemas, composiciones de reactivos, tiras de pruebas y equipos en cuestión encuentran uso en la detección de una amplia variedad de analitos en una muestra, tal como una muestra fisiológica, por ejemplo sangre o una fracción de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 provee una representación gráfica de la velocidad de reacción observada en una tira de prueba de conformidad con la invención en cuestión contra la velocidad de reacción esperada teórica para una tira de prueba que incluye tanto PMS como una diaforasa, claramente demostrando que el uso de agentes de transferencia de electrones tanto no-proteináceos como proteináceos, por ejemplo, PMS y una diaforasa, provee un incremento no esperado en la velocidad de reacción.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS Se proveen los sistemas de producción de señal, composiciones de reactivo, tiras de prueba y equipos de los mismos, como también métodos para su uso en la detección de una analito en una muestra. Los sistemas de producción de señal en cuestión se caracterizan por tener al menos un primer y segundo agentes de transferencia de electrones y un indicador de redox, en donde en muchas modalidades preferidas los sistemas incluyen un agente de transferencia de electrones proteináceo y no-proteináceo, por ejemplo, un compuesto de fenazina y una diaforasa. En muchas modalidades preferidas, los sistemas y equipos en cuestión además incluyen tanto un cofactor de enzima como un enzima que tiene una actividad de oxidación del analito, por ejemplo, un analito deshidrogenasa. Los sistemas, composiciones de reactivo, tiras de prueba y equipos en cuestión encuentran uso en la detección de una amplia variedad de analitos en una muestra, tal como una muestra fisiológica, por ejemplo sangre o una fracción de la misma. Antes de que se describa adicionalmente la invención en cuestión, debe entenderse que la invención no se limita a las modalidades particulares de la invención descritas a continuación, ya que variaciones de las modalidades particulares pueden elaborarse y aún entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. También debe entenderse que la terminología empleada tiene el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitativa. Más bien, el alcance de la presente invención se establecerá mediante las reivindicaciones anexas. En esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las referencias singulares incluyen el plural, a menos que ei contexto lo indique claramente de otra manera. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por los expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención.

Sistemas para producción de señal Como se definió anteriormente, la invención de cuestión provee un sistema de producción de señal que es capaz de detectar la presencia de un cofactor de enzima reducido en una muestra. Sistema de producción de señal significa una recolección de dos o más compuestos o moléculas que son capaces de actuar en concierto, cuando se combinan, para producir una señal detectable que es indicativa de la presencia de, y con frecuencia la cantidad de, un analito particular en una muestra dada. El término sistema de producción de señal se utiliza ampliamente para abarcar tanto una mezcla de todos los constituyentes de reactivo del sistema de producción de señal como también un sistema en el cual una o más de los constituyentes de reactivos se separan del resto de los constituyentes de reactivo, por ejemplo, como está presente en un equipo. Una característica desde los sistemas de producción de señal en cuestión es la presencia de dos agentes de transferencia de electrones diferentes. Por agente de transferencia de electrones se entiende un compuesto o molécula que puede transferir un electrón, en forma de un ion de hidruro, a partir de un cofactor de enzima reducido a un indicador de redox. En los sistemas de producción de señal en cuestión, el primero de ios agentes de transferencia de electrones diferentes es una molécula de bajo peso molecular, mientras que el segundo agente de transferencia de electrón es una molécula de alto peso molecular. En esta especificación, bajo peso molecular significa un peso molecular que no excede alrededor de 2000 daltons, generalmente alrededor de 1000 daltons y en muchas modalidades alrededor de 500 daltons. Alto peso molecular significa un peso molecular de alrededor de 5000 daltons y en muchas modalidades 10,000 ó 20,000 daltons o mayor. El peso molecular del agente de transferencia de electrones de alto peso molecular con frecuencia no excederá alrededor de 100,000 daltons. En muchas modalidades, el agente de transferencia de electrones de bajo peso molecular es un compuesto no-proteináceo mientras que el agente de transferencia de electrones de alto peso molecular es un compuesto proteináceo. Proteináceo quiere decir un polipéptido o mimético polimérico del mismo.

Una variedad de agentes de transferencia de electrones no proteináceos de bajo peso molecular es de interés. Estos agentes incluyen: flavinas tales como riboflavina (RBF), aloxazina (ALL) y lumicromo (LC); fenazinas tales como fenazina, metosulfato de fenazina (PMS), etosulfato de fenazina, metosulfato de metoxifenazina y safranina; metil-1 ,4-naftol (menadiona), fenotiazinas tales como PT y su catión radical, PT+, tionina (TH), azul celeste A (AA), azul celeste B (AB), azul celeste C (AC), azul metileno (MB), verde metileno (MG) y azul toluidina (TOL); fenoxazinas tales como fenoxazina (POA), azul básico 3 (BB3), y azul cresilo brillante ALD (BCBA), cloruro de benzo-a-fenazoxonio (azul de Medola); Indofenoles tales como indofenol de 2,6-diciorofenol (DCIP); e Indaminas tales como verde de Bindschedler y azul de fenileno; y similares. De interés particular en muchas modalidades son los compuestos de fenazina, por ejemplo PMS, etosulfato de fenazina, metosulfato de metoxifenazina y safranina, en donde PMS es el agente de transferencia de electrones no-proteináceo de bajo peso molecular en muchas modalidades. En muchas modalidades, el agente de transferencia de electrones proteináceo de alto peso molecular es una enzima que es capaz de oxidar un cofactor reducido, por ejemplo, NAD(P)H, y reducir de manera concomitante un indicador de redox. En muchas modalidades, esta enzima de transferencia de electrones es una diaforasa, tal como lipoic deshidrogenasa, ferredoxin-NADP reductasa, lipoamida deshidrogenasa, NADPH deshidrogenasa etc. Una variedad de diaforasas están disponibles y pueden emplearse, en donde las diaforasas se encuentran comercialmente disponibles de manera representativa que pueden estar presentes en ios sistemas de producción de señales en cuestión que incluyen bacilius diaforasa, clostridium diaforasa, vibrio diaforasa, porcino diaforasa, y similares. En los sistemas de producción de señales en cuestión, la relación del primer al segundo agente de transferencia de electrones se elige para proveer una velocidad de reacción acelerada en comparación con un control, por ejemplo, un sistema de producción de señal comparable con un agente de transferencia de electrones individual, por ejemplo, únicamente PMS o una diaforasa. Típicamente la relación del primer y el segundo agente de transferencia de electrones en los sistemas en cuestión oscila de alrededor de 0.001 a 10, generalmente de alrededor de 0.01 a 1.0 y más preferiblemente de 0.05 a 0.5 (nmoles/U), respectivamente. Además del primer y segundo agentes de transferencia de electrones antes descritos, los sistemas de producción de señal en cuestión también incluyen un indicador de redox. Indicador de redox quiere decir un compuesto que es capaz de ser reducido mediante los agentes de transferencia de electrones para producir un producto detectable, por ejemplo, producto cromogénico. En donde el indicador de redox produce un producto cromogénico, es decir el indicador de redox es un cromogen, los cromogenes adecuados pueden ser cualquier compuesto capaz de cambiar de color al momento de la reducción por uno o más electrones, en donde los cromogenes adecuados generalmente son los que aceptan electrones de los agentes de transferencia de electrones descritos anteriormente. Una variedad de compuestos indicadores de redox diferentes son de interés. Los compuestos de interés incluyen: oxazinas, tiazinas, y sales de tetrazolio. De particular interés en muchas modalidades son las sales de tetrazolio que con capaces de aceptar el hidruro capturado de los agentes de transferencia de electrones para formar un producto de formazan de color. En muchas modalidades, estas sales tienen la característica ventajosa de ser de color amarillo débil en la forma oxidada, pero se tornan a color visible brillante al momento de la reducción de electrones y conversión a colorantes de formazan. Los compuestos o sales de tetrazolio que son de interés particular incluyen: 2-(2' benzotiazolil)-5-stiril-3-(4'-ftalhidrazid¡l)tetrazolio(BSPT); 2-benzotiazolil-(2)-3,5-difenil tetrazolio (BTDP); 2,3-di(4-nitrofenil)tetrazolio (DNP); 2,5-difenil-3-(4-estirilfen¡l)tetrazolio (DPSP); distirii nitroazul tetrazolio (DS-NBT); 3,3'-[3,3'-dimetoxi-(1.l'-bifenilH^'-diilj-bisp^-nitrofeni -d-feni -2H tetrazolio (NBT); 3-(4,5-dimetil-2-t¡azolil)-2,5-d¡fenil-2H tetrazolio (MTT); 2-fenil-3-(4-carboxifenil)-5-metil tetrazolio (PCPM); azul tetrazolio (TB); tiocarbamil nitroazul tetrazolio (TCNBT); tetranitroazul tetrazolio (TNBT); violeta tetrazolio (TV); 2-benzotiazotiazolil-3-(4-carboxi-2-metoxifenil)-5-[4-(2-sulfoetilcarbamoil)fenil]-2H-tetrazolio (WST-4); 2,2'-dibenzotiazolil-5,5,-bis[4-di(2-sulfoetil)carbamoilfenil]-3,3'-(3,3'-dimetoxi-4)4'-bifenileno)ditetrazolio, sal disódica (WST-5); cloruro de 2-(p-nitrofenil)-3-(p-iodofeniI)-5-feniItetrazolio (I NT), y similares. WST-5 es preferido en muchas modalidades ya que se disuelve rápidamente en un medio acuoso, que es más compatible con muestras biológicas. Además, el compuesto de formazan resultante presenta una gran absorción espectral en la región púrpura-azul, reduciendo así la necesidad de corregir ia señal antecedente de la hemoglobina. Otras sales de tetrazolio útiles se describen en la patente de E.U.A. Nos. 4,490,465; 4,491 ,631; 4,598,042; 4,351 ,899; 4,271 ,265; 4,247,633; 4,223,090; 4,215,917; 4,142,938; 4,024,021 ; 3,867,259; 3,867,257; 3,791 ,931 ; y 4,254,222; cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia. Los sistemas de producción de señal antes descritos son capaces de detectar la presencia de un cofactor de enzima reducido en una muestra, particularmente una muestra acuosa y más particularmente una muestra fisiológica, por ejemplo, toda la sangre o una fracción o derivado de la misma. Una variedad de diferentes cofactores de enzima reducidos puede detectarse utilizando los sistemas de producción de señal en cuestión, en donde los cofactores de enzima reducidos representativos incluyen las formas reducidas de los siguientes cofactores: dinucleótido de adenina beta-nicotinamida (beta-NAD), fosfato de dinucleótido de adenina beta-nicotinamida (beta-NADP), dinucleótido de adenina tionicotinamida, fosfato de dinucleótido de adenina tionicotinamida, dinucleótido de 1,N6-etenoadenina nicotinamida, fosfato de dinucleótido de 1 ,N6-etenoadenina nicotinamida, y pirrolo-quinoiina quinona (PQQ). Los sistemas de producción de señal en cuestión son adecuados particularmente para utilizarse en la detección de NADH o NAD(P)H.

En muchas aplicaciones en las cuales los sistemas de producción de señal en cuestión encuentran uso, el cofactor de enzima reducido es uno que se produce después de la oxidación de un analito de interés en una muestra. En muchas modalidades, por lo tanto, los sistemas de producción de señal en cuestión también incluyen el cofactor de enzima y una enzima de oxidación de analito que es capaz de oxidar el analito de interés y reducir de manera concomitante el cofactor de enzima. Los cofactores de enzima de interés incluyen aquellos descritos anteriormente, es decir, dinucleótido de adenina beta-nicotinamida (beta-NAD), fosfato de dinucleótido de adenina beta nicotinamida (beta-NADP), dinucleótido de adenina tionicotinamida, fosfato de dinucleótido de adenlna tionicotinamida, dinucleótido de 1 ,N6-etenoadenina nicotinamida, fosfato de dinucieótido de 1,N6-etenoadenina nicotinamida, y pirrolo-quinolina quinona (PQQ). Los cofactores de enzima de interés particular que pueden incluirse en los sistemas de producción de señal en cuestión incluyen: NADH o NAD(P)H. La enzima de oxidación de analito presente en el sistema de producción de señal necesariamente depende de la naturaleza del analito a detectar con el sistema. Las enzimas de oxidación de analito representativas de interés incluyen: alcohol deshidrogenasa para alcohol, formaldehído deshidrogenasa para formaldehído, glucosa deshidrogenasa para glucosa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para glucosa-6-fosfato, glutamato deshidrogenasa para ácido glutámico, glicerol deshidrogenasa para glicerol, beta-hidroxibutirato deshidrogenasa para beta-hidroxibutirato, hidroxiesteroide deshidrogenasa para esteroide, L-lactato deshidrogenada para L-lactato, leucina deshidrogenasa para leucina, malato deshidrogenasa para ácido málico, y piruvato deshidrogenasa para ácido pirúvico. Como puede observarse a partir de ia lista representativa anterior, la enzima de oxidación de analito típicamente es una deshidrogenasa.

Composiciones de reactivo También se provee mediante la invención en cuestión composiciones de reactivo para utilizarse para detectar al menos un cofactor de enzima reducido, y en muchas modalidades un analito, en una muestra. Las composiciones de reactivo pueden ser un fluido, por ejemplo, composiciones acuosas, o secas, en donde en muchas modalidades las composiciones de reactivo son composiciones secas. A un mínimo, las composiciones de reactivo en cuestión son unas que incluyen el primero y segundo agentes de transferencia de electrones y el indicador de redox, en donde estos componentes se describen anteriormente. Dichas composiciones de reactivo son adecuadas para utilizarse en la detección de cofactores de enzima reducidos, por ejemplo, NAD(P)H, en una muestra. En muchas modalidades, sin embargo, las composiciones de reactivo además incluyen un cofactor de enzima y una enzima de oxidación de analito, en donde estos componentes se describieron anteriormente.

Tiras de prueba de reactivo También se provee por medio de la invención en cuestión tiras de prueba de reactivo para utilizarse para detectar la presencia de un analito en una muestra. En particular, la invención provee tiras secas para analizar un anaiito particular en toda la sangre, por ejemplo, en beta-hidroxibutirato, glucosa, etc. En un sentido más amplio, la tira de prueba de reactivo incluye un soporte sólido y una composición de reactivo en seco presente en la misma, en donde la composición de reactivo en seco se elabora de todos los compuestos reactivos necesarios para producir una señal detectable en presencia del analito de interés. En la mayoría de las modalidades de la invención en cuestión, la composición de reactivo en seco presente en la tira de prueba en cuestión es una que incluye los siguientes elementos: una enzima de oxidación de analito, un cofactor de enzima, primero y segundo agentes de transferencia de electrones, y un indicador de redox, en donde cada uno de estos elementos constituyentes se describen con mayor detalle supra. En muchas modalidades, las tiras de prueba en cuestión incluyen una almohadilla de prueba de membrana que se fija a un soporte sólido. El soporte puede ser un plástico- por ejemplo, poliestireno, naylon o poliéster, o una lámina metálica o puede ser cualquier otro material adecuado conocido en la técnica. En muchas modalidades, la almohadilla de prueba preferiblemente comprende un papel secante, tal como un papel de filtro o una membrana de polímero. Relacionada con la almohadilla de prueba, por ejemplo, revestido en almohadilla de prueba, incorporado en la almohadilla prueba etc., se encuentra la composición de reactivo. La tira también puede configurarse en disposiciones más complejas, por ejemplo, en donde la almohadilla de prueba está presente entre el soporte y la capa de superficie, en donde uno o más reactivos empleados en el procesamiento de prueba pueden estar presentes en la capa de superficie. Además, las trayectorias de flujo o canales pueden estar presentes en la tira de prueba, como es bien sabido en la técnica. De interés en muchas modalidades son las configuraciones de tira de prueba que se describen en la patente de E. U. A. No. 5,902,731 , cuya descripción se incorpora en la presente por referencia. Las tiras de prueba en cuestión pueden fabricarse empleando cualquier protocolo conveniente. Un protocolo conveniente es poner en contacto al menos la porción de almohadilla de prueba de la tira con una composición acuosa que incluye todos los elementos de la composición de reactivo que debe relacionarse con la almohadilla de prueba en la tira de prueba de reactivo final. De manera conveniente, la almohadilla de prueba puede sumergirse en la composición acuosa, mantenerse en la misma durante un período suficiente y posteriormente secarse, con lo cual se produce la almohadilla de prueba de la tira de prueba de reactivo que ha relacionado con la misma la composición de reactivo. Como se estableció anteriormente, la composición acuosa incluirá varios elementos de la composición de reactivo a relacionar con la almohadilla de prueba de la tira de prueba de reactivo, en donde varios elementos están presentes en cantidades suficientes para proveer cantidades deseadas en la composición de reactivo que se produce en la almohadilla de prueba. Como tal, la concentración del agente de transferencia de electrones no-proteináceo en la composición acuosa típicamente oscila de alrededor de 1 µM a 1000 µM, generalmente de alrededor de 10 µM a 500 µM; mientras que la concentración del agente de transferencia de electrones proteináceo en la composición acuosa oscila de alrededor de 50 U a 3000 U, generalmente de alrededor de 100 U a 1000 U. La concentración del agente de redox presente en la composición acuosa oscila de alrededor de 3 mM a 36 mM, generalmente de alrededor de 6 mM a 24 mM. Cuando está presente, el cofactor de enzima oscila en concentración de alrededor de 1.5 mM a 28 mM, generalmente de alrededor de 3.5 mM a 14 mM. De igual manera, la enzima del agente de oscilación de analito oscila en concentración de alrededor de 100 U a 2000 U, y generalmente de alrededor de 200 U a 1000 U cuando está presente. Otros componentes que pueden estar presentes en esta composición acuosa empleados para preparar la tira de prueba de reactivo incluyen cloruro de sodio, cloruro de magnesio, Tris, PSSA, Tetronic 1307, Crotein-SPA, sacarosa, ácido oxámico, sal de sodio, y similares. Véase la sección experimental, infra, para una descripción más detallada de un método representativo para preparar las tiras de prueba de reactivo en cuestión.

Métodos de detección de analito Los sistemas de producción de señal descritos anteriormente, las composiciones de reactivo y tiras de prueba encuentran uso en métodos para detectar la presencia de, y con frecuencia la cantidad de, un analito en una muestra. Una variedad de diferentes analitos puede detectarse utilizando los métodos en cuestión, en donde los analitos representativos incluyen aquellos descritos anteriormente, por ejemplo, alcohol, formaldehído, glucosa, ácido glutámico, glicerol, beta-hidroxibutirato, L-lactato, leucina, ácido málico, ácido pirúvico, esteroides, etc. Aunque en principio, los métodos en cuestión pueden utilizarse para determinar la presencia, y con frecuencia la concentración, de un analito en una variedad de diferentes muestras fisiológicas, tales como orina, lágrimas, saliva, y similares, particularmente se ajustan para utilizarse para determinar la concentración de un analito en sangre o fracciones de sangre, por ejemplo, muestras derivadas de sangre, y más particularmente en toda la sangre. Una característica importante de los métodos en cuestión es que el uso de los sistemas de producción de señal en cuestión que incluyen el primero y segundo agentes de transferencia de electrones proveen un tiempo de reacción acelerada en comparación con un sistema de control, por ejemplo, un sistema que incluye un agente de transferencia de electrones individual. Generalmente, la velocidad de reacción se acelera o mejora mediante un factor de 1 a 3 dependiendo de la relación de PMS y diaforasa. Además, la velocidad de reacción es mayor que la velocidad teórica o predicha que puede esperarse con base en la suma de las velocidades provistas mediante los agentes de transferencia de electrones individuales mediante un factor de 1 a 3. En donde la velocidad de reacción se mide en términos de K/S por segundo (véase la sección experimental infra) la K/S por segundo para una reacción en la cual los sistemas de producción de señal en cuestión se emplean típicamente oscila de alrededor de 0.01 a 10, generalmente de alrededor de 0.05 a 5 y más preferiblemente de 0.1 a 2. En los métodos en cuestión, la muestra y el sistema de producción de señal se combinan en una mezcla de reacción, se permite que la reacción proceda durante un período suficiente para generar un indicativo de señal de la presencia de (y con frecuencia de cantidad de) analito en la muestra, y la señal resultante se detecta y se relaciona con la presencia de (y con frecuencia la cantidad de) analito en la muestra. En un sentido más amplio, la mezcla de reacción puede producirse en cualquier entorno conveniente, tal como una probeta u otro medio de contención de fluido. Sin embargo, en muchas modalidades los pasos anteriores se llevan a cabo en una tira de prueba de reactivo como se describió supra. Como tal, los métodos en cuestión ahora se discuten además en términos de métodos en los cuales una tira de prueba de reactivo se emplea. Al practicar los métodos en cuestión, el primer paso es aplicar una cantidad de muestra fisiológica a la tira de prueba, en donde la tira de prueba se describe supra. La cantidad de muestra fisiológica, por ejemplo, sangre, que se aplica a la tira de prueba puede variar, pero generalmente oscila de alrededor de 2 µL a aproximadamente 40 µL, generalmente de alrededor de 5 µL a 20 µL. Debido a la naturaleza de la tira de prueba en cuestión, el tamaño de muestra de sangre que se aplica a la tira de prueba puede ser relativamente chico, oscilando en tamaño de alrededor de 2 µL a 40 µL, generalmente de alrededor de 5 µL a 20 µL. En donde la sangre es la muestra fisiológica, las muestras de sangre de una variedad de diferentes hematocritos puede analizarse con los métodos en cuestión, en donde el hematocrito puede oscilar de alrededor de 20% a 65%, generalmente de alrededor de 25% a 60%. Después de la aplicación de la muestra a la tira de prueba, se permite que la muestra reaccione con los elementos del sistema de producción de señal para producir un producto detectable que esté presente en una cantidad proporcional a la cantidad inicial del analito de interés presente en la muestra. La cantidad de producto detectable, es decir, señal producida mediante el sistema de producción de señal, entonces se determina y se relaciona con la cantidad del analito en la muestra inicial. En ciertas modalidades, se emplean los instrumentos automatizados que realizan la detección antes mencionada y pasos de relación. La reacción descrita anteriormente, detección y pasos relacionados, como también instrumentos para realizar los mismos, se describen adicionalmente en la patente de E.U.A. Nos. 4,734,360; 4,900,666; 4,935,346; 5,059,394; 5,304,468; 5,306,623; 5,418,142; 5,426,032; 5,515,170; 5,526,120; 5,563,042; 5,620,863; 5,753,429; 5,573,452; 5,780,304; 5,789,255; 5,843,691; 5,846,486; 5,902,731; 5,968,836 y 5,972,294; cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia. El paso de relación, la concentración de analito derivada toma en cuenta la contribución constante de reacciones competidoras hacia la señal observada, por ejemplo, al calibrar el instrumento.

Equipos También se provee mediante la invención en cuestión equipos para utilizarse en la práctica de los métodos en cuestión. Los equipos de la invención en cuestión al menos incluyen un sistema de producción de señal como se describió anteriormente, en donde los componentes del sistema de producción de señal pueden combinarse en una sola composición de reactivo o por separado, por ejemplo, presente en contenedores por separado. En ciertas modalidades, el sistema de producción de señal estará presente en los equipos en forma de una tira de prueba de reactivo, como se describió supra. Los equipos en cuestión pueden además incluir un medio para obtener una muestra fisiológica. Por ejemplo, en donde la muestra fisiológica es sangre, los equipos en cuestión además pueden incluir un medio para obtener una muestra de sangre, tal como una lanceta para adherirse a un dedo, medios de activación de lanceta, y similares. Además, los equipos en cuestión pueden incluir una solución de control o estándar, por ejemplo, una solución de control de analito que contenga una concentración estandarizada de analito. En ciertas modalidades, los equipos también incluyen un instrumento automatizado, como se describió anteriormente, para detectar la cantidad de producto producido en la tira después de la aplicación de la muestra y relacionando el producto detectado con la cantidad de analito en la muestra. Finalmente, los equipos pueden además incluir instrucciones para utilizar los componentes del equipo cuestión en la determinación de una concentración de analito en una muestra fisiológica. Estas instrucciones pueden estar presentes en uno o más empaques, inserto de etiqueta, contenedores presentes en los equipos, y similares. Los siguientes ejemplos se ofrecen por medio de ilustración y no por medio de limitación.

EXPERIMENTOS A. Preparación de la tira de prueba de cetona Una membrana de naylon de 0.8 µm obtenida a partir de Cuno (Meridien, CT) se sumergió en el reactivo del cuadro 1 , hasta que se saturó.

CUADRO 1 El reactivo en exceso se remueve raspando con suavidad con una varilla de vidrio. La membrana resultante se cuelga para secarse en un horno a 56°C durante 10 minutos. Porex (0.6 mm de espesor) se sumergió en la solución de nitrito al 5% y posteriormente se dejó secar en un horno a 100°C durante 10 horas. Finalmente, la membrana se laminó entre un material de poliéster (poliéster Melenex® a 0.4 mm de ICI America, Wilmington DE) y el Porex impregnado con nitrito.

B. Pruebas Utilizando el siguiente protocolo, 10 µL de muestras acuosas que comprenden 40 mg/dL (D) ß-hidroxibutirato se analizaron en tiras como se describió anteriormente, en donde las tiras variaron en términos de la cantidad de PMS y/o diaforasa presente en la tira. Una muestra acuosa de 10 ml se aplicó en una tira de prueba preparada recientemente. La tira se insertó en un reflectómetro y se comenzó la adquisición de datos. La relectancia de la tira de lectura se monitoreó a 660 nm a intervalos de un segundo durante dos minutos. A continuación, los datos se cargaron desde el almacenador intermedio de memoria del reflectómetro a una computadora personal por medio de un cable en serie modificado. La velocidad de reacción se calculó con base en la velocidad inicial de cambio en K/S a la escala en donde el perfil de reacción era lineal. Los resultados resumidos en el cuadro 2 fueron promediados de cinco réplicas. En cada ensayo individual, se observó la velocidad de reacción (en términos de K/S por segundo). (K/S es una medida de reflectancia, discutida y definida en USP 4,935,346, col. 14, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia). El cuadro 2 provee los resultados.

CUADRO 2 t Velocidad teórica, es decir, la velocidad predicha con base en la suma de la velocidad de reacción catalizada por la diaforasa y por PMS de manera individual. * La reacción es demasiado rápida y difícil para calcular la velocidad de manera precisa.

C. Velocidad observada contra velocidad teórica El cuadro 3 a continuación provee una comparación de la velocidad observada y la velocidad esperada o teórica para las pruebas antes descritas.

CUADRO 3 La figura 1 provee una gráfica de la velocidad observada contra la velocidad teórica. Como puede observarse mediante la gráfica de la figura 1 , la velocidad de reacción del sistema de producción de señal de la tira de prueba se acelera mediante la presencia de PMS y diaforasa, en donde la magnitud de la aceleración observada es inesperadamente mayor a la cantidad predicha de aceleración con base en la suma de las velocidades de reacción de sistemas que tienen PMS o diaforasa individualmente. Es evidente a partir de los resultados y discusión anteriores que la invención en cuestión provee una mejora importante e inesperada en la velocidad de reacción observada en un protocolo de detección de analitos con base en la oxidación de un analito y la reducción con comitante de un indicador de redox. Además, la invención en cuestión provee una manera más económica de detección de analito, en comparación con ciertos métodos de la técnica anterior, por ejemplo, uno que yace únicamente en la diaforasa como el agente de transferencia de electrones. Como tal, la invención en cuestión representa una contribución importante a la técnica. Todas las publicaciones y patentes citadas en esta especificación se encuentran incoforadas por referencia como si se hubiera indicado específica e individualmente que cualquier publicación individual o patente se incorporara en la presente por referencia. La cita de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe construirse como una admisión de que la presente invención no está autorizada para antedatar dicha publicación en virtud de la invención anterior. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, es evidente para aquellos expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden elaborarse en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un sistema de producción de señal para detectar la presencia de un cofactor reducido en una muestra, dicho sistema comprende: una composición de reactivo en seco, dicha composición de reactivo en seco comprende: (a) primero y segundo agentes de transferencia de electrones capaces de oxidar un cofactor reducido; y (b) un indicador de redox.

2.- El sistema de producción de señal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer agente de transferencia de electrones es un agente de transferencia de electrones de bajo peso molecular.

3.- El sistema de producción de señal de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho agente de transferencia de electrones de bajo peso molecular es un compuesto de fenazina.

4.- El sistema de producción de señal de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque dicho segundo agente de transferencia de electrones es un agente de transferencia de electrones de alto peso molecular.

5.- El sistema de producción de señal de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho agente de transferencia de electrones de alto peso molecular es un compuesto proteináceo.

6.- El sistema de producción de señal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho compuesto proteináceo es una enzima.

7.- El sistema de producción de señal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicho indicador de redox es un compuesto de tetrazolio.

8.- La producción de señal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque dicha composición de reactivo en seco está presente en una tira de prueba.

9.- En un método para detectar la presencia de un analito en una muestra, la mejora comprende: emplear una sistema de producción de señal que comprende una composición de reactivo en seco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10.- Un equipo para utilizarse en la detección de la presencia de un analito en una muestra, dicho equipo comprende: un sistema de producción de señal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.