CN1419604A - 检测样品中还原辅因子的存在的试剂系统及其使用方法 - Google Patents

检测样品中还原辅因子的存在的试剂系统及其使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了信号产生系统、试剂组合物、测试条及其试剂盒、以及它们用于检测样品中分析物的方法。该信号产生系统的特征在于具有至少一种第一和第二电子转移剂和一种氧化还原指示剂，其中在该系统的许多优选实施方案中包括一种蛋白质和非蛋白质的电子转移剂，例如吩嗪化合物和心肌黄酶。在许多优选实施方案中，该系统和试剂盒进一步包括酶辅因子和具有分析物氧化活性的酶，例如分析物脱氢酶两者中的至少一种，并且通常是两者都有。该系统、试剂组合物、测试条和试剂盒可用于检测样品中大范围的分析物，如一种生理学样品，例如血液或其级分。

Description

检测样品中还原辅因子的存在 的试剂系统及其使用方法
发明领域
本发明的领域是分析物检测，特别是用于分析物检测的试剂系统。
发明背景
目前，在生理学流体如血液或血液制品中进行分析物检测变得越来越重要。分析物检测化验可用于各种用途，包括临床实验检测、家庭检测等，其中这些检测的结果在诊断和处理各种疾病时起着十分重要的作用。相关分析物包括乙醇、甲醛、葡萄糖、谷氨酸、甘油、β-羟基丁酸酯、L-乳酸酯、亮氨酸、苹果酸、丙酮酸、甾醇等。随着分析物检测重要性的增长，已经开发出了用于临床和家庭的各种分析物检测程序和设备。到目前为止，已经开发出的许多程序和设备都采用一种信号产生系统来鉴别生理学样品如血液中相关分析物的存在与否。
用于检测各种不同分析物的一类信号产生系统是这样一种系统，其中一种脱氢酶使相关分析物氧化，并同时使一种酶辅因子如NAD(P)+还原。该辅因子的还原形式例如NAD(P)H，随后通过与辅因子氧化剂的后续反应来检测，例如吩嗪硫酸二甲酯或心肌黄酶，它会将一个电子转移到氧化还原指示剂中，如四唑鎓盐，从而产生可检测到的产物。
尽管到目前为止已经开发出了许多这样的信号产生系统，以用于检测各种各样的不同分析物，但是仍然需要进一步开发这些系统。例如，反应速率提高并且低成本的一种信号产生系统将会引起极大的兴趣。
相关文献
相关美国专利，包括4629697、5126247和5902731。也参见：Histochem.J.，(1983)15：881-893，Raap等人。
发明概述
提供了信号产生系统、试剂组合物、测试条及其试剂盒、以及它们用于检测样品中分析物的方法。该信号产生系统的特征在于具有至少一种第一和第二电子转移剂和一种氧化还原指示剂，其中在该系统的许多优选实施方案中包括一种蛋白质和非蛋白质的电子转移剂，例如吩嗪化合物和心肌黄酶。在许多优选实施方案中，该系统和试剂盒进一步包括一种酶辅因子和一种具有分析物氧化活性的酶，例如一种分析物脱氢酶。该系统、试剂组合物、测试条和试剂盒可用于检测样品中大范围的分析物，如一种生理学样品，例如血液或其级分。
附图简述
图1提供了在本发明测试条中观察到的反应速率与包括PMS和心肌黄酶的测试条中理论预测的反应速率之间关系的图示，该图清楚地表明同时使用蛋白质和非蛋白质的电子转移剂，例如PMS和心肌黄酶，会使反应速率明显提高。
具体实施方案的描述
提供了信号产生系统、试剂组合物、测试条及其试剂盒、以及它们用于检测样品中分析物的方法。该信号产生系统的特征在于具有至少一种第一和第二电子转移剂和一种氧化还原指示剂，其中在该系统的许多优选实施方案中包括一种蛋白质和非蛋白质的电子转移剂，例如吩嗪化合物和心肌黄酶。在许多优选实施方案中，该系统和试剂盒进一步包括一种酶辅因子和一种具有分析物氧化活性的酶，例如一种分析物脱氢酶。该系统、试剂组合物、测试条和试剂盒可用于检测样品中大范围的分析物，如一种生理学样品，例如血液或其级分。
在进一步描述本发明之前，应该理解本发明并非限于以下描述的本发明具体实施方案，因为具体实施方案可以作出改动，并且仍然落在所附权利要求的范围之内。还应该理解所采用的术语是出于描述具体实施方案的目的，并不意味着限制。本发明的范围而是由所附权利要求来规定。
在本说明书和所附权利要求中，单数形式包括复数，除非上下文另有清楚的限定。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域内普通技术人员平常所理解的意思相同。
信号产生系统
如上所概括，本发明提供了一种能够检测样品中还原酶辅因子存在的信号产生系统。信号产生系统是指采集两种或更多能够在合并时协同作用，以产生可检测到的信号的化合物或分子，该信号可指示出给定样品中特定分析物存在与否以及其含量。术语信号产生系统广泛用来涵盖信号产生系统中所有试剂组分的混合物以及这样一种系统，其中一种或多种试剂组分与除这些试剂组分以外的余料，例如试剂盒中存在的余料分隔开来。
该信号产生系统的一个特点是存在两种不同的电子转移剂。电子转移剂是指一种可以将一个电子以氢化物离子的形式从还原酶辅因子转移到氧化还原指示剂的化合物或分子。在该信号产生系统中，第一种不同的电子转移剂是一种低分子量分子，而第二种电子转移剂是一种高分子量分子。在本说明书中，低分子量是指分子量不超过约2000道尔顿，通常约1000道尔顿，并且在许多实施方案中为约500道尔顿。高分子量是指分子量至少约5000道尔顿，并且在许多实施方案中为10000或20000道尔顿或更高。高分子量电子转移剂的分子量通常不会超过约100000道尔顿。在许多实施方案中，低分子量电子转移剂是一种非蛋白质化合物，而高分子量电子转移剂是一种蛋白质化合物。蛋白质是指多肽或其模拟聚合物。
有各种低分子量非蛋白质电子转移剂。这些试剂包括：黄素如核黄素(RBF)、咯嗪(ALL)和光色素(LC)；吩嗪类如吩嗪、吩嗪硫酸二甲酯(PMS)、吩嗪硫酸二乙酯、甲氧基吩嗪硫酸二甲酯和碱性藏红；甲基-1，4-萘酚(维生素K)、吩噻嗪如PT及其自由基阳离子：PT+、硫堇(TH)、天青蓝A(AA)、天青蓝B(AB)、天青蓝C(AC)、亚甲基蓝(MB)、亚甲基绿(MG)和甲苯胺蓝O(TOL)；吩噁嗪类如吩噁嗪(POA)、碱性蓝3(BB3)和亮甲酚蓝ALD(BCBA)、苯并-α-氯化phenazoxonium(Medola蓝)；靛酚如2，6-二氯苯酚靛酚(DCIP)；以及吲达胺如Bindschedler绿和亚苯基蓝等。在许多实施方案中特别感兴趣的是吩嗪化合物，如PMS、吩嗪硫酸二乙酯、甲氧基吩嗪硫酸二甲酯和碱性藏红，其中在许多实施方案中PMS是低分子量、非蛋白质的电子转移剂。
在许多实施方案中，高分子量蛋白质电子转移剂是一种能够使还原辅因子氧化的酶，例如NAD(P)H，并同时还原一种氧化还原指示剂。在许多实施方案中，这种电子转移酶是心肌黄酶，如硫辛酸脱氢酶、铁氧化还原蛋白NADP还原酶、硫辛酰胺脱氢酶、NADPH脱氢酶等。可以采用各种市售心肌黄酶，其中可以用于本信号产生系统中的代表性市售心肌黄酶包括芽孢杆菌心肌黄酶、梭菌心肌黄酶、弧菌心肌黄酶、猪心肌黄酶等。
在该信号产生系统中，选择第一和第二电子转移剂之间的比例以与对照组相比加速反应速率，对照组是一种例如含有单电子转移剂的可比较的信号产生系统，例如仅含有PMS或心肌黄酶。在本系统中第一和第二电子转移剂之间的比例通常分别介于约0.001∶10，优选约0.01∶1.0，更优选约0.05∶0.5(nmol/U)。
除了上述第一和第二电子转移剂之外，该信号产生系统还包括一种氧化还原指示剂。氧化还原指示剂是指这样一种化合物，它能够被电子转移剂还原为可检测到的如生色的产物。其中氧化还原指示剂产生一种生色产物，即氧化还原指示剂是一种色原体，合适的色原体是在被一个或多个电子还原之后能够改变颜色的任何化合物，其中合适的色原体通常是一种从上述电子转移剂接受电子的化合物。
有各种不同的氧化还原指示剂化合物。这些化合物包括：噁嗪、噻嗪以及四唑鎓盐。在许多实施方案中特别感兴趣的是四唑鎓盐，它能够从电子转移剂接受捕获的氢化物以形成有色甲腾产物。在许多实施方案中，这些盐的优点是在氧化形式时为浅黄色，但是在电子还原之后变为明亮的可见颜色，并且转化为甲染料。特别感兴趣的四唑鎓化合物或盐包括：2-(2’-苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-邻苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)；2-苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)；2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓(DNP)；2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)；二苯乙烯基硝基蓝四唑鎓(DS-NBT)；3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H四唑鎓(NBT)；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H四唑鎓(MTT)；2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基四唑鎓(PCPM)；四唑鎓蓝(TB)；硫代氨基甲酰硝基蓝四唑鎓(TCNBT)；四硝基蓝四唑鎓(TNBT)；四唑鎓紫(TV)；2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓(WST-4)；2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-双[4-二(2-磺乙基)氨甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二亚苯基)二四唑鎓二钠盐(WST-5)；2-(对硝基苯基)-3-(对碘基苯基)-5-苯基氯化四唑鎓(INT)等。在许多实施方案中优选WST-5，因为它容易溶解在水性介质中，与生物样品的相容性最好。此外，生成的甲腾化合物在紫色到蓝色的区域内表现出强烈的光吸收，从而不需要校正血红蛋白的背景信号。其它可用的四唑鎓盐公开在美国专利4490465、4491631、4598042、4351899、4271265、4247633、4223090、4215917、4142938、4024021、3867259、3867257、3791931和4254222。其公开内容在此引为参考。
上述信号产生系统能够检测样品中还原酶辅因子的存在，特别是水性样品，更特别是生理学样品，例如全血或其相关的级分。使用本发明的信号产生系统可以检测各种不同的还原酶辅因子，代表性的还原酶辅因子包括下列辅因子的还原形式：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸磷酸、和吡咯并喹啉醌(PQQ)。该信号产生系统特别适用于检测NADH或NAD(P)H。
在使用本发明信号产生系统的许多应用中，还原酶辅因子是一种使样品中相应分析物氧化而生成的辅因子。因此在许多实施方案中，本发明信号产生系统还包括酶辅因子和能够使相应分析物氧化并且同时还原酶辅因子的分析物氧化酶。相应的酶辅因子包括上述的那些，即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸磷酸、和吡咯并喹啉醌(PQQ)。可以包括在本发明信号产生系统中的特别相关的酶辅因子包括：NADH或NAD(P)H。
信号产生系统中存在的分析物氧化酶必须取决于要用该系统检测的分析物的性质。代表性的分析物氧化酶包括：用于乙醇的乙醇脱氢酶、用于甲醛的甲醛脱氢酶、用于葡萄糖的葡萄糖脱氢酶、用于葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、用于谷氨酸的谷氨酸脱氢酶、用于甘油的甘油脱氢酶、用于β-羟基丁酸酯的β-羟基丁酸酯脱氢酶、用于甾醇的羟基甾醇脱氢酶、用于L-乳酸的L-乳酸脱氢酶、用于亮氨酸的亮氨酸脱氢酶、用于苹果酸的苹果酸脱氢酶、和用于丙酮酸的丙酮酸脱氢酶。从以上代表性的名单可以看出，分析物氧化酶通常是一种脱氢酶。
试剂组合物
本发明还提供用于在许多实施方案中和样品的分析物中检测至少一种还原酶辅因子的试剂组合物。该试剂组合物可以是流体，例如水性或无水组合物，在许多实施方案中试剂组合物是无水组合物。该试剂组合物至少包括第一和第二电子转移剂以及氧化还原指示剂，其中这些组分如上所述。这种试剂组合物适用于检测样品中的还原酶辅因子，例如NAD(P)H。但是在许多实施方案中，该试剂组合物进一步包括一种酶辅因子和一种分析物氧化酶，其中这些组分如上所述。
试剂测试条
本发明还提供用于检测样品中分析物存在的试剂测试条。具体地说，本发明提供用于化验全血中特定分析物的干燥的条，例如β-羟基丁酸酯、葡萄糖等。从最广泛的意义上讲，该试剂测试条包括一种固体载体和一种存在于载体上的无水试剂组合物，其中无水试剂组合物由所有在相关分析物存在时必须能够产生可检测到的信号的试剂化合物组成。在本发明的大多数实施方案中，该测试条上存在的无水试剂组合物包括下列成分：一种分析物氧化酶，一种酶辅因子，第一和第二电子转移剂以及氧化还原指示剂，其中每种这些组成成分在前面已经作了详细描述。
在许多实施方案中，本发明的测试条包括一种固定于固体载体上的膜测试垫。该载体可以是一种塑料，例如聚苯乙烯、尼龙、或聚酯，或金属板或者本领域内已知的任何其它合适的材料。在许多实施方案中，测试垫优选包含一种吸水的材料，如滤纸或聚合物薄膜。将试剂组合物与该测试垫结合，例如涂布到该测试垫上，掺入到测试垫中等。测试条还可以设计成更复杂的结构，例如测试垫夹在载体和表面层之间，一种或多种样品处理中采用的试剂可以存在于表面层。此外，如本领域内已知的那样，测试条上可以存在流动通道或通路。在许多实施方案中相应的测试条构造公开于美国专利5902731中，其公开内容在此引为参考。
本发明的测试条可以采用任何常用的方案来制造。一种常用方案是将测试条的至少测试垫部分与一种水性组合物接触，该组合物包括在最终的试剂测试条中与测试垫相结合的试剂组合物的所有成分。通常测试垫可以浸入到水性组合物中，在其中保持足够长的时间并随后干燥，由此产生出与试剂组合物结合的该试剂测试条的测试垫。如上所述，该水性组合物将包括与试剂测试条的测试垫结合的试剂组合物的各种成分，其中各种成分的存在量足以提供为生产测试垫的试剂组合物中所需的量。因此在该水性组合物中非蛋白质电子转移剂的存在浓度范围通常介于约1μM～1000μM，通常约10μM～500μM；而该水性组合物中蛋白质电子转移剂的浓度范围介于约50U～3000U，通常约100U～1000U。在该水性组合物中氧化还原剂的存在浓度范围介于约3mM～36mM，通常约6mM～24mM。如果存在，则酶辅因子的浓度范围介于约1.5mM～28mM，通常约3.5mM～14mM。类似地，如果存在，则分析物氧化酶试剂的浓度范围介于约100U～2000U，通常约200U～1000U。在用来制备试剂测试条的该水性组合物中可能存在的其它组分包括氯化钠、氯化镁、Tris、PSSA、Tetronic 1307、Crotein-SPA、蔗糖、草氨酸、钠盐等。参见下文的实验部分，以更加详细地描述制备本发明试剂测试条的代表性方法。
检测分析物的方法
上述信号产生系统、试剂组合物和测试条用于检测样品中分析物的存在以及通常还有其含量的方法。采用本发明的方法可以检测各种不同的分析物，其中代表性的分析物包括如上所述的那些，例如乙醇、甲醛、葡萄糖、谷氨酸、甘油、β-羟基丁酸酯、L-乳酸酯、亮氨酸、苹果酸、丙酮酸、甾醇等。尽管本发明的方法主要可用于确定各种不同的生理学样品中，如尿液、泪液、唾液等，分析物的存在以及通常还有其浓度，但是它们特别适用于确定血液或血液级分例如血液衍生样品中分析物的浓度，并且更特别是在全血中。
本发明方法的一个重要特点是采用了本发明的信号产生系统，它包括第一和第二电子转移剂以提供与对照系统相比加速了的反应时间，对照系统例如是一种包括单个的电子转移剂的系统。反应速率通常加速或提高1到3倍，取决于PMS和心肌黄酶的比例。此外，反应速率大于理论或预测速率，这是基于单个电子转移剂所提供的速率的加和乘以1到3倍来预测的。测量的反应速率以K/S每秒来表示(参见下文的实验部分)，在采用本发明信号产生系统的一个反应中，K/S每秒通常介于约0.01～10，通常约0.05～5，更通常约0.1～2。
在本发明的方法中，样品和信号产生系统组合到反应混合物中，允许反应进行足够长的时间以产生指示样品中分析物存在与否(通常还有其含量)的信号，检测所得到的信号，并分析样品中分析物的存在(通常还有其含量)。从最广泛的意义上讲，反应混合物可以在任何方便的环境中生产，如试管或其它流体容器装置。但是在许多实施方案中，在上文中描述过的试剂测试条上进行以上步骤。因此现在从方法的角度进一步讨论本发明的方法，其中采用试剂测试条。
在实施本发明的方法时，第一步是将一定量的生理学样品涂布到测试条上，其中测试条在上文中作了描述。生理学样品如血液涂布到测试条的量可以改变，但是通常介于约2微升～40微升，通常约5微升～20微升。由于本发明测试条的性质，涂布到测试条上的血液样品量可以相对较少，介于约2微升～40微升，通常约5微升～20微升。血液是生理学样品，各种不同血细胞比容的血液样品都可以用本发明的方法化验。其中血细胞比容可以介于约20％～65％，通常约25％～60％。
将样品涂布到测试条上之后，允许该样品与信号产生系统的成分反应，以生成一种可检测到的产物，该产物的存在量与样品中存在的相应分析物的最初含量成比例。随后确定可检测到的产物的量，即由信号产生系统产生的信号，并且分析最初样品中分析物的含量。在某些实施方案中，采用自动化装置进行上述检测和分析步骤。上述反应、检测和分析步骤，以及实施这些步骤的装置，进一步描述于美国专利4734360、4900666、4935346、5059394、5304468、5306623、5418142、5426032、5515170、5526120、5563042、5620863、5753429、5573452、5780304、5789255、5843691、5846486、5902731、5968836和5972294中，其公开内容在此引为参考。在分析步骤中，得到的分析物浓度考虑了竞争反应对观察到的信号的持续贡献，例如通过校正相应的装置。
试剂盒
本发明还提供用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒至少包括一种如上所述的信号产生系统，其中该信号产生系统的组分可以合并成一种单一的试剂组合物，或者存放在各个容器中以隔开。在某些实施方案中，该信号产生系统将以前文中所述的试剂测试条的形式存在于试剂盒中。本发明的试剂盒还可以进一步包括一种用于获得生理学样品的装置。例如，生理学样品是血液时，本发明的试剂盒可以进一步包括一种用于获得血液样品的装置，如刺手指的针，驱动取血针装置等。此外，本发明的试剂盒可以包括一种对照溶液或标准物，例如一种含有标准化浓度分析物的分析物对照溶液。在某些实施方案中，该试剂盒还包括一种如上所述的自动化装置，用于检测在涂布样品后的测试条上产生的产物的量，并由检测到的产物分析样品中分析物的含量。最后，该试剂盒包括使用本发明试剂盒组分来确定生理学样品中分析物浓度的说明。这些说明可以在一个或多个包装、标签插入页、试剂盒中存在的容器中等。
仅以说明的方式而非限制的方式提供以下实施例。
实施例
A.酮测试条的制备
将从Cuno公司(Meridien，CT)得到的0.8微米尼龙膜浸入到表1的试剂中直至饱和。
表1
组分   含量
水   100毫升
三(羟基甲基)氨基甲烷   1.2克
氯化钠(分子量56.44，Sigma公司(St.Louis，MO))   560毫克
氯化镁(分子量203，Sigma公司(St.Louis，MO))   2.5克
PSSA，聚苯乙烯磺酸，钠盐(分子量70000)   3克
Crotein-SPA(Croda公司，Parsippany，NJ)   3克
草氨酸，钠盐   250毫克
Tetronic 1307(BASF公司，Mount Olive，NJ)   2克
蔗糖(分子量342.30，Aldrich化学品公司，Milwaukee，WI)   5克
NAD(分子量663.4，N7004，Sigma公司(St.Louis，MO))   450毫克
D-3-羟基丁酸酯脱氢酶   50000U
WST-5(分子量1331.37，Dojindo，日本)   1.8克
心肌黄酶   0-15000U
吩嗪硫酸二甲酯(PMS)   0-3毫克
过量的试剂用玻璃棒轻轻刮除。得到的膜在56℃的炉子中悬挂干燥10分钟。Porex(0.6毫米厚)浸泡在5％的亚硝酸盐溶液中，随后在100℃的炉子中悬挂干燥10小时。最后，该膜层合在聚酯层(0.4毫米Melenex聚酯，美国ICI公司，Wilmington，DE)和亚硝酸盐浸泡的Porex之间。
B.测定
采用以下程序，在如上所述的测试条上检测包含40毫克/分升(D)β-羟基丁酸酯的10微升水性样品，其中根据测试条上PMS和/或心肌黄酶的存在量来改变测试条。将10毫升水性样品涂布到刚刚制备的测试条上。测试条插入到反射计中并开始进行数据采集，测试条的反射率在660nm下以1秒的间隔监测2分钟。接下来，数据通过串行电缆从反射计的内存缓冲器上载到计算机(PC)上。基于K/S在反应进程为线性的范围内的最初速率变化计算反应速率。概括在表2中的结果是5个平行实验的平均值。在每个单独的试验中，观察反应速率(K/S每秒)，(K/S是反射率的测量值，讨论并定义于美国专利4935346中，14栏。其公开内容在此引为参考。)表2提供下列结果。
表2
 DAD和PMS的单独配方 DAD和PMS的整体配方
  DADU/ml   速率(K/S/秒)     PMS(μm)   速率(K/S/秒) 单独的#(K/S/秒)     DADU/ml   PMS(μm)   整体的(K/S/秒)
  150   0.0166     10   0.013   0.0296     150     10   0.0385
  300   0.0392     20   0.0225   0.0617     300     20   0.1054
  600   0.0943     40   0.0484   0.1427     600     40   0.3095
  900   0.1666     60   0.078   0.2446     900     60   0.5861
  1200   0.1787     80   0.1085   0.2872     1200     80   0.9107
  1500   0.2866     100   0.13   0.4166     1500     100   太快*
#：理论速率，即基于由心肌黄酶和PMS单独催化的反应速率的加和的预测速率。
*：反应太快，难以准确计算速率。
C.观察速率对比/理论速率
下表3提供了上述试验中观察速率和预期或理论速率之间的比较。
表3
    理论速率(K/S/秒)     观察速率(K/S/秒)
    0.0296     0.0385
    0.0617     0.1054
    0.1427     0.3095
    0.2446     0.5861
    0.2872     0.9107
图1提供了观察速率和理论速率之间关系的图。
从图1中可以看出，测试条的信号产生系统的反应速率由于同时存在PMS和心肌黄酶而加速，其中观察到的加速幅度出乎意料地大大高于基于单独含有PMS或心肌黄酶的系统的反应速率加和的预测加速数值。
从上述结果和讨论中，很明显本发明使得明显并出乎意料地增加了分析物检测程序中观察到的反应速率，该检测程序基于使分析物氧化并同时将氧化还原指示剂还原。此外，与某些现有技术方法相比，例如单单依靠心肌黄酶作为电子转移剂的方法，本发明提供了更经济的分析物检测方式。因此本发明代表本领域的一种重要贡献。
本说明书中提及的所有申请和专利在此引为参考，假设每个单独的申请或专利特定而单独地指明列为参考。任何申请的引用内容是其在本申请提交之目前的公开内容，并且不应该理解为由于在先发明而认为本发明不能在这些申请之前授权。
尽管已经通过目的在于清楚理解的说明和实施例的形式较为详细地描述了前述发明，但是对于本领域内普通技术人员而言，很明显根据本发明的内容可以轻易地对本发明作出某些改变和修改，而不背离所附权利要求的精神或范围。

Claims (35)

1.一种信号产生系统，用于检测样品中还原辅因子的存在，所述系统包含：
能够使还原辅因子氧化的第一和第二电子转移剂，和一种氧化还原指示剂。
2.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述第一电子转移剂是一种低分子量电子转移剂。
3.根据权利要求2的信号产生系统，其中所述低分子量电子转移剂是一种吩嗪化合物。
4.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述第二电子转移剂是一种高分子量电子转移剂。
5.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述高分子量电子转移剂是一种蛋白质化合物。
6.根据权利要求5的信号产生系统，其中所述蛋白质化合物是一种酶。
7.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述氧化还原指示剂是一种四唑鎓化合物。
8.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述信号产生系统进一步包含一种酶辅因子。
9.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述系统进一步包含一种分析物氧化酶。
10.根据权利要求1的信号产生系统，其中所述信号产生系统作为一种试剂组合物存在。
11.一种试剂组合物，用于检测样品中分析物的存在，所述组合物包含：
一种分析物氧化酶；
一种酶辅因子；
一种非蛋白质的电子转移剂；
一种蛋白质电子转移剂；和
一种氧化还原指示剂。
12.根据权利要求11的试剂组合物，其中所述酶辅因子是NAD(P)+。
13.根据权利要求11的试剂组合物，其中所述非蛋白质的电子转移剂是一种吩嗪化合物。
14.根据权利要求11的试剂组合物，其中所述蛋白质电子转移剂是一种心肌黄酶。
15.根据权利要求11的试剂组合物，其中所述氧化还原指示剂是一种四唑鎓化合物。
16.根据权利要求11的试剂组合物，其中所述组合物是一种无水试剂组合物。
17.一种试剂组合物，用于检测样品中分析物的存在，所述组合物包含：
一种分析物脱氢酶；
NAD(P)+
一种吩嗪化合物；
一种心肌黄酶；和
一种四唑鎓化合物。
18.根据权利要求17的试剂组合物，其中所述吩嗪化合物是吩嗪硫酸二甲酯。
19.根据权利要求17的试剂组合物，其中所述组合物是一种无水试剂组合物。
20.根据权利要求19的试剂组合物，其中所述无水试剂组合物存在于测试条上。
21.一种试剂测试条，包括：
(a)一种载体成分；和
(b)一种无水试剂组合物，包含：
(i)一种分析物氧化酶；
(ii)一种酶辅因子；
(iii)一种非蛋白质的电子转移剂；
(iv)一种蛋白质电子转移剂；和
(v)一种氧化还原指示剂。
22.根据权利要求21的试剂测试条，其中所述第一种酶是一种脱氢酶。
23.根据权利要求21的试剂测试条，其中所述辅因子是NAD(P)+。
24.根据权利要求21的试剂测试条，其中所述非蛋白质的电子转移剂是一种吩嗪化合物。
25.根据权利要求24的试剂测试条，其中所述吩嗪化合物是吩嗪硫酸二甲酯。
26.根据权利要求21的试剂测试条，其中所述蛋白质电子转移剂是一种心肌黄酶。
27.根据权利要求21的试剂测试条，其中所述氧化还原指示剂是一种四唑鎓化合物。
28.一种用于检测样品中分析物的存在的方法，改进之处包括：
采用根据权利要求1的信号产生系统。
29.根据权利要求28的方法，其中所述信号产生系统作为一种根据权利要求11的试剂组合物存在。
30.根据权利要求29的方法，其中所述试剂组合物存在于根据权利要求21的试剂测试条上。
31.一种试剂盒，用于检测样品中分析物的存在，所述试剂盒包括：
根据权利要求1的信号产生系统。
32.根据权利要求31的试剂盒，其中所述信号产生系统作为一种根据权利要求11的试剂组合物存在。
33.根据权利要求32的试剂盒，其中所述试剂组合物存在于根据权利要求21的试剂测试条上。
34.根据权利要求31的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括一种用于获得生理学样品的装置。
35.根据权利要求34的试剂盒，其中所述用于获得生理学样品的装置是一种刺血针。
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