JPH01320998A - グルコースを含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は糖尿病の診断マーカーとして有用なｌ、５−ア
ンヒドログルシトール（以下ＡＣと言う）の測定法に関
する。

（従来の技術） ＡＧはヒト体液中音まれ、糖尿病の診断マーカーとして
有用であるが、その存在量はＡＧと構造的に類似してい
るグルコースと比して少なく、ＡＧの物理化学的あるい
は生化学的測定に際しグルコースの存在は測定誤差を大
きくするので好ましくな（、試料をイオン交換樹脂等で
処理してグルコースを除去していた。

（発明が解決すべき課題） しかし、従来の技術では樹脂処理に時間がかがり多量の
試料を分析するため、より簡便にグルコースを除去でき
、かつＡＣを分析できる測定法が要望されていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは研究の結果、試料中のグルコースをグルコ
ースオキシダーゼで処理し、生ずる過酸化水素をパーオ
キシダーゼと水素供与体とで水に分解した後、試料中の
ＡＧを酵素を用いて測定出来ること、又試料中のグルコ
ースをグルコース６位リン酸化酵素とアデノシン３リン
酸（以下ＡＴＰと言う）でグルコース−６−リン酸とし
、これを更にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とニコ
チナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ
）で酸化し、生ずるＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰの還元体）を
電子伝達体および溶存酸素で酸化し、生ずる過酸化水素
をパーオキシダーゼと水素供与体とで水に分解した後、
試料中のＡＣを酵素を用いて測定できることを見出だし
た。

即ち、本発明は（１）グルコースおよび１．５−アンヒ
ドログルシトールを含をする試料ヘグルコース６位リン
酸化酵素、アデノシン３リン酸、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、電子伝達体、パーオキシダーゼおよび水素供与体
を添加、反応し、グルコースを消去した後、該試料中の
１，５−アンヒドログルシトールを酵素を用いて定量す
ることを特徴とするグルコースおよび１．５−アンヒド
ログルシトールを含有する試料中の１，５〜アンヒドロ
グルシトールの測定法 （２）グルコースおよび１．５−アンヒドログルシトー
ルを含有する試料へグルコースオキシダーゼ、パーオキ
シダーゼおよび水素供与体を添加、反応しグルコースを
消去した後、該試料中の１．５−アンヒドログルシトー
ルを酵素を用いて定量することを特徴とするグルコース
と１．５−アンヒドログルシトールを含有する試料中の
１．５−アンヒドログルシトールの測定法に関する。

本発明で用いられる試料としては、ＡＣおよびグルコ一
スを含むことが予測され、かつＡＧ含量を測定したいも
のなら特に制限は無く、例えば血液、尿、髄液などの体
液や植物、動物などの抽出物およびその蛋白除去物など
があげられる。

第一の発明で用いられるグルコース６位リン酸化酵素と
しては例えばグルコキナーゼやヘキソキナーゼがあげら
れるがグルコキナーゼが好ましい。

グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼはＩ　ＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂの命名法委員会でそれぞれ（２，７，１，２）および
（２，７，１，１）と分類しうるちのであれば特に制限
なく、市販のものを使用しうる。グルコース−６−リン
酸脱水素酵素およびホースラディシュパーオシキダーゼ
などのパーオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＴＵＢの命名法
委員会で、それぞれ〔１゜１．１．４９）および（１，
１１，１，７）と分類しうるものであれば特に制限は無
く市販のものを使用しうる。

これらの酵素の使用量は試料中のグルコース量により異
なるが、グルコース６位リン酸化酵素の場合、試料１−
当り通常０．１〜１０単位である。グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素の場合試料ｌｌ１１当り通常０．１〜１
０単位であり、パーオキシダーゼの場合試料１Ｍｉ当り
０．１〜５単位である。

グルコースをリン酸化するにはＡＴＰが必要であり、そ
の使用量は試料中のグルコース量により異なるが１〜１
０ＩＩＩＭ程度で良い。

本発明で用いられる電子伝達体としては酸素の存在下に
ＮＡＤＰＨを酸化し、過酸化水素を生成しうるちので例
えばフェナジンメトサルフェートあるいは１−メトキシ
フェナジンメトサルフェート（以下１−ＭＰＭＳと言う
）などのフェナジンメトサルフェート類、メチレンブル
ー、２．６−ジクロロフェノールインドフェノール、ナ
フトキノン、インジゴスルホン酸類好ましくはフェナジ
ンメトサルフェート類、メチレンブルーなどがあり、通
常１〜１００　μ台の濃度でもちいられる。

電子伝達体とともに反応に関与するものは溶存酸素であ
るが、大気より反応系中に供給される酸素量で十分なの
で、大気中で試料を処理すれば、酸素を別に添加する必
要性はない。

水素供与体としてはパーオキシダーゼの存在下に過酸化
水素を分解しうるちので、特に発色をしないものが好ま
しく、例えばフェノール、アニリン、あるいはジアルキ
ルアニリンなどのそれらの誘導体が用いられ、その濃度
は通常０．１〜１０ｍＭである。

グルコース−６−リン酸脱水素酵素反応に必要なＮＡＤ
Ｐの量と試料中のグルコース量より異なるが１〜１０慣
Ｈ程度で良い。

反応は通常１〜２００ｍＭ　、ｐｉｆ　６〜１０バツフ
アー中で２０〜６０℃、望ましくは３０℃〜３７℃で５
〜６０分程度行われる。使用できるバッファーとしては
、リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどがあ
る。

上記のグルコースを消去させる反応の際、塩類を共存さ
せた方が好ましい０反応液に添加する必要のある塩類と
しては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのマグ
ネシウム塩および塩化カリウム、硫酸カリウムなどのカ
リウム塩がありそれぞれ共に１〜１００ｍＭの濃度で用
いられる。

第２の発明で用いられるグルコースオキシダーゼとして
はＩ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢの命名法委員会で（１，１，
３，４）と分類しうるものであれば特に制限は無く市販
のものが使用出来る。その使用量は試料中のグルコース
量により異なるが、試料１−当り１〜１００単位である
。パーオキシダーゼ、および水素供与体は前述のものが
同様に用いることが出来る０反応は通常ｌ〜ｌｏｏ＊Ｍ
　、ｐＨ５〜８のバッスアー中で２０〜６０℃、望まし
くは３０〜３７℃で１０分〜２時間程度行われる使用出
来るバッファーとしては例えばリン酸バフファー、トリ
ス塩酸バッファーなどがある。

上記のグルコース消去反応の際、各酵素試薬とも反応の
順に別々に添加してもよいが、同時に試料に添加し、反
応させた方が好ましい。

試料中のＡＣを酵素を用いて測定するには、ＡＧＭ化酵
素を用いる公知の方法、例えば特開昭６２−７９７８０
号もしくはＥＰ公開２６１５９１号記載の方法で行うこ
とができる。ＡＧ酸化酵素としては１，５−ＡＣの２−
位の水酸基を酸化する能力を存するものが好ましく、そ
のような酵素としては、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−
ソルボースオキシダーゼ、シュードモナスＳ　Ｐ　、　
Ｎ　Ｋ　−８５００１（Ｆｅｒｍ　ｐ−８１００）の産
生する酵素などがあげられる。

本発明で用いられるピラノースオキシダーゼとＬ−ソル
ボースオキシダーゼはＩ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢの命名法
委員会でそれぞれＥＣ１，１，３，１０およびＥ　Ｃ１
，１，３，１１と分類し得るものであれば特に制限はな
く、ピラノースオキシダーゼとしては、例えばポリボラ
スオブ７サス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓｏｂｔｕｓｕｓ）Ａ
　Ｔ　ＣＣ２６７３３の産生するものがあげられ、又、
Ｌ−ソルボースオキシダーゼとしては、例えばトラメテ
スサングイネア（Ｔｒａｍｅｔｅｓｓａｎｇｕｉｎｅａ
）　Ｉ　Ｆｏ　４９２３の産生するものなどがあげられ
る。

これらの酵素は通常緩衝液に溶解した溶液で使用される
が、マイクロカプセル、樹脂や多ｔｉ類に共存結合もし
くは吸着させたものなど、通常の方法で固定化した酵素
も使用しうる。又、その使用量は、試料の量などによっ
て異なるが、酵素による反応時間を好適な短時間とする
ためには１単位以上であればよく、好ましくは１．５〜
５単位程度である。また用いる酵素の比活性は高いもの
ほど反応にとって良好であることは言うまでもないこと
であるが必ずしも最高純度のものを要求するものではな
い。

なお、本発明で使用する酵素を採取する方法は、例えば
前者についてはＢｉｏｃｈｉｍ　、　［１ｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ１６７．４９３−５００（１９６８）に、
又後者についてはＴｈｅ　　Ｊｏｕｒｒ＋ａｌ　　ｏｆ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　６２（２）２２３−
２２９（１９６７）に開示されている。

グルコースを消去した後の試料中のＡＣを定量するには
例えば上記公報記載の方法のようにすればよい。

（１）酸素消費に基づく方法 密閉型反応容器に０．０５？ｌ　）　ＩＪスス−酸緩衝
液（ｐ）Ｉ　７）　１ＴＲ１，３０ｍＭフェナジンメト
サルフェート２０μｆ、１．５−ＡＧ酸化酵素又は膜画
分サスベンジッンあるいは１．５−　Ａ　Ｃ酸化酵素抽
出＊　０．３−を加え酸素電極を挿入し反応容器内を３
４℃で撹拌しながらこれに試料溶液５０μｌを加えて反
応を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニター
で測定する。既知濃度の１．５−　Ａ　Ｃ溶液で検量線
を作成しておき試料の酸素消費量から１．５−ＡＣの濃
度を算出する。

（２）電子受容体の着色度変化を利用する方法トリス−
塩酸緩衝液（０，０５Ｍ　　ｐｌ＋　７）０．７−・０
．１Ｍフェリシアン化カリウム溶液０．１−、ンユード
モナス属に属する微生物より得られる１・５−ＡＣ酸化
酵素又はその抽出液０．１Ｍｉおよび試料溶液０．１−
を容器に入れ３４℃で１０分間反応させた後、硫酸第二
鉄−デユバノール試薬（硫酸第二鉄５ｇ　、ラウリル硫
酸ナトリウム３ｇ　、　８５％リン酸９５−１蒸留水９
００　＋ａｆ　）０．５　ｄ、蒸留水３．５−を加え１
０分間放置して６６０ｎ＋ｓにおける吸光度を測定する
。既知濃度の１．５−ＡＧ？８？＆で検量線を作成して
おき試料の吸光度より１．５−ＡＣの濃度を算出する。

電子受容体としては上記のフェリシアン化カリウムやフ
ェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウム
などのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインドフ
ェノールなどが利用出来る。

（３）　ＨｚＯｚを検出する方法 リン酸ナトリウム緩衝液（１／１５Ｍ、ｐ）１５．６）
　０．３ｍ、４ｍＭ　、２．２’−アジノジ〔３−エチ
ルベンツチアゾリンスルホネイト（６）　　）　　（Ａ
　Ｂ　Ｔ　Ｓ　）　と１２μ／ｄのホースラデイツシュ
ペルオキシダーゼを含む発色液０．５−１１．５−ＡＧ
酸化酵素又はその抽出液０．１−および試料溶液０．１
ｍを容器に入れ、３７℃で３０分間反応させた後、水冷
下に反応を止め、４０５ｎ＋＊における吸光度を測定す
る。既知濃度の１．５−ＡＣ溶液で検Ｎ線を作成してお
き、試料の収光度より１．５−ＡＣの濃度を算出する。

ホースラデイツシュペルオキシダーゼの基質としては、
ＡＢＴＳの外、５−アミノサルチル酸、４−アミノアン
チピリンとフェノール、０−トルイジン等の発色ＳＭや
、ｐ−ヒドロキシ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン酸等
のケイ光基質が利用できる。

また、１．５−ＡＣの酸化反応により生成したＨ２０！
の検出法としては、この他に、ＨｚＯｚ　ｉｆ極を用い
て直接測定する方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン
、アリルシュウ酸エステル類のＨ２０！酸化による化学
発光を利用する方法なども利用し得る。

（４）ＡＣの酸化物質を分析する方法 試料溶液にシュードモナス菌由来の膜画分サスベンジッ
ンを加え３０℃、１６時間反応する０反応終了後超遠心
により膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥して白色粉
末を得る。この粉末をカルボニル基のラヘル化剤又は水
酸基の保護剤で処理することにより、分析することがで
きる。たとえばカルボニル基のラベル化剤として２，４
−ジニトロフェニルヒドラジンを用いる場合には、凍結
乾燥した粉末を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除
去したｉｌｌ液へ２．４−ジニトロフェニルヒドラジン
飽和エタノール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加
熱反応させる。この生成物を逆相系のＨＰＬＣ（液体ク
ロマトグラフィー）により分析することにより、ＡＣの
酸化物質を検出することができる。

（効果） 実験例１ ＡＧを蒸溜水又は２００ｍｇ／　ｄｌのグルコース水溶
液で溶解して各種濃度のＡＧ標準液を調整し、これら試
料を本発明の方法で処理後、ピラノースオキシダーゼで
ＡＣを酸化し、生じた過酸化水素をパーオキシダーゼ〜
４−アミノアンチピリン〜Ｎ−エチルーＮ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）　−３，５−ジメトキシ
アニリン（ＤＡＯ３）系により発色して検量線を作製し
た。

参考例としてグルコース水溶液で調整した標準液を本発
明の方法によらず、直接ピラノースオキシダーゼで酸化
し上述の系で発色して吸光度をみた。

下記の組成の試薬Ａ、試薬Ｂおよび酵素液を調整し、２
．５−の試薬ＡへＡＧ標準液０．１−と酵素液０．１−
を加え、３７℃、３０分反応後、試薬Ｂ　Ｏ，３−を加
え更に６０分反応して分光光度計で５９３ｎｍでの吸光
度を測定した。

試薬Ａニドリスー塩酸バフファー（５ＩＩＩＭ　、ｐＨ
９）、ＡＴＰ（１＋ｗＭ）、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　（ＩｓＭ
）、塩化マグネシューム（２０ｍＭ）塩化カリューム（
２０ａ＋Ｍ）　、パーオキシダーゼ　（２ｕ／Ｒ１）　
、Ｄ　Ａ　ＯＳ　Ｃ１ｍＭ＞、１−ＭＰＭＳ−（１０μ
Ｍ） 試薬Ｂニリン酸バッファー（２００ｍＭ　、ｐＨ５，６
）、ピラノースオキシダーゼ（２５ｕ／ｄ）　、４−ア
ミノアンチピリン（０，５＋ｗｇ／＋ｄ） 酵素液ニドリス塩酸バフファー（５ｍＭ　、　ｐＨ７）
、グルコキナーゼ（５０ｕ／ｍ）　、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素（３５ｕ／ｄ） 表ＩＡＣ濃度による発色強度変化（Ａ５９３）上表から
明らかなように本発明方法によると、グルコースが共存
しても共存しない場合と極めて高い相関関係を示した。

又ＡＧ濃度の吸光度の間には良い直線関係がみられた。

一方、直接ピラノースオキシダーゼで酸化して発色した
場合は過大な値が得られＡＧの測定には利用出来ないこ
とは明らかである。またグルコキナーゼに替えへキソキ
ナーゼを用いて同様の実験を行ったがグルコキナーゼを
用いた場合と同様ＡＧを測定できた。

実験例２ 蒸溜水および２ｓ＋Ｍグルコース水溶液でＡＣを溶解し
て作製した標準液ｌおよび２を用いて下の様に反応、発
色して５０５ｎ＋ｗにおける吸光度を測定した。参考例
として標準液２へ試薬ＡおよびＢを同時に加えて反応さ
せ、同様に吸光度を測定した。

試薬Ａニドリスー塩酸バック７−　（１０ｍＭ、ｐ　１
１７　）、パーオキシダーゼ（１０ｕ／ｄ）　、フェノ
ール（２ｍｇ／−）、グルコースオキシダーゼ（５０ｕ
ハ０試薬Ｂニリン酸バツフアー（１００ｍ門、ｐＨ５，
６）、４−アミノアンチピリン（ｌＩ１ｇ／ｍ）　、ピ
ラノースオキシダーゼ　（５ｕ／ｄ） 方法：各種標準液０．１−へ試薬Ａ　Ｉ、５ａｄを加え
、３７℃、２時間反応した後試薬Ｂを１．５ｄ加クンＣ
４器智０反応後５０５ｎ＋ｗにおける吸光度を測定した
。

表３ 上の表の様にグルコース水溶液中のＡＣはグルコースオ
キシダーゼ、パーオキシダーゼおよび水素供与体である
フェノールによりグルコースと過酸化水素を消去した後
、ピラノースオキシダーゼで酸化、発色することにより
、その含量と吸光度の間に良い比例関係がみられた。一
方、グルコース消去反応をしないで直接発色した場合、
発色度が過大となり、かつ比例関係が良くなかった。

実施例１ ヒト血清中のＡＣを測定するため、５種類の血清をアミ
コン社製ＭＰＳ−セントリフリーで除蛋白した試料およ
び蒸溜水で溶解したＡＧ標準液を実験例１の方法に準じ
て反応、発色し、ＡＣ標準液による検量線を用いて血清
中のＡＣ，を測定した。

同時に同試料を従来の方法であるガスクロマトグラフィ
ー法でＡＣおよびグルコース含量を測定した。

表２　本発明の方法による血清中のＡ　Ｇ　ｆ７４度測
定結果 上の表の様に本発明の方法による結果は、従来の方法で
あるガスクロ法による結果と良い相関を示しく相関係数
−０，９９６）、グルコースが大量に含まれる血清中の
ＡＣでも測定できること力くわ力１つた。

特許出願人　　日本化薬株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコースおよび１，５−アンヒドログルシトー
   ルを含有する試料へグルコース６位リン酸化酵素、アデ
   ノシン３リン酸、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、
   ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸、電子伝達
   体、パーオキシダーゼおよび水素供与体を添加、反応し
   、グルコースを消去した後、該試料中の１，５−アンヒ
   ドログルシトールを酵素を用いて定量することを特徴と
   するグルコースおよび１，５−アンヒドログルシトール
   を含有する試料中の１，５−アンヒドログルシトールの
   測定法
2. （２）グルコースおよび１，５−アンヒドログルシトー
   ルを含有する試料へグルコースオキシダーゼ、パーオキ
   シダーゼおよび水素供与体を添加、反応しグリコールを
   消去した後、該試料中の１，５−アンヒドログルシトー
   ルを酵素を用いて定量することを特徴とするグルコース
   と１，５−アンヒドログルシトールを含有する試料中の
   １，５−アンヒドログルシトールの測定法