JPH0555119B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、水性液中のクレアチンキナーゼ含量
の分析に関し、さらに詳しくは、生物学的液体、
たとえば、血清中のクレアチンキナーゼの分析用
試薬組成物及びその分析方法に関する。 従来技術 生物学的液体、特にヒト血清中のクレアチンキ
ナーゼの存在及び量の測定は、心筋梗塞症の診断
において非常に有用になつてきている。 従来のクレアチンキナーゼ測定法は一般に、ク
レアチンキナーゼが下記式で示される正逆両反応
を触媒するということに関係している： クレアチン＋アデノシン三燐酸燐酸クレアチ
ン＋アデノシン二燐酸。 これら正逆両反応は分析法に使用されている
が、逆反応は正反応よりも約６倍速いので逆反応
の使用の方が好ましい。 溶液中のクレアチンキナーゼを測定するための
いくつかの周知方法は、たとえば、N.W.タイエ
ツツ（Tietz）編、フアンダメンタルズ・オブ・
クリニカル・ケミストリー（Fundamentals of
Clinical Chemistry）、W.B.サウンダース社（W.
B.Saunders Co.）1970年、466〜470ページに記
載されているような２種またはそれ以上の反応を
結び付けることを含む。この文献に記載された１
つの測定法は467ページの式45a〜45cに説明され
ている。一連の反応の測定可能な目的生成物は、
分光光度計によつて340nmで存在が測定されるニ
コチンアミドアデニンジヌクレチド燐酸（還元
型、以下NADPHと称する）である。しかしな
がら、この方法は極めてPH−感受性であつて、厳
密なPHコントロールが維持されなければかなりの
誤差を生じやすい。さらに、NADPH及び
NADP⁺（酸化型）は比較的不安定である。UVア
ツセイ法は、比較的に複雑な計測を必要とし、し
かもクレアチンキナーゼ活性を測定する場合には
種々の血清成分からの妨害を受けやすいので望ま
しくない。 クレアチンキナーゼが生物学的液体中で明らか
にスルヒドリル（すなわち、メルカプト）酸化及
びジスルフイド形成により不安定であることもま
た、周知である。このため、全クレアチンキナー
ゼ活性を回復するために溶液アツセイでは活性化
剤が用いられる。当業界で周知の分析方法、たと
えば、UV吸光度の変化を測定する方法において
使用される最も普通の活性化剤としては、チオグ
ルコース、ジチオトレイトール、ジチオエリトリ
トール、メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシ
ステイン及びグルタチオンのようなスルフヒドリ
ル化合物が挙げられる。しかしながら、周知の方
法では所望のクレアチンキナーゼ活性化のために
充分な高い濃度で活性化剤を使用すると、それら
は比色分析に有用な多くの試薬（比色指示薬とし
ても知られる）に不利な影響を与える。一般に、
活性化剤は色原体を漂白して、色濃度を減少し、
アツセイをより変動しやすくする。変動性は、た
とえば周知のUV法の場合に問題であつた。この
ことは後述の例１に示す。 発明の目的 本発明の目的は、水性液中のクレアチンキナー
ゼを測定するための改良された方法及び組成物を
提供することにある。安定な試薬及び検出可能で
再現性のある比色変化を生ずる安定な副生物を含
む一連の反応を利用することによつて、周知の
UVアツセイ法の問題、特に変動性の問題を回避
する比色法が望まれている。 発明の構成 本発明は、この目的を達成する方法及び対応す
る組成物を提供する。本発明に従つた水性液中の
クレアチンキナーゼの定量方法は、 (A)(1) 該水性液のサンプルを、 (2) クレアチンキナーゼ含有液の存在下で次の
順序の一連の反応(a)，(b)及び(c)： (a) クレアチンキナーゼの存在下で燐酸クレ
アチンとアデノシン二燐酸とを反応させて
クレアチン及びアデノシン三燐酸を形成
し： (b) グリセロールキナーゼ及びアデノシン三
燐酸の存在下でグリセロールを燐酸化して
Ｌ−α−グリセロホスフエートを形成し；
そして (c) α−グリセロホスフエートオキシダーゼ
及び比色指示薬組成物の存在下でＬ−α−
グリセロホスフエートを酸化して吸光度変
化を生じる反応 を行なう試薬と接触せしめ、そして (B) 該吸光度変化の割合を定量的に検出すること
を含んでなる。 本発明の組成物は、(a)燐酸クレアチン、(b)アデ
ノシン二燐酸、(c)グリセロール、(d)グリセロール
キナーゼ、(e)α−グリセロホスフエートオキシダ
ーゼ及び(f)色原体を含む比色指示薬組成物を含ん
でなる。 発明の効果 本発明は、周知方法に優る多くの利点を有す
る。本発明は、たとえば、周知のUV法よりも変
動性が少ない。このため、本発明によれば、電磁
スペクトルの可視領域（一般に400〜900nm）の
いくつかの波長の１つにおいて測定可能な色の変
化を通してクレアチンキナーゼの信頼性があり且
つ正確な分析ができるのである。可視領域におけ
るこれらの測定は、低波長（たとえば、約400nm
未満）におけるUV測定よりも高波長（たとえ
ば、500nmを超える波長）で行なつた場合に特
に、血清成分からの妨害を受けにくい。 本発明ではNADP⁺及びNADPHを使用しない
一連の反応が用いられるので、NADP⁺及び
NADPHの安定性は本発明では関係がない。さ
らに、本発明によれば、少量の液体サンプルを用
いて溶液様式でも乾燥様式でも水性液（たとえ
ば、血清）のアツセイが可能である。また、本発
明の実施に使用する酵素は比較的広いPH範囲にわ
たつて活性である。従つて、厳密なPHコントロー
ルは不要である。本発明の組成物を用いる乾燥分
析要素においては、クレアチンキナーゼ活性化剤
は、このような要素中で比較的高い活性化剤濃度
が使用し易いような場所にまたは形態で使用でき
る。思いがけないことに、ある種のメルカプト−
含有活性化剤、すなわち、Ｎ−アセチルシステイ
ンは乾燥要素中のクレアチンキナーゼを充分に活
性化して正確で再現性のある結果を生じ、同時に
色原体を無視できるほどしか妨害しないことが判
明した。プレインキユベーシヨン工程もまた、こ
の乾燥要素の使用によつて回避される。 作 用 本発明は、水性液中のクレアチンキナーゼの定
量に関する。本発明の実施は、生物学的液体、た
とえば、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、
尿、背髄液、喀痰、汗等ならびにヒトまたは動物
の糞便（stool secretions）を用いて行なうこと
ができる。骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、
皮膚等のようなヒトまたは動物の組織の液体標本
も使用できる。本発明の実施に好ましい生物学的
液体はヒトの血清である。ほとんどの場合、血清
は稀釈の必要がないが、クレアチンキナーゼの量
が急性心筋梗塞の患者の血清のように異常に高い
場合には最適な結果を得るために稀釈することが
できる。血清は、加熱したヒトまたは動物の血清
のような高蛋白質溶液で稀釈できる。 以下の議論は分析溶液及び乾燥分析要素の両方
に関するものであるが、試薬は全て乾燥した形態
で提供でき、使用直前に水で再構成できることは
熟練した当業者ならば容易に理解できよう。この
型の組成物は、これによつて明白にされる。 本発明の前記方法における第一の反応は、水性
液サンプル中、クレアチンキナーゼの存在下でク
レアチン及びATPを形成する燐酸クレアチンと
ADPとの反応である。この反応が通常、二価金
属イオンのような酵素補因子の存在下で進行する
ことは当業界で公知である。補因子の例は以下に
述べる。燐酸クレアチンはカルバイオケム
（Calbiochem）〔カルフオルニア州ラ・ジヨラ
（La Jolla）〕を含む多数の入手源のいずれからも
市販されている生物学的化合物である。ADPは
ヌクレオチドATPの加水分解型である。ADPは
多数の商業的入手源、たとえば、シグマ・ケミカ
ル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ州セン
トルイス）から容易に入手できる。 次の反応において、グリセロールキナーゼは
ATPの存在下でグリセロールのＬ−α−グリセ
ロホスフエートへの燐酸化を触媒する。一般に、
本発明をうまく実施するには任意のグリセロール
キナーゼが有用であるが、大腸菌（E.coli）及び
カンジダ・ミコデルマ（Candida mycoderma）
から得たものが好ましい。他の入手源からのグリ
セロールキナーゼ酵素も当業界で公知である。こ
のような材料の充分な議論ならびにそれらの調製
及び反応性に関する詳細な言及は、T.E.バーマ
ン（Barman）、エンザイム・ハンドブツク
（Enzyme Handbook）、Ｉ、スプリンガーフエ
ルラーク（Springer−Verlag）、ニユーヨーク
（1969年）、401〜402ページに見られる。ウアーシ
ントン・バイオケミカル・カンパニー
（Worthington Biochemical Company）（ニユ
ージヤージー州フリーホールド）はグリセロール
キナーゼの商業的入手源である。 本発明の組成物に有用なグリセロールはまた、
たとえば、イーストマン・オーガニツク・ケミカ
ルズ（Eastman Organic Chemicals）（テネシ
ー州キングスポート）から商業的に容易に入手で
きるし、あるいは当業界で公知の手法を用いて製
造できる。グリセロールは遊離型でもグリセロー
ルの脂肪酸エステル（たとえば、トリグリセリ
ド）としても提供できる。本発明の実施には遊離
グリセロールを使用するのが好ましい。 一連の反応の次の工程は、Ｌ−α−グリセロホ
スフエートオキシダーゼ、電子受容体及び比色指
示薬組成物の存在下でＬ−α−グリセロホスフエ
ートを酸化して、比色分析によつて検出可能な物
質を生成することを含む。この物質は液体サンプ
ル中に含まれるクレアチンキナーゼと定量的に関
係する。 Ｌ−α−グリセロホスフエートオキシターゼ
は、種々の入手源から得ることのできる微生物の
酵素である。この酵素及び代表的な入手源に関す
る詳細は、米国特許第4241178号に記載されてい
る。また、次の文献は酵素とその調製及び抽出の
有用な方法とについて述べている：エスダース
（Esders）ら、「ストレプトコツカス・フエシウ
ムATCC 12755からのＬ−α−グリセロホスフエ
ートオキシダーゼの精製及び性質（Purification
and Properties of Ｌ−α−Glycerophosphate
Oxidase from Streptococcus Faecium
ATCC12755）」、J.Biol.Chem.，254，2710〜2715
ページ（1979年）；コデイチエク（Koditschek）
ら、「ストレプトコツカス・フエシウム，F24中
のα−グリセロホスフエートオキシターゼ（α−
Glycerophosphate Oxidase in Strepto−coccus
Faecium，F24）」、ジヤーナル・オブ・バクテリ
オロジー（Journal of Bacteriology），98(3)，
1063〜1068ページ（1969年）及び米国特許第
4166005号〔1979年８月28日にマシユアカー
（Masurekar）らに対して発行された〕。この酵
素はまた、東洋醸造（静岡県）から商業的に入手
し得る。 Ｌ−α−グリセロホスフエートの酸化は比色指
示薬組成物の存在下で起こる。オキシダーゼによ
るＬ−α−グリセロホスフエートの酸化を可能に
し、それと共に比色分析によつて検出可能な物質
を生成できる電子受容体を含む組成物が本発明へ
の使用に適当である。 一実施態様において、Ｌ−α−グリセロホスフ
エートは指示薬組成物中の色原体と直接反応す
る。このような色原体は還元されて、色の変化
（すなわち、吸光度のシフト）を生ずる、すなわ
ち、還元前に無色であるのが発色するか、あるい
は色濃度を減少させる（色のシフトではない）こ
とができる。この場合、色原体が電子受容体であ
る。次に、これらの変化はいずれも監視されてク
レアチンキナーゼ活性が測定できよう。いくつか
のインドフエノール類、フエリシアン化カリウム
及びいくつかのテトラゾリウム塩はこの実施態様
の実施に有用である。たとえば、フエナジンと組
み合わせたまたは単独の２，６−ジクロロフエノ
ール、インドールフエノール、及びフエナジンと
組み合わせたまたは単独の２−（ｐ−インドフエ
ニル）−３−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニ
ル−2H−テトラゾリウムクロリドが特に有用で
ある。 別の好ましい実施態様においては、非色原体電
子受容体、たとえば、酸素は下記式に従つて、Ｌ
−α−グリセロホスフエートを酸化して中間物質
を生成し、それが次に比色指示薬組成物中の独立
した色原体と反応して、比色分析によつて検出可
能な物質を生成する： （3a）Ｌ−α−グリセロホスフエート＋電
子受容体 α−グリセロホスフエートオキシダーゼ ――――――――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエート＋中間物質 (4) 中間物質＋比色指示薬組成物→比色分析によ
つて検出可能な物質。 この好ましい実施態様の実施においてクレアチ
ンキナーゼの定量は、電子受容体としての空中酸
素ならびに(1)過酸化活性を有する物質及び(2)色原
体を含んでなる比色指示薬組成物を用いて行な
う。反応（3a）は反応生成物としてジヒドロキ
シアセトンホスフエート及び過酸化水素を生成す
る。 式(4)において過酸化水素と反応するのに有用な
比色指示薬組成物は当業界で公知である。一般
に、このような組成物は過酸化活性を有する物質
を含んでなる。好ましくは、この物質はペルオキ
シダーゼである。 ペルオキシダーゼは、過酸化水素が別の物質を
酸化する反応を触媒する酵素である。ペルオキシ
ダーゼは一般に、鉄ポルフイリンを含む複合蛋白
質である。ペルオキシダーゼは、西洋ワサビ、じ
やがいも、いちじく樹液及びかぶ（植物ペルオキ
シダーゼ）；乳汁（ラクトペルオキシダーゼ）；な
らびに白血球（ベルドペルオキシダーゼ）中に存
在する。ペルオキシダーゼはまた、微生物中にも
存在し、発酵によつて生成できる。セオレル
（Theorell）及びメーリイ（Maehly）によつて
Acta Chem.Scand.，第４巻、422〜434ページ
（1950年）中に開示されたようないくつかの合成
ペルオキシダーゼもまた有用である。好ましいペ
ルオキシダーゼは西洋わさびから得られたもので
ある。 これらより少し劣るが、シリカゲルに吸収させ
たヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビ
ン、ヘモグロビン、ヘモクロモーゲン、アルカリ
性ヘマチン、ヘミン誘導体、スルホシアン酸鉄、
タンニン酸鉄、フエロシアン化第一鉄、第二クロ
ム酸塩〔たとえば、クロム酸硫酸カリウム
（potassium chromic sulfate）〕等のような物質
も有用である。 比色指示薬組成物はまた、定量的に測定し得る
定量的比色変化（たとえば、発色、色の変化また
は色濃度の変化）を直接的または間接的に生ずる
有色または無色の物質である色原体を含んでな
る。このような色原体は染料、染料形成物質また
は染料前駆体であることができる。色原体の反応
によつて生じる色は、電磁スペクトルの可視領域
（すなわち、約400〜900nm）にある。 本発明に有用な指示薬組成物中に使用できる、
過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で発色
する色原体としては次のものが挙げられる（必要
ならば発色剤と共に用いる）：モノアミン類、ジ
アミン類、フエノール類、ポリフエノール類、芳
香族酸類、ロイコ染料、有色染料等。 ペルオキシダーゼの存在下で酸化され得る物質
を含み且つ比色分析によつて検出可能な物質を生
ずることのできる他の色原体としてはいくつかの
染料形成性組成物が挙げられる。一面では、この
ような色原体は、ペルオキシダーゼによつて酸化
された時にそれ自体とまたはその還元型とさらに
結合して染料を形成することのできる化合物を含
むことができる。このような自己発色化合物は、
当業界で公知の種々のヒドロキシル化化合物を含
む。 検出可能な物質は、フエノール性基または活性
メチレン基を含むような発色剤と酸化縮合するこ
とのできるペルオキシダーゼ−酸化性化合物を含
む色原体とこのような発色剤とによつて形成する
ことができる。このような酸化性化合物の代表的
なものは、ペンジデン及びその同族体、ｐ−フエ
ニレンジアミン類、ｐ−アミノフエノール類、４
−アミノアンチピリン等である。多数の自己発色
化合物を含む広範囲のこのような発色剤は、ザ・
セオリー・オブ・ザ・フオトグラフイツク・プロ
セス（The Theory of the Photographic
Process）、ミーズ（Mees）及びジエームス
（James）編、（1966年）、第17章；コザー
（Kosar）、ライト−センシテイブ・システムズ
（Light−Sensitive Systems）、1965年、215〜
249ページ及び米国特許第4321397号〔1982年３月
23日にニツクス（Nix）らに対して発行された〕
のような先行文献に記載されている。 さらに別の好ましい一面において、比色分析に
よつて検出可能な物質は、ロイコ染料をペルオキ
シダーゼによつて対応する色素型に酸化すること
によつて形成できる。 本発明の実施には、米国特許第4241178号及び
同第4089747号に記載されたロイコ染料を含む
種々のロイコ染料が色原体として有用である。本
発明に使用するのが好ましいロイコ染料は、米国
特許第4089747号のトリアリールイミダゾール類
である。これらの染料は一般に下記式を有する： 〔式中、R¹、R²及びR³は各々、有機基であり、
それらのうち少なくとも１つが炭素数18またはそ
れ以下のオルトまたはパラ−ヒドロキシ−置換ア
リール基である〕。他の２個の基は、炭素基材電
極を用いて標準カロメル電極に対して環状電圧計
によつて測定した場合にイミダゾールの酸化電位
が約−70mV〜約＋110mVであるように選択す
る。ここで用いたアリールは、芳香族炭火水素基
（たとえば、置換された芳香族基を含むフエニル、
ナフチル等）を包含するものとする。炭素原子の
総数は、置換基を含む芳香族基中の炭素原子の数
を指す。有用なトリアリールイミダゾール類及び
それらの製造についての詳細は、米国特許第
4089747号及びここに述べた参考文献に記載され
ている。 特に有用なロイコ染料としては、２−（３，５
−ジメトキシ−４−ヒドロキシフエニル）−４，
５−ビス（４−ジメチルアミノフエニル）イミダ
ゾール、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフ
エニル）−４，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフ
エニル）−1H−イミダゾール及び２−（３−エト
キシ−４−ヒドロキシフエニル−４，５−ビス
（ｐ−ジメチルアミノフエニル）−1H−イミダゾ
ールが挙げられる。 所望の色を形成するためにロイコ染料がしばし
ば発色剤化合物と一緒に用いられることは当業界
において公知である。これらを一緒に用いる場
合、所望の結果を得るために染料と発色剤は特別
に緩衝化された媒体中で適切に組み合わせなけれ
ばならないことも知られている。本発明の実施に
有用な代表的発色剤としては、フエノール、ナフ
トール、芳香族アミンまたは反応性メチレン発色
剤が挙げられる。いくつかのロイコ染料は発色剤
なしでも使用できる。 本発明の実施に有用な比色指示薬組成物の成分
の濃度は、サンプル中のクレアチンキナーゼの濃
度、検出装置の精度、形成される染料、使用され
るアツセイ法等に大きく依存し、当業者ならば容
易に決定できる。代表的な値を以下の第表及び
第表に示す。 本発明の新規なアツセイ組成物は好ましくは、
充分なクレアチンキナーゼ活性を促進する１種ま
たはそれ以上のクレアチンキナーゼ活性化剤を含
む。これらの活性化剤は、比色指示薬組成物に対
して実質的に不活性であるような状態でアツセイ
組成物中に存在する。すなわち、活性化剤は、比
色指示薬組成物に対して実質的に不活性であるよ
うな場所（たとえば、乾燥要素において）または
濃度（または被覆量）もしくは形態（たとえば、
カプセル化）で存在する。たとえば、溶液アツセ
イ法はおいては、活性化剤は、比色指示薬組成物
の成分（すなわち、過酸化物質、たとえば、ペル
オキシダーゼまたは色原体、たとえば、ロイコ染
料）のいずれをも妨害しない（すなわち、反応し
ないかあるいは反応を触媒しない）ように充分に
低い濃度で存在する。このような妨害は普通は、
色原体の望ましくない漂白として表われる。要素
中に活性化剤を配置することによつて妨害を回避
することができる。意外なことに、乾燥要素アツ
セイ法では高濃度の活性化剤を使用でき、さらに
染料の漂白を回避できることが判明した。 種々の化合物が酵素反応においてクレアチンキ
ナーゼを活性化することが知られているが、特に
有用な活性化剤はメルカプト−含有化合物（チオ
ール−含有化合物またはスルフヒドリル化合物と
しても知られる）、たとえば、チオグルコース、
ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、メ
ルカカプトエタノール、グルタチオン、Ｎ−アセ
チルシステイン、システイン、チオグリセロール
及びチオグリコール酸である。溶液アツセイ法及
び乾燥アツセイ法の両者に好ましい活性化剤はＮ
−アセチルシステインである。 溶液アツセイ法においては、任意成分である活
性化剤の最終アツセイ溶液濃度が重要である。溶
液アツセイにおいて本発明を実施する場合には、
活性化剤は最終アツセイ溶液中で測定した時に約
0.2mM未満の量で、好ましくは約0.05〜約
0.15mMの量で存在する。 本明細中に記載した新規組成物の他の成分の濃
度はアツセイされる液体サンプル（すなわち、稀
釈されたもしくは未稀釈の血清またはいくつかの
成分で構成された他の水溶液）に応じて広く変化
させることができる。以下の第表は、溶液アツ
セイに用いる場合の本発明の新規アツセイ組成物
の他の必須試薬の一般的に有用な濃度範囲と好ま
しい濃度範囲に関する基準を示している。これら
の濃度は最終アツセイ溶液中で測定した。所望な
らば、他の試薬（たとえば、酵素、補因子、溶
媒、アデニレートキナーゼ阻害剤等）を溶液中に
含ませることができることは当業界において公知
である。

【表】

【表】 これら範囲外でも有用な結果を得られることは当
然である。しかしながら、これらは一般に、示し
た通り、特に有用である及び好ましいことがわか
つている範囲である。本明細書中においては、酵
素の１国際単位を、標準アツセイ条件下で１分間
に１マイクロモルの物質を転化する酵素の量とし
て定義した。 当業界でよく知られている通り、本発明の実施
に用いた酵素は、各々、PH−活性分布を有する、
すなわち、酵素の活性はPHに応じて変化する。決
定的なことではないが、本発明のアツセイ組成物
は約6.0〜約9.0、好ましくは約6.5〜約7.5のPHに
おいて緩衝化することが望ましい。緩衝化をする
方法及び緩衝剤は当業界において公知である。 本発明の方法及び組成物は溶液アツセイ及び乾
燥要素アツセイの両方に適応し得る。たとえば、
前記試薬組成物と適当な溶媒（たとえば、アセト
ン）とを含む溶液を調製し、水性液のサンプルを
所定容量の該組成物に加えることによつて水性液
中のクレアチンキナーゼが容易に測定される。次
いで、発色の割合を一般には37℃で常用の分光光
度計を用いて監視する。この溶液アツセイ法は例
１においてより詳細に述べる。 あるいは、試薬組成物は、米国特許第3992158
号〔1976年11月16日にプルジビロビツツ
（Przybylowicz）らに対して発行された）に記載
されているような乾燥分析要素に含ませるのが好
ましい。次いで、この要素をクレアチンキナーゼ
含有サンプルと接触せしめる（たとえば、要素に
サンプルをスポツトする）ことによつてクレアチ
ンキナーゼの量を測定する。この場合、要素の帯
域の１つにおける色の変化の割合はATP形成の
割合に直接的に相関し、それがさらにサンプル中
のクレアチンキナーゼ活性の割合に直接的に相関
する。 本発明の分析要素は一般に、本発明の組成物の
試薬を含む少なくとも１つの帯域を有する。この
要素中で、クレアチンキナーゼ活性化剤は、比色
指示薬組成物に対して実質的に不活性であるよう
な濃度もしくは形態（たとえば、カプセル化）で
またはそのような場所に存在することができる。
要素は支持体と複数の（少なくとも第１及び第２
の）帯域を含み、各帯域がある種の試薬を含んで
いることが好ましい。好ましくは、第１の帯域は
支持体に隣接する。これらの帯域は互いに液体接
触し、このことは隣接する帯域の重ね合わせられ
た領域の間を液体が通過できることを意味してい
る。すなわち、液体接触とは、液体接触している
帯域の間で液体の成分を輸送できる能力を指す。
好ましくは、帯域は、別個の被覆層であるが、１
個またはそれ以上の帯域が要素の１つの層中にあ
ることもできる。代表的な乾燥要素の形式は当業
界において公知であり、たとえば、前述した米国
特許第3992158号；ならびに、米国特許第4042335
号〔1977年８月16日にクレメント（Cl′ement）
に対して発行された〕；同第4144306号〔1979年３
月13日にフイギヤラス（Figueras）に対して発
行された〕；同第4132528号〔1979年１月２日にア
イケンベリー（Eikenberry）らに対して発行さ
れた）；同第4050898号〔1977年９月27日にゴツフ
エ（Goffe）らに対して発行された〕；及び再発
行特許第30267号〔1980年５月６日にブラシ
（Bruschi）に対して再発行された〕に記載され
ている。 要素の支持体は任意の寸法安定性材料〔たとえ
ば、ポリ（エチレンテレフタレート）〕から成る
ことができ、透明であるのが好ましい。 本発明の分析要素において、クレアチンキナー
ゼ活性化剤は意外にも、溶液アツセイ法で用いら
れるよりもはるかに多量に用いることができる。
たとえば、要素中に活性化剤は約2g／m²以下
（すなわち、130mMまで）、好ましくは約0.15〜
約1g／m²（すなわち、10〜65mM）の被覆量で存
在できる。 本発明の実施においては、クレアチンキナーゼ
の活性によつて生ずる色が活性化剤によつて消え
ないように活性化剤と比色指示薬組成物とは要素
の異なる帯域に位置せしめるのが望ましい。好ま
しくは、比色指示薬組成物を第１の帯域に、活性
化剤を第２の帯域の位置せしめる。１個またはそ
れ以上の他の帯域（たとえば、試薬、下塗り、塗
布、遮断帯域）もまた、要素中に、たとえば、第
１の帯域と第２の帯域との間に存在することがで
きる。 後述の例３〜８に示されるように、いくつかの
活性化剤がクレアチンキナーゼを多少活性化する
のに有用である。他の活性化剤、たとえば、チオ
グルコースはクレアチンキナーゼを中程度に活性
化し、色原体を無視できる程度しか妨害（たとえ
ば、染料漂白）しない。しかしながら、特に好ま
しい活性化剤であるＮ−アセチルシステインは特
に高い活性化能を示すと共に色原体を無視できる
程度しか妨害しないことが観察された。 本発明の組成物を用いるために適応される材料
及び要素は、たとえば、米国特許第3092465号、
第3418099号、第3418083号、第2893843号、第
2893844号、第2912309号、第3008879号、第
3802842号、第3798064号、第3298739号、第
3915647号、第3917453号、第3993594号、第
3936357号、第4270920号、第4248829号、第
4255384号及び第4256693号、英国特許第2052057
号ならびにリサーチ・デイスクロージヤー
（Research Disclosure）、第146巻、1976年６月、
アイテム（Item）14638に記載されている。 本発明の好ましい一実施態様において、要素は
支持体ならびに支持体上に記載順（支持体から）
に互いに液体接触する次の帯域を含む： α−グリセロホスフエートオキシダーゼならび
に過酸化活性を有する物質及び色原体を含んでな
る比色指示薬組成物を含む記録帯域； 燐酸クレアチン、アデノシン二燐酸、グリセロ
ール及びグリセロールキナーゼを含む試薬帯域；
ならびに クレアチンキナーゼ活性化剤、好ましくはＮ−
アセチルシステインを含む等方的に多孔質の塗布
帯域。 本発明の要素の帯域の１個またはそれ以上は、
緩衝剤、界面活性剤、結合剤（代表的には親水性
結合剤）、アデニレートキナーゼ阻害剤、溶媒、
酵素補因子及びキレート剤を含む望ましいが任意
の種々の他の成分を含むことができ、それらは当
業界において公知である。たとえば、酵素活性を
助長するために場合によつては酵素補因子（一般
的には二価の金属イオン、たとえば、Mg²⁺、
Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺等）を使
用する。さらに、クレアチンキナーゼアツセイに
おいて、アツセイされる液体がアデニレートキナ
ーゼを含む場合にはアデニレートキナーゼ阻害剤
〔たとえば、フツ化ナトリウム、アデノシン一燐
酸及び二アデノシン五燐酸（diadenosine
pentaphosphate）〕を用いることが望ましいこと
が多い。しかしながら、このような使用は本発明
の実施において任意である。要素の詳細及び塗布
帯域の特に適当な成分は前述の米国特許第
3992158号及び米国特許第4258001号〔1982年３月
24日にピアス（Pierce）らに発行された〕ならび
に英国特許出願第2052057号（1981年１月21日公
告された）に見られる。塗布帯域は、たとえば、
繊維材料もしくは非繊維材料またはその両方から
成ることができる。分析要素の例を例２に示す。 本発明の分析要素中の試薬の被覆量は、分析す
る液体に応じて広く変化させることができる。次
の第表は、必須試薬の一般的に有用な被覆量及
び好ましい被覆量に関する基準を示しているが、
他の被覆量も有用である。

【表】 実施例 本発明の実施を説明するために次の例を挙げ
る。 例 １ 溶液アツセイ法 本発明の組成物及び方法を用いるに当り、次の
手法を使用した。比較としての既知のUV反応式
及び本明細書に記載した新規の比色反応式を用い
てクレアチンキナーゼの活性を溶液アツセイで測
定し、両方法で得られた結果を比較した。 市販のウサギ筋肉クレアチンキナーゼの５種の
異なる量（90、167、207、284及び318U／）
を、ローカルの医療施設から入手したヒト血清に
加えることによつて、一連の検量液体サンプルを
調製した。クレアチンキナーゼを活性化するため
に活性化剤チオグルコース約10mMを添加した
後、各検量サンプル約500μを概ね５〜10分間
プレインキユベートした。次いで、使用するま
で、サンプルを氷冷した。 次の成分を含む比色指示薬組成物を調製した： トリアールイミダゾールロイコ染料である２−
（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフエニル）
−４，５−ビス（４−ジメチルアミノフエニル）
イミダゾール2.8mg； 西洋わさびペルオキシダーゼ1.26mg； 溶媒として試薬用アセトン500μ； トリトン^TM（Triton^TM）Ｘ−100界面活性剤
〔ペンシルバニア州フイラデルフイアのローム＆
ハース（Rohm＆Hass）から入手可能〕0.1％；
及び 最終指示薬組成物容量を50mlにするのに充分な
0.1M酢酸イミダゾール緩衝液（PH7.0）。 0.1ml中に次の成分を含む試薬混合物を調製し
た： グリセロール ５マイクロモル； 塩化マグネシウム（補因子）５マイクロモル； ADP2マイクロモル； 燐酸クレアチン 35マイクロモル； グリセロールキナーゼ 0.39U； アデノシン一燐酸（アデニレートキナーゼ活性
阻害剤）５マイクロモル； 二アデノシン五燐酸（アデニレートキナーゼ活
性阻害剤）0.02マイクロモル；及び α−グリセロホスフエートオキシダーゼ12U。 血清を10mMチオグリコースと共に少なくとも
５分間プレインキユベートしてクレアチンキナー
ゼを再活性化した。次いで、活性化した各血清サ
ンプル中のクレアチンキナーゼの活性を次のよう
にして測定した。 比色指示薬組成物約0.9mlを試薬混合物0.1mlと
共に５個のキユベツトの各々の中で37℃におい
て、分光光度計で640nmのバツクグラウンド吸光
度がそれ以上観察されなくなるまで、簡単にプレ
インキユベートした。次いで、活性化された各血
清サンプル約10μを各キユベツトに加えて反応
を開始させ、そして640nmにおける発色の割合を
ベツクマンモデル（Beckman Model）25分光光
度計を用いて測定した。各キユベツト中のクレア
チンキナーゼ活性化剤の最終濃度は約0.1mMで
あつた。 各血清サンプル中のクレアチンキナーゼ活性
を、340nmの紫外線検出を生ずる既知の一連の反
応を用いて同様にして測定した。クレアチンキナ
ーゼ活性のこの対照測定は、活性された各血清サ
ンプル10μをカルバイオケム（Calbiochem，カ
リフオルニア州ラ・ジヨラ）から市販されている
クレアチンキナーゼマツクス−パツク^TM（Max
−Pack^TM）キツト中の試薬混合物に加えること
によつて行なつた。この場合も、吸光度測定にベ
ツクマンモデル25分光光度計を用いた。このUV
アツセイは既知の一連の反応、すなわち、前に述
べたタイエツツの参考文献の467ページ、反応
45a〜45cに教示されているものを用いる。 UV対照測定及び比色測定によつて得られたデ
ータを用いて作製した検量線は全検量範囲にわた
つて直線であつた。これら２方法の間の回帰線の
勾配は0.99であつた。このことは本発明の方法に
よる液体サンプル中のクレアチンキナーゼ濃度の
測定が信頼できるものであることを示している。 ３個の血清サンプル（クレアチンキナーゼ濃度
は各々37162及び365U／である）の各各の６回
の反復溶液アツセイを、本例中で前に述べた比色
法を用いて行ない、本発明の方法の精度を求め
た。この結果を以下の第表に示す。変動係数
は、標準偏差を平均値の百分率で表わしたもので
あり、相対変動の指標である。

【表】 比較においては、UVアツセイ法を用いた３回
の反復溶液アツセイでクレアチン濃度365U／
におけるCOVは10％であつた。本発明の比色法
に関するCOV値が低いのは、この方法が極めて
正確なクレアチンキナーゼ測定法であることを示
している。 、標準偏差及び変動係数は標準法に従つて求
めた。 例 ２ 乾式分析要素 前述の米国特許第3992158号中の一般的記載に
従つて、次の構造の乾式分析要素を調製した： 展開帯域−アセチルシステイン活性化剤 （0.5g／m²） 酢酸セルロース結合剤 トリトン^TM（Triton^TM）Ｘ−405 界面活性剤¹ ブリジ^TM（Brij^TM）98界面活性剤² ポリウレタン結合剤 二酸化チタン 下塗帯域 ポリ（−イソプロピルアクリルアミ
ド） 試薬帯域ゼラチン結合剤 ２−ビス（２−ヒドロキシエチル）ア
ミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，
３−プロパンジオール緩衝剤（PH＝
７）トリトン^TMＸ−200界面活性剤¹燐
酸クレアチン（1.5g／m²） アデノシン二燐酸（0.15g／m²） アデノシン一燐酸 グリセロール（0.20ｇ／m²） 酢酸マグネシウム 二アデノシン五燐酸 グリセロールキナーゼ（4300U／m²） 記録帯域ゼラチン結合剤 ビスビニルスルホニルメチルエーテル
硬化剤 ２−ビス（２−ヒドロキシエチル）ア
ミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，
３−プロパンジオール緩衝剤（PH＝
７）５，５−ジメチル−１，３−シク
ロヘキサンジオン酸化防止剤 ２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒド
ロキシフエニル）−４，５−ビス（４
−ジメチルアミノフエニル）ロイコ染
料（0.2g／m²） ２，４−ジ−ｎ−ペンチルフエノール
溶媒 アルカノール^TM（Alkanol^TM）XC界
面活性剤³ トリトン^TMＸ−200界面活性剤¹ アスコルビン酸オキシダーゼ ペルオキシダーゼ（32000U／m²） グリコール酸 α−グリセロホスフエートオキシダー
ゼ（3200U／m²） 支持体 ポリ（エチレンテレフタレート） １ ペンシルバニア州フイラデルフイアのローム
＆ハース（Rohm＆Hass）から入手可能。 ２ イリノイ州シカゴのユニオン・カーバイド
（Union Carbide）から入手可能。 ３ デラウエア州ウイルミントンのデユポン
（Dupont）から入手可能。 要素に血清サンプル10μスポツトした場合に
32mMとなるような充分な濃度でＮ−アセチルシ
ステインを展開帯域（spreading zone）に混合
した。活性化剤に血清サンプル中のクレアチンキ
ナーゼを活性化させるためには、要素のプレイン
キユベーシヨンは必要なかつた。さらに、意外な
ことに、このような高濃度で存在する活性化剤に
よつて色原体は妨害されなかつた。 種々の量のクレアチンキナーゼ（7.5〜
2673U／）を含むヒト血清サンプル約10μを
前記要素にスポツトし、ベツクマンモデル25分光
光度計（乾燥要素アツセイに使用するために変形
した）を用いて37℃、670nmにおいて約５分間に
わたつて色濃度を測定した。同一のサンプルをま
た、ロートケム^TM（Rotochem^TM）遠心分析機
〔メリーランド州シルバー・スプリングスのアミ
コ（AMICO）から入手可能〕を用いてアツセイ
した。 ロートケム^TMアツセイ及び本発明の要素によつ
て得られたデータを用いて直線の回帰曲線をプロ
ツトした。この曲線の勾配は0.984、切片は
5.8U／及びγ値は0.993であり、これら全ては、
本発明の要素中で実施された本発明の比色法によ
つて、アツセイされたヒト血清中のクレアチンキ
ナーゼ活性が信頼性を持つて正確に測定されたこ
とを示している。 例 ３〜８ 種々のクレアチンキナーゼ活性化剤の使用 種々のクレアチンキナーゼ活性化剤を展開帯域
中に混合した以外は、例２に記載したのと同様に
して乾式分析要素を調製した。標準（45〜
300U／）、中程度（300〜600U／）及び高度
（600U／を超える）のクレアチンキナーゼ活性
を各々含んでなる３種のヒト血清プールからのサ
ンプル10μを各要素にスポツトした。クレアチ
ンキナーゼ活性の割合を例２に記載したのと同様
にして37℃、670nmにおいて測定した。次の第
表に、これらの測定の結果を示す。 さらに、同様にして調製した要素に過酸化水素
10μをスポツトし、クレアチンキナーゼ活性化
剤による塗料漂白の割合を、生ずる濃度の経時的
減少を測定することによつて示した。これらの結
果もまた、次の第表に示す。

【表】 第表のデータから、活性化剤Ｎ−アセチルシ
ステイン及びチオグリコールのいずれも本発明の
要素に有意な染料漂白を引き起こさなかつたこと
は明白である。しかしながら、Ｎ−アセチルシス
テインを含む要素においては、一貫してより不変
の割合が得られた。従つて、試験した活性化剤の
うち、Ｎ−アセチルシステインは思いがけないこ
とに、クレアチンキナーゼの高い活性化と無視で
きる程度の色原体の妨害（すなわち、染料漂白）
を示した。 例 ９ クレアチンキナーゼ活性化剤含有及び非含有要
素 これは、クレアチンキナーゼ活性化剤を含む乾
燥分析要素によるクレアチンキナーゼ活性の測定
と、クレアチンキナーゼ活性化剤を含まない要素
による測定とを比較する比較例である。 対照要素にクレアチンキナーゼ活性化剤を含ま
せなかつた以外は、例２に記載したのと同様にし
て２種の乾燥分析要素を調製した。もう１種は、
Ｎ−アセチルシステインを約0.54g／m²含んでい
た。各種の要素に、例３〜８の血清プールからの
サンプル（すなわち、標準、中程度及び高度のク
レアチンキナーゼ活性を有する）をスポツトし、
次いで、クレアチンキナーゼ活性の割合を測定し
た。活性化剤を含む本発明の要素の場合には、ク
レアチンキナーゼ活性の増加が観察された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水性液中のクレアチンキナーゼの定量方法で
   あつて、 (A)(1) 該水溶液のサンプルを、 (2) クレアチンキナーゼ含有液の存在下で次の
   順序の一連の反応(a)，(b)及び(c)： (a) クレアチンキナーゼの存在下で燐酸クレア
   チンとアデノシン二燐酸とを反応させてク
   レアチン及びアデノシン三燐酸を形成し； (b) グリセロールキナーゼ及びアデノシン三
   燐酸の存在下でグリセロールを燐酸化して
   Ｌ−α−グリセロホスフエートを形成し；
   そして (c) α−グリセロホスフエートオキシダーゼ
   及び比色指示薬組成物の存在下でＬ−α−
   グリセロホスフエートを酸化して吸光度変
   化を生じる反応 を行なう試薬と接触せしめ、そして (B) 該吸光度変化の割合を定量的に検出すること
   を含んでなるクレアチンキナーゼの定量方法。 ２ (a)燐酸クレアチン、(b)アデノシン二燐酸、(c)
   グリセロール、(d)グリセロールキナーゼ、(e)α−
   グリセロホスフエートオキシダーゼ、及び(f)比色
   指示薬組成物を含んでなる、水性液中クレアチン
   キナーゼ定量用組成物。