JPS61146197A - クレアチンホスフオキナ−ゼ活性測定法 - Google Patents

クレアチンホスフオキナ−ゼ活性測定法

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JPS61146197A
JPS61146197A JP26733084A JP26733084A JPS61146197A JP S61146197 A JPS61146197 A JP S61146197A JP 26733084 A JP26733084 A JP 26733084A JP 26733084 A JP26733084 A JP 26733084A JP S61146197 A JPS61146197 A JP S61146197A
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JP
Japan
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glycerol
phosphate
absorbance
activity
reaction
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Pending
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JP26733084A
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English (en)
Inventor
Kazuaki Yoshikawa
吉川 和明
Fujio Shimizu
清水 富士雄
Mitsuru Takada
高田 満
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NITSUSUI SEIYAKU KK
Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Original Assignee
NITSUSUI SEIYAKU KK
Nissui Pharmacetuical Co Ltd
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Publication date
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は心筋硬塞、筋ジストロフィー等の筋疾患の診断
に際しての有効な指標の1つとなっているクレアチンホ
スフォキナーゼ(以下rcPKJと称する)活性の測定
法に係る。
(従来の技術) 現在、CPK活性の測定はクレアチンリン酸を基質とし
、これにN−アセチル−L−システィン、還元型グルタ
チオン等の還元剤を添加してCPKを活性化させ、この
活性化CPKが生成するアデノシン−3−リンWI(以
下rATPJと称する)の測定を基盤とする方法が主流
を占めている。
このATPを測定する従来法としてはへキソキナーゼ及
びグルコース−6−リン酸脱水素酵素を共役酵素として
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドフオス
フエート(NADP)−1)の増加を波長340nlで
測定する方法(Rosalki法)及び更にジアホラー
ゼを用いてニトロテトラゾリウムブルーからホルマザン
色素を生成させることにより可視部での測定を可能にし
た方法(ホルマザン法)とがある。
(発明が解決しようとする問題点) 上記両従来法の内で、Rosalki法は反応を停止さ
せずに単位時間当りのNADPH増加量を測定すること
を基礎とするものであるから反応時間等に厳密な規制が
あり、多数の検体を連続的に処理する方法として必ずし
も好適なものとは言えない。
一方、ホルマザン法においては、反応試薬が不安定であ
り試薬ブランク吸光度の増加が著しいために測定精度に
問題点があり、又生成するホルマザン色素が水に離溶性
を有しているために測定機器に付着し、その洗浄が面倒
である等の問題点を有している。
従って、本発明は反応停止後に発色させ、可視部での比
色測定を可能にすることによりRosalki法におけ
る問題点を解消させると共に、安定性の^い試薬を用い
て水溶性色素を生成させることによりホルマザン法にお
ける問題点をも解消させるものである。
(問題点を解決するための手段及び作用)本発明によれ
ば、上記問題点は、クレアチンホスフォキナーゼ活性の
測定に当り、共役酵素としてグリセロールキナーゼ(G
K)、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ(GPO
)及びペルオキシダーゼ(POD)を用いることにより
解決される。
本発明方法を更に具体的に述べれば、基質としてのクレ
アチンリン酸にN−アセチル−し−シスナイン、還元型
グルタチオン等の還元剤を添加して被験試料中のCPK
を活性化させ、この活性化〇PKが生成するATPにG
Kを作用させてグリセロールをグリセロール−3−リン
酸に変じ、このグリセロール−3−リン酸にGPOを作
用させてジヒドロキシアセトン−1−リン酸に変ずる場
合に生成する過酸化水素とPODの作用により4−アミ
ノアンチピリンとN−エチル−N−<3−スルホプロピ
ル)−m−アニシジンナトリウム(ADPS)等のトリ
ンダー試薬とを酸化縮合させて水溶性のキノン型色素を
生成させて吸光度を測定し、一方CPK活性が既知の標
準試料を用いて同様に吸光度を測定してCPK活性と吸
光度との関係を予め調べて検」線を作成しておき、上記
被験試料に関して測定された吸光度を検量線と照合する
ことによりクレアチンホスフォキナーゼ活性が測定され
る。
この本発明による測定法は要約すれば下記の2段階反応
工程を利用するものである。
第1反応工程 活性化CPK 第2反応工程 GPO H202+4−アミノアンチピリン+トリンダー試薬O
D □→キノン色素 上記第1反応工程においてCPKの活性化に用いるN−
アセチル−し−システィン、還元型グルタチオン等は還
元性を有して°おり第2反応工程におけるキノン型色素
の生成を阻害するので、第2反応工程に使用する試液に
はN−エチルマレイミドを添加してCPK活性に関与す
るSH基をマスりすることが必要である。
更に、第1反応工程の実施において試料である血清中に
ミオキナーゼが存在すると、 ミオキナーゼ のII反応が生じ測定誤差が生ずるので、第1反応試液
にはAMPを予め添加してミオキナーゼ活性を阻害して
おく必要性がある。
(実施例) 次に、使用される反応試液、測定操作方法等について本
発明方法の1例を具体的に説明する。
(1)試液の調整 a) 第1反応試液 下記諸成分を配合して第1反応試液を調製する。
50mM   PIPESII衝液 p )−16,4
注1)20−M   クレアチンリン酸 31M      AMP      注 2)1.5
1M  ADP 5mM   N−アセチル−L−システィン 注3)1
0−M   塩化マグネシウム・6水塩10■M  グ
リセロール 1鶴M  エチレンジアミン−4−酢酸・2ナトリウム
塩 2.5sM  4−アミノアンチピリン2U/II  
 GK 注1:MESIlli液又はイミダ ゾール緩衝液に代替する ことができる。
注2:これはミオキナーゼ阻害 剤であり、pi 、 pi + ジ(アデノシン−5’)ペ ンタホスフェートと併用 することができる。
注3二還元型グルタチオンに代 替することができる。
b) 第2反応試液 下記諸成分を配合して第2反応試液を調製する。
50m M   リン酸1111 pHEl、4   
注4)4a+MN−エチルマレイミド 1iM   エチレンジアミン−4−酢酸・2ナトリウ
ム塩 1mM  ADPS  注5) 0.2%  トリトン X−100注6)5LJ/ml
  GPO O,21J/w+l  POD 注4:MES緩衝液又はMOP S緩衝液に代替すること ができる。
注5:これは発色剤でありフェ ノール系、アニリン系等 の発色剤に代替すること もできる。
注6:これは界面活性剤であり、 乳び血清試料の可溶化の ために用いられるが、こ の目的に供し得れば他の 界面活性剤に代替するこ とができる。
■ 測定操作方法 第2反応試液Q、5mlを採取して37℃で約5分間予
備加温した後に被験血清試料20μQ@:添加し37℃
で正確に10分間反応させる。この反応液に第2反応試
液2.C)eQを添加して37℃で更に5分間反応させ
る。この場合に第2反応試液中のN−エチルマレイミド
により第1反応は停止せしめられ且つ第2反応の結果と
して反応混合物は紫色を呈するのでこの液の吸光度を波
長540+mで測定する。
一方、CPK活性が既知の種々の標準血清試料について
も同様に操作して得た反応混合物について吸光度を測定
して検量線を予め作成しておく。
上記被験試料を処理して測定された吸光度を、上記検量
線に照合して当該試料のCPK活性を求める。
■ 反応性試験 a) 第1反応 出願人会社から「スィートロールA」及び[スィートロ
ールNJ  (共に標章)として市販の血清台50μQ
を試料とし、これを上記第1a項に記載の第1試液と上
記第2項に記載の要領で且つ37℃で反応させて反応1
1間と吸光度との関係及び試液ブランクの安定性を調べ
た処、第1図のグラフに示される通りの結果が得ら社た
。このグラフから明らかな通り、反応時間と吸光度とは
20分間に亘り、安定した且つ直線的な比例関係を有し
ていること並びに試薬ブランクは変動も殆んどなく安定
性の極めて高いことが判明した。
b) 第2反応 出願人会社から市販の既述の「スィートロールA」及び
「スィートロールN」を血清試料とし、これを上記第2
項に記載の要領で処理操作し第2反応における反応時間
と吸光度との関係及び試液ブランクの安定性を調べた処
、第2図のグラフに示される通りの結果が得られた。こ
の図から明らかな通り第2反応は5分以内に終了し、そ
の後吸光度に変化は生じないので、第2反応試液の添加
から5分経過後であれば任意の時期に且つ正確にCPK
活性を測定し得ること並びに試液ブランクの安定性が極
めて高いことが判明した。
(4)検量線の作成 ヒトプール血清にウサギ筋肉由来CPK (西ドイツの
ベーリンガー社製)を添加して高CPK血清(CPK活
性1190  U/Q>を調整し、これを生理食塩水で
段階稀釈して被験試料として上記第2項に記載の要領で
処理操作して吸光度を測定し、被験試料におけるCPK
活性値と吸光度との関係をプロットした処、第3図のグ
ラフに示される通りの結果が得られ、両者は直線的な関
係を有し、従ってこのグラフは検量線として有用である
ことが判明した。
■ 本発明方法とホルマザン法との相関50検体に関し
、本発明方法により測定された血清CPK活性値と、本
出願人会社から市販の血清CPKill定用試桑「ニツ
スイ」 (ホルマザン法に準拠)を用いて得られた血清
CPK活性値との相関関係を調べた処、第4図のグラフ
に示される通りの結果が得られた。
回帰式は y−1,19x−8,5 y二本発明方法 X :ホルマザン法 であり、相関係数は0.996であって両者間に良好な
相関のあることが確認された。
【図面の簡単な説明】
第1図は標準血清試料と第1反応試液とを反応させた反
応混合物における反応時間と波長540■で測定した吸
光度との関係及び第2反応試液自体の経時吸光度変化を
示すグラフ、第2図は標準血清試料と第1反応試液とを
反応させ、次いで第2反応試液と反応させ、この第2反
応工程における反応時間と波長540amで測定した吸
光度との関係及び第1反応試液自体の経時吸光度変化を
示すグラフ、第3図はクレアチンホスフォキナーゼ活性
が既知の標準試料の生理食塩水による稀釈系列を作成し
、これら試料を用いて第1及び第2反応試験液と反応さ
せて得た反応混合物の吸光度を測定し、この吸光度と稀
釈率との関係をプロットして作成した標準検量線を示す
グラフ、第4図は本発明方法と従来のホルマザン法との
相関関係を示すグラフである。 特 許 出 願 人  日水報薬株式会社乙゛1 第1図 5!応吟r、1(介) 第2図 □スィートロールA(20,y/) 反応時間(介) 生11食堪水t;よ番禰甲1勤lの望7第4図

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)クレアチンホスフォキナーゼ活性測定法であって
    、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール
    −3−リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを用い
    ることを特徴とする、クレアチンホスフォキナーゼ活性
    測定法。
  2. (2)基質としてのクレアチンリン酸にN−アセチル−
    L−システィン、還元型グルタチオン等の還元剤を添加
    して被験試料中のクレアチンホスフォキナーゼを活性化
    させ、この活性化クレアチンホスフォキナーゼが生成す
    るアデノシン−3−リン酸にグリセロールキナーゼを作
    用させてグリセロールをグリセロール−3−リン酸に変
    じ、このグリセロール−3−リン酸にグリセロール−3
    −リン酸オキシダーゼを作用させてジヒドロキシアセト
    ン−1−リン酸に変ずる場合に生成する過酸化水素とペ
    ルオキシダーゼの作用により4−アミノアンチピリンと
    N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−m−アニシ
    ジンナトリウム等のトリンダー試薬とを酸化縮合させて
    水溶性のキノン型色素を生成させて吸光度を測定し、一
    方クレアチンホスフォキナーゼ活性が既知の標準試料を
    用いて同様に吸光度を測定してクレアチンホスフォキナ
    ーゼ活性と吸光度との関係を予め調べて検量線を作成し
    ておき、上記被験試料に関して測定された吸光度を検量
    線と照合することを特徴とする、特許請求の範囲第1項
    に記載のクレアチンホスフォキナーゼ活性測定法。
JP26733084A 1984-12-20 1984-12-20 クレアチンホスフオキナ−ゼ活性測定法 Pending JPS61146197A (ja)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59135900A (ja) * 1983-01-18 1984-08-04 イ−ストマン・コダツク・カンパニ− クレアチンキナ−ゼの定量用組成物及び定量方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59135900A (ja) * 1983-01-18 1984-08-04 イ−ストマン・コダツク・カンパニ− クレアチンキナ−ゼの定量用組成物及び定量方法

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