JPH0536037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、呈色妨害物質による影響を回避し
た、トリフエニルメタン系ロイコ色素を発色剤と
する体液成分の定量方法に関する。 トリフエニルメタン系ロイコ色素は酸化発色し
た際の呈色波長が600nm以上と長波長側にあり、
分子吸光係数も５万以上と大きく、しかも呈色後
の経時的退色が殆どないなど、従来の被酸化性呈
色試薬と比べて優れた長所を有している為、微量
の酸化性物質例えば過酸化水素の定量や、ペルオ
キシダーゼ様物質の定量などへの応用が試みられ
ている。例えば、Analytical Chemistry
Vo1.42，p.410−411（1970）には、ロイコクリス
タルバイオレツト（LCV）とペルオキシダーゼ
（POD）の組合せ試薬を用いてH₂O₂を定量でき
ることが報告されており、又、Clinical
Chemistry Vo1.21，p.362−369（1975）には、ロ
イコマラカイトグリーン（LMG）とH₂O₂を用い
てヘモグロビンやその他のヘム化合物の定量を試
みた結果が報告されている。しかしながら、前者
に於けるH₂O₂の定量は単なる一般的なH₂O₂の定
量であつて、体液成分の定量に於て酵素反応によ
り生成するH₂O₂の定量に関しては全く触れられ
ていないし、又、後者に於ては、試料中のタンパ
クの影響を受け、検量線の直線性に乏しいことが
報告されている。更に、特開昭56−26199号公報
には、トリフエニルメタン系ロイコ色素であるビ
ス（ｐ−ジエチルアミノフエニル）−２−スルホ
フエニルメタン（以下、BSPMと略称する。）を
用いる“血清、尿などの中に含有されている微量
成分の定量法”が開示されているが、本発明者ら
の追試によれば、血清について同明細書に記載さ
れているような定量性は全く得られなかつた。即
ち、体液成分の定量等の臨床化学分析の分野に於
ては、トリフエニルメタン系ロイコ色素は未だ実
用化に到つていないというのが実状である。 本発明者らは、体液成分の定量に於て、トリフ
エニルメタン系ロイコ色素の酸化発色に影響を及
ぼしている呈色妨害物質について鋭意研究した結
果、タンパクと尿酸がその元兇であり、特に尿酸
が大きな妨害となることを突き止め、これら妨害
物質の影響回避方法について更に研究を重ねた結
果、尿酸についてはウリカーゼを添加することに
より、目的を達し得ることを見出し、本発明を完
成するに到つた。 即ち、本発明は、 一般式［］ 〔式中、R₁，R₂，R₃，R₄は水素又は低級アル
キル基を表わし、夫々同じであつても互いに異つ
ていても良く、X₁，X₂は水素、−SO₃M₁，−
COOM₂， −Ｏ（CH₂）mSO₃M₃，−Ｏ（CH₂）nCOOM₄、
又は

【式】 （但し、M₁，M₂，M₃，M₄は水素、アルカリ
金属イオン又はNH₄ ⁺を示し、R₅，R₆は水素又は
低級アルキル基を示し、ｍ，ｎは夫々２〜４の整
数を示す。）を表わし、夫々同じであつても互い
に異つていても良い。〕で示されるトリフエニル
メタン系ロイコ色素を発色剤として用い、（）
ペルオキシダーゼの共存下、基質、又は酵素反応
により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成
する過酸化水素を定量するか、又は（）を過
酸化水素の共存下に体液中のペルオキシダーゼ様
物質を定量することにより行う体液成分の定量方
法に於て、ウリカーゼの共存下が該測定を行うこ
とを特徴とする、定量方法の発明である。 本発明者らは、上記に加え、更にタンパクの影
響回避方法についても研究を重ねた結果、タンパ
クは特定の界面活性剤又は特定の金属キレートを
添加することにより、影響を回避し得ることも見
出した。 本発明に於て用いられる、タンパクの妨害を除
く効果のあるアニオン系界面活性剤としては、一
般式〔〕 又は一般式〔〕 R₆Ｏ（CH₂CH₂Ｏ）lSO₃M₆ 〔〕 〔但し、R₅は炭素数８〜９のアルキル基を、
又R₆は炭素数８〜18のアルキル基を夫々表わし、
M₅，M₆は夫々アルカリ金属イオン、アンモニウ
ムイオン又は第４級アンモニウムイオンを表わ
し、ｋ，ｌは夫々１〜６の整数を表わす。〕で表
わされるアニオン系界面活性剤が有効であり、具
体的商品としては一般式〔〕に該当するものと
して、エマールNC（ポリオキシエチレンアルキ
ルフエニルエーテル硫酸ナトリウム：花王石鹸(株)
商品名）、ニユコール560SF（ポリオキシエチレン
ノニルフエニルエーテル硫酸アンモニウム：日本
乳化剤（(株)９商品名）、ニツコールSNP−4T（ポ
リオキシエチレンノニルフエニルエーテル硫酸ト
リエタノールアミン）等が、一般式〔〕に該当
するものとして、エマール20C（ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル硫酸ナトリウム：花王石鹸
(株)商品名）、サンノール605D（ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸ナトリウム：ライオン(株)
商品名）、ニツコールNES−303（ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミ
ン：日光ケミカルズ(株)商品名）等が挙げられる
が、これらに限定されるものでないことは云うま
でもない。これら界面活性剤は通常、発色試液中
正味0.01〜10％の濃度になるように用いられる。 又、タンパクの妨害物質を除く効果のある金属
−EDTA（エチレンジアミン四酢酸）キレートと
しては、例えば、Fe（）−EDTA，Mn（）−
EDTA，Ni（）−EDTA等、通常市販されてい
る金属−EDTAキレートは全て例外なく使用で
きる。これら金属キレート化合物の添加量は
0.005％以上であれば効果が認められるが、通常
は0.01〜0.5％が好ましく用いられる。 一方、本発明に於て、尿酸の妨害を回避する為
に用いるウリカーゼは、尿酸の酸化酵素であつ
て、通常、尿酸に作用してこれをアラントインと
過酸化水素及び炭酸ガスに変えるが、本発明に於
ては、トリフエニルメタン誘導体及びペルオキシ
ダーゼ（又はペルオキシダーゼ様物質）の存在下
尿酸にウリカーゼを作用させることにより、過酸
化水素の生成を伴わずにこれを分解することがで
きる為、トリフエニルメタン系ロイコ色素が尿酸
の分解によつて生ずる過酸化水素により酸化され
て発色するというようなことは全くなく、妨害物
質である尿酸を極めて容易に且つ効果的に除くこ
とができる。ウリカーゼの添加量は、一般に
50U／以上であればよいが、通常は100〜
500U／の範囲が好ましく用いられる。即ち、
尿酸の妨害を除くには、尿酸を含有する試料に、
例えばPH６〜８の緩衝液中にトリフエニルメタン
系ロイコ色素0.01〜0.3mmol／ｌ、ウリカーゼ50
〜500U／、ペルオキシダーゼ100〜10000U／
及び要すれば適当量の界面活性剤を含む試液を
加えれば、尿酸は直ちに分解される。しかもその
際過酸化水素は生成せず、従つて、それによるト
リフエニルメタン系ロイコ色素の発色も全くな
い。分解された尿酸は、アロキサン又はその分解
生成物と尿素に変わつていることが推測される
が、いずれにしても、このようにH₂O₂の発生を
伴わずに尿酸がウリカーゼにより分解されるとい
うような文献記載はこれまでに全くない。かかる
現象は他の被酸化性呈色試薬には全く認められ
ず、トリフエニルメタン系ロイコ色素に特有の効
果であることを本発明者らが初めて見出したので
あるが、通常のウリカーゼの尿酸に対する酵素作
用とは全く異つた働きをウリカーゼに誘起させる
ものであり全く意想外のことである。 通常、血清中にはタンパクと尿酸の両方が存在
しているので、血清中の成分をトリフエニルメタ
ン系ロイコ色素を発色剤として酵素法（H₂O₂−
POD系）により測定する場合や、血清中のヘモ
グロビンをH₂O₂系で測定する場合などは、本発
明に係るアニオン系界面活性剤又は金属キレート
化合物とウリカーゼの両者を併用することによ
り、タンパク及び尿酸いずれの妨害をも回避で
き、より正確な測定値を容易に得ることができ
る。 本発明に於て発色剤として用いられるトリフエ
ニルメタン系ロイコ色素は、通常、一般式〔〕 〔式中、R₁，R₂，R₃，R₄は水素又は低級アル
キル基を表わし、夫々同じであつても互いに異つ
ていても良く、X₁，X₂は水素、−SO₃M₁，−
COOM₂，−Ｏ（CH₂）mSO₃M₃，−Ｏ（CH₂）
nCOOM₄、又は

【式】（但し、 M₁，M₂，M₃，M₄は水素、アルカリ金属イオン
又はNH₄ ⁺を示し、R₅，R₆は水素又は低級アルキ
ル基を示し、ｍ，ｎは夫々２〜４の整数を示す。）
を表わし、夫々同じであつても互いに異つていて
も良い。〕で表わされるものが多く用いられ、具
体例としては、例えば前掲のLCV，LMG，
BSPMの他に、本発明者らが最近開発し、特許
出願した、ビス（ｐ−ジエチルアミノフエニル）
−４−スルホプロポキシフエニルメタンナトリウ
ム（以下、BSproPMと略称する。）や、ビス
（ｐ−ジエチルアミノフエニル）−３，４−ジスル
ホプロポキシフエニルメタンジナトリウム（以
下、BSdiproPMと略称する。）などが挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、実際に
は、上記一般式には関係なく、発色剤として用い
得る殆ど全てのトリフエニルメタン系ロイコ色素
がこれに適用され得る。 本発明はトリフエニルメタン系ロイコ色素を発
色剤として用いる、酵素法（H₂O₂−POD系）に
よる体液成分の定量、例えば体液中のグルコー
ス、コレステロール、トリグリセライド、リン脂
質、コリン、クレアチン、クレアチニン、胆汁酸
等の基質の定量やモノアミンオキシダーゼ等の酵
素活性の測定に於て、並びにH₂O₂を用いた体液
中のペルオキシダーゼ様物質、例えばヘモグロビ
ン等の定量に於て、トリフエニルメタン系ロイコ
色素の酸化発色を妨害する物質の影響を回避し、
より正確な測定値が容易に得られる方法を提供す
るものであり、酸化発色した際の呈色波長が
600nm以上と長波長側にあり、分子吸光係数も５
万以上と大きく、而も呈色後の経時的退色が殆ど
ないなど優れた長所を有するトリフエニルメタン
系ロイコ色素の臨床化学分析への応用を可能なら
しめた点に於て、斯業に貢献するところ極めて大
なるものである。 以下に、実験例、実施例、参考例及び比較例を
挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではないこと
は云うまでもない。 実験例 １ (1) 試薬の調製 発色試液 0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）中にBSdiproPM
0.05mmo／，POD 3000U／及び呈色妨害
防止剤として、アニオン系界面活性剤の割合は２
％、金属−EDTAキレートの割合は0.2％を含む
ように調製し、夫々発色試液とする。 アルブミン溶液 人アルブミン（Sigma社製Albumin，Human
Fraction Ｖ 96〜99％）5gをとり蒸留水を加え
て全量100mlとする。 尿酸標準液 常法に従い尿酸150mg／の水溶液を調製する。 H₂O₂標準液 H₂O₂を夫々30ppm，60ppmを含む水溶液を調
製しH₂O₂標準液，とする。 (2) 測定操作 試料として、水、アルブミン溶液及び尿酸標準
液各50μをとり、発色試液３mlを加えて混合し
たのち、H₂O₂標準液又は20μを加えて37℃
恒温槽中10分間放置したのち試薬ブランクを対照
として、波長620nmにおける吸光度を測定する。 結果を第１表に示す。

【表】 第１表より明らかなように、本発明に係るアニ
オン系界面活性剤又は金属キレートを用いること
によりアルブミンによる呈色妨害は回避すること
ができる。しかし、これにより尿酸の妨害を回避
することはできない。 参考例 (1) 試薬の調製 発色試液 実験例１に同じ。（呈色妨害防止剤含まず。） 尿酸標準液 常法に従い尿酸０，25，50，75，100mg／の
水溶液を調製する。 H₂O₂標準液 H₂O₂を夫々15，30，45，60ppmを含む水溶液
を調製する (2) 測定操作 実験例１に従い試料として尿酸標準液を用いて
操作し吸光度を測定する。 結果を第２表に及び第１図に示す。

【表】 第２表及び第１図から明らかなように尿酸の存
在により負の誤差を生じ、検量線は湾曲し原点を
通らない。負誤差は尿酸の量が増えるに従い大き
くなるが比例はしない。 実験例 ２ (1) 試薬の調製 発色試液 実験例１に同じ。（呈色妨害防止剤含まず。） 尿酸標準液 上記参考例に同じ。 H₂O₂標準液 上記参考例に同じ。 (2) 測定操作 発色試液にウリカーゼを200U／の濃度にな
るように添加し、それを用いて参考例と同様に操
作して吸光度を測定する。 結果を第３表に示す。

【表】 第３表から明らかなように、ウリカーゼを用い
ることにより尿酸の影響は全く消失し、H₂O₂の
測定値には全く影響が無い。 実施例１ 血清モノアミンオキシダーゼの活性測
定 (1) 試薬の調製 基質発色試液 20mMリン酸緩衝液（PH7.0）に、基質として
アリルアミン15mmo／、ウリカーゼ200U／
、BSdiproPM 0.03mmo／、エマールNC
（花王石鹸(株)商品名）５％、POD300U／の濃
度になるように溶解し、基質発色試液とする。 反応停止液 ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム
8.9mmo／の水溶液を調製する。 モノアミンオキシダーゼ溶液 Sigma社製牛由来モノアミンオキシダーゼを用
いて、5IU／，10IU／，20IU／の水溶液
を調製する。 (2) 測定操作 血清50μをとり、基質発色試液３mlを加え、
37℃の恒温槽中30分間加温後反応停止液50μを
加えて混和したのち、試薬ブランクを対照として
波長620nmにおける吸光度を測定する。 モノアミンオキシダーゼ溶液を用いて血清と同
様に操作して吸光度を測定し、検量線を作成す
る。 第２図に検量線を示す。 検量線から試料中のモノアミンオキシダーゼ活
性を求める。 実施例２ 血清中の微量ヘモグロビンの定量 (1) 試薬の調製 試液Ｉ ロイコマラカイトグリーン2gを酢
酸３容と水１容の混液100mlに溶する。 試液 グリシン30g、尿素200gを水約900
mlに溶解後塩酸でPH4.に調製し、エマール
NC30℃を加えたのち水で全量1000mlとする。 試液 30％H₂O₂１mlに水を加えて100mlと
する。 ウリカーゼ溶液 0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）にウリカーゼ
を200U／の濃度になるように溶解する。 血清 ヘモグロビン不含のプール血清（尿酸50mg／
を含有）にヘモグロビンを加えて、夫々ヘモグロ
ビン0.34，0.68，1.0，1.5，2.0mg／含む血清を
調製する。 (2) 測定操作 血清0.1mlをとり、ウリカーゼ溶液１ml、試液
１mlを加えて37℃恒温槽中５分間加温後、試液
１ml、試液１ml、試液0.2mlを加えて37℃
恒温槽中60分間加温したのち、試薬ブランクを対
照として620nmにおける吸光度を測定する。 第３図に検量線を示す。 比較例 血清中の微量ヘモグロビンの定量 (1) 試薬の調製 試液 実施例２と同じ。 試液 実施例２の試液の組成のうち、エ
マールNCを含まないもの。 試液 実施例２に同じ。 血清 実施例２に同じ。 (2) 測定操作 血清0.1mlをとり、0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
１ml、試液I1ml、試液１ml、試液0.2mlを加え
て実施例４と同様に操作し620nmにおける吸光度
を測定する。 第３図に検量線を示す。 第３図から明らかなように、本発明に係る実施
例２は原点を通る直線になるが比較例では、タン
パク及び尿酸の影響の為原点を通らない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実験例２に於て、第２表の結果を図
示したものであり、横軸の各H₂O₂標準液濃度
（ppm）について得られた吸光度（OD）を、縦
軸に沿つてプロツトした点を結んだものである。
但し、−×−×−は尿酸標準液濃度が０mg／
（水）、−・−・−は25mg／、−○−○−は50mg／
、−△−△−は75mg／及び−□−□−は100
mg／の場合を夫々表わす。第２図は、実施例１
に於て得られた検量線を表わし、横軸の各モノア
ミンオキシダーゼ活性（IU／）について得ら
れた吸光度（OD）を、縦軸に沿つてプロツトし
た点を結んだものである。第３図は、実施例２及
び比較例に於て得られた検量線を表わし、−×−
×−は実施例２の、−・−・−は比較例の場合を
夫々表わす。横軸のヘモグロビン濃度（mg／）
について得られた吸光度（OD）を、縦軸に沿つ
てプロツトした点を結んだものである。尚、上記
測定のセル層厚はいずれも10mmである。

【特許請求の範囲】

１ 生体成分又は生体成分に酵素を作用させて生
じた物質に特異的に作用する酸化酵素を作用さ
せ、生成する過酸化水素を測定することにより行
なう生体成分の定量法に於て、生成する過酸化水
素に４価のチタン化合物と、２−（５−ブロモ−
２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−ス
ルホプロピルアミノ）フエノール又は／及びその
塩とから成る試薬を反応させて色素を生成させ、
該色素を比色測定することを特徴とする生体成分
の定量法。

Claims (1)

1. 質を定量することにより行う体液成分の定量方法
   に於て、ウリカーゼの共存下で該測定を行うこと
   を特徴とする、定量方法。 ２ ウリカーゼに加えて、一般式［］ 若しくは一般式［］ R₆Ｏ（CH₂CH₂Ｏ）lSO₃M₆ ［］ 〔但し、R₅は炭素数８〜９のアルキル基を、
   又はR_bは炭素数８〜18のアルキル基を夫々表わ
   し、M₅，M₆は夫々アルカリ金属イオン、アンモ
   ニウムイオン又は第４級アンモニウムイオンを表
   わし、Ｋ，ｌは夫々１〜６の整数を表わす。〕で
   表わされるアニオン系界面活性剤又は金属−
   EDTA（エチレンジアミン四酢酸）キレート、を
   共存させる、特許請求の範囲第１項に記載の定量
   方法。 ３ 過酸化水素を測定することにより行う体液成
   分の定量がグルコース、コレステロール、トリグ
   リセライド、リン脂質、コリン、クレアチン、ク
   レアチニン、胆汁酸又はモノアミンオキシダーゼ
   の定量である特許請求の範囲第１項又は第２項に
   記載の定量方法。 ４ ペルオキシダーゼ様物質を定量することによ
   り行う体液成分の定量がヘモグロビン又はその他
   のヘム化合物の定量である特許請求の範囲第１項
   又は第２項に記載の定量方法。