JP2713425B2 - ホスファターゼの定量法 - Google Patents
ホスファターゼの定量法Info
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- JP2713425B2 JP2713425B2 JP63161149A JP16114988A JP2713425B2 JP 2713425 B2 JP2713425 B2 JP 2713425B2 JP 63161149 A JP63161149 A JP 63161149A JP 16114988 A JP16114988 A JP 16114988A JP 2713425 B2 JP2713425 B2 JP 2713425B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はホスファターゼの定量法に関する。さらに詳
しくは試料特に生体液中のホスファターゼを定量するに
当たって、ｐ−アミノフェノール類を遊離するような基
質を使用する方法に関する。生成したｐ−アミノフェノ
ール類は公知の方法例えば他のアニリン誘導体やフェノ
ール誘導体と酸化縮合させて定量的に色素を生成させ、
比色定量することができる。
しくは試料特に生体液中のホスファターゼを定量するに
当たって、ｐ−アミノフェノール類を遊離するような基
質を使用する方法に関する。生成したｐ−アミノフェノ
ール類は公知の方法例えば他のアニリン誘導体やフェノ
ール誘導体と酸化縮合させて定量的に色素を生成させ、
比色定量することができる。
従来の技術 従来ホスファターゼの定量法として、次の方法が知ら
れている。
れている。
（Ａ）β−グリセロリン酸を基質として用いホスファタ
ーゼを作用させ、生成するリン酸をモリブデン酸と反応
させてリンモリブデン酸ブルーとして比色定量する方
法。この反応は生体液中の成分であるタンパク質によっ
て阻害されるため、トリクロル酢酸などで前もって蛋白
を除く必要があり、操作が面倒である。〔吉田孝光，北
村元仕，臨床化学分析IV,酵素 88−116（1970）〕。
ーゼを作用させ、生成するリン酸をモリブデン酸と反応
させてリンモリブデン酸ブルーとして比色定量する方
法。この反応は生体液中の成分であるタンパク質によっ
て阻害されるため、トリクロル酢酸などで前もって蛋白
を除く必要があり、操作が面倒である。〔吉田孝光，北
村元仕，臨床化学分析IV,酵素 88−116（1970）〕。
（Ｂ）基質としてフェニルリン酸を用い生成するフェノ
ールを酸化剤例えばフェリシアン化カリウムを使って４
−アミノアンチピリンと縮合させ、500nm付近に極大吸
収を持つ色素を生成させ、これを比色定量する方法。こ
の方法では500nm付近は血液中のヘモグロビンやビリル
ビンなどの影響を受けるほか、フェリシアン化カリウム
などの酸化剤はホスファターゼそのものを阻害するた
め、同時反応が出来ず、２段反応（ホスファターゼの反
応と酸化呈色反応）を行わねばならない。
ールを酸化剤例えばフェリシアン化カリウムを使って４
−アミノアンチピリンと縮合させ、500nm付近に極大吸
収を持つ色素を生成させ、これを比色定量する方法。こ
の方法では500nm付近は血液中のヘモグロビンやビリル
ビンなどの影響を受けるほか、フェリシアン化カリウム
などの酸化剤はホスファターゼそのものを阻害するた
め、同時反応が出来ず、２段反応（ホスファターゼの反
応と酸化呈色反応）を行わねばならない。
（Ｃ）基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用い、遊
離するｐ−ニトロフェノールが405nmに吸収極大を示
し、これによる吸収を希アルカリで反応を止めた後比色
定量する。この方法はヘモグロビン，ビリルビンによる
阻害の問題があり、必ず試薬盲検（基質を用いない盲検
と検体を用いない盲検の２種類）を必要とするので操作
が煩雑である。
離するｐ−ニトロフェノールが405nmに吸収極大を示
し、これによる吸収を希アルカリで反応を止めた後比色
定量する。この方法はヘモグロビン，ビリルビンによる
阻害の問題があり、必ず試薬盲検（基質を用いない盲検
と検体を用いない盲検の２種類）を必要とするので操作
が煩雑である。
又、ｐ−ニトロフェノールの生成を405nmでレートア
ッセイする方法が知られている（ハウザーマン,Clin.Ch
im.Acta 15 241−245頁,1967）。
ッセイする方法が知られている（ハウザーマン,Clin.Ch
im.Acta 15 241−245頁,1967）。
この方法は試験盲検を必要としなくなったが、やはり
黄疸血清では誤差が大きくなる他、基質がフェニルリン
酸より酸性度の強いｐ−ニトロフェニルリン酸であるた
め、イソ酵素の由来によってその反応性が異なっている
（日本臨床34巻秋期増刊号768−777頁,1976）。
黄疸血清では誤差が大きくなる他、基質がフェニルリン
酸より酸性度の強いｐ−ニトロフェニルリン酸であるた
め、イソ酵素の由来によってその反応性が異なっている
（日本臨床34巻秋期増刊号768−777頁,1976）。
発明が解決しようとする課題 （Ｃ）法におけるｐ−ニトロフェニルリン酸では、ニ
トロ基は強い電子吸引基として働きその結果リン酸基の
酸性度を上げている。このニトロ基の代わりにむしろ電
子を供与する様な基、例えばアミノ基，ヒドロキシ基，
アルコキシ基を付ければ酸性度を下げてフェニルリン酸
の基質に近いイソ酵素の挙動を示すことが期待されま
た、かかる基質を用いてホスファターゼによりリン酸基
が取れて生成するフェノール類が酸化酵素の存在下に安
定な色素を生ずるような基質は開発されていない。
トロ基は強い電子吸引基として働きその結果リン酸基の
酸性度を上げている。このニトロ基の代わりにむしろ電
子を供与する様な基、例えばアミノ基，ヒドロキシ基，
アルコキシ基を付ければ酸性度を下げてフェニルリン酸
の基質に近いイソ酵素の挙動を示すことが期待されま
た、かかる基質を用いてホスファターゼによりリン酸基
が取れて生成するフェノール類が酸化酵素の存在下に安
定な色素を生ずるような基質は開発されていない。
課題を解決するための手段 本発明によれば、ｐ−アミノ置換（もしくは非置換）
フェニルリン酸に試料中のホスファターゼを作用させ、
生成するｐ−アミノ置換（もしくは非置換）フェノール
を定量することによってホスファターゼを定量できる。
フェニルリン酸に試料中のホスファターゼを作用させ、
生成するｐ−アミノ置換（もしくは非置換）フェノール
を定量することによってホスファターゼを定量できる。
生成したｐ−アミノ置換（もしくは非置換）フェノー
ルは酸化酵素の存在下アニリン類もしくはフェノール類
と酸化カップリングして色素を生成するのでこの色素を
定量することによってホスファターゼを定量できる。
ルは酸化酵素の存在下アニリン類もしくはフェノール類
と酸化カップリングして色素を生成するのでこの色素を
定量することによってホスファターゼを定量できる。
上記反応の反応式が示される。
式中、Ｒは置換基を示し、ｎは０又は１〜４の正数を
示し、ｎ≧２においてＲは同一もしくは異なってよい。
示し、ｎ≧２においてＲは同一もしくは異なってよい。
本発明で基質として用いられるｐ−アミノ置換（もし
くは非置換）フェニルリン酸はホスファターゼを作用さ
せることによって生成するｐ−アミノ置換（もしくは非
置換）フェノールを酸化酵素の作用によってカップリン
グ剤と反応させ色素を生成しうる化合物であればいずれ
も用いうる。
くは非置換）フェニルリン酸はホスファターゼを作用さ
せることによって生成するｐ−アミノ置換（もしくは非
置換）フェノールを酸化酵素の作用によってカップリン
グ剤と反応させ色素を生成しうる化合物であればいずれ
も用いうる。
かかる化合物としてベンゼン環上の置換基は１〜４個
有してよく、ハロゲン例えば塩素原子，臭素原子等、炭
素数１〜６のアルキル例えばメチル，エチル，プロピ
ル，ブチル，ペンチル，ヘキシル等、炭素数１〜６のア
ルコキシ例えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブト
キシ等が例示される。
有してよく、ハロゲン例えば塩素原子，臭素原子等、炭
素数１〜６のアルキル例えばメチル，エチル，プロピ
ル，ブチル，ペンチル，ヘキシル等、炭素数１〜６のア
ルコキシ例えばメトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブト
キシ等が例示される。
本発明で用いられる具体例ｐ−アミノ置換（もしくは
非置換）フェニルリン酸としてはｐ−アミノフェニルリ
ン酸,2,6−ジブロモ−４−アミノフェニルリン酸,2,6−
ジクロロ−４−アミノフェニルリン酸,2,5−ジメチル−
４−アミノフェニルリン酸,3,4−ジメチル−４−アミノ
フェニルリン酸,2,6−ジメチル−４−アミノフェニルリ
ン酸,2,5−ジメトキシ−４−アミノフェニルリン酸,2−
クロロ−４−アミノフェニルリン酸,2−カルボキシ−４
−アミノフェニルリン酸,2,5−ジクロロ−４−アミノフ
ェニルリン酸,3,5−ジブロモ−４−アミノフェニルリン
酸等があげられる。これらは0.1mM−50mMで用いられ
る。
非置換）フェニルリン酸としてはｐ−アミノフェニルリ
ン酸,2,6−ジブロモ−４−アミノフェニルリン酸,2,6−
ジクロロ−４−アミノフェニルリン酸,2,5−ジメチル−
４−アミノフェニルリン酸,3,4−ジメチル−４−アミノ
フェニルリン酸,2,6−ジメチル−４−アミノフェニルリ
ン酸,2,5−ジメトキシ−４−アミノフェニルリン酸,2−
クロロ−４−アミノフェニルリン酸,2−カルボキシ−４
−アミノフェニルリン酸,2,5−ジクロロ−４−アミノフ
ェニルリン酸,3,5−ジブロモ−４−アミノフェニルリン
酸等があげられる。これらは0.1mM−50mMで用いられ
る。
反応は適当な緩衝液中で行われ、例えばトリスヒドロ
キシアミノメタノン，バルビツール，クエン酸，リンゴ
酸，炭酸，の他、グッドの緩衝剤（同仁化学研究所 第
15版総合カタログ）が用いられる。
キシアミノメタノン，バルビツール，クエン酸，リンゴ
酸，炭酸，の他、グッドの緩衝剤（同仁化学研究所 第
15版総合カタログ）が用いられる。
反応によって生成したｐ−アミノ置換（もしくは非置
換）フェノールの定量はそれ自体公知の方法もしくは新
規に開発される方法によって定量することができる。
換）フェノールの定量はそれ自体公知の方法もしくは新
規に開発される方法によって定量することができる。
簡単な方法の１つとして生成したｐ−アミノ置換（も
しくは非置換）フェノールとカップリング剤とを酸化酵
素の存在下に反応させて色素を生成させ生成色素を定量
する方法があげられる。
しくは非置換）フェノールとカップリング剤とを酸化酵
素の存在下に反応させて色素を生成させ生成色素を定量
する方法があげられる。
色素の定量は色素の吸収極大値における反応液の着色
による吸収の変化を測定することによって達成できる。
による吸収の変化を測定することによって達成できる。
用いられる酸化酵素としては酸素を一方の基質にする
ものが望ましく、モノフェノールモノオキシゲナーゼ
（MPO），ジフェノールオキシダーゼ，ビリルビンオキ
シダーゼ（BLOD），ラッカーゼ（LAC），アスコルビン
酸オキシダーゼ（AOD），セルロプラスミン等が好適で
あり、0.01−100U/mlの濃度で用いられる。
ものが望ましく、モノフェノールモノオキシゲナーゼ
（MPO），ジフェノールオキシダーゼ，ビリルビンオキ
シダーゼ（BLOD），ラッカーゼ（LAC），アスコルビン
酸オキシダーゼ（AOD），セルロプラスミン等が好適で
あり、0.01−100U/mlの濃度で用いられる。
カップリング剤としては４−アミノアンチピリンと酸
化縮合して色素を生成するアニリン誘導体，フェノール
誘導体が用いられ、アニリン類として、公知のパーオキ
シダーゼの存在下過酸化水素を定量するために使用され
る色源体例えばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニ
ル）−Ｎ′−サクシニルエチレンジアミン（EMSE）,N−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）,N−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルトルイジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニジン（ADO
S）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン
（ADPS）,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）アニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル
アニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメ
トキシアニリン（DAPS）,N−スルホプロピル−3,5−ジ
メトキシアニリン,N−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン,N−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン（TOOS）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−ト
ルイジン（TOPS）,N,N−ジスルホプロピルアニリン（DS
A）,N,N−ジスルホプロピル−ｍ−トルイジン（DST）,
N,N−ジスルホプロピル−ｍ−アニシジン（DSAN）,N,N
−ジスルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン（DSO
A）,N,N−ジスルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン
（DSDA）等が用いられ、フェノール類としては、フェノ
ールのほか、ｐ−キシレノール（PX）,2,4−ジクロルフ
ェノール等が好適で0.1〜10mg/mlで用いられる。
化縮合して色素を生成するアニリン誘導体，フェノール
誘導体が用いられ、アニリン類として、公知のパーオキ
シダーゼの存在下過酸化水素を定量するために使用され
る色源体例えばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニ
ル）−Ｎ′−サクシニルエチレンジアミン（EMSE）,N−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）,N−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルトルイジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニジン（ADO
S）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン
（ADPS）,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）アニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル
アニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメ
トキシアニリン（DAPS）,N−スルホプロピル−3,5−ジ
メトキシアニリン,N−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−3,5−ジメトキシアニリン,N−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン（TOOS）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−ト
ルイジン（TOPS）,N,N−ジスルホプロピルアニリン（DS
A）,N,N−ジスルホプロピル−ｍ−トルイジン（DST）,
N,N−ジスルホプロピル−ｍ−アニシジン（DSAN）,N,N
−ジスルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン（DSO
A）,N,N−ジスルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン
（DSDA）等が用いられ、フェノール類としては、フェノ
ールのほか、ｐ−キシレノール（PX）,2,4−ジクロルフ
ェノール等が好適で0.1〜10mg/mlで用いられる。
酵素反応を順次行ってもよいが、反応に必要な試薬を
一度に試料に加えて生成色素の定量を行うことができ
る。
一度に試料に加えて生成色素の定量を行うことができ
る。
かかる際には、基質，酸化酵素，カップリング剤，そ
の他必要な成分を適量含有するように緩衝液に溶解して
試薬液を調製し、これを用いればよい。
の他必要な成分を適量含有するように緩衝液に溶解して
試薬液を調製し、これを用いればよい。
色素の定量を行うには、生成色素の吸光の変化を反応
開始後の適当な２点で測定し、予め標準試料を用いて検
量線を作成しておき、この検量線からホスファターゼ活
性を簡単に求めることができる。
開始後の適当な２点で測定し、予め標準試料を用いて検
量線を作成しておき、この検量線からホスファターゼ活
性を簡単に求めることができる。
ホスファターゼは基質をリン酸に分解するばかりでな
く、生成したリン酸を他のヒドロキシ化合物に転移する
作用も有するので、この受容体として種々のヒドロキシ
化合物を用いることが望ましく、例えば、トリスヒドキ
シアミノメタン，プロパノール,2−アミノ−２−メチル
−１−プロパノール，エチルアミノエタノール（EAE）,
N−メチル−Ｄ−グルカミン（MEG），ジエタノールアミ
ン（DEA），トリエタノールアミンなどが利用でき、こ
れらは10−5000mMで用いられる。
く、生成したリン酸を他のヒドロキシ化合物に転移する
作用も有するので、この受容体として種々のヒドロキシ
化合物を用いることが望ましく、例えば、トリスヒドキ
シアミノメタン，プロパノール,2−アミノ−２−メチル
−１−プロパノール，エチルアミノエタノール（EAE）,
N−メチル−Ｄ−グルカミン（MEG），ジエタノールアミ
ン（DEA），トリエタノールアミンなどが利用でき、こ
れらは10−5000mMで用いられる。
また生体液には脂肪成分などによる濁りがある場合、
界面活性剤やリポプロティンリパーゼ等を用いて可溶化
することができる。界面活性剤としては、アルキル硫酸
エステル，脂肪酸塩，アルキルベンゼンスルホン酸塩，
アルキルナフタレンスルホン酸塩，ジアルキルスルホコ
ハク酸エステル塩，アルキルリン酸エステル塩，ナフタ
レンスルホン酸ホルマリン縮合物，ポリオキシエチレン
アルキル硫酸エステル塩，ポリオキシエチレンアルキル
エーテル，ポリオキシエチレンアルキルフェノールエー
テル，ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ソルビタン
脂肪酸エステル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル，グリセリン脂肪酸エステル，オキシエチレン
オキシプロピレンブロックコポリマー，アルキルアミン
塩，第４級アンモニウム塩，ポリオキシエチレンアルキ
ルアミン，アルキルベタインなどが0.1−100mg/mlで用
いられる。
界面活性剤やリポプロティンリパーゼ等を用いて可溶化
することができる。界面活性剤としては、アルキル硫酸
エステル，脂肪酸塩，アルキルベンゼンスルホン酸塩，
アルキルナフタレンスルホン酸塩，ジアルキルスルホコ
ハク酸エステル塩，アルキルリン酸エステル塩，ナフタ
レンスルホン酸ホルマリン縮合物，ポリオキシエチレン
アルキル硫酸エステル塩，ポリオキシエチレンアルキル
エーテル，ポリオキシエチレンアルキルフェノールエー
テル，ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ソルビタン
脂肪酸エステル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル，グリセリン脂肪酸エステル，オキシエチレン
オキシプロピレンブロックコポリマー，アルキルアミン
塩，第４級アンモニウム塩，ポリオキシエチレンアルキ
ルアミン，アルキルベタインなどが0.1−100mg/mlで用
いられる。
本発明によればｐ−アミノ−置換（もしくは非置換）
フェニルリン酸酸化，酸化酵素及びカップリング剤から
なるホスファターゼ定量用組成物が提供される。
フェニルリン酸酸化，酸化酵素及びカップリング剤から
なるホスファターゼ定量用組成物が提供される。
これらの成分は前述の使用濃度の量比からなる。
この組成物にリン酸受容体，界面活性剤を加えること
ができる。
ができる。
以下に本発明の態様を実施例によって示す。
実施例1. アルカリホスファターゼの定量 試薬液（pH＝9.5） DEA 1M ｐ−アミノフェニルリン酸 2mg/ml DAOS 1mg/ml BLOD 0.5U/ml トリトンＸ−100 1mg/ml テスト1. 試料として下記Ａ〜Ｅを用いた A:蒸留水0.05ml B:アルカリホスファターゼ0.05U/ml 0.05ml C:アルカリホスファターゼ0.1U/ml 0.05ml D:アルカリホスファターゼ0.2U/ml 0.05ml E:アルカリホスファターゼ0.5U/ml 0.05ml 各試料に3.0mlの試薬液を加え37℃で10分間保持した
後、678nmにおける吸光の変化を測定したときの吸光度
はＡ〜Ｅについてそれぞれ0,0.200,0.409,0.815,2.042
であり第１図に検量線として示される。
後、678nmにおける吸光の変化を測定したときの吸光度
はＡ〜Ｅについてそれぞれ0,0.200,0.409,0.815,2.042
であり第１図に検量線として示される。
テスト2. また別途本法の他、ベッシーローリー法（Bessy−Low
ry）に準拠した方法の試薬として（ａ法）アルカリ性ホ
スファＢ−テストワコー（和光純薬），カインドキング
法（Kind−King）に準拠した方法の試薬として（ｂ法）
アリカリ性ホスファＫ−テストワコー（和光純薬）の３
種類の方法でアルカリホスファターゼ0.1U/mlを標準
にして黄疸患者血清をそれぞれ検体として用い、ホス
ファターゼ活性を10回ずつ測定したところ第１表の結果
を得た。
ry）に準拠した方法の試薬として（ａ法）アルカリ性ホ
スファＢ−テストワコー（和光純薬），カインドキング
法（Kind−King）に準拠した方法の試薬として（ｂ法）
アリカリ性ホスファＫ−テストワコー（和光純薬）の３
種類の方法でアルカリホスファターゼ0.1U/mlを標準
にして黄疸患者血清をそれぞれ検体として用い、ホス
ファターゼ活性を10回ずつ測定したところ第１表の結果
を得た。
本法による測定値は黄疸血清の如何に関わらず再現性
の指標であるCV％に於いて格段によい結果を示してい
る。
の指標であるCV％に於いて格段によい結果を示してい
る。
実施例2. 実施例１のDAOSのかわりにEMSE,ADOS,TOPS,MAPS［Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−3,5−ジメチ
ルアニリン］,ADPS,DAPS,TOOS,DSOA,PXを使用してテス
ト１と同様なテストを行った。第２表にｐ−アミノフェ
ノールとこれらアニリン誘導体，フェノール誘導体とが
カップリングして生成する色素の極大吸収波長を示す。
また、これらの波長で測定した結果の検量線を第２図に
示す。
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−3,5−ジメチ
ルアニリン］,ADPS,DAPS,TOOS,DSOA,PXを使用してテス
ト１と同様なテストを行った。第２表にｐ−アミノフェ
ノールとこれらアニリン誘導体，フェノール誘導体とが
カップリングして生成する色素の極大吸収波長を示す。
また、これらの波長で測定した結果の検量線を第２図に
示す。
実施例3. 実施例１のビリルビンオキシダーゼの代わりにアスコ
ルビン酸オキシダーゼ（100U/ml），ジフェノールオキ
シダーゼ（1.5U/ml），モノフェノールモノオキシゲナ
ーゼ（1.0U/ml），又はラッカーゼ（5.0U/ml）を使用し
て実施例１のテスト１を繰返して第１図と同じ検量線が
得られた。
ルビン酸オキシダーゼ（100U/ml），ジフェノールオキ
シダーゼ（1.5U/ml），モノフェノールモノオキシゲナ
ーゼ（1.0U/ml），又はラッカーゼ（5.0U/ml）を使用し
て実施例１のテスト１を繰返して第１図と同じ検量線が
得られた。
実施例4. 実施例１のｐ−アミノフェニルリン酸のかわりに2,
6−ジブロモ−４−アミノフェニルリン酸2,6−ジクロ
ロ−４−アミノフェニルリン酸3,5−ジメチル−４−
アミノフェニルリン酸２−カルボキシ−４−アミノフ
ェニルリン酸を使用してテスト１と同じ操作をして第３
図に示す検量線を得た。但し測定波長は第３表に示す。
6−ジブロモ−４−アミノフェニルリン酸2,6−ジクロ
ロ−４−アミノフェニルリン酸3,5−ジメチル−４−
アミノフェニルリン酸２−カルボキシ−４−アミノフ
ェニルリン酸を使用してテスト１と同じ操作をして第３
図に示す検量線を得た。但し測定波長は第３表に示す。
実施例5. 酸性ホスファターゼの定量 試薬液（pH＝4.9） クエン酸ナトリウム 1M ｐ−アミノフェニルリン酸 2mg/ml DAOS 1mg/ml BLOD 0.1単位/ml トリトンＸ−100 1mg/ml 蒸留水、又は酸性ホスファターゼ（シグマ製）を0.0
5,0.1,0.2又は0.5U/ml含有する試料各0.05mlに試薬液3.
0mlを加え37℃で10分間の678nmにおける吸光の変化を測
定した結果第４図に示す検量線を得た。
5,0.1,0.2又は0.5U/ml含有する試料各0.05mlに試薬液3.
0mlを加え37℃で10分間の678nmにおける吸光の変化を測
定した結果第４図に示す検量線を得た。
第１図〜第４図はホスファターゼ含量と吸光度の関係に
ついての検量線を示している。 第２図又は第３図における番号は実施例２における色源
体の番号又は実施例４における基質の番号に対応する。
ついての検量線を示している。 第２図又は第３図における番号は実施例２における色源
体の番号又は実施例４における基質の番号に対応する。
Claims (6)
- 【請求項１】ｐ−アミノフェニルリン酸又はｐ−アミノ
−置換フェニルリン酸、ホスファターゼ、酸化酵素及び
カップリング剤を共存させ、生成する色素を定量するこ
とを特徴とするホスファターゼの定量法。 - 【請求項２】カップリング剤が、４−アミノアンチピリ
ンと酸化縮合して色素を生成するアニリン誘導体又はフ
ェノール誘導体である請求項１記載のホスファターゼの
定量法。 - 【請求項３】酸化酵素が、モノフェノールモノオキシゲ
ナーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ビリルビンオキシ
ダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及び
セルロプラスミンからなる群より選ばれる請求項１又は
２記載のホスファターゼの定量法。 - 【請求項４】ｐ−アミノフェニルリン酸又はｐ−アミノ
−置換フェニルリン酸、ホスファターゼ、酸化酵素及び
カップリング剤からなるホスファターゼ定量用組成物。 - 【請求項５】カップリング剤が、４−アミノアンチピリ
ンと酸化縮合して色素を生成するアニリン誘導体又はフ
ェノール誘導体である請求項４記載のホスファターゼ定
量用組成物。 - 【請求項６】酸化酵素が、モノフェノールモノオキシゲ
ナーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ビリルビンオキシ
ダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及び
セルロプラスミンからなる群より選ばれる請求項４又は
５記載のホスファターゼ定量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63161149A JP2713425B2 (ja) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | ホスファターゼの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63161149A JP2713425B2 (ja) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | ホスファターゼの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH029397A JPH029397A (ja) | 1990-01-12 |
| JP2713425B2 true JP2713425B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=15729526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63161149A Expired - Fee Related JP2713425B2 (ja) | 1988-06-29 | 1988-06-29 | ホスファターゼの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2713425B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60232099A (ja) * | 1984-05-01 | 1985-11-18 | Nitsusui Seiyaku Kk | アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性の測定法 |
-
1988
- 1988-06-29 JP JP63161149A patent/JP2713425B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH029397A (ja) | 1990-01-12 |
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