JPS6134799B2 - - Google Patents
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Description
本発明は過酸化水素もしくは過酸化水素を形成
する物質またはペルオキシダーゼもしくはペルオ
キシダーゼのように作用する物質を検出するため
の剤および方法に関する。 過酸化水素の分析測定は医学の診断で著しく重
要である。それというのも多数の重要な検出方法
で過酸化水素が中間生成物として形成され、次い
でこれを主として触媒としてのペルオキシダーゼ
（POD）の存在で好適な発色性物質と反応させて
光学的に把握可能な物質に変えるからである。光
学的に把握可能な生成物の形成の程度が過酸化水
素の量の尺度としてもしくは過酸化水素を形成す
る基質の量の尺度として用いられる。 この逆の反応でH2O2またはH2O2―形成物質の
添加下にペルオキシダーゼまたはペルオキシダー
ゼのように作用する化合物、例えばヘモグロビン
の濃度も測定することができる。 この反応に関して多数の発色体もしくは指示系
が提案された。良く使用される指示系の１つにト
リンダー（Trinder）のもの〔“Biochem”第６
巻、24〜27頁（1969年）〕があり、該系ではフエ
ノールがPODの存在でH2O2の作用下に４―アミ
ノアンチピリンと酸化的にカツプリングされて染
料となる。フエノールの代わりにフエノール誘導
体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘
導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体ま
たは類似の反応をする物質も使用することができ
る。４―アミノアンチピリンの代わりに他のアミ
ノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホ
ン酸、メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン
（HBTH）、スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒ
ドラゾン（Ｓ―MBTH）および類似の反応をす
る化合物を使用してもよい。 西ドイツ国特許出願公告第2833612号明細書に
よれば特に感度の高い検出系として４―アミノア
ンチピリンのＮ，Ｎ―ジアルキル―もしくはＮ―
ヒドロキシアルキル―置換３―アルキルアニリン
を用いての縮合が記載されている。生成するカツ
プリング生成物は高い分子吸光係数を有し、その
ために少量の過酸化水素もしくは相応する過酸化
水素を形成する化合物の検出に好適である。前記
の出願明細書に示されたように４―アミノアンチ
ピリンとのカツプリングにより生成する染料は通
常の測定時間内で安定であるが、アニリン誘導体
自体が、特に優れたＮ―エチル―Ｎ―ヒドロキシ
エチル―３―メチルアニリン（EHT）が十分に
は貯蔵安定でなく、特に試験条片に含浸させた際
に数週間以内に分解することが示された。更にこ
れらの化合物は室温で液状であり、そのために試
薬支持体に含浸させるには同様に有利ではない。
該化合物は弱塩基なので、その鉱酸との結晶質塩
はPH６を下回るPH値で使用することができるが、
診断の目的に特に重要であるPH６〜８では使用で
きない。 Ｎ―アルキル―Ｎ―ヒドロキシアルキルアニリ
ンとベンゾチアゾリンヒドラゾン、特に２―ヒド
ラゾノ―２，３―ジヒドロ―３―メチルベンゾチ
アゾール―スルホン酸―６（Ｓ―MBTH.）との
カツプリングは特に高い吸光を有する染料を与
え、したがつてＳ―MBTHは少量のH2O2または
PODの検出に４―アミノアンチピリンよりも有
利に使用されよう。しかしEHTとで得られる染
料が不安定であることが示された。特に過酸化お
よび他の副作用が起り、これは吸収スペクトルの
変化をもたらす。 したがつて微細に分配された状態で、例えば試
薬支持体に含浸させた際におよび試薬溶液で長期
貯蔵する際にも安定であり、室温でPH範囲６〜８
に固定しており、酸化性カツプリングで少なくと
も１時間の観測期間の間色安定である、高い分子
吸光を有する染料を与え、そのためにその色の濃
さを検出すべき過酸化水素の量の尺度として使用
することができる酸化性カツプリングのカツプリ
ング成分を見い出す課題が生じた。西ドイツ国特
許出願公開第3037342号明細書（＝J56099―454）
から一般式： 〔式中R1が水素原子、低級アルキル基または
Ｃ―原子数２〜４のスルホアルキル基であり、
R2がＣ―原子数２〜４のスルホアル基であり、
R3が水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシル基
または低級アルキル基であり、かつR4が水素原
子、アルコキシ基または低級アルキル基である〕
のカツプリング性基質並びにその塩が公知になつ
た。 本発明により前記の課題は、カツプリング性基
質として一般式： 〔式中ｎおよびｍは１〜４の整数を表わし、Ｘ
およびＹは価線またはフエニレン基を表わし、
R1およびR2はカルボキシル―またはスルホン酸
基を表わし、その際２つの基の１つは水素または
低級アルキル基であつてよく、かつR1および／
またはR2がスルホン酸基である場合には基Ｘお
よびＹの少なくとも１つはフエニレン基を表わ
し、R3およびR4は水素またはＣ―原子数１〜
６、有利に１〜２のアルキル基を表わす〕の化合
物並びにその塩を含有する剤により解決される。 本発明の目的はカツプリング性基質およびトリ
ンダー反応で公知の酸化性物質並びに場合により
他のトリンダー反応で公知の添加物およびａ）ペ
ルオキシダーゼまたはｂ）H2O2およびH2O2形成
物質から成り、カツプリング性基質として一般式
の化合物またはその塩を含有するａ）過酸化水
素もしくは過酸化水素を形成する基質、または
ｂ）ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼの
ように作用する物質を検出するための検出剤であ
る。 本発明による検出剤の有利な構成形を特許請求
の範囲第２項〜第４項に記載する。 更に本発明の目的は過酸化水素もしくは過酸化
水素を形成する基質またはペルオキシダーゼもし
くはペルオキシダーゼのように作用する物質を検
出するための方法であり、該方法は前記の検出剤
を試料として一緒にし、かつ得られる着色を目で
見て、または光度計で評価することより成る。 本発明による方法の優れた実施形を特許請求の
範囲第６項および第７項に記載する。 酸化性成分として４―アミノアンチピリン（４
―AAP）、２―ヒドラゾノ―２，３―ジヒドロ―
３―メチルベンズチアゾール（MBTH）および
特に２―ヒドラゾノ―２，３―ジヒドロ―３―メ
チルベンズチアゾール―スルホン酸―６（Ｓ―
MBTH）が優れているが、他の酸化カツプリン
グ性で知られている物質も同様にして使用するこ
とができる。 本発明によるアニリン誘導体は酸性の基と塩基
性の基を含んでいるので通常分子内塩として存在
する。しかし塩、特にアルカリ塩またはアンモニ
ウム塩の形状で使用すれば溶解法および取扱い法
を更に改善することができる。高められた吸光の
ために、アミン窒素に対する３位でアルキル基、
特にメチル基を含有する化合物が有利である。 これらのアニリン誘導体は一部公知の化合物で
あり〔“ジヤーナル・オブ・ゼ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイテイ（J.Am.Chem.Soc）”、第78
巻、5827頁（1956年）〕、またはこれらの公知化合
物と同様の方法で製造することができる。 既述したように、本発明による系はペルオキシ
ダーゼまたはH2O2もしくは過酸化水素形成系の
検出に使用される。過酸化水素を形成する系とは
特に臨床診断で重要な基質／基質オキシダーゼ対
と理解すべきであり、該系では空中酸素の存在で
基質が酸化され、かつH2O2が生成される。２つ
の成分のどちらが試薬に添加されるかによつて基
質または基質オキシダーゼのいずれかが検出され
る。例えばグルコース／グルコースオキシダー
ゼ、コレステリン／コレステリングオキシダー
ゼ、尿酸／ウリカーゼ、クレアチニン／クレアチ
ニナーゼおよびサルコシンオキシダーゼの系が挙
げられる。したがつて本発明による試薬組合せは
溶液中でまたは好適な固体支持体、有利に吸収性
の紙中で基質もしくは基質オキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、酸化性発色体並びに本発明による式
の物質１種並びに場合により緩衝剤、湿潤剤、
安定剤、活性剤等から成る。量と組成は公知の同
様の試験によつて当業者によつて問題なく決める
ことができる。次に実施例につき本発明を詳説す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。 例 １ 溶液中でH2O2の測定
する物質またはペルオキシダーゼもしくはペルオ
キシダーゼのように作用する物質を検出するため
の剤および方法に関する。 過酸化水素の分析測定は医学の診断で著しく重
要である。それというのも多数の重要な検出方法
で過酸化水素が中間生成物として形成され、次い
でこれを主として触媒としてのペルオキシダーゼ
（POD）の存在で好適な発色性物質と反応させて
光学的に把握可能な物質に変えるからである。光
学的に把握可能な生成物の形成の程度が過酸化水
素の量の尺度としてもしくは過酸化水素を形成す
る基質の量の尺度として用いられる。 この逆の反応でH2O2またはH2O2―形成物質の
添加下にペルオキシダーゼまたはペルオキシダー
ゼのように作用する化合物、例えばヘモグロビン
の濃度も測定することができる。 この反応に関して多数の発色体もしくは指示系
が提案された。良く使用される指示系の１つにト
リンダー（Trinder）のもの〔“Biochem”第６
巻、24〜27頁（1969年）〕があり、該系ではフエ
ノールがPODの存在でH2O2の作用下に４―アミ
ノアンチピリンと酸化的にカツプリングされて染
料となる。フエノールの代わりにフエノール誘導
体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘
導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体ま
たは類似の反応をする物質も使用することができ
る。４―アミノアンチピリンの代わりに他のアミ
ノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホ
ン酸、メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン
（HBTH）、スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒ
ドラゾン（Ｓ―MBTH）および類似の反応をす
る化合物を使用してもよい。 西ドイツ国特許出願公告第2833612号明細書に
よれば特に感度の高い検出系として４―アミノア
ンチピリンのＮ，Ｎ―ジアルキル―もしくはＮ―
ヒドロキシアルキル―置換３―アルキルアニリン
を用いての縮合が記載されている。生成するカツ
プリング生成物は高い分子吸光係数を有し、その
ために少量の過酸化水素もしくは相応する過酸化
水素を形成する化合物の検出に好適である。前記
の出願明細書に示されたように４―アミノアンチ
ピリンとのカツプリングにより生成する染料は通
常の測定時間内で安定であるが、アニリン誘導体
自体が、特に優れたＮ―エチル―Ｎ―ヒドロキシ
エチル―３―メチルアニリン（EHT）が十分に
は貯蔵安定でなく、特に試験条片に含浸させた際
に数週間以内に分解することが示された。更にこ
れらの化合物は室温で液状であり、そのために試
薬支持体に含浸させるには同様に有利ではない。
該化合物は弱塩基なので、その鉱酸との結晶質塩
はPH６を下回るPH値で使用することができるが、
診断の目的に特に重要であるPH６〜８では使用で
きない。 Ｎ―アルキル―Ｎ―ヒドロキシアルキルアニリ
ンとベンゾチアゾリンヒドラゾン、特に２―ヒド
ラゾノ―２，３―ジヒドロ―３―メチルベンゾチ
アゾール―スルホン酸―６（Ｓ―MBTH.）との
カツプリングは特に高い吸光を有する染料を与
え、したがつてＳ―MBTHは少量のH2O2または
PODの検出に４―アミノアンチピリンよりも有
利に使用されよう。しかしEHTとで得られる染
料が不安定であることが示された。特に過酸化お
よび他の副作用が起り、これは吸収スペクトルの
変化をもたらす。 したがつて微細に分配された状態で、例えば試
薬支持体に含浸させた際におよび試薬溶液で長期
貯蔵する際にも安定であり、室温でPH範囲６〜８
に固定しており、酸化性カツプリングで少なくと
も１時間の観測期間の間色安定である、高い分子
吸光を有する染料を与え、そのためにその色の濃
さを検出すべき過酸化水素の量の尺度として使用
することができる酸化性カツプリングのカツプリ
ング成分を見い出す課題が生じた。西ドイツ国特
許出願公開第3037342号明細書（＝J56099―454）
から一般式： 〔式中R1が水素原子、低級アルキル基または
Ｃ―原子数２〜４のスルホアルキル基であり、
R2がＣ―原子数２〜４のスルホアル基であり、
R3が水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシル基
または低級アルキル基であり、かつR4が水素原
子、アルコキシ基または低級アルキル基である〕
のカツプリング性基質並びにその塩が公知になつ
た。 本発明により前記の課題は、カツプリング性基
質として一般式： 〔式中ｎおよびｍは１〜４の整数を表わし、Ｘ
およびＹは価線またはフエニレン基を表わし、
R1およびR2はカルボキシル―またはスルホン酸
基を表わし、その際２つの基の１つは水素または
低級アルキル基であつてよく、かつR1および／
またはR2がスルホン酸基である場合には基Ｘお
よびＹの少なくとも１つはフエニレン基を表わ
し、R3およびR4は水素またはＣ―原子数１〜
６、有利に１〜２のアルキル基を表わす〕の化合
物並びにその塩を含有する剤により解決される。 本発明の目的はカツプリング性基質およびトリ
ンダー反応で公知の酸化性物質並びに場合により
他のトリンダー反応で公知の添加物およびａ）ペ
ルオキシダーゼまたはｂ）H2O2およびH2O2形成
物質から成り、カツプリング性基質として一般式
の化合物またはその塩を含有するａ）過酸化水
素もしくは過酸化水素を形成する基質、または
ｂ）ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼの
ように作用する物質を検出するための検出剤であ
る。 本発明による検出剤の有利な構成形を特許請求
の範囲第２項〜第４項に記載する。 更に本発明の目的は過酸化水素もしくは過酸化
水素を形成する基質またはペルオキシダーゼもし
くはペルオキシダーゼのように作用する物質を検
出するための方法であり、該方法は前記の検出剤
を試料として一緒にし、かつ得られる着色を目で
見て、または光度計で評価することより成る。 本発明による方法の優れた実施形を特許請求の
範囲第６項および第７項に記載する。 酸化性成分として４―アミノアンチピリン（４
―AAP）、２―ヒドラゾノ―２，３―ジヒドロ―
３―メチルベンズチアゾール（MBTH）および
特に２―ヒドラゾノ―２，３―ジヒドロ―３―メ
チルベンズチアゾール―スルホン酸―６（Ｓ―
MBTH）が優れているが、他の酸化カツプリン
グ性で知られている物質も同様にして使用するこ
とができる。 本発明によるアニリン誘導体は酸性の基と塩基
性の基を含んでいるので通常分子内塩として存在
する。しかし塩、特にアルカリ塩またはアンモニ
ウム塩の形状で使用すれば溶解法および取扱い法
を更に改善することができる。高められた吸光の
ために、アミン窒素に対する３位でアルキル基、
特にメチル基を含有する化合物が有利である。 これらのアニリン誘導体は一部公知の化合物で
あり〔“ジヤーナル・オブ・ゼ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイテイ（J.Am.Chem.Soc）”、第78
巻、5827頁（1956年）〕、またはこれらの公知化合
物と同様の方法で製造することができる。 既述したように、本発明による系はペルオキシ
ダーゼまたはH2O2もしくは過酸化水素形成系の
検出に使用される。過酸化水素を形成する系とは
特に臨床診断で重要な基質／基質オキシダーゼ対
と理解すべきであり、該系では空中酸素の存在で
基質が酸化され、かつH2O2が生成される。２つ
の成分のどちらが試薬に添加されるかによつて基
質または基質オキシダーゼのいずれかが検出され
る。例えばグルコース／グルコースオキシダー
ゼ、コレステリン／コレステリングオキシダー
ゼ、尿酸／ウリカーゼ、クレアチニン／クレアチ
ニナーゼおよびサルコシンオキシダーゼの系が挙
げられる。したがつて本発明による試薬組合せは
溶液中でまたは好適な固体支持体、有利に吸収性
の紙中で基質もしくは基質オキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、酸化性発色体並びに本発明による式
の物質１種並びに場合により緩衝剤、湿潤剤、
安定剤、活性剤等から成る。量と組成は公知の同
様の試験によつて当業者によつて問題なく決める
ことができる。次に実施例につき本発明を詳説す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。 例 １ 溶液中でH2O2の測定
【表】
次の吸光が測定された：
【表】
例 ２
血清中の尿酸の測定
付加的に洗浄剤0.5％およびＮ―エチル―Ｎ―
（２―スルホフエニレンメチル）―ｍ―トルイジ
ン（ESPT）１ミリモル／を含む。20℃で１年
安定な0.1M―リン酸カリウム緩衝溶液（PH7.0）
80mlを装入した、適当なガラス容器に長さ約120
mmおよび幅10mmの試薬ストリツプを入れる。該ス
トリツプは３つの区域に各２つの上下に重ねられ
た、面積10×15mmの試薬支持体をネツトに入れた
状態で含む。ストリツプの下端部に固定された２
つの区域は試薬支持体当り、K4〔Fe（CN）6〕各
1.7mgと一緒にメチルベンズチアゾロンヒドラゾ
ン―６―スルホン酸（MBTHS）2.5mgを含み、か
つ更に各１つのウリカーゼ６単位を有する試薬支
持体を含む。３番目の試薬区域はウリカーゼ６単
位、トリス／シトレート緩衝液（PH７）３mgおよ
びペルオキシダーゼ（POD）20単位を有する、
試薬支持体２つを含む。この試薬ストリツプを10
秒強力に動かし、引続き５分放置し、再度10秒動
かし、かつ溶離した試薬支持体を棄てる。 次の組成の反応溶液が生じる： リン酸カリウム緩衝液（PH７） 0.1モル／ ESPT １ミリモル／ 洗浄剤（脂肪アルコール―ポリグリ コールエーテル） 0.5％ MBTHS 0.2ミリモル／ K4〔Fe（CN）6〕 20mg／ ウリカーゼ 255U／ POD 470U／ この反応溶液２mlに試料0.050mlを添加し、か
つ20〜25℃で20分恒温維持の後578nmで吸光を、
または分光光度計で590nmで標準に対して測定す
ることにより血清中の尿酸含量を測定する。 例 ３ 血清中のクレアチニンの測定 試験成分 ａ 緩衝溶液： ホスフエぜト緩衝液（PH7.5） 0.1モル／ Ｎ―エチル―Ｎ―（２―スルホエチル） ―ｍ―トルイジン（EST） １ミリモル／ 洗浄剤 0.5％ ｂ 試薬ストリツプ 例２と同様の構造および寸法を有する試薬スト
リツプは１つの試験区域にMBTHS1.9mgおよび
K4〔Fe（CN）6〕0.64mgを含み、かつもう１つの
試験区域にサルコシンオキシダーゼ30U、クレア
チナーゼ300Uおよびペルオキシダーゼ30Uを含
有し、かつ試薬ストリツプ（寸法75×６mm）は
クレアチニナーゼ30Uを含む試験区域（６×６
mm）を有する。 試験溶液の製造： 試薬ストリツプを緩衝液32ml中で５〜10秒間
動かし、引続き５分放置し、再度５〜10秒動か
し、かつ溶離された試薬支持体を棄てる。 測定バツチ： 試薬溶液２mlに試料0.05mlを加える。20〜25℃
で10分恒温保持後吸光E1を578nmで測定する（内
因性クレアチン）。 引続き試薬ストリツプを同様にしてこの溶液
中で溶離させ、かつ20〜25℃で25分恒温保持の後
578nmで吸光E2を測定する。 これと平行して同条件下でクレアチニン標準を
一緒に行なう。濃度Ｃを Ｃ〔mg／100ml〕＝ΔＥ試料／ΔＥ試料 ΔＥ＝E2−E1 例 ４ 基質の貯蔵安定性 ホスフエート緩衝液（PH7.0）中の基質Ｎ―エ
チル―Ｎ―β―ヒドロキシエチル―ｍ―トルイジ
ン（EHT）およびＮ―エチル―Ｎ―β―スルホ
フエニレンメチル―ｍ―トルイジン（ESPT）の
１ミリモル溶液を種々の温度で３週間保持し、か
つ高圧液体クロマトグラフイーにより濃度を測定
した。
（２―スルホフエニレンメチル）―ｍ―トルイジ
ン（ESPT）１ミリモル／を含む。20℃で１年
安定な0.1M―リン酸カリウム緩衝溶液（PH7.0）
80mlを装入した、適当なガラス容器に長さ約120
mmおよび幅10mmの試薬ストリツプを入れる。該ス
トリツプは３つの区域に各２つの上下に重ねられ
た、面積10×15mmの試薬支持体をネツトに入れた
状態で含む。ストリツプの下端部に固定された２
つの区域は試薬支持体当り、K4〔Fe（CN）6〕各
1.7mgと一緒にメチルベンズチアゾロンヒドラゾ
ン―６―スルホン酸（MBTHS）2.5mgを含み、か
つ更に各１つのウリカーゼ６単位を有する試薬支
持体を含む。３番目の試薬区域はウリカーゼ６単
位、トリス／シトレート緩衝液（PH７）３mgおよ
びペルオキシダーゼ（POD）20単位を有する、
試薬支持体２つを含む。この試薬ストリツプを10
秒強力に動かし、引続き５分放置し、再度10秒動
かし、かつ溶離した試薬支持体を棄てる。 次の組成の反応溶液が生じる： リン酸カリウム緩衝液（PH７） 0.1モル／ ESPT １ミリモル／ 洗浄剤（脂肪アルコール―ポリグリ コールエーテル） 0.5％ MBTHS 0.2ミリモル／ K4〔Fe（CN）6〕 20mg／ ウリカーゼ 255U／ POD 470U／ この反応溶液２mlに試料0.050mlを添加し、か
つ20〜25℃で20分恒温維持の後578nmで吸光を、
または分光光度計で590nmで標準に対して測定す
ることにより血清中の尿酸含量を測定する。 例 ３ 血清中のクレアチニンの測定 試験成分 ａ 緩衝溶液： ホスフエぜト緩衝液（PH7.5） 0.1モル／ Ｎ―エチル―Ｎ―（２―スルホエチル） ―ｍ―トルイジン（EST） １ミリモル／ 洗浄剤 0.5％ ｂ 試薬ストリツプ 例２と同様の構造および寸法を有する試薬スト
リツプは１つの試験区域にMBTHS1.9mgおよび
K4〔Fe（CN）6〕0.64mgを含み、かつもう１つの
試験区域にサルコシンオキシダーゼ30U、クレア
チナーゼ300Uおよびペルオキシダーゼ30Uを含
有し、かつ試薬ストリツプ（寸法75×６mm）は
クレアチニナーゼ30Uを含む試験区域（６×６
mm）を有する。 試験溶液の製造： 試薬ストリツプを緩衝液32ml中で５〜10秒間
動かし、引続き５分放置し、再度５〜10秒動か
し、かつ溶離された試薬支持体を棄てる。 測定バツチ： 試薬溶液２mlに試料0.05mlを加える。20〜25℃
で10分恒温保持後吸光E1を578nmで測定する（内
因性クレアチン）。 引続き試薬ストリツプを同様にしてこの溶液
中で溶離させ、かつ20〜25℃で25分恒温保持の後
578nmで吸光E2を測定する。 これと平行して同条件下でクレアチニン標準を
一緒に行なう。濃度Ｃを Ｃ〔mg／100ml〕＝ΔＥ試料／ΔＥ試料 ΔＥ＝E2−E1 例 ４ 基質の貯蔵安定性 ホスフエート緩衝液（PH7.0）中の基質Ｎ―エ
チル―Ｎ―β―ヒドロキシエチル―ｍ―トルイジ
ン（EHT）およびＮ―エチル―Ｎ―β―スルホ
フエニレンメチル―ｍ―トルイジン（ESPT）の
１ミリモル溶液を種々の温度で３週間保持し、か
つ高圧液体クロマトグラフイーにより濃度を測定
した。
【表】
例 ５
尿中のグルコースの検出
紙〔ワツトマン（Whatman）No.６〕に次の
組成の溶液を含浸させ、かつ40〜60℃で乾燥す
る： グルコースオキシダーゼ 200mg ペルオキシダーゼ 20mg モルホリノーエタンスルホネート （１モル、PH６） 65ml ECPT 200mg MBTHS 200mg ポリビニルピロリドン 300mg エタノール 30ml 蒸留水 全量 100ml 試験紙はグルコース10〜100mg／dlを含む尿と
反応として明るいローズバイオレツトから暗いブ
ルーバイオレートの色調になる。 ペルオキシダーゼの測定 試験溶液 溶液 １ Ｓ―MBTH 3.2ミリモル／ ナトリウムラウリルスルフエート 0.1％ ３，３―ジメチルグルタル酸／NaOH― 緩衝液（PH6.6） 50ミリモル／ 溶剤として水 溶液 ２ ETTS 10ミリモル／ 過硼酸ナトリウム 480ミリモル／ EDTA 400ミリモル／ ジメチルグルタル酸緩衝液（PH6.6）
50ミリモル／ 溶剤として水 溶液１および２各１mlに試料20μを混合し、
かつ５分後588nmでの吸収を試薬盲検値に対して
測定する。濃度を既知濃度の吸収との比較により
測定する。次の表は測定値を挙げる。
組成の溶液を含浸させ、かつ40〜60℃で乾燥す
る： グルコースオキシダーゼ 200mg ペルオキシダーゼ 20mg モルホリノーエタンスルホネート （１モル、PH６） 65ml ECPT 200mg MBTHS 200mg ポリビニルピロリドン 300mg エタノール 30ml 蒸留水 全量 100ml 試験紙はグルコース10〜100mg／dlを含む尿と
反応として明るいローズバイオレツトから暗いブ
ルーバイオレートの色調になる。 ペルオキシダーゼの測定 試験溶液 溶液 １ Ｓ―MBTH 3.2ミリモル／ ナトリウムラウリルスルフエート 0.1％ ３，３―ジメチルグルタル酸／NaOH― 緩衝液（PH6.6） 50ミリモル／ 溶剤として水 溶液 ２ ETTS 10ミリモル／ 過硼酸ナトリウム 480ミリモル／ EDTA 400ミリモル／ ジメチルグルタル酸緩衝液（PH6.6）
50ミリモル／ 溶剤として水 溶液１および２各１mlに試料20μを混合し、
かつ５分後588nmでの吸収を試薬盲検値に対して
測定する。濃度を既知濃度の吸収との比較により
測定する。次の表は測定値を挙げる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ カツプリング性基質、トリンダー反応で公知
の酸化性物質およびａ）ペルオキシダーゼまたは
ｂ）H2O2およびH2O2形成物質から成る、ａ）過
酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質、ま
たはｂ）ペルオキシダーゼまたはペルオキシダー
ゼのように作用する物質を検出するための剤にお
いて、カツプリング性基質として一般式： 〔式中ｎおよびｍは１〜４の整数を表わし、Ｘ
およびＹは価線またはフエニレン基を表わし、
R1およびR2はカルボキシル―またはスルホン酸
基を表わし、その際２つの基の１つは水素または
低級アルキル基であつてよく、かつR1およびR2
の少なくとも１つがスルホン酸基である場合には
基ＸおよびＹの少なくとも１つはフエニレン基を
表わし、R3およびR4は水素または炭素原子数１
〜６のアルキル基を表わす（但しR3が水素また
は炭素原子数１〜２のアルキル基であり、R4が
水素である場合で、R1が水素、R2がカルボキシ
ル基、ＸおよびＹが価標であり、ｎ＝１又は２、
ｍ＝２又は３である場合を除く）〕の化合物並び
にその塩を含有することを特徴とする、過酸化水
素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペル
オキシダーゼもしくはペルオキシダーゼのように
作用する物質を検出するための剤。 ２ 酸化性物質として４―アミノアンチピリン、
２―ヒドラゾノ―２，３―ジヒドロ―３―メチル
ベンズチアゾールおよび２―ヒドラゾノ―２，３
―ジヒドロ―３―メチルベンズチアゾール―スル
ホン酸―６を含有する、特許請求の範囲第１項記
載の検出剤。 ３ 試薬が基質と過酸化水素を形成する基質オキ
シダーゼを含有する、特許請求の範囲第１項また
は第２項記載の検出剤。 ４ 試薬が吸収性支持体上に含浸されている、特
許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１
項記載の検出剤。 ５ 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基
質またはペルオキシダーゼもしくはペルオキシダ
ーゼのように作用する物質を検出するための方法
において、カツプリング性基質、トリンダ―反応
で公知の酸化性物質およびａ）ペルオキシダーゼ
またはｂ）H2O2およびH2O2形成物質から成り、
カツプリング性基質として一般式Ｉ： 〔式中ｎおよびｍは１〜４の整数を表わし、Ｘ
およびＹは価線またはフエニレン基を表わし、
R1およびR2はカルボキシル―またはスルホン酸
基を表わし、その際２つの基の１つは水素または
低級アルキル基であつてよく、かつR1およびR2
の少なくとも１つがスルホン酸基である場合には
基ＸおよびＹの少なくとも１つはフエニレン基を
表わし、R3およびR4は水素または炭素原子数１
〜６のアルキル基を表わす（但しR3が水素また
は炭素原子数１〜２のアルキル基であり、R4が
水素である場合で、R1が水素、R2がカルボキシ
ル基、ＸおよびＹが価標であり、ｎ＝１又は２、
ｍ＝２又は３である場合を除く）〕の化合物並び
にその塩を含有する、ａ）過酸化水素もしくは過
酸化水素を形成する基質、またはｂ）ペルオキシ
ダーゼまたはペルオキシダーゼのように作用する
物質を検出するための剤を試料と一緒にし、かつ
得られる着色を目で見てかまたは光度計で評価す
ることを特徴とする、過酸化水素もしくは過酸化
水素を形成する基質またはペルオキシダーゼまた
はペルオキシダーゼのように作用する物質を検出
するための方法。 ６ 検出剤を短時間試料に浸漬し、着色を公知方
法で測定する、特許請求の範囲第５項記載の方
法。 ７ 検出剤を試薬が溶融されるまで試料に浸漬
し、着色を希釈または酸素の導通後に光度計で測
定する、特許請求の範囲第５項記載の方法。
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