EP0267247A1 - Verfahren und reagenz zum nachweis von schädigungen bzw. erkrankungen des herzens - Google Patents

Verfahren und reagenz zum nachweis von schädigungen bzw. erkrankungen des herzens

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EP0267247A1
EP0267247A1 EP87903286A EP87903286A EP0267247A1 EP 0267247 A1 EP0267247 A1 EP 0267247A1 EP 87903286 A EP87903286 A EP 87903286A EP 87903286 A EP87903286 A EP 87903286A EP 0267247 A1 EP0267247 A1 EP 0267247A1
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EP
European Patent Office
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atoms
hydrogen
creatine
sulfonic acid
group
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP87903286A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Joris R. Delanghe
Marc L. De Buyzere
Ivan K. De Scheerder
Joachim Siedel
Johnny Staepels
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
Priority claimed from BE0/216599A external-priority patent/BE904688A/nl
Priority claimed from BE0/217095A external-priority patent/BE905345A/nl
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0267247A1 publication Critical patent/EP0267247A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine

Definitions

  • the invention relates to a method and a reagent for the detection of damage or diseases of the heart muscle, such as. B. heart attack, as well as its use for monitoring the course of heart operations, for further observation after a heart attack and for certain indications for cardiac therapy, such as. B. in thrombolytic treatments.
  • creatine kinase and that of CK isoenzyme (CK-MB) and that of lactate dehydrogenase (LDH) and glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) play a dominant role in clinical practice.
  • CK catalyzes the conversion of creatine into creatine phosphate, which is the storage form for high-energy phosphates in this tissue.
  • Creatinine is the catabolic end product of mammalian creatine metabolism and is excreted from the blood in the urine via the kidneys.
  • creatine kinase in the serum results from an increased enzyme release after damage to the skeletal and cardiac muscles.
  • An increase in CK activity can already be observed after 6 - hours after the heart attack, the maximum (10 - 20 times the norm) is reached after about 18 - 24 hours.
  • the increase in the activity of the lactate dehydrogenase or of the heart muscle-specific LDH isoenzymes in the serum is likewise based on damaged or destroyed heart muscle tissue. Certain increases are found in 90% of cases 12 hours after the beginning of clinical symptomatology. The maximum LDH increase (2 - 10 times the norm) is between 48 and 72 hours.
  • the determination of the GOT activity is also often used as an additional parameter.
  • the increase in GOT activity is approximately parallel to that in CK activity.
  • a disadvantage of the determination of the enzymes mentioned for the detection of myocardial infarction and other heart muscle damage is, however, that a significant increase in the enzyme activity in the blood or serum occurs only about 8 hours after the onset of the damage, where the maximum is reached after about 24 hours.
  • Corresponding electrocardiograms do not provide clear, reliable statements in approximately 15% of the cases.
  • the known methods are therefore only of limited suitability for use in the early specific diagnosis of heart attack or other damage to the heart muscle tissue.
  • targeted therapy based on a specific diagnosis that starts as early as possible, ie up to about 4 hours after the event, can achieve a therapeutic effect, particularly in the case of an acute heart attack.
  • the invention was therefore based on the object of developing a simple, quick, specific method for detecting heart attack and other damage to the heart muscle, which increases the meaningfulness of the heart attack diagnosis.
  • At least one low-molecular metabolite for example creatine (molecular weight 131 g-mol " 1 ) or creatine phosphate, in the sample of a body fluid such as urine, blood, serum, plasma, saliva and its ultrafiltrates or of Tissue extracts is determined.
  • a body fluid such as urine, blood, serum, plasma, saliva and its ultrafiltrates or of Tissue extracts
  • heart damage or disease The most common forms of heart damage or disease are acute heart attack, micronecrosis, acute and dumb myocardial ischemia, and heart contusion after blunt thoracic trauma.
  • metabolites is to be understood as meaning the products resulting from the creatine metabolism or the products implemented in this metabolism, as well as possible biological and chemical preliminary and secondary products and artificial artifacts.
  • substrates creatine, creatine phosphate, creatinine, sarcosine, phosphoenolpyruvate, pyruvate, lactate, urea, glycine, formaldehyde, amino acids of the heart muscle and their biochemical and chemical conversion products which, due to their low molecular weight, cause damage to the heart muscle tissue can be released more.
  • Creatine which is mainly synthesized from glycine and arginine in the liver and kidney and is mainly excreted as creatinine, is only present in low concentrations in serum and urine in healthy humans and mammals (approx. 5 - 10 mg / 1 or 2 - 4 mg / 1).
  • creatinine In contrast to the creatinine determination, the determination of creatine has so far been used essentially for clinical-chemical research. For example, an increased creatine content in the blood (creatinemia) is observed with increasing renal insufficiency (see, for example, JP 58.009.699). Furthermore, patients with haemolytic anemia during the painful haemolytic crisis were found to have a 10 to 20-fold increase in the level of creaatin in the 24-hour urine (Beyer et al., Clin. Chem. ⁇ 1, 1232-1234 (1985)). In addition, an increased creatine level in the serum and in the urine is observed in various diseases of the skeletal muscles (Yasuhara et al., Clin. Chim.
  • the determination of a low-molecular metabolite to detect an acute heart attack or other damage to the heart muscle or heart diseases is a completely new principle of biochemical cardiac diagnostics.
  • the respective metabolite can be determined in the sample of a body fluid either enzymatically via coupled enzyme reactions or via purely chemical reactions, with photometric detection being preferred.
  • creatine can be used in a coupled reaction with creatine kinase, pyruvate kinase and lactate dehydrogenase and the measurement of the NAD + that ultimately arises in the UV range (in: HU Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3th edn.
  • creatine using the enzymes creatinase (creatina idinohydrolase, EC3.5.3.3.) And sarcosine oxidase (or sarcosine dehydrogenase) and measurement of H2O2 or used O2 (or formed NADH or used NAD + ) or Formaldehyde possible.
  • the determination of the metabolite, z. B. des Crea ⁇ tins, for heart damage such as heart attack, takes place in the period of about 1 to 24 hours, preferably in the period of 2 to 8 hours, with a maximum at about 3 hours after the onset of heart damage.
  • the measurement up to 24 hours after the occurrence of the acute heart attack can be used for further medical observation, such as e.g. B. to secure the CK-dependent diagnostics or to detect any re-infarcts that may occur (see Fig. 1 and 2).
  • Urine is preferably used as the body fluid for the determination of the creatine, since the increase in the creatine is significantly higher here.
  • the enzymatic method is advantageously used for the detection of cardiac damage, with the addition of creatinamidinohydrolase (creatinase) and Sarcosine oxidase (EC1.5.3.1) hydrogen peroxide ultimately formed from creatine with peroxidase and a color-forming reagent for a dye is used.
  • Creatinase creatinamidinohydrolase
  • Sarcosine oxidase EC1.5.3.1
  • sarcosine dehydrogenase can also be used and NADH and / or formaldehyde can be determined.
  • the true creatine concentration is then calculated from the difference in the measurement signals.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the net content of creatine is obtained by subtracting this blank value from the first measurement.
  • the procedure for determining the creatine phosphate is analogous.
  • creatine phosphine (and ADP), creatine aminohydrolase and sarcosine oxidase are formed from creatine phosphate H2O2 (which is quantified photometrically in a corresponding subsequent reaction)
  • a further determination approach without creatine kinase (and ADP) is connected upstream or in parallel leads.
  • H2O2 formed from creatine and sarcosine is detected.
  • the net content of creatine phosphate in the sample is determined by forming the difference between the two determination values.
  • Another object of the invention is a hydrogen peroxide formed tion for 'the erfindungs ⁇ proper method, especially for the determination of creatine, suitable color-forming reagent for the detection of the sarcosine-reaction.
  • Numerous compounds are described in the literature which can be used as indicators for the detection of hydrogen peroxide with peroxidase as catalyst. Such indicators are: benzidine and benzidine derivatives, various phenols, polyphenols, such as. B. guaiac resin, leuco dyes such. B.
  • n and m can mean the numbers from 1 to 3,
  • X and Y are a valence line, an arylene or hydroxyalkylene radical with 1-6 C atoms, R 1 and R 2 are hydrogen, a hydroxy, alkyl or alkoxy group with 1-6 C atoms, a carboxyl, sulfonic acid , can be an acetamido or a P (O) (OR) (R 1 ) group,
  • P represents a phosphorus atom
  • R is hydrogen or an alkyl group with 1-6 C atoms and R 1 is a hydroxyl, an aryl, alkyl or alkoxy group mi
  • R 3 can be hydrogen, halogen, a carboxyl or a sulfonic acid group
  • halogen, iodine, bromine and preferably comprises chlorine and fluorine
  • R 4 and R 7 are hydrogen, an alkoxy or alkyl group with 1 to 6 carbon atoms,
  • R 5 and R 6 represent hydrogen, an aryl or alkyl group with 1-6 C atoms and
  • R 5 and R 7 or R 6 and R 4 in the event that the two substituents are ortho to one another, together can form a saturated or unsaturated hydrocarbon chain with 6 carbon atoms which are substituted by hydroxyl or oxo groups can,
  • aniline derivatives are in particular (N-methylanilino) methanephosphonic acid, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS), N-ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N- Ethyl-N-sulfopropyl-toluidine (TOPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidine (ADPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline (MAPS), N-ethyl-N- sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (HDAPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3
  • HETC 2,3,4-tetrahydroquinoline
  • THCMP 1,2,3,4-tetrahydroquinoline-N-methanephosphonic acid
  • TBHB 2,4,6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid
  • 2,4,6-triiodo-3-hydroxybenzoic acid can be used for the process according to the invention.
  • Examples of possible electron and radical acceptors are 4-aminophenazone (4-AAP), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone-6-sulfonic acid (S-MBTH) other substances known for their oxidative coupling ability can also be used in the same way.
  • the coupling of 4-aminophenazone (4-AAP) or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone-6-sulfonic acid (S-MBTH) with N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) has been particularly preferred.
  • m-toluidine TOOS or (N-methylanilino) methanephosphonic acid or S-MBTH with TBHB
  • TOOS m-toluidine
  • S-MBTH m-toluidine
  • An essential part of the present invention consists in to have recognized that the aniline coupling components, such as TOOS, are surprisingly superior to the phenolic coupling components, such as TBHB, in particular in combination with 4-AAP.
  • the reagent according to the invention can be in dissolved or dry form. It can be on a suitable carrier, e.g. B. a film impregnated with sarcosine pre-reaction zone.
  • a diagnostic agent in the form of a test strip can be produced by preferably impregnating filter paper, cellulose or synthetic fiber fleece with solutions of the reagents required, which are usually used for the production of test strips, in volatile solvents, such as acetone. This can be done in one or more impregnation steps.
  • the finished test papers can be used as such or glued to handles in a manner known per se or preferably sealed between plastics and a fine-mesh network.
  • the creating content in serum and urine was determined enzymatically by healthy-looking persons in the manner mentioned in the description section.
  • serum creatine values 138 people, divided according to age and gender, were used. Blood was drawn from all individuals after a five-day protein diet. A concentration range of 5.7 - 10.4 mg / 1 creatine in serum was obtained for male and female persons between the ages of 46 and 85 (see Table 1).
  • the determination of the urine creating content resulted in a mean value of 2.7 mg / 24 h with a standard deviation of the mean value of 1.2 mg / 24 h.
  • FIGS. 1 and 2 show a typical behavior of the CK and CK -MB enzyme activities and of creatine in urine and serum.
  • Ep c __ x ⁇ o (mg / dl)
  • the determination is linear up to a concentration of 20 mg / 100 ml urine.
  • FIGS. 1 and 2 show the results of the creatine determination in the urine or serum in comparison to the activity of the CK or CK-MB i serum of a typical heart attack patient up to 36 hours after the appearance of the symptoms.

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Description

Verfahren und Reagenz zum Nachweis von Schädigungen bzw. Erkrankungen des Herzens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zum Nachweis von Schädigungen bzw. Erkrankungen des Herzmuskels, wie z. B. Herzinfarkt, sowie dessen Verwendung zur Verlaufskontrolle bei Herzoperationen, zur weiteren Beobachtung nach einem Herzinfarkt und bei bestimmten Indikationen zur Herztherapie, wie z. B. bei thrombolytischen Behandlungen.
Zur Erkennung von Schädigungen bzw. Erkrankungen des Herzens, ins¬ besondere von Herzinfarkt, werden heute in der klinischen Praxis neben der Beurteilung der persönlichen Krankengeschichte zwei grundlegende Prinzipien herangezogen. Diese beruhen entweder auf Störungen elektrischer Potentiale des Herzmuskels oder auf Ver¬ änderungen der Enzymaktivitäten im Blut. Aus elektrσkardiographi- schen Befunden (EKG) können Informationen über die unterschied¬ lichen Entwicklungsstadien und die Lokalisation eines Infarktes gewonnen werden. Die Veränderungen der Enzymaktivitäten, die auf Herzschädigungen, beispielsweise einen Herzinfarkt hinweisen, stützen sich insbesondere auf die Messung der Erhöhung des Gehalts muskelspezifischer Enzyme im Serum, die aus zugrundegegangenen Herzmuskelzellen resultieren. Dabei spielen die Bestimmung der Creatinkinase (CK) bzw. die des CK-Isoenzyms (CK-MB) und die der Lactatdehydrogenase (LDH) und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) in der klinischen Praxis eine dominierende Rolle. Das Enzym Creatinkinase (ATP: Creatin-Phosphotransferase, E.C. 2.7.3.2) bzw. dessen Isoenzyme kommen bei den Vertebraten in be¬ sonders hohen Konzentrationen im Muskel- und Nervengewebe vor. Dort katalysiert CK die Umwandlung von Creatin in Creatinphosphat welches die Speiσherform für energiereiche Phosphate in diesem Ge webe darstellt. Creatinphosphat geht nach Dephosphorylierung über Creatin in einer niσht-enzymatischen, irreversiblen Reaktion in Creatinin über. Das Creatinin stellt das katabole Endprodukt des Creatin-Stoffwechseis der Säuger dar und wird aus dem Blut über die Niere im Urin ausgeschieden.
Die Bestimmung der Creatinkinase im Serum als Methode zur Erken¬ nung von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell von Herzinfarkt, resultiert aus einer vermehrten Enzymfreisetzung nach Schädigung der Skelett- und Herzmuskulatur. Schon nach 6 - Stunden nach dem Herzinfarkt kann ein Anstieg der CK-Aktivität be obachtet werden, das Maximum (10 - 20faches der Norm) wird nach etwa 18 - 24 Stunden erreicht.
Der Anstieg der Aktivität der Lactatdehydrogenase bzw. der herz¬ muskelspezifischen LDH-Isoenzyme im Serum basiert gleichfalls auf geschädigtem bzw. zugrundegegangenem Herzmuskelgewebe. Sichere Er höhungen werden in 90 % der Fälle 12 Stunden nach Beginn der kli¬ nischen Symptomatologie gefunden. Das Maximum des LDH-Anstiegs (2 - lOfaches der Norm) liegt zwischen 48 und 72 Stunden.
Häufig wird in der klinischen Diagnostik von Herzerkrankungen außerdem die Bestimmung der GOT-Aktivität als zusätzlicher Para¬ meter herangezogen. Der Anstieg der GOT-Aktivität erfolgt zeitlic ungefähr parallel zu dem der CK-Aktivität.
Ein Nachteil der Bestimmung der genannten Enzyme zum Nachweis von Herzinfarkt und anderen Herzmuskelschädigungen ist jedoch, daß eine signifikante Erhöhung der Enzymaktivität im Blut bzw. Serum erst ungefähr 8 Stunden nach Eintritt der Schädigung auftritt, wo bei das Maximum nach etwa 24 Stunden erreicht wird. Auch entspre¬ chende Elektrokardiogramme liefern in ca. 15 % der Fälle keine eindeutigen, verläßlichen Aussagen. Die bekannten Verfahren sind demnach für die Verwendung zur frühen spezifischen Diagnose des Herzinfarkts oder anderen Schädigungen des Herzmuskelgewebes nur beschränkt geeignet. Nur eine möglichst früh, d. h. bis zu etwa 4 Stunden nach dem Ereignis einsetzende, gezielte Therapie aufgrund einer spezifischen Diagnose kann jedoch, insbesondere beim akuten Herzinfarkt, einen therapeutischen Effekt erzielen.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, schnell durchzuführendes spezifisches Verfahren zum Nachweis von Herzinfarkt und anderen Schädigungen des Herzmuskels zu ent¬ wickeln, wodurch die Aussagekraft der Herzinfarkt-Diagnostik er¬ höht wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß mindestens ein niedermolekularer Metabolit, beispielsweise Creatin (Moleku¬ largewicht 131 g-mol"1) oder Creatinphosphat, in der Probe einer Körperflüssigkeit, wie Urin, Blut, Serum, Plasma, Speichel und ihre Ultrafiltrate oder von Gewebeextrakten bestimmt wird.
Bei den Schädigungen oder Erkrankungen des Herzens handelt es sic beispielsweise am häufigsten um die Formen akuter Herzinfarkt, Mikronekrosen, akute und stumme Myokardischämie, Herzkontusion nach stumpfen Thoraxtraumen.
Mit dem Begriff Metabolite sind in dem hier beschriebenen Zusam¬ menhang die aus dem Creatin-Stoffwechsel resultierenden oder die in diesem Stoffwechsel umgesetzten Produkte sowie mögliche biolo¬ gische und chemische Vor- und Folgeprodukte und künstliche Arte¬ fakte zu verstehen. Beispiele stellen die folgenden Substrate dar: Creatin, Creatinphosphat, Creatinin, Sarcosin, Phosphoenolpyruvat, Pyruvat, Lactat, Harnstoff, Glyσin, Formaldehyd, Aminosäuren des Herzmuskels sowie deren biochemischen und chemischen Umwandlungs¬ produkte, die aufgrund ihres geringen Molekulargewichts bei Schä¬ digungen des Herzmuskelgewebes vermehrt freigesetzt werden können. Creatin, das aus Glycin und Arginin überwiegend in der Leber und in der Niere synthetisiert und vorwiegend als Creatinin ausge¬ schieden wird, liegt beim gesunden Menschen bzw. Säugetier nur in geringen Konzentrationen im Serum bzw. Harn vor (ca. 5 - 10 mg/1 bzw. 2 - 4 mg/1) .
Die Bestimmung des Creatins wurde bisher, im Gegensatz zur Creati nin-Bestimmung, im wesentlichen für die klinisch-chemische For¬ schung herangezogen. Beispielsweise wird ein vermehrter Creatin- gehalt des Blutes (Creatinämie) bei zunehmender Niereninsuffizien beobachtet (siehe hierzu z. B. JP 58.009.699). Des weiteren wir be Patienten mit hämolytischen Anämien während der schmerzhaften hämolytischen Krise ein um das 10 bis 20fache gesteigerter Crea- tinspiegel im 24 Stunden-Urin festgestellt (Beyer et al., Clin. Chem. ^1, 1232 - 1234 (1985))..Außerdem wird bei verschiedenen Erkrankungen der Skelettmuskulatur ein erhöhter Creatinspiegel im Serum und im Urin beobachtet (Yasuhara et al., Clin. Chim. Acta 122, 181 - 188 (1982) ; Suzuki und Yoshida, Clin. Chim. Acta 140, 289 - 294 (1984)). Neu ist hingegen, daß das sehr schnelle Auf¬ treten eines erhöhten Creätinspiegels in Körperflüssigkeiten, wie insbesondere im Urin zur Diagnose von Herzerkrankungen und Herz¬ schädigungen herangezogen werden kann.
Der erfindungsgemäße Effekt, d. h. die Erkenntnis des Zusammen¬ hangs des erhöhten Metabolitspiegels in Körperflüssigkeiten mit Herzschädigungen und Herzerkrankungen ist sehr überraschend. Ein solcher Zusammenhang ist bisher nicht bekannt geworden. Hierdurch werden möglicherweise zusätzlich Energiereserven unter Umwandlung von Creatinphosphat in Creatin und gleichzeitiger ATP-Bildung mo¬ bilisiert. Im Gegensatz zum Anstieg der CK-Aktivität, der im Blut/Serum erst nach 8 - 24 Stunden auftritt, zeigt sich nach der Erfindung aber, daß der Anstieg eines niedermolekularen Metaboli- ten, wie z. B. des Creatins, im Blut bzw. Urin bereits nach unge¬ fähr einer Stunde eintritt, mit einem Maximum nach etwa 3 Stunden Somit stellt die Bestimmung eines niedermolekularen Metaboliten zum Nachweis eines akuten Herzinfarkts oder anderer Schädigungen des Herzmuskels oder Herzerkrankungen ein völlig neues Prinzip in der biochemischen Herzdiagnostik dar. Der jeweilige Metabolit kann in der Probe einer Körperflüssigkeit entweder enzymatisch über gekoppelte Enzymreaktionen oder über rein chemische Reaktionen bestimmt werden, wobei der photometri¬ sche Nachweis bevorzugt ist. Creatin kann beispielsweise in einer gekoppelten Reaktion mit Creatinkinase, Pyruvatkinase und Lactat- dehydrogenase und der Messung des letztlich entstehenden NAD+ im UV-Bereich (in: H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3th edn. New York, Aσademic Press, 1985, Vol. 8, 500 - 514) bzw. nach weiterer, dem Fachmann bekannter Umsetzung als entsprechender Farbstoff bestimmt werden. Die Bestimmung von Creatin unter Ver¬ wendung der Enzyme Creatinase (Creatina idinohydrolase, E.C.3.5.3.3.) und Sarcosinoxidase (bzw. Sarcosindehydrogenase) und Messung von gebildetem H2O2 oder verbrauchtem O2 (bzw. gebil¬ detem NADH oder verbrauchtem NAD+) bzw. Formaldehyd möglich. Be¬ vorzugt wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die Bestimmung mit¬ tels Sarcosinoxidase und Messung von gebildetem H2O2 unter Kata¬ lyse von Peroxidase (oder peroxidatisch wirksamen Substanzen) und einem farbbildenden System. Es besteht jedoch außerdem die Mög¬ lichkeit, gebildetes H2O2 oder verbrauchtes O2 titrimetrisch, po¬ tentiometrisch sowie polarographisch nachzuweisen. Auch diese Ver¬ fahren sind dem Fachmann bekannt.
Die erfindungsgemäße Bestimmung des Metaboliten, z. B. des Crea¬ tins, bei Herzschädigungen wie Herzinfarkt, erfolgt im Zeitraum von etwa 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise im Zeitraum von 2 bis 8 Stunden, mit einem Maximum bei etwa 3 Stunden nach Eintritt der Herzschädigung. Die Messung bis zu 24 Stunden nach dem Auftreten des akuten Herzinfarkts kann zur weiteren medizinischen Beobach¬ tung, wie z. B. zur Absicherung der CK-abhängigen Diagnostik oder zur Erkennung eventuell auftretender Re-Infarkte dienen (siehe Fig. 1 und 2) .
Als Körperflüssigkeit für die Bestimmung des Creatins wird bevor¬ zugt Urin herangezogen, da hier der Anstieg des Creatins signifi¬ kant höher liegt. Für die Bestimmung des Creatins wird vorteil¬ haft zum Nachweis von Herzschädigungen die enzymatische Methode, die unter Zusatz von Creatinamidinohydrolase (Creatinase) und Sarcosinoxidase (E.C.1.5.3.1) aus Creatin letztlich gebildetes Wasserstoffperoxid mit Peroxidase und einem Farbbildungsreagenz z einem Farbstoff umsetzt, verwendet. Anstatt Sarcosinoxidase kann auch Sarcosindehydrogenase eingesetzt werden und NADH und/oder Formaldehyd bestimmt werden.
Die folgende Erkenntnis stellt hierbei einen weiteren wichtigen und nicht a priori als notwendig vorhersehbaren Teil der Erfindun dar. Diese beruht auf dem überraschenden Befund, daß Sarcosin unter den spezifischen Bedingungen einer Herzmuskelschädigung in größerer, gegenüber Creatin ins Gewicht fallender, Menge im Blut bzw. Urin auftritt, denn bei gesunden Menschen kommt Sarcosin - wenn überhaupt - nur in Spuren und gegenüber Creatin in vernach¬ lässigbaren Konzentrationen im Blut bzw. Urin vor. Ein erhöhter Sarcosinspiegel im Zusammenhang mit Herzerkrankungen, wie z. B. Herzinfarkt, ist ebenfalls bislang nicht bekannt. Es ist somit vorteilhaft, für jeden Bestimmungsansatz eine weitere Umsetzung entweder vorgeschaltet oder parallel durchzuführen. Diese zusätz liche Bestimmung läuft identisch ab, allerdings ohne die Anwesen¬ heit von Creatinamidinohydrolase (Creatinase) . Im Anschluß wird aus der Differenz der Meßsignale die wahre Creatinkonzentration berechnet. Dadurch stimmen die erhaltenen Creatinwerte mit der Referenzmethode (High Performance Liquid Chromatographie = HPLC) überein und erlauben eine zuverlässige Aussage. Um also sicherzu¬ stellen, daß die Intensität des gebildeten Farbstoffs einzig auf die Menge an Creatin bzw. hieraus gebildetes Wasserstoffperoxid und nicht auf eventuell vorhandenes Sarcosin oder andere mit Sar¬ cosinoxidase reagierende Substanzen in der Probe zurückzuführen ist, wird für jede Creatinbestimmung neben dem allgemein üblichen Leerwert (Wasser oder Pufferlösung anstatt Probe) ein sogenannter Sarσosin-Leerwert berücksichtigt, der sich durch analoges Vorgehe bei der Bestimmung ohne den Zusatz einer Creatinase ergibt. Der Nettogehalt an Creatin wird durch den Abzug dieses Leerwertes von der ersten Messung erhalten. Bei der Bestimmung des Creatinphosphats wird analog verfahren. Zu jeder Umsetzung, bei der in Gegenwart von Creatinkinase (und ADP) , Creatinamidinohydrolase und Sarcosinoxidase aus Creatinphosphat H2O2 entsteht (das in einer entsprechenden Folgereaktion photo¬ metrisch quantifiziert wird) , wird ein weiterer Bestimmungsansatz ohne Creatinkinase (und ADP) vorgeschaltet oder parallel durchge¬ führt. Hierbei wird aus Creatin und Sarcosin gebildetes H2O2 er¬ faßt. Der Nettogehalt des Creatinphosphats in der Probe wird durc Differenzbildung der beiden Bestimmungswerte ermittelt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein für' das erfindungs¬ gemäße Verfahren, vor allem für die Creatin-Bestimmung, geeignete Farbbildungsreagenz zum Nachweis des in der Sarcosinoxidase-Reak- tion gebildeten Wasserstoffperoxids. In der Literatur sind zahl¬ reiche Verbindungen beschrieben, die als Indikatoren für den Nach weis von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase als Katalysator einge¬ setzt werden können. Solche Indikatoren sind: Benzidin und Benzidin-Derivate, verschiedene Phenole, Polyphenole, wie z. B. Guajakharz, Leukofarbstoffe, wie z. B. Leukomalachitgrün, Diσhlorphenolindophenol, A inoσarbazole, Triaryli idazole, 2,2'- Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolsulfon- säure-(6)] sowie FarbstoffSysteme, welche einen Wasserstoff-Donor und einen Elektronen- oder Radikal-Akzeptor enthalten. Letzere haben sich hierbei besonders bewährt. Bei dem erfindungsgemäßen Farbbildungsreagenz haben sich als Wasserstoff-Donoren insbeson¬ dere Anilin-Derivate als geeignet erwiesen. Bevorzugt sind dabei Anilin-Derivate der folgenden Formel:
in der
n und m die Zahlen von 1 bis 3 bedeuten können,
X und Y einen Valenzstrich, einen Arylen- oder Hydroxyalkylen- rest mit 1 - 6 C-Atomen, R1 und R2 Wasserstoff, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 - 6 C-Atomen, eine Carboxyl-, Sulfonsäure-, eine Acetamido- oder eine P(O) (OR) (R1)-Gruppe sein kann,
worin
P ein Phosphoratom bedeutet,
R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen und R1 eine Hydroxy-, eine Aryl-, Alkyl- oder Alkoxygruppe mi
1 - 6 C-Atomen sein kann, R3 Wasserstoff, Halogen, eine Carboxyl- oder eine Sulfon- säuregruppe sein kann,
wobei Halogen, Jod, Brom und bevorzugt Chlor und Fluor umfaßt,
R4 und R7 Wasserstoff, eine Alkoxy- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen,
R5 und R6 für Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen stehen und
R5 und R7 bzw. R6 und R4 für den Fall, daß die beiden Substitu- enten orthoständig zueinander stehen, zusammen eine ge sättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit - 6 C-Atomen bilden können, die durch Hydroxy- oder Oxogruppen substituiert sein kann,
sowie ihre Salze mit Säuren und Basen. Bevorzugte Anilin-Derivate sind insbesondere (N-Methylanilino)- methanphosphonsäure, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m- toluidin (TOOS) , N-Ethyl-N-sulfopropylanilin (ALPS) , N-Ethyl-N- sulfopropyl- -toluidin (TOPS) , N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidin (ADPS) , N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylanilin (MAPS) , N-Ethyl- N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin (DAPS) , N-Sulfopropyl-3,5- dimethoxyanilin (HDAPS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)anilin (ALOS) , N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-anisidin (ADOS) , N- Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (MAOS), N- Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (DAOS) , N- (2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (HDAOS) und N- Sulfopropylanilin (HALPS) , N-Ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin (EHT) , N-Ethyl-N-(2-sulfoethyl)-m-toluidin (EST) , N-Ethyl-N-(3- sulfobenzyl)-m-toluidin (ETTS) , N-(2-Acetamidoethyl)-N-ethyl-4- fluor-3-methyl-anilin (F-EMAE) und entsprechende Chinolinderivate, wie z. B. N-Hydroxy-ethyl-l,2,3,4-tetrahydrochinolin (HETC) oder 1,2,3,4-Tetrahydrochinoline-N-methanphosphonsäure (THCMP) . Die Verwendung dieser oder vόrwandter Anilinderivate als Kupplungs¬ komponente in oxidativen Farbbildungsreaktionen zum Nachweis von ' H2O2 ist beispielsweise in den folgenden Offenlegungsschriften beschrieben (DE-OS 31 24 594, DE-OS 34 13 693, DE-OS 34 25 219, EP-OS 0 175 250) .
Außerdem können z. B. die Phenolderivate 2,4,6-Tribrom-3-hydroxy- benzoesäure (TBHB) und 2,4,6-Trijod-3-hydroxybenzoesäure für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
Als Elektronen- und Radikal-Akzeptoren kommen beispielsweise 4- Aminophenazon (4-AAP) , 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) und 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäure (S-MBTH) in Frage, jedoch können auch andere für ihre oxidative Kupplungsfä¬ higkeit bekannte Substanzen in gleicher Weise eingesetzt werden. Als besonders bevorzugt hat sich die Kupplung von 4-Aminophenazon (4-AAP) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäure (S-MBTH) mit N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS oder (N-Methylanilino)-methanphosphonsäure bzw. S-MBTH mit TBHB erwiesen, da hier die Störanfälligkeit gegenüber Urin- bzw. Serum bestandteilen bei der oxidativen Kupplung besonders gering sind. Ein wesentlicher Teil der vorliegenden Erfindung besteht darin, erkannt zu haben, daß die anilinischen Kupplungskomponenten, wie TOOS den phenolischen Kupplungskomponenten, wie TBHB in überra¬ schend hohem Maß, insbesondere in Kombination mit 4-AAP, überlege sind.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann in gelöster oder trockener Form vorliegen. Es kann auf einem geeigneten Träger, z. B. einer Folie mit Sarcosin-Vorreaktionszone imprägniert enthalten sein. Ein diagnostisches Mittel in Form eines Teststreifens läßt sich her¬ stellen, indem man vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservlies mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zu Herstellung von Teststreifen verwendeten Reagenzien in leicht flüchtigen Lösungsmitteln, wie Aceton imprägniert. Dies kann in einem oder mehreren Imprägniersσhritten erfolgen. Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffen angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigem Netzwerk eingesiegelt werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Untersuchungsergebnisse und Beispiele näher erläutert:
I. Medizinischer Teil
a) Referenzwerte
Zunächst wurde der Creatingehalt im Serum und im Urin von gesund erscheinenden Personen auf die im Beschreibungsteil erwähnte Weise enzymatisch bestimmt. Für die Serumcreatinwerte wurden 138 Perso¬ nen, aufgeteilt nach Alter und Geschlecht, herangezogen. Die Blutentnahme erfolgte bei allen Personen nach einer fünftägigen Eiweißdiät. Für männliche und weibliche Personen im Alter zwischen 46 und 85 Jahren wurde hierbei ein Konzentrationsbereich von 5,7 - 10,4 mg/1 Creatin im Serum erhalten (siehe Tab. 1).
Die Bestimmung des Creatingehalts im Urin ergab einen Mittelwert von 2,7 mg/24 h mit einer Standardabweichung des Mittelwerts von l-,2 mg/24 h.
b) Ergebnisse bei Herzinfarktpatienten
Bei 22 Patienten mit eindeutigen Herzinfarktsymptomen wurde der Krankheitsverlauf elektrokardiographisch und durch übliche Blut¬ analytik verfolgt. Im Serum wurde bei diesen Patienten eine maxi¬ male Konzentration von 12,5 mg/1 mit einer Standardabweichung des Mittelwerts von 3,2 mg/1 ca. 3 Stunden nach Einsetzen des retro- sternalen Schmerzes gemessen. Im Urin wurden dagegen scharfe Peaks mit Konzentrationen zwischen 100 und 500 mg/1 gemessen. Der Urin- peak tritt nur geringfügig später als der Serumpeak auf. Rechnet man diese Daten auf eine 24-Stunden-Ausscheidung im Urin um, so ergibt sich ein Durchschnittswert von 94 mg/1 mit einer Standard¬ abweichung des Mittelwerts von 43. Die Figuren 1 und 2 zeigen ein typisches Verhalten der CK- bzw. CK-MB-Enzymaktivitäten und von Creatin im Urin und im Serum. Außerdem wurde zum Vergleich der Creatin- bzw. der Creatinphos- phatgehalt und die CK-Aktivität im Skelettmuskel (n = 3) sowie i gesunden (n = 3) und im Herzinfarkt-geschädigten Herzmuskelgeweb (n =3) bestimmt und jeweils der relative, prozentuale Substanzve lust im geschädigten Herzmuskelgewebe berechnet, der für die drei untersuchten Verbindungen im Mittel ungefähr 60 % beträgt (siehe Tab. 2).
Tab. 1: Creatingehalt im Serum (Referenzwerte)
In den Serumproben von 138 gesunden Personen (n^es, = 138), diffe¬ renziert nach Alter und Geschlecht, wurde der Creatingehalt enzy- matisσh bestimmt.
Feuchtgewicht
Tab. 2: Creatin- und Creatinphosphatgehalt sowie Aktivität der Creatinkinase (CK) im Skelett- und Herzmuskel und der jeweilige relative Verlust nach einem Herzinfarkt. II. Analytischer Teil
Bestimmung von Creatin im Urin
Beispiel 1
(Farbreagenz: 4-AAP/TOOS)
a) Reagenzien:
a^_) 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7.9 0.15 mM 4-AAP . 10 mM TOOS
10 /UM Kaliumhexacyanoferrat II 3 kU/1 Sarcosin-Oxidase 3 kU/1 Peroxidase 10 kU/1 Ascorbat-Oxidase
a2) 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7.9 100 kU/1 Creatinase
b) Testdurchführung:
Messung gegen Luft
T = 37° C d = 1 cm = Hg 578 nm
in Zentrifugen-Röhrchen pipettieren:
* Urin 1 + 9 mit 0.9 % NaCi verdünnen.
Berechnung: Zur Berechnung anstelle von Proben Creatin- Standard mit 1 mg/dl einsetzen.
Ep c =__ x ιo (mg/dl)
Est
Beispiel 2
(Farbreagenz: S-MBTH/TOOS)
ai) 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH - 7.9 0.15 mM S-MBTH
2 mM TOOS
10 /uM Kaiiumhexacyanoferrat II
3 kU/1 Sarcosin-Oxidase 3 kU/1 Peroxidase
10 kU/1 Ascorbat-Oxidase
* a2) 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7.9 100 kU/1 Creatinase
b) Testdurchführung:
Messung gegen Luft
T = 37° C d - 1 cm /H Hg 578 nm
in Zentrifugen-Röhrσhen pipettieren:
* Urin 1 + 9 mit 0.9 % NaCl verdünnen.
Berechnung: Zur Berechnung anstelle von Proben Creatin- Standard mit 1 mg/dl einsetzen.
Ep
C = x 10 (mg/dl)
Est
Beispiel 3
(Farbreagenz: S-MBTH/TBHB)
a) Reagenzien:
ai) 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7.9 0.15 mM S-MBTH 10 mM TBHB
10 /uM Kaiiumhexacyanoferrat II 3 kU/1 Sarcosin-Oxidase 3 kU/1 Peroxidase 10 kU/1 Ascorbat-Oxidase
a2 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH - 7.9 100 kU/1 Creatinase b) Messung gegen Luft
T =» 37° C d = 1 cm λ = Hg 546 nm
in Zentrifugen-Röhrchen pipettieren:
* Urin 1 + 9 mit 0.9 % NaCl verdünnen.
Berechnung: Zur Berechnung anstelle von Proben Creatin- Standard mit 1 mg/dl einsetzen.
Ep
C = x 10 (mg/dl)
ESt
Die Bestimmung verläuft bis zu einer Konzentration von 20 mg/100 ml Urin linear.
Analog kann die Bestimmung von Creatin im Blut, Serum, Plasma, ihren Ultrafiltraten oder Gewebsextrakten durchgeführt werden.
Die Figuren 1 und 2 zeigen die Resultate der Creatinbestimmung im Urin bzw. Serum im Vergleich zu der Aktivität der CK bzw. CK-MB i Serum eines typischen Herzinfarktpatienten bis zu 36 Stunden nach Auftreten der Symptome.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Schädigungen oder Erkrankungen des Herzens, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein nie¬ dermolekularer Metabolit in der Probe einer Körperflüssigkei bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schädigungen oder Erkrankungen des Herzens um die Formen akuter Herzinfarkt, Mikronekrosen, akute und stum me Myokardisσhämie oder Herzkontusion nach stumpfen Thorax¬ traumen handelt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es sich bei dem niedermolekularen Metaboliten um Creatin, um ein im Stoffwechsel vorhandenes Vor- oder Fol geprodukt oder einen natürlichen oder künstlichen Artefakt des Creatins handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem niedermolekularen Metaboliten um Creatinphospha oder Sarcosin handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es sich bei Körperflüssigkeiten um Urin, Blut, Serum, Plasma, Speichel oder einen Gewebeextrakt handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der niedermolekulare Metabolit im Zeitraum von 1 bis 24 Stunden nach Eintritt der Herzschädigung bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der niedermolekulare Metabolit im Zeitraum von 2 - 8 Stunden nach Eintritt der Herzschädigung bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Creatin enzymatisch mittels Sarcosin-Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid, welches mit einem Wasserstoff-Donor und einem Elektronen- oder Radikal-Akzeptor als farbbildendes System bzw. einem Leukofarbstoff bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donor ein Anilin-Derivat ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Anilinderivat eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel ist:
in der n und m die Zahlen von 1 bis 3 bedeuten können,
X und Y einen Valenzstrich, einen Arylen- oder Hydroxy- alkylenrest mit 1 - 6 C-Atomen,
R1 und R2 Wasserstoff, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Alkoxy¬ gruppe mit 1 - 6 C-Atomen, eine Carboxyl-, Sulfon- säure-, eine Acetamido- oder eine P(0) (OR) (OR' )- Gruppe sein kann, worin
P ein Phosphoratom bedeutet und
R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 6 C-
Atomen, R1 eine Hydroxy-, eine Aryl-, Alkyl- oder Alkoxygrupp mit 1 - 6 C-Atomen sein kann, R3 Wasserstoff, Halogen, eine Carboxyl- oder eine
Sulfonsäuregruppe sein kann,
wobei Halogen, Jod, Brom und bevorzugt Chlor und Fluor umfaßt, R4 und R7 Wasserstoff, eine bevorzugt in meta-Stellung stehende Alkoxy- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen,
R5 und R6 für Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe mit - 6 C-Atomen stehen und
R5 und R7 bzw. R6 und R4 für den Fall, daß die beiden Sub- stituenten orthoständig zueinander stehen, zusam¬ men eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwas¬ serstoffkette mit 2 - 6 C-Atomen bilden können, die durch Hydroxy- oder Oxogruppen substituiert sein kann,
sowie ihre Salze mit Säuren und Basen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Anilin-Derivat N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidi (TOOS) oder (N-Methylanilino)-methanphosphonsäure ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Elektronen- oder Radikal-Akzeptor 4-Aminophenazon (4-AAP) , 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäur (S-MBTH) ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Creatin-Nachweissystem die Enzyme Creatin¬ amidinohydrolase und Sarcosinoxidase beinhaltet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zusätzlichen Bestimmungswert heranzieht, der durch Um¬ setzung erhalten wird, die entweder vorgeschaltet oder parallel durchgeführt wird, aber ohne Anwesenheit von Crea¬ tinamidinohydrolase.
15. Verfahren zur Bestimmung von Creatin in einer Körperflüssig¬ keit mit einem farbbildenden System, welches einen Wasser¬ stoff-Donor und einen Elektronen- oder Radikal-Akzeptor ent¬ hält, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donor ein Anilin-Derivat ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Urin, Blut, Serum, Plasma, Speichel oder ein Gewebeextrakt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Anilinderivat eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel ist:
in der n und m die Zahlen von 1 bis 3 bedeuten können,
X und Y einen Valenzstrich, einen Arylen- oder Hydroxy- alkylenrest mit 1 - 6 C-Atomen,
R1 und R2 Wasserstoff, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Alkoxy¬ gruppe mit 1 - 6 C-Atomen, eine Carboxyl-, Sulfon- säure-, eine Acetamido- oder eine P(O) (OR) (OR1)- Gruppe sein kann, worin
P ein Phosphoratom bedeutet und
R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 6 C- Atomen,
R* eine Hydroxy-, eine Aryl-, Alkyl- oder Alkoxygrupp mit 1 - 6 C-Atomen sein kann,
R3 Wasserstoff, Halogen, eine Carboxyl- oder eine Sulfonsäuregruppe sein kann,
wobei Halogen, Jod, Brom und bevorzugt Chlor und Fluor umfaßt. R4 und R7 Wasserstoff, eine bevorzugt in meta-Stellung stehende Alkoxy- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C- Atomen,
R5 und R6 für Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen stehen und
R5 und R7 bzw. R6 und R4 für den Fall, daß die beiden Sub- stituenten orthoständig zueinander stehen, zusam¬ men eine gesättigte oder ungesättigte Kohlen¬ wasserstoffkette mit 2 - 6 C-Atomen bilden können die durch Hydroxy- oder Oxogruppen substituiert sein kann,
sowie ihre Salze mit Säuren und Basen.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Anilin-Derivat N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidi (TOOS) oder (N-Methylanilino)-methanphosphonsäure ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekenn zeichnet, daß der Elektronen- oder Radikal-Akzeptor 4-Aminophenazon (4-AAP) , 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäur (S-MBTH) ist.
20. Reagenz zur Bestimmung von Creatin in einer Körperflüssig¬ keit, enthaltend ein farbbildendes System mit einem Wasser¬ stoff-Donor und einem Elektronen- oder Radikal-Akzeptor, da¬ durch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donor ein Anilin- Derivat ist.
21. Reagenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Urin, Blut, Serum, Plasma, Speichel oder ein Gewebeextrakt ist.
22. Reagenz nach einem der Ansprüche 20 und 21, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Anilindervat eine Verbindung der allgemei¬ nen Formel ist: n und m die Zahlen von 1 bis 3 bedeuten können,
X und Y einen Valenzstrich, einen Arylen- oder Hydroxy- alkylenrest mit 1 - 6 C-Atomen,
R1 und R2 Wasserstoff, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Alkoxy¬ gruppe mit 1 - 6 C-Atomen, eine Carboxyl-, Sulfon- säure-, eine Acetamido- oder eine P(0) (OR) (OR1)- Gruppe sein kann, worin
P ein Phosphoratom bedeutet und
R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 - 6 C- Atomen,
R1 eine Hydroxy-, eine Aryl-, Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 - 6 C-Atomen sein kann,
R3 Wasserstoff, Halogen, eine Carboxyl- oder eine Sulfonsäuregruppe sein kann,
wobei Halogen, Jod, Brom und bevorzugt Chlor und Fluor umfaßt,
R4 und R7 Wasserstoff, eine bevorzugt in meta-Stellung stehende Alkoxy- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C- Atomen,
R5 und R6 für Wasserstoff, eine Aryl- oder Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen stehen und
R5 und R7 bzw. R6 und R4 für den Fall, daß die beiden Sub- stituenten orthoständig zueinander stehen, zusam¬ men eine gesättigte oder ungesättigte Kohlen¬ wasserstoffkette mit 2 - 6 C-Atomen bilden können, die durch Hydroxy- oder Oxogruppen substituiert sein kann,
sowie ihre Salze mit Säuren und Basen.
23. Reagenz nach einem der Ansprüche 20 und 22, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Anilin-Derivat N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3- sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) oder (N-Methylanilino)-methan- phosphonsäure ist.
24. Reagenz nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Elektronen- oder Radikal-Akzeptor 4-Aminophenazon (4-AAP) , 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäure (S-MBTH) ist.
25. Reagenz nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es Creatinamidinohydrolase, Sarcosinoxidase, Peroxidase und als Wasserstoff-Donor
N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) oder (N-Methylanilino)methanphosphonsäure und als Elektronen- oder Radial-Akzeptor 4-Aminophenazon (4-AAP) ,
3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) oder 3-Methyl-2- " benzothiazolinonhydrazon-6-sulfonsäure (S-MBTH) enthält.
26. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Verlaufskontrolle bei Herzoperationen und/oder bei Indi¬ kationen zur Herztherapie, z. B. bei Thrombolyse, oder zur weiteren klinischen Beobachtung nach einem Herzinfarkt.
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