DE3021259C2

DE3021259C2 - Mit Amidopyrin verbessertes Trinder-Reagens und Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei der enzymatischen Oxidation von Stoffwechselprodukten mit diesem Reagens

Info

Publication number: DE3021259C2
Application number: DE3021259A
Authority: DE
Inventors: Ugo Milano De Luca; Francesco Treviglio Bergamo Zoppi
Original assignee: ELVI SpA MILANO IT
Current assignee: ELVI SpA MILANO IT
Priority date: 1980-02-04
Filing date: 1980-06-04
Publication date: 1982-12-16
Also published as: IT8019672A0; EP0033462A1; ES499697A0; JPS56124398A; DE3021259A1; BR8100648A; AR224670A1; JPS603835B2; ES8301538A1; IT1130252B; US4350762A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mit

J Amidopyrin ^-Dimethylamino^-dimethyl-i-phenyl-3-pyrazolin-5-on) modifiziertes Trinder-Reagens und auf eine Methode zur quantitativen Bestimmung des ,Wasserstoffperoxids, das sich durch enzymatische

; 'Oxidation aus speziellen Stoffwechselprodukten durch ■|*die Verwendung dieses verbesserten Trinder-Reagen-

% ses bildet

Die Trinder-Reaktion (Ann. Clin. Biochem. 6,24 [1969]) wird im Bereich der klinischen Chemie in 'großem Umfang benutzt, um das Wasserstoffperoxid ^quantitativ zu bestimmen, das sich aus bestimmten jSubstraten unter der Einwirkung verschiedener Oxi-. dasen (Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase, Uricase, oc-Glycerinphosphatoxidase, Cholinoxidase) bildet. In .,der Praxis wird vor dieser Reaktion bei der enzymatischen Analyse von biologischen Stoffwechselprodukten ■' von bemerkenswerter diagnostischer Bedeutung, wie Glucose, Cholesterin, Harnsäure und Triglyceride, "Gebrauch gemacht.

Das nach Trinder bekannte Chromogensystem bestehend aus Phenol und 4-Aminophenazon (4-Amino-14-dimethyl-2-phenyI-3-pyrazoIon wird in Gegenwart von Peroxidasen durch Wasserstoffperoxid oxidiert und erzeugt eine rote Chinonimin-Verbindung, deren Farbintensität ein indirektes Maß für die Menge der Stoffwechselprodukte (Glucose, Cholesterin, Harnsäu re) darstellt, die sich in der zu untersuchenden Probe befinden.

Die Trinder-Reaktion wird jedoch durch Substanzen endogenen (Bilirubin, Haemoglobin) und exogenen Ursprungs (Arzneimittel) gestört

Vor allem bildet das Bilirubin, eine Stoffwechselprodukt des »Häms« (Ferro-Protoporphyrin), eine sichere Störquelle insofern, als es ein alternatives Substrat für das Oxidationssystem Wasserstoffperoxid/Peroxidase ist (vgl. Jacobsen, J, und Wennberg, R. P, Clin. Chem. 20, 783 [1974]) und ist immer in wechselnden Konzentrationen zwischen 0,6 und 1,2 mg/100 ml in den normalen menschlichen Seren und zwischen 3,0 und 30 mg/100 ml in den menschlichen Seren bei Hyperbilirubinämie anwesend.

Derartige Störungen durch Bilirubin in den Chromogensystemen vom Trinder-Typ sind untersucht worden von Fossati — L Prencipe Quad. Sclavo Diagn. 14,164

(1978) und Witte, D. L, Brown, L. F. u. a. Clin. Chem. 24, 1779 (1978), die verschiedene Lösungen vorgeschlagen haben, ur· sie zu vermeiden.

Die Bilirubin-Störung ist besonders merkbar bei der quantitativen Bestimmung nach der Trinder-Methode der Serum-Harnsäure, wo die Konzentration dieses Stoffwechselprodukts besonders niedrig ist (2,5 bis 7,5 mg/100 ml), d.h. mehr als zehnmal niedriger als diejenige der Glucose, die ebenfalls nach der Trinder-ο Methode bestimmbar ist.

Bei der Glucose-Bestimmung werden bei einem Verdünnungsverhältnis Serum/Reagens von 1 :150, Absorptionswerte bei 500 nm erhalten, welche ohne weiteres für die routinemäßige photometrische AbIesung geeignet sind. Um die gleichen Absorptionswerte zu erhalten und damit die gleiche Empfindlichkeit bei der quantitativen Bestimmung der Harnsäure mit dem »Trinder-Reagens«, wäre es notwendig, Verdünnungsverhältnisse Serum/Reagens von 1 :15 zu verwenden.

Unter diesen Bedingungen wird jedoch die Störung durch Bilirubin so bestimmend, daß eine genaue | 'Quantisierung der Harnsäure verhindert wird zum \_t .Unterschied von dem, was sich bei der Bestimmung der blucose feststellen läßt, bei welcher die Bilirubinstörung wegen des hohen Verdünnungsverhältnisses des Serums vernachlässigbar ist

Zur Vermeidung dieses ernsten Nachteils haben Barham D. und Trinder (P., Analyst 97, 142 [1972]) vorgeschlagen, das Phenol durch 2,4-DichlorphenoIsulfonat zu ersetzen. Sie erhalten auf diese Weise ein Chromophor, das viermal intensiver ist als das normale Trinder-Reagens, was ermöglicht, auf ein Verdünnungsverhältnis Serum/Reagens von 1 :40 überzugehen und damit eine Minderung, wenn auch noch nicht eine Beseitigung, der Bilirubinstörung zu erreichen.

Nach und nach wurden verschiedene Verfahren zur Beseitigung der Bilirubinstörung vorgeschlagen.
Wir zitieren «m besonderen:

a) die Dialyse des Musters unter Beseitigung der Proteine und des Bilirubins (Klose, S., Stolz, M., Münz, E et al, Clin. Chem. 24, 250 [1978]). Dieses System hat jedoch den Nachteil, daß es nur auf Analysatoren mit kontinuierlichem Fluß anwendbar ist, die über eine geeignete Dialysegruppe verfügen;

b) die Oxidation des Bilirubins und Biliverdins mit Kaliumeisenzyanid (Prenzipe, L, Fossati, P. et aiii, Quad. Sclavo Diagn. 14, 383 [1978]) oder mit Äthylenperoxid/peroxidase (Peracino, kl, Zoppi, F.

et aiii - Uric Acid assay: methods using uricase peroxidass-chromogen and uricase-catalase-aldehyde dehydrogenase-NAD⁺);

dieses System b) hat jedoch den Nachteil, daß es die Durchführung eines Leerwertansatzes für jedes zu analysierende Muster wegen des niedrigen Verdünnungsverhältnisses Serum/Reagens erfordert.

Weitere Untersuchungen mit dem Ziel, das analytische Verfahren weniger mühevoll zu machen und um die vorerwähnten Nachteile zu vermeiden, waren auf die direkte Bestimmung der verschiedenen Stoffwechselprodukte, insbesondere der Harnsäure, gerichtet.
So wurde vorgeschlagen:

c) die Oxidation des Ferrozyanids zu Ferricyanid mit dem System Wasserstoffperoxid/Peroxidase, um auf diese Weise die Störwirkung des Bilirubins zu blockieren.

Im Verlauf der Untersuchungen in diesem Zusammenhang wurde nun entdeckt, daß es erfindungsgemäß

möglich «si, in beträchtlichem Maße die Störung durch Bilirubin bei der Trinder-Reaktion auszuschalten, insbesondere bei der Anwendung auf die Analysen der Harnsäure dutch Modifizieren des Trinder-Reagens durch Einverleibung von Amidopyrin in Konzentratio- ι «en von 1 -30 g/I neben den verschiedenen Bestandteilen, weiche für die enzymatische quantitative Bestimmung der Harnsäure mit dem modifizierten chromogenen Trinder-System vorgesehen sind. Dies ist dadurch bedingt, daß das Amidopyrin direkt an der Trinder-Reaktion teilnimmt unter Bildung eines Chromophors mit dem 2,4-DichlorphenoIsulfonat und dem Wasserstoffperoxid, dessen Farbe nur !eich2 weniger intensiv als diejenige ist, die aus der Reaktion zwischen 4-Aminophenazon^/t-DichlorphenolsuIfonat/Wasserstoffper- oxid, resultiert In der Praxis kommt es vor, daß das ganze Wasserstoffperoxid im Augenblick seiner Entstehung vollständig durch das Trinder-System mit dem Amidopyrin und dem 4-Aminophenazon in Anspruch genommen wird, so daß die Störwirkung des Bilirubins ^vollständig aufgehoben wird,

\ Hinsichtlich der Konzentration des Amidopyrins hat |ich experimentell ergeben, daß eine wirksame Konzentration desselben zwischen 1 und 30 g/I und insbesondere bei etwa 15 g/1 Hegt

Die experimentellen Ergebnisse bei der Harnsäure-Bestimmung in biologischen Proben (Serum od. dgl.) mit {dem erfindungsgemäß modifizierten Trinder-Reagens unter Zusatz von Amidopyrin haben gezeigt, daß für die Durchführung der Bestimmung folgende Konzentrationen bei den Reagens-Bestandteilen günstig sind:

Peroxidase 2000 EinhVl

2,4-Dichlorphenolsulfonat

-Natriumsalz 1 g/l

einbasisches Kaliumphosphat

(KH₂PO₄) 18 g/l

Natriumtetraborat

(Na₂B₄O₇-IOH₂O) 13.9 g/l

4-Aminophenazon 260 mg/1

Amidopyrin 15 g/l

Uricase — Aspergillus flavus 100 Einh71

bei einem Verhältnis von Serum zu Farbreagens von 1/40, und der spektrophotometrischen Messung des Reaktionsproduktes bei 500 bis 520 nm.

Die Entwicklung der chromogenen Reaktion wurde am Spektralphotometer mit Anzeigegerät bei Ansätzen mit und ohne Amidopyrin untersucht. Es zeigte sich, daß die Störung des Bilirubins, bedingt durch die Oxidation des Bilirubins durch das Wasserstoffperoxid in Probe», die 11,6; 14,82; J5,30; ,16 und 18 mg Bilirubin/100 ml enthielten größtenteils durch den Zusatz von Amidopyrin vermieden werden konnte (vgl. nachstehende Beispiele.

Beispiele

Ergebnisse der Harnsäurebestimmung bei Hyperbilirubinämie-Proben: mit dem Trinder-Reagens mit und ohne "Zusatz von Amidopyrin und Angabe der.Differenz in Prozent der dabei ermittelten Harnsäurekonzentrationen.

1 BILIRUBIN: 15,3 mg/dl
ermittelte Harnsäure:

2 BILIRUBIN: 11,6 mg/dl
ermittelte Harnsäure:

3 BILIRUBIN: 16 mg/dl
ermittelte Harnsäure:

4 BILIRUBIN: 14,82 mg/dl
ermittelte Harnsäure:

5 BILIRUBIN: 18 mg/dl
ermittelte Harnsäure:

6,7 mg/dl ohne Amidopyrin 9,3 mg/dl mit Amidopyrin

6,5 mg/dl ohne Amidopyrin 10,7 mg/dl mit Amidopyrin

7.1 mg/dl ohne Amidopyrin

9.2 mg/dl mit Amidopyrin

6,5 mg/dl ohne Amidopyrin 9,2 mg/dl mit Amidopyrin

2.0 mg/dl ohne Amidopyrin

3.1 mg/dl mit Amidopyrin

+38,8%

+64,6%

+39,4%

+41,53%

+55%

Claims

Patentansprüche:

1, Verbessertes Trinder-Reagens für klinische Analysen von Wasserstoffperoxid durch enzymatische Oxidation von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß es neben den bekannten Komponenten Amidopyrin (4-Dimethylamino-2,3-dimetnyl-l-phenyl-3-pyrazolin-5-on) in einer Konzentration zwischen 1 und 30 g/l aufweist.
2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei der enzymatischen Oxidation von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß das verbesserte Trinder-Reagens nach Anspruch 1 angewandt wird, wobei ein Verhältnis von Serum zu Farbreagens wie 1 :40 eingehalten wird, und daß die spektraiphotometrische quantitative Bestimmung des Reaktionsprodukts bei 500 bis 520 nm vorgenommen wird.