DE3885577T2

DE3885577T2 - Luciferase.

Info

Publication number: DE3885577T2
Application number: DE19883885577
Authority: DE
Inventors: Naoki Kajiyama; Tsutomu Masuda; Eiichi Nakano; Hiroki Tatsumi
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1987-11-30
Filing date: 1988-11-29
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2008-11-30
Also published as: EP0318915A3; JPH088863B2; EP0318915A2; JPH01141592A; EP0318915B1; DE3885577D1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Luziferase, die die Oxidation von Luziferin durch ein Sauerstoffmolekül katalysiert.
Luziferasen sind sehr effektiv verwendbar, beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von ATP, doch Luziferase, abgeleitet von Luciola cruciata ist instabil, so daß ihre Reinigung und Trennung bisher nicht erfolgreich war [Tanpakushitsu Kakusan Koso (Protein, Nucleic Acid, Enzyme) Band 32, Nr. 10, Seiten 44-59, insbesondere S. 47 (Seiten 1234-1249, insbesondere S. 1237), (1987)].
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, eine Luziferase zur Verfügung zu stellen, die von Luciola cruciata abgeleitet ist.
Im Hinblick auf die oben beschriebenen Bedingungen unternahmen die gegenwärtigen Erfinder Untersuchungsanstrengungen, und es gelang ihnen als Folge davon, Luziferase in stabilem Zustand aus dem hinteren Teil von Luciola cruciata zu isolieren, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Luziferase, die von Luciola cruciata ableitbar ist, zur Verfügung gestellt, die die Oxidation von Luziferin durch ein Sauerstoffmolekül gemäß der Reaktion:
Luciferin + ATP + O&sub2; T
Oxyluziferin + AMP + Pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht
katalysiert, wobei die Luziferase in einem pH von 6,5 bis 9,0 stabil ist, und die die Oxidation von Luziferin gemaß der obigen Reaktion in einem pH von 8,0 bis 9,5 optimal katalysiert.
Fig. 1 ist ein Graph, der den optimalen pH-Bereich des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt, und
Fig. 2 ist ein Graph, der den pH-Stabilitätsbereich des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
Physiko-chemische Eigenschaften des vorliegenden Enzyms sind wie folgt:

(1) Wirkung:

Das vorliegende Enzym katalysiert die Luziferinoxidation durch ein Sauerstoffmolekül, wie durch die Enzymreaktionsformel gezeigt wird: vorliegendes Enzym Luziferin + ATP + O&sub2; Oxyluziferin + AMP + Pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht

(2) Substrat-Spezifität:

Das vorliegende Enzym wirkt nicht auf ADP, CTP, UTP und GTP.

(3) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich

Das pH-Optimum ist, wie in Fig. 1 gezeigt wird 8,0 bis 9,5, gemessen durch Ausführung der Reaktion unter Verwendung von Luziferin als Substrat bei verschiedenen pH's einer 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung von 6,5 bis 11,5 und einer Temperatur von 30ºC und Messung der Lichtmenge (der Photonenzahl), die in 20 sec emittiert wird. Der pH-Stabilitätsbereich ist, wie in Fig. 2 gezeigt ist, 6,5 bis 9,0, wie durch Zugabe des Enzyms zu jeder der Pufferlösungen [25 mM Phosphat-Pufferlösungen (pH 4,6 bis 8,0) und 25 mM Glycin- Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Pufferlösungen (pH 8,0 bis 11,5), von denen jede Ammoniumsulfat bis zu 10 % Sättigung enthält], die Luziferin enthielten, und indem man das Enzym bei einer Temperatur von 0ºC 4 Stunden einwirken ließ. In Fig. 2 zeigen
die Aktivität im Fall, daß die 25 mM phosphat-Pufferlösungen eingesetzt werden, bzw. die Aktivität im Fall, daß die 25 mM Glycin- Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Pufferlösungen eingesetzt wurden.

(4) Titer-Messungen

Eine Luziferinmischlösung wird hergestellt, indem 8 ml 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8), 0,5 ml Magnesiumsulfatlösung [eine Lösung, die hergestellt wird durch Zugabe von Magnesiumsulfat zu 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8) zu einer Magnesiumsulfatkonzentration von 0,1 M] und 0,8 ml einer Luziferinlösung (eine Lösung, hergestellt durch Zugabe von Luziferin zu 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8) auf eine Luziferinkonzentration von 1 mM].
Zu einer Mischung von 400 ul der so erhaltenen Luziferinmischlösung und 10 ul zu untersuchender Luziferase werden 80 ul einer ATP-Lösung eingegossen [eine Lösung, hergestellt durch Zugabe von ATP zu 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8) auf eine ATP-Konzentration von 10 mM]. Gleichzeitig mit dem Eingießen wird die Zahl der erzeugten Photonen gemessen, indem 20 sec lang mittels eines Luminometers aufaddiert wird (Luminescence Reader BLR-201, hergestellt von ALOKA CO., LTD.).

(5) Temperaturbereich, der zur Einwirkung geeignet ist

Wenn die Reaktion bei pH 7,8 und bei der jeweiligen Temperatur ausgeführt wird, und die Lichtmenge (die Photonenzahl) in 20 sec emittiert wird, reicht die geeignete Reaktionstemperatur von 0º bis 50ºC.

(6) Bedingungen für die Inaktivierung durch pH, Temperatur usw.

(a) Bedingungen für die Inaktivierung durch pH
Bei pH's von 5,0 oder weniger und 11,0 oder mehr wird das Enzym nach 4 Stunden vollständig inaktiviert.
(b) Bedingungen der Inaktivierung durch Temperatur
Bei pH 8 wird das Enzym durch eine 15 minütige Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 50ºC vollständig inaktiviert.
Als nächstes wird ein konkretes Mittel zur Herstellung des vorliegenden Enzyms nachstehend beschrieben.
Zur Herstellung des vorliegenden Enyzyms kann ein beliebiges Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann das folgende Verfahren angeführt werden.
Als in der vorliegenden Erfindung verwendete Luciola cruciata kann eine beliebige verwendet werden, die aus der natürlichen Welt gesammelt wurde, die künstlich gezüchtet wurde usw. Da eine große Menge an Luziferase im hinteren Teil von Luciola cruciata existiert, ist dieser hintere Teil als Quelle, von der Luziferase abgetrennt wird, geeignet.
Luciola cruciata wird zu einer Pufferlösung zugegeben und gemahlen, so daß ein gemahlenes Produkt erhalten wird.
Als Pufferlösung kann eine beliebige verwendet werden, solange sie nicht Luziferase inaktiviert, und als Beispiel können Lösungen angeführt werden, die hergestellt werden durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu jeweils Tris(hydroxy)aminomethan-Salzsäure-Pufferlösungen, Glycin- Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Pufferlösungen, Phosphat-Pufferlösungen usw., bis zu 10 % Sättigung.
Als Mittel zum Mahlen können beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung eines Mörsers und eines Stampfers, und Verfahren unter Verwendung eines Homogenisators, eines Warin-Mischers, einer französischen Presse oder dergl. angeführt werden.
Anschließend wird der Rückstand vom gemahlenen Produkt durch gewöhnliche Zentrifugation, Filtration oder dergl., entfernt, so daß eine Rohenzymlösung erhalten wird. Falls nötig wird die Rohenzymlösung durch ein Verfahren behandelt, das geeignet ausgewählt wird aus Gefriertrocknen, alkoholischer Fällung, Acetonfällung, usw., so daß ein Rohenzympulver erhalten wird.
Ein gereinigtes Enzympräparat kann aus der Rohenzymlösung oder dem Rohenzympulver durch Kombination von Verfahren erhalten werden, die geeignet ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus beispielsweise Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex, Ultrogel, Biogel, usw.; Adsorption- und Eluierungsverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern; elektrophoretischen Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelen usw.; Adsorption- und Eluierungsverfahren unter Verwendung von Hydroxyapatit; Sedimentationsverfahren wie Sucrosegradienten-Zentrifugation und dergl.; Affinitäts-chromatographischen Verfahren; und Fraktionierungsverfahren unter Verwendung einer Molekularsiebmembran, einer Hohlfasermembran usw.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert.
Zu 25 mM Tris(hydroxy)aminomethan-Salzsäure-Puffer wurde 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid gegeben, gefolgt von Zugabe von Ammoniumsulfat auf 10 % Sättigung. Zu 15 ml der so erhaltenen gemischten Lösung (pH 7,8) wurden die Hinterteile von 150 Insekten (Luciola cruciata) (gekauft von Seibu Department Store Co., Ltd.) gegeben und mittels PHYSCOTRON (hergestellt on NITI-ON Medical and Physical Instrument Manufacturing Company Ltd.) zerstört. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde bei 12.000 U/Min. 20 Minuten zentrifugiert, wodurch 14,5 ml eines überstands erhalten wurden (eine Rohenzymlösung).
Die so erhaltene Rohenzymlösung wurde unter Verwendung von Ammoniumsulfat nach einem herkömmlichen Verfahren ausgesalzen, und das bei 30 bis 60 % Sättigung gebildete Präzipitat wurde bei 30.000 U/Min. 10 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Niederschlag wurde in einer 25 mM Mischlösung [eine Lösung (pH 7,8), hergestellt durch Zugabe von 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat und Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß damit eine 10 %-ige Sättigung erreicht wurde, zu einer kleinen Menge 25 mM Tri5(hydroxy)aminomethan-Salzsäure-Puffer], unter Erhalt einer Lösung gelöst.
Anschließend wurde diese Lösung der Gelfiltrations-Chromatographie unterworfen, indem man dieselbe durch eine Ultrogel AcA34 (hergestellt von Pharmacia K.K.) Säule, die mit der obigen 25 mM Mischlösung equilibriert worden war, passieren ließ, wodurch eine Aktivitätsfraktion erhalten wurde.
Die so erhaltene Fraktion wurde gegen eine Phosphat-Pufferlösung dialysiert [eine Pufferlösung, hergestellt durch Zugabe von 0,1 M Natriumchlorid und 10 % (V/V) Ethylenglykol zu einer 10 mM Natriumhydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphatlösung]. Die dialysierte Lösung wurde auf einer Hydroxyapatit HPLC (TSK Gel HA-1000, hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.), die mit 10 mM Phosphat-Puffer äquilibriert worden war, adsorbiert und eine lineare Gradienteneluierung mit Phosphat-Pufferlösungen (pH 7,5) in Konzentrationsbereichen von 10 bis 100 mM wurde ausgeführt, so daß 200 ul (enzymatische Aktivität: 3,5 x 10² K-Count) einer gereinigten Luziferase-Aktivitätsfraktion, abgeleitet von Luciola cruciata, erhalten wurde.

Claims

1. Luziferase, ableitbar aus Luciola cruciata, die die Oxidation von Luziferin durch ein Sauerstoffmolekül gemäß der Reaktion:

Luziferin + ATP + O&sub2; T

Oxyluziferin + AMP + Pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht

katalysiert, wobei die Luziferase bei einem pH von 6,5 bis 9,0 stabil ist, und die die Oxidation von Luziferin nach der obigen Reaktion bei einem pH von 8,0 bis 9,5 optimal katalysiert.