WO1990005181A1

WO1990005181A1 - REINIGUNG VON Cu/Zn-SUPEROXIDDISMUTASE

Info

Publication number: WO1990005181A1
Application number: PCT/AT1989/000099
Authority: WO
Inventors: Alois Jungbauer; Karola Uhl; Wolfgang Schönhofer; Franz Steindl; Marlies Skias
Original assignee: Cl-Pharma Aktiengesellschaft
Priority date: 1988-11-07
Filing date: 1989-11-06
Publication date: 1990-05-17
Also published as: CA2002446A1

Abstract

Bei einem Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Cu/Zn-Superoxiddismutase (Cu/Zn-SOD) wird zwecks Erzielung eines leicht weiterverarbeitbaren Präparates, gegebenenfalls nach entsprechender Vorreinigung, die Cu/Zn-SOD durch Hydrophobic Interaction Chromatographie (HIC) von Fremdproteinen getrennt.

Description

REINIGUNG VON Cu/Zn-SUPEROXIDDISMUTASE

EINLEITUNG

1.1. Die biochemischen Eigenschaften der Cu/Zn-Superoxid- dismutase

Die Cu/Zn Superoxiddismutase, im folgenden Cu/Zn-SOD genannt, (E.C. .1.15.1.1) ist ein Metalloprotein, das auch unter dem Namen Erythrocuprein, Haemocuprein und Cytocu- prein bekannt ist. Die humane Cu/Zn Superoxiddismutase besteht aus 2 Untereinheiten, die nicht kovalent miteinan¬ der verbunden sind. Die natürlich vorkommende humane SOD ist am N-Terminus acetyliert und besteht aus 153 Amino¬ säuren. Pro Molekül Cu/Zn-SOD sind in der Regel 2 Kupfer und 2 Zinkionen gebunden. Die Cu/Zn-SOD besitzt eine charakteristische Absorptionsmaximum bei 265 nm. Nach Entfernung des Kupfers und Zinks durch Chelatbildner ver- schwindet dieses Absorptionsmaximum. Die Superoxiddismutase ist ein thermostabiles und sehr gut wasserlösliches Enzym. Eine gewisse Widerstandsfähigkeit gegenüber proteolytischen Abbau wird ihr auch zugeschrieben. Bei höheren Temperaturen (82 °C und 100 °C) entstehen verschiedene Konformationen, die calorimetrisch und durch Bindunsstudien festgestellt wurden. Diese Eigenschaft wird auch in HPLC und Elektrophorese beobachtet (1) .

1.2.. Biologische Bedeutung der Cu/Zn-Superoxiddismutase

üblicher Weise werden rote Blutkörperchen als Ausgangsma¬ terial für die Gewinnung der Cu/Zn-Superoxiddis utase herangezogen. Die biologische Bedeutung der Cu/Zn-SOD liegt in Abfangen von freien Superoxidradikalen, die bei ver¬ schiedensten Reaktionen im Organismus frei gesetzt werden.

_eqSATZBLÄTT Aus diesem Grund werden der Cu/Zn-SOD auch antiinfla - matorische Eigenschaften zugeschrieben (9) . Die bovine Cu/Zn-SOD wird bereits zur Behandlung von Osteoarthritis verwendet. Ebenso dürfte SOD eine Verstärkerwirkung für plasminogen-aktivierende Enzyme bei der Reperfusion besitzen (10) . Weiters scheint SOD die Lagerungsfähigkeit von den nach der Explantation zum Zwecke einer späteren Transplantation zu stabilisieren (11) .

1.3. Reinigungsverfahren für Erythrozyten SOD und SOD tierischem Gewebe und Zellkultur

Die konventionellen Reinigungsverfahren für SOD beruhen auf einer Lyse der Erythrozyten, meist eine Osmolyse und einer Extraktion der SOD mit Chloroform und Ethanol. Diese Prozedur wird auch Tsuchihaskiprozedur (M. Tsuchihaski, Biochem. Zeitschrift, 140, 65-72,1923) genannt. Dieser Rohextrakt wird dann chromatographisch mit Ionentauscher- Chromatographie weiter gereinigt.

Bei Erythrozytenkonzentraten als Ausgangsmaterial kann anstatt der Extraktion eine Hitzepräzipitation eingesetzt werden, um Hämoglobin zu entfernen. Diese Methode (A. Gärtner et al. Biochem.J.1984; 221, 549-551) eignet sich, weil humane Erythrozyten-SOD hitzestabil ist. Eine Dialyse nach der Lyse der Erythrozyten wie bei Gärtner et.al. beschrieben, ist nicht notwendig. Das Erythrozytenkonzentrat wird einem Gefrier¬ tauzyklus unterworfen und durch Zugabe von destilliertem Wasser lysiert. Das Lysat wird durch Zugabe von 80 °C heißem Wasser auf 70°C erhitzt und eine Stunde heißgehalten und danach rasch auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt. Wenn bei ca. 15 000 g zentrifugiert wird, entfällt ein zusätzlicher Filtrationsschritt, der für eine anschließende Anionen- tauscherchromatographie notwendig wäre. Die im Überstand zurückbleibende Cu/Zn SOD wird weiterverarbeitet.

_ERSATZBLATT 1.4. Reko binante Superoxiddismutase

Die Cu/Zn-SOD wurde in einer Reihe von Wirtszellen wie E.Coli, Hefe und tierischen Zellen kloniert (1-5) . Je nach Verwendung von verschiedenen Wirtszellen wird ein acetyliertes oder nicht acetyliertes Protein exprimiert. Die für E.coli und Hefe beschriebenen Systeme scheiden das Enzym nicht in das Kulturmedium aus. Bis zu 60 % des gesamten synthetisierten Proteins besteht aus SOD. Die tierischen Zellen scheiden die rekombinante humane Cu/Zn-SOD (rh-SOD) ins Kulturmedium aus.

1.5. Reinigungsverfahren für rekombinante SOD

Ein sehr häufig beschriebener Reinigungsschritt ist die Chromatographie mit DEAE-Sephacel oder DEAE-Cellu- losen. Das Homogenat wird geklärt und durch eine Ammonsulfatfällung vorgereinigt. Nach Bedarf werden noch weitere Schritte zur Entfernung von DNA bzw. Pyrogenen integriert. Hartmann et.al. (2) reinigen den dialysierten Ammonsulfatfällungsüberstand mit einer Anionentauscherchro- matographie (DEAE-Sephacel) . Um die gewünschte Reinheit zu erhalten, wird das Eluat rechromatographiert. Die Fraktionen werden mittels Ultrafiltration aufkonzen-triert und mittels Gelfiltration entsalzt. Die Gradien- tenelution bewirkt, daß ein homogenes Material erhalten wird.

Auch die Immunaffinitätschro atographie mit monoklonalen Anti-human-SOD-Antikörpern wird zur Reinigung rekombinanter SOD herangezogen. Ebenso eignet sich die Affinitätschro¬ matographie mit Heparin-Sepharose zur Reinigung von rekombinanter SOD (3) . Vom Prinzip her dürften diese Methoden auch zur Reinigung der natürlich vorkommenden SOD geeignet sein.

ER_SA_TZBLATT 1.6. Testsysteme für SOD

Die Testsysteme zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von SOD beruhen auf dem Prinzip einer Negativbestimmung. Zuerst werden Superoxid Radikale generiert. Die Radikal- generierung kann enzymatisch, chemisch oder mit UV-Licht erfolgen. Die SOD fängt einen Teil der freien Radikale ab. Die Verbleibenden werden durch einen Indikatorradikalfänger abgefangen, dessen Reaktionsprodukte werden colori e- trisch, photometrisch, polarographisch oder mittels Luminscenz essung ausgewertet. Die Bestimmung der SOD aus Rohextrakten von Mikroorganismen oder Geweben ist sehr störanfällig. Der immunologische Nachweis auf ELISA Basis funktioniert auch in Rohextrakten von Mikroorganismen.

BESCHREIBUNG DER REINIGUNGSVERFAHREN

Die eigentliche Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Cu/Zn-SOD. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, daß SOD gewonnen aus tierischen Geweben, Flüssigkeiten, transfor¬ mierten Mikroorganismen oder transformierten tierischen Zellen zu einem von Begleitproteinen und anderen Verunreinigung zubefreien.

Erfindungsgemäß wird, gegebenenfalls nach entsprechender Vorreinigung, die Cu/Zn-SOD durch Hydrophobic Interaction Chromatographie (HIC) von Fremdproteinen getrennt. Dadurch wird ein SOD-Produkt erhalten, das leicht zu einem Enzympräparat verarbeitet werden kann, das dann als Therapeutikum einsetzbar ist. Bevorzugt kann die durch HIC von Fremdproteinen getrennte Cu/Zn-SOD mittels Metallchelatchromatographie oder Ionentauscherchromato- graphie nachgereinigt werden, wodurch das Präparat besonders rein erhalten wird und direkt als Therapeutikum einsetzbar ist.

_ERSATZBLATT In dieser gegenständlichen Erfindung erfüllt die HIC in idealer Weise die Voraussetzung für einen technischen Prozeß, der zur Produktion von Biologika zum Einsatz in der human Medizin geeignet ist. Neben der Reinigung und Entfernung von Fremdproteinen werden auch Pyrogene und DNA stark abgereichert.

Da die Cu/Zn-SOD in hohen Am onsulfatkonzentrationen löslich ist, erfüllt sie eine wichtige Voraussetzung für die HIC. Pyrogene, als fiebererregende Substanzen dürfen nur in Spuren in Pharmazeutika , die parental Verabreicht werden, vorhanden sein. Der Wirtsstamm für die rekombinante SOD, E.coli produziert von sich aus Lipopolysacchride, die als Hauptvertreter der Pyrogene anzusehen sind. Hartmann et.al. müssen in ihrer Reinigungsprozedur einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung von Pyrogenen und DNA durchführen.

In der gegenständlichen Erfindung ist jedoch eine starke Pyrogenreduktion durch die HIC selbst gewährleistet. Ebenso wird die DNA entfernt, die bei Verwendung von gentechnisch erzeugten Wirksubstanz einen bestimmten Schwellenwert nicht überschreiten darf. Aus diesen Gründen erfüllt die HIC in der gegenständlichen Erfindung in idealer Weise die Voraussetzung für die Produktion von SOD, die parenteral verabreicht wird. Die von Arai et. al. (15) beschriebene immunaffinitätschro- atographische Reinigung hat zwar den Vorteil, daß sie sehr spezifisch und gleichzeitig universell einsetzbar ist. In der Unstabilität des IgG als Liganden durch proteolytischen Abbau ist eine nicht unerhebliche Problematik . bei der Reinigung von pharmazeutischen Wirksubstanzen gelegen. Vorreinigungsschritte, die ein chromatographisches oder ähnlich effektives Verfahren beinhalten, müssen bei der Immunaffinitätschromatographie unbedingt eingebaut sein. Die HIC benötigt keine Chromatographisehen Vorreinigungsschritte und dann zusätzlich noch sehr leicht mit Natronlauge entpyro- genisiert werden. Durch die Natronlaugenbehandlung der HIC werden auch unspezifisch gebundene Proteine und nicht proteinogene Substanzen entfernt. ERSATZBLATT 2.1. Beschreibung der Vorreinigungsschritte

Je nach Ausgangsmaterial (Bakterien, Hefen, Erythrozyten oder tierischen Zellen) müssen verschiedene Extraktions¬ schritte bzw. Vorreinigungsschritte dem eigentlichen Reinigungsverfahren vorgeschaltet werden.

Das Aussalzen, insbesondere die Ammonsulfatfällung ist ein effektiver Vorreinigungsschritt für die rh-SOD Bakterien oder Hefen als Ausgangsmaterial.

Die Mikroorganismenbrühe wird homogenisiert. Es eignen dazu sowohl enzy atische Methoden (Lysozym) als auch mechanische, (Hochdruckhomogenisatoren) oder physikalische (Ultraschall) Methoden. Um die Zentrifugierbarkeit des viskosen Homogenates zu verbessern, können dem Extraktionspuffer Nukleasen zugesetzt werden. Dadurch wird die DNA in kleinere Bruchstücke verdaut und somit sinkt die Viskosität. Das Homogenisat wird mit Hilfe von Zentrifugation oder Mikrofiltration geklärt. Das geklärte Homogenat wird mit Ammonsulfat oder einem entsprechenden Salz versetzt, sodaß eine Endkonzen¬ tration zwischen 40 und 60 % erhalten wird. Die Cu/Zn-SOD bleibt im Überstand, das Präzipitat wird neuerlich durch Zentrifugation oder Mikrofiltration abgetrennt.

2.2. Hydrophobie Interaction Chromatographie

Die Hydrophobic Interaction Chromatographie wurde von W. Melander (7) und Ochoa (8) in Reviews beschrieben. Diese Art der Chromatographie basiert auf der spezifischen Wechselwirkung der hydrophoben Zentren in den Proteinen mit einem hydrophoben Liganden, (wie Phenyl, Octyl, Butylliganden usw.) in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen. Diese hohen Salzkonzentrationen bewirken durch Wasser¬ entzug und Abblocken hydrophiler Zentren im Protein die spezifische Weschselwirkung.

ERSATZBLATT Die Hydrophobic Interaction Chromatographie (HIC) über Phenyl, Butyl, Octylsäulen etc. ist nur sinnvoll in Kombination mit einer Salzfällung einzusetzen. Der geklärte Überstand aus der Ammonsulfatfällung bzw. Salzfällung wird auf die HIC-Säule aufgetragen, die vorher mit einer entsprechenden Salzlösung äquilibriert wurde. Die SOD wird mit Salzpuffer niedriger Salzkonzentration eluiert. Aufgrund der hohen Salzlöslichkeit der SOD ist die Hydrophobic Interactionchro atographie besonders gut für das gegenständliche Reinigungsproblem geeignet. Durch die hohe Ammonsulfatkonzentration können Verunreinigungen in diesem Vorreinigunsschritt entfernt werden.

2.3. Nachweis der Cu/Zn-SOD

Die SOD-Bestimmung wurde entweder immunologisch chromato¬ graphisch oder mit einem Aktivitätstest durchgeführt.

Immunologischer SOD-Nachweis mit ELISA:

Es wurde Prozedur nach T.Porstmann (6) verwendet. Der Test basiert auf Verwendung zweier SOD-spezifischer onoklonaler Antikörper. Einer davon ist mit Meerret- tichperoxidase gekoppelt. Die Auswertung erfolgte in einem Mehrkanalphotometer für Mikrotiterplatten (Easy Reader der Firma SLT) .

Aktivitätstest:

Es wurde ein Testsystem gewählt, mit dem Xanthin/Xanthin oxidase als Radikalgenerator und Nitrobluetetradolium als Indikatorradikalfänger verwendet wird.

Auch dieser Test wurde in Mikrotiterplatten durchge¬ führt. 100 μl Reagenzlösung und 50 μl Probe bzw. Blindwert werden zusammenpipettiert und photometrisch bei 600 nm ausgewertet. Danach werden 50 μl Xanthinoxidase zupipet- tiert und 20 min. unter leichtem Schütteln inkubiert und wieder photometrisch bei 600 nm ausgewertet. Das farblose Nitrotetrazolium blau (NBT) wird die durch 0₂-Radikale,

ERSATZBLATT die durch Xanthinoxidase entstehen zu einer blauen Farbe aufoxidiert. In Gegenwart von SOD bleibt die Lösung ungefärbt. Als SOD-Standard wurde Peroxinorm der Fa. Grünenthal verwendet.

Puffer für den Aktivitätstest

- Reagenzlösung I besteht aus

50 mMolar Kaliumphosphatpuffer, 1,25 m Molar Diethylentriaminopentaessigsäure Puffer 100 μl

Puffer werden mit 10 mg Xanthin, 15 mg NBT und ca. 4000 Einheiten Katalase versetzt

- Xanthinoxidase wird so in einem 50 mM Kaliumphosphat,

1,25 mM Diethylentriaminopentaessigsäure Puffer gelöst, daß 100 ml eine Einheit des Enzyms enthalten

Definition der Einheiten:

Katalase: 1 Einheit baut 1,0 uM H₂0₂ pro Minute bei pH 7,0 und 25 °C ab, wobei die H₂0₂ Konzentration von 10,3 auf 9,3 uM/ml fällt

Xanthinoxidase: 1 Einheit konvertiert 1,0 uM Xanthin zu Harnsäure pro Minute bei pH 7,5 und 25 °C.

Chromatographische Bestimmung

Die SOD wurde auch mit Reversed Phase Chromatographie (RPC) quantifiziert. Es wurde eine C-4 oder C-14 Säule eingesetzt. Mit einem Acetonitrilgradienten (20-60 %) mit 0,1 % TFA wurde eluiert. Als Detektor wurde ein Diodenarray detector der Fa. Hewlett Packard verwendet. Die Methode eignet sich auch zur Quantifizierung von SOD aus Rohextrakten.

ERSATZBLATT 3. BEISPIELE

Beispiel I

Rekombinanter Mikroorganismenstamm

Ein für humane Cu/ZnSOD kodierendes chemisch syntheti¬ siertes Gen wurde über entsprechende flankierende Sequenzen in die Restriktionsschnittstellen BamHl und Hindlll des Plasmids pEMBL 8 kloniert. Aus dem so amplifi- zierten Plasmid pEMBL 8-SOD wurde das SOD-Gen mit den Restriktionsenzym ECORI und Hindlll herausgeschnitten und das gereinigte Restriktionsfragment in den Vektor pKK 223- 3 (Pharmacia) kloniert. Die AUG flankierenden Regionen des SOD-Gens wurden mittels der in vitro Mutagenese mit einem Oligonucleotid von der Sequenz:

5'-CACACAGGAAACAGACATATGGCAACAAAGGCCGTGTGCGTGC-3'

so verändert, daß eine hohe Expression von humaner Cu/ZnSOD • ermöglicht wurde. (Hallewell et. al.; l) Das so erhaltene Plasmid pKK223-SOD X 16 wurde in E.Coli JM 105 (Pharmacia) Wirtszellen transformiert und die reko binanten E.Coli Zellen im Batchverfahren kultiviert. 2 Stunden nach Induktion mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) wurde die Biomasse geerntet.

Zellernte und Aufschluß

Nach der Induktion mit IPTG wurde die Biomasse durch Zentrifugation abgetrennt. Das Pellet wird im Extraktions¬ puffer gewaschen und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Der Aufschluß wurde enzymatisch mit Lysozym durchgeführt.

_ERSATZBLATT (Lysozym wurde bei 37 °C mit dem gewaschenen resuspen¬ dierten Pellet inkubiert) . Um die Viskosität zu erniedrigen wurde das Homogenisat mit DNAse inkubiert. Das geklärte Homogenat wurde so bei 4 °C mit gesättigter Ammonsul¬ fatlosung versetzt, daß eine 60 % Endkonzentration erreicht wurde. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt und der überstand wird weiterverarbeitet. Anstelle von gesättigter Ammonsulfatlosung kann festes Ammonsulfat direkt in das Homogenat eingerührt werden.

4.3. Hydrophobie Interaction Chromatographie (HIC)

Durch diesen Schritt können hydrophobe und hydrophile Substanzen getrennt werden. Die rh-SOD bindet an die Säule bei hoher Ionenstärke und kann bei geringer Ionenstärke eluiert werden.

AUFSCHLUSS

Da sich die rh-SOD in der E.Coli Zelle befindet, muß die Zelle aufgeschlossen werden. Hier wird eine enzymatische Methode mit Lysozym aus Hühnereiweiß angewendet. Folgende Materialien und Chemikalien wurden verwendet:

- TRIS-Base (Fa. Sigraa) - CuS0₄

(Dinatrium EDTA; (Fa. Merck)

- ZnCl₂ (Fa. Merck)

- konz. Mercaptoethanol (Fa. Sig a)

- PMSF gelöst in Äthanol (Fa. Sigma) - Lysozym (Fa. Sigma, oder Fa. Serva)

- Triton x-100 (Fa. Serva)

- DNASE I (Fa. Sigma)

ERSATZBLATT Zusammensetzung der Lösungen

- Waschpuffer für E.Coli Zellen

100 M Tris/HCL pH 8,0 versetzt mit 100 mM NaCl und 1 mM EDTA

- Resuspensionspuffer: 20 mM TRIS/HC1 pH 8,2

- Aufschlußstammlösung:

Volumen für 30 ml Stammlösung Endkonzentr. E.coli in E.coli susp.

300 μl

150 μl

30 μl

15 μl

600 μl 5 % PMSF gelöst in Äthanol

600 μl 10 mg/ml Lysozym

30 μl 10 mg/ml DNAse I

Zu 30 ml der Bakteriensuspension kommen die angegebenen Volumen der Stammlösung. Danach wird 5 min bei 40 °C inkubiert. Die Lyse der Zellen erfolgt durch Zugabe von 1,5 ml 10 %iger Triton x-100 Lösung und 5 inütiger Inkubation bei 40 °C. Die lysierten Zellen werden mittels Zentrifugation ^"abgetrennt und der klare- Überstand weiterverwendet.

Folgende Materialien und Chemikalien wurden verwendet:

- Phenylsepharose fast flow (Fa. Pharmacia)

- Ammonsulfat tech. rein

- TRIS-Base (Fa. Sigma) ^■ - HC1 25 %

ERSATZBLATT Die Pufferbereitung erfolgte nach folgender Vorschrift :

- Aquilibrierungspuffer:

60 % (NH₄)₂S0₄ in 25 mM TRIS HCI pH 7,5 3,0 g TRIS/1000 ml + 351 g (NH₄)₂S0₄ mit HCI auf pH stellen Leitfähigkeit 200 mS/cm

- Elutionspuffer II:

25 mM TRIS/HCl pH 7,5 wird (NH₄)₂S0₄ gelöst 25 mM TRIS (auf 160 S/cm Leitfähigkeititriert, Zimmertemperatur

- Regenerierungspuffer: 25 mM TRIS/HCI pH 7,5 Leitfähigkeit: 1,9 S/cm

Die Chromatographie wurde wie folgt durchgeführt:

- Packen der Säule mit 20 % Äthanol - Äquilibrieren der Säule

Säule wird mit Aquilibrierungspuffer äquilibriert. Aufgrund der hohen Viskosität der Lösungen ist es von Vorteil diesen und alle anderen Lösungen von unten nach oben durch die Säule zu pumpen. Dadurch kann die störende Kanalbildung verhindert werden.

- Auftragen

Mikrofiltrat der Probe wird aufgetragen - Auswaschen

Nach dem Auftragen wird mit Aquilibrierungspuffer bis zum Erreichen der Basislinie ausgewaschen

- Elution

Mit den verschiedenen Elutionspuffern werden die Fraktionen eluiert und peakweise gesammelt.

- Die SOD wird bei ca. 170 mS/cm eluiert.

- Mit Reinigungspuffer werden die noch an der Säule haften den Proteine eluiert.

Nach Äquilibrieren kann die gleiche Säule mehrmals wieder verwendet werden.

ERSATZBLATT 50 ml Phenyl-Sepharose fast flow der Fa. Pharmacia wurde in eine Säule mit 5 cm₂ Querschnitt gepackt. Das Gel wurde mit einer 60 %igen Ammonsulfatlosung äquilibriert. Der geklärte überstand aus der Ammonsulfatlosung wurde mit 0,2 um Filter von allen Feinteilen befreit und auf die Phenyl-Sepharose fast flow aufgetragen.

Die Elution erfolgte mit einer Ammonsulfatlosung etwas geringerer Konzentration (ca. 50 % Sättigung) als der des Aquilibrierungspuffer.

Die einzelnen Fraktionen wurden zusätzlich mit reversed Phase Chromatographie (RPC) über RRC C14 überprüft. Die Elution erfolgte mit einer Ammonsulfatlosung etwas geringerer Konzentration (ca. 50 % Sättigung) als der des Äquilibrierungs-puffer.

Die Reinigungsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die SOD-Konzentration wurde mittels ELISA wie von Porstmann et.al. beschrieben, bestimmt. Die einzelnen Fraktionen wurden zusätzlich mit Reversed Phase Chromatographie (RPC) überprüft.

ERSATZBLATT Tabelle 1: Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse, Ammonsulfatberstand aus geklr- ten E.Coli Homogenat wird mit Phenylsepharose fast flow aufgetrennt. 5 * n.d.= nicht detektierbar mit spezifischer E.Coli DNA Probe

Stufe DNA

nat n. d. 39 , 1 800 100 150.000

Überstand Ammonsulfat IHL lung 16,7 17,2 198 42,7 150

20

- Eluat der Phenyl 13,7 12,8 34,7 32,7 1 ng. n.d. Superose fast flow

Der in Fig. 1 mit SOD gekennzeichnete Peak wurde mit RPC auf seine Reinheit geprüft und im Vergleich dazu auch der Ammon- sulfatüberstand. Die Proben wurde vor Injektion in die RPC-Säule mit Sephadex G25 Säulen entsalzt. Daraus resultiert eine unterschiedliche Verdünnung der Proben. Das Ausgangsmaterial ist doppelt so stark verdünnt als das Eluat. Die Retentionszeit der SOD wurde mit einem Material der Firma Biotechnology General (Israel) bestimmt. Die RPC-Chromatogramme der ungereinigten und der gereinigten SOD sind in Fig. 2 und 3 zusammengefaßt. Die entsprechenden Elektropherogra me (Es wurde das Phastsystem der Fa. Pharmacia verwendet. Die Auftrennung wurde laut Anleitung des Herstellers durchgeführt.) sind aus Fig. 3 ersichtlich (Bahn l der Molekulargewichtsraarker, 2 Cu/Zn-SOD nach Hartman*! et.al., 3 der Ammonsulfatüberstnad, 4 HIC Peak gekennzeichnet mit SOD, 5 HIC gekennzeichnet mit Peak 2, 6 die mit Cu Chelatchromatographie gereinigte SOD.), wofaβi ein homogenes Produkt erhalten werden konnte.

4.4. Metallchelatchromatographie

Das Eluat wurde mittel Cu-Chelat-Chromatographie nach Weselake et.al. (13) weitergereinigt. Das erhaltene Protein wurde auch elektrophoretisch charakterisiert (Fig. 3) . Es ist absolut pyrogenfrei.

BEISPIEL II.

1. Rekombinanter Mikroorganismenstamm

Es wurde das in E.Coli eingesetzte Gen für die Verwendung in Hefen umkonstruiert und in Hefestämmen der Gattung Saccharomyces und Pichia eingesetzt.

ERSATZBLATT 2. Zellernte und Aufschluß

Nach Erreichen der stationären Phase wurde die Biomasse durch Zentrifugation abgetrennt. Das Pellet wird im Extraktionspuffer gewaschen und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die Zellen wurden mit einer Schwingmühle der Fa. Netzsch aufgeschlossen. Das geklärte Homogenat wurde bei 4oC mit gesättigter Ammonsulfatlosung versetzt. (60 % Endkonzentration) . Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt und der überstand wird weiterverarbeitet.

3. Hydrophobie Interaction Chromatographie HIC

Octylsepharose CL-4 B (ca. 50 ml) der Fa. Pharmacia wurde in eine Säule mit 5 cm² Querschnitt gepackt. Das Gel wurde mit 60 % Ammonsulfat äquilibriert. Der Ammonsulfat- überstand wurde auf die Octylsepharose aufgetragen. Die Elution erfolgte mit 50 % Ethylenglycol. Die Reinigungsergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Es konnte ein enzymatisch aktives und immunologisch Enzym gefunden werden, weil der Quotient aus Aktivitätstest und ELISA im Bereich von 1 (Tabelle 2) liegt. Der Erfolg des Chromatographie-Schrittes ist aus Fig. 4 ersichtlich. Das Ausgangsmaterial und das Eluat aus der HIC wurden durch RPC auf einer C-4 Säule charakterisiert. Da bei 214 nm auch nicht proteingene Verunreinigungen erfaßt werden, zeigt die RPC die spezifische Anreicherung der SOD bezogen auf alle vorhandenen Verunreinigungen, liegt bei weitem höher als die spezifische Anreicherung bezogen auf Protein.

ERSATZBLATT

5 Tabelle Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse von rh-SOD aus Sacchero yces- lerevisial. Der Ammonsulfatberstand aus dem geklrten Hefehomogenat wird mit Ocytylsepharose CL-4B weiter aufgetrennt. Die Ausbeute wurde basie rend auf den Aktivittstest kalkuliert.

10

Stufe Ausbeute (%)

- berstand

Ammonsulfatfllung 500 46,0 45,0 254 100

20 Eluat 84 32,6 34,0 38,0 4,0 70,8

BEISPIEL III

nem nd in auten 30 kg

eißem . Die

rt und eratur

einer das ällung

ugiert phobic flow 0 mM Liter

gung) , f die

ml) e e cht ebundene ¬

Tabelle 3: Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse, Reinigung der Cu/Zn-SOD mit Phenylsepharose fast flow nach Hitze und Ammonsulfatfllung

m

(0 10 Stufe Volumen SOD Protein Anreicherung Ausbeute (ml) (mg) (mg) (mg) (%)

N

CD

- berstand 15 Ammonsulfatfllung 1000 17,0 1200 100

- Eluat 120 14,3 24 42,5 67,2

BEISPIEL IV

Reinigung von rh-SOD aus Zellkulturüberstand

Ein ähnlicher Expressionsvektor wie er von Tibel et.al. für die Expression von extrazellulärer SOD verwendet wurde, kam auch hier zum Einsatz.

Konstruktion des Expressionsvektors

Es wurde ein SV-40 Expressionsvektor, der folgende relevante DNA-Sequenzen enthält, konstruiert:

SV-40 Sequenz Basenpaar bp 5173 HIND III bis bp 294 (Kpn I) , das den Early promotor und den Origin of replication enthält. Weiters wurden die SV-40 Sequenzen bp 2770 (Bei I) bis bp 2533 (Barn HI) die das Polyadenylierungssignal enthalten kloniert. Weiters wurde ein synthetische Polylinker für verschiedene Restriktionsenzyme einschließlich Eco RI, und pBR 322 Sequenzen, die das ß- Lactamase Gen und den Origin of Replication enthalten, verwendet. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden in einer Mehrstufenprozedur mit Hilfe verschiedener Vektoren zusammengesetzt. Das entsprechende cDNA-Fragment, das die Cu/Zn-SOD kodiert wurde in die entsprechende Schnittstelle des Polylinkers eingesetzt.

Expression von Cu/Zn-SOD in CHO-Zellen

Das so konstruierte Plasmid wurde linearisiert und mit pSV 2 NeoDNA in CH0-K1 Zellen kotransfektiert. Die Genticin- 418 (G-418) resistenten Klone wurden in Optimem Medium, das mit 5 % fötalem Kälberserum und G-418 versetzt gezüchtet. Der überstand wurde zur Isolierung und Reinigung von Cu/Zn-SOD herangezogen.

ERSATZBLATT Reinigung der SOD

Der Kulturüberstand wurde mit Hilfe von 0,2 μm Filter von Feinteilen befreit und mit festem Ammonsulfat versetzt, daß eine 60 % Endkonzentration erreicht wurde. Der durch Zentrifugation geklärte überstand wurde auf eine mit 60 & Ammonsulfat aquilibrierte Phenylsuperose aufge¬ tragen. Die Elution der SOD erfolgte mit etwas geringerer Ammonsulfatkonzentration. Die gesammelten Fraktionen wurden mit Aktivitätstest ELISA und RPC auf SOD-Gehalt und Reinheit geprüft. Die Reinigungsergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die Chromatogramme der RPC sind in Fig. 5 zusammengefaßt.

Tabelle 4: Reinigungsergebnisse der rh-SOD aus CHO-Zell- kulturüberstand. Die SOD wurde mit Phenyl¬ sepharose aufgetrennt.

rh-SOD Volumen Protein Aktivität ELISA Ausbeute (ml) (mg) (mg) (mg) (%)

Ammonsulfat 50 40 0,15 0,16 100 Überstand

Eluat 4 9 0,12 0,11 80

Phenylsuperose

Eine weitgehende Anreicherung bezogen auf Protein und Volumen konnte durch die HIC erzielt werden.

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Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 6634, 1987

4) R. Hallewell, R. Mills, P. Tekamp-Olson, R. Blacker, S. Rosenberg, F. ötting, F. Masiarz and C. Scandella Amino terminal acetylation of authentic human Cu/Zn Superoxide dismutase produeted in yeast Biotechnology 5, 363, 1987

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Hydrophobic (Interaction) chromatography Biochemie, 60;1; 1978

9) K. Menander-Huber in

Biological and clinical aspeets of Superoxide and Super¬ oxide dismutase ed W. Bannister and J. Bannister p. 408-423, Elsevier/North, 1980

10) U. Fincke, M. Schneider, E. Friderichs, H. Giertzard and L. Flohe

Enhanced Myocardial Salvage by combined treatment with recombinant human Superoxide dismutase in a canine coronary thro bosis model.

Arzneimittelforschung 38, 138, 1988

11) L. M. Olson, G. Klintmal , B. Husberg, J. Nery, C. Whitten, A. Paulsen and R. McClure Superoxide Dismutase improves organ preservation in liver Transplantation Proceedings 20, 961-964, 1988

ERSATZBLATT 12) C. Billiaderis, R. Weselake, A. Pethou and A. Friesens A colorimetric study of human Cu/Zn Superoxide dismutase

Biochem. . 248, 981-984, 1987

13) R. Weselake, S. Chesney, A. Pethou and A. Friesen Purification of human Copper, Zinc Superoxide Dismutase by Copper Chelate Chromatography Anal.Biochem. 155, 193-197, 1986

14) M. Miyota-Asano, K. Ito, H. Ikeda and S. Sekigucki Purification of copper-zinc-superoxide dismutase and catalase from human erythrocytes by copper- chelate affinity chromatography J.Chromat. 370, 501-507, 1986

15) K. Arai, S. Izuka, A. Makita, K. Oikana and N. Tanigucki

Purification of Cu/Zn Superoxide dismutase from human erythrocytes by immuno affinity chromatography. J.Immunol.Meth. 91, 139-143, 1986

E_RSATZBLATT

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Cu/Zn- Superoxiddismutase (Cu/Zn-SOD) , dadurch gekennzeichnet, daß, gegebenenfalls nach entsprechender Vorreinigung, die Cu/Zn-SOD durch Hydrophobic Interaction Chromato¬ graphie (HIC) von Fremdproteinen getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durch HIC von Femdproteinen getrennte

Cu/Zn-SOD mittels Metallchelatchromatographie oder Ionentauscherchromatographie nachgereinigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch oder dadurch gekennzeichnet, daß die Vorreinigung durch Fällung mittels Ammonsulfat oder einem äquivalenten Fällungssalz durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die HIC-Säule mit 40 - 60 %iger Ammonsulfatlosung äquilibriert wird und die Elution mittels eines Stufengradienten mit niedrigerer Ammonsulfat- konzentration durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante SOD aus E. coli als Ausgangsmaterial verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante SOD aus Hefe als Ausgangsmaterial verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß SOD aus Erythro- zytenzellen als Ausgangsmaterial verwendet wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgansmaterial durch transgene Tiere produzierte SOD verwendet wird.

ERSATZBLATT 9. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß native SOD aus Säugetierblut oder Säugetierzellen als Ausgangsmaterial eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante SOD aus Säugetierzellen als Ausgangsmaterial verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante SOD aus Insektenzellen als Ausgangsmaterial verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche l und 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß für die HIC Phenylsepharose fast flow oder Phenylsepharose 4 B verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß für die HIC Phenylsuperose oder Alkylsuperose verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die HIC ein Ligand, ausgewählt aus der Gruppe isopropyl, tertiär butyl, sec butyl, sec pentyl, isopentyl, cyclohexyl, Phenyl, Octyl, gebunden an einen Träger, ausgewählt der der Gruppe quervernetzte Agarose, Cellulose, Sepharose, Silica, Polyacrylamide, verwendet wird.

ERSATZBLATT