DE2337312B2 - Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Dehydrogenasen - Google Patents

Description

25

Dehydrogenasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen enzymatisch-analytischen Prozessen. Insbesondere werden NADP-abhängige Enzyme wie die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH) für die im klinischen Labor sehr bedeutende Bestimmung der Glucose eingesetzt Es besteht danach ein Bedarf nach einfachen Isolierungsmethoden für die genannten Enzyme.

Im wesentlichen werden zwei Methoden zur enzymatischen Bestimmung der Glucose angewandt Für den Routinegebrauch im klinischen Labor hat sich das Verfahren mit Glucose-Oxydase und einer H₂OrViSUaIisierenden Farbreaktion bewährt

Für höchste Genauigkeitsansprüche jedoch verwendet man bevorzugt die Enzyme Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (s. zum Beispiel H. U. Bergmeyer, E Bernt F. Schmidt und H. Stork, in H. U. Bergmeyer Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, 1970, Seite 1163). Die Bestimmung des Blutzuckers nach dieser Methode erfordert jedoch Enzyme hoher Reinheit. So stören insbesondere folgende enzyma tische Verunreinigungen: 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH), Phosphogluco-Mutase (PGiuM), Hexokinase (HK), Phosphoglucose- Isomerase (PGI) und Glutathion-Reduktase (GR). Ihre Anwesenheit würde unkontrollierbar die Glucose-Analysenwerte verfälschen. Enthält die zu analysierende Probe, z. B. menschliche Serum, ATP und Glucose neben G6P, so ist eine genaue Analyse beider Substrate nicht nebeneinander möglich, wenn die G6P-DH mit Hexokinase verunreinigt ist. Vergleichbare Schwierigkeiten ergeben sich bei Anwesenheit der anderen erwähnten Fremdenzyme in der G6P-DH, wie von z. B. PGI, da hier Fructose mitreagieren würde, GR, da das ho Glutathion in der Probe mit erfaßt würde, 6-PGDH, da sie mit dem Reaktionsprodukt der G6P-Bestimmung weiterreagieren und zu hohe Werte vortäuschen würde.

Die Beseitigung der genannten Fremdaktivitäten erfordert einen IsolierungsprozeB, der aufwendig und b*> teuer ist. So werden in den von L Glaser u. D. H. Brown, J. B. C. 216, 67 (1955) publizierten Verfahren zur Reinigung der G6P-DH aus Hefe folgende Schritte angewandt: Autolyse, Protamin-Fällung, Ammonsulfatfraktionierung, Dialyse, Calcium-Phosphat-Gel-Adsorption, Dialyse, Äthanol-Fraktionierung, Aluminiumoxyd-Adsorption, Stärke-Cellit-Adsorption, Ammonsulfat-Abtrennung, Ribonucleinsäure. Jedoch gelang es mit diesen Verfahren nicht, Restspuren von Hexokinase zu beseitigen. Zusätzlich waren die Ausbeuten gering (19%). S. A. Kuby, E A. Noldman (in Meth. in Enzym. Band 9, 1969, Seite 160) publizierten ebenfalls ein äußerst aufwendiges Verfahren (s. auch J. BioL Chem. 36, 1225 (1961)), das über 17 Stufen mit geringer Ausbeute zu einem anscheinend reinen Präparat führt Bei diesem Verfahren wird zuerst ein Hefeextrakt hergestellt es folgt dann eine Ammonsulfat(AS)-Fraktionierung, anschließend eine Silbernitrat-Fällung, eine Extraktion mit Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), eine erneute Ammonsulfat-Fraktionierung. Nach der Dialyse erfolgt eine Äthanol-Fraktionierung, eine Bentonit-A**sorption, eine erneute AS-Fraktionierung und nachfolgende Dialyse, anschließend erfolgt eine Aceton-Fällung, eine erneute Ammonsulfat-Fällung; nach einer Dialyse schließen sich eine DEAE-Cellulose-Adsorption, eine Dialyse und eine zweite DEAE-Cellulose-Adsorption, eine Ammonsulfat-Fällung, eine Sulfat-Fraktionierung und drei Umkristallisationen an. Dieses Verfahren ist nicht nur außerordentlich umständlich und aufwendig, sondern es läßt sich auch nicht in beliebig großen Ansätzen in technischem Maßstab durchführen. Keines der genannten Verfahren war in der Lage, das Bedürfnis nach einem einfachen, reproduzierbaren Anreicherungsverfahren für G6P-DH zu befriedigen. Insbesondere war es auch nicht möglich, die beiden Enzyme G6P-DH und HK aus ein- und demselben Ansatz zu isolieren.

Zur Beseitigung der oben aufgeführten Schwierigkeiten und Nachteile hat man auch bereits versucht Dehydrogenasen nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie zu reinigen. Ein derartiges Verfahren, welches die Wechselwirkung zwischen Coenzym und Enzym ausnutzt indem an einem festen Träger das Coenzym des zu reinigenden Enzyms fixiert wird, wurde für die Dehydrogenasen von C R. Lowe und P. D. G. Dean in FEBS-Letters 14 (1971) Seite 313 beschrieben. Die Anwendung dieses Verfahrens auch für die Reinigung von G6P-DH wird in der DE-OS 22 06 636 vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren wurde jedoch nur eine etwa 20fache Aufreinigung erzieh (vgl. }. D. Hocking und J. I. Harris in Biochem. J. 1972). Dieses Verfahren bringt bereits einen gewissen Fortschritt ein wirklich einfaches Verfahren zur Reinigung der Dehydrogenasen wird dadurch jedoch immer noch nicht geschaffen, da die erzielbare Anreicherung viel zu gering ist um zu hochreinen Enzymen zu gelangen und daher stets die bekannten älteren umständlichen Methoden noch zusätzlich angewandt werden mußten.

Aufgabe der Erfindung ist es, die oben geschilderten Nachteile zu beseitigen und ein äußerst wirksames und einfaches Verfahren zur Reinigung der Dehydrogenasen, insbesondere der G6P-DH zu schaffen, welches es gestattet, zu den für diese Zwecke erforderlichen hohen Reinheitsgraden der Enzyme in wesentlich einfacherer Weise zu gelangen und damit diese Enzyme einer vielfältigeren und verbreiteteren Anwendung zuzuführen.

Erfindungsgemäß besteht ein Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von NADP-abhängigen Dehydrogenasen wie G6P-DH unter Anwendung der Affinitätschromatographie darin, daß als Affinitätsmaterial ein an

einen festen Träger gebundenes Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in 2'- oder 3'-Stellung verwendet wird, welches kein Coenzym der Dehydrogenase darstellt

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in einem einzigen Schritt eine außerordentlich hohe Anreicherung bis zum 700fachen. Da mit dem natürlichen Coenzym, welches als die weitaus günstigste Akzeptorgruppe an einem Träger angesehen werden mußte, nur Anreicherungen bis zum 20fachen gelangen, ist dieses Ergebnis äußerst überraschend, da mit einer Akzeptorgruppe, welche dem natürlichen Coenzym relativ ferne steht, wie sie erfindungsgemäß zur Anwendung kommt, ein wesentlich schlechteres Ergebnis erwartet werden mußte als mit dem natürlichen Coenzym als Akzeptor, welches eine maximale Affinität zu seinem Apoenzym aufweist und eine Ablösung vom Affinitätschromatographiematerial gestattet, bei welcher eine Inaktivierung des Enzyms nicht besorgt werden muß.

Als Trägermaterial wird im Rahmen der Erfindung sowohl ein natärÖches als auch ein synthetisches Material verwendet Bevorzugt werden jedoch hydrophile Trägermaterialien, wie beispielsweise Polyacrylamid, Polymere mit freien Hydroxylgruppen wie Cellulose, Stärke, Dextran, Agarose und deren chemische Abwandlungsprodukte, Polyvinylalkohol sowie insolubilisierte Proteine. Auch Polyamide, Polyester und Polystyrolderivate sind brauchbar, desgleichen anorganische Trägermaterialien, wie z. B. Glas. Das Trägermaterial kann in Form von Perlen oder Granulaten, als Gewebe oder eingebettet in Stützmaterialien vorliegen. Sehr gute Ergebnisse werden mit einem Trägermaterial in Form permeabler Perlen oder Gmulate erzielt, die sowohl in einer Säule als aurh im Batch-Verfahren eingesetzt werden können. Beäondr t bevorzugtes Trägermaterial sind vernetztes Dextran und Agarose.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Akzeptor verwendete Gruppierung besteht aus einem Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in Stellung 2' oder 3'. Diesen Verbindungen kommt beispielsweise nachstehende Formel zu

-CH₂ Base O '

Die Bindung dieses Akzeptormoleküls kann sowohl über die CH₂-Gruppe des Zuckers als auch über die Base erfolgen. Die Bindung kann direkt erfolgen oder unter Zwischenschaltung einer weiteren bindenden Gruppierung. Die Art dieser Bindungen ist für das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens unwichtig, kann jedoch im Einzelfall das Ergebnis des Verfahrens in gewissem Umfang beeinflussen. Um daher in einem speziellen Fall eine optimale Anreicherung eines bestimmten Enzyms zu erzielen, ist es zweckmäßig, verschiedene Bindungsarten auf die beste Anreicherungswirkung auszuprobieren.

Als Base können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb der Akzeptorgruppierung sowohl die natürlichen in Nucleotiden vorkommenden Basen wie Uridin, Guanosin, Adenosin, Thymidin, Cytidin, Xanthin, Methylxanthin u. dgl, als auch deren substituierte Derivate oder Homologe verwendet werden.

Zur Bindung des Akzeptors an den Träger können die bekannten chemischen Verknüpfungsmethoden ange-

wendet werden. Die Art der Fixierung ist nicht Gegenstand der Erfindung. Geeignete bekannte Methoden sind beispielsweise Aktivierung mit BrCN, Kupplung mit p-Aminophenylgruppierung, mit Aminocapronsäure, Aminoäthylamidobernsteinsäure usw.

ίο Andere Beispiele für bekannte Kupplungsmethoden zur Bindung des Akzeptors an den Träger sind die Einführung von Azidgruppen oder Chlortriazinylgruppierungen in den Träger, die anschließend mit dem Akzeptor umgesetzt werden. Bei Aminogruppen- bzw.

is Carboxylgruppen-haltigen Trägermaterialien kann beispieisweise auch eine Kupplung unter Verwendung von Carbodiimiden erfolgen.

Wie oben erwähnt, eignet sich das Verfahren der Erfindung zur Abtrennung und Reinigung der NaDP- abhängigen Dehydrogenasen. Unter NADP-abhängi- gen Dehydrogenasen werden dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch solche Dehydrogenasen verstanden, die nicht alleine von NADP, sondern auch von NAD abhängig sein können. Beispiele für NADP-abhängige Dehydrogenasen, die erfindungsgemäß gereinigt werden können, sind außer G6P-DH, die bevorzugt wird, Glutamatdehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, Glutathion-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 6-Phosphogluconsäure-

jo Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase und Malat-Dehydrogenase.

Die verschiedenen NADP-abhängigen Dehydrogenasen weisen überraschenderweise zu den verschiedenen erfindungsgemäß verwendbaren Akzeptoren unter schiedliche Affinität auf, so daß die Erfindung auch eine Auftrennung der einzelnen NADP-abhängigen Dehydrogenasen untereinander ermöglicht Die Dehydrogenasen, die erfindungsgemäß isoliert und gereinigt werden können, umfassen rohe Enzymextrakte und

•to Enzymgemische, die aus tierischen, piianzlichen oder mikrobiologischen Geweben stammen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so durchgeführt, daß eine Lösung, die die gesuchte Dehydrogenase enthält, beispielsweise als Bestandteil eines Enzym- oder Proteingemisches, durch eine Säule passieren gelassen wird, die mit dem erfindungsgemäßen Chromatographiematerial gefüllt ist Nach dem Waschen der Säule zur Entfernung unerwünschter Begleitstoffe werden dann die adsorbierten Enzyme

:-o durch Elution entfernt, wobei vorzugsweise Pufferlösungen mit steigender Ionenstärke eingesetzt werden, also eine Gradientenelution. Besonders gute Ergebnisse wurden mit anorganischen Phosphatpufferlösungen erhalten, geeignet sind jedoch auch andere Pufferlösun gen, welche keine Denaturierung des gewünschten Enzyms hervorrufen können. Geeignet sind ferner auch Neutralsalzlösungen, beispielsweise Lösungen von Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat Die Elution ist schließlich auch mit dem Coenzym, Substrat oder einem Inhibitor durchführbar. Das Verfahren der Erfindung kann jedoch auch durch Adsorption und Elution in Batch durchgeführt werden.

Wie bereits erwähnt, gestattet das Verfahren der Erfindung eine außerordentlich weitgehende Reinigung und Anreicherung der gewünschten Enzyme in einem einzigen Verfahrensschritt. Das Verfahren der Erfindung ist außerordentlich spezifisch und unkompliziert und rasch durchführbar. Da bis zu viel-100-fache

Reinigungen in einem einzigen Schritt möglich sind, genügt zumeist eine einzige Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um zu einem für praktische Zwecke ausreichend reinen Enzympräparat zu gelangen. Für besondere Zwecke kann jedoch die erfindungsgemäße Behandlung wiederholt werden, zweckmäßig unter Verwendung verschiedener Affinitätschromatographiematerialien, wobei sowohl der Träger als auch die Akzeptorgruppe variiert werden können. Es ist schließlich auch möglich, erfindungsgemäß gereinigte Dehydrogenasen auch nach den bekannten Feinreinigungsmethoden für die derartige Enzyme noch weiter zu reinigen.

Die folgenden Btispiele erläutern die Erfindung weiter. In diesen Beispielen werden die nachstehend aufgeführten Abkürzungen verwendet:

APUP = 5'(p-Amino-phenyl-phosphoryl)-Uridin-

2'(3')-phosphat APGP = 5'(p-Amino-phenyl-phosphoryl)-Guano-

sin-2'(3')-phosph3t APAP = 5'(p-Amino-phenyl-phosphcryl)-Adeno-

sin-2'(3')-phosphat

APG = 5'(p-Amino-phenyl-phosphory!)-Guanosin APA - 5'{p-Amino-phenyI-phosphoryl)-Adenos!n 8-AD-A-5-MP = 8-Amino-äthylainino-adenosin-5'-phosphatB

APG gekuppelt an Agarose-amino-capronsäure

APG gekuppelt an Agaroseamino-äthyl-amido-bernsteinsäure 8-HMD-A-5-MP = 8-Amino-hexyl-amino-adenosin-5'-phosphat B

8-Amino-hexyl-amino-adenosin-2'(3'),5'-phosphat B Glutamat-Dehydrogenase Isocitrat-Dehydrogenase Glutathion-Reduktase GlycerinaIdehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 8-HMD-A-2'3'-P = 8-Amino-hexyI-aminoadenosin-

2'(3')-phosphat Lactat-Dehydrogenase Malat-Dehydrogenase 3-Phosphoglycerat-Kinase Hexokinase Glycerokinase Ammoniumsulfat Creatinkinase

Myokintse ·

Pyruvatkinase

ACS-APG GDA-APG

8-HMD-A-2£-DP

GIDH ICDH GR GAPDH

MDH

Die Schreibweise Base-2'(3')-phosphat bedeutet, daß die Phosphatgruppe in T- oder 3'-Stellung steht, die genaue Stellung jedoch nicht bestimmt wurde. Vermutlich liegen Gemische vor.

B = Akzeptor über Stellung 8 der Base an den Träger gebunden.

Beispiel 1 A. Herstellung des Affinitätsadsorbens:

500 g abgesaugte Agarose (Sepharose 4 Bd. Fa. Pharmacia, Uppsala) werden in 500 ml dest Wasser aufgeschlämmt. Daneben werden 50 g Bromcyan in dest Wasser gelöst. Die Agarose wird dann mit SN NaOH auf pH 11 eingestellt und das gelöste Bromcyan wird zugegeben. Durch Zusatz von 5 N Natronlauge wird der pH bei ca. 11 über 10 min gehalten. Danach wird die aktivierte Agarose abgesaugt und mit 0,5 M eiskalter K2HPO₄-Lösung gründlich gewaschen. Sie wird anschließend mit dem zu fixierenden Akzeptor (5 g in 1000 ml 0,5 M K₂HPO₄) bei pH 9 über Nacht bei 4°C gekuppelt Der fertige Träger wird schließlich mit jeweils ca. 11 0,5 M K₂HPO₄, dest Wasser, 0,1 M Essigsäure, dest Wasser, 1,0 M NaCl und dest Wasser inhibitorfrei gewaschen. Der Gehalt des so dargestellten Affinitätsadsorbens beträgt zwischen ca. 5 und 10 μΜοΙ Akzeptor pro g auf einer Fritte abgesaugten Gels.

B. Adsorption von G -fr-P-Dl [ aus dem Hefe-Autolysat:

Ausgehend von 285 g Trockenhefe wurde der durch AS-Fraktionierung bei einer AS-Konzentration von 1,6—2,6 M erhaltene Niederschlag gelöst und gegen Wasser dialysiert Zu 500 ml Dialysat mit einer spezifischen G6P-DH-Aktivität von 0,6 wurden anschließend 25 g APGP-Agarosc, hergestellt gemäß A. unter Verwendung von APGP als Akzeptor, gegeben. Nach 20minütigem Rühren wurde abgesaugt Der Überstand enthielt noch 8,6% der eingesetzten G-6-P-DH. Nach Waschen des Adsorbens mit 0,4 M Kochsalzlösung wurden anschließend 60% der G-6-P-DH bei einem pH von 7,6 mit 0,5 M Phosphat eluiert Erhalten wurde eine spezifische Aktivität von 96. Das Enzym enthielt noch folgende Fremdaktivitäten:

ADH 0,26%, HK 0,22%, PGIuM 0,02%, PGI 0,12%, GR 0,37%, 6PGDH 1,46%.

Beispiel 2

Chromatographie von G-6-P-DH aus dem Hefe-Autolysat nach einer positiven AS-Fällung:

Ausgehend von 950 g Trockenhefe wurden nach 5 Std. Gärung der wie in Beispiel 1 B. beschrieben erhaltene Niederschlag der Ammonsulfatfällung gelöst und gegen Wasser dialysiert Das Dialysat wurde auf 51 (20 mg Protein/ml) verdünnt und über 150 g APGP-Agarose chronatographiert Nach Waschen mit 0,4 M Kochsalzlösung wurde die G-6-P-DH mit 1 M Anmonsulfatlösung eluiert in einer Ausbeute von ca. 80% mit einer spezifischen Aktivität von 420 und mit folgendem Gehalt an Fremdaktivitiiten: 6PGDH 0,0*%, PGI 0,01%, HK 0,08%, GR 0,01%, PGIuM 0,01%, ADH 0,01%.

Nachstehende Tabelle faßt die Ergebnisse zusammen:

Schritt

Spez. Akt.

Ausbeute an Aktivität in %

Reinigungsfaktor

Autolyse

AS-Fraktionierung Dialyse Chromatographie

0,6 420

100 80

700

Beispie (Vergleichsbeispiel)

Die folgende Tabelle enthalt die Ergebnisse des Verfahrens zur Isolierung der G-6-P-DH nach S. A. Kuby und E A. Noltmann, Kolowick-Kaplan, Methods in Enzymology. Band 9,(1966) 116 f.

Schritt	Spez. Aktivität	Ausbeute an	Reinigungsfaktor
		Aktivität in %
Autolyse	0,16	100
AS-Fraktiotiierung	0,20	90	1.2
Silbernitrat-Fällung,	0.5	70	2,5
Extraktion des Nieder
schlags
AS-Fraktionierung	0.7	65	1,4
Äthanol-Fraktion.	i3	56	!S
Betonit-Adsorp.	22	46	1,7
AS-Fraktionierung	37	42	1.5
Aceton-Fraktion.	71	34	2.1
AS-Fraktionierung	106	27	1,5
Dialyse, DEAE-Cellulose	160	23	1,5
AS-Fraktionierung	200	21	1,2
Verschiedene	410	10
Kristallisationen
Beispiel 4			Beispiel 6

Isolierung der G-6-P-DH aus dem Hefe-Autolysat

durch direkte Chromatographie: r>

500 g Trockenhefe wurden bei 37° C 20 Std. in 1,2 1 0,025 M Na₂HPO₄ bei pH 5 autolysiert. Das Autolysat wird mit 3,01 eiskaltem Wasser verdünnt, nach Zusatz von 4,5% Polyäthylenimin wird das Zentrifugat an 150 g APGP-Agarose Chromatographien. Erhalten wurden ausgehend von einer spezifischen Aktivität von ca. 0,4 U/mg nach Elution mit 1 M Ammonsulfat-Lösung in einer Ausbeute von 83%, 66 mg G-6-P-DH einer spezifischen Aktivität von 174. Anreicherung ca. 435fach.

Beispiel 5

Isolierung der G-6-P-DH aus dem

Frischhefeextrakt:

Die Frischhefe wird mit einer Glaskugel-Mühle aufgeschlossen. Aus 1,5 kg Frischhefe, die in 101 Leitungswasser suspendiert wurden, wird nach Zusatz von 1% Polyäthylenimin und Zentrifugation ein klares Zentrifugat erhalten. 6,51 dieses Zentrifugats wurden an einer 100 g APGP-Agarose enthaltenden Säule Chromatographien. Nach gründlichem Waschen mit 0,4 M Kochsalzlösung wurden 84% der G-5-P-DH mit 1 M Ammonsulfat-Lösung eluiert (50 mg, spez. Aktivität = 264). Das Präparat enthielt keine PGI, keine ADH, GR 0,1 %, HK 0,01 % und 6PGDH 0,02%.

Analoge Ergebnisse wie in den vorhergehenden Beispielen wurden erhalten, wenn mit 0,1 M Citratpuffer pH 6, 1 M Kochsalzlösung, 03 M Magneshnxichtoridlösung, 0,1 M Pyrophosphatpuffer pH 6,5 oder 03 M Phosphatpuffer pH 7,6 eluiert wurde.

Dieses Beispiel zeigt die Adsorption der G6P-DH (spezifische Aktivität ca. 150) an Agarosen, die verschiedene Akzeptoren enthalten. Die Akzeptoren wurden alle nach der Bromcyan-Aktivierung gebunden. Die Beladung (Menge Akzeptor pro g Träger) betrug ca. 5—10 μΜοΙ/g. Es wurden jeweils 5 ml Enzymlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml eingesetzt. Zu dieser Enzymlösung wurden 500 mg akzeptorhaltige Agarose gegeben. Die nachstehende Tabelle zeigt die verwendeten Akzeptoren und die mit diesen erhaltenen Ergebnisse.

Akzeptor	% gebunden
ErfindungsgemäB
APUF	75
APGP	95
APAP	95
8-HMD-A-5-MP	62
8-HMD-A-23-DP	97
Vergleich
APG	8
APA	0
8-AD-A-5-MP	15
ACS-APG	20
GDA-APG	20

Die nicht erfindungsgemäßen Akzeptoren, die also keine Phosphatgruppe in Stellung 2' oder 3' enthalten, wie APG und APA sowie solche, bei denen die Phosphatgruppe in Stellung 5' steht, wie 8-AD-A-5-MP, ACS-APG und GDA-APG sind, wie die obigen Ergebnisse zeigen, zur Reinigung der Dehydrogenasen ungeeignet

Beispiel 7

Chromatographie von G6P-DH aus Hefedialysat an APUP-Agarose

3,21 Hefedialysat, erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden auf 81 verdünnt (20 mg Protein/ml, 1.1 · 10' U). Diese Lösung wurde an 0,5 kg APUP-Agarose Chromatographien (Säulendimension 5 χ 32 cm). Eluiert wurde mit 0,25 M Phosphat, pH = 7,6. Ausbeute ι ο 200 mg zu 320 U/mg (entspricht 58%).

Beispiel 8

Chromatographie von G6P-DH
aus Trockenhefe an A PU P-Agarose

460 g Trockenhefe wurden in 1,21 0,2 M Natrium-Phosphat-Puffer 6 Std. bei 37°C und pH 6,5 autolysiert. Anschließend wurde mit Eiswasser 1 :4 verdünnt und durch Zusatz von 1% Polyäthylenimin wurden die >i> Zellrückstände gefällt. Das Zentrifugat enthielt 3,1 10* U (spezifische Aktivität 0,55). Nach der Verdünnung auf 21 I wurde die Enzymlösung an 200 g APUP-Agarose Chromatographien. Die G6P-DH wurde nach Waschen mit 0,15 M Kochsalzlösung mit 0,25 M r> Phosphat, pH = 7,6 eluiert. Erhalten wurden 76% (223 mg, spezifische Aktivität = 105, 0,02% HK, 0,04% GR, 0,4%6-PG-DH).

Gesamtausbeute 42 mg der spezifischen Aktivität von 380, «ι

Anreicherung ca. 700fach.

Beispiel 9

Chromatographie von G6P-DH
aus Frischhefe an APUP-Agarose

1,5 kg Frischhefe wurden in 101 Wasser aufgeschlämmt und in einer Glasperlen-Mühle aufgeschlossen. Nach Zugabe von 1% Polyäthylenimin und Abzentrifugation des Niederschlags wurde das Filtrat, das in 851 15· 10⁴U = 100% enthielt, an einer 200 g-Agarose-Säule Chromatographien. Das Eluat (025 M PO«, pH = 7,6) enthielt 91% (265 mg, spezifische Aktivität - 63). Der Gehalt an Fremdaktivitäten betrug 6-PG-DH 0,33%, HK 0,02%, GR 0,03%.

Beispiel 10

Verschiedene NADP-abhängige Dehydrogenasen wurden an APGP-Agarose adsorbiert. Dabei wurden jeweils 500 mg der akzeptorhaltigen Agarose zu 5 ml Enzymlösung mit einem Gehalt von 1 mg/ml gegeben. Nachstehende Tabelle zeigt die verwendeten Enzyme, die prozentuale Adsorption derselben an das Chromatographiematerial unter vergleichbaren Bedingungen sowie die prozentuale Elution beim Waschen mit 0,05 M Kochsalz.

Enzyme	% Adsorption	Elution beim Wa
	unter vergleich	schen mit 0,05 M
	baren Bedingungen	Kochsalz
G 6 P-DH	95	0
6 PG-DH	87	0
GIDH	87	0
ICDH	100	0
GR	95	5
GAPDH	99	14
MDH	99	5

Beispiel 11

Abtrennung von 6PG-DH als Fremdaktivität aus
Λ-Glucosidase an HMD-A-2'(3')-Phosphat-Agarose

30 mg einer Λ-Glucosidase der spezifischen Aktivität 40 U/mg mit einem Gehalt von 0,52% 6PG-DH als Verunreinigung wurden in 6 ml 0,1 M Citratpuffer pH 6,5 gelöst und diese Lösung auf einer 1 χ 8 cm-Säule, enthaltend 6 g HMD-A-2'(3')-Phosphat-Agarose, Chromatographien. Die Λ-Glucosidase wird hierbei nicht gebunden und findet sich beim Waschen der Säule mit zwei Säulenvolumina des Citratpuffers in einer Ausbrüte von 93,7% wieder. Der Gehalt an 6PG-DH beträgt 0,0017%.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von NADP-abhängigen Dehydrogenasen, wie G6P-DH, unter Anwendung der Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß als Affinitätschromatographiematerial ein an einen festen Träger gebundenes Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in 2'- oder 3'-Steilung verwendet wird, welches kein Coenzym der Dehydrogenase darstellt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleotid Uridin-, Guanosin- oder Adenosin-2'(3')-phosphat verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein hydrophiles Trägermaterial verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial vernetztes Dextran oder Agarose verwendet werden.