DE60315790T2

DE60315790T2 - Immobilisierte Biokatalysatoren für die Herstellung von natürlichen Nukleosiden und modifizierten Analogen durch enzymatische Transglykosylierungsreaktionen

Info

Publication number: DE60315790T2
Application number: DE60315790T
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Tonon; Emanuele Capra; Gaetano Orsini; Gabriele Zuffi
Original assignee: Adorkem Technology SpA
Current assignee: Adorkem Technology SpA
Priority date: 2003-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2023-01-17
Also published as: EP1439220B1; PT1439220E; US20040142438A1; DE60315790D1; EP1439220A1; ES2292927T3; CY1107015T1; SI1439220T1; ATE371021T1; DK1439220T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von neuartigen Biokatalysatoren, die in industriellen Verfahren zur Herstellung von natürlichen Nucleosiden und/oder modifizierten Analogen befähigt sind, die auf dem Gebiet der Pharmazie als Zwischenprodukte oder Endprodukte, auf dem Gebiet der Antitumor- und Antivirus-Arzneistoffe sowie bei der Herstellung von Zwischenprodukten für die Synthese von Oligonucleotiden von therapeutischem Interesse verwendet werden können.
Natürliche Nucleoside, Nucleosidanaloge und deren Derivate, die auf verschiedenartige Weise entweder in Bezug auf die Ribofuranosylgruppe oder in Bezug auf die an den Zucker gebundene heterocyclische Base modifiziert sind, können durch herkömmliche chemische Syntheseverfahren hergestellt werden, die insbesondere bei Purinderivaten Probleme in Bezug auf unbefriedigende Ausbeuten und/oder eine unvollständige Stereoselektivität der korrekten anomeren Position und/oder in Bezug auf die Notwendigkeit zur Anwendung von Reaktionen zum Schützen von labilen chemischen Gruppen durch Schutzgruppen oder zur Entfernung dieser Schutzgruppen und/oder in Bezug auf die Anwendung von komplizierten Reinigungsverfahren mit sich bringen.
Alternative Wege zur Herstellung von Nucleosiden und Analogen, die auf der Verwendung von Enzymen beruhen und die möglicherweise zur Überwindung der Herstellungsprobleme durch chemische Synthese geeignet sind, sind aus der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur bekannt.
Auf diesem Gebiet ist eine Klasse von Enzymen, die als Nucleosidphorphorylasen bekannt sind, von besonderem Interesse. Sie katalysieren sowohl Phosphorolyse-Reaktionen (Ablösen des Zuckers von einem Nucleosid unter Bildung des entsprechenden Zucker-1-phosphats) als auch die umgekehrten Reaktionen (Kondensation des Zucker-1-phosphats mit einer Purin- oder Pyrimidinbase oder mit einem nitrierten, heterocyclischen Akzeptor) unter Bildung eines neuen Nucleosids. Die Kombination der beiden Reaktionen, die durch zwei Phosphorylasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten katalysiert werden, ermöglicht die Durchführung einer sogenannten Transglycosylierungsreaktion: in Gegenwart von Phosphationen besteht diese Reaktion in der Übertragung der Ribofuranosyl- oder modifizierten Ribofuranosylgruppe von einem geeigneten Nucleosid, das die Funktion eines Zuckerdonators ausübt, auf eine geeignete heterocyclische Base, die sich als Zuckerakzeptor verhält, was zur Bildung eines neuen Nucleosids führt, und zwar entsprechend einem Reaktionsgleichgewicht, das von den chemischen/physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Substrate, von deren relativen Konzentrationen und von den angewandten Arbeitsbedingungen, z. B. dem pH-Wert und der Temperatur, abhängt (J. L. Otto, C. H. Werkman, Coupled nucleoside phosphorylase reactions in Escherichia coli, Arch. Biochem. Biophys., Bd. 69 (1957), S. 264-276; J. Doskocil, A. Holy, Specificity of purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli, Collect. Czech. Chem. Commun., Bd. 42 (1977), S. 370-382; T. Utagawa et al., Mechanism of purine arabinoside synthesis by bacterial transarabinosylation reactions, Bd. 49 (8) (1985), S. 2425-2430).
Insbesondere die Enzyme Uridin-phosphorylase oder UdP (E. C. 2.4.2.3) und Purinnucleosid-phosphorylase oder PNP (E. C. 2.4.2.1.) werden in Kombination zur Herstellung von natürlichen oder modifizierten Nucleosiden bei Transglycosylierungsreaktionen verwendet, die sich verschiedener Pyrimidinnucleoside, z. B. Uridin, 2'-Desoxyuridin, 2',3'-Didesoxyuridin oder Arabinofuranosyluracil, als Zuckerdonatoren, und einer Vielzahl von sowohl natürlichen als auch modifizierten Purinbasen und nitrierter heterocyclischer Verbindungen, die als Zuckerakzeptoren wirken, bedienen (D. W. Hutchinson, New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides, Trends Biotechnol., Bd. 8 (1990), S. 348-353; J. R. Hanrahan, D. W. Hutchinson, The enzymatic synthesis of antiviral agents, J. Biotechnol., Bd. 23 (1992), S. 193-210).
Die Isolierung und die Untersuchung von UdP und PNP verschiedener Spezies hat gezeigt, dass von prokaryontischen Mikroorganismen abgeleitete Enzyme eine breitere Substratspezifität und eine höhere thermische Stabilität aufweisen, verglichen beispielsweise mit den entsprechenden Enzymen, die aus Säugetieren isoliert worden sind, so dass sie als Katalysatoren für die industrielle Anwendung bevorzugt werden (C. Mao et al., The crystal structure of E. coli purine nucleoside phosphorylase. A comparison with the human enzyme reveals a conserved topology, Structure, Bd. 5 (1997), S. 1373-1383; A. Browska et al., Properties of purine nucleoside phosphorylase of mammalian and bacterial origin, Z. Naturforsch., Bd. 45c (1989), S. 59-70).
UdP und PNP, die aus prokaryontischen Mikroorganismen in Form von löslichen Enzymen isoliert worden sind, werden als Katalysatoren bei Transglycosylierungsreaktionen in homogener Phase verwendet. Dieser Weg erweist sich jedoch als nicht sehr wirkungsvoll und ist im allgemeinen auf den Laboratoriumsmaßstab begrenzt, da er die Verwendung von gereinigten Enzymen erfordert, die für anschließende Reaktionszyklen nicht erneut verwendet werden können, kein Arbeiten bei Temperaturen über 37-40°C zulässt und besonders lange Reaktionszeiten benötigt (T. A. Krenitsky et al., Enzymatic synthesis of purine arabinonucleosides, EP-0002192 (1979); T. A. Krenitsky et al., Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase, Biochemistry, Bd. 20 (1981), S. 3615-3621; T. A. Krenitski et al., An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides, Carbohydrate Res., Bd. 97 (1981), S. 139-146; T. A. Krenitsky et al., Imidazo[4,5-c]pyridines (3-deaza purines) and their nucleosides as immunosuppressive and anti-inflammatory agents, J. Med. Chem., Bd. 29 (1986), S. 138-143).
Die Entdeckung, dass die Enzyme UdP und PNP gleichzeitig im Zytoplasma zahlreicher Wildtypstämme von Mikroorganismen, die zu verschiedenen Gattungen gehören, in Verhältnissen vorhanden sind, die mit der Funktion der Katalyse von Transglycosylierungsreaktionen verträglich sind, hat ihre direkte Anwendung, d. h. in Form von Vollzellpräparaten, als Biokatalysatoren bei der Herstellung von Nucleosiden und von modifizierten Analogen nahegelegt. Die Vorteile dieses Wegs bestehen in der Möglichkeit, die Extraktion und Reinigung von UdP und PNP zu vermeiden, sowie in der Stabilität der zytoplasmatischen enzymatischen Aktivität, die die Durchführung von Transglycosylierungsreaktionen bei Temperaturen bis zu etwa 60°C ermöglicht, wodurch die Solubilisierung der Substrate begünstigt und die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird.
In zahlreichen Arbeiten wurde bereits die Anwendbarkeit von Transglycosylierungsreaktionen dokumentiert, die durch vollständige Zellen von Mikroorganismen verschiedener Spezies, z. B. Enterobacter aerogenes, Erwinia herbicola, Brevibacterium acetylicum, Escherichia coli, sowohl im Laboratoriumsmaßstab als auch im Produktionsmaßstab katalysiert wurden (Utagawa et al., Properties of nucleoside phosphorylase from Enterobacter aerogenes, Agric. Biol. Chem., Bd. 49 (1985), S. 3239-3246; T. Utagawa, Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics, J. Molec. Catalysis B: Enzymatic, Bd. 6 (3-4) (1999), S. 215-222; G. Cotticelli et al., Production of nucleosides by large-scale bioconversion, Nucleosides Nucleotides, Bd. 18 (4-5) (1999), S. 1135-1136; K. Yokozeki, T. Tsuji, A novel enzymatic method for the production of purine-2'-deoxynucleosides, J. Molec. Catalysis B: Enzymatic, Bd. 10 (2000), S. 207-213).
Die Verwendung von vollständigen bakteriellen Zellen, die die Durchführung der Reaktionen in heterogener Phase ermöglicht, erlaubt möglicherweise auch die Gewinnung der Zellen zur Wiederverwendung bei späteren Reaktionen, obgleich die Möglichkeit einer Kontaminierung aufgrund einer mehr oder weniger starken Zelllysis und die Tatsache, dass die Gewinnung von Zellen das Herstellungsverfahren erschwert, indem weitere Filtrations- und/oder Ultrafiltrations- oder Zentrifugationsschritte benötigt werden, in Betracht zu ziehen sind. Ferner wurden Möglichkeiten beschrieben, bei denen die Wiedergewinnung der als Biokatalysatoren verwendeten Zellen unter Verwendung von Zellen, die vorher mit Glutaraldehyd aggregiert worden waren, durchgeführt wurde (A. I. Zinchenko et al., Synthesis of 9-(β-D-arabinofuranosyl) guanine using whole cells of Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 32 (1990), S. 658-661; V. N. Barai et al., A universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation, Helv. Chim. Acta, Bd. 85 (2002), S. 1901-1907), sowie durch Einkapselung der Zellen in hydrophilen Matrices (I. Votruba et al., Synthesis of 2-deoxy-β-D-ribonucleosides and 2-3-dideoxy-β-D-pentofuranosides an immobilized bacterial cells, Collect. Czech. Chem. Commun., Bd. 59 (1994), S. 2302-2330) oder durch Einverleibung der Zellen in hydrophobe Polymerharze (K. Yokozeki et al., Production of adenine arabinoside by gelentrapped cells of Enterobacter aerogenes in water-organic cosolvent system, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 14 (1982), S. 225-231).
Schließlich hat die Konstruktion von genetisch modifizierten Bakterienstämmen, die hohe Konzentrationen der rekombinanten Formen der Enzyme UdP und PNP sowohl getrennt in verschiedenen Zellen als auch gleichzeitig in der gleichen Zelle exprimieren können (G. Bestetti et al., Recombinant bacterial strains for the production of natural nucleosides and modified analogues thereof, WO-00/39307 (1999)), es ermöglicht, Mikroorganismen zu erhalten, die in vorteilhafter Weise sowohl zur Herstellung von UdP und PNP (R. S. Esipov et al., Querexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/B121 (DE3) system yields active recombinant enzymes, Protein Express. Purif., Bd. 24 (2002), S. 56-60) als auch zum Einsatz der vollständigen Zellen als Biokatalysatoren bei der Herstellung von natürlichen Nucleosiden und Analogen durch Transglycosylierungsreaktionen (E. Spoldi et al., Recombinant bacterial cells as efficient biocatalysts for the production of nucleosides, Nucleosides Nucleotides, Bd. 20 (4-7) (2001), S. 977-979) verwendet werden können.
Es wird jedoch allgemein anerkannt, dass an einem festen Substrat immobilisierte Enzyme die physikalische Form darstellen, die besonders vorteilhaft zur Herstellung eines industriellen Biokatalysators ist, da diese Enzyme folgende Vorteile aufweisen: sie ermöglichen die Umsetzung der Reaktionen in heterogener Phase, sie verringern oder beseitigen das Problem einer Verunreinigung durch biologisches Material, sie können in einer physikalischen Form hergestellt werden, die leicht aus dem Reaktionsgemisch für eine mögliche Wiederverwendung abtrennbar ist, sie erleichtern den Vorgang der Reinigung des Reaktionsgemisches und sie vereinfachen das Herstellungsverfahren, da sie mit beliebigen Reaktorkonfigurationen zur Durchführung sowohl von diskontinuierlichen als auch von kontinuierlichen Reaktionen verträglich sind. Da die enzymatisch aktiven Formen von UdP und PNP aus homo-hexameren Komplexen bestehen, ist ihre Immobilisierung an einem festen Substrat mit einer Reihe von Problemen verbunden, da der Immobilisierungsvorgang mit der Aufrechterhaltung der aktiven oligomeren Konfiguration verträglich sein muss (M. J. Pugmire, S. E. Ealick, Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylase, Biochem. J., Bd. 361 (2002), S. 1-25). Es wird berichtet, dass Verfahren zur Immobilisierung durch nicht-kovalente Adsorption im Vergleich zu Verfahren zur Immobilisierung durch Bildung von kovalenten Bindungen die strukturellen Eigenschaften der Enzyme wesentlich weniger stören und infolgedessen die Aufrechterhaltung des immobilisierten Enzyms in einer Konfiguration ermöglichen, die mit der aktiven natürlichen Konfiguration, die in Lösung vorliegt, vergleichbar ist (J. E. Bailey, D. F. Ollis (Hrsg.), Biochemical engineering fundamentals, 2. Auflg., McGraw-Rill, New York (1986), S. 157).
Gemäß diesen Angaben beruht die einzige Form der Koimmobilisierung von UdP- und PNP-Enzymen prokaryontischen Ursprungs, die bisher bekannt ist, auf einer Adsorption durch nicht-kovalente Wechselwirkungen von gereinigten Präparaten der Enzyme mit einem schwach basischen DEAE-Celluloseharz. Jedoch ist dieser Weg im Hinblick auf die industrielle Anwendung mit Einschränkungen verbunden, da die Herstellung des Katalysators die getrennte Reinigung der beiden Enzyme vor dem Adsorptionsvorgang am Harz erfordert, um die Anwesenheit von anderen, fremden Enzymen auszuschließen, die gleichzeitig adsorbiert werden und die anschließende Transglycosylierungsreaktion stören, Außerdem ist die Wiederverwendung des immobilisierten Enzyms auf nur einige Reaktionszyklen beschränkt (D. R. Averett et al., 6-Methoxypurine arabinoside as a selective and potent inhibitor of varicella-zoster virus, Antimicrob. Agents Chemother., Bd. 35 (5) (1991), S. 851-857; M. Mahmoudian, Biocatalytic production of chiral pharmaceutical intermediates, Biocatalysis Biotransform., Bd. 18 (2000), S. 105-118).
Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt (und stellt den hauptsächlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar), dass die Koimmobilisierung der beiden Enzyme UdP und PNP durch Bildung von kovalenten Bindungen mit einer festen Matrix, die mit Epoxygruppen funktionalisiert ist, die Herstellung von Biokatalysatoren ermöglicht, die eine hohe spezifische Aktivität, eine hervorragende Wärmestabilität und eine hervorragende Verträglichkeit mit hohen Lösungsmittelkonzentrationen aufweisen. Da diese neuartigen immobilisierten Katalysatoren sich leicht aus dem Reaktionsgemisch abtrennen lassen und für zahlreiche anschließende Reaktionszyklen wiederverwendbar sind, eignen sie sich in besonderer Weise für die industrielle Anwendung und lösen die Probleme, die bisher mit der industriellen Herstellung von Nucleosiden durch Transglycosylierungsreaktionen verbunden waren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Möglichkeit, dass beim Koimmobilisierungsvorgang nicht nur die isolierten Enzyme, sondern auch die rohen löslichen Fraktionen der aus Zellkulturen erzeugten Enzyme UdP und PNP verwendet werden können (dabei ist unter dieser Ausdrucksweise die Fraktion zu verstehen, die nach Zelllysis und Zentrifugation als überstehende Flüssigkeit gewonnen wird; die aus dem Lysispuffer mit einem Gehalt an den Zellkomponenten, einschließlich der Enzyme, die im Puffer löslich sind, besteht; die aus dem unlöslichen Pellet, das aus Zellwandrückständen und nicht-lysierten oder nur teilweise lysierten Zellen gebildet ist, abgetrennt wird). Tatsächlich wurde überraschenderweise festgestellt, dass sämtliche verunreinigenden enzymatischen Aktivitäten vor dem Koimmobilisierungsvorgang vollständig inaktiviert werden können, indem man die Zellen der die Enzyme erzeugenden Mikroorganismen einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 50-65°C und vorzugsweise bei einer Temperatur von 60°C für eine Zeitspanne von 10 bis 120 Minuten und vorzugsweise für eine Zeitspanne von 30 Minuten unterwirft, ohne dass diese Wärmebehandlung die enzymatische Aktivität von UdP und PNP beeinträchtigt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die besten Ergebnisse für die Koimmobilisierung von UdP und PNP durch Bildung von kovalenten Bindungen mit einer festen Matrix mit Oxyrangruppen (Epoxygruppen) mittels einer Reaktion erreicht, an der vorwiegend die lateralen Aminogruppen der Lysinreste, die an den Polypeptidketten der Enzyme vorhanden sind, beteiligt sind, und zwar gemäß einem Verfahren, das keine drastischen Reaktionsbedingungen, wie eine Einwirkung von hohen Temperaturen oder breiten pH-Bereichen oder die Verwendung von hohen Konzentrationen an chaotropen Mitteln, erfordert. Ferner wurde festgestellt, dass es vorteilhaft ist, als Immobilisierungssubstrate handelsübliche Epoxyharze zu verwenden, bei denen einige technische Eigenschaften, die für die industrielle Anwendung wichtig sind, z. B. die Teilchengröße, ihre hohe Dichte und Porosität, ihre Beständigkeit gegen Kompression, ihre Beständigkeit gegen Angriffe durch Mikroorganismen und dergl., bekannt und garantiert sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Enzyme UdP und PNP durch Bildung von kovalenten Bindungen an festen Substraten, z. B. Agarosegel, Kieselgel, Polymere auf der Basis von Methacrylamid-Bisacrylamid oder Polymethacrylat-Polymere, die mit Epoxygruppen funktionalisiert sind, koimmobilisiert. Unter den verschiedenen festen Substraten, die im Handel erhältlich sind und die für die Koimmobilisierung von UdP und PNP erfindungsgemäß verwendet werden können, lassen sich unter anderem die folgenden Materialien erwähnen: Epoxy-aktivierte Sepharose^®; Fractogel^® TSK AF-Epoxy; Eupergit^® C und Eupergit^® C250L; Sepabeads^® EC-EP/M und Sepabeads^® EC-EP. Obgleich alle vorerwähnten Materialien als Substrate für die Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP durch Bildung von kovalenten Bindungen verwendet werden können, hat es sich herausgestellt, dass die festen Substrate, die aus Methacrylpolymeren, die mit Oxyrangruppen (Epoxygruppen) funktionalisiert sind, gebildet sind und in einer Konzentration von nicht unter 50 μmol/g feuchtes Harz und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 100 μmol/g feuchtes Harz vorliegen, sich in besonderer Weise zur Herstellung eines Katalysators eignen, der gewerblich für die Herstellung von Nucleosiden einsetzbar ist. Das Harz Sepabeads EC-EP/M oder gleichwertige Harze, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine variable Teilchengröße von etwa 200 bis 600 μm und eine Konzentration von aktiven Epoxygruppen, die 100 μmol/g feuchtes Harz oder mehr entspricht, aufweisen, werden vorzugsweise für die Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP gemäß den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen operativen Verfahren verwendet.
Diese Harze sind im Handel in voraktivierter Form erhältlich, d. h. sie tragen die Epoxygruppen in einem Zustand von hoher Reaktivität, die zur raschen Bildung von kovalenten Bindungen durch bevorzugte Umsetzung mit ε-Aminogruppen der in den Polypeptidketten der zu immobilisierenden Enzyme vorhandenen Lysinreste gemäß dem folgenden Reaktionsschema befähigt sind:
Die Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP an Sepabeads-Epoxyharzen oder gleichwertigen Harzen wurde untersucht, indem das rohe enzymatische Gemisch mit dem Immobilisierungssubstrat in Gegenwart eines Puffers mit einem pH-Wert von etwa 7-7,5 für eine Zeitspanne von bis zu 72 Stunden gerührt wurde.
Die endgültigen Bedingungen für die Zelllysis und Koimmobilisierung wurden durch Untersuchung der folgenden operativen Parameter ermittelt (die optimalen Bedingungen, die für jeden der untersuchten Parameter ausgewählt wurden, sind in Klammern angegeben):

a) Lysis der Zellbiomasse und Immobilisierung in 0,5 M, 1 M und 1,5 M Phosphatpuffer (gewählte Bedingung: 1 M Phosphatpuffer);
b) Immobilisierungstemperatur etwa 20°C (Umgebungstemperatur) und 50°C (gewählte Bedingung: Umgebungstemperatur);
c) Kontaktzeit zwischen dem Gemisch aus den rohen Zelllysaten und dem Harz von 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden (gewählte Bedingung: 48 Stunden);
d) Verhältnis zwischen enzymatischer UdP-Aktivität und enzymatischer PNP-Aktivität im Gemisch der rohen Zelllysate: UdP/PNP = 0,5; UdP/PNP = 1; UdP/PNP = 2; UdP/PNP = 3 (gewählte Bedingung: enzymatisches Aktivitätsverhältnis UdP/PNP = 1);
e) Verhältnis zwischen katalytischer Transglycosylierungsaktivität (angegeben in Einheiten·ml^–1 gemäß Definition in Beispiel 3c) des Gemisches der rohen Zelllysate und der Menge des Harzes: 90 Einheiten pro 2 g feuchtes Harz; 90 Einheiten pro 3 g feuchtes Harz; 90 Einheiten pro 4 g feuchtes Harz (gewählte Bedingung: etwa 90 Einheiten/3 g feuchtes Harz, entsprechend etwa 30 Einheiten/g feuchtes Harz);
f) Konzentration der katalytischen Transglycosylierungsaktivität (angegeben in Einheiten·ml^–1 gemäß der Definition in Beispiel 3c) im Gemisch der rohen Zelllysate von 2 Einheiten·ml^–1, 6 Einheiten·ml^–1 und 10 Einheiten·ml^–1 (gewählte Bedingung: etwa 6 Einheiten·ml^–1); und
g) Postimmobilisierungsbehandlung des immobilisierten Katalysators; keine weitere Behandlung, Konditionierung in Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5, Konditionierung in Phosphat-Glycin-Puffer (gewählte Bedingung: keine weitere Behandlung).

Auf der Grundlage der bei diesen Tests erhaltenen Ergebnisse umfasst die Herstellung des immobilisierten Katalysators gemäß einer der bevorzugten Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung die folgenden operativen Schritte:

a) Die Enzyme UdP und PNP werden durch getrennte Fermentation von rekombinanten Stämmen von Escherichia coli erzeugt, die mit dem Gen udp von E. coli, das für das Enzym UdP kodiert und mit dem Gen deoD von E. coli, das für das Enzym PNP kodiert, transformiert worden sind. Rekombinante Stämme, die für die Herstellung der Enzyme UdP und PNP verwendbar sind, sind beispielsweise dem Stamm DH5a/pGM708 (im vorliegenden Patent als NP23/3 bezeichnet) bzw. dem Stamm DH5a/pGM707 (im vorliegenden Patent als NP24/3 bezeichnet) ähnlich, die in WO-00/39307 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben sind. Die Eigenschaften dieser Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Gemäß den Anweisungen, die kürzlich von internationalen Behörden ergangen sind und um etwaige Gefahren einer Kontaminierung durch Erreger von boviner, spongiformer Enzephalopathie auszuschließen, wurden die rekombinanten Stämme NP23/3 und NP24/3 ohne Verwendung von Materialien, die tierischen Ursprungs waren, rekloniert. Die Herstellung und Konservierung der Zellbanken und die Fermentierung der rekombinanten Stämme wurden in ähnlicher Weise ohne Verwendung von Materialien tierischen Ursprungs durchgeführt (EMEA: Richtlinien für die Minimierung der Gefahr der Übertragung von Erregern von tierischer spongiformer Enzephalopathie über humanmedizinische und veterinärmedizinische Produkte (2001)).

Stamm	Kloniertes Protein	Selektionsmarker
NP23/3	Uridin-phosphorylase (UdP)	Tetracyclin
NP24/3	Purinnucleosid-phosphorylase (PNP)	Tetracyclin

b) Nach 30-minütiger Wärmebehandlung bei 60°C zur Inaktivierung der verunreinigenden enzymatischen Aktivitäten werden die bei den beiden Fermentationen erhaltenen Biomassen einer mechanischen Lysis (alternativ einer Lysis durch Ultraschallbehandlung und einer chemischen und/oder enzymatischen Lysis) unterworfen und zur Trennung der rohen löslichen Fraktionen zentrifugiert. Das Gemisch der beiden löslichen Fraktionen wird anschließend direkt ohne weitere Reinigungsschritte für die Immobilisierung verwendet.
c) Die rohen Zelllysate, die UdP und PNP enthalten, werden so vermischt, dass sich variable enzymatische UdP:PNP-Aktivitätsverhältnisse von 1:0,5 bis 1:3 (und vorzugsweise ein Verhältnis von etwa 1:1) ergeben, wonach sie in Kontakt mit dem Immobilisierungssubstrat gebracht werden.
d) Das Immobilisierungssubstrat besteht aus einem Acrylharz, das mit Epoxygruppen funktionalisiert ist. Vorzugsweise handelt es sich um das Harz Sepabeads EC-EP/M. Das Substrat wird in einem Anteil von etwa 2-3 kg feuchtes Harz zur Immobilisierung von 10 Liter des Gemisches von rohen Zelllysaten mit einer katalytischen Transglycosylierungsaktivität von etwa 6 Einheiten·ml^–1 verwendet.

Als eine Alternative zum vorerwähnten Verfahren können die rohen Zelllysate, die die Enzyme UdP und PNP enthalten, getrennt immobilisiert werden, indem man ein ähnliches Verfahren, wie es für die Koimmobilisierung der beiden Enzyme beschrieben wurde, anwendet, wonach vermischt wird und das Produkt als Katalysator für die Transglycosylierungsreaktionen verwendet wird.
Die Verwendung von rekombinanten Stämmen für die Herstellung der Enzyme UdP und PNP ermöglicht die Gewinnung von großen Mengen an Zellbiomasse und die Extraktion der Zelllysate mit einem hohen Enzymtiter, wie sich aus den nachstehenden Tabellen 2 und 3 ergibt. Tabelle 2 Herstellung von UdP durch Fermentierung des rekombinanten Stammes in NP23/3

Fermentierung Zellbiomasse*, g/Liter UdP-Aktivität**, Einheiten/Liter

1 162 476300

2 160 376300

3 185 511400

4 160 480000

* Die Zellbiomasse ist als Feuchtgewicht angegeben.
** Die enzymatische Aktivität wird am Zelllysat gemessen und bezieht sich auf die Phosphorolyse der Uridin-Reaktion.

Fermentierung	Zellbiomasse*, g/Liter	UdP-Aktivität**, Einheiten/Liter
1	185	111000
2	166	87150
3	165	111400
4	168	100800

* Die Zellbiomasse ist als Feuchtgewicht angegeben.
** Die enzymatische Aktivität wird am Zelllysat gemessen und bezieht sich auf die Phosphorolyse der Inosin-Reaktion.

Beim Koimmobilisierungsverfahren können die rohen Zelllysate, die UdP und PNP enthalten, in verschiedenen Verhältnissen vermischt werden, so dass man einen Katalysator erhält, der für jede Transglycosylierungsreaktion von Interesse optimiert ist. Beispielsweise wurde festgestellt, dass durch Beginn mit Lysatgemischen mit variablen enzymatischen UdP:PNP-Aktivitätsverhältnissen von 2:1 bis 1:2 immobilisierte Katalysatoren erhalten werden, die für die Anwendung bei den meisten Glycosylierungsreaktionen optimal sind, bei denen Ribofuranosyluracil, 2'-Desoxyribofuranosyluracil, 2',3'-Desoxyribofuranosyluracil und Arabinofuranosyluracil als Zuckerdonatoren verwendet werden.
Bei den beschriebenen operativen Bedingungen wird ein Katalysator mit den in Tabelle 4 angegebenen analytischen Eigenschaften erhalten, wobei die Ausbeute des Koimmobilisierungsvorgangs, berechnet als katalytische Transglycosylierungsaktivität, etwa 50-70 % beträgt. Tabelle 4 Analytische Eigenschaften des Katalysators, der durch Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP durch Bildung von kovalenten Bindungen am Harz mit funktionellen Epoxygruppen erhalten worden ist

Parameter Eigenschaften*

Erscheinungsbild Weiß-braune Granalien

Teilchengröße 200-600 μm

Wasser 40-60 %

pH-Wert 6-8

Enzymatische Aktivität** 10-20 Einheiten/g

* Bezogen auf das filtrierte feuchte Harz
** Katalytische Transglycosylierungsaktivität bestimmt gemäß Beispiel 3c.

Das immobilisierte Enzympräparat wird bei 4°C als feuchtes Harz in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, 20 % Isopropanol, pH-Wert 7, 500 ppm Ethyl-p-hydroxybenzoat aufbewahrt. Bei einer Stabilitätsstudie, die 6 Monate lang durchgeführt wurde, wurde festgestellt, dass unter diesen Bedingungen die katalytische Transglycosylierungsaktivität vollständig erhalten bleibt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur kovalenten Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP ermöglicht die Herstellung einer neuartigen Form eines immobilisierten Katalysators, der bis zu Temperaturen von 60-70°C stabil ist, mit dem Vorliegen einer hohen Konzentration an mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Ethylen und Polyethylenglykolen, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran, kompatibel ist und der eine gute enzymatische Aktivität im pH-Bereich von 6 bis 9 aufrechterhält.
Gemäß einer weiteren Anwendung der vorliegenden Erfindung werden die Enzyme UdP und PNP, die an einem festen Substrat mit funktionellen Epoxygruppen durch Bildung von kovalenten Bindungen immobilisiert sind, in vorteilhafter Weise für die gewerbliche Herstellung von natürlichen Nucleosiden und modifizierten Analogen verwendet, indem man Transglycosylierungsreaktionen unter Verwendung eines Zucker spendenden Nucleosids und einer Zucker aufnehmenden Base als Ausgangsmaterialien durchführt. Der erfindungsgemäße immobilisierte Katalysator weist solche Eigenschaften in Bezug auf enzymatische Wirksamkeit, Stabilität und mechanische Beschaffenheit auf, das die Durchführung von Transglycosylierungsreaktionen bei etwa 50-60°C ermöglicht wird, das Reaktionsgemisch nach Beendigung der Umsetzung leicht vom Katalysator getrennt werden kann (beispielsweise durch direkte Filtration an einem an das Reaktionsgefäß angeschweißten Trenneinsatz) und der gleiche Katalysator für anschließende Reaktionszyklen wiederverwendet werden kann, wie ausführlich in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird.
So wurde beispielsweise in einem Zyklus von 12 aufeinanderfolgenden Umsetzungen, die 2,5 Stunden bei 60°C zur Herstellung von β-D-Arabinofuranosyl-2,6-diaminopurin (Ara-DAMP) durchgeführt wurden, wobei bei jeder Umsetzung das bei der vorhergehenden Umsetzung gewonnene Harz als Katalysator wiederverwendet wurde, festgestellt, dass das nach dem letzten Zyklus gewonnene Harz (bei einer gesamten Betriebsdauer von 30 Stunden bei 60°C) mehr als 85 % seiner ursprünglichen katalytischen Aktivität behalten hatte. Die Stabilität des Katalysators wurde ferner bei 60°C, 50°C und 40°C für kontinuierliche Betriebszeiten von bis zu 240 Stunden (10 Tage) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten einen durchschnittlichen Verlust an katalytischer Wirksamkeit von 8 % pro 24-stündiger Betriebszeit bei einer Temperatur von 60°C und von 5 % pro 24-stündiger Betriebszeit bei einer Temperatur von 50°C, während bei einer Temperatur von 40°C der durchschnittliche Verlust an katalytischer Wirksamkeit pro 24-stündiger Betriebszeit weniger als 0,5 % betrug.
Gemäß einer weiteren Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung eignet sich der immobilisierte Katalysator auch für Umsetzungen, bei denen Substrate verwendet werden, die in wässrigen Puffern schlecht löslich sind; z. B. wurde bei der Herstellung von Fludarabin-desphosphat, die in einem der nachstehenden Beispiele beschrieben ist, in Gegenwart von 40 Dimethylsulfoxid im Reaktionsgemisch, das auf eine Temperatur von 60°C erwärmt wurde, die Aktivität des immobilisierten Katalysators nicht modifiziert.
Gemäß einer weiteren Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung eignet sich der immobilisierte Katalysator bei Transglycosylierungsreaktionen, die in einem kontinuierlichen Reaktor durchgeführt werden. Der Reaktor kann vorteilhafterweise aus einer thermostatisch gesteuerten Säule bestehen, wobei das Reaktionsgemisch, das das Zuckerdonator-Nucleosid, die Akzeptor-Base und den Phosphatpuffer enthält (entsprechend einem der nachstehenden Beispiele, das sich auf die Herstellung von 2'-Desoxyadenosin bezieht), unter Schwerkraftwirkung oder vorzugsweise mittels einer geeichten Strömungspumpe durch die Säule geleitet wird. Durch Einstellung der Strömung des Reaktionsgemisches durch das Katalysatorbett in Bezug zur Geschwindigkeit der Transglycosylierungsreaktion (unter den für die Herstellung von 2'-Desoxyadenosin angewandten Bedingungen betrug die optimale Strömung 1/5 des Säulenvolumens/Minute) erreicht die enzymatische Reaktion innerhalb der Zeitspanne, die für die Passage durch den Katalysator erforderlich ist, ein Gleichgewicht und das Säuleneluat kann direkt zur Reinigung des bei der Umsetzung gebildeten neuen Nucleosids verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne das Anwendungsgebiet einzuschränken.
Beispiel 1
Fermentation von rekombinanten Stämmen, die UdP und PNP bilden.
Die rekombinanten Stämme NP23/3 und NP24/3, die die Enzyme UdP bzw. PNP exprimieren, wurden getrennt unter absatzweisen Bedingungen und unter Verwendung von Fermentern mit einem geeigneten Fermentationsvolumen von 10 Liter fermentiert, wobei im Fermenter 8 Liter Kulturmedium vom pH-Wert 6,8-7,0 mit der folgenden Zusammensetzung (pro Liter) enthalten waren: 13,3 g KH₂PO₄; 4,0 g (NH₄)₂HPO₄; 1,7 g Citronensäure; 1,25 g Soitone; 2,5 g Glycerin; 0,125 g Hefeextrakt; 1,5 g MgSO₄·7H₂O; 0,08 g CaCl₂; 0,08 g FeSO₄·7H₂O; 0,02 g MnSO₄·H₂O; 0,03 g ZnSO₄·7H₂O; 0,003 g H₃BO₃; 0,006 g CuSO₄·5H₂O; 0,008 g CoCl₂·6H₂O; 0,004 g NaMoO₄·2H₂O; 0,010 g Thiamin·HCl; 0,0125 g Tetracyclin. Der Fermenter wurde mit etwa 300 ml bakterieller Suspension, die vorher 20 Stunden bei 30°C gezüchtet worden war, auf einen anfänglichen ^OD600^-Wert von 0,4 beimpft. Die Fermentation wurde unter den folgenden Betriebsbedingungen durchgeführt: Temperatur 30°C; Luftstrom 1 Volumenteil/Volumenteil Bouillonkultur/Minute; Rühren zu Beginn mit 150 U/min unter automatischer Erhöhung, um den pO₂-Wert 10 Stunden (Ansatzphase) auf 20 % der Sättigungskonzentration und anschließend auf 10 % der Sättigungskonzentration zu halten; pH-Wert durch automatische Zugabe einer Lösung von 12,5 % NH₄OH oder einer 25 %igen Lösung von H₃PO₄ auf 7,0 ± 0,1 gehalten. Während der Ansatzphase (10 Stunden nach Beginn der Fermentation und bis zu etwa 50 Stunden) wurde der Fermenter automatisch mit 2 Liter einer Lösung der folgenden Zusammensetzung (pro Liter) versetzt: 400 g Glycerin; 200 g Soitone; 20 g Hefeextrakt; 3 g MgSO₄·7H₂O; 0,0125 g Tetracyclin. Nach Beendigung der Fermentation (was nach etwa 51-52 Stunden der Fall war) wurde die Zellbiomasse durch Zentrifugation gewonnen, in 30 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 gewaschen, erneut zentrifugiert und als feuchte Zellbiomasse bei einer Temperatur von –20°C aufbewahrt.
Beispiel 2
Zelllysis

a) 400 g feuchte Zellpaste, die durch Zentrifugation oder durch Mikrofiltration einer Bouillon-Kultur des rekombinanten Stammes NP23/3, der das Enzym UdP exprimiert, abgetrennt worden war, wurden mit 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, unter Erzielung eines Volumens von 1,5 Liter resuspendiert und 30 Minuten unter Rühren auf 56-60°C erwärmt. Nach Abkühlen auf etwa 4°C wurde die Suspension mittels drei aufeinanderfolgenden Stufen bei einem Druck von etwa 600 bar in einem mechanischen Manton-Gaulin-Homogenisator, der auf einer Temperatur von etwa 10°C gehalten wurde, lysiert. Sodann wurde die Suspension durch Zentrifugation mit 12 000 × g geklärt. Man erhielt etwa 2 Liter Lösung, die die gesamten löslichen Proteine enthielt.
b) 1 600 g feuchte Zellpaste, die durch Zentrifugation einer Bouillon-Kultur des rekombinanten Stammes NP24/3, der das Enzym PNP exprimiert, erhalten worden war, wurde mit 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5 resuspendiert, so dass ein Volumen von 8 Liter erhalten wurde, und 30 Minuten unter Rühren auf 56-60°C erwärmt. Nach Abkühlen auf etwa 4°C wurde die Suspension mittels drei aufeinanderfolgenden Stufen bei einem Druck von etwa 600 bar in einem mechanischen Manton-Gaulin-Homogenisator, der auf einer Temperatur von etwa 10°C gehalten wurde, lysiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugation mit 12 000 × g geklärt. Man erhielt etwa 8 Liter Lösung mit einem Gehalt an gesamten löslichen Proteinen.

Beispiel 3
Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten
a) Bestimmung der enzymatischen Aktivität von UdP
Ein abgemessenes Volumen (100 bis 200 μl) zentrifugiertes Lysat, verdünnt auf 1:100 Vol./Vol., das aus der UdP exprimierenden Zellpaste extrahiert worden war, wurde zu 800 μl einer 75 mM Lösung von Uridin in 100 mM Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7, der bei 30°C vorinkubiert worden war, gegeben. Nach 5 Minuten wurde die Uridin → Uracil-Phosphorolysereaktion durch Zugabe von 1 ml 1 N HCl gestoppt. Ein Aliquotanteil des Reaktionsgemisches wurde durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer mit 5 μm-Kügelchen C-18-Capcell-Pack gepackten Säule der Abmessungen 250 × 4,6 mm (Shisheido) unter Flution mit einer 30 mM Lösung von monobasischem Ammoniumphosphat vom pH-Wert 4,5 mit einem Gehalt an 9 % Methanol analysiert. Die enzymatische Aktivität des Zelllysats wurde in Einheiten·ml^–1 (μmol Uracil·min^–1·ml^–1) angegeben und relativ zu einer Uracil-Eichlösung, die unter den gleichen Bedingungen eluiert worden war, berechnet.
b) Bestimmung der enzymatischen PNP-Aktivität
Ein abgemessenes Volumen (variabel von 100 bis 200 μl) zentrifugiertes Lysat, verdünnt auf 1:100 Vol./Vol., das aus der Zellpaste des Stammes, der PNP exprimiert, extrahiert worden war, wurde zu 800 μl einer 62,5 mM Lösung von Inosin in 100 mM Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7, der bei 30°C vorinkubiert worden war, gegeben. Nach 10 Minuten wurde die Inosin → Hypoxanthin-Phosphorolysereaktion durch Zugabe von 1 ml 1 N HCl gestoppt. Ein Aliquotanteil des Reaktionsgemisches wurde durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer mit 5 μm-Kügelchen C-18-Capcell-Pack gepackten Säule der Abmessungen 250 × 4,6 mm (Shisheido) unter Flution mit einer 30 mM Lösung von monobasischem Ammoniumphosphat vom pH-Wert 4,5 mit einem Gehalt an 9 % Methanol analysiert. Die enzymatische Aktivität des Zelllysats wurde in Einheiten·ml^–1 (μmol Hypoxanthin·min^–1·ml^–1) angegeben und relativ zu einer Hypoxanthin-Eichlösung, die unter den gleichen Bedingungen eluiert worden war, berechnet.
c) Bestimmung der katalytischen Transglycosylierungsaktivität
Die katalytische Transglycosylierungsaktivität des Gemisches von Zelllysaten mit einem Gehalt an UdP und PNP oder der an einem festen Substrat koimmobilisierten Enzyme UdP und PNP wurde in einer Transglycosylierungsreaktion bestimmt, die im analytischen Maßstab unter standardisierten Bedingungen durchgeführt wurde.
250 μl des Gemisches von Zelllysaten oder 100 mg (Feuchtgewicht) immobilisierter UdP-PNP-Katalysator wurden zu 10 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben: 40 mM β-D-Arabinofuranosyluracil (Ara-U), 40 mM Adenin, 30 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7, bei 60°C thermostatisiert. Nach 1,5 Stunden bei 60°C wurde die Umsetzung durch Verdünnen des Gemisches im Verhältnis von 1:50 und Abkühlen in Eis gestoppt. Der prozentuale Anteil der biologischen Umwandlung von Adenin zu β-D-Arabinofuranosyladenin (Ara-A) wurde durch Analysieren eines Aliquotanteils des Reaktionsgemisches durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer mit 5 μm-Kügelchen von C-18-Capcell-Pack gepackten Säule der Abmessungen 250 × 4,6 mm (Shisheido) unter Flution mit einer 30 mM Lösung von monobasischem Ammoniumphosphat vom pH-Wert 4,5 mit einem Gehalt an 9 % Methanol analysiert. Die analytische Transglycosylierungsaktivität wurde in Einheiten·ml^–1 (μmol Ara-A, gebildet in 1,5 Stunden·ml^–1 Gemisch der Zelllysate) oder in Einheiten·g^–1 feuchtes Harz (μmol Ara-A, gebildet in 1,5 Stunden·g^–1 feuchtes Harz) angegeben und wurde relativ zu einer Ara-A-Eichlösung bei Elution durch HPLC unter den gleichen Bedingungen berechnet.
Beispiel 4
Herstellung des Katalysators durch Koimmobilisierung von UdP und PNP
Die Koimmobilisierung der Enzyme UdP und PNP wurde ausgehend von einem Gemisch der Lysate, die so hergestellt worden waren, dass ein variables Aktivitätsverhältnis von UdP und PNP im Bereich von 1:0,5 bis 1:4 vorlag, durchgeführt. In diesem Beispiel wird die Immobilisierung ausgehend von einem Gemisch von Lysaten, bei dem das UdP:PNP-Aktivitätsverhältnis 1:1 betrug, beschrieben.
2,6 kg (Feuchtgewicht, mit einem Gehalt an etwa 40-50 % H₂O) Sepabeads EC-EP/M-Epoxyharz (Resindion Srl, Mailand) und 500 Teile pro Million p-Hydroxymethylbenzoat wurden zu einem Gemisch von 2 Liter rohem Zelllysat mit einem Gehalt an einer UdP-Aktivität von etwa 500 Einheiten/ml und 8 Liter rohem Zelllysat mit einem Gehalt an einer PNP-Aktivität von etwa 125 Einheiten/ml gegeben. Das Gemisch wurde unter mäßigem Rühren 48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Sodann ließ man das Gemisch klären und entfernte die überstehende Flüssigkeit. Das Harz wurde unter Vakuum mit einem Büchner-Filter filtriert und auf dem Filter mit etwa 20 Liter entionisiertem Wasser gewaschen.
Der immobilisierte Katalysator wurde durch Bestimmung der Transglycosylierungsaktivität charakterisiert. Er wurde bei 4°C in 100 mM Phosphatpuffer/20 % Propanol/500 ppm Ethyl-p-hydroxybenzoat gehalten.
Beispiel 5
Beispiele für die Herstellung von Nucleosiden durch eine Transglycosylierungsreaktion, die durch die Enzyme UdP und PNP, die durch kovalente Bindungen an einem festen Substrat koimmobilisiert sind, katalysiert wird.
a) Herstellung von Ara-A
10 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 12 Einheiten/g, der vorher aus der Aufbewahrungslösung abfiltriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurde zu 150 ml einer Lösung, die auf 60°C thermostatisiert wurde und die folgende Zusammensetzung aufwies, gegeben:
25 mM Ara-U
25 mM Adenin
30 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7.
Nach 1 Stunde bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung in einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet) und das Filtrat wurde abgekühlt, um den aus rohem Ara-A bestehenden Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag wurde durch Kristallisation aus Wasser gereinigt.
Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 70 %. Die Reinheit von Ara-A nach der Kristallisation, bestimmt durch HPLC-Analyse, betrug mehr als 98 %.
b) Herstellung von β-D-Arabinofuranosyladenin (Ara-DAMP)
65 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 13 Einheiten/g, der vorher aus der Aufbewahrungslösung filtriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurden zu 2 Liter einer auf 60°C thermostatisierten Lösung, die die folgende Zusammensetzung aufwies, gegeben:
30 mM Ara-U
30 mM 2,6-Diaminopurin (DAMP)
30 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7.
Nach 2,5 Stunden bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung bei einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet) und das Filtrat wurde abgekühlt, um den aus rohem Ara-DAMP bestehenden Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag wurde durch Kristallisation aus Wasser gereinigt.
Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 70 %. Die Reinheit des Ara-DAMP nach Kristallisation, bestimmt durch HPLC-Analyse, betrug mehr als 98 %.
c) Herstellung von β-D-Arabinofuranosyl-2-fluoradenin-des-phosphat (Fludarabin-des-phosphat)
30 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 13 Einheiten/g, der vorher aus einer Aufbewahrungslösung filtriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurden zu 800 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 40 % Dimethylsulfoxid (DMSO), die auf 60°C thermostatisiert wurde und die folgende Zusammensetzung aufwies, gegeben:
75 mM Ara-U
50 mM 2-Fluoradenin
30 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7.
Nach 4 Stunden bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung in einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet) und das Filtrat wurde abgekühlt, um den aus rohem Fludarabin-des-phosphat bestehenden Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag wurde durch Kristallisation aus einem DMSO/Wasser-Gemisch gereinigt.
Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 70 %. Die Reinheit von Fludarabin-des-phosphat nach der Kristallisation, bestimmt durch HPLC-Analyse betrug mehr als 98 %.
d) Herstellung von 2'-Desoxyadenosin
1 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 13 Einheiten/g, der vorher aus der Aufbewahrungslösung abfiltriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurde zu 200 ml einer auf 60°C thermostatisierten Lösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung gegeben:
75 mM 2'-Desoxyuridin
50 mM Adenin
30 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7.
Nach 2 Stunden bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung in einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet) und das Filtrat wurde abgekühlt, um den aus 2'-Desoxyadenosin bestehenden Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag wurde durch Fällung aus H₂O gereinigt. Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 70 %. Die Reinheit des 2'-Desoxyadenosins nach Kristallisation, bestimmt durch HPLC-Analyse, betrug mehr als 98 %.
e) Herstellung von 2'-Desoxyguanosin
5 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 13 Einheiten/g, der vorher aus der Aufbewahrungslösung abfiltriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurde zu 90 ml einer auf 60°C thermostatisierten Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben:
60 mM 2'-Desoxyuridin
30 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7.
5 ml einer 0,8 M Lösung von Guanin in 30 % NaOH wurde sehr langsam (2,5 ml/Stunde) zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch durch kontinuierliche Zugabe von 20 % HCl auf dem pH-Wert 7 gehalten wurde. Nach 2,5 Stunden bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung in einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet) und das Filtrat wurde auf 50°C abgekühlt, um nicht-umgesetztes Guanin durch Filtration zu entfernen. Sodann wurde das Filtrat auf 4°C abgekühlt, um das 2'-Desoxyguanosin auszufällen, das durch Kristallisation aus H₂O gereinigt wurde. Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 70 %. Die Reinheit des 2'-Desoxyguanosins nach Kristallisation, bestimmt durch HPLC-Analyse, betrug mehr als 98 %.
f) Herstellung von (N'-β-D-Ribofuranosyl)-5-hydroxyimidazolo-4-carboxamid (Mizoribin)
5 g (Feuchtgewicht) immobilisierter Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 12 Einheiten/g, der vorher aus der Aufbewahrungslösung abfiltriert und auf dem Filter mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, wurde zu 100 ml einer auf 60°C thermostatisierten Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben:
225 mM Uridin
150 mM Hydroxycarbamoylimidazol
30 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7.
Nach 6 Stunden bei 60°C wurde der Katalysator entfernt (und zur Umsetzung in einer neuen biologischen Umwandlungsreaktion verwendet), das Filtrat wurde abgekühlt und das Mizoribin wurde durch Chromatographie in einer Ionenaustauschersäule gereinigt.
Die Ausbeute der biologischen Umwandlungsreaktion betrug ≥ 80 %. Die Reinheit des Mizoribins, bestimmt durch HPLC-Analyse, betrug mehr als 98 %.
g) Herstellung von 2'-Desoxyadenosin in einem kontinuierlichen Reaktor
Ein Präparat von immobilisiertem Katalysator mit einer Transglycosylierungsaktivität von etwa 12 Einheiten/g wurde in einer Höhe von 4 cm in einer auf 40°C thermostatisierten Säule, die einen Durchmesser von 2 cm aufwies (Säulenvolumen = 12,5 ml), gepackt. 3 Liter einer auf 40°C vorerwärmten Lösung mit einem Gehalt an 10 mM Adenin, 15 mM 2'-Desoxyuridin und 30 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7, wurde durch die Katalysatorsäule mittels einer Pumpe mit einer kalibrierten Strömung von 2,5 ml/Minute (Strömungsgeschwindigkeit = 1/5 des Säulenvolumens/Minute) gepumpt. Aliquotanteile des Eluats wurden nach 30 und 60 Minuten sowie anschließend mit 2-ständigen Abständen bis zu 20 Stunden gesammelt und durch HPLC analysiert, um die Ausbeute der biologischen Umwandlung zu bestimmen. Diese Ausbeute lag für sämtliche Proben im Bereich von 83 bis 86 %.

Claims

Biokatalysator, der für Transglycosylierungsreaktionen geeignet ist, enthaltend eine feste Matrix funktionalisiert mit Epoxygruppen und die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase auf der festen Matrix durch die Bildung von kovalenten Bindungen co-irrmobilisiert sind.
Biokatalysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalenten Bindungen durch Reaktion zwischen den Epoxygruppen der festen Matrix und den Aminogruppen der Enzyme gebildet werden.
Biokatalysator nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminogruppen Aminogruppen der Lysinreste sind, die in den Polypeptidketten der Enzyme vorhanden sind.
Biokatalysator nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix eine Konzentration von Epoxygruppen von nicht weniger als 50 μmol/g feuchtem Harz, bevorzugt eine Konzentration von etwa 100 μmol/g feuchtem Harz, aufweist.
Biokatalysator nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix ein Epoxyharz ist.
Biokatalysator nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Epoxyharz ausgewählt ist aus Epoxy-aktivierter Sepharose^®, Fractogel^® TSK AF-Epoxy, Eupergit^® C, Eupergit^® C250L, Sepabeads^® EC-EP/M und Sepabeads^® EC-EP.
Biokatalysator nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Epoxyharz eine Teilchengröße zwischen 200 und 600 Mikron aufweist.
Biokatalysator nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix ein mit Epoxygruppen funktionalisiertes Agarosegel, ein mit Epoxygruppen funktionalisiertes Silicagel, ein mit Epoxygruppen funktionalisiertes Polymer auf Basis von Methacrylamid-Bisacrylamid oder ein mit Epoxygruppen funktionalisiertes Polymethacrylat-Polymer ist.
Biokatalysator nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme UdP und PNP prokaryotischen Ursprungs sind.
Biokatalysator nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme UdP und PNP durch ein rekombinantes Verfahren gebildet werden.
Biokatalysator nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme UdP und PNP in dem aus den rekombinanten Zellen extrahierten rohen löslichen Anteil oder in teilweise gereinigten oder gereinigten Zubereitungen, die von dem aus den rekombinanten Zellen extrahierten rohen löslichen Anteil abgeleitet sind, enthalten sind.
Verwendung des Biokatalysators nach den Ansprüchen 1 bis 11 für die Herstellung von Nucleosiden durch eine enzymatische Transglycosylierungsreaktion zwischen einem Zucker-Donornucleosid und einer heterocyclischen Zucker-Akzeptorbase.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Zucker des Donornucleosids β-D-Ribose, 2'-Deoxy-β-D-ribose, 2'-3'-Dideoxy-β-D-ribose, β-D-Arabinose, α-L-Xylose oder Aminoderivate oder Halogenderivate davon ist.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Base des Donornucleosids Uracil ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglycosylierungsreaktion in wässriger Phase durchgeführt wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglycosylierungsreaktion in Anwesenheit von Phosphatpuffer durchgeführt wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglycosylierungsreaktion bei einem pH zwischen 6 und 8, bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5, durchgeführt wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglycosylierungsreaktion bei Temperaturen von bis zu 75°C und bevorzugt bei Temperaturen zwischen 55 und 60°C durchgeführt wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass nach Vervollständigung der Reaktion der immobilisierte Katalysator aus der Reaktionsmischung durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren abgetrennt wird und in nachfolgenden Transglycosylierungsreaktionen wiederverwendet wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglycosylierungsreaktion in einem kontinuierlichen System durchgeführt wird, in dem die Reaktion durch Hindurchleiten durch den Biokatalysator vervollständigt wird, der in einer Säule oder in einem thermostatisch gesteuerten kontinuierlichen Reaktor gehalten wird.
Verfahren zur Herstellung eines Biokatalysators nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase unter Rühren bei einem pH zwischen 6 und 9 und bei einer Temperatur zwischen 10 und 50°C mit der mit Epoxygruppen funktionalisierten festen Matrix in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase gesondert mit zwei verschiedenen Fraktionen der festen Matrix in Kontakt gebracht werden, die dann zusammengemischt werden, um den Biokatalysator zu ergeben.
Verfahren nach den Ansprüchen 21-22, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase in enzymatischen Aktivitätsverhältnissen Uridinphosphorylase:Purinnucleosidphosphorylase zwischen 1:0,5 und 1:3, bevorzugt in einem Verhältnis von etwa 1:1, verwendet werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass (a) die Biomasse, die durch Fermentation von Bakterienstämmen, die die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase exprimieren, erhalten wird, einer Lysis unterworfen wird und zentrifugiert wird, um die löslichen Rohfraktionen zu trennen, (b) die Mischung der so erhaltenen löslichen Rohfraktionen ohne weitere Reinigungsschritte mit der mit Epoxygruppen funktionalisierten festen Matrix in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bakterienstamm, der gleichzeitig die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase exprimiert, verwendet wird oder zwei verschiedene Bakterienstämme verwendet werden, wobei einer das Enzym Uridinphosphorylase exprimiert und der andere das Enzym Purinnucleosidphosphorylase.
Verfahren nach den Ansprüchen 24-25, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienstämme rekombinant sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (a) die Biomasse einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 50 bis 70°C, bevorzugt bei 60°C, unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Wärmebehandlung 20 bis 40 Minuten, bevorzugt 30 Minuten, durchgeführt wird.
Biokatalysator, der durch das Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis 28 hergestellt werden kann.