CH651317A5 - Verfahren zur enzymatischen synthese von doppelstrangiger rna, nach diesem verfahren synthetisierte doppelstrangige rna und diese enthaltende interferon-induktoren. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von doppelstrangiger RNA unter Verwendung von nativer Human-DNA aus Human-Plazenta als Schablone. Sie betrifft auch eine nach diesem Verfahren synthetisierte doppelstrangige RNA und diese enthaltende Interferon-Induktoren.

Interferon (nachstehend auch mit IF abgekürzt) ist eine Substanz mit antiviraler Aktivität. Es ist bekannt, dass tierische Zellen, die bestimmten Stimuli, wie Viren und Nucleinsäuren, ausgesetzt werden, Interferon bilden (vgl. Biologyof Interferon, Tsunataro Kishida, veröffentlicht 1971 durch KINOKUNIYA SHOTEN).

In letzter Zeit wurde festgestellt, dass IF eine Antitumorwir-kung gegen osteogene Sarkome (maligne Tumoren) aufweisen; vgl. International Workshop on Interferon in the treatment of cancer, New York, 1975. Ferner wird vermutet, dass chronische, s aktive Hepatitis, eine nicht behandelbare Hepatitis B, ebenfalls durch hohe IF-Dosen geheilt werden kann; vgl. The New England Journal of Medicine, Bd. 295 (10), S. 517 bis 522.

Da, wie bereits erwähnt, IF eine Substanz von hoher biologischer Aktivität ist, hat man sich in jüngster Zeit bemüht, die io grosstechnische Herstellung von IF zu verbessern, beispielsweise durch Induktion und Herstellung aus menschlichen Leukozyten, menschlichen lymphoplastoiden Zellen und dergleichen.

Da IF eine Spezifität gegen Wirtszellen aufweist, ist es andererseits erforderlich, zur Herstellung von IF zur Behandlung von 15 Krankheiten des Menschen Humanzellen zu verwenden. Die Schwierigkeiten, die beim grosstechnischen Einsatz von Humanzellen bestehen, haben die Entwicklung derartiger Verfahren verzögert.

Im Gegensatz zum vorstehend erläuterten Verfahren, bei dem 20 exogenes IF in vitro gebildet wird, hat man sich in j üngster Zeit mit sogenannten IF-Induktoren beschäftigt, die in vivo IF induzieren und vermehren. Um IF-Induktoren, die als Arzneistoffe verwendet werden können', zu erhalten, hat man versucht, weitere Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln. B eispiele 25 für bekannte IF-Induktoren sind verschiedene Arten von Viren, Nucleinsäuren, Polysacchariden und Mikroorganismenextrakten. Aufgrund ihrer hohen Aktivität sind Nucleinsäuren besonders interessant. Die bisher bestätigten Möglichkeiten zur IF-Induktion durch Nucleinsäuren sind in Tabelle I zusammenge-30 stellt.

Tabelle I

35

Nucleinsäurearten

IF-

Induzierbarkeit*

zu den Wirtszellen homologe Nucleinsäuren — zu den Wirtszellen heterologe Nucleinsäuren +

40

zu den Wirtszellen heterologe DNA

+

zu den Wirtszellen heterologe RNA

+

zu den Wirtszellen heterologe, 45 einstrangige RNA

+

zu den Wirtszellen heterologe, doppelstrangige RNA

+++

50

zu den Wirtszellen homologe DNA

zu den Wirtszellen homologe, einstrangige RNA

keine, ± zweifelhaft, + beträchtlich, +++ sehr stark

55

Seit der von Isaac und seinen Nachfolgern aufgestellten Hypothese (vgl. Nature Bd. 197 (1963), S. 564undLancet, Bd. 11 (1963), S. 113) wird angenommen, dass Nucleinsäuren, dielF induzieren, heterologzu den Wirtszellen sein müssen. Der 60 Verwendung von Nucleinsäuren als IF-Induktoren wurde so lange kein besonderes Interesse geschenkt, bis sich herausstellte, dass zu den Wirtszellen heterologe, doppelstrangige Ribo-nucleinsäure (RNA) eine starke IF-Induktionswirkung aufweist. Daher wurden Versuche zur Herstellung von doppelstrangiger 65RNA aus Pilzen, E. coli, anderen mit Phagen induzierten Bakterien und dergleichen durchgeführt. Etwa gleichzeitig wurde festgestellt, dass unter den synthetischen, doppelstrangigen Ribonucleinsäuren Poly-I:C eine starke IF-induzierende

Wirkung aufweist. Man weiss heute, dass insbesondere das zu den Wirtszellen heterologe, doppelstrangige RNA unter den verschiedenen Nucleinsäuren ein besonders wirksamer IF-Induktor ist. Jedoch hat zu den Wirtszellen heterologe RNA aufgrund ihrer heterologen Eigenschaften unerwünschte Nebenwirkungen. Somit weist RNA die vorerwähnte starke IF-induzie-rende Wirkung auf, ist jedoch bei der klinischen Anwendung zu toxisch, so dass es gegenwärtig in der Therapie praktisch nicht angewendet wird.

Wie vorstehend erwähnt, war man allgemein der Ansicht, dass es für mit Nucleinsäuren in Zusammenhang stehende IF-Induk-toren wesentlich ist, dass sie zu den Wirtszellen heterologe Nucleinsäuren aufweisen. Man hat deshalb versucht, Substanzen von geringer Toxizität aufzufinden. Diese Versuche haben jedoch nicht zu den gewünschten Ergebnissen geführt. Somit ist der Anstieg in der IF-induzierenden Wirkung von mit Nuclein-säure in Zusammenhang stehenden IF-Induktoren immer von einem Anstieg der Toxizität begleitet.

Die Erfinder unterzogen zu Wirtszellen homologe Nucleinsäuren einer nochmaligen Untersuchung. Hierin sah man aufgrund des vollständigen Fehlens einer IF-induzierenden Wirkung bisher keine Möglichkeiten. Die Erfinder setzten aber ihre Suche nach Nucleinsäuren mit starker IF-induzierender Wirkung bei gleichzeitig geringer Toxizität fort.

Um derartige IF-Induktoren aus zu Wirtszellen homologen Nucleinsäuren zu gewinnen, wurde versucht aus menschlichen Geweben extrahierte RNA chemisch zu modifizieren; vgl. JA-AS 2008/75. Für diese Substanzen scheint zwar aufgrund ihrer geringen Toxizität der Einsatz als Arzneistoffe möglich, jedoch weisen sie eine sehr geringe IF-induzierende Wirkung auf.

Aufgabe der Erfindung ist es Nucleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die neben einer starken Interferon-induzierenden Wirkung eine geringe Toxizität aufweisen. Ferner sollen erfindungs-gemäss Interferon-Induktoren mit einem Gehalt an derartigen Nucleinsäuren zur Verfügung gestellt werden.

Der Verfahrensanspruch 1 sowie die Erzeugnisansprüche 10 und 11 definieren erfindungsgemässe Lösungen dieser Aufgabe.

Gestützt auf den Befund der genannten JA-AS 2008/75 wurde erfindungsgemäss versucht, entsprechende, zu Wirtszellen homologe Nucleinsäuren zur Verfügung zu stellen. Hierbei wurde versucht, das Prinzip der zu den Wirtszellen heterologen, doppelstrangigen RNA, die bisher die stärkste IF-induzierende Wirkung verbunden mit einer hohen Toxizität aufweist, auf homologe, doppelstrangige RNA anzuwenden. Erfindungsgemäss wurde also versucht, doppelstrangige RNA unter Verwendung von Human-DNA (Desoxyribonucleinsäure) als Schablone (template) zu synthetisieren. Hierbei wurde überraschenderweise festgestellt, dass homologe, doppelstrangige RNA im Vergleich zu den bisher bekannten Substanzen eine besonders geringe Toxizität verbunden mit einer ausgezeichneten IF-induzierenden Wirkung aufweist. Diese Substanzen stellen daher wertvolle Arzneistoffe dar.

Die erfindungsgemäss eingesetzte native Human-DNA wird durch Extraktion aus menschlichem Gewebe nach einem an sich üblichen Verfahren hergestellt. Bevorzugt ist eine Extraktion mit einem Phenol, einer mit einem Phenol gesättigten wässrigen Lösung oder mit einer mit einem Phenol gesättigten Pufferlösung.

Beispielsweise lässt sich native Human-DNA aus Humanplazenta gemäss dem Verfahren von Parish und Mitarb., (J. h.

Parish und K. S. Kirby, Biochem. Biophys. Acta. Bd. 129 (1966), S. 554 und nach dem Verfahren von Kirby und Mitarb. (K. S. Kirby und E. A. Cook, Biochem. J., Bd. 104 (1967), S. 254 reinigen. Nachstehend wird ein derartiges Verfahren kurz umrissen: auf —20°C tiefgefrorene Humanplazenta wird in Gegenwart von 6 Prozent Natrium-p-aminosalicylat und einem Phenol-Cresol-Gemisch homogenisiert, um eine Extraktion der Nucleinsäuren und Deproteinisierung durchzuführen. Der nach Zentri-

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fugation des Phenol-Cresol-Gemisches erhaltene flüssige Überstand wird nochmals deproteinisiert. Sodann wird wieder zentri-fugiert und der Überstand einer Nucleinsäurefällung unterzogen. Der Niederschlag wird in einer Lösung geringer Ionenstärke gelöst und zur Aussalzung von RNA mit einer hohen Konzentration an Natriumchlorid versetzt. Nach dem Abzentrifugieren der RNA wird restliche RNA und stark aggregierte DNA entfernt. Anschliessend wird Glycogen durch Ultrazentrifugation entfernt.

Aus dem Überstand wird DNA ausgefällt und in einer Lösung geringer Ionenstärke gelöst. Die Lösung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert. Man erhält native DNA in Form eines lyophilisierten Produkts.

Obgleich die verschiedensten menschlichen Gewebe verwendet werden können und es diesbezüglich keine Beschränkungen gibt, werden Plazenta und Leukozyten, die am leichtesten zur Verfügung stehen, bevorzugt eingesetzt. Auf diese Weise extrahierte native DNA wird als Schablone bei der Polymerisation von Ribonucleosid-triphosphaten unter der katalytischen Wirkung von RNA-Polymerase verwendet, wobei RNA synthetisiert wird. RNA-Polymerase bedeutet allgemein eine DNA-abhängige RNA-Polymerase. Es handelt sich um ein Enzym, das die Synthese von RNA unter Polymerisation von Ribonucleosid-triphosphaten durch Diesterbindungen katalysiert, wobei DNA als Schablone dient. Dieses Enzym zeigt im allgemeinen Schablo-nenspezifität, d.h. nur DNA, die aus der gleichen Quelle wie das Enzym extrahiert ist, ist als Schablone aktiv. Jedoch muss es sich bei der erfindungsgemäss verwendeten aktiven RNA-Polymerase um ein Enzym von geringer Schablonenspezifität handeln, d. h. sie muss menschliche DNA als Schablone für die RNA-Synthese verwenden können. Unter dem hier verwendeten Ausdruck «aktive RNA-Polymerase» ist ein derartiges Enzym zu verstehen. Enzyme aus Micrococcus lysodeikticus und Escherichia coli, die allgemein erhältlich sind, haben sich als für diesen Zweck besonders geeignet erwiesen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Enzyme beschränkt.

Beispielsweise kann zur Isolierung und Reinigung von aktiver RNA-Polymerase aus Micrococcus lysodeikticus das Verfahren vonNakamoto undMitarb. (J. Biol. Chem., Bd. 239 (1964), S. 167) durch Kombination mit dem Verfahren von Weiss (Methods Enzymol., Bd. 12 (1968), S. 559) angewendet werden. Hierzu werden Zellen in ihrer späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet und bis zu ihrer Verwendung in gefrorenem Zustand aufbewahrt. Beider Verwendung wird mit Lysozym lysiert. Der erhaltene rohe Extrakt wird mit Streptomycinsulfat versetzt, um einen Nucleinsäure-Nucleoprotein-Komplex anzureichern.

Nach Elution von RNA-Polymerase aus dem Komplex durch Zusatz von Phosphatpuffer wird wieder Streptomycinsulfat zugesetzt, um die Nucleinsäuren selektiv auszufällen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert. Membranbestandteile und die Ribo-somenfraktion werden durch Ultrazentrifugation entfernt. Sodann wird zur Bildung eines Protamin-RNA-Polymerase-Komplexes Protaminsulfat zugesetzt. Aus dem Komplex wird die RNA-Polymerase mit Phosphatpuffer eluiert. Die auf diese Weise eluierte RNA-Polymerase wird zur nochmaligen Komplexbildung mit Protaminsulfat umgesetzt. Der Komplex wird anschliessend wieder mit P-hosphatpuffer eluiert. Das Eluat wird der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterzogen. Die bei 30-bis 50prozentiger Sättigung ausgefällte Fraktion wird gewonnen und mit einem Kationenaustauscherharz behandelt. Man erhält gereinigte RNA-Polymerase. Die spezifische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen RNA-Polymerase beträgt 50 bis 10 000 Einheiten/mg Protein. Bezüglich der Definition der Enzymeinheit wird auf Methods Enzymol., Bd. 12 (1968), S. 559 verwiesen.

Anschliessend wird die RNA-Synthese durch RNA-Polymerase unter Verwendung von nativer Human-DNA als Schablone beispielsweise wie folgt durchgeführt: Das Reaktionsgemisch für

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die RNA-Synthese enthält 4 bis 10 Einheiten/ml RNA-Polymerase (bezüglich der Einheiten wurde auf die vorstehende Literaturstelle verwiesen), 100 bis 1000 |xg/ml DNA, 0,2 bis 2 millimol ATP, GTP, CTP und UTP als Substrat, 1 bis 4 millimol MnCl2,0 bis 4 millimol Spermidin-hydrochlorid und 0,01 bis 0,1 m Tris-HC1 (pH-Wert 7,0 bis 8,0). Die Reaktionstemperatur beträgt 20 bis 40° C. Es werden Reaktionszeiten von 1 bis 10 Stunden angewendet. Bei Reaktionszeiten von 2 bis 4 Stunden erhält man gute Ausbeuten. Die Umsetzung wird durch Kühlung mit Eis beendet. Zusätzliche Behandlungsschritte, wie Abbau der DNA-Polymerase durch Behandlung mit Desoxyribonuclease (DN-ase), Entferung der Proteine durch Behandlung mit Phenol, Reinigung durch Dialyse und dergleichen, werden gemäss Gumport und Mitarb., Biochemistry, Bd. 8 (1969), S. 3168 durchgeführt. Anschliessend wird das Dialysat durch Ultrafiltration eingeengt. Das Konzentrat wird gemäss dem Verfahren von Glisin und Mitarb., Biochemistry, Bd. 13 (1974), S. 2633 auf einem CsCl-Kissen zur Isolation des RNA zentrifugiert. Die auf diese Weise isolierte RNA wird weiter durch Fällung mit Äthanol gereinigt. Das gereinigte Produkt wird der folgenden Tempe-rungsbehandlung zur Ausbildung von doppelstrangigen Bereichen unterzogen. Diese Temperungsbehandlung zur Ausbildung von doppelstrangigen Bereichen in der RNA wird gemäss dem Verfahren von Robinson und Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 239 (1964) S. 2944 durchgeführt. Dabei wird RNA in Standard-Kochsalz-Citrat-Lösung (SSC:0,15 m NaCl und 0,015 m Natriumeitrat) der doppelten Konzentration, bezogen auf RNA, gelöst. DerpH-Wertbeträgt6,5bis7,5. Die erhaltene Lösung wird auf Temperaturen von 70 bis 100° C erwärmt und anschliessend allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Reaktion zu beenden. Vorzugsweise wird die erhaltene Lösung 3 bis 10 Minuten einmal auf 70 bis 100° C erwärmt und sodann rasch auf Raumtemperatur abgekühlt. Hierauf wird nochmals auf die angegebenen Temperaturen erwärmt, und anschliessend die allmähliche Abkühlung auf Raumtemperatur vorgenommen. Bei der Temperung ist es auch vorteilhaft, eine Temperatur zwischen den angegebenen hohen Temperaturen und Raumtemperatur eine beträchtliche Zeit aufrechtzuerhalten. Nach beendeter Reaktion wird RNA durch Fällung mit Äthanol oder dergleichen als Niederschlag gewonnen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und gewaschen. Anschliessend wird er in einer wässrigen Natriumchloridlösung geringer Konzentration gelöst und 10 bis 30 Stunden bei niedrigen Temperaturen gegen Wasser dialysiert. Gegebenenfalls wird eine Sterilfiltration durchgeführt. Schliesslich wird zur Gewinnung eines festen Präparats gefriergetrocknet.

Der auf diese Weise erhaltene Interferon-Induktor, d.h. unter Verwendung von nativer Human-DNA als Schablone synthetisierte doppelstrangige RNA, ist weiss, geschmack- und geruchlos , enthält mindestens etwa 4 und im allgemeinen 10 bis 15 Prozent doppelstrangige Reste im Molekül und weist die nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnung angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften auf. Diese Angaben beziehen sich auf das Präparat von Beispiel 1.

Fig. 1 erläutert das Sedimentationsverhalten einer Probe in einem Saccharose-Dichtegradienten. Die Radioaktivität (dpm) wird an einer gemäss (3) von Beispiel 1 gewonnenen Probe, zu deren Herstellung anstelle von normalem ATP (8-14c) ATP (5uCi/ml) verwendet worden sind, gemessen.

Fig. 2 zeigt das UV-Absorptionsspektrum.

Fig. 3 erläutert die thermische Denaturierungskurve von RNase-resistenter RNA. Die thermische Denaturierung wird an der vorstehend erwähnten radioaktiven Probe gemessen. Die Probe wird auf verschiedene Temperaturen erwärmt und sodann einer RNAse-Behandlung unterzogen.

Fig. 4 zeigt Aborptionsverhältnisse bei 260 nm, d.h. das Verhältnis der Absorptionen bei verschiedenen Temperaturen zur Absorption bei 25° C.

(1) Molekulargewicht Der Sedimentationskoeffizient wird durch Zentrifugation in einem Saccharose-Dichtegradienten (5 bis 20 Prozent, Spinco SW 50.1 Rotor, 38 000 U/min, 3,5 Stunden) unter Verwendung von ribosomaler RNA aus Mäuse-L-Zellen als Standard bestimmt. Die Probe besteht hauptsächlich aus 11 bis 13 s-Bestandteilen (vgl. Fig. 1).

(2) Löslichkeit Das Präparat ist löslich in destilliertem Wasser, 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5, SSC der doppelten Konzentration, SSC der 0,1-fachen Konzentration vom pH-Wert 7,0 und dergleichen löslich. Es ist unlöslich in Äthanol und Aceton.

(3) UV-Absorptionsspektrum Eine wässrige Lösung von 0,02 mg/ml des Präparats ergibt ein für Nucleinsäuren typisches UV-Absorptionsspektrum (vgl. Fig. 2). Das Absorptionsmaximum liegt bei 260 nm und das Minimum bei 230 nm.

(4) Farbreaktionen Das Präparat erweist sich beim Orcinol-Test als positiv und beim Diphenylamin-Test und Indol-Test als negativ. Die Farbreaktionen sind für RNA charakteristisch.

(5) Fällungsreaktionen Eine wässrige Lösung einer Probe mit 0,5 mg/ml wird mit dem 2fachen Volumen Äthanol versetzt und bei —20° C mehr als 1 Stunde stehengelassen. Es ergibt sich eine fast lOOprozentige Fällung des Materials. Durch Zusatz von 50prozentiger Trichlor-essigsäure (TCA) in der halben Volumenmenge zu einer wässrigen Lösung einer Probe mit 0,1 mg/ml werden etwa 80 bis 90 Prozent des RNA unlöslich gemacht. Das unlösliche Produkt kann mit einem Millipore-Filter (0,45 (im) gewonnen werden.

(6) Abbau durch Ribonuclease

Die Probe wird in SSC-Lösung (pH-Wert 7,0) der doppelten Konzentration gelöst und 30 Minuten bei 37° C mit 10 (.ig/ml Ribonuclease aus Rinderpankreas und 1 ug/ml Ribonuclease-Tj behandelt. Etwa 11 bis 13 Prozent der Probe werden nicht angegriffen. Ferner wird eine Probe in SSC-Lösung (pH-Wert 7,0) von 0,3facher Konzentration gelöst, erwärmt und rasch abgekühlt. Anschliessend wird die vorstehend erwähnte Ribo-nuclease-Behandlung durchgeführt. Etwa 2 bis 3 Prozent werden nicht angegriffen.

(7) Abbau durch Desoxyribonuclease

Die Probe wird in 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,4 gelöst und 30 Minuten bei 37°C mit 50 ug/ml Desoxyribonuclease behandelt. Es ergibt sich, dass der in TCA unlösliche Anteil genauso hoch ist wie vor der Behandlung. Ferner lässt sich kein Anstieg der Absorption bei 260 nm nach der Behandlung feststellen.

(8) Empfindlichkeit gegenüber alkalischer Hydrolyse

Eine Probe wird in 0,3 n Kaliumhydroxidlösung gelöst und 18 Stunden bei 37° C inkubiert. Es ergibt sich eine vollständige Hydrolyse. Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse des Hydrolysats ergeben sich ausschliesslich Flecken von Ade-nylsäure, Guanylsäure, Cytidylsäure und Uridylsäure.

(9) Basenzusammensetzung Die Analyse der Basenzusammensetzung wird dünnschicht-chromatographisch an dem alkalischen Hydrolysat (8) durchgeführt. Es ergibt sich ein Molverhältnis von 27,0 bis 30.5 Prozent

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5

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Adenylsäure, 20,6 bis 24,7 Prozent Guanylsäure, 16,8 bis 24,3 Prozent Cytidylsäure und 27,8 bis 32,7 Prozent Uridylsäure.

(10) Dichte in CS2S04

Die durch Ultrazentrifugation in Cs2S04 (Spinco SW 50.1 Rotor, 31500 U/min, 72 Stunden) betimmte Dichte beträgt 1,635 bis 1,640.

(11) Thermische Denaturierung von RNase-resistenter RNA

(Tm)

Eine Probe wird in SSC-Lösung (pH-Wert 7,0) von 0, lfacher Konzentration gelöst. DerTm-Wert (Schmelztemperatur) wird gemäss dem Verfahren von C. Colby und D.H. Duesberg,

Nature Bd. 222 (1969), S. 940 bestimmt. Es ergibt sich ein Tm-Wert von 71°C (vgl. Fig. 3).

(12) Zunahme der Absorption bei steigenden Temperaturen

Die Probe wird in SSC-Lösung (pH-Wert 7,0) von 0,lfacher

Konzentration gelöst. Der Anstieg der Absorption bei 260 nm wird gemessen. Im Bereich von 25 bis 90° C wird ein Absorptionsanstieg von etwa 20 Prozent beobachtet (vgl. Fig. 4).

(13) Reinheit

Eine Reinheitsbestimmung wird folgendermassen durchgeführt: Die Proteinmenge wird nach Folin-Lowry bestimmt. Die Menge an DNA wird nach dem SST(Standard solution test)-Verfahren, modifiziert durch Mizuno et al («General Method of Separation nand Quantitative Analysis of Nucleic Acid», Hrsg. Uzitani und Mitarb., Tokyo University Publication, 1969, S. 23) bestimmt. Es lässt sich keine Verunreinigung durch Protein und DNA feststellen.

(14) Elektronenmikroskopische Untersuchung

Die elektronenmikroskopische Untersuchung gemäss dem Verfahren von Kleinschmidt und Mitarb., J. Molec. Biol., Bd. 10 (1964), S. 282 zeigt, dass die meisten RNA-Moleküle linear sind und eine Länge von etwa 0,1 bis 3 [j. aufweisen.

Die erfindungsgemässe doppelstrangige RNA mit den vorerwähnten physikalischen und chemischen Eigenschaften kann als IF-Induktor verwendet werden. Sie weist eine ausgezeichnete IF-induzierende Wirkung auf und hat dabei eine äusserst geringe Toxizität. Diesbezüglich wird auf die nachstehenden Versuchsbeispiele verwiesen.

Zur Herstellung von Arzneipräparaten können die vorstehend erwähnten Lösungen mit einem Gehalt an aktivem Material vor der Lyophilisation mit verschiedenen Stabilisatoren, wie Humanalbumin und Mannit, Lösungsvermittlern, wie Glycin, Trägerstoffen, wie Sorbit, und anderen Zusatzstoffen versetzt werden. Bei der Verwendung werden diese Arzneipräparate in Kochsalzlösung, sterilisiertem Wasser oder sterilisierten isotonen Lösungen für Injektionszwecke gelöst. Die Verabfolgung an Patienten kann durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion erfolgen.

Wirksame Dosen liegen im Bereich von 1 jj,g bis 2 mg pro kg Körpergewicht täglich. Gegebenenfalls können die Dosen auch gesteigert werden.

Die erfindungsgemässen Präparate sind auch in rohem Zustand als Arzneipräparate wirksam, d. h. in Form von Gemischen mit einstrangiger RNA. Eine Konzentration von 4 Prozent oder mehr an doppelstrangiger RNA ergibt eine ausreichende Wirksamkeit. Nachstehend sind die biologischen Eigenschaften des erfindungsgemässen Präparats anhand von Versuchsbeispielen erläutert.

Versuchsbeispiel 1 Antivirale in vitro-Aktivität

Die antivirale Aktivität wird durch Messung der Virusaus-5 beute gemäss einem teilweise modifizierten Verfahren nach Billiau et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Bd. 132 (1969), S. 790 bestimmt. Dabei werden Induktor-Proben (erfindungsgemässes Präparat und Poly-I:C als Kontrolle) in Mengen von 0,01,1,10 bzw. 50 ug/ml sowie 50 ug/ml DEAE-Dextran (Molekularge-io wicht 50 X104, Pharmacia, Schweden) und 3 ml Eagle-Minimal-medium (nachstehend als Eagle-MEM bezeichnet), ergänzt mit 0,5 Prozent fötalem Kälberserum, auf einlagige Zellschichten (monolayer cells; 2,5 bis 3,0x 106 Zellen/Flasche) in 50 ml-Kulturflaschen gegeben und 20 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach 15 der Inkubation wird das den Induktor enthaltende Eagle-Mini-malmedium entfernt. Die Zellen werden dreimal mit Hanks-Salzlösung gewaschen. Anschliessend werden Vesikular-Stomatitis-Viren (VSV) in einer Menge von 2 bis 3 Plaquebil-dungseinheiten (p.f ,u.)/Zelle auf die Zellschicht gegeben. Die 20 Viren werden 1 Stunde bei 37° C adsorbiert. Nach der Adsorption werden die Zellen zur Entfernung von freiem VSV fünfmal gewaschen. 5 ml neues Erhaltungsmedium (Eagle MEM mit einem Gehalt an 1 Prozent fötalem Kälberserum) werden zugesetzt. Nach 20stündiger Inkubation bei 37° C werden die Zellen in 25 einem Gefriergerät bei —30°C geerntet. Der Gefrier-Auftau-Vorgang wird zweimal wiederholt. Schliesslich wird 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Der VS V-Titer wird mittels Plaque-test auf FL-Zellkulturen bestimmt. Die Virusausbeute aus Zellen, die mit Eagle-MEM ohne Induktor (mit einem Gehalt an 30 DEAE-Dextran und Serum) behandelt werden, dient als Kontrolle.

Als Zellen werden zwei Arten von eingeführten Zellinien von menschlichem Amnion-FL-Zellen und Kaninchennieren-RK-13-Zellen sowie menschliche diploide Zellen aus Embryovorhaut 35 (HFS-Zellen) und menschliche HK-Zellen aus Embryonieren verwendet. Die HFS-Zellen sind ein Produkt der Flow Laboratories Inc. (Flow-7000-Zellen) und sind 25 bis 27 Passagen unterworfen. Heteroploide Zellen von HK-Zellen wurden von den Erfindern gezüchtet und anschliessend etwa 130 Passagen unter-40 worfen.

Die Zellen werden in Eagle-MEM, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Kälberserum, 100 ut/ml Penicillin G, 100 ug/ml Streptomycinsulfat und 60 ug/ml Kanamycin gezüchtet. Die Zellen werden in Erhaltungsmedium, in dem die Serummenge auf 451 Prozent verringert ist, gezüchtet. Die Züchtung erfolgt im C02-Inkubator (5 Prozent C02).

Als Kontrolle wird Poly-I:C der Miles Laboratories, Inc., V.St.A., verwendet. Dieses Produkt wird in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 in einer Menge von 2,5 mg/ml gelöst und bei —30° C so,gelagert. Bei der Verwendung wird das Produkt verdünnt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Obgleich zwischen den Zellen geringfügige Unterschiede auftreten, zeigt das erfindungsgemässe Präparat praktisch die gleiche antivirale Wirkung wie Poly-I:C.

55

Tabelle II

60

65

Wirtszellen

Konzentration des Induktors (Hg/ml)

Virusausbeute (p.f.u

../ml)*

erfindungsgemässes Präparat

Poly-I:C

FL

0

6 X 107

6 X 107

(human)

0,1

1 X 107

8 x 106

1

2,4 X 104

7,5 x 103

10

3,3 x 103

4 x 102

50

2 X 102

1,5 x 102

651317

6

Tabelle II

Wirtszellen

Konzentration des Induktors (Hg/ml)

Virusausbeute (p.f.u.

erfindungsgemässes Präparat

./ml)* Poly-I:C

HK

0

7,5 X 107

7,5 X 107

(human)

0,1

4,5 X 107

5 X 107

1

1 X 106

1,6 X 106

10

4 X 104

3,3 X 104

50

1,5 X 103

2 x 103

RK-13

0

1 X 107

1 x 107

(Kaninchen)

0,1

1,5 x 104

9 x 103

1

5 x 103

1 x 103

10

3,3 x 102

2,3 x 102

50

2 x 102

2 x 102

* p.f.u.: Plaquebildungseinheiten

Versuchsbeispiel 2 Induktion von IF (in vitro)

Die IF-induzierende Aktivität wird durch Zugabe des erfindungsgemässen Präparats zu gezüchteten Zellen untersucht. Der Test wird unter Anwendung der Superinduktionstechnik gemäss Vilcek und Mitarb. (PB-266,670 (1976)) durchgeführt. Hierzu werden 2 ml Eagle-MEM (ohne Serum) mit einem Gehalt an 5 bis 50 ng/ml Induktor und 100 ug/ml Cycloheximid (Nakarai Chemicals Co.) zu HFS-Zellen, die sich in Form einer einlagigen Zellschicht in einer Kunststoff-Petrischale von 6 cm Durchmesser befinden, gegeben. Die Zellen werden 5 Stunden bei 37°C inkubiert.

Anschliessend wird das Medium mit 0,5 ml Actinomycin-D (Becton Dickinson Co.) versetzt, so dass die endgültige Konzentration 1 [ig/ml beträgt. Die Inkubation wird eine weitere Stunde bei 37° C durchgeführt. Nach Beendigung der gesamten Inkubationszeit von 6 Stunden werden die Zellen fünfmal mit Hanks-Salzlösung gewaschen. Sodann werden 5 ml Eagle-MEM,

ergänzt mit 0,5 Prozent Serum, zugesetzt. Nach 20stündiger Inkubation bei 37° C wird das Medium gewonnen und 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um den Überstand unter Einschluss von IFzu gewinnen. Der IF-Titer wird unter Verwendung von FL-Zellen ermittelt.

Der IF-Titer wird gemäss dem modifizierten Verfahren von Vilcek und Mitarb., J. gen. Virol., Bd. 2 (1968), S. 648 bestimmt. Einlagige Zellkulturen in einer Kunststoff-Petrischale von 6 cm Durchmesser werden gewaschen und mit 2fachen Serienverdünnungen einer IF-Probe in Eagle-MEM mit einem Gehalt an 0,5 Prozent fötalem Kälberserum inokuliert. Die Inkubation wird 20 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach dem Waschen werden die Zellschichten mit VSV in einer Menge von etwa 100 p. f. u/Platte infiziert. Nach weiterer 2- oder 3tägiger Inkubation werden die gebildeten Plaques gezählt. Der IF-Titer wird als reziproker Verdünnungswert der Probe, die die Plaquezahl auf 50 Prozent der Kontrolle, die anstelle der Probe Eagle-MEM enthält, verringert. Der Titer der IF-Probe von Humanzellen wird gleichzeitig ermittelt, indem man den Humanleukozyten-Standard-IF unter Umwandlung in internationale Einheiten (IU) bestimmt. Poly-I:C wird als Kontrolle verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. Das erfindungsgemässe Präparat zeigt eine ausgeprägte IF-induzie-rende Wirkung als Poly-I:C.

Tabelle III

Konzentration des Induktors (ug/ml)

Titer (IU/ml)

erfindungsgemässes Präparat

Pol-I:C

0

< 10

<10

5

200

50

50

350

80

Versuchsbeispiel 3 IF-Induktion (in vivo)

Männliche Kaninchen mit einem Gesicht von 2,0 bis 2,5 kg erhalten eine intravenöse Injektion von 10 bis 100 (ig/kg des erfindungsgemässen Präparats bzw. von Poly-I:C als Kontrolle. Blutproben werden unmittelbar vor der Verabfolgung und 1,2, 4, 8,11 und 24 Stunden danach entnommen.

Die IF-induzierende Wirkung der verabfolgten Induktoren wird bestimmt, indem man den IF-Gehalt in den erhaltenen Seren ennittelt. Das Verfahren der IF-Titration ist ähnlich dem vorstehend erwähnten Verfahren gemäss Vilcek und Mitarb., mit der Ausnahme, dass RK-13-Zellen anstelle von FL-Zellen verwendet werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle IVzusammengestellt. Hieraus ergibt sich, dass das erfindungsgemässe Präparat in bezug auf die in vivo-IF-Bildung ebenso wirksam oder wirksamer ist als Poly-I:C.

Tabelle IV

Std. IF-Titer* (Einheiten/ml Serum)

nach der

Ver- erfindungsgemässes Poly-I:C

abfolgung Präparat

10 ng/kg

100 (ig/kg

10 ng/kg

100 ng/kg

0

. 25

35

20

20

1

180

300

180

250

2

2200

9500

1600

8000

4

800

5000

600

2000

8

280

350

200

300

11

160

240

100

150

24

40

90

60

80

* Der IF-Titer stellt den Mittelwert einer Gruppe von zwei

Kaninchen dar..

Die Eigenschaften des durch den erfindungsgemässen Induktor gebildeten IF werden im Hinblick auf Spezies-Spezifität der Wirtszellen, mangelnde Spezifität gegen infizierende Viren, Empfindlichkeit gegenüber Trypsin-Behandlung, Unempfind-lichkeit gegenüber Behandlung mit RNase und Behandlung beim pH-Wert 2 sowie Ultrazentrifugationsbehandlung (3 Stunden bei 100 000 g) untersucht. Es ergibt sich, dass das Material ausschliesslich aus IF besteht.

Versuchsbeispiel 4 Toxizitätstest

Die Wirkung des erfindungsgemässen Präparats und von Poly-I:C als Kontrolle auf die Vermehrung von gezüchteten Zellen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

wird untersucht. 4 ml Zellsuspension mit menschlichen Amnion-FL-Zellen (60x 104 Zellen/4 ml) in Wachstumsmedium werden in eine 5-ml-Kulturflasche gegeben. Gleichzeitig wird jeweils 1 ml Eagle-MEM mit einem Gehalt an 5,50 und 250,ug/ml zugesetzt, so dass sich endgültig eine 5fache Verdünnung ergibt. Die Zellen werden 6 Tage bei 37°C stationär gezüchtet.

Nach einer Züchtungsdauer von 2,4 und 6 Tagen werden jeweils 2 Flaschen einer jeden Gruppe entfernt. Die Zellen werden zur Entferung von schwimmenden Zellen mit Phosphatpuffer gewaschen. Die verbliebenen Zellen werden zur Ermittlung der Zellzahl mit Hilfe von Äthylendiamintetraacetat (EDTA) (0,02 Prozent) und Trypsin (0,25 Prozent) von der Glasoberfläche entfernt. Sodann werden die lebensfähigen Zellen durch Erythrocin B-Anfärbung unter Verwendung eines Hämozyten-Zählgeräts gezählt.

Die inTabelle Vzusammengestellten Ergebnisse zeigen, dass Poly-I:C in einer Konzentration von 1 ug/ml eine gewisse toxische Wirkung zeigt und bei 10 ug/ml deutlich toxisch ist, während bei einer Konzentration von 50 ug/ml fast keine Zellvermehrung beobachtet wird. Im Gegensatz dazu zeigt das erfindungsgemässe Präparat in einer Konzentration von 10 ug/ml oder darunter keinerlei Toxizität. Die Zellvermehrung ist auch bei einer Konzentration von 50 ug/ml im Vergleich zur Kontrolle nur geringfügig beeinträchtigt.

Die vorstehenden Versuche zeigen, dass das erfindungsgemässe Präparat einen IF-Induktor darstellt, dessen antivirale Aktivität etwa gleich gross oder höher als die von Poly-I: C ist, wobei das erfindungsgemässe Produkt eine geringere Toxizität als Poly-I:C aufweist.

Tabelle V

Konzentration des zugesetzten Induktors

Züchtungszeit in Tagen lebensfähige Zellen* (x 104 Zellen/Flasche)

erfindungsgemässes Poly-I :C Präparat

0 |xg/ml

0

62

62

2

112

112

4

168

168

6

273

273

1 ug/ml

0

62

62

2

126

88

4

183

133

6

286

219

10 [ig/ml

0

62

62

2

109

54

4

174

71

6

279

114

50 (xg/ml

0

62

62

2

99

37

4

154

45

6

247

83

* Die Anzahl der lebensfähigen Zellen stellt einen Mittelwert aus zwei Flaschen dar.

Versuchsbeispiel 5 Akute Toxizität Die akute Toxizität des erfindungsgemässen Präparats wird an männlichen C57 BL-Mäusen gemäss dem Verfahren von Lichied

651 317

und Wilcoxon, Journal of Pharmacology and Expérimental The-rapeutics, Bd. 90 (1949), S. 99 ermittelt. Bei intraperitonealer Verabfolgung des Präparats in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht bzw. bei einer intravenösen Verabfolgung in einer Dosis von 25 mg/kg treten keine Todesfälle bei den Mäusen auf.

Der LD50-Wert bei Mäusen liegt bei subkutaner Verabfolgung über 50 mg/kg und bei intravenöser Verabfolgung über 25 mg/kg.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemässen doppelstrangigen RNA. Wesentlich für die Erfindung ist die Tatsache, dass doppelstrangige RNA durch «Tempern» von RNA hergestellt wird, wobei die RNA durch Wirkung von RNA-Polymerase von geringer Schablonenspezifi-tät in Gegenwart von nativer Human-DNA als Schablone synthetisiert worden ist. Die nachstehenden Beispiele stellen eine Erläuterung dieses allgemeinen Prinzips dar. Die Angaben Prozent (Gew./Vol.) und Prozent (Vol./Vol.) geben den prozentualen Anteil der gelösten Bestandteile in Gewicht bzw. Volumen pro Lösungsvolumen an.

Beispiel 1

(1) Isolation und Reinigung von DNA aus Humanplazenta

Unmittelbar nach dem Geburtsvorgang eingefrorene und bei —20° C gelagerte Humanplazenta wird zerkleinert. 60 g davon werden mit 15 Volumina 6prozentigem Natrium-p-aminosali-cylat und 15 Volumina eines Phenol-Cresol-Gemisches (500 g Phenol, 70 ml m-Cresol, 55 ml Wasser und 0,5 g 8-Hydroxy-chinolin) versetzt. Das Gemisch wird 1 Minute mit einem Mischer bei maximaler Umdrehungsgeschwindigkeit homogenisiert. Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann zur Entfernung von denaturiertem Protein und von Phenol 30 Minuten bei 5° C und 6000 g zentrifu-giert. Der Überstand wird mit so viel Natriumchlorid, dass die endgültige Konzentration 3 Prozent (Gew./Vol.) beträgt, und wieder mit Phenol-Cresol-Gemisch entsprechend dem halben Volumen des Überstands versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann 10 Minuten bei 5° C und 800 g zentrifugiert.

Der Überstand wird mit 2 Volumina eines gekühlten Gemisches aus Äthanol und Cresol (Volumverhältnis 9:1) versetzt und zur Bildung eines Niederschlags vorsichtig vermischt. Nach dem Aufspulen des faserigen Niederschlags mit einem Glasstab wird die verbleibende Flüssigkeit 1 Stunde bei 2° C stehengelassen. Sodann wird der restliche Niederschlag abzentrifugiert. Die vereinigten Niederschläge werden gründlich mit einem ausreichenden Volumen an 75prozentigem Äthanol mit einem Gehalt an 2 Prozent Natriumacetat gewaschen und vollständig in 200 ml 0,1 mNatriumacetatlösung, die5millimolaranNatriumfluorid ist, gelöst. Diese Lösung wird anschliessend mit Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 3 m versetzt. Die Lösung wird 15 Stunden bei -2 bis -5° C stehengelassen und sodann 10 Minuten bei 5° C und 12 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird mit der gleichen Volumenmenge an kaltem Äthylenglykolmono-äthyläther (Äthylcellosolve) versetzt und vorsichtig vermischt, wobei sich ein weisser, faseriger Niederschlag bildet. Nach 20minütigem Stehenlassen in einem Eisbad wird der faserige Niederschlag mit einem Glasstab herausgenommen und in 300 ml 3 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0, der 5 millimolar an Natriumfluorid ist, dispergiert und gelöst. Nachdem der Lösungsvorgang fast vollständig ist, wird die Lösung 10 Minuten bei 5° C und 2000 g zentrifugiert, um restliche RNA und stark aggregierte DNA als Niederschlag zu entfernen.

Der Überstand wird mit dem gleichen Volumen an kaltem Äthylenglykolmonoäthyläther (Äthylcellosolve) versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten in einem Eisbad stehengelassen. Der gebildete faserige Niederschlag wird mit einem Glasstab aufgespult und sodann bei Raumtemperatur in 200 ml 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0, der 5 millimolar an Natrium-

7

5

10

15

20

25

30

35

.40

'45

50

• 55

' 60

65

651 317 8

fluorid ist, dispergiert und gelöst. Nachdem der Lösungsvorgang lOprozentigen Streptomycinsulfatlösung zugesetzt. Nach fast vollständig ist, wird die Lösung 90 Minuten bei 5° C und lOminütigem Rühren wird der gebildete Niederschlag durch

60 000 g zentrifugiert, wodurch Glycogen als Niederschlag abge- 30minütige Zentrifugation bei 5° C und 30 000 g abgetrennt. Der trennt wird. Überstand wird weitere 2 Stunden bei 5° C und 105 000 g zentrifu-

Der Überstand wird mit so viel Natriumacetat versetzt, dass 5 giert, wodurch Membranbestandteile und Ribosomenfraktionen sich eine Endkonzentration von 0,3 m ergibt. Sodann wird das entfèrnt werden.

gleiche Volumen an gekühltem Äthylenglykolmonoäthyläther 800 ml des bei der Ultrazentrifugation erhaltenen Überstands (Äthylcellosolve) zugegeben. Nach 20minütigem Stehenlassen in werden mit 110 ml 1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5

einem Eisbad wird der faserige Niederschlag mit einem Glasstab versetzt. Sodann werden weitere 160 ml einer 2,5prozentigen,

aufgespult und in 16 ml 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 10 nicht-neutralisierten Protaminsulfatlösung zugesetzt, um RNA-

6,0, der 5 millimolar an Natriumfluorid ist, gelöst. Polymerase als Komplex mit Protaminsulfat auszufällen. Nach

Nach vollständiger Auflösung wird die Lösung in einen Di- lOminütigem Rühren wird der Überstand durch lOminütige alyseschlauch übertragen und 48 Stunden bei 2 bis 5° C gegen Zentrifugation bei 5° C und 20 000 g gewonnen. Der Niederschlag

200 ml destilliertes Wasser dialysiert, wobei die äussere Dialyse- wird in 180 ml 0,2 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit flüssigkeit fünfmal gewechselt wird. Das Dialysat wird zur Ent- 15 einem Gehalt an 0,2 m Saccharose homogenisiert, um die RNA-

fernung von unlöslichen Bestandteilen zentrifugiert. Die DNA- Polymerase zu eluieren. Nach lOminütigem Rühren wird die

Konzentration wird durch Messung der Absorption des verdünn- Suspension 10 Minuten bei 5° C und 30 000 g zentrifugiert. Der ten Überstands bei 260 nm ermittelt. Überstand wird mit 360 ml 0,lprozentiger, nicht-neutralisierter

Die Berechnung der Konzentration erfolgt unter Zugrunde- Protaminsulfatlösung versetzt. Die RNA-Polymerase wird wie-

legung einer Absorption einer DNA-Lösung mit einem Gehalt 20 der als Komplex mit Protaminsulfat ausgefällt. Nach lOminüti-

an 1 mg/ml bei 260 nm von 20. Lösungen mit einem Gehalt an gern Rühren der Suspension wird 15 Minuten bei 5° C und 20 000 g

6,5 mg DNA werden in 10 ml fassende Fläschchen gegeben und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 50 ml 0,14 m Kaliumphos-

lyophilisiert. Nach diesem Verfahren werden insgesamt 40 mg phatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,2 m Saccha-

Human-DN A erhalten. Zur Reinheitsbestimmung des erhalte- rose homogenisiert. Sodann wird 10 Minuten bei 5° C und 30000 g nen DNA-Präparats wird die Proteinmenge gemäss Lowry und zentrifugiert. Die vereinigten Niederschläge werden in 30 ml

Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 193 (1951), S. 265 und die RNA- 0,2 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt

Menge gemäs Mizuno, Shigeki Mizuno: «General Method of an 0,2 m Saccharose homogenisiert, um die RNA-Polymerase zu

Isolation Quantitative Analysis of Nucleic Acid», Hrsg. Ujitani eluieren. Nach lOminütigem Rühren wird die Suspension 15

und Mitarb., Tokyo University Publication, 1969, S. 23 (Verbes- Minuten bei 5° C und 30 000 g zentrifugiert. Der Überstand (30

serung des Verfahrens «Fraktionierende, quantitative DNA- 30 ml) wird mit 7,27 g Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine

RNA-Analyse» gemäss Schmidt-T annhauser-Schneider) 40prozentige Sättigung zur Durchführung einer fraktionierenden bestimmt. Die Proteinmenge beträgt 0,4 Prozent, bezogen auf Fällung mit Ammoniumsulfat entsteht. 15 Minuten nach der

Albumin von Humanplazenta und die RNA-Menge 4,8 Prozent, Zugabe von Ammoniumsulfat wird die Suspension 10 Minuten bezogen auf Gesamtnucleotide. bei 5° C und 30 000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 5 ml

35 0,02 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an

(2) Reinigung von RNA-Polymerase 0,3 m Ammoniumsulfat gelöst und mit einem gleichen Volumen

Micrococcus lysodeiticus wird in einem Fermentationsgefäss an Glycerin versetzt. Die Lösung wird mit der 2,5fachen Menge

(Jar Fermenter) gezüchtet. Beim Erreichen der späten logarith- m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 verdünnt und über eine mischen Wachstumsphase wird geerntet. Die Zellen werden CM-Cellulosesäule in einem Glasfilter, die unter Verwendung eingefroren und bei -20° C gelagert. 400 g gefrorene Zellen von 2,4 g CM-Cellulose hergestellt worden ist, gegeben, um die werden in 2 Liter 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 Ribonucleasen zu entfernen. Die Säule wird mit 0,01 m Tris-HCl-

dispergiert. Die auf diese gewaschenen Zellen werden durch Puffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 20 Prozent

Zentrifugieren gewonnen und sodann in 0,01 m Tris-HCl-Puffer Glycerin und 0,06 m Ammoniumsulfat gewaschen. Das Eluat vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,2 m Saccharose bis zu wird über eine CM-Cellulosesäule, die aus 0,8 g CM-Cellulose einem Gesamtvolumen von 2 Liter dispergiert. Diese Suspension hergestellt worden ist, gegeben. Nach dem Waschen der Säule wird mit 600 mg Hühnereiweiss-Lysozym versetzt. Die Suspen- werden 80 ml des gesamten Eluats zur Durchführung einer sion wird bei 30°C inkubiert. Nach 15minütiger Inkubation Ammoniumsulfatfällung mit 22,2 g Ammoniumsulfat versetzt,

werden 6 ml 0,1 m MgCl2 zugesetzt. Zur Zerstörung der Zell- 15 Minuten danach wird der gebildete Niederschlag durch wände wird weitere 45 Minuten inkubiert. Anschliessend werden 15minütige Zentrifugation bei 5°C und 30 000 ggewonnen. Der

18 mg 0,1 m MgCl2 und 2400 ml eisgekühltes Wasser zugegeben. auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in 4 ml 0,02 m Tris-

Das Gemisch wird in einem Eisbad heftig gerührt. (Auch die HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,3 m folgenden Verfahrensschritte werden alle in einem Eisbad durch- Ammoniumsulfat gelöst. Sodann wird ein entsprechendes Volu-

geführt). 10 Minuten später werden 600 ml lOprozentige (Gew./ men an Glycerin zugesetzt. Das Präparat wird bis zur Verwen-

Vol.) Streptomycinsulfatlösung zugesetzt. Weitere 10 Minuten dung bei —70°C gelagert.

später wird der gebildete Niederschlag 10 Minuten bei 5° C und

20 000 g zentrifugiert. Anschliessend wird der Niederschlag in Aus 400 g gefrorenen Zellen erhält man 43 mg eines RNA-

800 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 mit einem Polymerase-Präparats mit einer spezifischen Aktivität von

Gehalt an 0,2 m Saccharose, 0,1 Prozent Streptomycinsulfat und 190 Einheiten pro mg Protein (die Gesamtaktivität beträgt

0,00025 m MgCl2 suspendiert. Weitere 10 Minuten danach wird 60 ^200 Einheiten). Das Absorptionsverhältnis 280.260 nm beträgt die Suspension 10 Minuten bei 5° C und 20 000 g zentrifugiert. 1'55.

Der Niederschlag wird in 720 ml einer Lösung, die durch 1 Enzymeinheit ist definiert als die Enzymmenge, die den

Vermischen von 8 ml 1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert Einbau von 1 nMol C-ATP bei lOminütiger Inkubation m TC A-

7,58ml0,lmMgCl2und80ml2mSaccharoseundVerdünnen unlösliches Material katalysiert.

des Gemisches mit destilliertem Wasser auf720 ml hergestellt worden ist, unter Verwendung eines Potter-Elvejhem-Teflon- 65 ß) Synthese, Isolation und Reinigung von RNA

Homogenisators homogenisiert. Die bei der RNA-Synthese verwendeten Reagentien entspre-

Das Homogenisat wird mit 32 ml 0,1 m Kaliumphosphatpuffer chen denen des RNA-Polymerase-Bestimmungssystems gemäss vom pH-Wert 7,5 versetzt. 10 Minuten später werden 70 ml einer Weiss, Methods Enzymol., Bd. 12 (1968), S. 559. Die in der

651 317

nachstehenden Tabelle VI angegebenen Reagentien werden in 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst.

Tabelle VI

Reagentien im RNA-Synthesesystem, Gesamtvolumen 500 ml

Reagentien

Konzentration

Gesamtmenge gereinigt RNA-

20 Einheiten/ml

10000 Einheiten

Polymerase

Humanplazenta-DNA

200 ug/ml

100 mg

ATP

0,4 millimolar

200 fiMol

CTP

0,4 millimolar

200 [iMol

UTP

0,4 millimolar

200 (iMol

GTP

0,4 millimolar

200 (xMol

MnCl2

2,5 millimolar

1250 uMol nicht-neutralisiertes

1 millimolar

1000 piMol

Spermidin-trihydro-

chlorid

Tris-HCl vom

0,1 m

50 mMol pH-Wert 7,5

Die vorgenannten Reagentien werden gründlich vermischt und 3 Stunden bei 30° C in einem Wasserbad inkubiert. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad zur Beendigung der Reaktion abgekühlt und hierauf zur Inaktivie-rung von RNA-Polymerase 5 Minuten auf 65° C erwärmt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch mit Leitungswasser auf etwa 37° C gekühlt und mit 56 ml 1 m MgCl2 versetzt, wodurch sich eine 10 millimolare Lösung ergibt. Ferner werden 5,6 mg DNase (frei von Ribonuclease) zugesetzt. Zum Abbau von DNA wird 30 Minuten bei 37° C inkubiert.

Sodann wird das Reaktionsgemisch zur Inaktivierung der DNase 3 Minuten auf 100° C erwärmt und anschliessend mit Leitungswasser auf Raumtemperatur abgekühlt. Hierauf werden 560 ml SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der doppelten Konzentration und 1120 ml eines Phenol-Cresol-Gemisches (500 g Phenol, 70 ml m Cresol, 55 ml Wasser und 0,5 g 8-Hydroxychinolin) zugesetzt.

Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und sodann 10 Minuten bei 5° C und 5000 g zentrifugiert. Der Überstand wird von der Phenolschicht abgetrennt. Die denaturierte Proteinphase wird nochmals mit der Hälfte des Volumens des vorgenannten Phenol-Cresol-Gemisches versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.

Der durch Zentrifugation erhaltene Überstand wird gegen 5 Liter SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der doppelten Konzentration, die 0,05 Prozent Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, 1 Stunde bei Raumtemperatur dialysiert. Ferner wird nach Austausch des Dialysebads eine weitere Stunde dialysiert. Hierauf wird das Dialysebad durch 5 Liter SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der 0,01fachen Konzentration ersetzt. Die Dialyse wird über Nacht bei 2 bis 5° C durchgeführt. Das Dialysat (890 ml) wird unter Verwendung eines Hohlfasermembranfilters ultrafiltriert und auf 19 ml eingeengt.

In diesem ultrafiltrierten Konzentrat (19 ml) werden 19 g CsCl gelöst. Ansschliessend wird das Gesamtvolumen durch Zusatz vonO.Ol mTris-HCl-PuffervompH-Wert7,5, der CsCl in einer Menge von 1 g pro 1 ml Pufferlösung enthält, auf 26 ml eingestellt. Diese Lösung (26 ml) wird auf 7,8 ml 5,7 m CsCl vom pH-Wert 6,5 mit einem Gehalt an 0,1 m EDTA geschichtet. Anschliessend werden 1,3 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 überschichtet. Hierauf wird unter Verwendung eines Spinco S W 27-Rotors 15 Stunden bei 15° C und 27 000 U/min (130000 g) zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt. Die RNA im klaren Zentrifugationsrückstand (Pellet) wird in 3 ml

0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die erhaltene Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und mit dem doppelten Volumen an Äthanol versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei —20° C stehengelassen. Anschliessend wird der gebildete Nieder-5 schlag durch Zentrifugation bei geringer Tourenzahl gesammelt. Der Überstand wird entfernt und der Niederschlag wieder in 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst.

Die Ausbeute an gereinigter RNA beträgt 8,6 mg. Dieser Wert wird aus der Beziehung A260 = 22 (A260 bedeutet die Absorption m bei 260 nm einer Lösung von 1 mg RNA pro 1 ml) berechnet.

Durch Zusatz von 50 Prozent TCA werden etwa 80 Prozent der gereinigten RNA als TCA-unlösliche Fraktion ausgefällt. Der Sedimentationskoeffizient der gereinigten RNA, gemessen durch Zentrifugation im Saccharose-Dichtegradienten unter 15 Verwendung von ribosomaler RNA aus Mäuse L-Zellen als Standard, beträgt etwa 12 s.

(4) Tempern von RNA

3 mg gereinigte RNA werden in 4,8 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die Lösung wird mit 1,2 ml SSC-Lösung vompH-Wert7,0der lOfachen Konzentration versetzt, so dass die RNA-Konzentration in der SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 von 2facher Konzentration 500 [xg/ml beträgt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird in ein verstöpseltes Glasreagenzglas gebracht, 5 Minuten auf 100°C erwärmt, rasch in einem Eisbad abgekühlt und anschliessend in ein Wasserbad von 85° C gestellt. Die Temperatur des Wasserbads wird innerhalb von 2 Stunden allmählich auf 65° C gesenkt. Sodann wird weitere 4 Stunden bei 65° C umgesetzt. Anschliessend wird die Wärmequelle des Wasserbads abgestellt. Hierauf lässt man das Wasserbad über Nacht allmählich auf Raumtemperatur abkühlen.

Der Sedimentationskoeffizient der getemperten RNA wird durch Zentrifugation im Saccharose-Dichtegradienten bestimmt. Es ergibt sich ein Maximum bei 12 s, was im Vergleich mit dem Zustand vor dem Tempern praktisch keinen Unterschied bedeutet. Jedoch wird im Bereich oberhalb 28 s ein kleines neues Maximum beobachtet.

Die Ribonuclease-Beständigkeit der getemperten RNA (teils RNA-RNA-Hybrid, teils doppelstrangige RNA) wird gemäss dem Verfahren von Gumport und Mitarb. bestimmt. 30 ngder getemperten RNA werden mit 30 jxg Ribonuclease aus Rinder-pankreas und 3 |ig Ribonuclease-Tj in SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der 2fachen Konzentration 30 Minuten bei 37°C behandelt.

20

25

30

35

40

^ Man erhält 13,3 Prozent einer in TCA unlöslichen Fraktion, die unabgebaut auf einem Millipore-Filter (0,45 [im) verbleibt. Ferner werden 30|ig der Probe in SSC-Lösung der 0,3fachen Konzentration 5 Minuten auf 100° C erwärmt und rasch in einem Eisbad abgekühlt. Das so vorbehandelte Präparat wird der Ribonuclease-Behandlung in SSC-Lösung der 2fachen Konzentration gemäss den vorstehenden Angaben unterzogen. Es werden 2,3 Prozent einer in TCA unlöslichen Fraktion auf dem Filter in nicht abgebauter Form gesammelt.

Die getemperte RNA wird durch Fällung mit Äthanol gemäss einem üblichen Verfahren gewonnen; vgl. Parish & Kirby, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 129 (1966), S. 554. Der Niederschlag wird gegen destillliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird steril filtriert, in 2 Fläschchen verteilt und der Lyophilisation unterworfen. Die auf diese Weise erhaltenen Präparate sind IF-Induktoren, deren physikalsiche, chemische und biologische Eigenschaften in den Versuchsbeispielen 1 bis 5 angegeben sind.

45

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60

Beispiel 2

(1) Isolation und Reinigung von DNA aus Humanplazenta 65 Die Reinigung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt.

(2) Reinigung von RNA-Polymerase aus E. coli E. coli Stamm K-12 wird in einem Fermenter in Nährbrühe

651 317

10

gezüchtet und in der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die Zellen werden bei —20° C in gefrorenem Zustand gelagert. 250 g Zellen werden in 750 ml Grinding-Puffer (0,05 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,9 mit einem Gehalt an 5 Prozent (Vol./ Vol.) Glycerin, 2 millimolar EDTA, 0,1 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar 2-Mercaptoäthanol, 0,233 mNaCl, 130 [ig/mlHüh-nereiweiss-Lysozym und 23 ug/ml Phenylmethansulfonylchlorid) suspendiert und 20 Minuten bei 8° C stehengelassen. Anschliessend werden 0,0125 Volumteile einer 4prozentigen Natriumde-soxycholat-Lösung (DOC) zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Sekunden gerührt. Nach 20minütigem Stehenlassen wird weitere 30 Sekunden gerührt. Hierauf werden 1000 ml TGED + 0,2 m NaCl (TGED bedeutet 0,91m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert7,9 mit einem Gehalt an5 Prozent (Vol./Vol.) Glycerin, 0,1 millimolar EDTA und 0,1 millimolar Dithiothreit; TGED + 0,2 m NaCl bedeutet TGED mit einem Gehalt an 0,2 m NaCl) zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten heftig gerührt. Anschliessend wird die Suspension 45 Minuten bei 4° C und 10 000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit dem 0,075fachen Volumen 5prozentiger Polymin P-Lösung (Fluka AG, Schweiz) vom pH-Wert 7,9 versetzt. 5 Minuten danach wird der gebildete Niederschlag 15 Minuten bei 4° C und 6000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wird in TGED + 0,5 mNaCl (TGED mit einem Gehalt an 0,5 m NaCl) homogenisiert. Das Homogenisat wird 10 Minuten bei 4° C gerührt. Sodann wird das Homogenisat 30 Minuten bei 4° C und 6000 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird in TGED +1,0 m NaCl (TGED mit einem Gehalt an 1,0 NaCl) homogenisiert und 10 Minuten bei 4° C gerührt. Sodann wird das Homogenisat 30 Minuten bei 4° C und 6000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit Ammoniumsulfat in einer Menge von 35 g/100 ml versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei 4° C wird die Suspension 45 Minuten bei 4° C und 10 000 g zentrifugiert. Der gebildete Niederschlag wird in 700 ml TGED gelöst.

Die Lösung wird über eine mit Kalbsthymus-DNA-Agarose gepackte Säule der Abmessungen 2,6 x 15 cm (hergestellt gemäss Schallar und Mitarb., Eur. J. Biochem. Bd. 26 (1972), S. 474 gegeben, um die RNA-Polymerase zu adsorbieren. Die Säule wird mit 500 ml TGED + 0,15 m NaCl (TGED mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl) und anschliessend mit 500 ml TGED + 0,3 m NaCl (TGED mit einem Gehalt an 0,3 m NaCl) gewaschen. Hierauf werden 500 ml TGED +1,2 m NaCl (TGED mit einem Gehalt an 1,2 m NaCl) über die Säule gegegen, um die RNA-Polymerase zu eluieren. Das Eluat wird mit Ammoniumsulfat in einer Menge von 35 g/100 ml versetzt und 30 Minuten bei 4° C gerührt. Die gebildete Suspension wird 30 Minuten bei 4°Cund 10000 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird in 7 ml TGED + 0,5 m NaCl 4- 30 Prozent Gylcerin (TGED + 0,5 m NaCl mit der Abänderung, dass 30 Prozent Glycerin anstelle von 5 Prozent enthalten sind) gelöst. Die Lösung wird in 2 bis 3 gleiche Teile unterteilt. Die einzelnen Teile werden an einer mit Polyacrylamidgel (Biogel A 5 m der Biogel Co., V.St. A.) gepackten Säule der Abmessungen 2x110 cm, die mit TGED + 0,5 m NaCl äquilibriert worden ist, der Gelfiltration unterworfen . Die Elution wird mit TGED + 0,5 m NaCl durchgeführt. Die Fraktionen mit RNA-Polymerase-Aktivität im Eluat werden gesammelt und zur RNA-Synthese verwendet.

Die spezifische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen RNA-Polymerase beträgt 320 Einheiten/mg Protein, bestimmt gemäss Burgess, J. Biol. Chem., Bd. 244, S. 6160, unter Verwendung von Kalbsthymus-DNA als Schablone.

1 Enzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die den Einbau von 1 nMol 14C-ATP in TCA-unlösliches Material bei lOminütiger Inkubation katalysiert.

Das Absorptionsverhältnis (A2SI|/A2wi) beträgt 1,86. Die Gesamtaktivität der erhaltenen RNA-Polymerase aus 250 g gefrorenen Zellen beträgt 30 000 Einheiten und die Gesamtproteinmenge 96 mg.

(3) Synthese, Isolation und Reinigung von RNA Die Reagentien für die RNA-Synthese sind in Tabelle VII zusammengestellt. Diese Reagentien werden in 0,04 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,9 gelöst.

Tabelle VII

Reagentien im RNA-Synthesesystem, Gesamtvolumen 150 ml

10

15

20

25

Reagentien

Konzentration

Gesamtmenge

RNA-Polymerase

20 Einheiten/ml

3000 Einheiten

Humanplazenta-DN A

200 ug/ml

30 mg

ATP

0,6 millimolar

90 uMol

CTP

0,6 millimolar

90 jiMol

GTP

0,6 millimolar

90 |iMol

UTP

0,6 millimolar

90 (xMol

KCl

50 millimolar

7,5 mMol

MnCli

1 millimolar

150 [iMol

MgCl2

4 millimolar

600 |xMol

2-Mercaptoäthanol

0,5 millimolar

75 mMol

Tris-HCl-Puffer

0,04 m

6 mMol vom pH-Wert 7,9

Die vorstehend aufgeführten Reagentien werden gründlich vermischt und 3 Stunden bei 37° C inkubiert. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt, um die Reaktion zu beenden. Hierauf wird zur Inaktivierung von RNA-30 Polymerase 5 Minuten auf 65° C erwärmt.

Nach Abkühlung des Reaktionsgemisches mit Leitungswasser auf 37° C werden 16,7 ml 0,1 m MgCl2-Lösung zugesetzt,

wodurch eine 10 millimolare Lösung entsteht. Ferner werden 1,7 mg Desoxyribonuclease (frei von Ribonuclease) zugesetzt. 35 Zum Abbau von DNA wird 30 Minuten bei 37° C inkubiert.

Hierauf wird das Reaktionsgemisch 3 Minuten auf 100° C erwärmt, um die Desoxyribonuclease zu inaktivieren. Hierauf wird mit Leitungswasser auf Raumtemperatur abgekühlt.

Anschliessend werden 170 ml SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der 40 2f achen Konzentration und 340 ml eines Phenol-Cresol-Gemi-sches (500 g Phenol, 70 ml m Cresol, 55 ml Wasser und 0,5 g 8-Hydroxychinolin) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und sodann 10 Minuten bei 5° C und 5000 g zentrifugiert. Der von der Phenolphase 45 und der denaturierten Proteinphase abgetrennte Überstand wird mit dem vorerwähnten Phenol-Cresol-Gemisch entsprechend der halben Volumenmenge versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.

Die Emulsion wird zentrifugiert. Der Überstand wird gegen 50 5 Liter SSC-Lösung vom pH-Wert 7,5 der 2fachen Konzentration mit einem Gehalt an 0,05 Prozent SDS1 Stunde bei Raumtemperatur dialysiert. Nach Austausch des Dialysebads wird eine weitere Stunde dialysiert. Anschliessend wird das Dialysebad durch 5 Liter SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der 0,01fachen 55 Konzentration ersetzt. Die Dialyse wird sodann über Nacht bei 2 bis 5° C durchgeführt. Das Dialysat (310 ml) wird unter Verwendung eines Hohlfaser-Membranfilters ultrafiltriert und auf 19 ml eingeengt.

Im ultrafiltrierten Konzentrat (19 ml) werden 19 g CsCl gelöst. 60 Ansschliessend wird das Gesamtvolumen durch Zugabe von 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an CsCl in einer Menge von 1 g pro 1 ml Pufferlösung auf 26 ml eingestellt. Die Lösung (26 ml) wird auf 7,8 ml 5,7 m CsCl-Lösung vom pH-Wert 6,5 mit einem Gehalt an 0,1 m EDTA 65 geschichtet. Anschliessend werden 1,3 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 überschichtet. Das Gemisch wird 15 Stunden mit einem Spinco SW 27-Rotor bei 15° C und 27 000 U/min (130000 g) zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und die RNA im klaren Pellet in 3 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die erhaltene Lösung wird in einem Eisbad abgekühlt. Nach Zusatz des 2fachen Volumens an gekühltem Äthanol wird 1 Stunde bei -20° C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugation bei geringer Tourenzahl gesammelt. Der Überstand wird entfernt. Der Niederschlag wird wieder in 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst.

Die Ausbeute an gereinigter RNA beträgt 9,0 mg, berechnet aus der Beziehung A260 = 22, wobei A26n die Absorption bei 260 nm einer RNA-Lösung mit einem Gehalt an 1 mg/ml bedeutet.

Durch Zusatz von 50 Prozent TCA werden etwa 90 Prozent der gereinigten RNA als TCA-unlösliche Fraktion ausgefällt. Der Sedimentationskoeffizient der gereinigten RNA, gemessen durch Zentrifugation im Saccharose-Dichtegradienten unter Verwendung von ribosomaler RNA aus Mäuse-L-Zellen als Eichsubstanz beträgt etwa Iis.

(4) Tempern der RNA

3 mg gereinigte RNA werden in 12,0 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst. 3,0 ml SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der lOfachen Konzentration werden zugesetzt, so dass die RNA-Konzentration in der SSC-Lösung der 2fachen Konzentration 200 ug/ml beträgt. Die erhaltene Lösung wird in ein mit einem Stöpsel versehenes Glasreagenzglas gebracht, 5 Minuten auf 100° C erwärmt, rasch auf einem Eisbad abgekühlt und anschliessend in ein Wasserbad von 85° C gestellt. Die Temperatur des Wasserbads wird allmählich innerhalb von 2 Stunden auf 65° C gesenkt. Sodann wird die Umsetzung weitere 4 Stunden bei 65° C duchgeführt. Anschliessend wird die Wärmequelle des

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Wasserbads entfernt und die Lösung über Nacht allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt.

Der Sedimentationskoeffizient der getemperten RNA wird durch Zentrifugation im Saccharose-Dichtegradienten 5 bestimmt. Man beobachtet ein Maximum bei 11 s, was praktisch keinen Unterschied im Vergleich zum Zustand vor dem Tempern bedeutet. Jedoch tritt im Bereich oberhalb 28 s ein kleines, neues Maximum auf.

Die Ribonuclease-Beständigkeit der getemperten RNA (teils 10 RNA-RNA-Hybrid, teils doppelstrangige RNA) wird gemäss dem Verfahren von GumportundMitarb. bestimmt. 30 ng getemperte RNA werden mit 30 (ig Ribonuclease aus Rinderpan-kreas und 3 [xg Ribonuclease-Ti in einer SSC-Lösung vom pH-Wert 7,0 der 2fachen Konzentration 30 Minuten bei 37° C 15 behandelt, wonach 12,0 Prozent einer nicht-abgebauten, in TCA unlöslichen Fraktion auf einem Millipore-Filter (0,45 |im) verbleiben. Ferner werden 30[ig der Probe in einer SSC-Lösung der 0,3fachen Konzentration 5 Minutenf auf 100° C erwärmt und sodann rasch in einem Eisbad abgekühlt. Anschliessend wird die 20 vorerwähnte Behandlung mit Ribonuclease durchgeführt. 3,3 Prozent einer nicht-abgebauten, in TCA unlöslichen Fraktion verbleiben auf dem Filter.

Die getemperte RNA wird durch Äthanolfällung gemäss 25 einem herkömmlichen Verfahren gewonnen; vgl. Parish &

Kirby, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 129 (1966), S: 554. Der Niederschlag wird gegen destillliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird durch Filtration sterilisiert, in 2 Fläschchen verteilt und schliesslich der Lyophilisation unterzogen. Die Basenzusam-30 mensetzung der auf diese Weise erhaltenen gereinigten RNA beträgt 27,3 Prozent Adenylsäure, 21,5 Prozent Guanylsäure, 18,5 Prozent Cytidylsäure und 32,7 Prozent Uridylsäure.

M

4 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

651 317

1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von doppelstrangi-ger RNA unter Verwendung von nativer Human-DNA als Schablone, dadurch gekennzeichnet, dass man Adenosintriphos-phat, Guanosintriphosphat, CytosintriphosphatundUridintri-phosphat miteinander in Gegenwart von nativer Human-DNA unter der katalytischen Wirkung einer aktiven RNA-Polymerase unter Bildung von RNA umsetzt und die erhaltene RNA durch Erwärmen auf Temperaturen von 70 bis 100° C und allmähliches Abkühlen auf Raumtemperatur oder darunter unter Bildung von doppelstrangigen Bereichen zwischen den Molekülen tempert.

2. Verfahrennach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als aktive RNA-Polymerase eine aktive, DNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man RNA-Polymerase aus Micrococcus lysodeikticus verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aktive RNA-Polymerase aus Escherichia coli verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in einem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 bis 8,0 durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung 1 bis 10 Stunden bei Temperaturen von 20 bis 40° C durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung 2 bis 4 Stunden durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die gebildete RNA vor dem Tempern reinigt und isoliert, indem man sie von Protein befreit und der Zentrifugation auf einem CsCl-«Kissen» zentrifugiert und anschliessend einer Äthanolfällung unterzieht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Temperungsbehandlung nach Erwärmen der gebildeten RNA auf Temperaturen von 70 bis 100° C und anschliessendes rasches Abkühlen auf Raumtemperatur oder darunter durchführt.

10. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 synthetisierte doppelstrangige RNA, in welcher der doppelstrangige Rest in einer Menge von mindestens 4 % zwischen ihren Molekülen vorliegt, wobei das Molekulargewicht in Sedimentationskoeffizienten ausgedrückt 11 bis 13s beträgt, bei Zentrifugation im Saccharosedichtegradenten gemessen, die Basenzusammensetzung 27,0 bis 30,5 Mol-Prozent Adenylsäure, 20,6 bis 24,7 Mol-Prozent Guanylsäure, 16,8 bis 24,3 Mol-Prozent Cytidylsäure und 27,8 bis 32,7 Mol-Prozent Uridylsäure, die Dichtein Cs2S04 1,635 bis 1,640 und die thermische Denaturierung von 0,lfacher SSC (Standard-Kochsalz-Citratlösung) 71° C beträgt, mit ultra- 1 violettem Absorptionsspektrum gemäss Figur 2, thermischer Denaturierung gemäss Figur 3 und einem Absorptionsverhältnis bei 25 bis 90° C gemäss Figur 4.

11. Interferon-Induktor, enthaltend eine wirksame Menge einer doppelstrangigen RNA gemäss Anspurch 10.