DE19860541A1

DE19860541A1 - Pharazeutische Formulierung enthaltend glycosaminoglycanspaltendes Enzym

Info

Publication number: DE19860541A1
Application number: DE1998160541
Authority: DE
Inventors: Peter-Juergen Mueller; Joerg-Hermann Ozegowski; Albert Haerl; Norbert Presselt; Gundela Peschel
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Id Pharma 07743 Jena De GmbH
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2000-06-29

Abstract

Die Erfindung beinhaltet pharmazeutische Formulierungen für Injektionspräparate mit einer therapeutischen Anwendung bei Gefäßkrankheiten von Mensch und Tier, die als Folge von atheromatösen Ablagerungen auf den Innenwänden der Arterien auftreten. Die Injektionspräparate enthalten eine Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft bzw. ein aus diesem Enzym hergestelltes Enzymfragment.

Description

Auf der Arterieninnenwand, der Intima, lagern sich bei Menschen als auch bei Säugetieren mit zunehmendem Alter hydrophobe Plaques ab, die zu einer Verhärtung der Arterienwände, zu Läsionen und zu einer Verringerung des Innenlumens der Gefäße führen. In Folge dieser Gefäßveränderung sind pathologische Erscheinungen, wie Herzarrythmien, Thrombusbildung und Thrombosen, zerebale Infarkte, zerebrale Thrombosen, Bluthochdruck und eine Verminderung der Blutversorgung in engem Zusammenhang.

Die Erfindung betrifft ein Enzym, welches bei intraarterieller oder intravenöser Anwendung das Ausmaß der mit Plaques belegten Flächen der Intima verringert bzw. deren Auswirkung auf den Blutdurchfluß vermindert.

Das vorgeschlagene Enzym, eine Hyaluronatlyase, oder ein aus ihm gewonnenes Fragment besitzen Glycosaminoglycan-spaltende Aktivität und ist vor allem durch bevorzugten Abbau von Hyaluronsäure charakterisiert.

Zu den Glycosaminoglycanen gehören neben der Hyaluronsäure das Chondroitinsulfat, das Dermatansulfat und Heparansulfat. Die Glycosaminoglycane kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure ist besonders in der interzellularen Matrix in der Haut und des Knorpelgewebes sowie in Körperflüssigkeiten, wie Gelenkflüssigkeit und Kammerwasser der Augen vorhanden. Zusammen mit den anderen Glycosaminoglycanen ist es in den Wänden der Blutgefäße, insbesondere auch in den atheromatösen Ablagerungen bzw. Plaques auf den Arterieninnenwänden enthalten. Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokolloider Lösungen zu binden oder mit basischen Proteinen schwerlösliche Polyelektrolytkomplexe zu bilden. Sie besteht aus Glucuronsäure und acetyliertem Glucosamin, die durch β-(1-3)- glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische β-(1-4)-Bindungen verbunden. Hyaluronsäure wird durch Hyaluronidasen gespalten.

Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht ganz korrekt drei unterschiedlich wirkende hyaluronsäurespaltende Enzymtypen (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, (1961)). Es sind einmal die Endohydrolasen, die die β-(1-3)- Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese Hyaluronat-Glycanhydrolasen (E.C. 3.2.1.35/36) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glycosaminoglycane. Einen weiteren Typ stellt die Endo-β-Hyaluronidase aus dem Blutegel dar, welche die β-(1-4)- Bindung hochspezifisch spaltet. Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyase (EC 4.2.99.1), spaltet die Hyaluronsäure in der β(1-4)- Bindungen nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glucuronsäure. Hyaluronatlyase sind häufig mikrobieller Herkunft. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre hohe Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glycosaminoglycane werden in der Regel in einem vernachlässsigbaren Ausmaß gespalten (J.-H. Ozegowski et. al. Puriflcation and characterization of Hyaluronidase from Streptococcus agalactiae, Zbl. Bakt. 280, 497-506 (1994), A. Linker et al. The production of unsaturated uronides by bacterial hyaluronidases, JBC 219 13-25, (1956), T. Ohya, Y. Kaneko: Novel hyaluronidase from Streptomyces, BBA 198 (1970), 607-609 and K. Gase, J.-H.

Ozegowski, and H. Malke: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronat lyase completion of the sequence and expression analysis, BBA, 1998, 86-98).

Hyaluronidasen aus Tierhoden werden eingesetzt, um tierisches bzw. menschliches Gewebe durchlässiger zu machen. Hyaluronidase aus Rinderhoden dient als Resorptionsbeschleuniger subkutan verabreichter Arzneimittel und zur schnelleren Rückbildung von Ödemen. Gute Wirkungen wurden bereits in den 60er Jahren mit hochdosierter, intravenös verabreichter Rinderhoden-Hylase "Dessau" bei akuter Tendovaginitis und Paratenonitis crepitans, bei der intravenösen Behandlung des plantaren Fersensporns und in der Dermatologie erzielt. So kam es bei progressiver Sklerodermie, bei zirkumskripter Sklerodermie und bei Keloiden nach Hyaluronidase- Behandlung zu einer wesentlichen Verringerung der Beschwerden.

Sawyer et. al. (EU 193330 B1) beschreiben die Herstellung und Anwendung einer speziellen Endo-β-glucuronidase mit einer Molmasse von 28.500 D aus einem Blutegel zur Stimulierung des Flußes physiologischer Flüssigkeiten bei Augenkrankheiten. Dieses Enzym ist hochspezifisch für Hyaluronsäure und unterscheidet sich von einer bekannten Endo-β-glucuronidase aus dem Blutegel (Hirudo medicinalis) durch eine höhere Stabilität bei höheren Temperaturen und extremen pH-Werten.

In den 70er Jahren wurde versucht, die Spätfolgen des Herzinfarktes im Tiermodell mit Hyaluronidasen zu beeinflussen. Ziel der Studien war eine Verkleinerung der kardialen Nekroseareale bedingt durch die beschleunigte Gefäßneubildung nach dem Infarkt und eine Verbesserung der periphären Durchblutung.

Seit den 60er Jahren gibt es Literaturhinweise, daß Rinderhoden-Hyaluronidase zur therapeutischen Beeinflussung arterieller Gefäßerkrankungen beim Menschen, insbesondere zur Durchblutungsverbesserung der peripheren Gefäße eingesetzt werden kann (z. B. Thurnherr und Koch, zit. bei Wolff: Behandlungsergebnisse mit intravenösen Magnesium comp./Hylase-Mischinjektionen bei Arteriopathien vom Beckentyp im Stadium II. Z. ärztl. Fortbild., 1972, 66, 446-447). So berichtete Wolff, daß Hyaluronidase aus Rinderhoden bei gleichzeitiger Anwendung von Magnesiumionen, intravenös appliziert (Mischinjektion, wöchentlich drei mal 300 IU über 6 Wochen), bei 90% der untersuchten Patienten mit Arteriopathie vom Beckentyp im Stadium II, die Durchblutung der Gefäße verbessert. Grosshennig (in: Ergebnisse der Behandlung degenerativer arterieller Gefäßerkrankungen der unteren Extremitäten mit intravenösen Gaben von Magnesium compositum "Scharffenberg" und Hyaluronidase. Dtsch. Ges.- wesen, 1965, 21, 869-872) führte eine ähnliche Mischbehandlung bei degenerativen Gefäßerkrankungen der unteren Extremitäten sowie von Patienten mit hochsitzenden degenerativen Gefäßobliterationen vom Beckentyp mit "eindrucksvollem Erfolg" durch. Er gab dreimal wöchentlich 300 IU für die Dauer von etwa 5 Wochen. In einigen schweren Fällen erfolgten insgesamt 30 Injektionen. Bei Nachuntersuchungen 6-8 Wochen nach Abschluß der Behandlung konnte keine Verschlechterung des erreichten Zustandes festgestellt werden.

Nachteilig war, daß die zur Verfügung stehenden Hyaluronidasen aus Rinderhoden nur in relativ geringer Aktivitäten zur Verfügung stand und somit nur geringe Enzymaktivitäten appliziert werden konnten. So hatte eine einmonatige i.v., i.p. oder s.c. Gabe einer sehr geringen Hyaluronidase-Aktivität von 300 IU bei hypercholesterinämischen Kaninchen keinen Einfluß auf die atherosklerotischen Gefäßveränderungen. Eine wiederholte Gabe dieser Menge über einen Zeitraum bis zu drei Monaten erniedrigte den Blutcholesterolgehalt und den Fibringehalt des Plasma, erhöhte den freien Heparingehalt des Plasmas, steigerte die vasculäre Permeabilität in Richtung Gewebe und führte auch zu einer signifikanten Abnahme der atheromatösen Gefäßplaques (A.I. Pertsovskii, S.I. Koval'chuk, V.A. Baronenko, R.N. Gold'man, S. Ya. Guz, and T.L. Fonbarova (1973): Effect of hyaluronidase on the course of experinmental atherosclerosis. Kardiologija, 13, 37-40).

Gottlieb (US 3,708,575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herzarrythmien, Thrombosen, zerebrale Infarkte, zerebralen Thrombosen und Herzinfarkte insbesondere von Atherosklerose mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU per Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathecal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird das Enzym im Patenttitel als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung eindeutig hervorgeht, daß es sich um eine Hyaluronidase aus Rinderhoden handelt. Ein Enzym mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Aus der Erfindungsbeschreibung geht hervor, daß es sich bei dem Enzym eindeutig um die Anwendung mit Hyaluronidase aus Tierhoden handelt. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase hin. Auch die angewendete Aktivitätsbestimmungsmethode bezieht sich auf eine Vorschrift zur Hyaluronidasebestimmung.

Demnach ist Hyaluronidase aus tierischen Hoden geeignet, die Durchlässigkeit von Blutgefäßen für den Blutstrom dadurch zu erhöhen, daß atheromatöse Ablagerungen und möglicherweise auch Konstituenten von Blutgerinnseln und Blutthromben gelöst, abgebaut oder durchlässig gemacht werden. Bei einer Art von Konstituenten könnte es sich um Plaquepartikel handeln, die sich von der Intima gelöst haben und an denen sich ein Blutthrombus gebildet hat.

Weiterhin gibt es Hinweise, daß Hyaluronidaseanwendungen die Gefäßwände zum Gewebe hin als auch möglicherweise das angrenzende Gewebe durchlässiger machen. Nachteilig bei der Anwendung der Hyaluronidase tierischer Herkunft ist jedoch, daß das Enzym auf Grund seiner tierischen Herkunft die Gefahr einer Übertragung von Viren und anderem infektiösen Material in sich trägt. Weiterhin ist nachteilig, daß bei der Herstellung der Hyaluronidase zur Entfernung von Verunreinigungen in Form von Inhaltsstoffen aus dem tierischen Material ein größerer Reinigungsaufwand betrieben werden muß.

Hyaluronidase aus Säugetierhoden hydrolysiert auf Grund ihrer Unspezifität auch die in der Gefäßwand vorhandenen sulfatierte Glycosaminoglycane. Vom Dermatansulfat oder Chondroitinsulfat und Heparansulfat wird angenommen, daß sie das Anheften von Blutthromben an die Innenwand der Gefäße (Intima) durch ihre gerinnungshemmenden Eigenschaften verhindern. Es besteht demnach der Möglichkeit, daß die Hydrolyse dieser Verbindungen die sekundäre Bildung von Blutgerinnseln an der Intima vergrößert und somit Hyaluronidasen aus Hoden auch eine ungünstige Nebenwirkung besitzen könnten.

Es ist das Ziel der Erfindung, ein Plaque-abbauendes Enzym aus einem Mikroorganismus zu gewinnen und es therapeutisch bei atherosklerotischen Gefäßveränderungen einzusetzen. Die Nachteile der bisher für diese Anwendungen vorgeschlagenen Hyaluronidase aus Rinderhoden oder aus anderem tierischem Material bestehen darin, daß Krankheiten und Viren übertragen werden können. Diese Nachteile sind dadurch zu umgehen, daß ein Enzym mikrobieller Herkunft angewandt werden soll, das auf einfachem Weg biotechnologisch gewinnbar ist.

Weiterhin soll es bei der Applikationen von größeren Mengen über längere Zeiträume den lebenden Säugerorganismus nicht negativ beeinflussen. Das Enzym soll eine nur begrenzte Spaltung von Glycosaminoglycanen bewirken, um einerseits eine mit der Hyaluronidase aus Hoden vergleichbare Auflösung von Plaques und Konstituenten von Blutgerinseln zu bewirken. Andererseits soll es aber nicht durch intensiven Abbau der sulfatierten Glycosaminoglycane in der Intima sekundäre Blutgerinnsel hervorrufen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein glycosaminoglycanspaltendes Enzym mikrobieller Herkunft vorzuschlagen, welches eine mit der Hyaluronidase aus Rinderhoden vergleichbare bzw. bessere Wirkung im Blutgefäßsystem beim Auflösen von Plaques und von Konstituenten der Thromben und Blutgerinnseln aufweist, nicht toxisch ist und keine weiteren negativen Wirkungen bei der Anwendung als Injektionspräparat besitzt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Herstellung eines solchen Enzyms und dessen therapeutische Anwendungen bei Gefäßkrankheiten, die direkt oder als Folge der Plaquebildung auftreten.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.99.1.), insbesondere die durch einen Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt der Art Streptococcus agalactiae bei Fermentation in das Submersmedium exkretierte Hyaluronatlyase (Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase) und auch ein aus diesem Enzym hergestelltes Enzymfragment in vitro Plaques, gewonnen aus Säugetieren und aus dem Menschen, auflöst. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei oftmals wiederholter intravenöser Injektionen von vergleichsweise hohen Enzymaktivitäten in lebende Watanabe-Kaninchen, die auf Grund eines genetischen Defektes auf der Aorta große Plaqueauflagerungen aufweisen, sich das Ausmaß der Plaqueauflagerungen in den Gefäßen verringerte. Während das Gefäßinnere der unbehandelten Tiere eine mit einer dünnen weißlichen Plaquesschicht belegten Oberfläche sowie auch dickere Plaques aufwies, war das Gefäßinnere der behandelten Tiere frei von den dünneren Plaqueauflagerungen und wies eine tiefrote Färbung auf. Die Flächenausdehnung der dickeren Plaquesauflagerungen war ebenfalls reduziert.

Überraschenderweise wurde auch gefunden, daß diese Wirkung nicht nur auf das native Holoenzym mit einer Molmasse von 116.000 D beschränkt ist, sondern besonders auch durch ein hochaktives stabiles Fragment des Holoenzyms mit einer Molmasse von 84.000 bis 86.000 D bewirkt wird. Das Fragment entsteht durch proteolytischen Teilabbau des Holoenzyms mit einer spaltspezifisch wirkenden Protease, die die Peptidbindung bevorzugt an der C-terminalen Seite der aromatischen Aminosäuren spaltet.

Vorteilhaft an der erfindungsgemäßen Anwendung des Fragments im Vergleich zu dem Holoenzym ist, daß es auf Grund seiner kleineren Größe schneller als das Holoenzym in die festen Schichten der Plaques eindringen und dadurch schneller ihre Zerstörung bewirkt.

Die Hyaluronatlyase besitzt einen isoelektrischen Punkt von IP = 8,6.

Weiterhin ist günstig, daß die Hyaluronatlyase durch sulfatierte Glycosaminoglycane, wie beispielsweise sulfatierte Hyaluronsäure, inhibiert wird (Abb. 1).

Das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym bzw. das Fragment zeigt keine negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand der Versuchstiere.

Es ist naheliegend und gehört in den Schutzumfang, daß die Wirkung des vorgeschlagenen Enzyms und/oder ihres Fragments nicht nur auf die Entfernung der aktuellen Ablagerungen beschränkt ist, sondern daß die Anwendung auch einen günstigen Effekt auf Kreislaufkrankheiten wie Myocardischämie, Myocardinfarkt, Koronarinfarkt, Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose und ähnliche Erscheinungen hat.

Die Erfindung betrifft dementsprechend eine pharmazeutische Formulierung zur Behandlung von Gefäßkrankheiten, wie Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen, Koronarthrombosen und kardiale Infarkte, die auf die Anwesenheit von atheromatösen Plaques in den Blutgefäßen zurückzuführen sind, in Säugetieren und Menschen, enthaltend eine Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft als Holoenzym in hochgereinigter Form, ein hyaluronatspaltendes Fragment davon oder eine Mischung beider Formen sowie gegebenfalls zusätzlich Stabilisatoren, pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmittel und pharmazeutisch unbedenklichen Träger.

Erfindungsgemäß hergestellte pharmazeutische Formulierungen sind insbesondere Injektionspräparate für intravenöse oder intraarterielle Injektionen, welche aus einer isotonischen, sterilen wässrigen Lösung des hochgereinigten Enzymproteins des Holoenzyms und/oder des Fragmentes oder einer definierten Mischungen beider aktiven Enzymspezies in Mengen bestehen, wobei die Enzymaktivitäten zwischen 20.000 bis 4.000.000 IU/ml betragen. Die Enzymproteine werden vorteilhafterweise in Form eines gefriergetrockneten Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, eingesetzt. Stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, Albumin, insbesondere Ovalbumin, und dessen Hydrolysate oder Gelatine und seine Hydrolysate sein. Die bei einer Injektion angewendete Menge an Hyaluronatlyase und/oder ihres Fragmentes liegt zwischen 2.000 bis 12.000 IU/kg Körpermasse des behandelten Säugetieres oder Menschen.

Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder gereinigte Hyaluronatlyase mit der spezifisch wirkenden Protease zu dem Fragment umgesetzt. Die nachfolgende Beschreibung der Herstellung, insbesondere die Reihenfolge der Reinigungsschritte hat beispielhaften Charakter und schränkt nicht den Schutzumfang ein. Die Umsetzung erfolgt mit immobilisierter oder auch mit nicht-immobilisierter spezifischer Protease. Vorteilhaft ist an der Umsetzung mit immobilisierter Protease, daß die Verdauung gezielt und ohne Kontamination durch die Protease selbst durchgeführt werden kann. Im Fall der direkten Umsetzung mit zugesetzter Protease muß nach der Verdauung ein Inaktivierungsschritt der Protease, die Abtrennung des Proteaseproteins und eine Hochreinigung erfolgen. Als spezifisch wirkende Protease kann beispielsweise die Protease MO/2 (Müller et al., DD 270 924) eingesetzt werden.

Das hochgereinigte Enzym oder das Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt.

Das Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg und die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt etwa zwischen 400.000 bis 800.000 IU/mg. Zur Stabilisierung werden dem Enzym bzw. Fragment mindestens einer der Stabilisatoren, beispielsweise Albumin (v.a. Ovalbumin) und anorganische Salze, zugesetzt.

Die Herstellung der im Injektionspräparat eingesetzten hochreinen Hyaluronatlyase und des hochgereinigtes Fragments kann beispielhaft in Bezug auf die Reihenfolge als auch die Auswahl der Reinigungsschritte in einer nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränkenden Weise wie nachfolgend durchgeführt werden.

Die Fermentation des Mikroorganismus, z. B. eines der oben genannten, erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung bei einer Azidität von pH 6,5 bis 7,5. Die während der Fermentation gebildete Milchsäure wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge neutralisiert. Das Medium besteht aus anorganischen Salzen, Hefehydrolysat, wahlweise Kaseinpepton oder Sojapepton sowie Glukose. Nach etwa 20stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird verworfen. Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlußgrenze (cut oft) des Ultrafilter-Moduls liegt zwischen 30 bis 50 kD. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden muß, bevor es als Injektionspräparat verwendet werden kann. Durch die Reinigungsschritte und der Anwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird ein Pyrogenfreiheit des Injektionspräparats gewährleistet.

Nach Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40% wird das Enzym an Phenylsepharose adsorbiert. Anschließend erfolgt die Desorption mit einer neutralen gepufferten wässrigen Lösung, die 25% Ammonlumsulfat, bezogen auf 100% Sättigung, enthält. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Anschließend erfolgt eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, beispielsweise Aminophenyloxaminsäure.

Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) bestehen.

Die Enzymfraktion kann in folgender Weise zur Herstellung des Fragmentes eingesetzt werden:
Die spezifisch spaltende Protease wird in bekannter Weise, beispielsweise an Sepharose gebunden. Die immobiliserte Protease wird beispielsweise bei pH 7,5 und einer Temperatur von 37°C mit einer wässrigen Hyaluronatlyaselösung gemischt. Nach abgeschlossener Verdauung wird das Fragment mit Ammoniumsulfat gefällt und durch Molekulargewichtschromatografie in hochreiner Form gewonnen.

Die hochreine Enzymlösung oder die fragmenthaltigen Fraktionen kann nach Konzentrierung unter teilweisen Wasserentfernung und gegebenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder pharmakologisch aktiven Substanzen und Sterilfiltration als Injektionspräparat eingesetzt werden. Die hochreine Enzym- bzw. Fragmentlösung kann auch nach Sterilfiltration beispielsweise unter Zusatz von 5 mM Magnesiumchlorid und 1% Eieralbumin gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Enzym bzw. Fragment kann mit Kochsalzlösung als isotonisches Injektionspräparat gelöst werden.

Experimenteller Teil Beispiel 1

Die Fermentation wird in einem gerührten Fermentor mit einem Bruttofüllvolumen von 301 durchgeführt. Das Arbeitsvolumen beträgt 201. Zur Beimpfung wird ein allgemein verfügbarer Stamm der Art Streptococcus agalactiae eingesetzt. Die Stammkonservierung erfolgt mit einer Kryokonserve (Mast-Diagnostica). Eine Kugel, bedeckt mit Stamm-Material wird in ein Agarschrägröhrchen mit Keimzahlagar gegeben und durch Bewegung mit der Agaroberfläche in Berührung gebracht (Kultur A). Anschließend wird zur Sterilkontrolle die abgerollte Kugel in 3 ml einer Herz-Hirn- Bouillon gegeben (Kultur B). Beide Kulturen werden 24 h bei 37°C als Standkulturen kultiviert.

1. Vorkultur

2 × 50 ml eines Mediums, welches 5 g/l Caseinpepton und 10 g/l Hefe-Extrakt (Difco) enthält, werden in zwei 100 ml Steilbrustflaschen gefüllt und bei pH pH 7,0 sterilisiert. Zusätzlich zu den 50 ml Kulturmedium wird jeweils 5 ml Eagle-Medium kurz vor Beimpfung zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt mit einer Abschwemmung des Schrägagarröhrchens Kultur A mit der Kulturlösung von Kultur B. Die Steilbrustflaschen werden unter Schütteln (150 rpm) bei 37°C über 24 h kultiviert.

2. Vorkultur

2 × 1 l eines Mediums, bestehend aus 20 g/l HefeExtrakt und 10 g/l pankreatischem Pepton, 1,75 g/l Na-acetat, 7 g/l Na-hydrogencarbonat (extra gelöst), 7 g/l Di-Na hydrogenphosphat × 2H₂O und 3,5 g/l Na-Di-hydrogenphosphat wird auf pH 6,2 vor Sterilisieren mit 20% H₂SO₄ eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH bei etwa 7,0. Eine Lösung einer 6,0 g/l enthaltenden Glucoselösung wird separat autoklaviert. Davon werden 100 ml vor Beeimpfen der 2. Vorkultur zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt durch Zugabe von 50 ml der 1. Vorkultur (Beimpfung mit 5% v/v). Die Kultivierung erfolgt unter langsamen Schütteln bei ca. 45 rpm bei 32°C für 24 Stunden.

Hauptkultur

Das Medium der Hauptkultur besteht aus 20 g/l Hefe-Extrakt, 10 g/l pankreatisches Pepton und 25 g/l Glucose. Die Glucose wird extra autoklaviert. Die Beimpfung erfolgt mit einem Liter der 2. Vorkultur. Die Fermentationsparameter betragen 34°C, pH 7,0, Belüftung über Kopfraum (25 l/min Luft) und Rührgeschwindigkeit 150 rpm. Der pH wird durch Titration mit einer 40% Natronlaugelösung konstant gehalten. Glucose wird manuell so zugegeben, daß die Glucosekonzentration nicht unter 5 g/l sinkt. Nach 11 Stunden wird die Kultivierung abgebrochen.

Beispiel 2

50 l Kulturlösung einer Fermentation der Art Streptococcus agalactiae mit einem Hyaluronatlyaseaktivität von 400 IU/ml werden durch Sterilfiltration in einem 0,2 µm Filter von den Lebendzellen befreit. Die klare Kulturflitratlösung wird anschließend durch Ultrafiltration bei einem cut offvon 60.000 D zu einem Kulturkonzentrat von 2 l eingeengt. Diesen 21 Kulturkonzentrat werden 480 g festes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die bei dieser Konzentration ausfallenden Proteine werden durch eine Klarfiltration unter Verwendung eines Filterhilfsmittels abgetrennt und das klare Konzentrat auf eine zuvor mit 40%iger phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 equilibrierte Phenylsepharosesäule von 2,5 × 20 cm aufgetragen. Nach Wäsche mit einer 35%igen phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5, wird die Hyaluronatlyase mit einer 25%igen phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden vereinigt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% eingestellt. Das ausgefallene Präzipitat wird gesammelt und in 100 ml 0,03 M Trispuffer pH 8,2 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Anschließend wird die dialysierte Rohhyaluronatlyaselösung über eine equilibrierte Q- Sepharosesäule von 2, 2 × 15 cm gegeben. Die Hyaluronatlyase befindet sich im Durchlauf. Der Durchlauf wird durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 80% gesättigt. Das ausfallende Protein wird gesammelt, in 0,05 M Trispuffer pH 8,7 gelöst und über eine Sephadex G 10 Säule vom Ammoniumsulfat befreit. Die so equilibrierte Lösung Hyaluronatlyase haltige Lösung wird auf eine entsprechend equilibrierte Affinitätssäule (0,8 cm × 10 cm) von N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,1 M NaCO₃ -Lösung pH 9,7 eluiert.

Die eluierten Hyaluronatlyase-haltigen Fraktionen werden vereinigt und durch Sättigung auf 80% mit Ammoniumsulfat gefällt. Das gefallene Präzipitat wird gesammelt, in 1 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,5 gelöst und auf eine Superdex 200-Säule (16 × 60) aufgetragen. Die Hyaluronatlyase-Proteinbande bei 116. 000 D wird gesammelt, gegen 0,02 M Trispuffer pH 7,5, der 0,005 M MgCl₂, enthält, dialysiert. Es werden 10 mg Hyaluronatlyase mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 113/mg erhalten. Der dialysierten Hyaluronatlyaselösung wird Ovalbumin in einer Konzentration von 1% zugesetzt und die Lösung lyophil getrocknet.

Beispiel 3

10 mg Hyaluronatlyase aus Streptoococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g fixierter MO/2- Proteasesepharose zugesetzt, an die eine proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/g gebunden wurden. Nach 15 Minuten wird die Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80% ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment gesammelt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molgewichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hatte eine spezifische Aktivität von 600 000 IU/mg.

Beispiel 4

4 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in /ml 0,05 M Tris-HCL- Puffer pH 7,8 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert.

Dieser Lösung werden 80 µg der Protease MO/2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/mg zugefügt und das Gemisch für 30 Minuten bei 37°C verdaut. Zum Stoppen der Reaktion werden dem Gemisch 10 µl 0,1 M EDTA pH 7,0 zugesetzt. Danach wird das das Gemisch auf eine 3 ml Affinitätssäule von N-(p- Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,05 M Na₂ CO₃, pH 9,7 eluiert. Das Fragment wurde durch Sättigung auf 80% Ammoniumsulfat gefällt, gesammelt und durch Molekulargewichtschromatografie gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 460 000 IU/mg.

Beispiel 5 Aktivitätsbestimmung für Hyaluronatlyase bzw. des Fragments 1. Optischer Test bei 232 nm

Es werden Stammlösungen für Hyaluronsäure (HA) und sulfatierter Hyaluronsäure (mg/ml) hergestellt und bei 4°C aufbewahrt.

Der Standardtestansatz wird wie folgt in 3 ml-Quarzküvetten (d = 1 cm) bei einer Wellenlänge von 232 nm und einer Temperatur von 26°C durchgeführt. Zu 1,8 ml 0,1 M Azetatpuffer pH 6,0 werden 200 µl Hyaluronsäurestammlösung gegeben und die Reaktion mit 2 bis 4 U/ml (50 ml) Hyaluronatlyase gestartet. Das Endvolumen beträgt 2050 µl.

Für die Hemmversuche wird der oben beschriebene Standardtestansatz wie folgt variiert. Zu 1,5 bis 1,8 ml Puffer werden 300 bis 500 µl sulfatierte Hyaluronsäure und 200 µl Hyaluronsäure gegeben und die Reaktion durch Zugabe von Hyaluronatlyase gestartet. Die Hyaluronatlyase wird partiell nichtkompetitiv gehemmt. Der Kl-Wert beträgt S. 5 × 10^-4 mg/ml.

Hyaluronatlyase zeigt eine lineare Zunahme der Extinktion bei 232 nm, aus deren Anstieg sich die Aktivität berechnen läßt. Dabei wird ein Extinktionskoeflizient von c = 6, 0 × 10³ lxmol^-1cm^-1 für das gebildete Δ^4,5-ungesättigte Uronid zugrundegelegt (J. Ludowig: The mechanism of hyaluronidases. JBC 236, 333-339 (1991)).

2. Optischer Test bei 600 nm auf Mikroplatten

Bestimmung der Lyaseaktivität nach D. Gerlach, W. Köhler "Hyaluronatlyase von Streptococcuspyogenes. II. Charakterisierung der Hyaluronatlyase" (E.C. 4.2.99.1.) Zbl. Bakt.Hyg., I. Abt. Orig. A 221, 296-302 (1972).

Eine Hyaluronatlyase-Lösung wird aus einer Stammlösung (50.000 U/ml) durch Verdünnen 1 : 50 hergestellt; 0,5 ml Hyaluronatlyaselösung werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg /ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2 ml einer 2,5%igen Cetyltrimethylammoniumbromidlösung in 2%iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1 cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespalteter Hyaluronsäure bestimmt. 5 internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyase spalten 16 µg Hyaluronsäure/min.

Beispiel 6

10 mg Hyaluronatlyase des Holoenzyms werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g einer spezifisch spaltenden Proteasesepharose mit einer proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/mg zugesetzt. Nach 15 Minuten wird die unlösliche Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80% ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment abgetrennt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molgewichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert.

Beispiel 7

Versuch mit der Hyaluronatlyase zum Auflösen atheromatöser Gefäß-Ablagerungen humaner Herkunft:
Etwa 0,3 mm große, aus der Neointima der Arteria carotis interna des Menschen entnommenen weißlich-gelben Gewebsstücke (Plaque-Stücken) wurden in Lösungen von Hyaluronatlyase (etwa 20.000 IU in 1 ml Tris-Puffer, 10 mM, pH 7,0) suspendiert und für 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es tritt eine teilweise Auflösung der vorher scharfen Phasengrenzen der Plaque-Stücke sowie eine Freisetzung von suspendiertem feinverteilten Material auf. Parallel wurden Plaque-Stücke nur mit Tris- Puffer behandelt. Es treten hierbei keine Auflöseerscheinungen auf.

Beispiel 8

Versuch mit dem Fragment der Hyaluronatlyase zum Auflösen atheromatöser Gefäß- Ablagerungen humaner Herkunft:
Etwa 0,3 mm große, aus der Neointima der Arteria carotis interna des Menschen entnommenen weißlich-gelben Gewebsstücke (Plaque-Stücken) wurden in Lösung des Fragmentes (etwa 15.000 IU in 1 ml Tris-Puffer, 10 mM, pH 7,0) suspendiert und für 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es tritt eine weitgehende Auflösung der vorher scharfen Phasengrenzen der Plaque-Stücke sowie eine Freisetzung von suspendiertem, feinverteilten Material auf. Parallel wurden Plaque-Stücke nur mit Tris-Puffer behandelt. Es treten hierbei keine Auflöseerscheinungen auf.

Beispiel 9

Einfluß der Hyaluronatlyase auf atheromatöse Gefäßablagerungen beim Watanabe- Kaninchen Ibm:WHHL (Watanabe heritable hyperlipidemic). Das Kaninchen wird seit 1981 von Y. Watanabe, Universität Kobe, Japan gezüchtet und kam 1992 als Auszuchtstamm zu Charles River Savo und wird seit 1994 vom Broekman-Institut in Someren, Niederlanden, weitergezüchtet.

Das Watanabe-Kaninchen hat eine erbliche Hyperlipidämie, verursacht durch ein erblich bedingtes Defizit an LDL-Rezeptoren. Infolge der Hypercholesterinämie (<400 mg/100 ml Plasma) kommt es bei allen Tieren zu einer frühzeitigen Aortenarteriosklerose.

14 Tage vor Versuchsbeginn wurden 10 Watanabe-Kaninchen (Ibm: WHHL; 4 ♀ und 6 ♂) im Alter von 9 bis 11 Monaten vom Broekman-Institut in Someren, Niederlanden, gekauft. Die Tiere wurden einzeln in Käfigen (0,5 × 1 m) bei Raumtemperaturen von 20 ± 2°C gehalten und mit Standardfutter (ssniff Kaninchen-Haltung) und Trinkwasser ad libitum versorgt.

Vor Versuchsbeginn, also vor der 1. klinisch-chemischen Untersuchung, wurden die 10 Kaninchen, nach Geschlecht getrennt, randomisiert und danach mit den Nummern 1 bis 10 gekennzeichnet.

Die Tiere erhielten 3×/Woche (montags, mittwochs und freitags) Infusionen. 4 Kontrollkanichen (1-4) bekamen jeweils 20 ml pyrogenfreie 0,9%ige NaCl-Lösung innerhalb 1 Stunde intravenös (i.v.) verabreicht. Den 6 Versuchstieren (5-10) wurden jeweils mit dem Infusionsvolumen von 20 ml pyrogenfreier 0,9%ige NaCl-Lösung 30 000 IU hochgereinigter Hyaluronatlyase pro Stunde i.v. injiziert. Das entspricht einer Dosierung von 10.000 IU/kg Körpermasse.

Im Versuchszeitraum wurden Allgemeinverhalten, Körpermasse (KM), Körpertemperatur und klinisch-chemische Parameter (Cholesterin, Triglyceride, und Amylase) kontrolliert.

Das Allgemeinverhalten der Tiere wurde weder durch die Behandlungen mit 0,9%iger NaCl-Lösung noch mit Hyaluronatlyase erkennbar beeinträchtigt.

Die Körpermassen der ausgewachsenen Watanabe-Kaninchen, Kontrollen oder Hyaluronatlyase-behandelte, veränderten sich im Behandlungszeitraum vom 18.11.96 bis 3.2.97 nur unwesentlich.

Die Körpertemperaturänderungen, gemessen vor und nach jeder Infusion, lag im Schwankungsbereich von -0,3 bis +1,2°C. Auffällige Unterschiede zwischen Kontroll- und Hyaluronatlyase-behandelten Kaninchen wurden nicht gemessen.

Die Serumcholesterin-Werte der Kontrolltiere veränderten sich durch die 0,9%ige NaCl-Infusionen nicht wesentlich. Bei einem vor vier (1/4) Tieren kam es zur Halbierung der Cholesterin-Konzentration im Serum.

Die Hyaluronatlyase-Behandlung führte ebenfalls zu keinen auffälligen Verschiebungen der Serumcholesterin-Konzernrationen.

Unter der Infusions-Behandlung nahmen bei allen Tieren die z. T. sehr hohen Serumtriglycerid-Werte ab.

Nach der 20. Infusion lagen die Werte für die Kontrollen zwischen 570 und 740 mg/dl und für die Hyaluronatlyase-behandelten Kaninchen zwischen 200 und 290 mg/dl.

Bei (2/4) Kontroll-Kaninchen waren die Aortenbögen hochgradig atheromatös und bei 2/4 mittel- bis hochgradig. Bei 2/6 Hyaluronatlyase behandelten Kaninchen waren die Aortenbögen mittelgradig und bei 4/6 gering- bis mittelgradig atheromatös.

Bei 2/4 Kontrollkaninchen war die A. thoracica hochgradig atheromatös und bei 2/4 mittelgradig atheromatös belegt. Bei 4/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen war die A. thoracica geringgradig atheromatös und bei 2/6 waren kaum erkennbar Beläge. Bei 2/4 Kontrollkaninchen war die Aorta abdominalis hochgradig und bei 2/4 gering- bis mittelgradig atheromatös. Bei 2/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen waren mittelgradige und bei 4/6 schwach - bis geringgradige atheromatöse Beläge erkennbar.

Bei 2/4 Kontrollkaninchen waren die Aa. pulmonalis hochgradig mit Plaques belegt und bei 2/4 gering- bis mittelgradig.

Bei 1/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen waren die Aorta pulmonalis hochgradig, bei 2/6 gering- bis mittelgradig mit Plaques belegt und bei 3/6 keine Plaques vorhanden. Allgemeinverhalten, Körpermassen-Entwicklung, Körpertemperatur vor und nach den Infusionen und klinisch-chemische Parameter von 0,9% NaCl-Lösung- und Hyaluronatlyase-behandelten Watanabe-Kanichen wiesen während zweier Bandlungszyklen mit je 10 Infusionen keine auffälligen Unterschiede auf, so daß auf eine gute Verträglichkeit der Infusionsflüssigkeiten geschlossen werden kann.

Eine subjektive Bewertung des makroskopischen Aortenmaterials ergibt, daß die atheromatösen Beläge im Ausmaß bei den 4 mit 0,9%iger NaCl-Lösung behandelten Watanabe-Kaninchen hochgradiger erscheinen als bei den 6 mit mikrobieller Hyaluronatlyase-behandelten Watanabe-Kaninchen.

Claims

1. Pharmazeutische Formulierung zur Behandlung von Gefäßkrankheiten enthaltend eine Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft als Holoenzym in hochgereinigter Form, ein hyaluronatspaltendes Fragment davon oder eine Mischung beider Formen sowie gegebenenfalls zusätzlich Stabilisatoren, pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmittel und pharmazeutisch unbedenkliche Träger.

2. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt aus Streptococcus agalactiae, durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.

3. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Hyaluronatlyase in Form des Holoenzyms mikrobieller Herkunft einen isoelektrischen Punkt im Bereich von IP = 8,6 und eine Molmasse im Bereich von 116 kD besitzt.

4. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fragment der Hyaluronatlyase eine Molmasse im Bereich von 84 bis 86 kD aufweist.

5. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 für die Behandlung von Gefäßkrankheiten ausgewählt aus der Gruppe Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen, Koronarthrombosen und kardiale Infarkte.

6. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 enthaltend ein hyaluronatspaltendes Fragment einer Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft als Holoenzym, wobei das Fragment hergestellt wurde, indem man eine Hyaluronatlyase aus Streptokokken der serologischen Gruppe B einer enzymatischen Hydrolyse durch eine Protease unterwirft, die die Peptidbindung des C-terminalen Restes von aromatischen Aminosäuren spaltet.

7. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß sie als Injektionspräparat für intravenöse oder intraarterielle Injektionen vorliegt.

8. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivität der Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft und/oder ihres Fragments zwischen 20.000 bis 4.000.000 IU/ml beträgt.

9. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Infektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und etwa 1% (w/w) Albumin und/oder dessen Hydrolysate.

10. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Injektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und Magnesiumsalze.

11. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Injektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und Glukose.