DE3150318C2 - "Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidderivats des Fibrinolysins" - Google Patents

"Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidderivats des Fibrinolysins"

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DE3150318C2
DE3150318C2 DE3150318A DE3150318A DE3150318C2 DE 3150318 C2 DE3150318 C2 DE 3150318C2 DE 3150318 A DE3150318 A DE 3150318A DE 3150318 A DE3150318 A DE 3150318A DE 3150318 C2 DE3150318 C2 DE 3150318C2
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die chemisch-pharmazeutische Industrie, insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidderivats des Fibrinolysins. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man Fibrinolysin mit Dialdehyddextran vom Molekulargewicht 20000 bis 110000 bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 5 bis 30 ° C umsetzt, das sich bildende Polysaccharidderivat des Fibrinolysins mit Natriumborhydrid reduziert und isoliert. Das erhaltene Polysaccharidderivat des Fibrinolysins besitzt eine thrombolytische Wirksamkeit mit prolongierter Wirkung und findet Verwendung in der Medizin.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.
Fibrinolysin wird in der Medizin als thrombolytisches Arzneimittel bei der Behandlung solcher Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Thrombosen, Thromboembolien der Lungenarterien breit verwendet. Das Präparat wird intravenös während einiger Tage eingeführt. Jedoch wird die Therapie mit Fibrinolysin durch folgenden Umstand erschwert: Erstens besitzt Fibrinolysin keine Substratspezifität. Es hydrolysiert nicht nur Fibrin, sondern auch andere Proteine: Fibrinogen, Kasein und einige Proteine des Blutgerinnungssystems. Zweitens kann die Anwendung von Fibrinolysin nicht nur die Erhöhung der fibrinolytischen Wirksamkeit, sondern auch die Aktivierung des Blutgerinnungssystems hervorrufen; infolgedessen ist die neuerliche <to Thrombenbildung möglich. Drittens wird Fibrinolysin ebenso wie alle Fermentpräparate unter physiologischen Bedingungen unter Einwirkung von pH, Temperatur, endogenen Proteasen und Naturinhibitoren schnell inaktiviert und aus dem Blutstrom schnell entfernt, was zur Notwendigkeit führt, hohe Fermentdosen während einer längeren Frist einzuführen. Dabei erwies sich die Behandlung der Kranken mit Thromben von bedeutendem Ausmaß sowie mit niedrigen antikoagulierenden Blutindexen als erfolglos.
Zur Zeit sind Verfahren zur Bindung von Enzymen an Polymere bekannt, die gestatten, Arzneimittel zu erhalten, die im Vergleich zu nativen Enzymen eine recht erhöhte Stabilität in bezug auf verschiedene deaktivierende Einwirkungen, eine verlangsamte Elimination aus dem Organismus und herabgesetzte antigene Eigenschaften besitzen. So ist beispielsweise ein Verfahren
H2C
-O
.OH
OH
OH
H2C
CH,
CH2OH zur Herstellung eines Fibrinolysinderivats durch kovalente Bildung von Fibrinolysin an ein Kopolymerisat aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid bei einer Temperatur von 0 bis 40C während einiger Stunden bekannt. Im Ergebnis erhält man Produkte mit 15 bis 30% biologische Wirksamkeit (Zeitschrift für analytische Chemie, 1968, Band 243, Nr. 2, S. 457).
Das nach dem genannten Verfahren erhaltene Fibrinolysinderivat ist mit den Geweben des lebendigen Organismus inkompatibel, weil das Kopolymerisat aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid kein biozerlegbarer Stoff ist, und kann in der medizinischen Praxis keine Verwendung finden.
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Fibrinolysinderivats mit einem aldehydhaltigen Polysaccharid bekannt, daß darin besteht, daß Fibrinolysin mit modifiziertem aldehydhaltigen Sefadex im Phosphatpuffer bei einer Temperatur von 4°C während einiger Stunden umgesetzt wird. Das ungebundene Enzym wird durch aufeinanderfolgendes Waschen mit eiskaltem Phosphatpuffer, 0,001 n-Salzsäurelösung, I molarer Natriumchloridlösung, Wasser und Wasser-Azeton-Gemisch gereinigt, wonach man das Präparat mit Azeton trocknet (Kardiologiya [Kardiologie], Moskau, 1977, Nr. 11 S. 139-142).
Die nach dem genannten Verfahren erhaltene Verbindung ist in Wasser und wäßrigen Lösungen unlöslich, was die Möglichkeiten ihrer medizinischen Verwendung begrenzt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch die Ausnutzung einer neuen Ausgangskomponente ein Polysaccharidderivat von Fibrinolysin zu erhalten, das eine hohe thrombolytische Wirksamkeit mit prolongierter Wirkung, eine Stabilität unter physiologischen Bedingungen besitzt und zu medizinischer Verwendung geeignet ist.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß man im Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidderivate von Fibrinolysin, das die Umsetzung des Fibrinolysins mit einem aldehydhaltigen Polysaccharid unter Bildung einer kovalenten Bindung und darauffolgende Isolierung des Endproduktes vorsieht, erfindungsgemäß als aldehydhaltiges Polysaccharid Dialdehyddextran vom Molekulargewicht 20 000 bis 110 000 benutzt, den Prozeß bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 5 bis 300C durchführt und das sich bildende Polysaccharidderivat von Fibrinolysin vor der Isolierung zusätzlich mit Natriumborhydrid reduziert. Man nimmt vorzugsweise Natriumborhydrid und Polysaccharidderivat von Fibrinolysin in einem Verhältnis von 1,5: 1 bis 2,0: 1.
Das erhaltene Polysaccharidderivat von Fibrinolysin besitzt eine thrombolytische Wirksamkeit, eine erhöhte Stabilität, eine vergrößerte Zirkulationsdauer im Organismus.
Schematisch kann dessen Struktur folgenderweise dargestellt werden:
H2C
worin bedeuten: Fl Fibrinolysin, η 100 Mol-% Glukopyranosenglieder von Dextran, y 10 bis 25 Mol-% oxydierte Glukopyranosenglieder von Dextran, ρ Mol-% CH2OH
CH2OH
NH2-Gnippen von Fibrinolysin, die an der Bildung teilnehmen. Der Proteingehalt im Präparat beträgt 10 bis 30%, der Dextrangehalt -90 bis 70%.
Es wurde die thrombolytische Wirksamkeit mit prolongierter Wirkung und die Toxizität des erhaltenen Polysaccharidderivats von Fibrinolysin im Tierversuch untersucht.
Die Untersuchung der spezifischen (thrombolytisehen) Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharidderivats von Fibrinolysin wurde an Modellen der Thrombosen der Drosselvene des Kaninchens und der Oberschenkelvene oder -Schlagader des Hundes durchgeführt. Bei den obengenannten Tieren wurden Thrombösen von 1 bis 2,5 cm Ausmaß geformt, die die lichte Weite des Blutgefäßes völlig obliterierten. Die Einführung des Versuchspräparats neben Heparin begann man eine Stunde nach der Thrombenbildung.
Ausgehend vom vermutlichen prolongierten fibrinolytischen Effekt des erfindungsgemäßen Präparats wurde die zu untersuchende Präparatdosis - von 400 bis
Tabelle 1
4000 Einheiten pro 1 kg Körpergewicht - für Kaninchen in 20 bis 30 ml und für Hunde in 50 bis 100 ml physiologischer Lösung gelöst und mit einer Spritze während 20 min intravenös strahlartig eingeführt, nicht aber wie in der Gebrauchsanweisung für Fibrinolysin (intravenös nach der Tropfmethode mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 12 Tropfen pro min).
Die Dynamik der Thrombenbildung und der Thrombolyse wurde im Laufe der 6 Stunden des Versuchs, nach 1, 2 und 3 Tagen visuell und manuell beobachtet. Die Angiographie und Fluometrie wurden vor dem Beginn der Behandlung und 1 Tag nach der Präparateinführung durchgeführt.
Die Ergebnisse der Untersuchung der thrombolytischen Wirksamkeit des erfindungsgemäß erhaltenen Polysaccharidderivats von Fibrinoylsin sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tiergruppe Versuchspräparat Tieranzahl Präparatdosis
pro 1 kg Körpergewicht		 600 Einheiten Behandlungseffektivi
tät (Thrombolyse)
1 2 3 4 800 Einheiten 5
Kaninchen Fibrinolysin 1 800 Einheiten keine Lyse
Kaninchen Fibrinolysin 2 1200 Einheiten vollständige Lyse
1 2000 Einheiten keine Lyse
1 4000 Einheiten vollständige Lyse
1 400 Einheiten vollständige Lyse
1 600 Einheiten vollständige Lyse
(ging an Blutung
unter)
erfindungsgemäß
erhaltenes Fibrinoly-
sinderivat		 7 800 Einheiten vollständige Lyse
1 800 Einheiten vollständige Lyse
Hunde Fibrinolysin 1 (Oberschenkelvene) 1600 Einheiten keine Lyse
1 (Oberschenkelvene) 1600 Einheiten keine Lyse
1 (Oberschenkelvene) 600 Einheiten vollständige Lyse
1 (Oberschenkelvene) vollständige Lyse
erfindungsgemäß
erhaltenes Fibrinoly-
sinderivat		 , 3 (Oberschenkelvene) vollständige Lyse
3 (Oberschenkelvene) 600 Einheiten
vollständige Lyse
Aus experimentellen Angaben folgt, daß die Behandlung der Kaninchen mit Fibrinolysin keinen thrombolytischen Effekt in allen Fällen der Verwendung der minimalen therapeutischen Dosis (800 Einheiten/kg) ergibt. Dabei wurden Blutfluß, pathologische Veränderungen in der dritten Phase der Blutgerinnung, Senkung des Fibrinogengehalts bis 0 in den ersten Stunden nach der Einführung beobachtet. Die Erhöhung der Dosis auf 4000 Einheiten pro kg ruft das Eingehen des Tiers an Fibrinolysin hervor. Zum Unterschied vom nativen Fibrinolysin ist die Behandlung mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivat sogar bei der Verwendung der minimalen therapeutischen Dosis von 400 Einheiten/kg effektiver. Außerdem wird die fibrinolytische Wirkung des erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats eine längere Zeit - bis 2 Tage nach der Einführung - beobachtet. Das Präparat ruft keine scharfen Veränderungen in der dritten Phase der Blutgerinnung hervor und im Zusammenhang damit wird die Behandlung von keiner Blutung begleitet. Die an Hunden erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Gesetzmäßigkeiten der an Kaninchen festgestellten thrombolytischen Therapie.
Der fibrinolytische Wirkungseffekt wird bei der Einführung des erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats auch am zweiten Tag nach der Einführung des Präparats in den Organismus des Tieres beobachtet, während bei der Einführung des nativen Fibrinolysins der Wirkungseffekt auf 24 Stunden begrenzt ist. Die prolongierte Wirkung des erfindungsgemäßen Fibrinolysinderivats wurde im Experiment an Hunden im Vergleich zur Wirkung des nativen Fibrinolysins untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
5 6
Tabelle 2
Veränderung der Lysezeit (in min) der Euglobulinplasmafraktion bei Hunden mit experimenteller Thrombose bei der Einführung des erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats und des nativen Fibrinolysins
Präparat Tierzahl
Ausgangsindex Untersuchungsdauer ITag nach 2 Tagen
nach 2 Stunden nach 10
70 90 1 90
38 3 105
Erfindungsgemäß 6
erhaltenes Präparat
Natives r ibrinolysin 4
Tabelle 3
Veränderung der Thrombinzeit (in see) bei Hunden mit experimenteller Thrombose nach der Einführung des erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats und des nativen Fibrinolysins
Präparat
Tierzahl Ausgangsindex Untersuchungsdauer nach der Präparateinführung
nach 2 Stunden nach 1 Tag nach 2 Tagen
Erfindungsgemäßes 6
Präparat
Natives Fibrinolysin 4
35
22
92
95
210
27
Tabelle 4
Toxizität des erfindungsgemäßen Fibrinolysinderivats Tür verschiedene Tierarten bei der intravenösen Einführung
Tierart Tierzahl Dosen in Einheiten/kg und !500 Versuchsergebnisse 2500 3750 5000 6250 LD50 Einh/kg
500 1000 2000 0/6 1/5 2/4 6/0
Mäuse 34 0/6 0/6 2/4 3/3 6/0 5000
Ratten 30 2/4 0/6 6/0 4586
Kaninchen 30 0/6 1/5 0/1 2/4 1834
Hunde 7 /03 0/3 _
Die Toxizität des erfimdungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats wurde im akuten Versuch an weißen Mäusen, Ratten, Kaninchen und Hunden untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Toxizität des erfindungsgemäßen Fibrinolysinderivats erwies sich der Toxizität des nativen Fibrinolysins als ähnlich. Die einmalige Einführung den Tieren des erfindungsgemäßen Fibrinolysinderivats in Dosen, die die therapeutische um 4- bis 5mal übersteigen, rief ihren Tod nicht hervor. In den untersuchten Dosen besitzt das Präparat keine gefäßgeschädigende Wirkung und ruft keine makro- und mikroskopischen Veränderungen der inneren Organe hervor. In therapeutischen Dosen übt es keine Wirkung auf das Zentralnervensystem und den Blutdruck aus.
Die dargelegten Untersuchungsergebnisse zeigen
1. Die Behandlung der experimentellen Thrombose nach der Methode der einmaligen intravenösen strahlartigen Infusion des erfindungsgemäß erhaltenen Polysaccharidderivats ist bei der Minimaldosis von 400 Einheiten/kg Körpergewicht effektiv, während die minimale therapeutische Dosis des nativen Fibrinolysins, die 800 Einheiten/kg Körpergewicht beträgt, eine Thrombolyse nicht immer hervorruft.
Ϊ. Die Normalisierung der durch die Einführung des erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinolysinderivats erzeugten Veränderungen des Blutgerinnungssystems tritt bei den Versuchstieren am zweiten Tag auf, was von der Prolongation der Präparatwirkung um das 2- bis 3fache im Vergleich zum nativen Fibrinolysin zeugt.
3. Das erfindungsgemäß erhaltene Fibrinolysinderivat ruft keine scharfen Veränderungen in der dritten Phase der Blutgerinnung hervor und gestattet also Blutungen zu vermeiden, die bei der Verwendung von nativen Fibrinolysin oft beobachtet wird.
4. Das erfindungsgemäß erhaltene Fibrinolysinderivat besitzt eine geringe Toxizität. Die intravenöse Einführung des Präparats in Dosen, die die thera^ peutische um das 4- bis 5fache übersteigen, führt nicht zum Eingehen der Tiere.
55 Die Verwendung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Fibrinolysinderivats, das eine prolongierte Wirkung besitzt, gestattet, das vieltätige intravenöse tropfartige Verfahren zur Präparateinführung durch das einmalige intravenöse strahlartige Verfahren zu ersetzen, die Kurdosis zu reduzieren und dadurch die Zahl der Komplikationen bei der gleichzeitigen Erhöhung der Effektivität der thrombolytischen Therapie herabzusetzen.
Das erfindungsgemäß erhaltene Fibrinolysinderivat kann zur Behandlung akuter Thromboembolien und Thrombosen der Lungenarterien, der Gehirngefäße, der peripheren Arterien (bevor sich eine Gangrän ent-
wickelt hat), bei Thrombophlebitis, Thrombose der peripheren Venen, beim akuten Myokardinfarkt, bei Thrombose der Zentralvene oder -arterie der Augennetzhaut verwandt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Polysaccharidderivate von Fibrinolysin wird wie folgt verwirklicht.
Dialdehyddextran vom Molekulargewicht 20 000 bis 110 000 wird nach einem beliebigen bekannten Verfahren zur Oxydation von Dextran bis zu Aldehydgruppen im Glukopyranosenglied, beispielsweise durch Dextranoxydation mit Jodsäure oder deren Kaliumsalz, erhalten. Zu Dialdehyddextran wird in Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8 bis 9,5 und einer Temperatur von 5 bis 30°C die Fibrinolysinlösung zugegeben und es wird die Bindungsreaktion während 30 bis 120 min durchgeführt. Nach der Fibrinolysinbindung mit dem oxydierten Dextran werden nicht umgesetzte Aldehydgruppen des Trägers in inerte Oxygruppen unter Einwirkung eines milden Reduktionsmittels, beispielsweise Natriumborhydrid übergeführt. Das Polysaccharidderivat von Fibrinolysin wird von dem Überschuß der Mineralsalze durch die Demineralisation auf Membranen, insbesondere durch Dialyse gegen Wasser abgetrennt. Die Lösung des erhaltenen Präparats wird lyophilisiert. Man erhält ein Endprodukt, das ein geruchloses und geschmackloses Pulver von gelblicher Schattierung darstellt. Das Präparat ist hygroskopisch, in Wasser und 0,9%iger isotonischer Natriumchloridlösung leicht löslich, in 95%igem Alkohol, Äther und Chloroform praktisch unlöslich. Die spezifische Aktivität des Präparats beträgt 20 bis 25 Einheiten/mg, die Ausbeute an Endprodukt macht 25 bis 30% aus.
Das erfindungsgcmäße Verfahren zur kovalenten Fibrinolysinbindung mit dem oxydierten Dextran entspricht sowohl den klinischen als auch den technologischen Forderungen zur Herstellung der Arzneipräparate: die Matrize enthält Iceine toxischen Gruppen, überschüssige reaktionsfähige Aldehydgruppen wurden bis zu Hydroxylgruppen reduziert, um deren Wechselwirkung mit den dem Organismus eigenen Proteinen zu vermeiden. Im Verfahren werden keine hochtoxischen Stoffe benutzt, die Prozesse der Herstellung des aktivierten Dextrans und der nachfolgenden Dialdehyddextranbindung mit Fibrinolysin verlaufen unter milden Bedingungen im wäßrigen Medium ohne Verwendung organischer Lösungsmittel; der Verwirklichung des Verfahrens wurden die Bedingungen zugrundegelegt, bei welchen praktisch eine vollständige Bindung von Fibrinolysin mit dem Polymer vor sich geht; deswegen entfällt die Notwendigkeit von zusätzlichen Stufen zur Abtrennung des ungebundenen Proteins vom gebundenen. Somit sind alle Herstellungsstufen des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin technologisch einfach und können unter Industriebedingungen bei der Herstellung des Arzneimittels, des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin, verwirklicht werden.
Beispiel 1
60
Man löst 1,25 g Dextran - Polyglykin (= Dialdehyddextran) in 25 ml destilliertem Wasser und gibt 0,71 g Kaliumperjodat zu. Man führt die Oxydation bei einer Temperatur von 22 ± 3°C und unter ständigem Rühren während 1 Stunde durch.
Man läßt die erhaltene Lösung des oxydierten Polyglykin* durch eine mit 6 g Anionenaustauscher in Azetatform gefüllte Kolonne durch, verwirft ein Eluatvolumen, das dem Kolonnenvolumen 3 bis 5 ml gleich ist, und sammelt die restlichen 20 ml in einen Meßzylinder.
Man mischt 20 ml gereinigtes und oxydiertes Polyglykin vom Molekulargewicht 20 000 mit 110 ml 0,2 molarer Sodapufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5 (bis zu einer Konzentration des oxydierten Polyglykins von 7,5 mg/ml) und gibt unter leichtem Rühren 6,5 g Fibrinolysin zu.
Man läßt das Reaktionsgemisch in einer Menge von 130 ml bei einem pH-Wert von 8,4 bis 8,9 und einer Temperatur von 20 ± 3°C während einer Stunde stehen, kühlt nachher auf 10 ± 5°C ab und fügt 40 ml 0,5%ige Natriumborhydridlösung hinzu. Die Reduktionsreaktion geht im Verlaufe von 30 Minuten bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 vor sich.
Man gießt die Lösung des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin in Zellophansäcke - zwei je zu 85 ml - ein und dialysiert bei einer Temperatur von 6 ± 2°C gege_n 17 1 destilliertes Wasser während 24 Stunden. Man verdünnt die dialysierte Lösung des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin mit dem apyrogenen Wasser bis 350 ml, läßt durch einen sterilen Filter (Porendurchmesser 0,22 μΐη) durch und gefriergetrocknet.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 2275 mg. Die spezifische fibrinolytische Wirksamkeit ist 21,2 Einheiten/ mg Präparat und die Gesamtaktivität 48 230 Einheiten was 31,0 %, bezogen auf das Ausgangspräparat, beträgt. Das erhaltene Produkt stellt ein geruchloses, geschmackloses Pulver von gelblicher Farbe dar. Das Präparat ist hygroskopisch, in Wasser und 0,9%iger isotonische Natriumchloridlösung löslich, in 95%igem Alkohol, Äther und Chlorform praktisch unlöslich.
Beispiel 2
Man löst 10 g Dextran - Polyglykin in 200 ml destilliertem Wasser und gibt 5,65 g Kaliumperjodat zu. Man führt die Oxydation bei einer Temperatur von 20 ± 30C unter ständigem Rühren während einer Stunde durch. Man läßt die erhaltene Lösung des oxydierten Polyglykins von Molekulargewicht 110 000 mit einer Oxydationsstufe von 20 ± 2% durch eine mit 50 g Anionenaustauscher in Azetatform gefüllte Glaskolonne bis zur vollen Abtrennung des oxydierten Polyglykins von den Anionen HCOO,"JO4", HCOJ durch. Am Ausgang der Kolonne verwirft man ein Eluatvolumen, das dem Kolonnenvolumen - 50 ml - gleich ist, und sammelt 150 ml Lösung, die oxydiertes Polyglykin in einer Konzentration von 50 mg/ml enthält, in einen Meßzylinder.
Man mischt 150 ml gereinigte Lösung des oxydierten Polyglykins mit 425 ml 0,2 molarer Sodapufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5. Man mischt die erhaltene Lösung des oxydierten Polyglykins mit der Lösung des nativen Fibrinolysins, die durch Auflösen von 45 g Fibrinolysin in 425 ml destilliertem Wasser bereitgestellt wurde.
Man läßt das Reaktionsgemisch in einer Menge von 1000 ml bei einer Temperatur von 2O±3°C während 40 min stehen und gibt 310 ml der auf eine Temperatur von 6 ± 2°C abgekühlten Natriumborhydridlösung hinzu. Die Reduktionsreaktion geht innerhalb von 30 Minuten vor sich. Nachher dialysiert man die Lösung des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin gegen destilliertes Wasser in einem Verhältnis von der zu dialysierenden Lösung zum Wasser von 1 : 150 während 24 Stunden bei einer Temperatur von 4 bis 7°C und gefriergetrocknet. Die Ausbeute an Präparat beträgt 12,5 g mit der spezifischen Wirksamkeit von 24 EjoJl/
mg und der Gesamtaktivität von 300 000 Einheiten, was 30%, bezogen auf das Ausgangspräparat, beträgt. Das erhaltene Produkt stellt ein geruchloses, geschmackloses Pulver von gelblicher Farbe dar. Das Präparat ist hygroskopisch, in Wasser und 0,9%iger isotonischer Natriumchloridlösung löslich, in 95%igem Alkohol, Äther und Chloroform praktisch unlöslich.
Beispiel 3
Man mischt eine Lösung aus 2 g Dialdehyddextran vom Molekulargewicht 50 000 in 40 ml destilliertem Wasser mit 200 ml 0,2 molarer Sodapufferlösung (pH-Wert = 9,5) und gibt der Lösung unter Rühren 13 g Fibrinolysin hinzu. Man läßt das Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert von 9,5 bei einer Temperatur von 5°C während einer Stunde stehen, gibt nachher die abgekühlte Natriumborhydridlösung (0,5%ige Lösung in
100 ml) im Sodapuffer mit einem pH-Wert von 8,5 hinzu. Die Reduktionsreaktion führt man innerhalb von 30 Minuten bei einer Temperatur von +40C und einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 durch.
Die Lösung des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin gießt man in Zellophansäcke ein und dialysiert bei einer Temperatur von 4 ± 2°C gegen destilliertes Wasser während 24 Stunden. Man läßt die dialysierte Lösung des Polysaccharidderivats von Fibrinolysin, die mit apyrogenem Wasser bis 700 ml verdünnt wurde, durch einen sterilen Filter (Durchmesser der Poren ist 0,22 μΓη) durch und gefriergetrocknet.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 4500 mg. Das erhaltene Produkt stellt ein geruchloses, geschmackloses Pulver von gelblicher Schattierung dar. Die spezifische fibrinolytische Wirksamkeit ist 20 Einheiten/mg Präparat, die Gesamtaktivität 90,000 Einheiten, was 30%, bezogen auf das Ausgangspräparat, beträgt.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidderivats des Fibrinolysins, welches die Umsetzung von Fibrinolysin mit einem aldehydhaltigen PoIysaccharid unter Bildung einer kovalenten Bindung und darauffolgende Isolierung des Endproduktes vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß man als aldehydhaltiges PolysaccharidDialdehyddextran vom Molekulargewicht 20 000 bis 110 000 benutzt, den Prozeß bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 5 bis 300C durchführt und das sich bildende Polysaccharidderivat von Fibrinolysin vor der Isolierung mit Natriumborhydrid reduziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumborhydrid und das Polysaccharidderivat von Fibrinolysin in einem Verhältnis von 1,5 : 1 bzw. 2,0: 1 nimmt.
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