DD157561A5 - Verfahren zur herstellung von mucopolysacchariden - Google Patents

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Jean Choay
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Darstellung von Mukopolysacchariden, die gegenueber dem aktivierten X-Faktor oder Xa-Faktor des Blutes eine hochselektive Wirkung ausueben und dadurch eine starke antithrombotische Wirkung aufweisen, ohne fuer den Patienten ein haemorrhagisches Risiko zu bergen. Erfindungsgemaess wird Heparin mit Ketten mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 50000 der schonenden Einwirkung eines chemischen Agens, insbesondere salpetriger Saeure, ausgesetzt, das die Heparinketten depolymerisiert oder fragmentiert. Die Reaktion muss unter aufeinander abgestimmten Bedingungen ablaufen, um eine teilweise Depolymerisierung des Heparinausgangsmaterials bis zur Herstellung eines Gemisches zu ermoeglichen, das groesstenteils aus Produkten mit einem Y in-Wessler/USP-Titer-Verhaeltnis ueber 2, vorzugsweise ueber 6 besteht und das Reduktionsendgruppen der Struktur 2,5-Anhydro-D-Mannose enthaelt. Anschliessend werden vom Reaktionsmedium die durch eine alkoholische Loesung ausfuellbaren Produkte abgeschieden und entnommen.

Description

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Verfahren zur Darstellung von Mukopolysaccariden mit besonders gerinnungshemmenden Eigenschaften
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Darstellung von Mukopolysaccariden mit solchen biologischen Eigenschaften, die es ihnen insbesondere erlauben, auf hochspezifische Weise einige Etappen der Blutgerinnung zu kontrollieren.
Sie betrifft im einzelnen ein Verfahren zur Darstellung von Mukopolysaccariden (nachstehend durch die Abkürzung MPS bezeichnet), die eine seletivere 7/irkung als Heparin, und zwar gegenüber derr. aktivierten X-Paktor oder Xa-Paktor des Blutes, und dadurch eine starke antithrombotische Y/irkung haben, ohne für den Patienten ein hämorrhagisches Risiko zu bergen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Die Forschung auf dem Gebiet der Erfindung von Erzeugnissen des obengenannten Typs, ihrer leichteren Anwendung und mit höherem Wirkungsgrad hat die Erfinder dazu veranlaßt, die Depolymerisation des Heparins auf chemischem Wege genauer zu untersuchen·
Es ist darauf hinzuweisen, daß der Begriff Heparin in der Beschreibung und den Ansprüchen in seinem weitesten Sinn gebraucht wird, um ohne Unterschied ein handelsübliches pharmazeutisch hergestelltes Heparin oder ein:rohes Heparin zu bezeichnen, wie es durch Extraktion aus biologischem Material, insbesondere aus dem Gewebe von Säugetieren, gewonnen wird.
4 9 О
Ss ist bekannt, daß Heparin seine gerinnungshemmende XHrkung durch die Verstärkung des hemmenden Effektes des Antithrombin III (ЛТ III) ausübt, das ein Plasmaprotein ist, gegenüber den Kaskaden von onzymatischan Reaktionen, die sich während der Gerinnung abspielen.
Da das Heparin gleichseitig eine große Anzahl von Paktoren der Koagulation abschwächen kann, die an der Bildung und der Erhaltung der verschiedenen Formen der Hyperkoagulabilität beteiligt sind, ist seine Y/irkung nicht spezifisch, sondern global*
Obwohl sich diese antikoagulierende Y/irkung als wertvoll erweist, erschwert sie jedoch die Wiederausgleichung des Systems Gerinnung/Pibrinolyse bei den in Behandlung befindlichen Patienten, und dies auf Grund des allgemeinen Charakters seiner Wirkung. Daraus ergibt sich, daß die Verabreichung von su hohen Dosen antikoagulierender Medikamente (um der Gefahr der Hyperkoagulation vorzubeugen, zum Beispiel das Auftreten von Thrombosen nach chirurgischen Eingriffen) oder eine falsche Auswahl dieses Medikaments letztendlich die Ursache von schweren Blutungen sein können·
Es wurde also nach Mitteln' der Darstellung von KPS-Ketten gesucht, die von denen des Heparins abgeleitet und hinsichtlich ihrer biologischen Eigenschaften zufriedenstellender als die Ketten des Heparins sind.
Dio gründliche Untersuchung von unterschiedlichen Bedingungen der Depolymerisation des Heparins und der daraus resultierenden Depolymerisationsmischungen hat zu der
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Peststellung geführt, daß es unter bestimmten Arbeitsbedingungen möglich ist, die Heparinketten teilweise auf einen' Grad zu depolymerisieren, der der Darstellung von MPS-Ketten entspricht, die -wertvolle antithrombotische Eigenschaften und eine höhere, sogar mengenmäßig höhere Ausbeute an aktiven Molekülen besitzen. Diese KPS sind in der Lage, den Xa-Paktor entsprechend einem höheren Selektivitätsgrad als dem des Heparins zu hemmen, während ihre allgemeine antikoagulierende Wirkung schwächer ist als die des Heparins. Sie weisen demzufolge -hinsichtlich ihres Yin-7/essler-Titers und ihres USP-Titers ein vorteilhaftes Verhältnis auf.
Es ist anzumerken, daß die Yin-Wessler-Wirkung stärker für die Fähigkeit der aktiven Fraktionen, die Hemmung des Xa~Faktors des Blutes durch AT III im entsprechenden Test zu verstärken und der USP-Titer stärker für das Vermögen der aktiven Fraktionen, die vollständige Gerinnung des Blutes oder des Plasmas zu hemmen, repräsentativ ist·
Der Yin-Wessler-Titer wird nach der von diesen Autoren in J. Lab. Clin. Med. 1976, S. 81, und 298 bis 300 und der USP-Titer nach der in "Pharmacopea of the United States of America" S. 229 und 230 beschriebenen l'ethode gemessen (siehe auch im zweiten Ergänzungsband USP-ITH, S. 62, und im vierten Ergänzungsband USP, S. 90, mit dem Titel "Drug substances" bzw. "Dosage forms").
Ziel der Erfindung:
Ziel der Erfindung ist ein neues Herstellungsverfahren mit höherer Leistung und einfacherer Anwendung für die Herstellung von Erzeugnissen, die ein günstigeres Verhältnis zwischen Yin-Wessler-Titer und USP-Titer haben als das Heparin und die als aktive Prinzipien von bledi-
kamenten verwendet werden können.
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Darlegung des Wesens der Erfindung:
Das erfindungsgemäße Verfahren wird dadurch charakterisiert, daß Heparin mit Ketten mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 50000 vorsichtig der Wirkung eines chemischen Agens, das in der Lage ist, die Heparinketten zu depolymerisieren oder zu fragmentieren, insbesondere der Wirkung der salpetrigen Säure ausgesetzt wird, -wobei diese Reaktion unter abgestimmten Bedingungen abläuft, um die Darstellung einer teilweisen Depolymerisation des Heparin-Ausgangsmaterials bis zur Darstellung eines Gemischs zu ermöglichen, das zum größten Teil aus Produkten besteht, die zwischen Yin-Wessler-Titer und USP-Titer ein Verhältnis über 2, insbesondere mindestens 3 und vorzugsweise über б haben und Reduktionsendgruppen von der Struktur 2,5-Anhydro-D-Mannose enthalten:
CH2OH
CHO
Wenn der gewünschte Depolymerisationsgrad erreicht ist, werden die durch eine alkoholische Lösung ausfällbaren Produkte getrennt und gesammelt.
Diese Vorkehrungen ermöglichen auf vorteilhafte Art die Darstellung von MPS mit einem schwächeren USP-Titer als der des Ausgang-Heparins, wogegen ihr Yin-Wessler-Titer höher ist, und das bei einer praktisch mengenmäßigen Ausbeute.
Entsprechend einer zusätzlichen Vorkehrung, die günstigervJeise getroffen wird, um über ein KPS-Gemisch mit stabileren Sndgruppen zu verfügen, setzt man das vorher erhaltene Gemisch einer Behandlung aus, durch die die Aldehydgruppe in eine stabilere funktioneile Gruppe, insbesondere in eine Säure- oder Alkoholgruppe, verwandelt werden kann.
Im allgemeinen führt das Erfindungsverfahren zu einem Gemisch, das einen groi3en Teil von Ketten enthält, die von Heparin deriviert sind und die in einem hydroalkoholischen Medium (Wasser-Äthanol) mit einem Titer von 55 - 61° GL löslich sibd, zur Unlöslichkeit in einem Wasser-Äthanol-Medium mit einem höheren Alkoholgehalt neigen und in reinem Alkohol unlöslich sind. Sie weisen Yin-Wessler-Titer und USP-Titer jeweils in einem Verhältnis von mindestens 2, namentlich mindestens 3, vorzugsweise über β und sogar bis zu 10 auf.
Diese MPS-Ketten enthalten Endverbindungen, die die Grundstruktur der 2,5-Annydro-D-manno besitzen, deren primäre Alkoholgruppe an 6.' Stelle eventuell durch eine SOÖ-Gruppe ersetzt sein kann. Diese Struktur ergibt sich aus der Einwirkung von salpetriger Säure auf die IT-Sulfat-Glukosamin-Verbindungen des Heparins.
Die fragliche Endverbindung entspricht folgender allgemeiner Formel:
CH2OR2
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wobei Ко ein Wasserstoffatom oder eine SCU-Gruppe und R1 eine funktioneile Gruppe darstellt, die insbesondere unter den Aldehyd-,· Alkohol- oder Karbonsäuregruppen oder ihren Derivaten ausgewählt wurden-, insbesondere die Azetale, Amide, Äther, Ester oder entsprechende Salze,
Das erfindungsgemäße Verfahren führt in günstiger Weise und, wie bereite unterstrichen wurde, ohne Zuhilfenahme von Fraktionie.rungsstufen zu Produkten mit Yin-Y/essler/USP-Verhältnissen von 10 oder höher, mit einer stärkeren Yin-Wessler-Wirkung als 200 UI/mg (Usage interne) (innerliche Anwendung) vorzugsweise stärker als 250 UI/mg.
Diese Produkte bestehen aus einem großen Teil von Arten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 2000 bis 6000 DaI-ton, was Strukturen mit 8 bis 30 Saccharideinheiten entspricht.
Bei einer bevorzugten Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man günstigerweise als Ausgangsmaterial ein Heparin ein, das ein Molekulargewicht von ungefähr 2000 bis 50 000 hat.
Bs kann sich um ein Heparin der klassischen pharmazeutischen Art, geeignet für Injektionen, oder ein Rohheparin handeln, wie es durch Extraktionen dieses aktiven Prinzips aus Geweben oder Organen von Säugetieren gewonnen wird, insbesondere aus dem Darmschleim oder den Lungen zum Beispiel von Schweinen oder Rindern. Es kann auch aus Produkten bestehen, die normalerweise bei der Reinigung von Heparin zwecks Darstellung eines Heparins mit Injektionsqualität und mit höherer spezifischer Wirkung abfallen.
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Das verwendete Heparin wird der 7/irkung eines chemischen Agens ausgesetzt, das in der Lage ist, unter den angewendeten SGhonenden Bedingungen das Heparin teilweise zu depolymerisieren, indem es zur Entstehung solcher biologisch akti ven Ketten wie weiter oben erwähnt führt.
Speziell wird die salpetrige Säure HIiO2 verwendet. Diese Säure wirkt auf die H-Sulfat-Glukosamin-Verbindungen des Heparins und verwandelt sie in Gruppierungen der Struktur 2,5-Anhydro-D-Manno36. Die salpetrige Säure wird vorteilhaft in situ durch Addition entsprechend kontrollierter Kengen einer Säure zu einem Mineralsalz der salpetrigen Säure, besonders einem alkalischen Salz oder einem erdalkalischen Salz, erzeugt.
Bei einer vorteilhaften Art der Ausführung der Erfindung wird insbesondere ITatriumnitrit ITaIIO2 verwendet. Um in situ die salpetrige Säure zu erzeugen, werden kontrollierte Mengen einer Säure wie z, B. Chlorwasserstoffsäure zugegeben, die ein physiologisch annehmbares Anion enthalten, wie Essigsäure oder vorzugsweise HCb.
Die Einwirkung der salpetrigen Säure auf das Heparin verläuft günstig in einem wässerigen Medium,
Die Beachtung dieser Vorkehrungen ist ganz besonders hinsichtlich der geplanten biologischen Anwendungen von Nutzen.
Das wässerige Medium, in dem die Depolymerisation erfolgt, stellt in äer Tat ein physiologisch annehmbares Milieu d.ar, was ermöglicht, jegliches Problem der Eliminierung
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eines in dieser Hinsicht schädlichen Lösungsmittels auszuschließen. Außerdem ist das Salz, das sich im Ililieu bei der Herstellung der salpetrigen Säure bildet, ein v/asserlösliches Gel, und zv/ar Natriumchlorid, dessen Anwesenheit ebenfalls nicht störend erscheint.
Die verschiedenen Kennziffern, die bei einer chemischen Reaktion eine Rolle spielen, insbesondere die Konzentrationen der Reagenzien, die Dauer, die Temperatur und der pH-Y/ert werden aufeinander abgestimmt, um die gewünschten Produkte unter den günstigsten experimentellen Bedingungen zu erhalten.
In dieser Hinsicht ist bekannt, wie eng diese Kennziffern im allgemeinen miteinander verbunden sind.
Es ist offenbar, daß die Änderung eines dieser Paktoren in der Folge die Anpassung eines oder mehrerer anderer Paktoren nach sich ziehen kann.
Die Untersuchung dieser experimentellen Bedingungen durch die Anträgstellerin hat gezeigt, daß es günstig ist, diese Reagenzien entsprechend denjenigen Mengen einzusetzen, die zu einer Ileparinendkonzentration von 1 bis 10 g, vorzugsweise von 1,5 bis 5 g, vor allem um 2 g bei 100 ml Reaktionsmedium führen, wobei die Endkonzentration des Uatriumnitrits ungefähr zwischen 0,02 M und 0,1 Ы variieren kann und vorzugsweise in der Größenordnung von 0,05 liegt. Die Chlorwasserstoffsäure wird in ausreichender Menge eingesetzt, um einen pH-Y/ert des Reaktionsmediums zwischen 2 und 35 günstigerweise von 2,2 bis 2,7 und vorzugsweise von 2,5 zu erhalten·
Wenn Ьѳі einer Temperatur zwischen O und 10° C gearbeitet wird, vorzugsweise um 4° C, läßt man der Reaktion ausreichend Zeit, um den gewünschten Depolymerisationsgrad zu erreichen. Als Richtwert erscheint eine Inkubation von 10 Ivlinuten ausreichend, wenn bei 40C gearbeitet wird.
Der Dopolymerisierungsvorgang wird dann unterbrochen. Zu diesem Zweck ist es vorteilhaft, den pH-Wert des Mediums zu erhöhen.
Die Zugabe eines alkaliseifen Agens, zum Beispiel von Hatron, in ausreichender Yienge für den Erhalt eines mindestens neutralen oder leicht alkalischen рН-7/ertes ermöglicht die gewünschte Unterbrechung der Depolymerisierungsreaktion.
Danach werden die Hukopolysaccharide getrennt, die mit einem alkoholischen Lösungsmittel ausgefällt werden können. Durch die Verwendung von reinem Äthanol in einer Kenge von etwa 5 Volumeneinheiten kann die gewünschte Trennung erreicht werden.
Der niederschlag wird gesammelt und zu seiner Anwendung gewaschen und getrocknet.
Durch die Beachtung der oben genannten Vorkehrungen isoliert man die LIPS mit YW/USP-Titern in einem Verhältnis von 10/1 mit einem Tit er der Y\7-\7irkung über 200 UI/mg ausgehend von Heparinen mit einem UV/ATSP-Verhältnis um 1.
Entsprechend einer zusätzlichen Vorkehrung werden dio Aldehydgruppen dor Reduktionsendgruppen in stabilere funktio-
-ΊΟ -
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nelle Gruppen verwandelt, wie zum Beispiel die stabileren Alkohol- oder Säuregruppen, was zu KPS-Ketten führt, cn deren Enden sich in der Mehrzahl Verbindungen der 2,5-Anhydro~D-Mannitol- oder 2,5-Anhydro»D-Mannonsäure-Struktur befinden·
Um die 2,5-Anhydro-D-Il annose-Endgruppen in 2,5-Anhydro-D-Mannitol-Gruppen zu überführen, werden die vorher durch das Ausfällen erhaltenen Produkte der V/irkung eines Reduktionsmittels ausgesetzt, indem die Bedingungen geschaffen werden, durch die wenigstens teilweise die gewünschte Umwandlung erreicht werden kann.
Das Reduktionsmittel wird unter denjenigen ausgewählt, die gewöhnlich für die Umwandlung von Aldehydgruppen in Alkoholgruppen verwendet werden. 2s erscheint günstig, von diesen Reagenzien ein metallisches Borhydrid zu verwenden.
Vorteilhaft verläuft die Reaktion mehrere Stunden lang in einem wässerigen Medium in Anwesenheit von JJatrium- oder Kaliumborhydrid·
Wenn bei Umgebungstemperatur und vorzugsweise unter Rühren gearbeitet wird, erscheint es ausreichend, das Gemisch ungefähr 4 Stunden reagieren zu lassen. Es ist eine Erhöhung des pH-Wertes des Reaktionsmediums zu beobachten. Im Falle der Verwendung von ITaBIL kann dieser pH-Wert 10 erreichen, wobei eine Freisetzung von'lTatron festzustellen ist·
Um das Borhydrid, das nicht reagiert hat, zu vernichten, wird der pH-Wert durch Zugabe von Säure gesenkt.
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In dem betrachteten Sonderfall erscheint es vorteilhaft, den pH-Y/ert durch die Zugabe von beispielsweise Essigsäure bis auf 4 zu senken.
Danach wird der pH-Wert erneut durch Zugabe eines alkalischen Agens, zum Beispiel natron auf eine Höhe nahe des lieutralwertes, insbesondere um 7,5, gebracht.
Vom Reaktionsmedium v/erden diejenigen Produkte aufgefangen, die durch Alkohol ausgefällt werden können, und der gebildete Niederschlag, der die gewünschten Produkte enthält, in denen die 2,5-Anhydro-D-Mannose Strukturen der Endgruppen in 2,5-Anhydro-D-Mannitol-Strukturen verwandelt wurden, wird gesammelt.
Die besagte Ausfällung kann vorteilhafterweise durch Zugabe von 5 Volumeneinheiten reinem Äthylalkohol erfolgen·
Um die gewünschten reduzierten Produkte zu isolieren, wird am vorteilhaftesten eine Zentrifugeerung durchgeführt, und man erhält den Zentrifugenrückstand, der danach, falls es gewünscht wird, gewaschen und getrocknet wird.
Die Untersuchung der so erhaltenen UPS zeigt, daß sie ein YW/USP-Verhältnis um 10 oder höher mit einem Titer der YW-Aktivität über 200 UI/mg, vorteilhafterweise über 250 UI/mg, haben.
Einer Variante entsprechend werden die 2,5-Anhydro-D-Mannose-Gruppen in 2,5-Anhydro-D-biannonsäuregruppen verwandelt.
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Die die Endgruppe*! 2,5-Anhydro-D-Manno3e enthaltenden Produkte läßt man unter den Bedingungen, die zur Erzielung der gewünschten Umwandlung notwendig sind, mit einem Oxydationsmittel reagieren, das unter denjenigen gewählt wird, die -gewöhnlich für die Umwandlung von Aldehydgruppen in Karbonsäuregruppen verwendet werden, insbesondere die Permanganate.
Die Reaktion verläuft vorteilhafterweise in einem wässerigen Medium mit einem pH-Y/ert oberhalb der Neutralität.
Die Oxydation der Aldöhydgruppierungen zu Säuregruppierungen zieht einen Abfall des pH-Wertes nach sich, der während der Reaktion ständig reguliert werden sollte.
Wenn bei Umgebungstemperatur gearbeitet wird, wird die gewünschte Oxydation nach ungefähr 15 Stunden erreicht. Vom Reaktionsgemisch werden diejenigen Produkte entnommen, die mit einem alkoholischen Lösungsmittel ausgefällt werden können.
Der Niederschlag wird danach vorteilhafterweise gewaschen und getrocknet.
Selbstverständlich ergeben sich die vorangehenden Angaben für das Molekulargewicht (und auch die folgenden, insbesondere in den Beispielen) aus den Messungen der Retentionszeit von Lösungen mit einem bestimmten Gehalt an •untersuchtem Material in Gel-Permeations-Sxperimenten durch eine Gelkolonno unter gleichfalls bestimmten Bedingungen der Bluierung, wobei die Logarithmen dieser Angaben des
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Molekulargewichtes das gleiche Proportionalitätsverhältnis gegenüber den oben erwähnten gemessenen Retentionszeiten aufweisen wie diejenigen des Molekulargewichts von jeweils 4000, 6500, 16000 und ЗЮ00 von Sichungs-ITatrium-Polystyrol-Sulfonaten, insbesondere die von der Firma CHROHPACK (Orsayles-Ulis, Frankreich) gehandelten, gegenüber ihren jeweiligen Retentionszeiten, gemessen in einem identischen System und unter identischen Bedingungen der Gel-Permeation.
In dem Maße, wie sich die behandelten Produkte gleich welchen erreichten Reinheitsgrades im Zustand eines Salzes eines physiologisch annehmbaren Salzes befinden, wie zum Beispiel !Tatrium, können sie danach in gemischte oder einfache Salze umgewandelt werden, die ein anderes physiologisch annehmbares Metall enthalten, wie zum Beispiel Kalzium, und zwar durch jedes für die Salze des Keparins anwendbare Verfahren. Vorteilhafterweise kann das in dem am 13. April 1973 auf den Hamen der Antragstellerin hinterlegten französischen Patent IJr. 73 13580 beschriebene Verfahren angewendet werden. Ss sei daran erinnert, daß dieses Verfahren im wesentlichen darin besteht, ausgehend zum Beispiel von einem liatriumsalz des Heparins, dieses mit einem anderen Salz eines anderen physiologisch annehmbaren Metalls, zum Beispiel Kalziumchlorid, in einer Lösung in Kontakt zu bringen, danach die nicht mit dem Heparin verbundenen bietallionen abzuscheiden (zum Beispiel durch alkoholische Ausfällung oder Dialyse), und, in dem Maße, wie der erreichte Substitutionsgrad nicht ausreichend ist, das durch den ersten Kontakt erhaltene gemischte Heparinsalz in einer Lösung mit einer v/eiteren Dosis des anderen Salzes, insbesondere Kalziumchlorid, entsprechend dem letztendlich gewünschten Substitutionsgrad in Kontakt zu bringen.
Ausführungsbeispiele:
Andere Kennziffern und Vorteile der Erfindung erscheinen in der folgenden Beschreibung der Beispiele.
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BIi)ISPIBL-I - Teilweise Depolymerisierung des Heparins und Darstellung von Oligosaccharide!! mit Reduktionsendgruppen mit der Struktur 2,5-Anhydro-D-Mannose, und zwar:
CH2OH O
OH
-0
CHO
wobei die primäre Hydroxylgruppe in 6 wiederholt insbesondere durch eine SOZ -Gruppe ersetzt werden kann·
Vorteilhafterweise setzt man den Heparinrohstoff einer schonenden 7/irkung von HITOp aus, wobei folgendermaßen vorgegangen -wird;
60 g Heparin in Handelsform mit einem YW/USP-Verhältnis um 1 und einem USP-Titer von 160 UI/mg werden in 3 1 destilliertem Wasser bei '+ 4° C gelöst«
Es wird Natriumnitrat NaIIOp in ausreichender Menge zugegeben, um eine Lösung 0,05 M, gleich 10,35 g, zu erhalten, dann wird der pH-Wert mittels reiner Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 eingeregelt und bei + 4° C 10 min. lang umgerührt« Danach wird der pH-Wert mit Hilfe von liatron 5H auf 7,5 gebracht.
Durch Zugabe von 5 Volumeneinheiten reinem Äthanol (gleich 15 500 ml) werden die Reaktionsprodukte ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugierung aufgefangen.
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Br v.1i.rä mit Äthanol gewaschen und bei 60° C unter Tiefvakuum getrocknet. Kan erhält 60 g Produkt mit folgenden Kennziffern:
USP-Titer = 17 ul/mg YW-Titer = 240 \xlMg AP TT-Titer*) =· .12 ul/mg
) Abkürzung des englischen Ausdrucks "activated partial thromboplastin time" "Zeitäquivalent des Kaolineephalin" (Caen J. und Mitarbeiter: Die Hämostasie /'Wissenschaftliche Verbreitung, 1976, 169 - 170)
In einem anderen Versuch wird wie obenstehend verfahren, jedoch wird als Ausgangsmaterial eine andere Serie Heparin mit 1б5 Ul/mg in USP-Sinheiten und einem YV//USP-Verhältnis um 1 verwendet.
Davon werden 3 g bei + 4° C in 150 ml destilliertem 7/asser gelöst, danach werden dem Reaktionsmedium 517 mg ITaIIOp zugegeben.
Am Ende der vorher beschriebenen Behandlung erhält man 2,8 mg Produkt mit einem USP-Titer von 24 Ul/mg und einem Titer der YW-Wirkung von 250 Ul/mg.
In einem weiteren Versuch unter den weiter oben beschriebenen Bedingungen verwendet man 50 g Heparin mit einem USP-Titer von 158 Ul/mg und mit einem YW/USP-Verhältnis um 1.
Sie werden in 2500 ml destilliertem Wasser gelöst und bei + 40C werden 8,625 g HaSO2 zugegeben. Am Ende' der Behänd-
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lung erhält man-4б g Produkt mit folgenden Kennziffern:
USP-Titer : 13 UI/mg
Tit er der YY/-Aktivität : 270 UI/mg APTT-Titer
7 UI/mg,
BEIS-PIS1L II - teilweise Depolymerisation des Heparins und Darstellung von Oligosacciaariden mit Sndgruppen der Struktur von 2,5 Anhydro-D-Monnitol, und zwar:
CH2OH
CH2OH
wobei der primäre Alkohol in 6 wie bereits ermähnt substituiert werden kann.
Es werden 47 g des in Beispiel I erhaltenen Produktes bei Umgebungstemperatur in 1200 ml destilliertem Wasser gelöst. Unter starkem Umrühren werden 7 g Kaliumborhydrid KBH. zugegeben« Dieses Umrühren wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur fortgesetzte Dem Reaktionsmedium wird Essigsäure zugegeben, um den pH-Y/ert auf 4,0 zu senken und so das KBH,, das nicht verbraucht wurde, zu vernichten.
Das Reaktionsrnedium wird 30 min. lang umgerührt, dann wird der pH-Wert mit IT a tr on 5 IT auf 7,5 gebracht.
Dem Reaktionsmedium werden 5 Volumenoinheiten Alkohol zugegeben.
228490 3
Der entstehende niederschlag wird aufgefangen, zentrifugiert, mit reinom Äthanol gewaschen und unter Vakuum bei 6O° C getrocknet.
Man erhält 46,5 g Produkt mit folgenden Kennziffern:
USP-Titer . · : 17 UI/mg Titer der YW-Wirkung : 250 UI/mg APTT-Titer : 11 UI/mg
BBISPIEL III - teilweise Depolymerisation des Heparins und Darstellung von Oligosacchariden mit Endgruppen mit der Struktur der 2,5-Anhydro-D-b-annonsäure, und zwar:
CH2OH
COOH
wobei die primäre Hydroxylgruppe in 6 wie bereits angegeben substituiert werden kann.
40 g des entsprechend dem letzten Versuch von Beispiel I erhaltenen Produktes werden bei Umgebungstemperatur in 400 ml destilliertem V/asser gelöst.
Der pH-Wert wird mit Natron 5ΪΤ auf 8,5 eingestellt, danach werden 2 g Kaliuinpermanganat KIvInO. in 40 ml Wasser gelöst zugegeben.
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Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden lang stark umgerührt. Während dieses Umrührens wird der pH-Wert beständig mit Katron 5Ii auf 8,5 gehalten.
Am Ende der 15 Stunden werden 0,2 Volumeneinheiten Alkohol (90 n:l) zugegeben, um das KLInO., das nicht reagiert hat, vollständig zu reduzieren·
Kan läßt das Reaktionsgemische eine Stunde lang ruhen. Durch Zentrifugieren wird der gebildete Niederschlag von KnOp eliminiert. Die Reaktionsprodukte v/erden-durch Ausfällen mit Äthanol eliminiert, gewaschen und getrocknet. Kau erhält auf diese Weise 35 g Produkt mit folgenden Kennziffern:
USP-Titer : 12 UI/reg
Titer der YW-Y/irkung : 270 UI/mg APTT-Titer : 8 UI/mg
Die gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte können in allen therapeutisch nötigen Formen γόη Salzen, besonders in Form physiologisch annehmbarer Metalle (Salze des ITatrium, Kalzium, Magnesium oder gemischte Salze) verwendet werden· Eventuell kann man durch das Verfahren, das in dem am 13. April 1973 auf den Hamen der Antragstellerin hinterlegten Patent Kr. 73 135SO beschrieben ist, von einem zum anderen übergehen.
Die pharmakologische Untersuchung der vorzugsweise entsprechend den klassischen Te.chniken, zum Beispiel durch Dialyse, Chromatographie oder alkoholische Ausfällung, erhaltenen Produkte zeigt, daß sie eine deutlich selektivere Y/irkung haben, insbesondere bei der Hemmung des Xa-Faktors,
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als das Besugsheparin, wobei die Produkte unter anderem den Vorteil aufweisen, keine Anhäufung der Blutplättchen bei den Patienten hervorzurufen, bei denen das Heparin eine solche Reaktion auslöst.
Die entsprechend der Erfindung dargestellten Produkte vmrden in unterschiedlichen Systemen getestet. Ihre Wirkung gegenüber den Blutplättche.n wurde in vitro an menschlichem Blut untersucht und ermöglichte die Beobachtung der Ergebnisse, von denen weiter oben berichtet wurde. Ss wurden ebenfalls die Blutungszeiten bei mit diesen Erzeugnissen und mit Heparin behandelten Tieren verglichen. Danach wurde überprüft, daß bei Verabreichung von 5 bis 10 mg/kg von entsprechend der Erfindung hergestellten Produkten die erhaltene Hämoglobinmenge 130 °/oo der des Plazebo beträgt, wogegen bei Heparindosen von 1,2 und 4 mg/kg Prozentsätze von 170, 180 und 323 % erzielt wurden. Die Untersuchung der antithrombotischen Wirkung in vivo bei Kaninchen entsprechend dem Modell von Wessler hat die Beibehaltung und sogar die Verbesserung der antithrombotischen Aktivität bestätigt, die durch das Heparin erreicht werden kann.
- 20 Diese Produkte sind antitoxisch·
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Die .Verabreichung von Dosen von 3200 mg/kg an Mäuse erlaubte es nicht, die LD 50 festzustellen.
Die Erfindung betrifft also insbesondere die Darstellung von Mukopolysacchariden der Art, die gerade beschrieben vmrde, die vor al]em eine Wirkung von mindestens 200 UI/mg (Yin-Wessler) ur.d ein YW/USP-Verhältnis über 6 aufweisen. Sie betrifft außerdem die Darstellung von pharmazeutischen Präparaten mit ähnlichen Wirkungen, ausgenommen pyrogene Substanzen, und in Verbindung mit pharmazeutischen Exzipienten. Sie betrifft insbesondere die Darstellung von konzentrierten Lösungen dieser Fraktionen, die injesierbar, steril, in der Therapie zur Kontrolle der Blutkoagulation anwendbar und auf besondere vorteilhafte Weise zur Vorbeugung gegen postoperatorischen Thrombosen oder Smbolien geeignet sind, wobei diese Lösungen von 1000 bis 100 000 UI/mg (Yin-Wessler) lipopolysaccharide enthalten, vorzugsweise von 5000 bis 50 000, zum Beispiel 25 000 Ul/ml, v;enn diese Lösungen für die subkutane Injektion bestimmt sind, oder sie enthalten auch zum Beispiel 500 bis 10 000 Einheiten Ul/ml Mukopolysaccharide, wenn sie für' die intravenöse Injektion oder die Infusion bestimmt sind.
Die gemäß- der Erfindung dargestellten ilukopolysaccliaride liegen vorzugsweise in Salzform mindestens eines physiologisch annehmbaren Metalles wie natrium und/oder Kalzium vor. Vorteilhafterweise «erden diese pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von im gegebenen Augenblick gebrauchsfertigen einmalig zu verwendenden Spritzen angeboten.
Die entsprechend der Erfindung dargestellten Zusammensetzungen sind besonders der Kontrolle (präventiv oder
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kurativ) der Blutkoagulation bei Mensch Und Tier angepaßt, besonders in solchen Fällen, wo beim Empfänger die Gefahr der Hyperkoagulabilität vorliegt, insbesondere wenn sie sich aus einer Störung der erwähnten äußeren Phase ergibt, zum Beispiel infolge einer· Freisetzung von Thrombokinase durch den Organismus, zum Beispiel von geweblicher Thrombokinase (chirurgische Eingriffe, atheromatöse Prozesse, Entwicklung von Tumoren, Störung der Mechanismen der Koagulation durch'bakterielle oder enzymatische Einwirkungen usw.). Nur um die Erfindung zu veranschaulichen und ohne daß dies ein Grund für die Eingrenzung des Schutzes der Erfindung sein könnte, v/ird nachstehend als Beispiel eine für den Menschen anwendbare Dosierung angegeben. Sie besteht zum Beispiel in einer Verabreichung von 1000 bis 25 000 UI an den Patienten, und zwar auf subkutanem Weg zwei- oder dreimal täglich, entsprechend dem Grad der Hyperkoagulationsgefahr oder dem thrombotischen Zustand des Patienten, oder von 1000 bis 25 000 UI in 24 Stunden auf intravenösem Weg bei diskontinuierlicher Verabreichung .in regelmäßigen Intervallen oder kontinuierlich durch Infusion, oder auch von 1000 bis 25 000 UI (dreimal pro Y/oche) auf intramuskulärem Weg (Titer in YI/Yin-V/essler ausgedrückt). Diese Dosen werden gegebenenfalls für jeden Patienten entsprechend den Ergebnissen der vorher erfolgten Blutanalysen, der Art des Leidens des Patienten und allgemein entsprechend seinem Gesundheitszustand abgewandelt, wie gut bekannt ist.
Die Erfindung betrifft ebenfalls auch die Anwendung der entsprechend der Erfindung hergestellten L.ukopolysaccharide für die Herstellung von biologischen Reagenzien für Laborarbeiten, besonders als Vergleichsgröße für die Untersuchung anderer Erzeugni.sse, bei denen die gerinnungshemmende Wirkung getestet wird, insbesondere hinsichtlich der Hemmung des XA-Paktors.

Claims (9)

  1. ERP Hf DUKGS AlISPRU CH
    Verfahren гиг Herstellung von I^ukopolysacchariden mit erhöhter Anti-Xa-Wirkung (Yin-Y/essler) mit einem Verhältnis ihres Yin-Wessler-Titers zu ihrem USP-Titer von mindestens 2, durch Depolymerisation des Heparins durch Einwirkung eines chemischen Agens, dadurch gekennzeichnet, daß man das Heparin mit Ketten mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 50 000 der schonenden Einwirkung eines chemischen Agens aussetzt, das in der Lage ist, die Heparinketten zu depolymerisieren oder zu fragmentieren, insbesondere durch Einwirkung von salpetriger Säure, wobei diese Reaktion unter aufeinander abgestimmten Bedingungen abläuft, um eine teilweise Depolymerisierung des Heparinausgangsmaterials bis zur Herstellung eines Gemisches zu ermöglichen, das größtenteils aus Produkten mit einem Yin-Wessler/USP-Titer-Verhgltnis über 2, besonders mindestens 3, vorzugsweise über 6 besteht und das Reduktionsendgruppen der Struktur 2,5~Anhydro-D-Kannose enthält:
    CH2OH
    Danach werden vom Reaktionsmedium die durch eine alkoholische Losung ausfällbaren Produkte abgeschieden und entnommen.
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Depolymerisierungsreaktion in wässerigem Medium abläuft, wobei die salpetrige Säure in situ durch Addition von kontrollierten Kengen einer Säure· zu einem Mineralsalz der salpetrigen Säure -erzeugt wird.
    228490 3
  3. 3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Mineralsalz der salpetrigen Säure ITatriumnitrit ist.
  4. 4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die salpetrige Säure in situ durch Addition von Chlorwasserstoff säure zu natriumnitrat erzeugt wird.
    Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration an Heparin vorteilhafterv;eise 1 bis 10 g, vorzugsweise 1,5 bis 5 g und insbesondere um 2g für 100 ml Reaktionsmediuni liegt, wobei die Endkonzentration des blineralsalzes der salpetrigen Saure, und zwar insbesondere des Hatriumnitrits, von 0,02 M bis 0,1 Ы variieren kann und vorzugsweise um 0,05 M liegt.
    Verfahren nach Punkt 4 oder 5, gekennzeichnet dadurch, daß für die Erzeugung der salpetrigen Säure in situ Chlorwasserstoffsäure in kontrollierter und ausreichender Menge zugegeben wird, um einen pH-Y/ert zwischen 2 und 3» vorteilhafterweise von 2,2 bis 2,7 und vorzugsweise von 2,5 zu erreichen.
  5. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß bei Temperaturen von 0 bis 10° C, vorzugsweise um 4° C, eine für die Erreichung des gewünschten Dapolymerisationsgrades ausreichende Zeit lang gearbeitet wird, wobei diese Zeit ungefähr 10 min. beträgt, wenn bei 4° C gearbeitet wird.
    228490 3
  6. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7', gekennzeichnet dadurch, daß die Depolymerisation unterbrochen wird, indem, der pHrV/ert des Reaktionsmediums durch Addition eines alkalischen Ag ons Ms zu fast neutralen oder leicht alkalischen Werten erhöht Mira.
  7. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß für die Entnahme der gewünschten Fraktionen mit 2,5-A.nhydro-D-Kannose-Endgruppen dem Reaktionsmedium Alkohol zugesetzt wird, vorteilhafterweise ungefähr in einer Menge von mindestens 5 Volumeneinheiten im Verhältnis zum Volumen dieses Mediums. Der entstandene Niederschlag wird entnommen·
  8. 10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe, durch die die Sndgruppen der Struktur 2,5~Anhydro~D-Mannose in Gruppen der Struktur 2,5-Anhydro-D-Mannitol durch Reduktion mittels eines Reduktionsagens umgewandelt werden, das unter denjenigen gewählt wird, die gewöhnlich für die Umwandlung von Aldehyügruppen in Alkoholgruppen verwendet werden, insbesondere durch ein metallisches Borhydrid. Die dargestellten reduzierten Produkte werden entnommen.
  9. 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis S1 gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe, durch die die Sndgruppen der Struktur 2,5-Anhydro-D~I.':annose in Gruppen der Struktur 2,5-D-Anhydro-Karmonsäure umgewandelt werden, indem die tlukopolysaccharidprodukte der Wirkung eines Ortydationsmittels ausgesetzt werden, das unter denjenigen ausgewählt wird, die gewöhnlich für die Umwandlung von Aldehydgruopen in Säuregruppen verwendet werden.
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