DE2834702C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für Heparin und Heparinsalze sowie die in diesem Verfahren entstehenden Produkte, die gegenüber bekannten Heparinsalzen verbesserte Eigenschaften aufweisen und ihre Verwendung.

Natriumsalze von Heparin (im folgenden: Natriumheparinate) werden üblicherweise zur Herstellung von Heparin-Injektionslösungen verwendet. In jüngerer Zeit werden auch gemischte Calcium- Natrium-Heparinate oder Calcium-Magnesium-Heparinate und insbesondere Calciumheparinate angewandt, um verschiedene un­ erwünschte Gefäßreaktionen insbesondere an der Injektionsstelle zu vermeiden, die von den Natriumionen verursacht werden.

Gemischte Heparinate, d. h. Calcium-Natrium-Heparinate oder Calcium-Magnesium-Heparinate und natriumfreie Heparinate, insbesondere Calcium-Heparinate, können aus Heparinaten, z. B. Natriumheparinat, nach dem Verfahren der GB-PS 14 71 482 hergestellt werden. Hierbei bringt man das eingesetzte Einfachsalz von Heparin in einem wäßrigen Medium mit einem Salz des gewünschten Metalls in Berührung, das zumindest teilweise das Metall in dem eingesetzten Heparinsalz ersetzen soll. Hierbei entsteht als Zwischenprodukt ein gemischtes Heparin­ salz, das das gewünschte Metall enthält und von den freien Metallionen, die in dem Medium enthalten sind, abgetrennt wird. Je nach dem gewünschten Anreicherungsgrad des Substitutions­ metalls wird das als Zwischenprodukt entstandene Heparinsalz nochmals in einem wäßrigen Medium mit einem Salz des ge­ wünschten Metalls in Berührung gebracht. Die Verfahrensbe­ dingungen können hierbei gegebenenfalls so gewählt werden, daß ein einfaches Heparinat des Substitutionsmetalls entsteht, das das in dem ursprünglichen Heparinsalz enthaltene Metall nicht mehr enthält.

Bei der Lagerung von Lösungen von Heparinsalzen, die Calcium­ ionen enthalten, hat sich gelegentlich gezeigt, daß sich Niederschläge bilden oder die Lösungen trübe werden. Diese Erscheinungen, die bei konzentrierten Heparinlösungen noch deutlicher ausgeprägt sind, sind vor allem bei Heparin-Injektions­ lösungen für den therapeutischen Einsatz von Nachteil, die vor­ her industriell angefertigt werden, insbesondere in Form von vorbestimmten Dosierungen, z. B. in Form von Ampullen oder Einmal­ spritzen, welche dementsprechend selbst nach mehrmonatiger Lagerung völlig klar bleiben müssen. Die Bildung geringer Nieder­ schlagsmengen oder selbst eine geringe Trübung macht derartige Lösungen für die therapeutische Verabreichung unbrauchbar.

Dies trifft umso mehr zu, als Teilchen oder Kristalle mit einer Größe unterhalb etwa 50 µm unsichtbar sind und andererseits die Kapillargefäße des Menschen einen Innendurchmesser von nur 1 bis 3 µm aufweisen. Die Anwesenheit derartiger Teilchen oder Kristalle, die ohne optische Ausrüstung unsichtbar sind, in Injektionslösungen ist insbesondere dann gefährlich, wenn als Wirkstoff Heparin, das gerinnungshemmende Eigenschaften aufweist, injiziert wird. Die durch die in den Patienten injizierten festen Teilchen hervorgerufenen hämorrhagischen Risiken können durch die einerseits erwünschte Aktivität von Heparin noch erhöht werden.

Die Tatsache, daß die Lösung klar bleibt, muß nicht notwendiger­ weise bedeuten, daß sich kein Niederschlag gebildet hat. Insbesondere in den Fällen, bei denen die Ausfällung sehr langsam vonstatten geht, kann es vorkommen, daß die winzigen Kristalle (insbesondere unsichtbare Kristalle mit einer Größe von weniger als 50 µm) zu einigen wenigen, wenn nicht gar zu einem relativ großen Kristall zusammenwachsen, der natürlich die Gesamtklarheit der Lösung nicht beeinflußt. Die Injektion einer derartigen Lösung kann daher zumindest genauso schädlich sein wie im vorangehenden Fall.

Die vorstehend geschilderten Risiken sind umso größer, je höher die Heparinkonzentration in der pharmazeutischen Standard­ lösung ist. Sie können jedoch je nach der Injektionsart (subkutan, intramuskulär, intravenös) variieren. Bekannt­ lich ist es oft erwünscht, möglichst hohe Heparinkonzentrationen einzusetzen, wodurch die Möglichkeit der Ausfällung oder der Anwesenheit von unsichtbaren Teilchen in wachsender Anzahl ein ernsthaftes Problem darstellen kann.

Um diese Schwierigkeiten zu beheben, werden die frisch herge­ stellten Heparinlösungen, insbesondere Lösungen von Heparin­ salzen mit physiologisch verträglichen Metallen, die zumindest teilweise von Calcium gebildet werden, relativ lange gelagert, worauf man gegebenenfalls entstandene Niederschläge abfiltriert, bevor die Lösungen weiter gehandhabt werden, z. B. in Ampullen oder Einmalspritzen aufgeteilt werden. Hierbei ist es offen­ sichtlich, daß mit größerer Vorlagerungszeit die Herstellung der pharmazeutischen Präparate unwirtschaftlicher wird.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, Heparin von Injektions­ qualität bereitzustellen, das zur Herstellung von Lösungen, insbesondere Injektionslösungen, mit guter Lagerbeständigkeit verwendet werden kann. Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Heparine bereitzu­ stellen, bei dem die beschriebene Vorlagerung unterbleiben kann.

Es wurde nun gefunden, daß die meisten dieser Schwierigkeiten darauf beruhen, daß die Heparin-Injektionslösungen Mineral­ salze von verschiedener Natur und in unterschiedlichen Mengen (bis zu 2,5 Gewichtsprozent) enthalten, je nach dem Ursprung der untersuchten Probe und den angewandten Verfahren zu ihrer Extraktion aus natürlichen Quellen und/oder zum Entfärben (oder Bleichen) der erhaltenen natürlichen Heparine, damit sie der für Heparine von Injektionsqualität üblicherweise geforderten Farblosigkeit genügen. Dies gilt auch trotz der Tatsache, daß der Gehalt an Mineralsalzen innerhalb der von geltenden Vorschriften tolerierten Grenzen liegt, z. B. den Standards des französischen Codex.

Der größere Teil der Restsalze besteht aus Chloraten und Sulfaten in einer Menge von jeweils bis zu 1%. Andere Salze, insbe­ sondere Carbonate und Sulfite, sind in kleineren Anteilen vor­ handen. Die Umwandlung der Natriumsalze von Heparin in calcium­ haltige Salze von Heparin, z. B. nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren, sollte auf Grund der geringen Löslichkeit von Calcium­ sulfat, -sulfit und -carbonat, den Anteil dieser Salze verringern.

Die Calciumsalze sollten als Feststoffe von der klaren Lösung der calciumhaltigen Heparinsalze abtrennbar sein.

Überraschenderweise hat sich jedoch gezeigt, daß gegen Ende der Umwandlung von Natriumheparinat in Calciumheparinat, ins­ besondere bei Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, der Anteil der genannten Rest-Mineralsalze im Vergleich zum ursprünglichen Natriumheparinat nur gering modifiziert wird.

Noch überraschender war die Erkenntnis, daß Heparinsalze, einschließlich Salze von Metallen, von denen zumindest ein Teil Calcium ist, in Form von klaren wäßrigen Lösungen solubilisiert werden können, obwohl sie geringe, doch nicht vernachlässigbare Mengen an Oxalationen enthalten. Dies ist umso überraschender, als Oxalate von Metallen, wie Calcium, bekanntlich in Wasser sehr wenig löslich sind.

Der genaue Grund für dieses Verhalten ist noch nicht bekannt. Es ist jedoch eine Änderung der normalen Löslichkeitseigen­ schaften von Calciumoxalaten festgestellt worden, insbesondere wenn Calciumchlorid im Überschuß vorhanden ist. Es hat sich gezeigt, daß handelsübliche injizierbare Heparine oder Heparinate Restsalzgehalte von 1,0 bis 2,5 Gewichtsprozent aufweisen können. Zahlreiche Versuche mit solchen Proben haben gezeigt, daß ihr Oxalatgehalt durchweg über 90 ppm liegt. In einem Fall wurde ein Oxalatgehalt von 40 ppm gefunden, dieses Ergebnis stellte sich jedoch später als falsch heraus. Typischerweise liegt bei im Handel verfügbaren injizierbaren Heparinpräparaten der Oxa­ latgehalt zwischen 90 und 300 ppm, in manchen Fällen sogar hoch höher.

Es wurde gefunden, daß die Abtrennung von Mineralsalzen, insbesondere Oxalatspuren, aus den behandelten Heparinen zur Folge hat, daß die nach der Herstellung von Calciumheparinat­ lösungen auftretenden Trübungen und Niederschläge verschwinden. Ferner wurde gefunden, daß bei längerer Lagerung keine wesent­ liche Zunahme an unsichtbaren Teilchen (nachweisbar mit üblichen optischen Vorrichtungen, z. B. Teilchenzählern zum Nachweis von Teilchen mit einer Größe von 2 bis 50 µm) in diesen Lösungen zu beobachten ist, wenn der Gehalt an Oxalationen ausreichend verringert wird.

Gegenstände der Erfindung sind daher Heparinsalze gemäß Patentanspruch 1, das Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß Patentanspruch 2 und ihre Verwendung gemäß Patentanspruch 3.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigten Lösungen von Calcium- oder gemischten Calciumheparinaten bleiben selbst nach mehrmonatiger Lagerung klar. Es treten weder Trübungen noch Niederschläge auf. Ihr Gehalt an unsichtbaren Teilchen nimmt selbst bei längerer Lagerung nicht zu, so daß die vorstehend beschriebenen Ge­ fahren einer Kristallkoaleszenz ebenfalls verringert werden.

In den Heparinen oder Heparinsalzen der Erfindung ist somit der Gehalt an Rest-Mineralsalzen, insbesondere Oxalaten, ausreichend niedrig, damit aus diesen Heparinen und insbesondere aus Calciumheparinatlösungen Injektionslösungen mit der für diese Applikationsart üblichen Konzentration hergestellt werden können, die selbst nach mehrmonatiger Lagerung vollständig klar bleiben, z. B. mindestens 6 Monate.

Die Heparinsalze der Erfindung enthalten weniger als 70, vorzugsweise weniger als 30 ppm und insbesondere weniger als 20 ppm Oxalationen und können zu Lösungen, insbesondere Injektionslösungen, verarbeitet werden, die klar bleiben und deren Gehalt an unsichtbaren Teilchen, falls überhaupt vorhanden, bei längerer Lagerung, die zwei Jahre lang und sogar drei bis fünf Jahre dauern kann, im wesentlichen konstant bleiben.

Diese Angaben zur Lagerung beziehen sich auf Raumtemperatur, also auf den Bereich von etwa 20 bis 25°C. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Rest-Mineralsalzen weniger als 0,5%, vorzugsweise weniger als 0,3%.

Der Ausdruck "Mineralsalze" ist nicht auf Salze von Mineralsäuren, wie Schwefel- oder Salzsäure beschränkt, sondern schließt auch Salze von Säuren, wie Oxal- oder Kohlensäure, oder sogar von niedermolekularen organischen Säuren, wie Essigsäure, ein. Alle derartigen Salze können als Nichtheparin­ salze betrachtet werden.

Es wurde gefunden, daß derartige Heparinsalze zur Herstellung von Injektionslösungen verwendet werden können, die über längere Zeit lagerfähig sind, selbst wenn das Metall des Heparinsalzes zumindest teilweise ein Metall ist, dessen Oxalate nicht wasserlöslich sind, z. B. Calcium.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstel­ lung dieser gereinigten Heparine aus handelsüblichen Produkten, einschließlich stark verfärbten Heparinprodukten, wie sie in herkömmlichen Entfärbungsverfahren, insbesondere Oxidations­ verfahren anfallen, in denen im allgemeinen der Oxalatgehalt der behandelten Heparine erhöht wird.

Das Verfahren der Erfindung geht aus von den zu reinigenden Heparinpräparaten, im allgemeinen einem Gemisch aus Heparin und anderen Salzen, insbesondere Mineralsalzen, und führt eine selektive Ausfällung unter Nutzung des Löslichkeitsunter­ schiedes zwischen den Heparinsalzen und den Rest-Mineralsalzen durch. Hierbei wird eine wäßrige Lösung, die das Heparin- Mineralsalzgemisch enthält, mit einer geeigneten Menge eines nicht-ionischen Fällungsmittels versetzt, z. B. einem Alkohol, wie Äthanol, um eine selektive Ausfällung des Heparins oder der Heparinsalze zu bewirken, während die Mineralsalze in der wäßrigen Lösung bleiben. Hierauf trennt man das Heparin ab und wiederholt gegebenenfalls diese selektive Trennung mit einer neuen wäßrigen Lösung des gewonnenen Heparins, bis die Oxalatkonzentration in dem erhaltenen Heparin unter einem Schwellenwert liegt, der in vielen Fällen 70 ppm sein kann, jedoch so niedrig wie 30 ppm sein kann und vorzugsweise noch unter 20 ppm liegt, wenn längere Lagerungszeiten (z. B. 2 Jahre oder auch 3 bis 5 Jahre) erforderlich sind und wenn absolute Sicherheit für diesen Zeitraum gefordert wird, daß keine Fällungen auftreten. Es wird auch in Betracht gezogen, den Oxalationengehalt bis auf Spuren zu senken, bezogen auf die mit den derzeit verfügbaren Methoden bestehenden Nachweis­ möglichkeiten.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Heparin in Form eines Salzes eines Metalls, wie Natrium, Lithium oder Kalium, verwendet, dessen Oxalate wasserlöslich sind. Das Metall des schließlich erhaltenen gereinigten Heparins, das im wesentlichen von seinem Oxalatgehalt befreit ist, kann zumindest teilweise durch ein anderes Metall ersetzt werden, insbesondere Calcium, dessen Oxalate wasserunlöslich sind, oder gegebenenfalls durch Magnesium.

Die Konzentration der eingesetzten Heparinlösung kann stark variieren. Aus praktischen Gründen ist es bevorzugt, keine zu verdünnten Lösungen zu verwenden, da das verwendete Äthanol­ volumen proportional dem der behandelten Lösung ist. Für eine gleiche Heparinmenge ist eine um so größere Äthanolmenge erforderlich, je verdünnter die Lösung ist. Andererseits dürfen die Heparinlösungen einen gewissen Konzentrationsgrad nicht überschreiten, da ihre Viskosität rasch zunimmt und die Heparin­ ausfällung aus derartigen Lösungen möglicherweise dazu führt, daß eine große Menge der ursprünglichen Verunreinigungen, die abgetrennt werden sollen, mitgefällt wird.

Das Verfahren wird daher vorzugsweise mit Lösungen durchgeführt, deren Konzentration in etwa der von gewöhnlichen Injektions­ lösungen entspricht, d. h. die etwa 40 bis 250 g/l Natrium­ neparinat enthalten, entsprechend etwa 5000 bis 30 000 IE/ml.

Der pH der Lösung beeinflußt das Ergebnis der Reinigung. Eine saure Lösung hält die Mineralsalze eher in Lösung zurück, insbesondere die Oxalate, und verbessert daher das Trennergebnis. Daneben kann jedoch Heparin durch starke Säuren angegriffen werden. Es werden daher vorzugsweise Lösungen mit einem pH oberhalb 3,5, insbesondere zwischen 5 und 7, angewandt.

Die so hergestellte Heparinlösung wird mit einer ausreichenden Äthanolmenge versetzt, so daß praktisch das gesamte Heparin ausfällt, während die Mineralsalze in der wäßrigen Alkohol­ lösung verbleiben. Vorzugsweise verwendet man ein Volumenteil Heparinlösung pro 0,5 bis 1,5 Volumenteile Äthanol. Vorzugs­ weise wird praktisch reiner neutraler Alkohol angewandt (99 bis 100°GL).

Der Heparinniederschlag wird dann von dem Überstand abgetrennt und geknetet und gewaschen, um verbliebene Spuren der Lösung zu entfernen. Das Auswaschen erfolgt vorzugsweise mit absolutem Alkohol. Hierauf wird das Heparin filtriert und getrocknet. Sollte diese erste Trennung unvollständig sein, wird die Behandlung des Heparinniederschlages gegebenenfalls wiederholt, bis Heparin­ salze erhalten werden, die den vorstehenden Anforderungen genügen.

Das meiste eingesetzte Heparin wird bei der beschriebenen Aus­ fällung wiedergewonnen; der Rest verbleibt in der wäßrigen Alkohollösung. Diese kann mit einer weiteren Menge Alkohol be­ handelt werden, um eine neue Heparinfällung zu erhalten.

Das Reinigungsverfahren der Erfindung ist in allen Fällen anwend­ bar, bei denen in handelsüblichen Heparinen von beliebiger Quelle enthaltene Oxalate abgetrennt werden sollen. Obwohl jedoch das Verfahren das Entfernen von meßbaren freien Oxalaten ermöglicht, bis die Heparine weniger als 30, vorzugsweise weniger als 20 ppm, enthalten, hat sich in einigen Fällen bei der Be­ handlung von Heparinsalzen eines Metalls, wie Natrium, dessen Oxalat wasserlöslich ist, gezeigt, daß beim zumindest teilweisem Überführen dieses Heparinsalzes in das eines Metalls, wie Calcium, dessen Oxalate unlöslich sind, das schließlich erhaltene Produkt größere Mengen an freien Oxalaten enthält. Obwohl noch keine Erklärung für diese Erscheinung gefunden wurde, wird vermutet, daß ein Teil der in handelsüblichen Heparinen aus bestimmten Quellen enthaltenen Oxalate sich so verhält, als wären sie an des Heparinmolekülen absorbiert oder fixiert. Das Heparin ver­ hält sich somit als eine Art Anionenaustauscher. Diese Erscheinung kann dazu führen, daß die erhaltenen Heparinsalze weiterhin nicht zur Herstellung von Heparin-Injektionslösungen verwendbar sind, die über längere Zeit gelagert werden können.

Es wurde jedoch gefunden, daß diese Schwierigkeiten behoben werden können, wenn man in einer Abwandlung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens das nicht-ionische Heparin-Fällungsmittel in den vorstehend beschriebenen Reinigungsstufen mit einer zu reinigenden wäßrigen Lösung von Heparin (oder des Heparin-Mineralsalzgemisches) in Be­ rührung bringt, die wasserlösliche Mineralsalze außer Oxalaten in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Abtrennung der Oxalate zu begünstigen, einschließlich der scheinbar fixierten oder adsorbierten Oxalate, die dann freigesetzt werden und bei der anschließenden Ausfällung der Heparinsalze in der wäßrigen Lösung verbleiben.

Einige der in der zu reinigenden Heparinlösung vorhandenen anderen Salze können daher beim Einstellen einer geeigneten Konzentration in der Lösung gegebenenfalls eine vollständigere Extraktion der Oxalationen bewirken.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens ist es daher gewöhnlich notwendig, die Konzentration dieser wasserlöslichen Mineralsalze in der eingesetzten wäßrigen Heparinlösung vor dem Kontaktieren dieser Lösung mit dem nicht- ionischen Heparin-Fällungsmittel einzustellen. Es hat sich gezeigt, daß eine ausreichende Konzentration insbesondere von Salzen, die zweiwertige Anionen und vorzugsweise auch einwertige Anionen enthalten, offensichtlich bewirkt, daß die möglicherweise an dem Heparin adsorbierten oder fixierten Oxalate verdrängt werden.

Gegebenenfalls kann man dann die Fällungsstufen wiederholen, indem man eine Lösung des gewonnenen Heparins und von wasser­ löslichen Mineralsalzen (mit Ausnahme von Oxalaten) in der vorstehend definierten Konzentration nochmals behandelt, bis die Konzentration an Gesamtoxalaten in dem erhaltenen Heparin weniger als 30 ppm, vorzugsweise weniger als 20 ppm, beträgt.

Bevorzugte Metalle von Salzen mit zweiwertigen Anionen (außer Oxalaten), die in der eingesetzten Heparinlösung enthalten oder dieser gegebenenfalls zugesetzt werden, sind Metalle, deren Oxalate wasserlöslich sind. Carbonate und insbesondere Natriumcarbonate haben sich im Verfahren der Erfindung als besonders wirksam erwiesen. Vorzugsweise liegt das Heparin in der genannten Lösung auch in Form eines Heparinsalzes des­ selben Metalls wie das der Mineralsalze vor. Die Möglichkeit eines Austausches des in den Mineralsalzen enthaltenen Metalls mit dem Metall des Heparinsalzes wird somit vermieden, so daß der Metallgehalt der gereinigten Heparinsalze genau kon­ trolliert werden kann.

Die Konzentration der Mineralsalze in der Lösung, die mit dem nicht-ionischen Fällungsmittel, z. B. einem Alkohol, in Be­ rührung gebracht wird, beträgt vorzugsweise 0,3 bis 2,5, z. B. etwa 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf Heparin.

Vorzugsweise enthält die eingesetzte Lösung auch Salze mit einwertigen Anionen mindestens eines Metalls, dessen Oxalat wasserlöslich ist, z. B. Natriumchlorid. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Konzentration dieses einwertigen Salzes 1 bis 7, z. B. etwa 2,5 Gewichtsprozent/Volumen der Lösung oder wird auf diesen Wert eingestellt.

Es hat sich als vorteilhaft, jedoch nicht notwendig erwiesen, den pH der Lösung, die mit dem nicht-ionischen Fällungsmittel in Berührung gebracht wird, auf einen Wert von 7 bis 10, z. B. etwa 8,5, einzustellen. Dieser pH-Wert stellt sich automatisch ein, wenn man als Salz mit zweiwertigen Anionen Natrium­ carbonat verwendet.

Diese Salze mit zweiwertigen und/oder einwertigen Anionen können in der Endstufe des Verfahrens leicht abgetrennt werden, z. B. in der letzten Kontaktierstufe der Heparin­ lösung mit dem nicht-ionischen Mittel. Vorzugsweise stellt man dann den pH, z. B. mit Salzsäure, auf einen leicht sauren Wert ein, der zur Zersetzung der Carbonate ausreicht, vorzugsweise einen pH von 3 bis 7. Die Chloridionen verbleiben beim Aus­ fällen des Heparinsalzes in der wäßrigen Lösung.

Es werden somit im wesentlichen oxalatfreie Heparinpräparate, insbesondere Heparinsalze, erhalten, die

• - entweder direkt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten verwendet werden können, insbesondere Injektions- oder Infusions­ lösungen mit langer Lagerfähigkeit, selbst wenn die Metallkationen der Heparinsalze zumindest teilweise von Metallen gestellt werden, deren Oxalate sehr wenig löslich sind, z. B. Calcium,
• - oder nach dem Verfahren der GB-PS 14 71 482 als Ausgangs- Heparinsalze, deren Metallkationen zumindest teilweise vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise ersetzt werden können, in andere, im wesentlichen oxalatfreie Heparinsalze überführt werden können, die dann zu pharmazeutischen Präparaten mit langer Lagerfähigkeit verarbeitet werden.

Gegenstand der Erfindung sind daher insbesondere oxalatfreie Heparinpräparate und Metallsalze von Heparin, d. h. entweder Einfachsalze von Heparin, wie die Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalze von Heparin, oder gemischte Heparinsalze, die mindestens zwei der genannten Metallkationen in beliebigen Mengenverhältnissen enthalten, wobei alle diese Heparinsalze im wesentlichen frei von Oxalaten sind, da sie einen Schwel­ lenwert von 70 ppm unterschreiten, in vielen Fällen sogar so wenig wie 30 ppm Gesamtoxalate enthalten (im wesentlichen: oxalatfreie Heparine). Als gemischte Salze sind jene bevor­ zugt, die Natrium und Calcium enthalten.

Die erfindungsgemäßen Heparinpräparate sind in pharmazeuti­ schen Präparaten verwendbar, die das oxalatfreie Heparin neben einem pharmazeutischen Träger enthalten. Die Heparin­ präparate sind insbesondere pyrogenfrei, oxalatfrei, vorzugs­ weise farblos und weisen eine Aktivität von mindestens 120, vorzugsweise mehr als 150 IE/mg auf. Für die subkutane Injektion finden insbesondere oxalatfreie, vorzugsweise farblose Lösungen, die 5000 bis 35 000, vorzugsweise 20 000 bis 30 000, z. B. 25 000 IE/ml Heparin enthalten, oder für die intravenöse Injektion oxalatfreie Lösungen, die 1000 bis 10 000, z. B. 5000 IE/ml Heparin enthalten, Verwendung.

Vorzugsweise liegt das Heparin in diesen Mitteln in Form eines physiologisch verträglichen Metallsalzes vor, das ein oder mehrere Metallkationen enthält. Vorzugsweise ist das Metall zumindest teilweise Calcium. Besonders bevorzugt sind Heparinsalze, bei denen Calcium das einzige Metall ist. Die pharmazeutischen Präparate können mit Vorteil zu anwendungs­ fertigen Einmalspritzen verarbeitet werden.

Das oxalatfreie erfindungsgemäße Heparin eignet sich außerdem zum Regeln der Blutgerinnung beim Menschen. Hierbei wird eine wirksame Dosis verabreicht, z. B. 13 500 bis 50 000 IE subkutan zweimal täglich, wie es der thrombotische Zustand des Patienten erfordert, oder 20 000 bis 50 000 IE pro 24 Stunden intravenös, gleichmäßig verteilt über den Tag, vorzugsweise durch kontrollierte Infusion, oder 5000 bis 10 000 IE dreimal wöchentlich intramuskulär.

Das erfindungsgemäß gereinigte Heparin kann direkt z. B. zur Herstellung von Injektionslösungen mit der üblichen Dosierung und Konzentration verwendet werden. Es kann aber auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung anderer Salze, z. B. Calcium­ heparinaten oder gemischten Calcium-Magnesium- oder Calsium- Natrium-Salzen, z. B. nach dem Verfahren der GP-PS 14 71 482, verwendet werden.

Erstes Beispiel eines bevorzugten Reinigungsverfahrens für Heparin

In einem bevorzugten Alkoholfraktionierungs-Reinigungsverfah­ ren für injizierbares Natriumheparinat wird Natriumheparinat vom Rind oder Schwein von Injektionsqualität verwendet. Das Heparinat wird in entsalztem Wasser aufgelöst (spezifischer Widerstand 300 000 bis 800 000, vorzugsweise 500 000 Ω/cm). Die Konzentration der Heparinlösung wird auf 5000 bis 30 000, vorzugsweise 25 000 IE/ml eingestellt. Hierauf gibt man 0,3% m-Kresol zu, um eine Kontamination zu verhindern. Der pH der Lösung wird durch Zugabe von 5 n Natronlauge oder 5 n Salzsäure auf einen Wert von 5 bis 7 eingestellt. Die Leitfähigkeit der Lösung beträgt 7000-15 000 µS/cm (7000 bis 15 000 µmhos/cm).

Die erhaltene Heparinatlösung wird mit 0,7 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt und stehenge­ lassen, bis sich der Niederschlag absetzt. Gegebenenfalls gibt man eine geringe Menge Natriumchlorid zu. Der Nieder­ schlag wird dann von dem Überstand abgetrennt und nochmals in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften gelöst, so daß eine Konzentration von etwa 12 500 IE/ml erhalten wird. Der pH wird erforderlichenfalls mit 5 n Natron­ lauge oder 5 n Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf man die Lösung durch ein 0,3 µ-Millipore-Filter filtriert. Ein Volumen­ teil der Lösung wird dann unter Rühren mit 1,2 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt. Man läßt den Niederschlag, gegebenenfalls unter Zugabe einer geringen Menge Natriumchlorid, absetzen.

Der erhaltene Heparinniederschlag wird entwässert, indem man ihn in absolutem Äthanol zerstößt, auf einem Büchner- Trichter unter vermindertem Druck filtriert, mit absolutem Alkohol auswäscht und bei 35 bis 40°C/1,33 mbar trocknet.

Falls weitere Fällungen erforderlich sind, werden sie genauso wie die zweite Fällungsstufe durchgeführt, d. h. mit einer Heparinkonzentration von 12 500 IE/ml, einem pH von 5,5 und 1,2 Volumenteilen absolutem Alkohol pro 1 Volumenteil Lösung.

Zweites Beispiel einer bevorzugten Verfahrensweise Erste Alkoholfraktionierung

Natriumheparinat vom Rind oder Schwein von Injektionsqualität wird in entsalztem Wasser gelöst, das einen spezifischen Wider­ stand von 300 000 bis 800 000, vorzugsweise 500 000 Ω/cm auf­ weist. Die Heparinkonzentration beträgt 5000 bis 30 000, vor­ zugsweise 25 000 IE/ml. Hierauf gibt man m-Kresol bis zu einer Konzentration von 0,003% zu. Der pH der Lösung wird durch Zugabe einer Natriumcarbonatlösung (wasserfreies Natriumcarbonat in einem Mengenanteil von 0,5%, bezogen auf das eingesetzte Heparingewicht) auf einen Wert von 7 bis 10, vorzugsweise 8,5, eingestellt. Die Leitfähigkeit der erhaltenen Lösung beträgt 7000-15 000 µS/cm (7000 bis 15 000 µmho/cm). Hierauf versetzt man die Lösung mit Natriumchloridkristallen in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen. Die Heparinlösung wird dann pro Volumenteil mit 0,7 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) unter Rühren versetzt, worauf man das Medium 6 Stunden stehen läßt, und dann den Heparinniederschlag abtrennt.

Zweite Alkoholfraktionierung

Der erhaltene Heparinniederschlag wird in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst. Der pH beträgt etwa 8,5. Hierauf versetzt man mit Natriumchloridkristallen in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen der Lösung. Ein Volumenteil neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) wird dann unter Rühren zugegeben. Nach 12stündigem Stehelassen des Mediums wird der neue Heparin­ niederschlag abgetrennt.

Die zweite Alkoholfraktionierung wird unter denselben Be­ dingungen dreimal wiederholt, so daß insgesamt vier Fraktionie­ rungsschritte erfolgen. Der Niederschlag aus der vierten Alkohol­ fraktionierung wird in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst. Der pH wird unter kräftigem Rühren mit Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Hierauf rührt man weitere 15 Minuten und stellt dann mit 5 n Natronlauge einen pH von 5,5 ein. Die Lösung wird dann mit Natriumchloridkristallen in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen versetzt und durch eine 0,3 µMillipore-Membran filtriert. Das Filtrat wird unter Rühren mit neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 versetzt. Hierauf läßt man das Medium 12 Stunden stehen und entwässert den erhaltenen Heparinniederschlag dann dadurch, daß man ihn in absolutem Äthanol zerstößt, unter vermindertem Druck filtriert, mit absolutem Alkohol wäscht und bei 35 bis 40°C/1,33 mbar trocknet. Hierbei erhält man ein injizierbares Natriumheparinat, in dem der Anteil an Gesamt-Mineralsalzen weniger als 0,5% und der Gesamt-Oxalatgehalt weniger als oder höchstens 20 ppm beträgt.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird handelsübliches Natriumheparinat mit einem Titer von 160 IE/ml verwendet. Der Gesamt-Mineralsalz­ gehalt beträgt 2,5% und der Oxalatgehalt 220 ppm (d. h. 0,022%).

10 000 g dieses Heparinats werden in einem 300-l-Edelstahl­ reaktor gelöst, indem man 50 l entsalztes Wasser mit einem spezifischen Widerstand von 500 000 Ω/cm zugibt, das vorher durch eine 0,22 µ-Millipore-Membran filtriert worden ist.

Die Auflösung erfolgt durch einstündiges Rühren. Der pH wird gemessen und durch Zugabe von 5 n NaOH oder 5 n HCl auf einen Wert von 6,5 eingestellt. Hierauf verdünnt man mit demselben entsalzten Wasser auf 64 l. Die Leitfähigkeit beträgt 15 000 µS/cm (15 000 µmhos/ cm); die Temperatur wird zwischen 15 und 30°C gehalten. An­ schließend versetzt man mit 192 ml frisch destilliertem m-Kresol und gibt 0,7 Volumenteile neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) pro 1 Volumenteil der Lösung zu, d. h. 44,8 l. Die Lösung wird stehen gelassen, bis sich ein Niederschlag bildet; gegebenenfalls wird eine geringe Menge Natriumchlorid zugesetzt. Hierauf trennt man den Natriumheparinat-Niederschlag von dem Überstand. Der Mineralsalzgehalt des Niederschlages beträgt weniger als 0,5%, der Gehalt an Oxalationen etwa 200 ppm.

Das Natriumheparinat wird wieder in 50 l desselben entsalzten Wassers mit einem Widerstand von 500 000 Ω/cm gelöst. Gegebenenfalls stellt man den pH mit 5 n NaOH oder 5 n HCl auf 5,5 ein. Die gemessene Leitfähigkeit beträgt 15 000 µS/cm (15 000 µmhos/cm). Anschließend verdünnt man mit demselben entsalzten Wasser auf 128 l, versetzt mit 384 g frisch destilliertem m-Kresol und läßt das Ganze 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Die Heparinlösung wird dann durch ein 0,3 µ CWSS-Millipore-Filter filtriert. 25 l des Filtrats werden langsam unter Rühren mit 30 l neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) (d. h. 1,2 Volumenteilen) versetzt. Hierauf läßt man stehen, bis sich ein Niederschlag bildet, gegebenenfalls wird eine geringe Menge Natriumchlorid zugegeben. Anschließend trennt man den Überstand und den Natriumheparinat-Niederschlag, der dann mit absolutem Alkohol entwässert, zerstoßen, auf einem Büchner-Trichter unter ver­ mindertem Druck filtriert und schließlich getrocknet und ge­ friergetrocknet wird. Hierbei werden 9,40 g (Ausbeute 94%) Natriumheparinat erhalten, das einen Titer von 160 IE/mg, einen Mineralsalzgehalt von 0,15% und einen Gehalt an Oxalat­ ionen von 30 ppm aufweist.

Um das in der wäßrigen Alkohollösung noch enthaltene Heparinat zu gewinnen, wird folgende Behandlung angewandt:

Ein Volumenteil des Überstandes aus der ersten Alkoholfällung wird mit 1 Volumenteil neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt. Nach 24stündigem Absetzen zieht man die klare bis leicht trübe überstehende Flüssigkeit ab und arbeitet sie auf Rest­ alkohole auf. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit absolutem Äthanol behandelt, entwässert, zerstoßen und getrocknet.

Der Überstand aus der zweiten Fällung wird unter Rühren mit neutralem Äthanol (90 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1 : 0,5 versetzt und 24 Stunden stehen gelassen. Das Natrium­ heparinat wird unter ähnlichen Bedingungen wie im Falle des ersten Überstandes abgetrennt.

Das erhaltene Natriumheparinat wird zur Herstellung des Calcium­ salzes nach dem Verfahren der GB-PS 14 71 482 verwendet. Hierzu versetzt man die Natriumheparinatlösung mit Calciumchlorid, so daß ein mit Calcium angereichertes Heparinat entsteht. Durch Abtrennen der freigesetzten Natriumionen und nochmalige Zugabe von Caliumionen erhält man ein Calciumheparinat mit einem Titer von 160 IE/mg, das 10,3% Calcium, 0,2% Natrium und 20 ppm Oxalationen enthält.

Beispiel 2

Ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Natriumheparinat mit einem Titer von 160 IE/mg, das etwa 30 ppm Oxalat enthält, wird nach dem Verfahren der GB-PS 14 71 482 zu Calcium-Natriumheparinat verarbeitet. Hierauf versetzt man die Natriumheparinatlösung auf einmal mit Calciumchlorid und trennt dann die freigesetzten Natriumionen ab. Das erhaltene Calcium-Natriumheparinat hat einen Titer von 160 IE/mg und enthält etwa 7% Calcium. Der Gehalt an Oxalationen beträgt 18 ppm. Eine Lösung dieses Heparinats mit einem Titer von 25 000 IE/ml zeigt nach mehrmonatiger Lagerung in einer Ampulle keine Niederschlagsspuren.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch überführt man das Natriumheparinat diesmal nach dem Verfahren der GP-PS 14 71 482 vollständig in Calciumheparinat. Das erhaltene Heparinat hat einen Titer von 160 IE/mg und enthält etwa 10,4% Calcium sowie weniger als 0,1% Natrium. Der Gehalt an Mineralsalzen beträgt 0,4%, einschließlich 20 ppm Oxalat­ ionen. Lösungen mit einem Titer von 25 000 IE/ml besitzen dieselbe Lagerfähigkeit wie die Lösung von Beispiel 2.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird ein handelsübliches injizierbares Natriumsalz von Heparin mit einem Titer von 160 IE/mg ver­ wendet, das 2,5% Mineralsalze und 1000 ppm (d. h. 0,1%) Oxalate enthält. 10 000 g dieser Heparins werden in 50 l entsalztem Wasser gelöst, das einen spezifischen Widerstand von 500 000 Ω/cm aufweist und vorher mit einer 0,22 µ-Millipore- Membran filtriert worden ist. Die Lösung wird in einem 300-l- Edelstahlreaktor 15 Minuten gerührt und dann mit entsalztem Wasser auf 64 l verdünnt. Die Konzentration beträgt 25 000 IE/ml. Hierauf gibt man 192 ml frisch destilliertes m-Kresol, dann 50 g Natriumcarbonat als wäßrige Lösung und schließlich 1600 g Natriumchloridkristalle zu. Die Lösung wird dann weitere 15 Minuten gerührt. Der pH, der einen Wert von 8,5 haben soll, wird gegebenenfalls mit einer Natriumcarbonatlösung auf diesen Wert eingestellt. Unter Rühren werden 44 l neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) zugegeben (0,7 Volumenteile Alkohol pro 1 Volumenteil der eingesetzten Lösung). Hierauf läßt man das Medium 6 Stunden stehen und trennt den Heparinniederschlag ab.

Dieser wird einer zweiten Alkoholfraktionierung unterworfen, indem man ihn in 110 l entsalztem Wasser mit den vorstehend genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml auflöst. Die Löschung wird 15 Minuten gerührt und dann mit entsalztem Wasser auf 128 l verdünnt. Hierauf gibt man 384 ml frisch destilliertes m-Kresol zu, stellt mit einer Natriumcarbonatlösung einen pH von 8,5 ein, versetzt mit 3200 g Natriumchlorid und rührt weitere 15 Minuten. Unter Rühren wird dann neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 zugegeben. Nach 12stündigem Stehen­ lassen des Gemisches trennt man den Heparinniederschlag ab, nachdem der Überstand abgetrennt wurde.

Die Alkoholfraktionierung wird dreimal unter denselben Be­ dingungen wie bei der zweiten Fraktionierung wiederholt, wobei jeweils der in der vorangehenden Fraktionierungsstufe gewonnene Heparinniederschlag eingesetzt wird.

Der schließlich erhaltene Heparinniederschlag wird in ent­ salztem Wasser in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst, wobei die Lösung ein Volumen von 128 l hat. Hierauf stellt man unter kräftigem Rühren mit Salzsäure einen pH von 3 ein, rührt die Lösung 15 Minuten, stellt mit 5 n Natron­ lauge eine pH von 5,5 ein, versetzt mit 384 ml frisch destilliertem m-Kresol und dann mit 3200 g kristallinem Natrium­ chlorid. Die erhaltene Lösung wird durch eine 0,3 µ-Millipore- Membran filtriert. Alle Verfahrensschritte werden bei einer Temperatur von 15 bis 30°C durchgeführt. Unter Rühren ver­ setzt man dann das Filtrat mit 1 Volumenteil neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) und läßt 12 Stunden stehen.

Der auf diese Weise erhaltene Heparinniederschlag wird durch Zerstoßen in absolutem Äthanol entwässert, unter vermindertem Druck filtriert, mehrmals mit absolutem Alkohol ausgewaschen und schließlich 24 Stunden bei 35 bis 40°C/1,33 mbar getrocknet. Das Pulver wird nochmals zerrieben und 24 Stunden bei 40°C/1,33 mbar getrocknet, um letzte Lösungsmittelspuren zu entfernen. Hierbei erhält man 9100 g eines Natriumsalzes von Heparin, das weniger als 0,5% Mineralsalze und weniger als 20 ppm Oxalat enthält. Die Ausbeute dieser Fraktion beträgt 90,43% und der Titer 157 IE/mg.

Die Bestimmung der Oxalationen in den gereinigten Heparinen erfolgt nach ihrer Extraktion nach dem Verfahren von J. R. HELBERT und M. A. MARINI, Biochem. J., (1963), Bd. 2 (5), S. 1101-6, jedoch mit der Abwandlung, daß die in den Heparinen vorhandenen Oxalationen daraus in Gegenwart von überschüssigem Natriumcarbonat extrahiert werden, bevor sie an dem IRA® 400- Anionenaustauscherharz absorbiert werden, dessen Verwendung von den Autoren empfohlen wird. Nach der Elution von dem Harz werden die Oxalationen nach dem Verfahren von P. M. ZAREMBSKI und A. HODGKINSON, Biochem. J. (1965), Bd. 96, s. 717-721, fluorometrisch bestimmt.

Versuchsbericht (nachgereicht)

Es wurden Lösungen von Calciumheparinat hergestellt von zwei verschiedenen Chargen. Dabei wurde verwendet: Calciumheparinat der Firma Cohelfred (CH102U) und Calciumheparinat der Firma Diosynth (CH2033). Diese Probelösungen wurden mit verschiedenen Mengen Oxalat versetzt, abgefüllt und sechs Monate gelagert. In bestimmten Zeitabständen wurden die Lösungen auf Nie­ derschläge untersucht. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:

Aus diesem Vergleichsversuch ist deutlich zu entnehmen, daß Proben, die unter 100 ppm Oxalat enthalten, sechs Monate gelagert werden können, ohne daß sich irgend­ welche Niederschläge bilden. Demgegenüber zeigten Proben, die 120 ppm und mehr Oxalat enthielten eine weitaus geringere Lagerfähigkeit.

Claims (3)

1. Heparinsalze, deren Kationen zumindest teilweise aus Calciumionen bestehen, mit einem Oxalationengehalt von weniger als 70 ppm, erhältlich durch fraktionierte Aus­ fällung von Heparin in Form eines Metallsalzes, dessen Metall mit Oxalsäure wasserlösliche Oxalate bildet, aus wäßriger Lösung mit nichtionischen Fällungsmitteln wie Äthanol und zumindest teilweisen Austausch der Metall­ ionen des Ausgangsheparins durch Calciumionen, wobei man

• a) zuerst eine wäßrige Lösung des Ausgangsheparins in an sich bekannter Weise der fraktionierten Ausfällung un­ terwirft, bis die Oxalatkonzentration in dem so erhaltenen Heparinsalz weniger als 70 ppm beträgt und dann
• b) durch Zugabe eines Calciumsalzes zu einer wäßrigen Lösung des nach a) erhaltenen Heparinsalzes in an sich bekannter Weise wenigstens teilweise die Metallionen des Heparinsalzes durch Calciumionen ersetzt.

2. Verfahren zur Herstellung von Heparinsalzen, deren Kationen zumindest teilweise aus Calciumionen bestehen, durch fraktionierte Ausfällung von Heparin in Form eines Metallsalzes, dessen Metall mit Oxalsäure wasserlösliche Oxalate bildet, aus wäßriger Lösung mit nichtionischen Fällungsmitteln wie Äthanol und zumindest teilweisen Austausch der Metallionen des Ausgangsheparins durch Calciumionen, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) zuerst eine wäßrige Lösung des Ausgangshepa­ rins in an sich bekannter Weise der fraktionierten Ausfällung unterwirft, bis die Oxalatkonzentration in dem so erhaltenen Heparinsalz weniger als 70 ppm beträgt und dann
• b) durch Zugabe eines Calciumsalzes zu einer wäßrigen Lösung des nach a) erhaltenen Heparinsal­ zes in an sich bekannter Weise wenigstens teilweise die Metallionen des Heparinsalzes durch Calcium­ ionen ersetzt.

3. Verwendung der Heparinsalze nach Anspruch 1 bei der Regelung der Blutgerinnung.