DE1940130A1

DE1940130A1 - Injizierbare Insulinaufbereitungen fuer klinische Zwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1940130A1
Application number: DE19691940130
Authority: DE
Inventors: Jorgensen Klavs Holger; Schlichtkrull Dr Phil Jorgen
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1968-08-09
Filing date: 1969-08-07
Publication date: 1970-02-12
Also published as: ES370345A1; IL32665A0; BE737257A; CH526958A; FR2015369A1; BR6911403D0; MTP620B; NL6912142A; AT354634B; MY7800209A; YU40003B; NL141377B; BG25638A3; JPS543931B1; CU33401A; YU204569A; SE7901917L; HK61977A; GB1285023A; IE33239L

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sieh auf injizierbare Insulin- " aufbereitungen für klinische Zwecke und auf deren Herstellung.

Während der ersten Jahre der Insulintherapie mit injizierbaren Lösungen von amorphem Insulin traten im allgemein allergische Hautreaktionen auf. Mit der Einführung von injizierV baren Lösungen von kristallinem Insulin wurde die Häufigkeit und die Intensität derartiger Hautreaktionen herabgesetzt. Sie konnten praktisch ausgeschaltet werden, wenn die Patienten mit Lösungen von rekristaliisiertem Insulin behandelt wurden. Heutzutage werden die kommerziellen InsulinaufBereitungen für klinische Zwecke stets unter Verwendung von kristallinem Insulin hergestellt. «

Die vorerwähnte Hautallergie würde offensichtlich durch Eankreasjproteine verursaehi;» die als Verunreinigtöigsn in ertogm Ä amöEgfeen iMöia, is geciigerea Sengen.

in kristallisiertem Insulin und, wenn überhaupt-invöllig unbedeutenden Mengen in rekristallisiertein Insulin enthalten sind. · , . . ■ . " --': [■■■'_-

Die heutigen Insulinaufbereitungen aus rekristallisierten Insulin zeigen keine anderen Nebenwirkungen als diejenigen, die auf die. liatür des Insulinaoleküls zurückzuführen sind. Nach einer ,Behandlung.übe:r mehrere Monate werden im Serum V der Diabetiker 5x:uioglobu.l±ne festgestellt, die sieh in Titrο und in vivo mit Insulin verbinden (derartige Seren, die von mit Insulin behandelten Meerschweinchen erhalten werden, werden heutzutage routinenässig für die iEaunologische Bestimmung von Insulin verwendet). Eine solche Nebenwirkung ist aus mehreren Gründen unerwünscht:

1.. Die.Erzeugung von Insulinantikörpern zeigt einen Zustand von andauernden Antagonismus des Körpers gegenüber dem wesentlichen Hormon Insulin an,

2. Dieser Zustand wirkt sich wahrscheinlich schädlich auf die Körperzellen aus, z.B. auf diep-Zellen, die bei Kaninchen durch die Immunisierung mit- Insulin und den liebenstoffen zerstört wurden. Es ist zu erwarten, dass die spaten Diabeteskomplikationen^wie die Angiopathie, schlimmer werden können.

5. Es wurde festgestellt, dass ein. bober Spiegel von Insulinantikörpern .manchmal zu einer Insulinresistenz führt, und, demzufolge eine hohe. Dosis erforderlich macht und.,. ., eine matabolische Kontrolle ausscbliesst.

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4. -Ss ist in Betracht au ziehen, dass die tatsächliche Dosis, die zur Behandlung von Diabetes erforderlich ist, bei weitem die Dosis übersteigt, die nur dann erforderlich wäre, wenn die Antikörperbildung ver— ; mieden werden könnte. ■

5. Bei einigen Patienten binden die Antikörper Rinderinsüliri stärker als Schweineinsulin; es'wird von hypoglykämischen Erscheinungen nach einem Viechsei in der Zusammensetzung der Insulinaufbereitungen berichtet.

- " 6. Venn sich Insulinantikörper in den Patienten aufbauen,. dann ist dies von einem Anstieg der Konzentration an zirkulierendem exogenen Seruminsulin begleitet. Von dem Seruminsulin wird etwas an die Antikörper gebunden. Die Konzentrationen an dem gesamten und sogar an dem freien Insulin können Werte erreichen, die 10 bis 100 jaal so gross sind wie die normale physiologische Konzentration. Diese hohen Konzentrationen können für* die Gewebe schädlich sein. Hierdurch kann eine Arteriosklerose/gef ordert, und es können die noch verbleibenden ρ-Zellen geschädigt werden. Es wurde nachgewiesen, dass hohe Konzentrationen an Insulin eineiinhibitorischen Effekt.auf die Sekretation der ß-Zellen haben.

Der Mechanismus, der hinter der Entwicklung der Influlinaiiti- körper steht sowie deren Eigenschaften sind in eteigöndem

Masse während der letzten 5 "bis 10 Jahre untersucht worden. Es wurde festgestellt, dass die Insulinspezies der beherrschende Pale tor für die Entwicklung der Antikörper zu sein scheint., Rind er insulin, das sich mehr (3 Aminosäurepositionen.) von menschlichem Insulin unterscheidet als das Schweineinsulin (1 Aminosäureposition ) hat, wie erwartet werden kann, eine stärkere antigene Yfirkung als Schv/eineinsulin. Andererseits führt Schweineinsulin su der Bildung von Antikörpern gegen Schweineinsulin sogar bei Schweinen. Bisher wurde keine Erklärung für diese Beobachtung gefunden, wenngleich vermutet wird, dass die abnorm hohen Konzentrationen von Schweineinsulin an der Injektionsstelle den immunologischen Mechanismus im Schwein dazu anregen, Antikörper gegen das eigene Insulin zu bilden.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Beitrag zur Lösung des Problems der Unverträglichkeit des Körpers gegenüber den bekannten Insulinaufbereitungen dar. Nach der Erfindung tritt eine antagonistische Reaktion des Körpers, beispielsweise indem Insulinantikörper erzeugt werden, überhaupt nicht oder nur in sehr geringem Masse auf, wenn ein neuer Typ einer Insulinaufbereitung verwendet wird, die von bestimmten Substanzen frei ist, die bei den bekannten Insulinaufbereitungen immer vorliegen, wobei diese Substanzen ein höheres Molekulargewicht besitzen als das Insulin. Y/äbrend früher angenommen wurde, dass die Insulinantikörper durch das Insulin selbst erzeugt werden, wurde im Zuge der Erfindung festge-

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stellt.,., dass überraschenderweise dieUrsache nicht beim Insu— linmolekül zu suchen ist, sondern bei den Substanzen mit einem höheren Molekulargewicht als Insulin. .' .

Die Insulinaufbereitungen gemäss der Erfindung enthalten Insulin, das frei von Proteinen pankreatischen Ursprungs ist, die ein Molekulargewicht oberhalb etwa 6000 besitzen und auch einige insulinähnliche Substanzen enthalten können, die annähernd dasselbe Molekulargewicht wie Insulin besitzen, jedoch in ihrer chemischen Zusammensetzung von diesem etwas abweichen, wie dies beispielsweise bei dem bekannten Monodesamido-Insulin der Pail ist, das als ein Argininderivat des Insulins angesehen werden kann. Da festgestellt wurde, dass diese Substanzen auch eine antigenetisehe Wirkung besitzen, sind die erfindungsgemässen Insulinaufbereitungen vorzugsweise auch -frei von diesen Substanzen und enthalten im wesentlichen bei der Analyse vermittels einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAG-E) nur eine einzige Komponente, nämlich reines Insulin. Eine solche Aufbereitung soll vorzugsweise einen pH von etwa 7 besitzen, um die.Bildung von Mono-desamido-Insulin während der Lagerung herabzusetzen.

Ein bekanntes Verfahren für die !Trennung von Proteinmolekülen verschiedener Grosse besteht darin, dass die Proteinmischung in einem Lösungsmittel aufgelöst wird, in welcher die Proteine dissoziieren, wonach die Lösung durch ein Molekularsieb gegeben wird, wie z.B. Säulen aus organischem Material, das

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zu einem dreidimensionalen Netzwerk bestimmter Porengrösse vernetzt ist» Es konnte gezeigt werden, dass kristallines Insulin, das in 1 M Essigsäure gelöst war, mit einer Sephadex G 50-Säule in Komponenten (_a.)-_f (^) und (c) fraktioniert werden konnte. Diese Komponenten können aus ihren Lösungen ,-■■■■ auf herkömmliche Y/eise isoliert werden, beispielsweise durch Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz neutraler Reaktion oder Gefriertrocknen usw. Die Menge der Komponente (a) kann 2 bis 5 Gew$ des kristallinen Insulins und weniger als 1 Gew$ des rekristallisierten Insulins bätragen. Die Menge der Komponente (b) kann in beiden Pail en 4 bis 8 Gew$ betragen. Die Komponente (b) kann weiterhin in eine Anzahl von Proteinen mit annähernd derselben Molekulargrösse zerlegt werden, wobei sie Jedoch in bezug auf die Charge differieren. Dies wurde mit' dem Anionenaus tausch er DEAE Sephadex A 50 und einer lösung der Komponente (b) in mit iDRIS (Iris (hydroxymethyl) aminomethan) gepuffertem 7 M Harnstoff bei pH 7,7 festgestellt, wie es in Pigur1 dargestellt ist. Die Spitzen Nos. 4, 6 und 7 in dieser Mgur entsprechen den bekannten Substanzen, namlieh dem Eroinsulin, der Zv/ischeiistufe und dem Dimeren. Die anderen Spitzen konnten noch nicht identifiziert werden. Sie können aus ihrer Lösung auf an sich bekanntem Wege isoliert werden.

Die Komponente (c) kann ebenfalls vermittels einer Ionenaustausch-Chromatographie zerlegt werden. Sie enthält eine Hauptfraktion aus reinem Insulin, Mono-desamido-Insulin und

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eine Fraktion,die als "Arginin-Insulin" gezeichnet werden kann, da sie mehr Arginin enthält als der im Insulinmolekül vorliegenden Argininmenge entspricht. Die Fraktion an Monodesaniido-Insulin in der Komponente (c) ist variabel und hängt von der Entstehung bzw. der Herkunft des Insulins ab. Im allgemeinen macht sie 3 bis 10 Gew$ der Komponente (c) aus. Das Arginin-Insulin kann 2 bis 3 Gew$ der Komponente (c) betragen.

Die Figur 2 gibt einen Überblick über die Fraktionierungen und die Komponenten wie sie sich bei einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) darstellen, die nach der von Ornstein und Davis beschriebenen Methode durchgeführt wird, wobei 7,5 $ Polyacrylamid und ein pH von 8,9 angewendet werden. . :"■·

Die erfindungsgemässen Insulinaufbereitungen werden überraschenderweise vom Organismus besser vertragen als die bekannten Insulinaufbereitungen. Die Erklärung, besteht darin, dass die Komponenten (a) und (b), die in den bekannten Insulinauf bereituhgen vorliegen, Substanzen enthalten, die unerwarteterweise eine stark antigene und offensichtliche diabetogene Wirkung entfalten, wohingegen ebenfalls unerwarteterweise die neuen Insulinaufbereitungen sich nicht antigen verhalten. v*¹- ■

Dies konnte vermittels bei Tieren durchgeführten Toxizitäts-

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versuchen festgestellt werden. Hierfür wurden Kaninchen ausgewählt, weil sie auf Serumantiicörper in derselben Weise reagieren wie Menschen, v/enn die Behandlung mit bekannten Insulinaufbereitungen durchgeführt wird; d.h. die Antikörper besitzen ähnliche Eigenschaften in bezug auf ihre Fähigkeit Insulin zu binden und in bezug auf die Affinität zu Insulin. (Meerschweinchen wurden Antikörper mit einer grösseren Affinität und Fähigkeit, Insulin zu binden, erzeugen. Kanincheninsulin unterscheidet sich von menschlichem Insulin lediglich an der B 50-Stellung, bei der es sich bei Kanin- - ' eben um Serin und bei Menschen um Threonin handelt. Meerschweinchen-Insulin unterscheidet sich hingegen von menschlichem Insulin an 19 Stellen).

Dem Kaninchen wurden dreimal wöchentlich Injektionen verabreicht mit einer konstanten Proteindosis: 40/ug in 1 ml 0,04 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 aufgelöst. Bei Verwendung von Insulin entspricht diese Menge, etwa. 0,5 internationalen Einheiten pro Kilogramm. Dies entspricht der durchschnittliehen Dosis bei der Therapie von Diabetis^ Die Serumantikörper-Spiegel wurden in regelmässigen Abständen unter Anwendung der herkömmlichen Arbeitstechniken ermittelt. Der Spiegel wird angegeben als Prozentsatz von zugesetztem .'■ -I-Insulin (Rind) _t das^ bei dem betreffenden Beispiel an Antikörper gebunden ist. Die hierbei erzielten Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt.

Zwei der Ergebnisse sind höchst überraschend und widersprechen den Erwartungen:

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1. Die Insulinaufbereitung, die nur reines Insulin enthält, erzeugt keine Antikörper zu Insulin.

2. Die Komponente (a)_vdie kein Insulin ist, erzeugt eine ausserordentlich grosse Menge an Antikörper gegen Insulin. Die ■wahrscheinlichste Erklärung besteht darin, dass sie etwas enthält, das in unbekannter Weise in einer chemischen Beziehung zu Insulin steht.

5. Herkömmliches Insulin von hoher Reinheit, d.h. rekristallisiertes Insulin,erzeugt Antikörper wie es bei Menschen der Pail ist.

4. Substanzen die zur Komponente (b) gehören* nämlich Fo. 3 (vgl. Figur 1), das Dimere und das Proinsulin haben eine antigene Wirkung, die die Erzeugung von Antikörpern gegen Insuliii ansteigen lässt.

In der Figur ist nicht die Feststellung berücksichtigt, dass das "Arginin-Insulin" der Komponente (c) eine kleine^ Jedoch bedeutsame Menge an Antikörpern nach 4$ lagen produziert. Demnach handelt es sich in bezug auf die Antikörper bei den Aufbereitungen, welche bei der Analyse vermittels PACrE nur eine Komponente enthalten, um die bevorzugte Ausführuiigsform der Erfindung.

Bei den Verträglichkeitsuntersuehungen wurde festgestellt, dass bei einigen Kaninchen die Neigung zu höheren Blutzuckerwerten besteht, nämlich bei solchen Kaninchen, denen die Kompo-

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nente (b) injiziert wurde, wobei diese Wirkung insbesondere dann beobachtet wurde, wenn eine der Fraktionen der Komponente (b)y nämlich das Dimere verabreicht wurde. Das Dimere führt zwar nicht zu dem höchsten Spiegel an Antikörpern, Jedoch waren aus unbekannten Gründen die Blutzuckerwerte bei diesen Tieren am höchsten. Dieser Effekt der Komponente (b) und des Dimeren kann als diabetogene oder antiinsuline Wirkung bezeichnet werden, wenn es sich tatsächlich herausstellt, dass die Tiere gegen insulin, resistent werden, wie es in Figur 4 gezeigt ist." '.': : ■ ;_; Λ, ^:;': V \ _:_\ _ _ - - \ .- .J-:

Fach einer Behandlungszeit von 14- Wochen mit dem Dimeren (Rind 40 yug dreimal wöehentlich) liess man die Kaninchen über 16 Stünden faste|i, wonach ihnen auf intravenösem Wege Insulin verabreicht würde (0,5 internationale Einheiten pro Kilogramm). Pur den Kontrοliversuch wurde eine Gruppe von Kaninchen mit einer reines Insulin enthaltend,en Aufbereitung behandelt. Aus den; in-Figur 4 gezeigten Kurven für die Serumglukose ist zu ersehen, dass die für den Kontrollversuch eingesetzten Kaninchen in der erwarteten Weise auf Insulin reagierten, während die mit dem Dimeren der Komponente (b) behandelten Kaninchen sich gegenüber Insulin resi-r sistent verhielten. Die Resistenz mag zwar für den Anstieg der Blutzuckerwerte ursächlich sein ohne dass jedoch hierfür eine Erklärung gefunden wurde. Diese» Beobachtung dürfte wohl auch der sich bei einigen Patienten im Verlaufe der Behandlung mit den bekannten Insulinaufbereitungen zeigenden Resistenz entsprechen. Is ist zu erwarten, dass die klini-

sehe Resistenz durch Verabreichung von Insulinaufbereitungen, die frei von der Komponetite (b) und dem Dimer en sind, vermieden werden kann.

Um die oben beschriebenen Feststellungen hinsichtlich der biologischen Eigenschaften der Verunreinigungen in handelsüblichem Insulin nutzbringend auszuwerten, wird das Insulin bis zu einem Grad gereinigt, der bisher bei handelsüblichem Insulin noch nicht vorgekommen ist. Die erforderliche Reinigung kann grundsätzlich vermittels einer Vielzahl von Arbeitstechniken erfolgen, wie sie für die Reinigung von Proteinen Anwendung finden.' Hierfür können beispielsweise die Kristallisation, die fraktionierte Ausfällung, die Elektrophorese, die Elektrofällung und die Membranfiltration dienlich sein. Vorzugsweise wird jedoch für die Reinigung die Säulenehromatographie eingesetzt. ^:

Aufgrund der obigen Beschreibung ist selbstverständlich, dass das Hauptziel der aufgrund der Erfindung vorzunehmenden Reinigung darin besteht, dass aus dem als Ausgangsmaterial verwendetetn Insulin die aus der Pankreas stammenden Proteine mit einem Molekularge\dßht von mehr als etwa 6000 entfernt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass das Insulin einer Gelfiltration unterworfen wird. Vorzugsweise wird diese Filtration in einem wässrigen Medium durchgeführt, das mit Wasser mischbare nicht-wässrige Flüssigkeiten enthalten kann. Es ist jedoch auch möglich, die Gelfiltration gegebenenfalls in organischen Lösungsmitteln durchzuführen, die nur wenig Wasser ent-

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halten. Palls ein wässriges Medium eingesetzt wird, kommt vorzugsweise ein pH-Bereich zwischen 2 und 4 zur Anwendung. Die Stabilität von Insulin bei einem pH von weniger als 2 und mehr als 9 ist gering, so dass dann das Insulin abgebaut wird. Deshalb sind sehr hohe oder sehr niedrige pH-Y/erte wenig zweckmässig. Ein pH-Bereich zwischen 4 und 9 kann angewendet werden, falls die Löslichkeit des Insulins erhöht wird, beispielsweise durch die Zugabe von Harnstoff, der gleichzeitig der Bildung von Assoziationsprodukten entgegenwirkt, die zwischen Insülinmolekülen und den Verunreinigungen im neutralen Bereich gebildet werden können. Wird bei einem niedrigen pH gearbeitet, dann wird vorzugsweise eine organische Säure, beispielsweise Essigsäure für die Einstellung des pH verwendet; es können jedoch auch starke Mineralsäuren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommt eine Konzentration von 0,5 bis 4 M Essigsäure zur Anwendung.

Für die Gelfiltration ist die Temperatur nicht kritisch. Sie wird im wesentlichen durch die Stabilität und die Löslichkeit des Insulins begrenzt. Es wird deshalb vorzugsweise im Bereich normaler Raumtemperatur beispielsweise 20 bis 25⁰C gearbeitet. Die vor der Insulin enthaltenden Komponente,(c) eluierten Fraktionen werden verworfen. Diejenigen Fraktionen der Komponente (c), die frei von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 sind, werden gesammelt, wonach das Insulin abgetrennt wird, beispielsweise durch Abdampfen, Aussalzen . oder durch Fällen mit Zinkionen. Für die Herstellung von pharmazeutischen Insulinaufbereitungen kann das Insulin als

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- 13 solches oder aber erst nach Kristallisation verwendet werden.

Um Insulinaufbereitungen mit einer möglichst niedrigen antigenen Wirkung zu erhalten, ist es erforderlich, die dem In-* sulin ähnlichen Substanzen zu entfernen, die ungefähr dasselbe Molekulargewicht wie Insulin haben, jedoch in ihrer chemischen Zusammensetzung etwas vom Insulin abweichen, wie z.B. das bekannte Mono-desamido-Insulin und diejenigen Verbindungen, die als Argininderivate des Insulins angesehen werden können.

Das Mono-desamido-Insulin kann sich sogar nach seiner vollständigen Abtrennung wieder in kleinen Mengen während der Lagerung von pharmazeutischen Insulinaufbereitungen bilden. Hierbei ist jedoch die antigene Wirkung sehr gering. I¹Ur die Abtrennung des Argininderivats und diamidietten Insulinswird vorzugsweise die Säulenchromatographie auf einem Ionenaustauscher angewandt. Hierfür können fast alle handelsüblichen Ionenaustauscher eingesetzt werden, welche die Durchwanderung des Insulins gestatten, vorausgesetzt, dass das Verfahren in einem Medium ausgeführt wird, in welchem das Insulin weder mit sich selbst noch mit den Verunreinigungen Aggregate bilden kann. '

In der nachfolgenden Tabelle sind geeignete Substanzen für die Reinigung des Insulins angegeben:/

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Säulenfüllungen für die chromatographische Reinigung von Insulin.

Ausgangsprodukt

Material

synthetisch

Abkömmlinge natürlicher Verbindungen

PoIyacrylam id

PoIystyrol

Pöly-

aeryl^-

säure

Dextran vernetzt

Zellulose Alginsäure

Gelfiltrations-Materialien

Bio-Gel P-IO

Bio-Gel P-3Q Sephadex G 50

Sephadex G 75

> Typ -* des

j^ nen-" ' ■. aus-^:, : ■■ tauscher s

st_fark basische Gruppen,

schwach basische Gruppen

Dowex 1

Bio-Gel DM QAE-Sephadex

DEAE-Sephadex

DEAE Zellulose

Typ des Kationen-

- stark saure Gruppen

austau

schwach

. saure schers _Gruppen

Dowex 50 W

SE- ^l

Sephadex

Zellulosephosphat

Bio-Gel

CM

Amberlite CG 50

' Sephadex

CM-Zellulose

CD O CO

Der Ionenaustauschprozess kann mit einem Eluierungsmittel auf der Basis eines organischen Lösungsmittel durchgeführt ; werden, das Wasser enthält. Das organische Lösungsmittel soll hierbei vorzugsweise mit .Wasser mischbar sein. Als Beispiele." .-■ für derartige Lösungsmittel seien genanntjTetramethylharnstoff, Dimethylformamid, Dioxan, mit Wasser mischbare Ketone wie Aceton,, niedere Alkohole wie Methanol, Äthanol und Propanol. Vorzugsweise Anwendung finden Alkohole, die in einer Konzentration von 30 bis 80 $ (v/v) vorzugsweise zwischen 50 und 70 i» (v/v) eingesetzt werden können.

Wenn das Eluierungsmittel weniger als 50 # (v/v) an dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel enthält, kann es als wässriges Medium bezeichnet werden. In solchen Fällen > kann das organische Lösungsmittel durch Harnstoff ersetzt werden, der in einer Menge entsprechend einer 4 - 8, vorzugsweise etwa 7 molaren Lösung verwendet wird. Die Harnstofflösungen müssen von Ammoniumcyanat frei sein, da-sonst das Cyanation mit der Aminogruppe im Insulinmolekül reagiert. '

Die Eluierungsmittel enthalten immer eine Puffersubstanz , um den pH-Wert des Eluierungsmittels zu regeln. Vorzugsweise wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet. Tails ein Kationenaustauscher verwendet wird, kann der pH-Wert des Eluierungsmittels auf einen Wert zwischen 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6 eingestellt werden. Wird ein Anionenaustauscher " eingesetzt, dann sollte der pH-Wert des Eluierungsmittels zwi-

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Die angegebenen pH-Werte werden mit einer Glaselektrode gemessen, die gegen einen Standardpuffer in der üblichen weise eingestellt wird.

Geeignete Puffersubstanzen können aus der Literatur entnommen werden.

Es ist wesentlich, dass die Temperatur bei dem Ionenaustausch verbaltnismässig konstant ist. Die Temperatur kann zwischen -10° und 4O⁰C, vorzugsweise 0° und 3O⁰G liegen, es sei denn, dass es sich bei dem Eluierungsmitter-um eine wässrige Harnstofflösung handelt. In diesem Falle wird die Temperatur vorzugsweise unter 5⁰C gehalten.

Für den Reinigungsprozess wird als Ausgangsmaterial im allgemeinen das marktgängige Insulin, also amorphes Insulin oder kristallines Insulin verwendet, das wiederholt kristallisiert worden ist. Es kann allerdings auch rohes Insulin eingesetzt werden, wie z.B. der Insulin enthaltende Salzkuchen, der bei der Aufbereitung von Insulin aus Pankreasdrüsen' -ertha.lten wird und im allgemeinen 10 bis 30 Gew# Insulin enthält. Wegen der hohen Gehalte an Verunreinigungen ist jedoch ein solches Ausgangsmaterial weniger für den gemäss vorliegender Erfindung" durchzuführenden Reinigungsprozess geeignet. Ein besseres Ausgangsmaterial kann dadurch erhalten werden, dass eine Lösung des Salzkuchens einer isoelektrischen Ausfällung unterworfen

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wird, indem der pH-Wert der lösung auf 5,5 eingestellt wird; der Niederschlag kann durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Als Ergebnis der Reinigungsstufen wird immer eine Lösungsmittelfraktion mit gereinigtem Insulin erhalten, aus der das Insulin in der üblichen Weise, beispielsweise durch Abdampfen, · Aussalzen oder Ausfällen in Gegenwart von Zinkionen gewonnen werden kann. Das Insulin kann gegebenenfalls kristallisiert und zu einem injizierbaren Inaulinpräparat in an sich bekannter Weise aufbereitet werden.

Falls ein reines Insulin, also ein Insulin, das von aus der Pankreas stammenden und ein Molekulargewicht von etwa oberhalb 6000 aufweisenden Proteinen frei ist, gewünscht wird, und das bei einer Analyse vermittelseiner Polyacrylamidgel-Elektrophorese als einzige Komponente auftritt, dann ist eine Gelfiltration des als Ausgangsmaterial eingesetzten Insulins nicht ausreichend, wie bereits erwähnt wurde. In diesem 3?alle ist eine Kombination der Gelfiltration mit einer lonenaustaüschbehandlung notwendig.

Es wurde jedoch im Zuge der Erfindung festgestellt, dass es möglich ist, reines Insulin in einem einstufigen Verfahren zu erhalten. Pas grundlegende kennzeichnende Merkmal dieses Verfahrens besteht daiin, dass unreines Insulin auf Säulen-' chromatographischem Wege einem Anionenaustausch unterworfen wird. Vorzugsweise wird ein stark basischer Ionenaustauscher eingesetzt» Ein typisches Beispiel hierfür ist

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QAE-SEPHADEX Α-25, das in der Tabelle auf Seite 14 erwähnt wurde. Dieser Ionenaustauscher ist ausserordentlich stabil; seine Dextranketten reagieren noch nicht einmal mit labilen Verbindungen. Es können die bereits oben erwähnten Eluierungsmittel verwendet werden. Es ist jedoch ein weiteres Merkmal dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung, dass als Eluierungsmittel ein mit Wasser mischbares und Wasser enthaltendes organisches lösungsmittel verwendet wird, insbesondere ein aliphatischer Alkohol. Es ist überraschend, dass durch einen solchen Anionenaustausch dem unreinen Insulin die Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 entzogen werden können und dass ein wässriges alkoholisches Medium in der lage ist, die Bindungen zwischen den Proteinmolekülen deshandelsüblichen Insulins in einem solchen Hasse aufzubrechen, dass reines Insulin gewonnen werden kann.

Die erfindungsgemässe Reinigung des Insuline wird durch die nach· folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

5 kg SephadexG 50, feinkörnig (von PHlRMAGIA, üppsala, Schweden) werden in 1M Essigsäure gequollen und die feinsten Teilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zur Füllung einer Säule mit einem Durchmesser von 15 cm und einer Höhe von 130 cm verwendet. Die Säule wird mit 1 M Essigsäu-

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re ins Gleichgewicht gebracht. \ _

10 g Insulin, das zuvor aus einem>Zitratpuffer kristallisiert worden war, wurden in einer Mischung aus 390 ml von 1 M Essigsäure und 8 ml von 1 N HCl aufgelöst. Mit dieser Lösung wird die Säule beschickt. Die Eluation wird mit 1 M Essigsäure mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter/h durchgeführt. Traktionen von 200 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 260 nm werden gemessen, und gegen die Fraktionszahlen graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Haupt teil der Ihsulinspitze (es handelt sich hierbei um die grösste Spitze) entsprechen, werden gesammelt und das Insulin wird durch Zugabe von 200 g NaCl auf 1 liter der gesammelten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und einer ieoelektrischen Ausfällung und Kristallisation aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 8g an kristallisiertem Insulin, das frei ist von pankreatischen Proteinen mit einem Molekulargemisch von etwa oberhalb 6000.

Beispiel 2

Das kristalline gereinigte Insulin, das nach Beispiel 1 erhalten wird, wird durch eine Ionenaustausch-Chromatographie aus einem Amberlit-IonenaustäuschvHarz weiter gereinigt. Hierzu

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werden Lösungen von 7M Harnstoff hergestellt und deiqnisier/t indem die lösungen durch Säulen mit einem Mischbett—Ionenaustausch-Harz geschickt werden ( Amborlit MB-1). Der deionisierte Harnstoff wird dann für die Herstellung des folgenden Puffers verwendet: 0,13 M Natriümphosphat-7 M Harnstoff-1# n-Butanol, pH 6,00 bei 25⁰C. Der Puffer wird gelagert und bei 4⁰C eingesetzt, 1,5 kg Amberlit CG 50 Type II wird behandelt mit: 1) Wasser; 2) Azeton; 3) Wasser + NaOH; 4) Wasser; 5) Wasser + HCl, und 6) Wasser. Das gewaschene Harz wird dann mit 5 Liter des Puffers aufgerührt* Der pH der Suspension fällt so fort und annähernd 30 ml Anteile von 40 Seiger (w/v) NaOH werden jeweils nach wenigen Minuten zugegeben,um den pH bei etwa 6,0 zu halten. Wenn der pH der Suspension bei 6,00 nach 15 minutigem Rühren stehen bleibt, wird die Mischung über ftactt bei 4⁰C gerührt. Das Harz wird filtriert und mit 30 Litern des Puffers während 8 Stunden gewaschen. Der pH des Endfiltrats sollte identisch mit dem des einfliessenden Puffers sein. Das auf diese Weise erhaltene Material wird zum Füllen einer Säule mit einem Durchmesser von 7,5 cm und einer Höhe von 80 cm benutzt. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebradafc.

15 g Insulin, das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1hergestellt worden war, werden auf die Säule gegeben und zwar als 10 #ige (w/v) Lösung in dem Pijffer. Die Eluierung wird mit dem Puffer bei einer Temperatur von 4⁰C und mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/h durchgeführt. Fraktionen von jeweils

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10 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemssen und gegen die Fraktioraiummern graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um"die grösste Spitze) entsprechen, werden ge-. sammelt und das Insulin wird durch Zugäbe von 2 Litern H₂O, 15 ml 4 N HCl und 600 g NaGl auf 1 Liter der gesammelten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird durch !Zentrifugieren isoliert und einer isoelektrischen Ausfällung und einer Kristallisation aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 10 g kristallines Insulin, das nur eine Komponente enthält, wenn es der Polyacrylamidgel - Elektrophorese unterworfen wird. Mit anderen Worten: das kristalline Insulin kann als reines Insulin angesprochen werden.

Beispiel 3

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,1 M NH₄Cl . .. . O₁02 M NH₅

60 £ (v/v) Äthanol

Der pH beträgt 8,3 bei 25⁰O.

15 g Dowejx 1x2 (Maschengrösse: 50/100) werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten Teilchen werden durch Dekan-

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tieren abgetrennt. Dieses Material wird zur Füllung einer Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 25 cm verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht,

500 mg Insulin, das zuvor aus einem Zitratpuffer kristallisiert worden war, werden in einer Mischung von 20 mg des Dinatriumsalzes der Äthylendiamin-tetra-Essigsäure, 5 ml Puffer, 5 ml öOjSigem (v/v) Äthanol und 0,04 ml 13,3 M NH₅ (End-pH 8,5) aufgelöst. Der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugieren entfernt und die klare Iiösung wird auf die Säule gegeben. Die Eluierung wird mit dem Puff er bei einer Temperatur von 25⁰C und mit einer Geschwindigkeit von 7,5 ml/h durchgeführt. Fraktionen von 5 ml werden gesammelt*

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Praktionsnummern graphisch aufgetragen. Diejenigen Praktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um die grösste Insulinspitze)entsprechen, werden gesammelt und das Insulin wird durch Zugabe von 100 ml Wasser, 1,3 ml 1 N HCl und 2 ml 1 M Zinkazetat pro 100 ml der gesammelten Praktionenauagefallt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren und Kristallisation aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuff er in an sich bekannter Weise isoliert* Die Auebeute an reinem Insulin beträgt 200 mg.

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. Beispiel 4 ,

Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt;.

2,5 ml 7 M Harnstoff (deLonisiert wie in

Beispiel 2 beschrieben) 51»3 g Iris-(hydroxymethyl)-aminomethan 36,3 ml 6 N HCl Der pH ist 7,9 bei 25⁰C. ;

40g QAE-Sephadex-A-25 (von PHARMACIA, Uppsala, Schweden) werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten Teilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zur iiillung einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer -Höhe von 25 cm verwendet. Mit dem Puffer wird das Gleichgewicht in der Säule eingestellt;

500 mg Insulin, das zuvor aus einem Zitratpuffer kristallisiert worden war, werden in einer Mischung von 5 ml des Puffers und 5 ml von 7 M Harnstoff gelöst; der pH-Wert wird auf 7,9 mit festem Tris-(hydroxymethyl)-aminometban eingestellt. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die klare Lösung wird auf die Säule gegeben. Die Bluierung wird mit dem Puffer bei einer Temperatur von 4⁰C und mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h durchgeführt. Fraktionen von jeweils 5 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 mn werden gemessen und gegen die

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Fraktimsnummern graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt.sieh um die grösste Spitze) entsprechen, werden gesammelt und das Insulin durch Zugabe eines den gesammelten Fraktionen entspre-i _: chenden Wasservolumens unterEinstellung des pH auf 2,8 mit _r. HCl und durch Zugabe von gesättigter NaCl-Lösung in_;. einer Volumenmenge_/die doppelt so gross ist wie das Volumen der,gesammelten Anteile ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und einer isoelektrischen Ausfällung und : Kristallisation aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer in. an sich bekannter Weise unterworfen. Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 200 mg.

Beispiel 5

Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

25 g Tris-(h.ydroxymethyl)-^iiinomethan 29,0 ml 6 N HGl
1^2 1 Methanol

Es wird mit Wasser auf ein Volumen von 2 1 aufgefüllt. Der pH-Wert ist 7,3 bei 25⁰C

40 g QAE-Sephadex-A-25 werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten Teilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zur Füllung einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und. einer Höhe von 25 cm verwendet. Die Säule

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mit'dem PUffet ins Gleichgewicht gebracht.

500 mg Insulin, das zuvor aus einem Zitratpuffer kristallisiert worden war, werden in einer Mischung von 20 mg des Dinatrlümsalzes der A^hylendiamin-tetra-Essigsäure, 94 mg iris-(hydroxyiäethyl)aminomethan, 10 ml ßÖjSigem (v/v) Methanol und 0,073 ml 6 N HOl (End-pHi 7,3) aufgelöst. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren entfernt und die klare Lösung wird auf die Säule aufgegeben. Die Eluierung wird mit dem Puffer bei einer !Temperatur von 25⁰G und mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h ausgeführt. Fraktionen von jeweils 5 ml werden gesammelt.

Me Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Praktionszahlen graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die . dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um die grösste Spitze) entsprechen, werden gesammelt und das Insulin wird ausgefällt und durch Zugabe von 100 ml Wasser und 200 ml 1 M Zinkazetat pro 100 ml der gesammelten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisierts Die

Ausbeute an reinem Insulin beträgt 250 mg.

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lim Riffer folgender Zusammensetzung wird hergestellti

0,06 M Tris—{hydroxymethyljaminomöthän" 0,02 IT HCl 0,075 M NaOl 60 #iges (v/v) Äthanol Der pH-Wert beträgt 8,3 bei 25⁰C

80 g QAE~Sephadex A 25 werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten !Teilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zum Füllen einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Hohe von 50 cm verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht*

2*5 g Insulin» das zuvor aus einem Zitratpuffer kristallisiert woiden war, werden bei O⁰C in einer Mischung aus 450 mg Tris — (hydroxymethyl)ämlnometban» 100 mg des Tetranatriumsalzes der Ätbylendiamin-teträ -Essigsäure, 25 ml Puffer, 25 ml 60#igem (v/v) Äthanol /und 0,08 ml 4 N HCl (End-pH bei 25⁰Cs 8,4) aufgelöst* Das Unlösliche Material wird durch Zentrifugleren bei 2 bis 4⁰C entfernt und der klare überstehende Anteil auf die Säule,gegeben. Die Eluierung wird.mit dem Puffer bei einer Temperatur von 4⁰C und mit einer Geschwindigkeit von 26* ml/h ausgeführt. Fraktionen von jeweils 20 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionszahlen graphisch aufgetragen*' Diejenigen Fraktionen die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich um die grösste Spitze) entsprechen, werden, gesammelt und das

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Cf-I Γ->.^;. ; -η-

Insulin wird durch Zugabe einer den gesammelten Fraktionen entsprechenden Volumenmenge von 0,02 M Zinkazetat und 0,03 N HCl ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und in an sich "bekannter Weise aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer kristallisiert.

Die Ausbeute ist 1,3 g reines Insulin.

Beispiel 7

Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt.:

14,9 g Histidinmonochlorid

38,7 ml 1 N NaOH

16,1 g NaCl

3,12 1 96 #iges (ν/ν Äthanol)

mit Wasser wird auf ein Volumen Von 51 aufgefüllt

Der pH-Wert beträgt 6,5 bei 25⁰C

35 g QAE-Sephadex A-25 werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten Teilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zum Füllen einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 25 cm verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht.

500 mg Insulin, das zuvor aus einem Zitratpuffer kristallisiert worden war, werden in einer Mischung aus 20 mg Dinatriumsälz der Athylendiamin^tetra-Essigsaure, 6„5 ml Puffer und 6 ml

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60 tigern (v/v) Äthanol aufgelöst, wobei der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 6,8 eingestellt wird. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die klare Lösung wird auf die Säule gegeben. Die Eluierung wird mit dem Puffer bei einer Temperatur von 25⁰C und einer Geschwindigkeit von 30 ml/h durchgeführt. !Fraktionen von jeweils 5 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktlonszahlen graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um die grösste Spitze) entsprechen, werden gesammelt" und das Insulin wird durch Zugabe von 0,02 M Zinkazetat in einer den gesammelten Fraktionen entsprechenden Volumenmenge ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und aus einem Azeton enthaltenden Zitratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 210 mg.

Beispiel 8

Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt j

1,25 kg iDris (hydroxymethyl)aminomethan

725 ml 12,5 N HCl '

62,4 1 96?6iges (v/v) Äthanol -

mit Wasser wird auf ein Volumen von 100 1 aufge-

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■ iüllt. ·..

Der .pH-Wert ist 7,3 "bei 25⁰O

1,3 kg QAE-Sephadex A-25 werden in dem Puffer aufgequollen und die feinsten Seilchen werden durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zur Füllung einer Säule mit einem Durchmesser von 15 cm und einer Höhe von 25 cm verwendet. Mit dem Puffer wird die Säule ins Gleichgewicht gebracht.

18 g Insulin das zuvor aus einem Zitratpuffer isoliert worden war, werden in einer Mischung von 0,72 g Dinatriumsals der Ethylendiamin-tetra-Essigsäure, 10,3 g Tris-ihydroxymethyl)— aminomethan und 720 ml 60#igera (v/v) Äthanol aufgelöste Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt. 10,7 ml β N HOl werden der klaren Lösung zugegeben, die dann auf die Säule gebracht wird. Die Eluierung wird mit dem Puffer bei einer Temperatur von 25⁰O und mit einer Geschwindigkeit von 1,2 l/h durchgeführt. Fraktionen von jeweils 0,5 1 werden gesammelt. _v

Die Extinktionen bei 276 nm (E₂^g) werden gemessen und gegen die Volumen des Eluats graphisch aufgetragen, wie es in Figur 5 gezeigt ist. Diejenigen Fraktionen, die den zentralen Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechen, werden gesammelt (wie in der Figur dargestellt)« Das Insulin wird aus der gesammelten Flüssigkeit ausgefällt, indem 0,02 M Zinkazetat in einer den gesammelten Fraktionen entsprechen-

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den Volumenmenge zugegeben wird. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und aus einem Azeton enthaltenden Zi-. tratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisiert. Die

Die Ausbeute an reinem Insulin ist 8,2 g.

Das Insulin wird aus einem Puffer folgender Zusammensetzung rekristallisiertj

2,0 $ Insulin _;

0>8 j£ Zn⁺⁺ (als Chlorid), bezogen auf die

Insulinmenge OjOIM Natriumazetat 7^0 ^Natriumchlorid

Es wird mit HCl auf einen pH von 5,45 bis 5,55 eingestellt.

Das Insulin wird in Wasser gelöst_#das HCl und ZnCl₂ enthält, wonach eine Lösung von Natriumazetat und Natriumchlorid zugegeben' wird» Die Kristallisation wird bei Raumtemperatur unter mechanischem Rühren durchgeführt. Nach 1 bis 2 Tagen ist die Kristallisation beendet. Das Insulin wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 8,0 g.

Das gereinigte Insulin und das reine Insulin gemäss der Erfindung kann für die Herstellung Jeder Art von pharmazeuti-

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sehen Insulinaufbereitungen für klinische Zwecke verwendet werden.

Um eine schnelle Insulinwirkung zu erhalten, wird bekanntlich eine Injizierbare wässrige Insulinlösung verwendet. Diese Lösung hat normalerweise einen pH-Wert von etwa 2 bis 3» Es gibt aber auch bekannte Insulinaufbereitungen die aus einer Insulinlösung mit einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 bestehen* Im Zusammenhang mit der zuletzt erwähnten Insulinlösung wird auf die US-Patentschrift ITo. 3 091 573 verwiesen. Das gereinigte und reine Insulin gemäss der Erfindung kann für die Herstellung von beiden Arten der bekannten injizierbaren Insulinlösungen verwendet werden.

Es sind auch injizierbare Insulinaufbereitungen bekannt, in denen das Insulin an eine Verbindung gebunden wird, durch welche das Insulin bei dem pH-Wert des menschlichen Blutes und der menschlichen Gewebe weniger löslich wird, Beispiele für derartige Verbindungen sind Protamine, Globin und Surfen (bis-2-Methyl-4— amino ehino Iy 1-6-carbämid)«, Eine hinlänglich bekannte Aufbereitung dieser Art.stellt eine wässrige Suspension von einer amorphen Insulinausfällung und Protamin in einem Zink enthaltenden Medium dar» Als weiteres Beispiel sei auf eine Injizierbare wässrige Suspension einer Insulinverbindung und Protamin in kristalliner Porm verwiesen. Das gereinigte Insulin und das reine Insulin gemäss der Erfindung kann auch für die Bildung von injizierbaren Insullnaüf-

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- 52 bereitungen dieser Art verwendet werden.

In grossem Umfange werden solche injizierbaren Insulinaufbereitungen verwendet, bei denen es sieb um wässrige Suspensionen bandelt, die Insulin in kristallinem und/oder amorphen Zustand enthalten. In derartigen Suspensionen von kristallisiertem Insulin liegen Zinkionen in einer solchen Menge vor, dass die suspendierten Insulinkristalle mindestens 0,35 Milliäquivalente Zink pro Gramm der Kristalle enthalten und wobei die Suspensionen einen pH-Wert von etwa 7 besitzen. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die US-Patentschrift 2 ΘΘ2 202 verweisen. Das gereinigte Insulin und das reine Insulin gemäss der Erfindung kann zur Herstellung dieser Art von injizierbaren Insulinaufbereitungen verwendet werden.

Während der letzten 10 Jahre wurden auch injizierbare wässrige Suspensionen hergestellt, die Rinderinsulin in kristallisierter Form enthalten, wobei die Kristalle die Form von scharfkantigen Rbomboedern besitzen, die von ebenen Kristallflächen begrenzt sind, wobei der stumpfe Winkel von jedem Rhombus zwischen 114° und 115° beträgt. Bezüglich der Herstellung von derartigen Kristallen wird beispielsweise auf die US-Patentschrift 2 920 014 verwiesen. Die Suspension von derartigem Rinderinsulin in kristalliner Form kann auch gelöstes Insulin enthalten. Das gereinigte Insulin und das reine Insulin gemäss der Erfindung kann auch zur Bildung von dieser

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Art von Insulinaufbereitungen für klinische Zwecke verwendet werden.

Schliesslich ist es bekannt, dass es von Vorteil ist, dass die Insulinkristalle, die in kristalliner Form in Insulinkristallsuspensionen zur Injektion verwendet werden, eine im wesentlichen einheitliche Grosse besitzen. Dies kann auf dem in den US-Patentschriften Nos. 2 819 999 und 2 799 622 beschriebenem Weg erreicht werden. Derartige Kristallisationsverfahren können in Verbindung mit der Herstellung von gereinigtem Insulin und reinem Insulin gemäss der Erfindung für injizierbare Insulinkristall-Suspensionen verwendet werden.

In den nachfolgenden Beispielen wird beschrieben, wie das gereinigte Insulin und das reine Insulin für die Herstellung von einigen Arten der vorerwähnten Insulinaufbereitungen eingesetzt werden kann.

Beispiel 9

Neutrale Insulin-Injektion 40 int.E./ml.

160 mg von reinem Insulin, das gemäss Beispiel 6 erhalten wurde, werden in 20 ml N/100 Salzsäure aufgelöst. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert und das Zutrat wird auf aseptischem Wege mit 60 ml.einer sterilen wässrigen Lösimg vermischt, die 0,1 g Metbyl-l-hydroxybenzoat enthält. Scbliesalich werden

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20 ml einer sterilen Lösung, die 136 mg Natriumazetat, 0,7 g
Natriumchlorid und 10 mg Natriumhydroxyd enthält, zugegeben.
Die hiernach erhaltene Aufbereitung hat einen pH-Wert von
etwa 7t3· Sie wird auf aseptischem Wege in sterilisierte Ampullen abgefüllt.

Beispiel 10
Protamin-Zink-Insulin-Injektion 40 int.E./ml.

1,6 g gereinigtes Insulin, das gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, werden in 75 ml 0,03N Salzsäure aufgelöst. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert und das Piltrat wird auf aseptischem Wege unter konstantem Rühren mit 80 ml einer sterilen Lösung vermischt, die 16 g Glyzerin, Zinkchlorid in einer 85 mg
Zink äquivalenten Menge und 1 g Methyl-p-hydroxybenzoat enthält. Dieser Lösung werden 25 ml einer sterilen Lösung von
340 mg Protaminsulfat in 0,08 N Salzsäure und 100 ml einer sterilen Lösung von 0,058 N Natriumhydroxyd zugesetzt, die 1,36 g Natriumazetat enthält. Das so erhaltene Produkt bat einen pH
von etwa 7,2. Ss wird auf aseptischem Wege in sterilisierte
Ampullen abgefüllt. ·

Beispiel 11
Zweiphasen-Insulin-Injektion 40 int.E./ml«

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19AO130

FUr die Herstellung dieses pharmazeutischen Insulinpräparats wird reines Insulin eingesetzt, das aus einem Azetat-Salz-Puffer rekristallisiert worden war. 1,6 g an reinem (Rinder)Insulin, das gemäss Beispiel 8 hergestellt war, wer- ^] den in 75 ml ^25 Salzsäure aufgelöst, die Zinkchlorid in einer 1,1 mg Zink äquivalenten Menge enthält. Sie Lösung wird durch Filtration sterilisiert und das Filtrat auf aseptischem Wege unter konstantem Rühren mit 25 ml einer sterilen lösung vermischt, die 1,36 g Natriumazetat, 7 g Natriumchlorid und soviel Natriumhydroxyd enthält, dass sich in der Mischung ein pH-Wert von 5_f4 bis 5_f5 einstellt. Das Rühren wird während etwa 20 Stunden fortgeführt oder solange, bis das ausgefällte Insulin in rhomboedrische Kristalle umgewandelt worden ist. Diese Suspension wird dann auf aseptischem Wege 800 ml einer sterilen wässrigen Lösung zugegeben, die 1 g Methyl-p-hydroxybenzoat enthält. Die Mischung wird dann mit 100 ml einer Lösung verdünnt, die soviel Natriumhydroxyd enthält, dass ein Produkt mit einem pH-Wert von etwa 7 erhalten wird. Diesem Produkt wird eine sterile neutrale Lösung von reinem Insulin, die 1,6 mg reines Insulin pro ml enthält, solange zugesetzt, bis ein Viertel des Insulins in löslicher Form vorliegt. Die Suspension wird auf aseptischem Wege in sterilisierte Behälter abgefüllt.

Die sterile Lösung von reinem Insulin wird auf folgendem Wege erhalten. P,4 g reines (Schweine)Insulin, das gemäss Beispiel 8 erhalten wurde, wird mit 25 ml N/50 Salzsäure aufgelöst, die Zinkchlorid in einer 0,25 mg Zink äquivalenten Men-

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. - 36 -

ge enthält. Die Lösung wird durch Sterilisation filtriert und das Filtrat wird auf aseptischem Wege mit 200 ml einer sterilen wässrigen Lösung verdünnt, die 0,25 g Methyl-phydroxybenzoat enthält, sowie mit 25 ml einer sterilen Lösung, die 0,34 g Natriumazetat, 1,75 g Natriumchlorid und soviel Natriumhydroxyd enthält, dass sich in der schliesslich erhaltenen Lösung ein pH von etwa 7 ergibt.

Beispiel 12 Insulin-Zink-Suspension 40 int.E./ml.

Zunächst wird die kristalline Fraktion der Aufbereitung in der nachfolgenden Weise hergestellt. 1,6 g reines Insulin, das gemäss Beispiel 3 hergestellt wurde, werden in 75ml N/50 Salzsäure aufgelöst, die Zinkchlorid in einer 10 mg Zink äquivalenten Menge enthält. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert und das Filtrat wird auf aseptischem Wege unter Umrühren mit 25 ml einer sterilen Lösung vermischt, die 1,36 g Natriumazetat, 7 g Natriumchlorid und genügend Natriumhydroxyd enthält, damit sich in der Mischung ein pH von 5»4 - 5,5 einstellt. Das Umrühren wird während etwa 20 Stunden fortgeführt bzw. solange bis das ausgefällte reine Insulin in rhomboedrische Kristalle umgewandelt ist. Die Suspension wird dann auf aseptischem Wege unter andauerndem Umrühren zu 900 ml einer sterilen Lösung gegeben, die'Zinkchlorid in einer 70 mg Zink äquivalenten Menge, 1 g Methyl-p-hydroxybenzoat und .genügend Natriumhydroayd enthält, damit in der

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erhaltenen kristallinen Fraktion ein pH-Wert von etwa 7,3 vorliegt.

Die amorphe Fraktion wird in der folgenden Weise hergestellt. 1,6 g reines Insulin, das gemäss Beispiel 5 hergestellt war, werden in 100 ml N/50 Salzsäure aufgelöst, die Zinkchlorid in einer 10 mg Zink äquivalenten Menge enthält. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert und das Filtrat auf aseptischem Wege mit 800 ml einer sterilen lösung verdünnt, die Zinkchlorid in einer 70 mg Zink äquivalenten Menge und 1 g Methyl-p-hydroxybenzoat enthält. 100 ml einer sterilen Lösung, die 1,36 g Natriumazetat, 7g Natriumchlorid und genügend Natriumhydroxyd enthält, um einen pH-Wert von etwa 7,3 in der schliesslich erhaltenen amorphen Fraktion einzustellen, werden dann auf aseptischem Wege unter andauerndem Umrühren zugegeben.

Die Insulin-Zink-Suspension wird durch aseptisches Vermischen von 7 Volumenanteile der kristallinen Suspension und 3 VpIumenanteile der amorphen Suspension hergestellt. Die Mischung wird auf aseptischem Wege in sterilisierte Ampullen abgefüllt.

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Claims

- Patentansprüche

1. Insulin, in anorpher oder kristalliner Form, das.von
Proteinen pankreatischen Ursprungs mit einem Molekulargewicht von etwa oberhalb 6000 frei ist.

2. Insulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

es bei einer Analyse vermittels Polyaerylamidgel-Elektrophorese im wesentlichen nur einen Bestandteil (reines
Insulin) ausweist.

3. Insulinaufbereitung für klinische Zwecke, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Insulin nach einem oder beiden der vorhergehenden Ansprüche.

4·. Verfahren zur Herstellung· einer Insulinaufbereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin, in einem injizierbaren Medium verteilt wird.

5» Verfahrennach Anspruch 4, dadurch.gekennzeichnet, dass eine wässrige Insulinlösung bereitet wird, die vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 7-8 aufweist«

6. Verfahren nach Anspruch 4_t dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Suspension von Insulinkristallen bereiten wird, in der die Insulinkristalle mindestens etwa 0,35 Milliä^ulvalente Zink pro Gramm Kristall enthalten.⁴

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7. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Suspension von amorphem Insulin bereitet wird.

C. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 7» dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension mit kristallinem und amorphem Insulin "bereitet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Suspension von Rinderinsulinkristallen bereitet wird, welche die Form scharfkantiger Rhomboeder aufweisen, welche von ebenen Kristallflächen begrenzt sind, wobei der stumpfe Winkel jedes Rhomboeders zwischen 114° und 115° beträgt.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin zur Herabsetzung seiner Löslichkeit bei dem pH-Wert des menschlichen Blutes und des Gewebes an eine andere Substanz gebunden wird.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 6, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass Insulinkristalle verwendet werden, welche eine annähernd gleiche Grosse besitzen.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein

einer Gelfiltration unterworfenes Insulin verwendet 909887/1S64

wird.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin zunächst einer Gelfiltration und hiernach einer Säulenchromatographie auf einem Ionenaustauscher unterworfen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass ein Kationenaustauscher verwendet wird.

15« Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin einer Säulenchromatographie auf einem Anionenaustauscher unterworfen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet _t dass ein stark basischer Anionenaustauscher verwendet wird.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein wasserhaltiges und mit Wasser vermischbares organisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein aliphatischer Alkohol, als Eluierungsmittel verwendet wird.

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