DE2505306A1 - Verfahren zur reinigung von alkalioder ammoniuminsulin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Reinigung von Alkali- oder Ammoniuminsulin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Alkali-oder Ammoniuminsulin durch Gelfiltration bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5.
• Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Reinigung eines Alkali-oder Arnmoniuminsulins geschaffen, das darin besteht, daß man ein Gel, das im Trockenzustand eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent aufweist, und dessen Teilchendurchmesser kleiner als etwa 100 Mikron ist, aufquillt, mit dem aufgequollenen Gel eine Säule bepackt, die bepackte Säule mit einer wässrigen Lösung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins mit einer Reinheit von wenigstens etwa 80 % versetzt, wobei die Insulinkonzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 Prozent, auf Gewicht pro Volumen bezogen, liegt, die Insulingesamtmenge für eine Säulenbeladung im Bereich von etwa 0,8 bis etwa 6,7.g pro Liter Bettvolumen ausreicht und der pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,5 liegt, und schließlich das Insulin bei einer Temperatur im Bereich von ° etwa 5 bis etwa 30 C mit einem wässrigen Eluiermittel, dessen pH-Wert im gleichen Bereich wie der der Insulinlösung liegt, von der Säule eluiert.
• Seitdem Insulin im Jahre 1921 als Komponente des Pancreas entdeckt wurde, erlangte es weltweite Bedeutung zur Behandlung von Diabetes mellitus. Bei den Extraktionsverfahren zur Entfernung von Insulin aus Pancreasgewebe werden jedoch auch ziemliche Mengen an Nichtinsulinprotein entfernt, und es wurden daher große Anstrengungen zur Entwicklung von Reinigungsverfahren von Insulin, nämlich Verfahren zur Abtrennung des Insulins von dem Nichtinsulinprotein, unternommen. Mehrere zur Insulinreinigung entwickelte Verfahren wurden auch technisch von Bedeutung.
• Eine dieser technisch wichtigen Methoden und eine der ersten überhaupt bedient sich des allgemeinen Phänomens, daß ein Protein am isoelektrischen Punkt minimal löslich ist, wenn die sonstigen Faktoren konstant gehalten werden.
• So wird in US-PS 1 469 994 ein Reinigungsverfahren beschrieben, bei dem die in einem wässrigen Pacreasextrakt befindlichen Nichtinsulinproteine an ihrem isoelektrischen Punkt ausgefällt werden. Die isoelektrische Ausfällung von Insulin aus einem wässrigen Pancreasextrakt bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 7 geht aus US-PS 1 520 673 hervor.
• Nach einem anderen Verfahren erfolgt die Ausfällung von Insulin durch Zugabe einer ausreichenden Menge eines anorganischen Salzes. Das erste Verfahren zum Aussalzen von Insulin ist in US-PS 1 547 515 beschrieben, und besteht in einer Zugabe von Natriumchlorid zu einem Extraktionslösungsmittel. In US-PS 2 449 076 wird ein Differentialaussalzverfahren beschrieben, das darin besteht, daß man Insulin aus einem neutralisierten Extrakt durch Zugabe von Natriumchlorid aussalzt, das Ganze abfiltriert, den Rückstand wieder auflöst und das Insulin erneut aussalzt, wobei allerdings die Salzkonzentration niedriger ist als diejenige beim ersten Aussalzen.
• Ein drittes technisch wichtiges Verfahren zur Reinigung von Insulin besteht in einer Ausfällung oder Auskristallisation von Insulin aus einer Lösung in Form eines Zinkinsulinkomplexes.
• Im allgemeinen wird Zinkinsulin aus einer gepufferten wässrigen Lösung ausgefällt, die Zinkionen enthält. Hierzu werden verschiedene Puffer verwendet; und nach US-PS 2 626 228 gelangt beispielsweise ein Zitronensäure-Zitrat-Puffer zur Anwendung.
• Den heutigen technischen Verfahren zur Reinigung von Insulin liegen alle drei oben erwähnten Methoden zugrunde. Zinkinsulin ist die wichtigste handelsübliche Form von Insulin, und die letzte Stufe der Insulinreinigung besteht daher normalerweise in einer Auskristallisation mit Zinkionen.
• In den letzten Jahren wurde jedoch festgestellt, daß Nichtinsulinproteine, bei denen es sich hauptsächlich um Proinsulin und proinsulinähnliches Protein handelt, in geringerer Menge in handelsüblichen Zinkinsulinen vorhanden sind. Diese Komponenten machen im allgemeinen zwar weniger als etwa 8 Gewichtsprozent der handelsüblichen Zinkinsuline aus, doch nimmt man an, daß einige dieser Komponenten antigen oder immunogen sind. Es wird in diesem Zusammenhang beispielsweise auf Chance et al., Science 161, 165 (1968), Steiner et al., Diabetes 18, 725 (1968), Bromer, BioScience 20, 701 (1970) und Rubenstein et al., Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971) verwiesen.
• Es besteht daher das Problem, wie man Nichtinsulinproteine in technischem Maßstab von Insulin abtrennen kann.
• Unter dem Begriff Insulin versteht man nicht nur Insulin selbst, sondern auch alle insulinähnlichen Proteine, wie Desamidoinsulin. Insulin und insulinähnliche Proteine verfügen über ähnliche hypoglykämische Wirkungen, und eine Abtrennung des Insulins von allen anderen pancreatischen Proteinen ist daher normalerweise nicht erforderlich, d.h.man braucht normalerweise kein homogenes Insulin.
• Durch bekannte Auftrenntechniken für biologische Substanzen in analytischem Maßstab, wie durch Elektrophorese und Ionenaustauschchromatographie, lassen sich auch die Nichtinsulinbestandteile von der Insulinkomponente aus technischen oder sogar rohen Insulinpräparationen abtrennen. Mit diesen Techniken kann man sogar die Insulinkomponente im Insulin selbst und desamidierte Insuline auftrennen. Im technischen Maßstab sind diese Verfahren jedoch nicht sonderlich geeignet.
• Ein Verfahren, das sich leichter an einen technischen Maßstab anpassen läßt, ist die Gelfiltration, worunter man sowohl die Gelexklusionschromatographie als auch die Gelpermeationschromatographie versteht. Bei diesem Verfahren werden Proteine auf einer Säule voneinander getrennt, die ein Gel enthält, welches derart vernetzt ist, daß es innerhalb jedes Gelteilchens Poren gibt. Diese Poren haben ein begrenztes meßbares Volumen, das zum Quellungsgrad des Gels direkt proportional und zum Vernetzungsgrad umgekehrt proportional ist. Da kleinere Moleküle wesentlich leichter in diese Poren eintreten können als größere, wird der Strom der kleineren Moleküle durch die Säule im Verhältnis zu den größeren Molekülen, die nur teilweise oder überhaupt nicht in die Poren gelangen können, erschwert.
• Die Gelfiltration wurde in der Vergangenheit bereits zur Reinigung von Insulin eingeführt. Bei der Isolierung von Insulin aus einem einzigen Katzenpancreas erhielt man Rohinsulin durch Säure-Alkohol-Extraktion und anschließende alkalische Fällung zur Entfernung von inaktivem Material, Konzentration, isoelektrische Ausfällung und schließlich Aussalzen mit Natriumchlorid. Dieses Rohinsulin wurde dann auf eine mit einem vernetzten Dextrangel gefüllte Säule gegeben und von dieser mit 1,0 m Essigsäure eluiert. Davoren, Biochim. Biophys. Acta 63, 150 (1962).
• Zur Isolierung von Insulin aus Fisch wurden Drüsen in Wasser homogenisiert und die Proteine mit Trichloressigsäurelösung ausgefällt. Die Ausfällung wurde mit Säure-Äthanol extrahiert, worauf man die Extrakte zur Entfernung der Lipide mit Methylenchlorid behandelte. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden isoliert, in 5,0 m Essigsäure aufgenommen und über einer mit einem vernetzten Dextrangel gefüllten Säule unter Verwendung von 5,0 m Essigsäure als Eluiermittel filtriert. Humbel, Biochem. Biophys. Res.
• Commun. 12, 333 (1963). Es werden Ausbeuten von etwa 80 z angegeben. Humbel weist jedoch darauf hin, daß die Elutionsbedingungen für eine gute Abtrennung des Insulins von anderen Proteinen eine Dissoziation der Insulinmoleküle begünstigen sollten. Er berichtet ferner, daß eine 1,0 m Essigsäure kein zufriedenstellendes Lösungsmittel ist, da das Insulin nach Yphantis und Waugh tBiochim. Biophys. Acta 26, 218 (1957)/ darin nicht vollständig dissoziiert wird.
• Von Epstein et al., Biochemistry 2, 461 (1963) wurde bereits ein Rohextrakt von Rinderpancreas durch ein vernetztes Dextrangel filtriert. Als Eluliermittel wurde 0,2 m Ammoniumbicarbonat verwendet, nämlich ein von Humbel ebenfalls empfohlenes Lösungsmittel. Epstein et al. berichten von einer etwa 60-prozentigen Ausbeute.
• Insulin wurde auch bereits aus menschlichem Pancreas isoliert.
• Die Drüsen wurden zuerst homogenisiert und extrahiert. Durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat wurde eine gewisse Menge an inaktivem Material abgetrennt. Das Insulin wurde dann ausgefällt, und zwar zuerst mit Natriumchlorid und dann durch eine isoelektrische Fällung. Das dabei erhaltene Insulin wurde in 0,5 n Essigsäure gelöst und durch vernetztes Dextrangel filtriert. Das filtrierte Insulin wurde anschließend in Zinkinsulin umgewandelt. Jackson et al., Diabetes 18, 206 (1969). Die Ausbeute an Insulin nach der Gelfiltration betrug etwa 60 %.
• Nach ZA-PS 69/5280 (die der BE-PS 737 257 entspricht), wurde schließlich auch bereits eine Kombination aus Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie eingesetzt. Bei dem einzigen Beispiel, das sich mit einer Gelfiltration-befaßt (Beispiel 1), wird Zinkinsulin durch eine mit vernetztem Dextrangel gefüllte Säule filtriert, wobei man eine Ausbeute von 80 % erhält. Als Eluiermittel wird 1,0 m Essigsäure verwendet. Es- ist jedoch zu beachten, daß bei diesem Verfahren nach Filtration ein Aussalzen, eine isoelektrische Ausfällung und ein Zinkkristallisationsverfahren für erforderlich gehalten werden, damit man Zinkinsulin erhält.
• Jedes bekannte Verfahren unter Verwendung der Gelfiltration zur Reinigung von Insulin führte jedoch zu einem starken Verlust an Insulin. Darüberhinaus können dem Stand der Technik keine verlässlichen Angaben entnommen werden, daß man infolge des Einsatzes einer Gelfiltration nur Insulin (unter Einschluß von insulinähnlichen Proteinen der oben erwähnten Art) erhält.
• Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann im allgemeinen jedes in Wasser quellbare Gel eingesetzt werden, das sich zusammen mit Proteinlösungen verwenden läßt. Die Wasserrückaufnahme des Gels im trockenen oder nicht gequollenen Zustand sollte jedoch wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent betragen, bezogen auf das Gewicht des Trockengels, und der Teilchendurchmesser sollte kleiner sein als etwa 100 Mikron. Die Wasserrückaufnahme des Gels liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 98 %, und sie-beträgt insbesondere etwa 5-bis etwa 20 %. Die Durchmesser der Trockengelteilchen sind vorzugsweise kleiner als etwa 80 Mikron, wobei ein besonders gUnstiger Teilchendurchmesserbereich zwischen etwa 20 und etwa 80 Mikron liegt.
• Beispiele geeigneter Gele sind unter anderem Stärke (unter Einschluß von Maisstärke), vernetztes Galactomannan, vernetztes Dextran, Agar oder Agarose, Polyacylamide, Copolymere von Acylamid und Methylenbisacrylamid , Copolymere von Methylenbisacrylamid mit Vinyläthylcarbitol und mit Vinylpyrrolidon und dergleichen. Bevorzugte Gele sind vernetzte Dextrane, wie das von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J., V.St.A. hergestellte und vertriebene Sephadex.
• Die Art der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Säule ist nicht kritisch. Wahl von Höhe, Durchmesser oder Konfiguration der Säule hängen von den gewünschten Verfahrensparametern ab. Mit zunehmender Säulenhöhe wird natürlich die Fließgeschwindigkeit langsamer, was in anderen Worten ausgedrückt bedeutet, daß der Säulenrückdruck umgekehrt proportional zur Säulenhöhe ist. Ein fbereinander aufgestockter Säulenaufbau wird daher bevorzugt, wie beispielsweise die Pharmacis Sectional Column KS-370. Für normale Produktionszwecke reicht eine Anordnung aus sechs Sektionen.
• Approximativ erhält man eine zufriedenstellende Insulinreinigung mit einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g Alkali- oder Ammoniuminsulin pro Liter Bettvolumen, und diese Beladung wird besonders bevorzugt. Die Säulenbeladungen können jedoch im allgemeinen zwischen etwa 0,8 und etwa 6,7 g pro Liter Bettvolumen liegen, und der bevorzugte Bereich beträgt etaia 3,5 bis etwa 5,0 g pro Liter Bettvolumen. Natürlich lassen sich ohne weiteres optimale Bedingungen für jede vorgegebene Säule ermitteln.
• Das Gel läßt sich nach irgendeiner bekannten Methode aufquellen und dann in die Säule packen. Im allgemeinen wird das Gel in dem eluierenden Medium aufgeauollen. Wahlweise kann man das Gel jedoch auch in 30-prozentigem wässrigem Äthanol aufquellen, dann dekantieren und das Quellmedium durch das Eluiermedium ersetzen.
• Im allgemeinen löst man das Alkali- oder Ammoniuminsulin in destilliertem Wasser und stellt den pH-Wert mit verdünnter Base oder mit verdünntem organischem Puffer je nach Wunsch ein. Geeignete Basen für diesen Zweck sind beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid und dergleichen. Natriumhydroxid wird bevorzugt. Beispiele geeigneter organischer Puffer sind unter anderem Glycin-Natriumhydroxid, Tris (hydroxymethyl) -aminomethan und dergleichen.
• Das Alkali- oder Ammoniuminsulin kann im allgemeinen nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung des Alkali- oder Ammoniuminsulins jedoch nach der in US-PS 3 719 655 beschriebenen Arbeitsweise. Wie oben angegeben muß dieses Insulin allerdings eine Reinheit von wenigstens etwa 80 % haben. Dies bedeutet, daß der Insulingehalt unter Einschluß der nichtinsulinähnlichten Proteine mit hypoglykämischer Wirksamkeit wenigstens etwa 80 % der gesamten vorhandenen Proteine ausmachen muß.
• Die Konzentration an Alkali- oder Ammoniuminsulin in der auf die Säule aufgegebenen Insulinlösung beträgt, wie oben bereits angegeben, etwa 1 bis etwa 8 %, und zwar bezogen auf Gewicht pro Volumen. Die bevorzugte Konzentration liegt bei etwa 4 bis etwa 6 %.
• Damit man zu sauberen Ergebnissen gelangt, sollte das Alkali-oder Ammoniuminsulin in einem Lösungsmittelvolumen gelöst werden, das geringer ist als das Auftrennvolumen, worauf im folgenden näher eingegangen wird.
• Bei der Chromatographie wird der Verteilungskoeffizient Kd -als das Verhältnis aus der Konzentration des gelösten Stoffes in der mobilen Phase und der Konzentration des gelösten Stoffes in der stationären Phase definiert. Bei der Gelfiltration ist die mobile Phase das sich in den Hohlraum zwischen den Gelpartikeln bewegende Lösungsmittel, und die stationäre Phase ist das Lösungsmittel, das in den Gelteilchen aufgesogen ist, d.h. in den Poren innerhalb eines jeden Gelteilchens eingefangen ist. Der Wert Kd gibt somit den Teil an aufgesogenem Lösungsmittel an, der von einem gelösten Stoff durchdrungen werden kann.
• Über den Verteilungskoeffizienten Kd läßt sich das Elutionsvolumen Ve eines gelösten Stoffes durch folgende Gleichung ausdrücken: Ve =Vo + Kd Vi worin V0 das Leervolumen der Säule und V. das Volumen des aufgesogenen Lösungsmittels darstellen. Löst man diese Gleichung nach Kd auf, dann ergibt sich folgender Zusammenhang: Wird die Dichte von Wasser als Einheit angenommen, dann gilt Vi = a.Wr worin a das Gewicht des Trockengels ist und Wr die Wasserrückaufnahme bedeutet. Der Verteilungskoeffizient Kd wird somit und kann vom Fachmann experimentell bestimmt werden.
• Unter der Voraussetzung, daß eine Lösung zwei gelöste Stoffe enthält, läßt sich das Elutionsvolumen für jeden gelösten Stoff wie folgt ausdrücken: Ve' = V0 + Kd1Vi Ve " = VO + KdsaVi.
• Das Abtrennvolumen V5 ist die Differenz zwischen den Elutionsvolumina aus den beiden gelösten Stoffen: V5 = Ve11 - Ve V5 = (Kd - Ka')Vi.
• Aus obigen Ausführungen ergibt sich, daß das Ausmaß der Trennung zweier (oder mehrerer) gelöster Stoffe zum Teil von der säulenbeladung abhängt. Da sich die Menge an niedermolekularem gelöstem Stoff der Grenze der verfügbaren Poren nähert, muß die Trennung zweier gelöster Stoffe notwendigerweise abnehmen. Innerhalb der als Teil der Erfindung angegebenen Beladungsgrenzwerte kann das Ausmaß der Trennung schwanken. Gelegentlich kann man auch eine höhere Säulenbeladung auswählen, um die Abtrennung gegenüber der Produktilität auszuhalancieren.
• Wie bereits angegeben, kann das zum Eluieren verwendete Medium einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,5 haben. Normalerweise ist das Elutionsmedium eine wSssrige Lösung der gleichen Base oder des gleichen Puffers, wie man sie auch zur Herstellung der Insulinlösung verwendet, Das Elutionsmedium kann gewünschtenfalls bis zu etwa 0,02 Mol eines anorganischen Salzes pro Liter enthalten, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid und dergleichen. Bevorzugt wird eine Salzkonzentration von 0,01 Mol, und als Salz wird vorzugsweise Natriumchlorid verwendet.
• Der Einsatz eines derartigen Salzes wird bevorzugt, um eine Auftrennung zu verbessern und eine Absorption basischer Substanzen durch das Gel zu verhindern.
• Die Elution der Säule kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 5 bis etwa 30 0C vorgenommen werden. Vorzugsweise liegt diese Arbeitstemperatur bei Umgebungstemperatur oder darunter.
• Der Verlauf der Elution wird in irgendeiner geeigneten Weise verfolgt. Besonders eignet sich hierzu jedoch ein Verfahren, bei dem man die Ultraviolettabsorption einer jeden Fraktion bei 280 m/u mißt. Diejenigen Fraktionen, die die gewünschte gereinigte Insulinkomponente enthalten, werden vereinigt und normalerweise zu Zinkinsulin umgesetzt.
• Wie bereits oben angegeben ist das Zinkinsulin die wichtigste Form von Insulin. Das nach dem erfindungsgematßen Verfahren erhaltene hochreine Alkali- oder Ammoniuminsulin wird daher normalerweise in Zinkinsulin umgewandelt. Die Umwandlung zu Zinkinsulin erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 in Gegenwart eines Ammoniumacetatpuffers.
• Eine Isolierung des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus dem Elutionsmedium oder eine Konzentrierung der Lösung des gereinigten Insulins vor der Kristallisation mit Zink sind nicht erforderlich. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß das Insulin in Form der eluierten Lösung bereits derart konzentriert ist, daß Salz- oder isoelektrische Ausfällungen nicht erforderlich sind, obwohl derartige Verfahren gewünschtenfalls jedoch zusätzlich angewandt werden können.
• Das auf diese Weise erhaltene Zinkinsulin ist infolge des angewandten Verfahrens reiner. Diese erhöhte Reinheit läßt sich durch mehrere Methoden zeigen. Hierzu kann das Zinkinsulin beispielsweise direkt bezüglich seiner Nichtinsulinproteinkomponenten, wie Proinsulin und Glucagon, analysiert werden. Die Gegenwart hochmolekularer Proteine, wozu normalerweise auch das proteolytische Enzym Proaminase gehört, läßt sich ermitteln, indem man die Stabilität einer Protamininsulinsuspension bei erhöhter Temperatur mißt. Falls Protaminase vorhanden ist, dann dissoziiert der Protamin-Insulin-Komplex infolge Protaminabbau. Es können ferner auch physikalische Eigenschaften, wie eine Löslichkeit des Zinkinsulins bei neutralem pH-Wert und die Färbung der erhaltenen Lösung, gemessen werden. Schließlich kann man auch die spezifische Wirksamkeit des Insulins durch biologische und immunologische Versuche ermitteln.
• Wegen der besseren Reinheit ist das nach Durchführung des Verfahrens erhaltene Zinkinsulin ein begehrtes Material zur Formulierung der verschiedenen pharmazeutischen Formen von Insulin, wie normalem Insulin, Isophaninsulin, Protaminzinkinsulin, Zinkinsulinsuspensionen, Globininsulin und dergleichen.
• Das vorliegende reinere Zinkinsulin erlaubt ferner die Herstellung eines neutralen Insulins, das stabiler ist als saures Insulin, da die bisher in Zinkinsulin vorhandenen Verunreinigungen bei neutralem pH-Wert oft teilweise ausfielen. Zu solchen Verunreinigungen gehören oft Insulin abbauende Enzyme, wie Trypsin und Chymotrypsin, die die Stärke der Insulinpräparation vermindern. Das reinere Zinkinsulin erlaubt ferner die Formulierung von länger wirksamen Schweine- und Rinderinsulinzubereitungen, ohne daß wie bisher eine weitere Reinigung erforderlich ist. Die Herstellung von Isophaninsulin-aus dem reineren Zinkinsulin erfordert darin überhinaus weniger Protamin, da durch das Fehlen der sauren Proteinverunreinigungen nur diejenige Protaminmenge verwenden muß, die zur Ausfällung des Insulins benötigt wird.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann gewünschtenfalls auch mit anderen Reinigungsverfahren kombiniert werden. So kann man die Alkali- oder Ammoniuminsulinlösunq vor Durchführung der Gelfiltration beispielsweise einem oder mehreren Filtrationsverfahren unterwerfen. Ferner kann das eluierte Insulin vor seiner Umwandlung zu Zinkinsulin auch einem oder mehreren Filtrationsverfahren unterzogen werden.
• Beispiel 5,53 g Natriuminsulin vom Rind mit einer Stärke von 26,4 Einheiten/mg und einem Proinsulingehalt von 7,2 Gewichtsprozent werden in destilliertem Wasser suspendiert. Sodann gibt man bis zur Einstellung eines pH-Wertes von 9,0 verdünntes Natriumhydroxid zu. Das Volumen der dabei erhaltenen Lösung beträgt 100 ml. Hierauf wird ein vernetztes Dextrangel mit einer Wasserrückaufnahme von 5 % und einer Teilchengröße von 20 bis 80 Xu in wässrigem Natriumhydroxid mit einem pH-Wert von 9,0 equilibriert. Das so hergestellte aufgequollene Gel wird zum Bepacken einer 4,0 x 43,0 cm messenden Säule verwendet, die über ein Bettvolumen von 540 ml verfügt.
• Auf die Säule gibt man hierauf eine 40 ml Teilmenge der Insulinlösung. Die Säule wird dann mit wässrigem Natriumhydroxid vom pH 9,0 eluiert, wobei etwa 6,5 ml Fraktionen aufgefangen werden. Die Elution wird überwacht, indem man die Ultraviolettabsorption bei 280 m/u mißt. Die der Insulinkomponente entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und mit 6 n Chlorwasserstoffsäure auf-pH 3,0 angesäuert. Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit Zinkchlorid versetzt, worauf man das Zinkinsulin bei einem pH-Wert von 6,0 aus Ammoniumacetatpuffer isoliert. Die Ausbeute an Zinkinsulin beträgt 1,83 g, was einer auf das Ausgangsmaterial bezogenen Ausbeute von 82,5 % entspricht. Das erhaltene Insulin verfügt über eine Stärke von 26,8 Einheiten/mg und einen Proinsulingehalt von weniger als 0,05 Gewichtsprozent. Die Ausbeute auf Einheiten bezogen beträgt 83,8 %.
• Eine 37,5 ml Teilmenge der ursprünglichen Insulinlösung wird in der oben beschriebenen Weise ohne die erwähnte Gelfiltration direkt zu Zinkinsulin umgewandelt. Hierbei erhält man eine Ausbeute von 1,87 g (90,1 %) Zinkinsulin mit einem Proinsulingehalt von 5,4 Gewichtsprozent.

Claims (14)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gel, das im Trockenzustand eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent aufweist, und dessen Teilchendurchmesser kleiner als etwa 100 Mikron ist, aufguillt, mit dem aufgequollenen Gel eine Säule bepackt, die bepackte'Säule mit einer wässrigen Lösung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins mit einer Reinheit von wenigstens etwa 80 % versetzt, wobei die Insulfnkonzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 Prozent, auf Gewicht pro Volumen bezogen, liegt, die Insulingesamtmenge für eine Säulenbeladung im Bereich von etwa 0,8 bis etwa 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreicht und der pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 7,5 bis etwa 9,5 liegt, und schließlich das Insulin bei einer Temperatur im Bereich von etwa 5 bis etwa 30 OC mit einem wässrigen Eluiermittel, dessen pH-Wert im gleichen Bereich wie der der Insulinlösung liegt, von der Säule eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gel verwendet, das über eine Wasserrückaufnahme im Bereich von etwa 4 bis etwa 98 % verfügt.

3. Verfahren nach-Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gel verwendet, das über eine Wasserrückaufnahme im Bereich von etwa 5 bis etwa 20 % verfügt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gel ein vernetztes Dextran verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel eine Wasserrückaufnahme von etwa 5 % aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchendurchmesser des Gels im Bereich von etwa 20 bis etwa 80 Mikron liegen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Säulenbeladung im Bereich von etwa 3,5 bis etwa 5,0 g pro Liter Bettvolumen arbeitet.

8. Verfahren nach Anspruch 7,-dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g pro Liter Bettvolumen arbeitet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Eluiermittel verwendet, welches bis zu etwa 0,02 Mol eines anorganischen Salzes enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer etwa 0,01 molaren anorganischen Salzkonzentration arbeitet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als anorganisches Salz Natriumchlorid verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei Umgebungstemperatur vornimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei einer Temperatur von 5 0C durchführt.

14. Verfahren zur Reinigung von Rindernatriuminsulin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein vernetztes Dextrangel, das Uber eine Wasserrückaufnahme von 5 % verfügt.und eine Teilchengröße von 20 bis 80 /u hat, aufquillt, mit dem aufgequollenen Gel eine 4,0 x 43,0 cm messende Säule, die über ein Bettvolumen von 540 mm verfügt, bepackt, die bepackte Säule mit einer wässrigen Lösung von Rindernatriuminsulin versetzt, die eine Insulinkonzentration von 5,5 % und einen pH-Wert von 9 hat, und das Insulin dann bei Umgebungstemperatur mit wässrigen Natriumhydroxid bei einem pH-Wert von 9 von der Säule eluiert.