DE3850407T2

DE3850407T2 - Protein mit inhibierender wirkung auf die entzündungserregende phospholipase a2.

Info

Publication number: DE3850407T2
Application number: DE3850407T
Authority: DE
Inventors: Atsushi Imaizumi; Keizo Inoue; Takashi Kamimura; Ichiro Kudo; Masahiro Okada; Yorimasa Suwa; Yoji Suzuki
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2008-03-31
Also published as: EP0413024A1; EP0413024A4; WO1988007552A1; EP0413024B1; DE3850407D1; US5116942A; JPH06799B2; JPS63246397A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit einer inhibierenden Wirkung auf die entzündungserregende Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;). Diese Erfindung betrifft insbesondere ein Protein, welches durch Verabreichung eines Glucocorticoids von Zellen induziert wird und eine inhibierende Wirkung auf die entzündungserregende PLA&sub2; besitzt.

Stand der Technik

Ein Glucocorticoid wird heutzutage als eines der wirksamsten Arzneimittel gegen eine Reihe entzündlicher Krankheiten und allergischer Krankheiten, z. B. rheumatische Arthritis, Lupus erythematosus und Bronchialasthma, verwendet. Der Mechanismus seiner Wirkung ist der entzündungshemmenden Wirkung, der antiödematösen Wirkung und der immunsupressiven Wirkung des Glucocorticoids zuschreibbar. Von diesen Wirkungen betrifft die Art der entzündungshemmenden Wirkung die Inhibierung der Freisetzung von Arachidonsäure, die die Vorstufe von Prostaglandinen oder Leukotrienen ist, die als entzündungserregende Mediatoren angesehen werden. Kürzlich ist eine neue Theorie von Flower (Nature 278 : 456 (1979) vorgebracht worden, daß ein Glucocorticoid die Wirkung von PLA&sub2;, welches ein Schlüsselenzym für die Freisetzung von Arachidonsäure direkt aus dem Phospholipid ist, unterdrückt. Hinsichtlich des Wirkungsmechanismus eines Glucocorticoids wird angenommen, daß das Glucocorticoid, wenn es in eine Zelle eindringt, zuerst an den Rezeptor der Zelle gebunden wird, dann der resultierende Komplex in den Kern transportiert wird, wo er das spezifische Gen aktiviert und schließlich die Synthese eines spezifischen Proteins indiziert. Tatsächlich haben Tsurufuji et al. (Nature 280 : 408 (1979)) gezeigt, daß Cycloheximid, ein Inhibitor der Proteinsynthese, und Actinomycin D, ein Inhibitor der mRNA-Synthese, die therapeutische Wirkung eines Glucocorticoids gegen gegen das Pfoten-Ödem (experimentelles Tiermodell für die Entzündung), das durch Serotonin verursacht wird, unterdrückt. Die oben erwähnten Ergebnisse legen daher nahe, daß ein Glucocorticoid seine entzündungshemmende Wirkung durch die Induktion der Synthese eines Proteins entfaltet, welches PLA&sub2; inhibiert.
Bis heute sind von einigen Gruppen Versuche unternommen worden, ein Protein zu isolieren, dessen Synthese durch Glucocorticoid induziert wird und das die Wirkung von PLA&sub2; in vitro inhibiert und die Produktion von Prostaglandin in vivo unterdrückt. In diesen Versuchen ist PLA&sub2; aus Schweinepankreas in ihrem Auswertungssystem verwendet worden. Es gibt jedoch eine weitere entzündungserregende PLA&sub2; mit anderen Eigenschaften als jene der Pankreas-PLA&sub2;, von welcher allgemein angenommen wurde, daß sie eine Rolle eines Verdauungsenzyms spielt. Kürzlich haben Inoue et al. [Biochemistry (in japanisch geschrieben) 58 (Nr. 8): 766 (1986)] PLA&sub2;, die in Bauchfellhöhlen von Ratten vorkommt, isoliert und gereinigt und ihre Eigenschaften untersucht. Sie beobachteten, daß die Inokulierung von 100 ng gereinigtem Enzym in die Rückenhaut von Ratten den Anstieg in der Gefäßpermeabilität verursachte, wobei Evans- Blau austrat, welches vorher intravenös injiziert worden war. In der Zwischenzeit ist nicht bestätigt worden, daß PLA&sub2;, welches von Pankreas stammt, diese Wirkung aufweist. Ferner berichteten Vadas et al., daß PLA&sub2; in Gelenken mit rheumatischer Arthritis gesteigert auftritt, und daß das gereinigte Enzym nicht mit dem Antikörper von PLA&sub2; aus menschlicher Pankreas reagiert (J. Biochem. 100, 1297-1030, 1986). Die aus Pankreas stammende PLA&sub2; unterscheidet sich somit in der Primär- und in der Tertiärstruktur von der entzündungserregenden PLA&sub2;, und ihre Rollen sind in vivo vollkommen voneinander verschieden.

Offenbarung der Erfindung

Vor solchem Hintergrund haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine intensive Suche nach Proteinen vorgenommen, welches das Enzym spezifisch binden, und sind zur vorliegenden Erfindung gelangt. Das erfindungsgemäße Protein ist von Bauchfellhöhlen nach Verabreichung eines Glucocorticoids an eine Ratte erhältlich und besitzt eine inhibierende Wirkung auf die entzündliche PLA&sub2;, besitzt ein Molekulargewicht von 40 K und eine Aminosäuresequenz, die ab der N-terminalen Aminosäure aus (N-terminale Aminosäure)-Asp-Val-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Ser-Asp- besteht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Eluierungsmuster des gegenständlichen Proteins, erhalten durch Anionenaustausch-HPLC.
Fig. 2 zeigt ein Eluierungsmuster des gegenständlichen Proteins, erhalten durch Gelfiltrations- HPLC.
Fig. 3 zeigt ein Eluierungsmuster des gegenständlichen Proteins, erhalten durch Anionenaustausch-HPLC.
Fig. 4 zeigt ein Eluierungsmuster des gegenständlichen Proteins (40 K), erhalten durch Umkehrphasen-HPLC.
Fig. 5 zeigt ein Eluierungsmuster des gegenständlichen Proteins (35 K), erhalten durch Umkehrphasen-HPLC.
Fig. 6 zeigt kinetische Daten des gegenständlichen Inhibitorproteins.

Beste Durchführung der Erfindung

Zuerst wird die Isolierung und die Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins beschrieben.
Da es ein Protein ist, welches durch Verabreichung eines Steroids in vivo produziert wird, kann das erfindungsgemäße Protein durch direkte Verabreichung eines Steroids induziert werden, oder es kann auch induziert werden, indem eine normale Zelle oder eine errichtete Zelle in vitro in direkten Kontakt mit einem Steroid gebracht wird. Zum Beispiel wurde Ratten subkutan in den Rücken Dexamethason injiziert, eineinhalb Stunden nach der Injektion wurden sie mit Kohlendioxid getötet, und die Bauchfellhöhlen wurden mit einer Salzlösung, die Heparin und PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) enthielt, gründlich gespült. Die Spülflüssigkeiten wurden gewonnen, vereinigt, notwendigerweise gegen eine Ammoniumacetatpuffer dialysiert und lyophylisiert. Pro Stück wurden etwa 20 mg einer gefrorenen Rohprobe von Bauchfellspülflüssigkeit der Ratte erhalten. Das gegenständliche Protein wurde aus der so erhaltenen Probe isoliert und gereinigt, beispielsweise mit dem folgenden Verfahren:
Die Probe wurde zum Beispiel einer Anionenaustansch-HPLC unterworfen, und die Peaks mit Wirkung wurden durch Bestimmen der inhibierenden Wirkung von entzündungserregender PLA&sub2; in jeder Fraktion erhalten, wobei die Wirkung, die entzündungserregende PLA&sub2; zu inhibieren, als ein Index verwendet wurde. Es wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gefunden, daß die Peaks, die eine Wirkung aufwiesen, jeweils aus vielen Proteinen bestanden. Ferner wurden die wirksamen Fraktionen einer Gelfiltrations-HPLC unterworfen, sie wurden jedoch nicht zu einer einzigen Bande gereinigt, obwohl in der Operation wirksame Fraktionen erhalten wurden. Dann wurden die Fraktionen mit Umkehrphasen-HPLC gereinigt, um Peaks mit Wirkung zu erhalten. Durch SDS-PAGE wurde gefunden, daß die Peaks ein einzelnes Protein waren. Aus etwa 200 mg der Probe wurden etwa 100 ng die entzündungserregende PLA&sub2; inhibierende Proteine erhalten.
Wie oben erwähnt, sind die Isolierung eines Proteins aus Bauchfellhöhlen von Ratten, induziert mit einem Steroid, und die Reinigung des Proteins, welches eine inhibierende Wirkung auf die entzündungserregende PLA&sub2; aufweist, erklärt worden, aber die Quelle und die Herstellung des Proteins sind in der vorliegenden Erfindung überhaupt nicht darauf beschränkt. Es kann vom Menschen und von anderen Tieren als der Ratte extrahiert oder von Mikroorganismen oder Säugetierzellen durch ein biotechnologisches Verfahren produziert werden. Sie sind in der vorliegenden Erfindung enthalten, solange sie Proteine mit inhibierender Wirkung auf die entzündungserregende PLA&sub2; sind.
Die Test- und Bestimmungsmethoden, die in dieser Erfindung angewendet werden, sind folgende:

(1) Methode zum Bestimmen der inhibierenden Wirkung auf die entzündungserregende PLA&sub2;

Es wurde die entzündungserregende PLA&sub2;, die, induziert mit Kasein, aus einem Bauchfellexdrudat einer Ratte isoliert worden war, verwendet, und Phosphatidylethanolamin, markiert mit ¹&sup4;C, welches aus E. coli, in welches ¹&sup4;C-Essigsäure aufgenommen war, extrahiert worden war, wurde als Substrat verwendet. Das Reaktionssystem des Standards wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, nachdem 130 ul einer Probe oder der Kontrolle (eine Pufferlösung) mit 50 ul einer 0,5 Mol Tris-HCl (pH 9,0) und 25 ul von 40 mMol CaCl&sub2; und 25 ul des Substrats (400 dpm/nMol·2 mMol) und schließlich mit 20 ul entzündungserregender PLA&sub2; (0, 1 ng/ul, 80 Einheiten/mg Protein) gemischt worden waren. Dann wurden die Reaktionen mit Dole'schem Reagens gestoppt. Die markierte Fettsäure, die durch Hydrolyse des Phosphatidylethanolamins gebildet wurde, wurde mit Heptan extrahiert und mit dem Flüssigscintillationszähler bestimmt. Das Verhältnis zur Kontrolle in % wurde als die Inhibierungsrate der entzündungserregenden PLA&sub2; definiert.

(2) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Ein Teil der Proben, die durch eine Reihe chromatographischer Techniken fraktioniert worden waren, wurde 10 Minuten in Gegenwart von 1% SDS und 2-Mercaptoethanol auf 100ºC erhitzt. Dann wurde die Probe auf ein 12,5% Polyacrylamidgel aufgetragen und eineinhalb Stunden bei 15 mA einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde die Probe mit Silberfärbe-Kit (Bio-Rad®) gefärbt.

(3) Bestimmung der Proteinprimärstruktur

Die Struktur wurde unter Verwendung eines Gasphasen-Proteinsequenzers (hergestellt von Applied Biosystem, Modell 470A) bestimmt. Dazu wurden 10 ug der isolierten und gereinigten Probe in 30 ul 1% SDS gelöst und dem Gasphasen-Proteinsequenzer aufgetragen. Die PTH-(Phenylthiohydantoin)-Aminosäurederivate, die mittels automatischen Abbau nach Edmann gebildet wurden, wurden in der Form einer freien Aminosäure mit HPLC analysiert.
Die vorliegende Erfindung wird mit den folgenden Beispielen detailliert beschrieben:

Beispiel 1

(1) Herstellung gefriergetrockneter Proben von Bauchfellspülflüssigkeiten der Ratte

Fünfzig männlichen, 8 Wochen alten SD-Ratten wurden in den Rücken subkutan 1,5 mg/kg Dexamethason injiziert, und eineinhalb Stunden später wurden sie mit Kohlendioxid getötet. Die Bauchfellhöhlen wurden pro Ratte gründlich mit 12 ml Salzlösung, die 2 Einheiten/ml Heparin und 50 uMol PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) enthielt, gespült, und etwa 500 ml Spülflüssigkeiten wurden gesammelt. Die Spülflüssigkeiten wurden zweimal gegen 10 mMol Ammoniumacetatpuffer (pH 7,4) 40mal dialysiert und lyophylisiert, um etwa 940 mg einer gefriergetrockneten Probe von Bauchfellspülflüssigkeiten der Ratte zu erhalten.

(2) Isolierung und Reinigung des gegenstandlichen Proteins mittels Anionenaustausch-HPLC

Unter Eiskühlung wurden 200 mg einer gefriergetrockneten Probe einer Bauchfellspülflüssigkeit der Ratte in 50 ml 20 mMol Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Nachdem die Lösung durch ein 0,45 um Membranfilter filtriert worden war, wurde das Filtrat direkt einer Säule (aus TSK GEL DEAE-SPW) aufgetragen, wobei eine sp 8750-HPLC-Pumpe verwendet wurde. Die absorbierte Probe wurde mit einer Flußgeschwindigkeit von 2,5 ml/min mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert, wie in Fig. 1 mit einer strichlierten Linie gezeigt ist. In Fig. 1 gibt eine ausgezogene Linie die Menge von Proteinen an, überwacht durch UV-Absorption bei 280 nm, und eine starke inhibierende Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; wurde in den Fr. I bis Fr. IV detektiert. Es wurde mittels SDS-PAGE gefunden, daß jede Fraktion ein Gemisch von Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht war. Fig. 1 zeigt die Menge an markierter Fettsäure, die mit der Methode zum Bestimmen der inhibierenden Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; bestimmt wurde.

(3) Isolierung und Reinigung des gegenständlichen Proteins mittels Gelfiltrations-HPLC

Ferner wurde die für entzündungserregende PLA&sub2; inhibierende Fraktion (Fr. IV) durch Ultrafiltration (Centricut 10 · 3000 G) konzentriert, um die Fraktion zu reinigen. Etwa 0,7 ml des Konzentrats wurde auf eine Gelfiltrationssäule (TSK Gel G 3000 SW), äquilibriert mit 0,1 Mol Tris-HCl und 1,0 M NaCl bei pH 7,7, aufgetragen und mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Es wurden zwei Peaks mit inhibierender Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; erhalten (die mit schrägen Linien in Fig. 2 markierten Bereiche). Die Fraktionen, die mit den Retentionszeiten von 37 bis 44 Minuten eluierten, wurden weiter gereinigt.

(4) Isolierung und Reinigung des gegenständlichen Proteins mittels Anionenaustausch-HPLC mit einer analytischen Säule

Die Fraktionen, welche von der Gelfiltrationssäule in der Retentionszeit von etwa 40 Minuten eluiert wurden, wurden gesammelt, gegen 25 mMol Tris-HCl-(pH 7,7)-Puffer dialysiert und auf eine Anionenaustauschersäule (TSK Gel DEAE-5 pW), die mit Puffer äquilibriert war, aufgetragen. Das gegenständliche Protein wurde mit einer Flußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einem linearen NaCl- Gradienten abgetrennt. Die inhibierende Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; wurde in den Fraktionen mit einer Retentionszeit von 26-36 Minuten (der Bereich, der mit schrägen Linien in Fig. 3 gezeichnet ist) gesehen.

(5) Isolierung und Reinigung des gegenständlichen Proteins mittels Umkehrphasen-HPLC

Es wurde durch SDS-PAGE gefunden, daß die Fraktionen mit inhibierender Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2;, die mittels analytischer Anionenaustausch-HPLC fraktioniert worden waren, hauptsächlich aus 40 K und 35 K bestanden. Sie wurden daher jeweils der Umkehrphasen-HPLC unterworfen, so daß sie zu einem einzigen Protein gereinigt wurden. Die wirksamen Peaks in Fig. 3 wurden jeweils auf eine Säule (Bio-Rad Hi-pore RP-304), äquilibriert mit 0,1% TFA, aufgetragen. Das Protein mit 40 K wurde mit einer Flußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einem linearen Acetonitril-Gradienten eluiert, wie mit einer strichlierten Linie in Fig. 4 gezeigt ist. Die Fraktionen, deren UV-Absorption bei 280 nm detektiert wurde, wurden gegen 25 mMol Tris-HCl (pH 9,0) dialysiert, und ihre inhibierende Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde eine beträchtliche inhibierende Wirkung in der einzelnen Fraktion mit einer Retentionszeit von 59 Minuten detektiert. Es wurde mittels Elektrophorese gefunden, daß diese Fraktion ein einzelnes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 ist.

Beispiel 2

Der folgende Versuch wurde ausgeführt, um die Art der bekannten Wirkung des Proteins mit 35 K, die entzündungserregende PLA&sub2; zu inhibieren, kennenzulernen:
Die Konzentrationen des Enzyms und des inhibierenden Proteins wurden konstant gehalten, und die Reaktionsgeschwindigkeit wurde mit variierender Substratkonzentration gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 durch Auftragen der reziproken Werte gezeigt (die leeren Quadrate zeigen die Enzymreaktionen in dem System, das von inhibierendem Protein frei war, während die vollen Quadrate die Enzymreaktionen in demjenigen System zeigen, das ein inhibierendes Protein enthält).
Aus Fig. 6 wurde geschlossen, daß die Inhibierungsart des Proteins nicht-kompetitiv ist (das Substrat und die inhibierende Substanz wirken nicht-kompetitiv), und die Inhibierungskonstante wurde zu 4,5·10&supmin;&sup8; Mol berechnet.

Beispiel 3

Die Primärstruktur von Proteinen wurde teilweise mit Proben bestimmt, welche in Beispiel 1 isoliert und gereinigt worden waren. Obgleich die N-terminale Aminosäure nicht identifiziert wurde, sie ist entweder Glu oder Asp, wurde gefunden, daß das Protein mit 40 K ab der zweiten Aminosäure die Aminosäuresequenz Asp-Val-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Ser-Asp- besitzt.
Die Primärsequenz des Proteins mit 35 K war, obwohl die N-terminale Aminosäure nicht identifiziert worden war, sie ist entweder Gly oder Asp, ab der zweiten Aminosäure Glu-Arg-Leu-Lys-His-Leu- Ile-Val.

Industrielle Anwendungsmöglichkeit

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das eine inhibierende Wirkung auf entzündungserregende PLA&sub2; aufweist. Das Protein kann demgemäß als ein entzündungshemmendes oder immunsupressives Mittel zum Behandeln einer Reihe entzündlicher Krankheiten oder allergischer Krankheiten, wie rheumatischer Arthritis, Lupus erythematosus oder Bronchialasthma, verwendet werden, indem die entzündungserregende PLA&sub2;, welche die Freisetzung von Entzündungsmediatoren aus Arachidonsäure beschleunigt, inhibiert wird, wenn eine Entzündung auftritt.

Claims

1. Protein mit inhibierender Wirkung auf die entzündungserregende Phospholipase A&sub2;, wobei das Protein aus der Bauchfellhöhle einer Ratte nach Verabreichung eines Glucocorticoids erhältlich ist und das Protein ein Molekulargewicht von etwa 40 K und eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist: terminale Aminosäure