JPS6256429A - フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フオスフオリパーゼＡ２　　（ＰＬＡ２　）
阻害活性を有する蛋白に関する。更に詳しくは、グルコ
コルチコイド投与により、細胞から誘導され、ＰＬＡｚ
阻害活性を有する蛋白に関するものである。

グルココルチコイドは、慢性関節リウマチ、全身性エリ
テマトーデス、気管支喘息等の種々の炎症性、アレルギ
ー性疾患の治療薬として、今日最も有効性の高い医薬品
のひとつとして幅広く用いられている。その作用メカニ
ズムは、グルココルチコイドの抗炎症作用、抗浮腫作用
、免疫抑制作用などに由来している。その中で抗炎症効
果の発現は、炎症関連物資であるロイコトリエンやプロ
スタグランジンの前駆体であるアラキドン酸の、遊離を
抑制することに関連する。即ち、アラキドン酸をリン脂
質から直接切り出す酵素、ＰＬＡ２を阻害するとの説が
近年Ｆ　ｌｏｗｅｒ　　（Ｎ　ａｔｕｒｅ　２７８　：
４５６１９７９）により提唱されている。グルココルチ
コイドの作用機序については、細胞内に入ったグルココ
ルチコイドは最初に胞体内受容体と結合し、この複合体
が核内へと輸送されて、遺伝子発現の制御が働き、最終
的には蛋白合成の誘導が行なわれる。事実、鶴藤ら（Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２８０：　４０８１９７９）は、蛋白合
成阻害剤シクロヘキシミドとｍＲＮＡ合成阻害剤アクチ
ノマイシンＤとが、セロトニンにより惹起される足蹴浮
腫（実験的炎症動物モデル）に対する、グルココルチコ
イドの治療効果を抑制することを示した。これらの結果
より、グルココルチコイドの抗炎症作用は、ＰＬＡ２阻
害活性のある蛋白の合成誘導を介して行なわれると考え
られる。

グルココルチコイドにより合成が誘導され、１ｎＶｉｔ
ｒＯでＰＬＡ２活性を阻害し、ｉｎ　　ｖｉｖｏでプロ
スタグランジン生成を抑制するような蛋白を分離する試
みは、これまで数グループよりなされているが、今だ、
単一に蛋白を精製し、蛋白化学的にその一次構造の一部
、あるいはアミノ酸組成等を明確にし、なおかつ、ＰＬ
Ａ２阻害活性を明確に示した蛋白を単離した成功例はな
い。

本発明者らはステロイドにより細胞から誘導され、更に
特異的にＰＬＡ２活性を阻害する蛋白の゛分離・精製を
試み、本蛋白を通じてステロイド剤の作用メカニズムを
追求する目的で鋭意研究した結果、本発明に到達した。

即ち、本発明は、ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白であり
、特にデキサメサゾン等のグルココルチコイド投与によ
り細胞から誘導されるという性質を有するものであり、
特に好ましくは、構成アミノ酸組成（モル％）が下記の
ものである。アスパラギン酸（ＡＳＩ））　１２．３．
　トレオニン（Ｔ　ｈｒ）５．１．セリン（５ｅｒ）　
　４，８．グルタミンＩＩ（ＧＩＬＩ）２０．３．グリ
シン（Ｇ　Ｉｙ）　　４．３．アラニン（Ａｌａ）６．
５．バリン（Ｖａｌ）　　６．８．　１／　２−シスチ
ン（１／　２−ＣＶＳ）　　０．４．メチオニン（Ｍｅ
ｔ）３．２．イソロイシン（ＩＬｅ　）　　２．１．　
ロイシン（Ｌ　ｅｕ）　１１．９．チロシン（Ｔ　ｙｒ
）　　１．４．フェニルアラニン（Ｐ　ｈｅ）　　３．
４．リジン（Ｌ　ｙｓ）　　７．７．ヒスチジン（Ｈｉ
ｓ）　　１，６．アルギニン（Ａｒｇ）３．８．プロリ
ン（Ｐｒｏ）　　４，０．　トリプトファン（Ｔ　ｒｐ
）　　０，４゜また、本発明の蛋白は、ラット起源のも
のは、ゲル濾過法による分子量が約４万３千で、ラット
腹腔液より精製され、未変性条件下及びＳＯＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動で共に単一のバンドを与える。

これは、水溶性であり、低いＰＨ及び有機溶媒存在下で
失活せず、酸性蛋白であり、かつＰＬＡ２　ｔ！ＩＩ害
活性全活性る蛋白である。

ここで、本発明に到る経緯の１つである評価系について
述べる。従来フオスフオリバーゼ活性を評価づ゛る際は
、その酵素であるフオスフオリパーゼはその基質（リン
脂質）の水溶液中での状態により、反応が大きく左右さ
れることが知られている。即ち、分散したモノマー基質
には弱い活性しか示さないが、ミセル状基質には高い活
性を示す。

従って基質であるフオスファチジルコリンはミセル状態
を作る必要がある。これらの目的の為に、細々の界面活
性剤を反応系に添加することが知られている。添加する
界面活性剤は、目的に応じて用いられるが、カチオン系
界面活性剤であるＣＴＡＢ（Ｃｅｒｙ１℃ｒｉｍｅｔｈ
ｙｌａｉｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）は、０．０１
％という低濃度でＰＬＡ２活性を阻害し、またアニオン
系界面活性剤ＳＤＳ　（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ　
５ｕｌｆａｔｅ　）は、０．０１％では阻害しないが、
０．１％では約２６％はど活性を阻害し、更に非イオン
系界面活性剤では、反応系に０．１％添加してもＰＬ△
２活性は阻害されないことが知られてイル（Ｔ、　Ｔｅ
ｒａｍｏｔｏ　Ｃ１ａｌ　１９８３．Ｊ　、　Ｂ　ｉｏ
ｃｈｃｍ。

９３　１３５３）　、。

一方、Ｐ　Ｌ　Ａ　２を特異的に阻害する蛋白を得るた
めには、フオスフオリバーゼとの親和性を旧なわない反
応系の確立が必要であり、過剰の界面活性剤の添加はＰ
Ｌ△２と目的蛋白との親和性を損ない、目的とする蛋白
を評価する系としては不適である。

以上のような状況から、本発明者らは、基質のミセル状
態を維持し、なおかつＰＬＡ２と目的蛋白との親和性を
損なわない反応系く非イオン系界面活性剤と適当量のＣ
ａイオンの系）を確立し、それを応用することによって
本発明に到達した。

次に本発明の蛋白の、単離精製方法について述べる。本
蛋白は、ステロイドの投与により生体内で合成される蛋
白であることから、その誘導法としては、直接ステロイ
ドを生体内に投与し、本蛋白を誘導してもよいが、正常
細胞あるいは株化細胞を用いて、ｉｎ　ＶｉｔｒＯで直
接にステロイドと接触させて誘導さける方法もある。−
例としては、クツ１−背部皮下にデキリメ＋１シンを投
与し、１．５時間優にドライアイスにて炭酸ガス下窒息
死させ、腹腔をリン酸、ヘパリン及びＰＭＳＦ （Ｐ　ｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｐｈｏｎｙｌＮ
ｕｏｒｉｄｅ　）加、生理食塩水にてよく洗浄機、洗浄
液を回収する。この洗浄液を酢酸アンモニウム緩衝液に
てよく透析復、凍結乾燥する。１匹のラットより、約２
０ＩＩ１ｇのラット腹腔洗浄凍結標品を１ワる。この標
品を出発材料として、例えば、以下の如き方法で本蛋白
は精製単離される。ＰＬΔ２阻害活性を指標にして、例
えば、アニオン交換高速流体クロマトグラフィーに標品
をアプライし、各画分のＰＬＡ２阻害活性を測定し、活
性ピークを得た。活性ピークはＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動から多数の蛋白の混合物であるから、更にこ
の活性画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーにか
けた。ここに於いても活性画分は得られたが、まだ単一
蛋白には精製されておらず、更に逆相高速液体クロマト
グラフィーによる精製を行なった。蛋白ピークは３本ｉ
りられたが、第３番目のピークに活性が認められ、その
分画のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動から、これは
単一蛋白よりなることがわかった。

約２００ｆｆ１９の標品から、ＰＬＡ２阻害蛋白を約５
０μ９単離しＩζ。本蛋白の性質は、分子量約４３，０
００゜水溶性であり低いＰ　ｌ−（及び有機溶媒存在下
でも失活せず、酸性蛋白であり、Ｎ端から２６番目まで
のアミノ酸が、ＮＨ２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−８ｅ
ｒ　−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−−△ＳＤ　−Ｔ　ｙｒ−Ｐ　ｈｅ
　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−８ｅｒ−Ａ
　Ｓｎ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　１ａ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　ｌｕ　−
Ａ　１ａ−Ｖａｌから成る蛋白であった。以上、ステロ
イド誘導ラット腹腔液から、本発明のＰＬＡ２阻害活性
を有する蛋白を、精製・単離する方法を中心に説明した
が、本発明において、蛋白の起源や蛋白の製法は何ら限
定されるものではない。ヒトや他の動物から抽出・精″
￥Ｊ！ｌｉ離してもよく、また遺伝子工学的手法で微生
物あるいは動物Ｉｌｌ胞から製造してもよい。ＰＬ△２
阻害活性を有する蛋白である限り、本発明に含まれるも
のである。

目的蛋白のＮ端より２６個のアミノ酸配列をもとに、こ
れら配列とホモロジーを持つ既知蛋白との検索を行なっ
た。その結果、ラットアポリボプロティンＡ　ＩＶとＮ
端より２６番目まではすべて一致した。ラットアポリボ
プロティンＡ　ＩＶは、そのｐｏｔｙｍｏｒｏｈｉｓｍ
が報告されており、また文献によればその分子量は４６
，０００である。またラットアポリボプロティンＡ　Ｉ
Ｖに、ＰＬＡｚ阻害活性があるという報告はない。

本発明において用いられた各欅試験、測定法は以下の通
りである。

（１１Ｐ　Ｌ　Ａ　２阻害活性の測定法標準の反応系は
１０μ囚のＰ　ＬＡ２ （ｐ　ｏｒｃｉｎｅｐａｎｅｒｅａｔｉｃ　：シグマ社
製、絶対量として１０１００ｎに、２６０μ文の試料あ
るいは対照（２０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−１５ｈ＋Ｍ　Ｎ　
ａ　Ｃｆ）−）及び１０μすの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　
Ｘ１００及び１０μ文の１５０ｉＭＣａＣ旦２を混合後
、３７℃にて　１．５時間、軽く振盪しながらインキュ
ベートする。その後ｊＯμ旦の［２−”Ｃ］ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｔｎｅ　　（最終濃度２００７
７Ｍ−１０μｃｉ）を加え、３７℃で５分間インキュベ
ートする。その後Ｄｏｌｅ　’　ｓ　　ｒｅａａｅｎｔ
で反応を停止させ、”　Ｃ−ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ　
ａｃｉｄをペブタンにて抽出後、液体シンチレーション
カウンターにて測定する。

［２］ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動各種クロマト
的手法により分画した試料の一部を取り、１％ＳＯ８，
２−メルカプトエタノール存在下、１００℃で１０分間
加熱した。次いで、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
に試料をアプライし、１５ｎ＋　Ａで１．５時間電気泳
動した。泳動終了後、バイオランド社製シルバースティ
ンキットで染色した。

（３）蛋白−次構造の決定法 気相プロティンシーケンサ−（アプライド・バイオシス
テム社、＋＋ｏｄｅ１４７０　Ａ　）を用いて決定した
。

即ち、単離精製されたサンプル１０μ９を、３０μ文の
１％ＳＤＳに溶解し、上記気相プロティンシーケンサ−
にアプライした。自動的にエドマン分解されたＰＴＨ（
フェニルチオヒダントイン）アミノ酸誘導体は、その後
、高速液体りＯマドグラフィーにて各アミノ酸として分
析された。

（４）蛋白−次構造解析法 目的蛋白の一次構造決定とともに、その配列のホモロジ
ー配列検索を行ない、既知の蛋白との異同を調べた。−
次構造のデータベースとしては、（財）蛋白質研究奨励
金ペプチド研究所が収録したものを三井情報開発株式会
社がデータベース化したもの（商標ｐｒｉｎａｓ）を用
いた。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ （１）ラット　　°′　　Ｐ　ｏの　ｊＳＤ系ラッう８
週令退会５０匹を用いて、デキサメサゾンを１．５Ｒｇ
／４ｆｆとなるように背部皮下に注射し、１．５時間後
にドライアイスにて炭酸ガス下窒素死させ、腹腔を１匹
当り１２ｍの２υ／ｄのヘパリン及び５０μＭのＰ　Ｍ
　Ｓ　Ｆ　（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌＤｈｏｎ
ｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ　）加生理食塩水にてよく洗浄後
、洗浄液約５００ｄを回収した。この洗浄液を、４０倍
量の１０ｍ　Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ＰＨ７，４）
にて、２回透析後、凍結乾燥し、約９４０１Ｒｇのラッ
ト腹腔洗浄凍結乾燥標品を得た。

氷冷下、２００ＩＩｔｇのラット腹腔洗浄凍結乾燥標品
を５０１ｄの２０ｍ　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣｆ　（ＰＨ８
，０）に溶解させ、０，４５　μｍ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ
　Ｆ　１ｌｔｅｒにて濾過した後に、直接５ｐ８７５０
ＨＰ　Ｌ　Ｃ用ポンプでカラム（ＴＳＫ　　Ｇｅｔ　　
ＤＥＡＥ−５ＰＷ）にアプライした。吸着した試料は、
流速２．５ｄ／１ｌｌｉｎで、第１図破線で示すＮａ　
ｃｕ直接濃度勾配にて溶出させた。第１図の実線は、Ｕ
Ｖ２８０ａｓ＋に於ける吸収で蛋白ｍを表わしたもので
あるが、ＰＬＡ２阻害活性は大きな蛋白ピークの前の両
分（Ｎ　Ｏ，３５，・Ｎｏ、３６）に強力な活性を検出
した（第１図の斜線部）。Ｎｏ、３５．　Ｎｏ、３６の
画分ＳＯＳ電気泳動の結果、多くの分子量の量なる蛋白
（１８，４３，５０，６０Ｋ　）の混合物であった。

（３）゛ル濾゛カラムを用いた高速液体クロマト−フィ
ーによる　的蛋白の分離　製 更にＰＬＡ２阻害分画（ｐ４　ｏ、３５．　Ｎ　ｏ、３
６）を精製するために、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　−１０を
用いて濃縮した。

約０．７ａｌ！に濃縮された分画を、２０ｍ　ＭＴｒｉ
Ｓ　−１５Ｏｎ＋Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　（Ｐ　Ｈ７，４）
で平衡化した。ゲル濾過カラム（ＴＳＫ　　Ｇｅｌ　　
Ｇ　３００　　ＳＷ）にアプライし、流速０．２ｄ／ｍ
ｉｎで溶出させた。結果を第２図に示すが、強力なＰＬ
Ａ２阻害活性が画分（Ｎｏ、８〜Ｎｏ、１０）に検出さ
れたく第２図の斜線部）。これら画分を５Ｏ８ｆｌ気泳
動で解析したところ、１８に蛋白は存在しなかったが、
まだ４３に、６０に等を含む両分であった。

ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーにて、ＰＬＡ２阻
害活性を検出した画分（Ｎ　ｏ、１０＞　　１．０戒を
、０．１％ＴＦＡで平衡化したカラム（Ｂ　１Ｏ−Ｒａ
ｄ）　　Ｈｉ　−Ｐｏｒｅ　　ＲＰ−３０４）にアプラ
イし、流速１．０ＩＪｌ／Ｗｉｎにて、第３図破線で示
寸アセトニトリル直線濃度勾配で溶出させた。ＵＶ２８
０ｎｍで吸収を検出した両分について、２０ｆｆｉ　Ｍ
Ｔｒｉｓ　−１５０ｍＭＮａ　Ｃ！１（ＰＨ８，０＞に
対して透析した後、ＰＬＡ２阻害活性を測定した。その
結果、第３図に示すＮ　Ｏ，３２画分に、顕著なＰＬＡ
２阻害活性を検出した。次いで、同画分についてＳＤＳ
電気泳動を行なったところ、この蛋白は単一で分子量が
約４３，０００であることが判明した。

実施例２ 実施例］と同様にＳＤ系ラうト８週退会雄、　５０匹を
用いて、デキサメザゾンにより誘導をかけたラット腹腔
洗浄液凍結乾燥標品を出発材料にして、異なる精製法に
より目的蛋白を単離精製した例を示す。

水冷下、約２００ＩｒＩｇの出発材料を５０ｄの２０１
　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＵに溶解゛させ、０．４５１部ｍＭ
ｅｍｂｒａｎｅ　　ｒ；＋ｔｅｒにて濾過後に、直接５
ｐ８７５０ＨＰＬＣ用ポンプでアニオンイオン交換）−
Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム（ＴＳＫ　　ｇｅｌ　　ＤＥＡＥ
−５ＰＷ）にアプライした。第４図破線で示すＮａ　ｃ
ｐ直線濃度勾配にて溶出させ、ＰＬＡ２阻害活性画分を
得た（第４図の斜線部）。更に同様のカラムでリクロマ
トグラフイーを行ない、第５図破線に示すＮａＣＪＩｉ
１ｍ度勾配にて精製全勾配った。第５図に示すように、
ＰＬＡ２阻害活性（第５図の斜線部）は溶出時間４１〜
４４分の位置と、５６〜５９分の位置に検出された。後
部の活性ピークを、更に逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけた。即ち、０．１％ＴＦＡで平衡化したカラム
（３ｉｏ　−Ｒａｄ　　Ｈｉ　−ｐｏｒｅ　　ＲＰ　３
０４）にアプライし、流速１．Ｏｄ／ｍｉｎにて、第６
図の破線に示すアセトントリル濃度勾配にて溶出させた
。第６図に示すように、３本の蛋白ピークが得れたが、
主ピークにＰＬＡ２阻害活性が得られたく第６図の斜線
部）。

活性画分を更に精製するため、アセトニトリルの濃度勾
配を変えた逆相高速液体クロマトグラフィーを行なった
。その結果、第７図に示す１本の活性ピークを得た。更
にＳＤＳ電気泳動の結果、このピークは分子量約４３，
０００の単一蛋白より成ることが判明した。

実施例３ 実施例１及び実施例２で単離精製したサンプルの、蛋白
−次構造の１部を決定した。その結果、両蛋白とも同一
のＮ末端からのアミノ酸配列を示した。その一部Ｎ末端
よりのアミノ酸配列は、以下の通りであった。即ち、Ｎ
　Ｈ２Ｇ　ｌｕ　−Ｖａｌ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　
−Ａ　ｓｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　Ｉａ　−Ａ
　ｓｎ　−Ｖ　ａｌ−ｖ　ｅｔ−Ｔ　ｒｐ−Ａ　ＳＤ　
−Ｔ　ｙｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ−１
ｅｕ−５ｅｒ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　Ｖ
Ｓ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ−Ｖ　ａｌであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アニオン交換日ＰＬＣを用いた目的蛋白の溶
出パターンを示す。 第２図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶出パ
ターンを示す。 第３図は、逆相１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いた目的蛋白の
溶出パターンを示す。 第４図は、アニオン交換ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶
出パターンを示す。 第５図は、アニス“ン交換ＨＰＬＣを用い、低いＮａ　
Ｃｕｌｔｌ度勾配により目的蛋白を溶出させたパターン
を示す。 第６図は、逆相）−（ＰＬＯを用いた目的蛋白の溶出パ
ターンを示す。 第７図は、逆相ＨＰＬＣを用い更に低いアセトニトリル
濃度勾配にて、目的蛋白を溶出させたパターンを示す。 ＋１収（Ｚ５Ｏｎ−ｙｒｌ） Ｋ　’ＩＬ　（２６０ｎｍ） 尺αＣ１ＣＭ） ＣＨ３ＣＮ　（ｙ６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フオスフオリパーゼＡ＿２阻害活性を有する蛋白。 ２、グルココルチコイド投与により細胞から誘導される
   という性質を有し、フオスフオリパーゼＡ＿２阻害活性
   を有する特許請求の範囲第１項記載の蛋白。 ３、構成アミノ酸の組成（モル％）がアスパラギン酸（
   Ａｓｐ）１２．３、トレオニン（Ｔｈｒ）５．１、セリ
   ン（Ｓｅｒ）４．８、グルタミン酸（Ｇｌｕ）２０．３
   、グリシン（Ｇｌｙ）４．３、アラニン（Ａｌａ）６．
   ５、バリン（Ｖａｌ）６．８、１／２−シスチン（１／
   ２−Ｃｙｓ）０．４、メチオニン（Ｍｅｔ）３．２、イ
   ソロイシン （ＩＬｅ）２．１、ロイシン（Ｌｅｕ）１１．９、チロ
   シン（Ｔｙｒ）１．４、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）３
   ．４、リジン（Ｌｙｓ）７．７、ヒスチジン（Ｈｉｓ）
   １．６、アルギニン（Ａｒｇ）３．８、プロリン（Ｐｒ
   ｏ）４．０、トリプトファン（Ｔｒｐ）０．４である特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載の蛋白。 ４、グルココルチコイド投与後、ラット腹腔より精製さ
   れ、分子量が約４３，０００で、Ｎ端より２６個までの
   アミノ酸がＮＨ＿２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
   −Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
   Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇ
   ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌより成るフオスフオリパー
   ゼＡ＿２阻害活性を有する特許請求の範囲第２項又は第
   ３項記載の蛋白。