JP3067212B2 - 心臓の機能不全を治療する薬剤 - Google Patents
心臓の機能不全を治療する薬剤Info
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Description
【０００１】
【本発明の技術的背景】ジギタリス、ジゴキシン、ウワ
バイン及び関連物質は植物から誘導された強心性配糖体
である。強心性配糖体の主な薬理学的な性質は、投薬量
依存的な方式で心筋の収縮の力を増加する能力である
（正筋変力性効果-positive inotropic effect）。直接
的正筋変力性効果の最も可能性ある説明は、強心性配糖
体が膜−結合性Ｎａ+、Ｋ+−活性化アデノシントリホス
ファターゼ（Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ）を阻害する能
力であるとされる。The Pharmacological Basis of The
rapeutics （グッドマン[Goodman]及びジルマン[Gilma
n]編） 732頁(1980)所載のB.F.ホフマン[Hoffman]及び
J.T.ビッガー・ジュニア[Bigger、Jr]による“Digitali
s and Allied Cardiac Glycoside"参照。この酵素によ
るアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）の加水分解がナトリウム
・カリウムポンプのエネルギーを与える。
バイン及び関連物質は植物から誘導された強心性配糖体
である。強心性配糖体の主な薬理学的な性質は、投薬量
依存的な方式で心筋の収縮の力を増加する能力である
（正筋変力性効果-positive inotropic effect）。直接
的正筋変力性効果の最も可能性ある説明は、強心性配糖
体が膜−結合性Ｎａ+、Ｋ+−活性化アデノシントリホス
ファターゼ（Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ）を阻害する能
力であるとされる。The Pharmacological Basis of The
rapeutics （グッドマン[Goodman]及びジルマン[Gilma
n]編） 732頁(1980)所載のB.F.ホフマン[Hoffman]及び
J.T.ビッガー・ジュニア[Bigger、Jr]による“Digitali
s and Allied Cardiac Glycoside"参照。この酵素によ
るアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）の加水分解がナトリウム
・カリウムポンプのエネルギーを与える。
【０００２】Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの内因的調節に
ついてはあまり知られていない。カテコールアミン（J.
W.フィリス[Phillis]、Cell,Tissue and Organ Culture
s in Neurobiology、93-97頁(1978)；B.A.ホロヴィッツ
[Horwitz]、Fed. Proc.、38:2170-2176頁(1979)、甲状せん
ホルモン（T.J.スミス[Smith]及びI.S.エーデルマン[Ed
elman]、Fed. Proc.、38:2150-2153頁(1979)）、アルドス
テロン(B.C.ロジャー[ Rossier]等、Science、12:483-4
87(1987))、リノール酸及びリノレイン酸（J.N.ビダー
ド[Bidard]等、Biochem. Biophys. Acta、769;247(198
4);M.タムラ[Tamura]等、J. Biol．Chem. 、260:9672(19
85)；及びバナジウム（L.C.カントレー・ジュニア[Cantl
ey、Jr]等、J．Biol. Chem. 、243:7361-7368(1978)）は
総て酵素活性に及ぼす直接又は間接的な効果に結び付い
ている。
ついてはあまり知られていない。カテコールアミン（J.
W.フィリス[Phillis]、Cell,Tissue and Organ Culture
s in Neurobiology、93-97頁(1978)；B.A.ホロヴィッツ
[Horwitz]、Fed. Proc.、38:2170-2176頁(1979)、甲状せん
ホルモン（T.J.スミス[Smith]及びI.S.エーデルマン[Ed
elman]、Fed. Proc.、38:2150-2153頁(1979)）、アルドス
テロン(B.C.ロジャー[ Rossier]等、Science、12:483-4
87(1987))、リノール酸及びリノレイン酸（J.N.ビダー
ド[Bidard]等、Biochem. Biophys. Acta、769;247(198
4);M.タムラ[Tamura]等、J. Biol．Chem. 、260:9672(19
85)；及びバナジウム（L.C.カントレー・ジュニア[Cantl
ey、Jr]等、J．Biol. Chem. 、243:7361-7368(1978)）は
総て酵素活性に及ぼす直接又は間接的な効果に結び付い
ている。
【０００３】多くの研究者は阻害剤が上昇している状況
で、ジギトキシンの放射免疫測定法を用いて血漿中の免
疫反応性を測定することにより、ジギタリス又はウワバ
インに類似しているが哺乳類起源の形質膜Ｎａ+、Ｋ+−
ＡＴＰアーゼの特異的内因性阻害剤を単離することを試
みた。キリングスミュラー［Killingsmueller]等はＮａ
+−負荷された正常人の被験者の尿中にジギタリス様の
免疫反応性を見出した（キリングスミュラー等、Klin.
Wochenschr.、60:1249-1253(1982)）。S.W.グレーブス(G
raves)等は尿毒症の血漿中で類似の観察を行った（S.W.
グレーブス等、Ann. Intern.Med.、99:604-608(1983)）。
で、ジギトキシンの放射免疫測定法を用いて血漿中の免
疫反応性を測定することにより、ジギタリス又はウワバ
インに類似しているが哺乳類起源の形質膜Ｎａ+、Ｋ+−
ＡＴＰアーゼの特異的内因性阻害剤を単離することを試
みた。キリングスミュラー［Killingsmueller]等はＮａ
+−負荷された正常人の被験者の尿中にジギタリス様の
免疫反応性を見出した（キリングスミュラー等、Klin.
Wochenschr.、60:1249-1253(1982)）。S.W.グレーブス(G
raves)等は尿毒症の血漿中で類似の観察を行った（S.W.
グレーブス等、Ann. Intern.Med.、99:604-608(1983)）。
【０００４】血漿、尿又は組織のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰア
ーゼ阻害剤の明確な構造は未知である（ The Na+,K+-Pu
mp ,Part B:Cellular Aspects;J.C.スコウ[Skou]等編、
G.T.ホーパート・ジュニア[Haupert、Jr]、297-320(198
8)）。更に各種の候補化合物も最も大きな生化学的な細
目点で強心性配糖体ジギタリス及びウワバインとの幾分
かの差があることを特徴としているので、これらの物質
が構造又は機能のいずれかの点で真に“ジギタリス様”
である度合は議論の分かれる所である。（C.T.カリリ[C
arilli]等、J. Biol. Chem. 、260:129(1985);M.クラボス
[Crabos]等、Eur. j. Biochem.、162:129(1987);M.タム
ラ、Biochem.、27:4244-4253(1988)）。
ーゼ阻害剤の明確な構造は未知である（ The Na+,K+-Pu
mp ,Part B:Cellular Aspects;J.C.スコウ[Skou]等編、
G.T.ホーパート・ジュニア[Haupert、Jr]、297-320(198
8)）。更に各種の候補化合物も最も大きな生化学的な細
目点で強心性配糖体ジギタリス及びウワバインとの幾分
かの差があることを特徴としているので、これらの物質
が構造又は機能のいずれかの点で真に“ジギタリス様”
である度合は議論の分かれる所である。（C.T.カリリ[C
arilli]等、J. Biol. Chem. 、260:129(1985);M.クラボス
[Crabos]等、Eur. j. Biochem.、162:129(1987);M.タム
ラ、Biochem.、27:4244-4253(1988)）。
【０００５】例えばグレーブスにより単離されたジギタ
リス様因子（ＤＬＦ）は抗−ジギトキシン抗体と交差反
応する（S.W.グレーブス米国特許第４，７８０，３１４
号）。しかしＤＬＦは内因性調節体の場合期待されるよ
うな、生理学的阻害剤であることは示されていない。生
理学的という意味は、酵素に極めて高い結合親和性を有
する阻害剤である；可逆的に結合して阻害する；膜Ｎａ
+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼに高い特異性を有する；及び適当
な刺激に応答することである。それらの正筋変力性効果
のために、強心性配糖体（例えばジギタリス及びウワバ
イン）は心不全の治療上の価値が無類である。強心性配
糖体はうっ血性の心不全の患者の血行の適正を増大する
ために、及び心房細動及び粗動の存在において心室速度
を遅くするために治療上最も多く使用されている。
リス様因子（ＤＬＦ）は抗−ジギトキシン抗体と交差反
応する（S.W.グレーブス米国特許第４，７８０，３１４
号）。しかしＤＬＦは内因性調節体の場合期待されるよ
うな、生理学的阻害剤であることは示されていない。生
理学的という意味は、酵素に極めて高い結合親和性を有
する阻害剤である；可逆的に結合して阻害する；膜Ｎａ
+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼに高い特異性を有する；及び適当
な刺激に応答することである。それらの正筋変力性効果
のために、強心性配糖体（例えばジギタリス及びウワバ
イン）は心不全の治療上の価値が無類である。強心性配
糖体はうっ血性の心不全の患者の血行の適正を増大する
ために、及び心房細動及び粗動の存在において心室速度
を遅くするために治療上最も多く使用されている。
【０００６】しかし強心性配糖体は治療指数が狭く、そ
れらの使用はしばしば激しく又は致死的であり得る毒性
効果を伴っている。患者に対する危険の点からいえば、
最も重要な毒性効果は心臓に起こる効果（例えば心臓調
律の異常性及び房室伝導の障害）である。胃腸障害、神
経学的効果、食欲不審、視力障害、吐き気及び嘔吐は他
の共通した強心性配糖体の反応である。
れらの使用はしばしば激しく又は致死的であり得る毒性
効果を伴っている。患者に対する危険の点からいえば、
最も重要な毒性効果は心臓に起こる効果（例えば心臓調
律の異常性及び房室伝導の障害）である。胃腸障害、神
経学的効果、食欲不審、視力障害、吐き気及び嘔吐は他
の共通した強心性配糖体の反応である。
【０００７】
【本発明の総括】本発明は視床下部阻害因子(Hypothala
mic Inhibitory Factor)（ＨＩＦ）が心筋細胞に正筋変
力性効果を有するという本発明出願者の発見に関する。
即ち本発明は一つの具体化においては、正筋変力性効果
を生じる量のＨＩＦを哺乳類宿主に投与することにより
該宿主に正筋変力性効果を生じる方法を含んで成る。
mic Inhibitory Factor)（ＨＩＦ）が心筋細胞に正筋変
力性効果を有するという本発明出願者の発見に関する。
即ち本発明は一つの具体化においては、正筋変力性効果
を生じる量のＨＩＦを哺乳類宿主に投与することにより
該宿主に正筋変力性効果を生じる方法を含んで成る。
【０００８】ＨＩＦは強心性配糖体と同じ毒性プロフィ
ルを呈さない。従ってＨＩＦを用いる心臓機能不全の治
療は患者に対する毒性の危険を少なくして遂行できる。
ルを呈さない。従ってＨＩＦを用いる心臓機能不全の治
療は患者に対する毒性の危険を少なくして遂行できる。
【０００９】本発明は更に強心性配糖体中毒、浮腫的疾
患及び低血圧の処置に治療的に投与できるという発見に
関する。又ＨＩＦは高血圧の予防の特異的な治療法を開
発するために使用できる。
患及び低血圧の処置に治療的に投与できるという発見に
関する。又ＨＩＦは高血圧の予防の特異的な治療法を開
発するために使用できる。
【００１０】
【本発明の詳述】生理学的Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ調
節体が牛の視床下部から単離され、視床下部阻害因子
（ＨＩＦ）と名付けられた（G.T.ホーパート・ジュニア
等、Am. J.Physiol.、 247、F919(1984)）。ＨＩＦを単
離する方法は実施例Ｉに詳細に記載されている。
節体が牛の視床下部から単離され、視床下部阻害因子
（ＨＩＦ）と名付けられた（G.T.ホーパート・ジュニア
等、Am. J.Physiol.、 247、F919(1984)）。ＨＩＦを単
離する方法は実施例Ｉに詳細に記載されている。
【００１１】ＨＩＦはＮａ+ポンプの生理学的調節体と
して必須な幾つかの生化学的基準を満足している(G.T.
ホーパート・ジュニア及びJ.M.サンチョ[Sancho]、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、76:4658-4660(1979)）。ＨＩＦ
は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼを可逆的に阻害
し、高い親和性（Ｋi＋１.４ｎｍ）を有する（G.T.ホー
パート・ジュニア等、Am. J. Physiol.、 247、F919(198
4)）。更にその効果は特異的である（C.T.カリリ等、J.
Biol. Chem.、260:129(1985)）．精製された視床下部阻
害因子（ＨＩＦ）は上記のように心臓の筋肉細胞（即ち
筋細胞）に正筋変力性効果を有することが新規に見出さ
れた。“正筋変力性効果”という用語は、細胞の収縮性
が投薬量に依存する方式で高められることを意味する。
して必須な幾つかの生化学的基準を満足している(G.T.
ホーパート・ジュニア及びJ.M.サンチョ[Sancho]、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、76:4658-4660(1979)）。ＨＩＦ
は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼを可逆的に阻害
し、高い親和性（Ｋi＋１.４ｎｍ）を有する（G.T.ホー
パート・ジュニア等、Am. J. Physiol.、 247、F919(198
4)）。更にその効果は特異的である（C.T.カリリ等、J.
Biol. Chem.、260:129(1985)）．精製された視床下部阻
害因子（ＨＩＦ）は上記のように心臓の筋肉細胞（即ち
筋細胞）に正筋変力性効果を有することが新規に見出さ
れた。“正筋変力性効果”という用語は、細胞の収縮性
が投薬量に依存する方式で高められることを意味する。
【００１２】ＨＩＦの正筋変力性効果を生じる量は心臓
機能不全（例えばうっ血性心臓不全、発作性心房性頻
脈、心房細動及び粗動）を処置するため“哺乳類宿主”
（例えばヒト）に投与することができる。投与は腸内的
（即ち経口的）又は非経口的（例えば、静脈、皮下又は
筋肉内注射を経由して）であることができる。更にＨＩ
Ｆは強心性配糖体と同じ毒性プロフィルを呈さないか
ら、ＨＩＦを用いる心臓機能不全の治療は患者に対する
毒性の危険を少なくして遂行することができる。
機能不全（例えばうっ血性心臓不全、発作性心房性頻
脈、心房細動及び粗動）を処置するため“哺乳類宿主”
（例えばヒト）に投与することができる。投与は腸内的
（即ち経口的）又は非経口的（例えば、静脈、皮下又は
筋肉内注射を経由して）であることができる。更にＨＩ
Ｆは強心性配糖体と同じ毒性プロフィルを呈さないか
ら、ＨＩＦを用いる心臓機能不全の治療は患者に対する
毒性の危険を少なくして遂行することができる。
【００１３】図１は５×１０-5Ｍウワバインと対照して
１単位／ｍｌのＨＩＦに暴露された心筋細胞に及ぼす正
筋変力性効果；及び１×１０-6Ｍウワバインに暴露され
た心筋細胞に及ぼす毒性効果に対照してＨＩＦの効果を
示すグラフである。１単位のＨＩＦは３７℃における標
準的分析条件下で、１μｇの高度に精製されたＮａ+、
Ｋ+−ＡＴＰアーゼを５０％だけ阻害するのに必要な量
である。これは約０.７５ｐモルＨＩＦ（約１５ｎＭ Ｈ
ＩＦに等しい、５０マイクロリットル中１単位）である
と見積もられた。（G.T.ホーパート・ジュニア等、Am.
J. Physiol.、 247、F919(1984)）。収縮性実験のプロト
コルは実施例ＩＩＩＣに記載されている。
１単位／ｍｌのＨＩＦに暴露された心筋細胞に及ぼす正
筋変力性効果；及び１×１０-6Ｍウワバインに暴露され
た心筋細胞に及ぼす毒性効果に対照してＨＩＦの効果を
示すグラフである。１単位のＨＩＦは３７℃における標
準的分析条件下で、１μｇの高度に精製されたＮａ+、
Ｋ+−ＡＴＰアーゼを５０％だけ阻害するのに必要な量
である。これは約０.７５ｐモルＨＩＦ（約１５ｎＭ Ｈ
ＩＦに等しい、５０マイクロリットル中１単位）である
と見積もられた。（G.T.ホーパート・ジュニア等、Am.
J. Physiol.、 247、F919(1984)）。収縮性実験のプロト
コルは実施例ＩＩＩＣに記載されている。
【００１４】一般に収縮の振幅（即ち正筋変力性の度
合）は位相差ビデオ運動検出装置を用いて心収縮性運動
の振幅（ＡＳＭ）として単一の脈動する心筋細胞中で測
定された。同じ検出装置がＡＳＭ中の減少、最大弛緩
（ＭＲ）位置の変化、及び拍動頻度の増大として立証さ
れる毒性を測定するために使用された。
合）は位相差ビデオ運動検出装置を用いて心収縮性運動
の振幅（ＡＳＭ）として単一の脈動する心筋細胞中で測
定された。同じ検出装置がＡＳＭ中の減少、最大弛緩
（ＭＲ）位置の変化、及び拍動頻度の増大として立証さ
れる毒性を測定するために使用された。
【００１５】図１Ｂはこれらの細胞に最高に筋変力性的
であるが非毒性の投薬量である、５×１０-7Ｍウワバイ
ンが心収縮性運動の振幅（ＡＳＭ）を４１％だけ増大す
るが、対照期間（図１Ａ）における同じ細胞に比較して
拍動頻度の減少を起こしたことを示している。“治療範
囲”であるが無毒効果を示す、最大弛緩（ＭＲ）位置の
変化はなかった。
であるが非毒性の投薬量である、５×１０-7Ｍウワバイ
ンが心収縮性運動の振幅（ＡＳＭ）を４１％だけ増大す
るが、対照期間（図１Ａ）における同じ細胞に比較して
拍動頻度の減少を起こしたことを示している。“治療範
囲”であるが無毒効果を示す、最大弛緩（ＭＲ）位置の
変化はなかった。
【００１６】図１Ｃは１μＭ濃度のウワバインは、総て
これらの高度な投薬量が収縮する心筋細胞に“毒性範
囲”の効果を及ぼすことを示す、ＡＳＭの減少、ＭＲの
位置の上昇、及び拍動頻度の増大を起こすことを示して
いる。
これらの高度な投薬量が収縮する心筋細胞に“毒性範
囲”の効果を及ぼすことを示す、ＡＳＭの減少、ＭＲの
位置の上昇、及び拍動頻度の増大を起こすことを示して
いる。
【００１７】図１Ｅは１単位／mlのＨＩＦが対照（図
Ｄ）に比較して、拍動頻度の減少及びＭＲ位置の不変と
共に、３７±３％のＡＳＭの減少を起こすことを示して
いる。従って１単位／mlは治療範囲内であるが、毒性効
果を呈しない。
Ｄ）に比較して、拍動頻度の減少及びＭＲ位置の不変と
共に、３７±３％のＡＳＭの減少を起こすことを示して
いる。従って１単位／mlは治療範囲内であるが、毒性効
果を呈しない。
【００１８】図１Ｆは同じ細胞がＨＩＦを含まない緩衝
液で灌流される際に、１分間の“濯ぎ出し”による結果
を示す。ＡＳＭ及び拍動頻度は対照水準に戻り、ＨＩＦ
により起こされた正筋変力性効果の迅速な可逆性を示し
ている。
液で灌流される際に、１分間の“濯ぎ出し”による結果
を示す。ＡＳＭ及び拍動頻度は対照水準に戻り、ＨＩＦ
により起こされた正筋変力性効果の迅速な可逆性を示し
ている。
【００１９】ウワバイン処理された新生児ラットの心筋
細胞が対照水準よりも高い収縮性に戻るためには５分間
の濯ぎ出し期間が必要であるから、ＨＩＦの効果はウワ
バインよりも一層容易に可逆的である（K.ワーダン[Wer
dan]等、Biochem. Pharmacol.、33:1873-1886(1984)）。
細胞が対照水準よりも高い収縮性に戻るためには５分間
の濯ぎ出し期間が必要であるから、ＨＩＦの効果はウワ
バインよりも一層容易に可逆的である（K.ワーダン[Wer
dan]等、Biochem. Pharmacol.、33:1873-1886(1984)）。
【００２０】心臓機能不全を処置するために使用する以
外に、ＨＩＦの製薬学的組成物は重篤な又は生命の危険
のある強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療するため
に投与（例えば腸内的に又は非経口的に）できる。現在
強心性配糖体中毒は一般に患者にカリウム又は抗−不整
脈薬剤を投与するか、又はとりわけ特異的強心性配糖体
製剤に対する抗体フラグメントを投与することにより治
療されている。重篤な毒性を持った患者は一般の治療方
法には反応がない。更に抗体フラグメントを用いる治療
は血行中の強心性配糖体を中和するが、抗体は心臓組織
に結合した強心性配糖体には有効ではない。更に、抗体
は蛋白質であるから、静脈的に投与され、及びアレルギ
ー反応を起こすことがある。
外に、ＨＩＦの製薬学的組成物は重篤な又は生命の危険
のある強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療するため
に投与（例えば腸内的に又は非経口的に）できる。現在
強心性配糖体中毒は一般に患者にカリウム又は抗−不整
脈薬剤を投与するか、又はとりわけ特異的強心性配糖体
製剤に対する抗体フラグメントを投与することにより治
療されている。重篤な毒性を持った患者は一般の治療方
法には反応がない。更に抗体フラグメントを用いる治療
は血行中の強心性配糖体を中和するが、抗体は心臓組織
に結合した強心性配糖体には有効ではない。更に、抗体
は蛋白質であるから、静脈的に投与され、及びアレルギ
ー反応を起こすことがある。
【００２１】対照的に、ＨＩＦは循環する強心性配糖体
をＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結合から遮断するのみ
ならず、恐らく強心性配糖体結合部位を互いに競合又は
妨害することによって、以前に結合した強心性配糖体を
Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼから溶離又は“追い出す”。
“追い出し”実験は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアー
ゼがリポゾームに再構成される分析方式(B.M.アナー[An
ner]及びM.ムースマイヤー[Moosmayer]、Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.、129:102-108(1985)）を用いて行われ
た。この実験の詳細なプロトコルは実施例ＩＶに記載さ
れている。一般に、機能的なＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ
分子を含むリポゾームは、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ上
の結合部位に結合している特異的なウワバインの測定が
可能である3Ｈ−ウワバインと共にインキュベートされ
た。リポゾーム−Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ−ウワバイ
ン複合体は次いで２５℃で１０分間各種の薬量のＨＩＦ
に暴露された。結合した3Ｈ−ウワバインは投薬量に依
存する方式で、２.５マイクロリットルのリポゾーム当
たり０.５単位のＨＩＦ濃度で、結合したウワバインの
完全溶離まで、ＨＩＦによりＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ
から溶離された。
をＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結合から遮断するのみ
ならず、恐らく強心性配糖体結合部位を互いに競合又は
妨害することによって、以前に結合した強心性配糖体を
Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼから溶離又は“追い出す”。
“追い出し”実験は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアー
ゼがリポゾームに再構成される分析方式(B.M.アナー[An
ner]及びM.ムースマイヤー[Moosmayer]、Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.、129:102-108(1985)）を用いて行われ
た。この実験の詳細なプロトコルは実施例ＩＶに記載さ
れている。一般に、機能的なＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ
分子を含むリポゾームは、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ上
の結合部位に結合している特異的なウワバインの測定が
可能である3Ｈ−ウワバインと共にインキュベートされ
た。リポゾーム−Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ−ウワバイ
ン複合体は次いで２５℃で１０分間各種の薬量のＨＩＦ
に暴露された。結合した3Ｈ−ウワバインは投薬量に依
存する方式で、２.５マイクロリットルのリポゾーム当
たり０.５単位のＨＩＦ濃度で、結合したウワバインの
完全溶離まで、ＨＩＦによりＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ
から溶離された。
【００２２】かようにＨＩＦはジギタリス化合物のＮａ
+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結合を防ぐことができるだけ
でなく、これらの実験で示されたように、既にＮａ+、
Ｋ+−ＡＴＰアーゼに結合した強心性配糖体に置き換わ
ることができる。従ってＨＩＦを用いる強心性配糖体中
毒の治療は心臓に対する毒性効果を迅速に逆転させる高
度に特異的な治療法として役立つことができよう。更
に、非ペプチドであるから、ＨＩＦの経口投与が可能で
ある。
+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結合を防ぐことができるだけ
でなく、これらの実験で示されたように、既にＮａ+、
Ｋ+−ＡＴＰアーゼに結合した強心性配糖体に置き換わ
ることができる。従ってＨＩＦを用いる強心性配糖体中
毒の治療は心臓に対する毒性効果を迅速に逆転させる高
度に特異的な治療法として役立つことができよう。更
に、非ペプチドであるから、ＨＩＦの経口投与が可能で
ある。
【００２３】ＨＩＦは又血圧異常性の治療の際に投与
（腸内的に又は非経口的に）することができる。研究の
結果によれば、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの内因性循環
阻害体の過剰は、或種の又は多くの患者において、本質
的な低血圧の原因となることが示されている。（H.E.デ
ワードナー[DeWardener]及びG.W.マクグレガー[MacGreg
or]、Kidney Int.、18:1-9(1980)）。恐らくＮａ+、Ｋ+−
ＡＴＰアーゼへの阻害剤の結合の結果である細胞内カル
シウムイオン濃度の上昇が血管の収縮及び低血圧を生じ
るのであろう。（M.P.ブローシュテーン[Blaustein]、A
m. J. Physiol.、232:C165-C173(1977)）。
（腸内的に又は非経口的に）することができる。研究の
結果によれば、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの内因性循環
阻害体の過剰は、或種の又は多くの患者において、本質
的な低血圧の原因となることが示されている。（H.E.デ
ワードナー[DeWardener]及びG.W.マクグレガー[MacGreg
or]、Kidney Int.、18:1-9(1980)）。恐らくＮａ+、Ｋ+−
ＡＴＰアーゼへの阻害剤の結合の結果である細胞内カル
シウムイオン濃度の上昇が血管の収縮及び低血圧を生じ
るのであろう。（M.P.ブローシュテーン[Blaustein]、A
m. J. Physiol.、232:C165-C173(1977)）。
【００２４】ＨＩＦの血管収縮性を測定するために実験
が行われた。これらの実験のプロトコルは実施例Ｖに詳
細に記載されている。一般にスプラーグ−ドーレー(Spr
ague-Dawley)ラットに麻酔をかけ、腹部大動脈が外科的
に取り出される。２ｍｍの血管輪が力変換器に取り付け
られ、及び緩衝液中に浸けられ、及び張力は１.５ｇに
調節された。組織の生存力が記録され、血管収縮応答が
塩化カリウム及びノルエピネフリンのような既知の血管
収縮剤を用いて校正された。こうして調製された血管が
次いでＨＩＦの薬量を変えて試験された。
が行われた。これらの実験のプロトコルは実施例Ｖに詳
細に記載されている。一般にスプラーグ−ドーレー(Spr
ague-Dawley)ラットに麻酔をかけ、腹部大動脈が外科的
に取り出される。２ｍｍの血管輪が力変換器に取り付け
られ、及び緩衝液中に浸けられ、及び張力は１.５ｇに
調節された。組織の生存力が記録され、血管収縮応答が
塩化カリウム及びノルエピネフリンのような既知の血管
収縮剤を用いて校正された。こうして調製された血管が
次いでＨＩＦの薬量を変えて試験された。
【００２５】ＨＩＦは効能のある可逆的な血管収縮を生
じ、これらの応答は薬量に依存的であった。血管はＨＩ
Ｆに暴露後も完全に生存したままであり、毒性効果の不
存在を証明した。最大の血管収縮応答は標準として使用
される既知の血管収縮剤物質により生じるものと類似し
ていた。
じ、これらの応答は薬量に依存的であった。血管はＨＩ
Ｆに暴露後も完全に生存したままであり、毒性効果の不
存在を証明した。最大の血管収縮応答は標準として使用
される既知の血管収縮剤物質により生じるものと類似し
ていた。
【００２６】低血圧、異常に低い血圧は、心臓の出口が
細いこと、不適切な血管収縮、又は両者が同時に起こる
ことにより生じることがある。ＨＩＦは心臓細胞の収縮
の強度を増し、及び血管の収縮を促進することの両者を
示したから、その治療的量の投与は低血圧の効果的な治
療となるであろう。
細いこと、不適切な血管収縮、又は両者が同時に起こる
ことにより生じることがある。ＨＩＦは心臓細胞の収縮
の強度を増し、及び血管の収縮を促進することの両者を
示したから、その治療的量の投与は低血圧の効果的な治
療となるであろう。
【００２７】ＨＩＦは又過剰な血管収縮及びその結果と
しての高血圧を予防する特異な治療法を開発するために
使用できる。かような治療法は下記の事項を含むが、そ
れらに限定されない：（１）受動免疫のためにＨＩＦへ
の抗体を投与すること；（２）高血圧に対して能動免疫
のためにＨＩＦの免疫原体を投与すること；及び（３）
天然ＨＩＦの血管細胞Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結
合及び作用を防止又は変調(modulate)することができる
ＨＩＦの類似体を投与すること。
しての高血圧を予防する特異な治療法を開発するために
使用できる。かような治療法は下記の事項を含むが、そ
れらに限定されない：（１）受動免疫のためにＨＩＦへ
の抗体を投与すること；（２）高血圧に対して能動免疫
のためにＨＩＦの免疫原体を投与すること；及び（３）
天然ＨＩＦの血管細胞Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼへの結
合及び作用を防止又は変調(modulate)することができる
ＨＩＦの類似体を投与すること。
【００２８】更に腎臓管状細胞のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰア
ーゼ活性を効果的に阻害し、及びナトリウムの分泌を促
進することによって、ＨＩＦの製薬学的な組成物は、う
っ血性心不全、肝硬変、及びネフローゼ性症候群として
共通の臨床的状態に罹患している患者の腎臓による過剰
な塩及び水の分泌を促進する天然の利尿剤として使用す
ることができる。ＨＩＦがＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼに
対して有する特異的阻害剤効果のために、ＨＩＦを用い
る利尿治療法は、現在使用されている利尿薬により共通
的に生じる副作用（例えば、不能症、発疹、血液脂質の
異常）を伴わずに遂行することができる。
ーゼ活性を効果的に阻害し、及びナトリウムの分泌を促
進することによって、ＨＩＦの製薬学的な組成物は、う
っ血性心不全、肝硬変、及びネフローゼ性症候群として
共通の臨床的状態に罹患している患者の腎臓による過剰
な塩及び水の分泌を促進する天然の利尿剤として使用す
ることができる。ＨＩＦがＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼに
対して有する特異的阻害剤効果のために、ＨＩＦを用い
る利尿治療法は、現在使用されている利尿薬により共通
的に生じる副作用（例えば、不能症、発疹、血液脂質の
異常）を伴わずに遂行することができる。
【００２９】本発明は更に下記の実施例により説明され
るが、それがいずれかの方式によっても本発明を限定す
るものと解釈すべきではない。
るが、それがいずれかの方式によっても本発明を限定す
るものと解釈すべきではない。
【００３０】
【実施例】Ｉ． ＨＩＦの製造法 Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤は前記（C.T.カリリ
等、J. Biol. Chem. 、260:1027-1031(1985)）のように牛
の視床下部から製造された。新しく集められ、直ちにド
ライアイス上で凍結された視床下部を解凍し、ホモジネ
ートとしてメタノール：水（４：１、容量：容量）で抽
出した。フラッシュ蒸発によってメタノールを除去し、
残った水性相を石油エーテル及びクロロホルムで抽出す
ることにより脂質を取り出した。ＨＩＦの始めの分離は
親油性ゲルクロマトグラフィー（C.T.カリリ等、J. Bio
l. Chem. 、260:1027-1031(1985)）を用いて行った。そ
れ以上の精製は逐次陽イオン及び陰イオン交換クロマト
グラフィーを用いて遂行された。親油性ゲルクロマトグ
ラフィーからの約１００単位のＨＩＦが１０mlの二回蒸
留した水（ｄｄＨ2Ｏ）中に溶解され、１０mlのプロト
ン形のスルホン酸陽イオン交換樹脂（アマーシャム[Ame
rsham]、ＩＲ１２０）を含む小さいカラムにかけられ、
及び１ml／分でｄｄＨ2Ｏで溶離した。溶離液を集め、
凍結乾燥し、残渣を１mlのｄｄＨ2Ｏ中に溶出し、ヒド
ロキシル形の１.５mlのＱＡＥセファデックス（ファル
マシア[Pharmacia]）を含むカラムにかけた。カラムを
順次１ベッド(bed)容量のｄｄＨ2Ｏ、及び１ベッド容量
の１０ｍＭ酢酸で溶離した（後者はＨＩＦ上のカルボキ
シル基（C.T.カリリ等、J. Biol. Chem.、260:1027-103
1(1985)との相互作用の結果、陰イオン交換体に吸着さ
れたＨＩＦを回収するために使用された）。酢酸を凍結
乾燥により除去し、残渣を再分散し、ＨＩＦ活性度の濃
度を測定するために、酵素共役活性測定法（coupled-en
zyme assay)（G.T.ホーパート等、Am. J. Physiol.、247:
F919-924(1984)）及びヒト赤血球86Ｒｂ+摂取分析（C.
T.カリリ等、J. Biol. Chem.、260:1027-1031(1985)）
により、特異的Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害活性（Ｈ
ＩＦ）を分析した。陽イオン交換段階は少量のガンマア
ミノ安息香酸、セリン、スレオニン及びグルタミン酸
を、陰イオン交換段階は痕跡量の乳酸塩を充分に除去し
た。これら総ては親油性ゲルクロマトグラフィーによる
活性画分の質量スペクトル分析により検出されていたも
のである。ＨＩＦの回収はイオン交換段階により定量的
であった。上記の処理後のＨＩＦは、適切なバイオアッ
セーにおいて干渉することが示されている、バナジン酸
塩（発光分光分析）、ＮＨ4イオン（還元的アミノ化、
シグマ[Sigma]キット１７０−Ａ）を含まず、遊離の脂
肪酸及びリゾ燐脂質（ガスクロマトグラフィー−質量ス
ペクトル分析）を含んでいない。
等、J. Biol. Chem. 、260:1027-1031(1985)）のように牛
の視床下部から製造された。新しく集められ、直ちにド
ライアイス上で凍結された視床下部を解凍し、ホモジネ
ートとしてメタノール：水（４：１、容量：容量）で抽
出した。フラッシュ蒸発によってメタノールを除去し、
残った水性相を石油エーテル及びクロロホルムで抽出す
ることにより脂質を取り出した。ＨＩＦの始めの分離は
親油性ゲルクロマトグラフィー（C.T.カリリ等、J. Bio
l. Chem. 、260:1027-1031(1985)）を用いて行った。そ
れ以上の精製は逐次陽イオン及び陰イオン交換クロマト
グラフィーを用いて遂行された。親油性ゲルクロマトグ
ラフィーからの約１００単位のＨＩＦが１０mlの二回蒸
留した水（ｄｄＨ2Ｏ）中に溶解され、１０mlのプロト
ン形のスルホン酸陽イオン交換樹脂（アマーシャム[Ame
rsham]、ＩＲ１２０）を含む小さいカラムにかけられ、
及び１ml／分でｄｄＨ2Ｏで溶離した。溶離液を集め、
凍結乾燥し、残渣を１mlのｄｄＨ2Ｏ中に溶出し、ヒド
ロキシル形の１.５mlのＱＡＥセファデックス（ファル
マシア[Pharmacia]）を含むカラムにかけた。カラムを
順次１ベッド(bed)容量のｄｄＨ2Ｏ、及び１ベッド容量
の１０ｍＭ酢酸で溶離した（後者はＨＩＦ上のカルボキ
シル基（C.T.カリリ等、J. Biol. Chem.、260:1027-103
1(1985)との相互作用の結果、陰イオン交換体に吸着さ
れたＨＩＦを回収するために使用された）。酢酸を凍結
乾燥により除去し、残渣を再分散し、ＨＩＦ活性度の濃
度を測定するために、酵素共役活性測定法（coupled-en
zyme assay)（G.T.ホーパート等、Am. J. Physiol.、247:
F919-924(1984)）及びヒト赤血球86Ｒｂ+摂取分析（C.
T.カリリ等、J. Biol. Chem.、260:1027-1031(1985)）
により、特異的Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害活性（Ｈ
ＩＦ）を分析した。陽イオン交換段階は少量のガンマア
ミノ安息香酸、セリン、スレオニン及びグルタミン酸
を、陰イオン交換段階は痕跡量の乳酸塩を充分に除去し
た。これら総ては親油性ゲルクロマトグラフィーによる
活性画分の質量スペクトル分析により検出されていたも
のである。ＨＩＦの回収はイオン交換段階により定量的
であった。上記の処理後のＨＩＦは、適切なバイオアッ
セーにおいて干渉することが示されている、バナジン酸
塩（発光分光分析）、ＮＨ4イオン（還元的アミノ化、
シグマ[Sigma]キット１７０−Ａ）を含まず、遊離の脂
肪酸及びリゾ燐脂質（ガスクロマトグラフィー−質量ス
ペクトル分析）を含んでいない。
【００３１】ＩＩ． 心臓細胞の調製 心筋細胞は、従来記載（S. [Yagev]等、In Vitro、20:89
3-898(1984)）されたＣａ2+及びＭｇ2+を含まないハン
クス(Hanks)緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の一連のトリプ
シン処理により、生後１日のスプラーグ−ドーレーラッ
トの心臓の心室フラグメントから単離された。トリプシ
ン処理された細胞は２０％の血清及び抗生物質を含むハ
ムＦ１０培地中にデカンテーションし、１００ｒｐｍで
１０分間遠心した。胎児牛血清及び１０％の馬血清を
０.１％のペニシリン−ストレプトマイシンと共に含む
ハムＦ１０培地中に細胞ペレットを再分散し、５×１０
5細胞／mlの濃度まで希釈した。細胞ゾル性の遊離のカ
ルシウム濃度(［Ｃａ2+]ｉ）を測定するために細胞を長
方形のカバーガラス（１３×３０mm）上に置き、細胞の
収縮性の測定のために円形カバーガラス（１２mm）上に
置き、両方のカバーガラスをペトリ皿の中に入れた。86
Ｒｂ+摂取を測定するために、細胞をペトリ皿中に入れ
た（１−１.５±１０6細胞／３５mm皿）。総ての培養基
を湿潤した５％ＣＯ2、９５％空気中で３７℃において
インキュベートした。概算で８０％の細胞が自発的な同
期的収縮を呈する、融合した単一細胞層が三日間に亙っ
て発現し、その期間に実験が行われた。
3-898(1984)）されたＣａ2+及びＭｇ2+を含まないハン
クス(Hanks)緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の一連のトリプ
シン処理により、生後１日のスプラーグ−ドーレーラッ
トの心臓の心室フラグメントから単離された。トリプシ
ン処理された細胞は２０％の血清及び抗生物質を含むハ
ムＦ１０培地中にデカンテーションし、１００ｒｐｍで
１０分間遠心した。胎児牛血清及び１０％の馬血清を
０.１％のペニシリン−ストレプトマイシンと共に含む
ハムＦ１０培地中に細胞ペレットを再分散し、５×１０
5細胞／mlの濃度まで希釈した。細胞ゾル性の遊離のカ
ルシウム濃度(［Ｃａ2+]ｉ）を測定するために細胞を長
方形のカバーガラス（１３×３０mm）上に置き、細胞の
収縮性の測定のために円形カバーガラス（１２mm）上に
置き、両方のカバーガラスをペトリ皿の中に入れた。86
Ｒｂ+摂取を測定するために、細胞をペトリ皿中に入れ
た（１−１.５±１０6細胞／３５mm皿）。総ての培養基
を湿潤した５％ＣＯ2、９５％空気中で３７℃において
インキュベートした。概算で８０％の細胞が自発的な同
期的収縮を呈する、融合した単一細胞層が三日間に亙っ
て発現し、その期間に実験が行われた。
【００３２】ＩＩＩ． 心筋細胞に及ぼすＨＩＦの生理
学的効果 Ａ． 86Ｒｂ+流入測定 パネット等（R. Panet等、J. Memb. Biol.、70:165-169(1
982)）の方法に従い、５ｍＭのウワバインの不存在及び
存在下において観察された86Ｒｂ+摂取の差として、培
養された心筋細胞中でＮａ+ポンプ活性が評価された。
結合の飽和を確実とするために、１０分間のフラックス
(flux)を行う86Ｒｂ+の添加の前に、２０分間ＨＩＦ
（２単位／ml）又はウワバイン（５mＭ）又は両者と共
に、心筋細胞を予備インキュベートした。単一心筋細胞
層をＨＥＰＥＳ緩衝溶液（最終濃度、mＭ；ＮａＣl １
５０、ＲｂＣl ５、ＨＥＰＥＳ−トリス １０（ｐＨ
７.０）、ＣａＣl2 １、ＭｇＣl2 ５、グルコース
１０）で洗浄し、３７℃に予備加温され、２μＣｉの86
ＲｂＣlを含む同じ溶液０.５mlで覆うことにより摂取が
開始された。インキュベーションを１０分間まで継続し
（同位体の直線的摂取の期間）（M.[Heller]等、Bioche
m. Biophys. Acta、939:595-602(1988)）、及び摂取は
３mlの氷冷ＭｇＣｌ2（１２５ｍＭ）で二回、及び５ml
の氷冷ＮａＣl（１６５mＭ）で二回洗浄することに続い
て反応混合物の吸引により終了した。細胞を０.１％
（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウムを含む０.１Ｎ
のＮａＯＨの０.６mlで溶解し、放射能をインスタゲル
(Instagel)（パッカード[Packerd]）シンチレーション
媒体中で計数した。
学的効果 Ａ． 86Ｒｂ+流入測定 パネット等（R. Panet等、J. Memb. Biol.、70:165-169(1
982)）の方法に従い、５ｍＭのウワバインの不存在及び
存在下において観察された86Ｒｂ+摂取の差として、培
養された心筋細胞中でＮａ+ポンプ活性が評価された。
結合の飽和を確実とするために、１０分間のフラックス
(flux)を行う86Ｒｂ+の添加の前に、２０分間ＨＩＦ
（２単位／ml）又はウワバイン（５mＭ）又は両者と共
に、心筋細胞を予備インキュベートした。単一心筋細胞
層をＨＥＰＥＳ緩衝溶液（最終濃度、mＭ；ＮａＣl １
５０、ＲｂＣl ５、ＨＥＰＥＳ−トリス １０（ｐＨ
７.０）、ＣａＣl2 １、ＭｇＣl2 ５、グルコース
１０）で洗浄し、３７℃に予備加温され、２μＣｉの86
ＲｂＣlを含む同じ溶液０.５mlで覆うことにより摂取が
開始された。インキュベーションを１０分間まで継続し
（同位体の直線的摂取の期間）（M.[Heller]等、Bioche
m. Biophys. Acta、939:595-602(1988)）、及び摂取は
３mlの氷冷ＭｇＣｌ2（１２５ｍＭ）で二回、及び５ml
の氷冷ＮａＣl（１６５mＭ）で二回洗浄することに続い
て反応混合物の吸引により終了した。細胞を０.１％
（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウムを含む０.１Ｎ
のＮａＯＨの０.６mlで溶解し、放射能をインスタゲル
(Instagel)（パッカード[Packerd]）シンチレーション
媒体中で計数した。
【００３３】図２は新生児ラットの心筋細胞による全86
Ｒｂ+摂取に及ぼすＨＩＦ（２単位／ml）又はウワバイ
ン（５mＭ）又は両者の阻害効果を図示している。Ｎａ+
ポンプ仲介摂取（６００ｎモル／蛋白質mg／１０分間）
は合計摂取、及び５mＭウワバインの存在における差と
して計算される。
Ｒｂ+摂取に及ぼすＨＩＦ（２単位／ml）又はウワバイ
ン（５mＭ）又は両者の阻害効果を図示している。Ｎａ+
ポンプ仲介摂取（６００ｎモル／蛋白質mg／１０分間）
は合計摂取、及び５mＭウワバインの存在における差と
して計算される。
【００３４】ウワバイン（５mＭ）は８１０ｎモル／蛋
白質mgの対照水準から２１０ｎモル／mg（７４％）まで
摂取を減少させたが、同時にＨＩＦ（２単位／ml）は対
照水準から３７７ｎモル／mg（５４％）まで摂取を減少
させた。ウワバイン・プラス・ＨＩＦの組み合わせは相
加的ではなく、従来ヒトの赤血球（C.T.カリリ等、J. B
iol. Chem.、260:1027-1031(1985)）及び腎臓管状細胞
（H.F.カンチエロ[Cantiello]等、Am. J. Physiol.、255:
F574-F580(1988)）について示されたように、ＨＩＦの
阻害効果はＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼによるＫ+の輸送
に特異的であることを示している。こうしてＨＩＦ（２
単位／ml）は心筋細胞中におけるウワバイン−感受性Ｋ
+輸送を７４％だけ阻害した。
白質mgの対照水準から２１０ｎモル／mg（７４％）まで
摂取を減少させたが、同時にＨＩＦ（２単位／ml）は対
照水準から３７７ｎモル／mg（５４％）まで摂取を減少
させた。ウワバイン・プラス・ＨＩＦの組み合わせは相
加的ではなく、従来ヒトの赤血球（C.T.カリリ等、J. B
iol. Chem.、260:1027-1031(1985)）及び腎臓管状細胞
（H.F.カンチエロ[Cantiello]等、Am. J. Physiol.、255:
F574-F580(1988)）について示されたように、ＨＩＦの
阻害効果はＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼによるＫ+の輸送
に特異的であることを示している。こうしてＨＩＦ（２
単位／ml）は心筋細胞中におけるウワバイン−感受性Ｋ
+輸送を７４％だけ阻害した。
【００３５】ＨＩＦ阻害の濃度依存性は０.５単位／m
l、０.８単位／ml、１単位／ml、２単位／ml及び４単位
／ml濃度で２０分間ＨＩＦで細胞を予備インキュベート
することにより測定された。86ＲｂＣｌ（２マイクロＣ
ｉ／ウエル）が次いでフラックスを行うために添加され
た。
l、０.８単位／ml、１単位／ml、２単位／ml及び４単位
／ml濃度で２０分間ＨＩＦで細胞を予備インキュベート
することにより測定された。86ＲｂＣｌ（２マイクロＣ
ｉ／ウエル）が次いでフラックスを行うために添加され
た。
【００３６】図３は新生児ラットの心筋細胞におけるウ
ワバイン−感受性Ｒｂ+摂取のＨＩＦ阻害の濃度依存性
（Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の特異的尺度）を示
す。各値は各濃度におけるｎ＝４測定値の平均±ＳＥＭ
である。ＨＩＦ−仲介Ｎａ+ポンプ阻害は薬量に依存的
であり、心筋細胞が阻害剤に暴露される時間的量に関係
する。新生児ラットの心筋細胞におけるＮａ+ポンプ活
性の９０％がＨＩＦの最大投薬量（４単位／ml）により
阻害される。図３（挿入図版）は心筋細胞がＨＩＦ（２
単位／ml）に暴露される時間の関数として活性Ｋ+輸送
の阻害を図示している。最大阻害効果（即ち、心筋細胞
のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の約９０％の阻害）に
はＨＩＦと共に２０−３０分間の予備インキュベーショ
ンを必要とする。
ワバイン−感受性Ｒｂ+摂取のＨＩＦ阻害の濃度依存性
（Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の特異的尺度）を示
す。各値は各濃度におけるｎ＝４測定値の平均±ＳＥＭ
である。ＨＩＦ−仲介Ｎａ+ポンプ阻害は薬量に依存的
であり、心筋細胞が阻害剤に暴露される時間的量に関係
する。新生児ラットの心筋細胞におけるＮａ+ポンプ活
性の９０％がＨＩＦの最大投薬量（４単位／ml）により
阻害される。図３（挿入図版）は心筋細胞がＨＩＦ（２
単位／ml）に暴露される時間の関数として活性Ｋ+輸送
の阻害を図示している。最大阻害効果（即ち、心筋細胞
のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の約９０％の阻害）に
はＨＩＦと共に２０−３０分間の予備インキュベーショ
ンを必要とする。
【００３７】しかし、重要なポンプ阻害は又短時間のＨ
ＩＦへの暴露後にも生じた。新生児ラットの心筋細胞に
おけるポンプ阻害のＩＤ50は、約０.５単位／mlのＨＩ
Ｆ濃度で生じる。これは培養されたブタの腎臓管状細胞
よりも約３０倍少なく（H.F.カンチエロ等、Am. J. Phys
iol.、255:F574-F580(1988)）、従って新生児ラットの心
筋細胞はＨＩＦに対し比較的高い親和性を有することを
示唆している。
ＩＦへの暴露後にも生じた。新生児ラットの心筋細胞に
おけるポンプ阻害のＩＤ50は、約０.５単位／mlのＨＩ
Ｆ濃度で生じる。これは培養されたブタの腎臓管状細胞
よりも約３０倍少なく（H.F.カンチエロ等、Am. J. Phys
iol.、255:F574-F580(1988)）、従って新生児ラットの心
筋細胞はＨＩＦに対し比較的高い親和性を有することを
示唆している。
【００３８】Ｂ． 細胞ゾル性遊離Ｃａ2+（［Ｃ
ａ2+］）の測定 ［Ｃａ2+］ｉの変化は蛍光試験薬、、フラ−２（G. グ
リンキエビッチ[Grynkiewicz]等、J. Biol Chem.、260:34
40-3450(1985)）を用いて検出された。心筋細胞を付着
させた長方形のカバーガラスを緩衝塩溶液（下記物質を
各ｍＭ単位で含むＢＳＳ：ＮａＣl １４０、ＫＣl
５、ＣａＣl2 １、ＭｇＣl2 １、グルコース １０、
Ｎａ2ＨＰＯ4 １、ＨＥＰＥＳ−トリス １０（ｐＨ
７.４））中に入れ、それに５μＭのフラ−２／ＡＭを
添加し、湿潤した５％ＣＯ2−９５％空気中で３７℃に
おいて１時間インキュベートした。更に混入培地を添加
し、フラ−２／ＡＭの加水分解を完結するために１５分
間インキュベーションを継続した。細胞を洗浄し、更に
３０分間ＢＳＳ中でインキュベートした。添加された心
筋細胞を有するカバーガラスを、２mlのＢＳＳ及び指示
されたような各種の添加量のＨＩＦ又はウワバインを含
む恒温（３７℃）キュベット中に挿入した。ＰＴＩデル
タスキャン(DeltaScan)１蛍光分光光度計を用いて蛍光
を連続的に記録した。二重の励起波長が３４０nm及び３
８０nmの間を迅速（６０Ｈｚ）に交番し、発光波長は５
０５nmである。［Ｃａ2+］ｉの値は下記式： ［Ｃａ2+］i＝ＫdＢ（Ｒ−Ｒmin）／（Ｒmax−Ｒ） 上式中、Ｋdは２２５nmである、を用いいて比Ｒ＝Ｆ340
／Ｆ380から計算された。Ｒmin及びＲmaxはジギトニン
を用いて［Ｃａ2+］iを周囲［Ｃａ2+］と平衡させ（Ｒm
ax）、及びＭｎＣｌ2（０.１mＭ）及びＥＧＴＡ（１m
Ｍ）を添加する（Ｒmin）別な実験で測定された。バッ
クグラウンドの自己蛍光は未充填のセル中で測定され、
総ての測定値から差し引かれた。
ａ2+］）の測定 ［Ｃａ2+］ｉの変化は蛍光試験薬、、フラ−２（G. グ
リンキエビッチ[Grynkiewicz]等、J. Biol Chem.、260:34
40-3450(1985)）を用いて検出された。心筋細胞を付着
させた長方形のカバーガラスを緩衝塩溶液（下記物質を
各ｍＭ単位で含むＢＳＳ：ＮａＣl １４０、ＫＣl
５、ＣａＣl2 １、ＭｇＣl2 １、グルコース １０、
Ｎａ2ＨＰＯ4 １、ＨＥＰＥＳ−トリス １０（ｐＨ
７.４））中に入れ、それに５μＭのフラ−２／ＡＭを
添加し、湿潤した５％ＣＯ2−９５％空気中で３７℃に
おいて１時間インキュベートした。更に混入培地を添加
し、フラ−２／ＡＭの加水分解を完結するために１５分
間インキュベーションを継続した。細胞を洗浄し、更に
３０分間ＢＳＳ中でインキュベートした。添加された心
筋細胞を有するカバーガラスを、２mlのＢＳＳ及び指示
されたような各種の添加量のＨＩＦ又はウワバインを含
む恒温（３７℃）キュベット中に挿入した。ＰＴＩデル
タスキャン(DeltaScan)１蛍光分光光度計を用いて蛍光
を連続的に記録した。二重の励起波長が３４０nm及び３
８０nmの間を迅速（６０Ｈｚ）に交番し、発光波長は５
０５nmである。［Ｃａ2+］ｉの値は下記式： ［Ｃａ2+］i＝ＫdＢ（Ｒ−Ｒmin）／（Ｒmax−Ｒ） 上式中、Ｋdは２２５nmである、を用いいて比Ｒ＝Ｆ340
／Ｆ380から計算された。Ｒmin及びＲmaxはジギトニン
を用いて［Ｃａ2+］iを周囲［Ｃａ2+］と平衡させ（Ｒm
ax）、及びＭｎＣｌ2（０.１mＭ）及びＥＧＴＡ（１m
Ｍ）を添加する（Ｒmin）別な実験で測定された。バッ
クグラウンドの自己蛍光は未充填のセル中で測定され、
総ての測定値から差し引かれた。
【００３９】図４は培養された心筋細胞中の細胞ゾルの
遊離カルシウムイオン（［Ｃａ2+］i）含量に及ぼすＨ
ＩＦ（１単位／ml）の効果を示す。緩衝塩溶液（ＢＳ
Ｓ）中で培養されたフラ−２充填心筋細胞の蛍光を連続
的に記録した。対照値（１３８ｎＭ）はＨＩＦの添加
（矢印）に先立つＢＳＳ中の細胞に対するものである。
ＨＩＦに暴露後３０分間（２５０nm）及び６０分間（４
３２nm）後に示された。細胞ゾルの遊離のＣａ2+濃度
は、３０分間及び６０分間ＨＩＦへの暴露後、ぞれぞれ
１３８ｎＭの基線から２５０ｎＭ及び４３２ｎＭに増加
した。
遊離カルシウムイオン（［Ｃａ2+］i）含量に及ぼすＨ
ＩＦ（１単位／ml）の効果を示す。緩衝塩溶液（ＢＳ
Ｓ）中で培養されたフラ−２充填心筋細胞の蛍光を連続
的に記録した。対照値（１３８ｎＭ）はＨＩＦの添加
（矢印）に先立つＢＳＳ中の細胞に対するものである。
ＨＩＦに暴露後３０分間（２５０nm）及び６０分間（４
３２nm）後に示された。細胞ゾルの遊離のＣａ2+濃度
は、３０分間及び６０分間ＨＩＦへの暴露後、ぞれぞれ
１３８ｎＭの基線から２５０ｎＭ及び４３２ｎＭに増加
した。
【００４０】ＨＩＦにより生起した［Ｃａ2+］ｉの変化
の開始は１５分内に起こり６０分までに新しい定常状態
の濃度に達し、この水準に少なくとも２時間安定に留ま
る。
の開始は１５分内に起こり６０分までに新しい定常状態
の濃度に達し、この水準に少なくとも２時間安定に留ま
る。
【００４１】強心性配糖体の毒性及びこれらの薬剤に特
徴的な狭い治療指数の背後にある生化学的事象は、緊張
性の(tonic)ポンプ阻害と関連した持続的に高い細胞内
Ｎａ+に派生的な、過剰な細胞内の遊離のＣａ2+が中心
的な役割を有すると仮定されている（R.W.チェン[Tsie
n]及びB.U.カーペンター[Carpenter]、Fed. Am. Soc. Ex
p. Biol.、37:2127-2131(1978))が、完全には理解されて
いない。
徴的な狭い治療指数の背後にある生化学的事象は、緊張
性の(tonic)ポンプ阻害と関連した持続的に高い細胞内
Ｎａ+に派生的な、過剰な細胞内の遊離のＣａ2+が中心
的な役割を有すると仮定されている（R.W.チェン[Tsie
n]及びB.U.カーペンター[Carpenter]、Fed. Am. Soc. Ex
p. Biol.、37:2127-2131(1978))が、完全には理解されて
いない。
【００４２】表１はＨＩＦの各種の投薬量により誘発さ
れた定常的な［Ｃａ2+］iの増加を示す。投薬量−応答
関係は、０.５単位／mlＨＩＦを用いて心筋細胞中の
［Ｃａ2+］ｉを、同じ実験条件下で１μＭのウワバイン
により起こされる（２８７±１５ｎＭ）のと同様な水準
（３０３±１５ｎＭ）まで、増加することが見出され
た。ＨＩＦ（１単位／ml）は［Ｃａ2+］ｉを１μΜのウ
ワバインにより誘発されたよりも著しく大きい水準まで
引き上げた。
れた定常的な［Ｃａ2+］iの増加を示す。投薬量−応答
関係は、０.５単位／mlＨＩＦを用いて心筋細胞中の
［Ｃａ2+］ｉを、同じ実験条件下で１μＭのウワバイン
により起こされる（２８７±１５ｎＭ）のと同様な水準
（３０３±１５ｎＭ）まで、増加することが見出され
た。ＨＩＦ（１単位／ml）は［Ｃａ2+］ｉを１μΜのウ
ワバインにより誘発されたよりも著しく大きい水準まで
引き上げた。
【００４３】 表 １：ウワバイン及び各種の濃度のＨＩＦ＊で処理された心筋細胞中の定常状
態の細胞ゾルの遊離のＣａ2+（［Ｃａ2+］ｉ）の変化 条 件 対 照 ウワバイン ＨＩＦ（単位／ml） １０-6Ｍ ０.２５ ０.５ １.０ ([Ｃａ2+]ｉ)(ｎＭ) 183±3 287±15 197±9 303±15 432±18 ＊値は平均±ＳＥＭである；ｎ＝各濃度毎に３回測定 １μΜのウワバインはＣａ2+の濃度を２８７±１５ｎＭ
に上昇させ、及び明瞭な毒性を起こす（図１Ｃ）が、１
単位／mlのＨＩＦは同じ細胞中の細胞内Ｃａ2+の濃度を
極めて高い水準、４３２±１８ｎＭまで上げるが、毒性
の兆候がなく（図１Ｅ）安定な、最大の筋変力性効果を
伴う。
態の細胞ゾルの遊離のＣａ2+（［Ｃａ2+］ｉ）の変化 条 件 対 照 ウワバイン ＨＩＦ（単位／ml） １０-6Ｍ ０.２５ ０.５ １.０ ([Ｃａ2+]ｉ)(ｎＭ) 183±3 287±15 197±9 303±15 432±18 ＊値は平均±ＳＥＭである；ｎ＝各濃度毎に３回測定 １μΜのウワバインはＣａ2+の濃度を２８７±１５ｎＭ
に上昇させ、及び明瞭な毒性を起こす（図１Ｃ）が、１
単位／mlのＨＩＦは同じ細胞中の細胞内Ｃａ2+の濃度を
極めて高い水準、４３２±１８ｎＭまで上げるが、毒性
の兆候がなく（図１Ｅ）安定な、最大の筋変力性効果を
伴う。
【００４４】Ｃ． 心筋収縮性の測定 収縮性細胞運動の振幅（ＡＳＭ）として測定される収縮
性、及び拍数頻度はバーリ(Barry)等の方法（W.H.バー
リ等、Circ. Res. 、56:231-241(1985)）による位相差顕
微鏡ビデオ運動検出装置を用いて個々の細胞内で測定さ
れた。培養された心筋細胞を取り付けたカバーガラス
を、媒体灌流用の入り口及び出口を備える室内に入れ
た。室を３７℃でルサイト(Lucite)箱中に閉じ込め、逆
転した位相差顕微鏡の台上に置く。細胞をＨＩＦ又はウ
ワバインを含む１mlの培地で覆う。連続的灌流の間、カ
バーガラスの中心で細胞を浸す媒体は１５秒の一定時間
で０.９６ｍｌ／分の流速で交換した。画像は４０×の
対物レンズを用いて拡大され、運動は顕微鏡に取り付け
た低光レベルのＴＶカメラにより監視され、２６２本の
ラスター線で校正された。運動検出器は選択されたラス
ター線セグメントを監視し、ラスター線に沿って動く細
胞層内の微小球の画像境界のために、１６m秒毎に新し
い位置データを提供する。運動検出器からのアナログ電
圧出力は低域フィルターで濾過され、実際の運動のμｍ
を指示するように校正され、微分値が電子的に得られ、
μｍ／秒の運動の速度として記録される。収縮の拍数、
振幅及び速度は対照灌流の際数時間に亙って安定であっ
た。ウワバイン又はＨＩＦにより誘発された収縮性の変
化は、ウワバイン又はＨＩＦの添加前の同じ細胞の収縮
性と比較して計算された。
性、及び拍数頻度はバーリ(Barry)等の方法（W.H.バー
リ等、Circ. Res. 、56:231-241(1985)）による位相差顕
微鏡ビデオ運動検出装置を用いて個々の細胞内で測定さ
れた。培養された心筋細胞を取り付けたカバーガラス
を、媒体灌流用の入り口及び出口を備える室内に入れ
た。室を３７℃でルサイト(Lucite)箱中に閉じ込め、逆
転した位相差顕微鏡の台上に置く。細胞をＨＩＦ又はウ
ワバインを含む１mlの培地で覆う。連続的灌流の間、カ
バーガラスの中心で細胞を浸す媒体は１５秒の一定時間
で０.９６ｍｌ／分の流速で交換した。画像は４０×の
対物レンズを用いて拡大され、運動は顕微鏡に取り付け
た低光レベルのＴＶカメラにより監視され、２６２本の
ラスター線で校正された。運動検出器は選択されたラス
ター線セグメントを監視し、ラスター線に沿って動く細
胞層内の微小球の画像境界のために、１６m秒毎に新し
い位置データを提供する。運動検出器からのアナログ電
圧出力は低域フィルターで濾過され、実際の運動のμｍ
を指示するように校正され、微分値が電子的に得られ、
μｍ／秒の運動の速度として記録される。収縮の拍数、
振幅及び速度は対照灌流の際数時間に亙って安定であっ
た。ウワバイン又はＨＩＦにより誘発された収縮性の変
化は、ウワバイン又はＨＩＦの添加前の同じ細胞の収縮
性と比較して計算された。
【００４５】表２は各種の投薬量のＨＩＦの関数として
のＡＳＭ及び拍数頻度を総括している。ＨＩＦの濃度を
増大すると、ＡＳＭの漸進的な増大及び拍数の減少が起
こる。ＡＳＭの最大の増大は、ウワバインの最大の、無
毒的投薬量（５×１０-7Μ）に等しい水準である、約
０.５単位／ml（３９±６％）のＨＩＦ濃度で起こっ
た。
のＡＳＭ及び拍数頻度を総括している。ＨＩＦの濃度を
増大すると、ＡＳＭの漸進的な増大及び拍数の減少が起
こる。ＡＳＭの最大の増大は、ウワバインの最大の、無
毒的投薬量（５×１０-7Μ）に等しい水準である、約
０.５単位／ml（３９±６％）のＨＩＦ濃度で起こっ
た。
【００４６】 表 ２：各種の濃度のＨＩＦ、及びウワバイン（Ｏｕ）による心筋細胞中の収縮
運動の振幅（ＡＳＭ）及び心拍数に及ぼす効果＊ ＨＩＦ （単位／ml） Ｏｕ（Μ） ０.２ ０.２５ ０.３３ ０.５ １.０ ５×１０-7 ＡＳＭ、増加％ １５±２ ２２±１ ３２±９ ３９±６ ３７±３ ４１±３ 心拍数、減少％ １２±１ １５±１ ２５±７ ４０±２ ４９±６ ２３±２ ＊値は平均±ＳＥＭである；ｎ＝各濃度毎に３回測定 ＩＶ． Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの結合部位から強心
性配糖体を置換するＨＩＦの能力 “追い出し”実験は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアー
ゼがホスファチジルコリンリポゾームに再構成される分
析系を用いて行われた。分散したランダムに配向したＮ
ａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ分子を含むＡＴＰ−含有リポゾ
ームは、アナー(B.M.アナー及びM.ムースマイヤー、Bioc
hem. Biophys. Res. Commun.、129:102-108(1985)）によ
るコレート−透析法により製造された。本出願者はこの
小形化した二−側面試験法を用いて、０.１単位ＨＩＦ
（約７５ｆモル）の単一投薬量、及び１.０単位のＨＩ
Ｆ（約７５０ｆモル）の膜透過によるＮａ+、Ｋ+−ＡＴ
Ｐアーゼ阻害が測定可能となり、単位当たりのＨＩＦ分
子の最小数の見積もりが可能であることを示した。他の
提案された内因性のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤を
含めて多数の物質の試験を行ったにも拘らず、ＨＩＦは
かような驚くべき輸送阻害を示す精製系において今まで
試験された唯一の化合物（強心性配糖体以外の）であ
る。
運動の振幅（ＡＳＭ）及び心拍数に及ぼす効果＊ ＨＩＦ （単位／ml） Ｏｕ（Μ） ０.２ ０.２５ ０.３３ ０.５ １.０ ５×１０-7 ＡＳＭ、増加％ １５±２ ２２±１ ３２±９ ３９±６ ３７±３ ４１±３ 心拍数、減少％ １２±１ １５±１ ２５±７ ４０±２ ４９±６ ２３±２ ＊値は平均±ＳＥＭである；ｎ＝各濃度毎に３回測定 ＩＶ． Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの結合部位から強心
性配糖体を置換するＨＩＦの能力 “追い出し”実験は精製されたＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアー
ゼがホスファチジルコリンリポゾームに再構成される分
析系を用いて行われた。分散したランダムに配向したＮ
ａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ分子を含むＡＴＰ−含有リポゾ
ームは、アナー(B.M.アナー及びM.ムースマイヤー、Bioc
hem. Biophys. Res. Commun.、129:102-108(1985)）によ
るコレート−透析法により製造された。本出願者はこの
小形化した二−側面試験法を用いて、０.１単位ＨＩＦ
（約７５ｆモル）の単一投薬量、及び１.０単位のＨＩ
Ｆ（約７５０ｆモル）の膜透過によるＮａ+、Ｋ+−ＡＴ
Ｐアーゼ阻害が測定可能となり、単位当たりのＨＩＦ分
子の最小数の見積もりが可能であることを示した。他の
提案された内因性のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤を
含めて多数の物質の試験を行ったにも拘らず、ＨＩＦは
かような驚くべき輸送阻害を示す精製系において今まで
試験された唯一の化合物（強心性配糖体以外の）であ
る。
【００４７】“追い出し”実験のために機能性のＮ
ａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ分子を含むリポゾームを3Ｈ−
ウワバイン（１０μΜ）と共に２５℃で１０分間インキ
ュベートし、次いで各種の薬量でＨＩＦを添加し、そし
て２５℃で１０分間インキュベーションを継続した。反
応は１２５μlの氷冷した停止溶液を添加して阻止さ
れ、試料は遊離の3Ｈ−ウワバインから結合したものを
分離することが可能である、２０cmセファデックスＧ−
５０媒体カラムにかけて溶離（０℃）した。結合した3
Ｈ−ウワバインは表３に示すように薬量に依存する方式
でＨＩＦによりＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼから溶離され
た。
ａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ分子を含むリポゾームを3Ｈ−
ウワバイン（１０μΜ）と共に２５℃で１０分間インキ
ュベートし、次いで各種の薬量でＨＩＦを添加し、そし
て２５℃で１０分間インキュベーションを継続した。反
応は１２５μlの氷冷した停止溶液を添加して阻止さ
れ、試料は遊離の3Ｈ−ウワバインから結合したものを
分離することが可能である、２０cmセファデックスＧ−
５０媒体カラムにかけて溶離（０℃）した。結合した3
Ｈ−ウワバインは表３に示すように薬量に依存する方式
でＨＩＦによりＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼから溶離され
た。
【００４８】 表 ３：各種の薬量のＨＩＦによる２.５μlのＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ・リポ
ゾームに結合した3Ｈ−ウワバインの溶離 −ＨＩＦ ＋ＨＩＦ （単位／２.５μlリポゾーム） ０.１２５ ０.２５ ０.５ 結合した3Ｈ−ウワバイン（ｃｐｍ） ２９０２ １７８ １１１ ４５ 溶離した3Ｈ−ウワバイン（％） − ９４.０ ９６.２ ９８.５ Ｖ． 視床下部Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤の血管
収縮的性質 体重２５０−３５０ｇのスプラーグ−ドーレーラットを
腹腔内にペントバルビタールを注射して麻酔し、腹部大
動脈を迅速に切除し、下記の組成、ｍＭ：ＮａＣl、１
１８.３；ＫＣl、４.７；ＭｇＳＯ4、１.２；ＫＨ2ＰＯ
4、１.２；ＣａＣl2、２.５；ＮａＨＣＯ3、２５.０；
Ｎａ−ＥＤＴＡ、０.０１６；及びグルコース、１１.
１、を有する冷却したクレブス-ヘンゼライト(Krebs-He
nseleit)炭酸水素塩緩衝液中で総ての緩い結合組織を切
り離した。２−３mm（長さ）の血管輪を切除し、力変換
器に取り付け、９５％のＯ2で 及び５％のＣＯ2ガス処理された上記の緩衝液５mlを含
む温水（３７℃）ジャケットを備えた器官箱中に浸し
た。等張力の測定はグラース(Grass)７９Ｄポリグラフ
ＤＣ増幅器に取り付けたグラース力変位変換器を用いて
得られ、２−チャンネルのキップ(Kipp)ゾーネン(Zone
n)記録計で記録された。校正の研究によれば、１.５ｇ
の張力下に置かれた大動脈輪がＫＣl復極後の最大収縮
応答を発生することを示したので、従って総ての輪は実
験の開始前に１.５ｇの張力下で平衡化された。個々の
実験の場合の組織の生存性は塩化カリウム及びノルエピ
ネフリンのような既知の血管収縮剤を用いて証明され
た。こうして調製された血管は次いで薬量を変えたＨＩ
Ｆを用いで試験され、応答の大きさをＫＣl−誘発収縮
と比較した。ＨＩＦは強力な可逆的な血管の収縮を生
じ、及びこれらの応答は表４に示すように薬量に依存性
であった。
ゾームに結合した3Ｈ−ウワバインの溶離 −ＨＩＦ ＋ＨＩＦ （単位／２.５μlリポゾーム） ０.１２５ ０.２５ ０.５ 結合した3Ｈ−ウワバイン（ｃｐｍ） ２９０２ １７８ １１１ ４５ 溶離した3Ｈ−ウワバイン（％） − ９４.０ ９６.２ ９８.５ Ｖ． 視床下部Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤の血管
収縮的性質 体重２５０−３５０ｇのスプラーグ−ドーレーラットを
腹腔内にペントバルビタールを注射して麻酔し、腹部大
動脈を迅速に切除し、下記の組成、ｍＭ：ＮａＣl、１
１８.３；ＫＣl、４.７；ＭｇＳＯ4、１.２；ＫＨ2ＰＯ
4、１.２；ＣａＣl2、２.５；ＮａＨＣＯ3、２５.０；
Ｎａ−ＥＤＴＡ、０.０１６；及びグルコース、１１.
１、を有する冷却したクレブス-ヘンゼライト(Krebs-He
nseleit)炭酸水素塩緩衝液中で総ての緩い結合組織を切
り離した。２−３mm（長さ）の血管輪を切除し、力変換
器に取り付け、９５％のＯ2で 及び５％のＣＯ2ガス処理された上記の緩衝液５mlを含
む温水（３７℃）ジャケットを備えた器官箱中に浸し
た。等張力の測定はグラース(Grass)７９Ｄポリグラフ
ＤＣ増幅器に取り付けたグラース力変位変換器を用いて
得られ、２−チャンネルのキップ(Kipp)ゾーネン(Zone
n)記録計で記録された。校正の研究によれば、１.５ｇ
の張力下に置かれた大動脈輪がＫＣl復極後の最大収縮
応答を発生することを示したので、従って総ての輪は実
験の開始前に１.５ｇの張力下で平衡化された。個々の
実験の場合の組織の生存性は塩化カリウム及びノルエピ
ネフリンのような既知の血管収縮剤を用いて証明され
た。こうして調製された血管は次いで薬量を変えたＨＩ
Ｆを用いで試験され、応答の大きさをＫＣl−誘発収縮
と比較した。ＨＩＦは強力な可逆的な血管の収縮を生
じ、及びこれらの応答は表４に示すように薬量に依存性
であった。
【００４９】 表 ４：１.５g の静止張力以上の増加％として示された、各種の濃度のＨＩ
Ｆ、及びＫＣlによるラットの腹部大動脈輪の血管張力に及ぼす効果 ラットの動脈の張力の変化 ＨＩＦ（単位／ml） ＫＣｌ（ｍＭ） ０.１ ０.１ ０.４ ０.８ ２０ 増加 ％ ２ ５ １２ ２６ ２０ 血管はＨＩＦの濯ぎ出し後のＫＣｌの応答の保存により
判断されるように、ＨＩＦに暴露後も完全に生存してお
り；毒性的効果の欠如を証明している。最大の血管収縮
応答はＫＣｌ投薬で復極する膜により生じるものと同様
であった。これらの研究はＨＩＦが血管の調整において
提示された役割及び高血圧症の病因に有効な役割に適合
する有効な血管収縮物質であることを確証するものであ
る。
Ｆ、及びＫＣlによるラットの腹部大動脈輪の血管張力に及ぼす効果 ラットの動脈の張力の変化 ＨＩＦ（単位／ml） ＫＣｌ（ｍＭ） ０.１ ０.１ ０.４ ０.８ ２０ 増加 ％ ２ ５ １２ ２６ ２０ 血管はＨＩＦの濯ぎ出し後のＫＣｌの応答の保存により
判断されるように、ＨＩＦに暴露後も完全に生存してお
り；毒性的効果の欠如を証明している。最大の血管収縮
応答はＫＣｌ投薬で復極する膜により生じるものと同様
であった。これらの研究はＨＩＦが血管の調整において
提示された役割及び高血圧症の病因に有効な役割に適合
する有効な血管収縮物質であることを確証するものであ
る。
【００５０】等価物 当業者は日常的な実験以上のものを使用せずに、本文中
で詳細に記載された本発明の特定の具体化に対する多数
の等価物を認識し、又は確認することが可能であろう。
かような等価物は特許請求の範囲内に包含されることを
意図するものである。
で詳細に記載された本発明の特定の具体化に対する多数
の等価物を認識し、又は確認することが可能であろう。
かような等価物は特許請求の範囲内に包含されることを
意図するものである。
【００５１】本発明の主なる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００５２】１．哺乳類宿主に正筋変力性効果を生じる
量の視床下部阻害因子（ＨＩＦ）を投与することによ
り、該宿主中に正筋変力性効果を生ぜしめる方法。
量の視床下部阻害因子（ＨＩＦ）を投与することによ
り、該宿主中に正筋変力性効果を生ぜしめる方法。
【００５３】２．心臓の機能不全に罹患している患者に
正筋変力性効果を生じる量のＨＩＦを投与することによ
り、該患者の心臓の機能不全を治療する方法。
正筋変力性効果を生じる量のＨＩＦを投与することによ
り、該患者の心臓の機能不全を治療する方法。
【００５４】３．心臓の機能不全がうっ血性心不全、発
作性心房性頻脈又は心房細動である、上記２に記載の方
法。
作性心房性頻脈又は心房細動である、上記２に記載の方
法。
【００５５】４．正筋変力性効果を生じる量のＨＩＦが
約０.１ないし１単位／ml（０.０７５−０.７５ｎＭ）
である、上記３に記載の方法。
約０.１ないし１単位／ml（０.０７５−０.７５ｎＭ）
である、上記３に記載の方法。
【００５６】５．正筋変力性効果を生じる量の視床下部
阻害因子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤ
ーを含有して成る心臓の機能不全に罹患した患者を治療
するのに有用な製薬学的組成物。
阻害因子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤ
ーを含有して成る心臓の機能不全に罹患した患者を治療
するのに有用な製薬学的組成物。
【００５７】６．正筋変力性効果を生じる量のＨＩＦが
約０.１ないし１単位／ml（０.０７５−０.７５ｎＭ）
である、上記５に記載の製薬学的組成物。
約０.１ないし１単位／ml（０.０７５−０.７５ｎＭ）
である、上記５に記載の製薬学的組成物。
【００５８】７．強心性配糖体中毒を治療するための治
療的に有効な量の視床下部阻害因子（ＨＩＦ）及び製薬
学的に許容し得るキャリヤーを患者に投与することを含
んで成る、強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療する
方法。
療的に有効な量の視床下部阻害因子（ＨＩＦ）及び製薬
学的に許容し得るキャリヤーを患者に投与することを含
んで成る、強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療する
方法。
【００５９】８．治療的に有効な量の視床下部阻害因子
（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含有
して成る、強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療する
のに有用な製薬学的組成物。
（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含有
して成る、強心性配糖体中毒に罹患した患者を治療する
のに有用な製薬学的組成物。
【００６０】９．治療的に有効な量のＨＩＦを患者に投
与することを含んで成る、浮腫性の疾患に罹患した患者
を治療する方法。
与することを含んで成る、浮腫性の疾患に罹患した患者
を治療する方法。
【００６１】１０．浮腫性の疾患がうっ血性心不全、肝
硬変又はネフローゼ症候群である、上記９に記載の方
法。
硬変又はネフローゼ症候群である、上記９に記載の方
法。
【００６２】１１．治療的に有効な量の視床下部阻害因
子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含
有して成る、浮腫性の疾患に罹患した患者を治療するの
に有用な製薬学的組成物。
子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含
有して成る、浮腫性の疾患に罹患した患者を治療するの
に有用な製薬学的組成物。
【００６３】１２．患者にＨＩＦへの抗体を投与するこ
とを含んで成る、能動免疫による高血圧症に罹患してい
る患者を治療する方法。
とを含んで成る、能動免疫による高血圧症に罹患してい
る患者を治療する方法。
【００６４】１３．患者にＨＩＦの免疫抗原体を投与す
ることを含んで成る、受動免疫による低血圧症に罹患し
ている患者を治療する方法。
ることを含んで成る、受動免疫による低血圧症に罹患し
ている患者を治療する方法。
【００６５】１４．天然のＨＩＦの結合を防止又は変調
するＨＩＦの類似体を患者に投与することを含んで成
る、低血圧症に罹患している患者を治療する方法。
するＨＩＦの類似体を患者に投与することを含んで成
る、低血圧症に罹患している患者を治療する方法。
【００６６】１５．患者に治療的に有効な量のＨＩＦを
投与することを含んで成る、低血圧症に罹患している患
者を治療する方法。
投与することを含んで成る、低血圧症に罹患している患
者を治療する方法。
【００６７】１６．治療的に有効な量の視床下部阻害因
子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含
有して成る、低血圧症に罹患している患者を治療するの
に有用な製薬学的組成物。
子（ＨＩＦ）及び製薬学的に許容し得るキャリヤーを含
有して成る、低血圧症に罹患している患者を治療するの
に有用な製薬学的組成物。
【図１】図１は心筋細胞の収縮性に及ぼすウワバイン
（上部区画）及びＨＩＦ（下部区画）の効果を示す位相
差顕微鏡のビデオ運動検出器により生じたグラフであ
る。
（上部区画）及びＨＩＦ（下部区画）の効果を示す位相
差顕微鏡のビデオ運動検出器により生じたグラフであ
る。
【図２】図２は新生児ラットの心筋細胞による全86Ｒｂ
+の摂取に及ぼすＨＩＦ（２単位／ｍｌ）及びウワバイ
ン（５mΜ）又は両者の阻害効果をプロットするグラフ
である。
+の摂取に及ぼすＨＩＦ（２単位／ｍｌ）及びウワバイ
ン（５mΜ）又は両者の阻害効果をプロットするグラフ
である。
【図３】図３は心筋細胞におけるウワバイン−感受性86
Ｒｂ+の摂取（ナトリウム・ポンプ活性）に及ぼすＨＩ
Ｆの投薬量の増大とその阻害効果をプロットするグラフ
である。
Ｒｂ+の摂取（ナトリウム・ポンプ活性）に及ぼすＨＩ
Ｆの投薬量の増大とその阻害効果をプロットするグラフ
である。
【図４】図４は培養された心筋細胞中における細胞ゾル
の遊離のＣａ+2含量に及ぼす３０及び６０分間暴露され
たＨＩＦ（１単位／ml）の効果を示す蛍光信号である。
の遊離のＣａ+2含量に及ぼす３０及び６０分間暴露され
たＨＩＦ（１単位／ml）の効果を示す蛍光信号である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/30 A61K 9/14 A61K 35/12 A61K 39/00 A61K 39/395 ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 視床下部阻害因子（ＨＩＦ）を有効成分
として含有することを特徴とする哺乳類宿主における陽
性の筋変力作用を生ぜしめるための薬剤。 - 【請求項２】 心臓の機能不全の処置剤である請求項１
に記載の薬剤。 - 【請求項３】 強心性配糖体中毒の処置剤である請求項
１に記載の薬剤。 - 【請求項４】 浮腫性疾患の処置剤である請求項１に記
載の薬剤。 - 【請求項５】 低血圧症の処置剤である請求項１に記載
の薬剤。
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