BR9911294B1

BR9911294B1 - complexo reversìvel de equilìbrio, preparação liofilizada, solução injetável e composição farmacêutica.

Info

Publication number: BR9911294B1
Application number: BRPI9911294-9A
Authority: BR
Inventors: Oleg Strelchenok
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2012-01-10
Also published as: WO1999065936A3; BR9911294A; JP4392991B2; HK1035866A1; EP1085909B1; CA2335079C; US6599507B2; CA2335079A1; JP2004500315A; AU4773499A; US20010034324A1; DE69929189D1; DE69929189T2; ATE314094T1; EP1085909A2; AU748838B2; SE9802162D0; WO1999065936A2

Description

COMPLEXO REVERSÍVEL DE EQUILÍBRIO, PREPARAÇÃO LIOFILIZADA, SOLUÇÃO INJETÁVEL E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Campo da Invenção

Essa invenção se refere a uma nova composição terapêutica, em particular uma composição imunomoduladora ou uma composição para o uso no tratamento de imuno deficiências. A invenção também descreve métodos para a aplicação terapêutica da mesma. Descrição do estado da arte

A alfa-fetoproteina (AFP), uma proteína do sangue fetal de mamíferos, tem sido de certo interesse cientifico desde o momento em que foi descoberta em 1958. As propriedades biológicas dessa proteína são objeto de numerosas investigações; todavia, ainda não existe uma resposta final para o papel dessa proteína no organismo. É conhecido, que os ácidos graxos insaturados, tais como o ácido araquidônico e docosahenaenóico e seus metabólicos são caracterizados como ligantes naturais da AFP, e podem ser detectados como complexos com uma determinada proteína que circula nos vasos sangüíneos. Todavia, a AFP não é somente uma proteína de transporte para o ácidos graxos insaturados. Também foi descoberto que ela forma complexos com bilirrubina, retinóides e cobre. Além disso, para o transporte de substâncias de baixo peso molecular, a AFP pode tomar parte na regulação à resposta imune. A maioria dos estudos nas propriedades imunoreguladoras da AFP indica que a proteína possui aspectos imunosupressivos.

Também deve ser ressaltado, que praticamente não foram obtidos quaisquer dados sobre as propriedades imunosupressoras para a proteína pura, porém usando soro enriquecido com AFP ou fluido aminiótico durante os experimentos in vitro. As propriedades imunoreguladoras da AFP mostraram ser dependentes da origem das preparações e dos métodos de purificação.

Por exemplo, a AFP obtida do fígado de fetos é caracterizada pela forte supressão da transformação de linfócito induzido por mitogene em comparação com a AFP, obtida a partir do sangue humano de paciente que sofrem de câncer primário do fígado.

Ao mesmo tempo, foi demonstrado que a AFP estimula a regeneração de tecidos após os ferimentos. A AFP apresentou tendência na diminuição dos processos inflamatórios artificialmente estimulados em animais provavelmente através do bloqueamento de receptores de células imunocompetentes. Também foi recentemente mostrado em uma série de experimentos, que a AFP é ativamente absorvida pelas células de crescimento e de diferenciação, e esse processo é controlado pela quantidade de receptores de AFP expressados. Foi descoberto que a concentração intracelular de AFP aumentou simultaneamente com o aumento da quantidade de receptores de AFP na superfície de células proliferadoras de T-linfócitos e células malignas. Com base nesses dados, foi relatado que essa proteína funciona como um transportador de ida-e-volta, conduzindo o ligante para o interio:: da célula, e, então, retornando para o interior do liquido intracelular para repetir o ciclo (Esteban C., et al., Int. J. Câncer, v. 49, p. 425-430, 1991).

Os mais importantes ligantes transportados para o interior da célula são ácidos graxos insaturados, denominados ácido araquidônico e docosahexaenóico e seus metabólitos. É experimentalmente provado, que a presença de AFP aumenta de forma significativa o fluxo desses ácidos no interior do citoplasma de T-linfócitos ativados (Torres J. M., et al., J. Cell. Physiol, v. 150, p. 456-462, 1992).

O aumento da concentração de ácidos graxos insaturados é de grande importância já que os ditos ácidos são não somente os componentes estruturais necessários da membrana da célula, como também servem como uma fonte adicional de energia para as células. Os metabólitos desses ácidos, em particular aqueles do ácido araquidônico, podem atuar como mensageiros secundários, participando assim na regulação do crescimento celular e diferenciação celular (Bevan S., et al., Nature (London), v. 328, p. 20, 1987).

A anandamida (araquidonil-2-etanolamida) é um dos recentemente descobertos metabólitos de ácido graxo. Esta é caracterizada pelo alto efeito fisiológico alcançado no cérebro. A anandamida é um novo neurotransmissor de lipideo, primeiramente isolado do cérebro de suínos. Essa mostrou ser um agonista funcional para os receptores canabinóides CBl e CB2. Sua presença resulta em muitos efeitos farmacolóqicos causados pelo delta 9-tetra-hidrocanabinol (delta 9- THC). A anandamida se compara à delta 9-THC em sua interação especifica com o receptor canabinóide e na inibição de ciclase adenilato. Durante muitas décadas, era desconhecido o mecanismo de ação de compostos de canabinóide, que são estruturalmente similares à delta 9-THC. Recentemente foi feito extraordinário progresso na caracterização de receptores canabinóides, tanto centralmente como perifericamente, bem como no estudo do papel dos sistemas secundários mensageiros a nível celular. As drogas derivadas de canabinóide foram usadas durante séculos, para fins medicinais. Todavia, essas drogas, hoje sendo comercializadas, não possuem especificidade e produzem muitos efeitos c2fIaterais (Chakrabarti A., et al., Brain. Res. Bull., v. 45, p. 67-74, 1998).

A anandamida pode ser formada enzimaticamente através de dois caminhos sintéticos separados no cérebro: condensação enzimática do ácido araquidônico livre e etanolamina; e, formação de N-arquidonoil fosfatidiletanolamina a partir de fosfatidiletanolamina e ácido araquidônico esterificado na posição-1 da fosfatidilcolina, e subsequente liberação de anandamida a partir de N-araquidonoil fosfatidiletanolamina através da ação de uma fosfodiesterase (fosfolipase D) (Suguira T., el al., Eur. J. Biochem., v. 240, p. 53- 62, 1996). A N-acil-transferase catalisa a transferência de resíduo de araquidonoil no grupo NH2 da fosfatidiletanolamina. Essa enzima é dependente de Ca2 + e está principalmente localizada no cérebro e nos testículos. 0 caminho para a formação de anandamida é apresentado a seguir.

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R - Araquidonoil

R1 e R2 - alquil N-araquidonoil fosfatidiletanolamina também poderia ser um substrato para a fosfoplipase C (Brockerhoff H., Jensen R. G., Lipolytic enzymes, Academic press, New York, San Francisco, London, 1974). Nesse caso, a reação enzimática resulta na formação de N-araquidonoil aminoetilfosfato (N-AAP).

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A ausência de dados de literatura sobre a presença de N-AAP no cérebro, sustenta a suposição de que esse fosfato é instável e pode ser rapidamente transformado em anandamida pelas fosfatoses endógenas durante o processamento das preparações do cérebro. Para estudar a atividade biológica da N-AAP, deve ser considerado um complexo reversível de AFP com N-AAP. Nesse caso a N- AAP pode ser protegida pela molécula de proteína a partir da influência enzimática nos vasos sangüíneos, bem como em outros líquidos biológicos.

A idéia em usar complexos reversíveis de proteínas de transporte com os conjugados de seus ligantes naturais com drogas para reforçar seus efeitos farmacêuticos e reduzir os efeitos laterais, particularmente durante o tratamento de câocex, foi primeiro relatada em 1958 (Mathe G. et al., C. R. Seances Acad. Sci., v. 246, p. 1626-1628, 1958; Magnenat R., et al., Eur. J. Câncer., v. 5, p. 33-40, 1969) . O complexo reversível de AFP com os conjugados de daunomicina com ácidos araquidônico e docosohexanóico mostrou ser um agente citostático mais efetivo para células AH-66 de hepatoma, gerando mais AFP do que daunomicina livre (Deutsch H. F. et al., Câncer Res. v. 43, p. 2668-2662, 1983), e o conjugado dos ácidos 2-deóxi-5-fluorouridina-oleico e docoso hexanóico com AFP possuía muito maior atividade citotóxica para as linhagens de células cancerígenas H 1-29 do que a 2-deóxi-5-fluorouridina livre (Halmos T., et al., Biochem. Pharmacol, v. 44, p. 149-156, 1992).

Foram relatadas algumas observações diretas à resposta imunológica sobre o papel de um fator que mostra ser a AFP (Abramsky, 0., et al., Isr. Med., vol. 15, p. 943, 1979); Brenner T., et al. , Immunol. Lett., vol. 3, p. 163, 1981) . Eles descobriram que o que é provável ser a AFP fetal evitou o desenvolvimento de miastenia grave em coelhos e, além disso, que os sinais clínicos da doença nesses animais desapareceram quando eles foram tratados com a suposta AFP. Foi mostrado que a encefalomielite alérgica experimental induzida em cobaias foi tratada com sucesso, bem como parcialmente evitada através da administração de AFP (Abramsky 0., et al., J. Neuroimmunol., vol. 2, ρ. 1, 1982). Assim, foi mostrado que a AFP, dependendo de sua origem e condições circundantes, exerce diferentes funções através de diferentes mecanismos. Primeiramente, existe um efeito regulatório na concentração da forma não ligada de seus vários ligantes (e.g., ácidos graxos, estrogênios, fitoesteróides) . É sabido que os ácidos graxos, em particular ácidos graxos poli-insaturados, modulam positiva ou negativamente muitas etapas da ação de vários esteróides e muitas enzimas envolvidas na transdução de sinais disparadas pela membrana. Em segundo lugar, diferentes conformações (holoformas) de AFP, dependendo da natureza e concentração de ligante(s) ligado(s) à ela, poderia influenciar a ligação da proteína ao(s) receptor (es) especifico(s) e como conseqüência influenciar sua/suas propriedades biológicas (internalisação, ação no caminho de transdução de sinal da membrana). Em terceiro lugar, em adição aos mecanismos acima propostos, a proteína pode exercer efeitos associados com outros sinais, tais como fatores de crescimento.

Obviamente, parece não existir qualquer entendimento uniforme e consistente dos mecanismos de AFP. As substâncias imunomoduladoras usadas no momento e, em particular, as substâncias imunoestimuladoras não estão sem suas desvantagens. As preparações de interferon produzem sintomas semelhantes à influenza em cerca de 90% dos pacientes e precisa ser considerado o risco de outros efeitos. Tipicamente, os efeitos laterais variam de irritação dos músculos e do esqueleto e dores, dores de cabeça e sintomas similares até os mais sérios sintomas como leucopenia, anemia, trombocitopenia, esplenomegalia e hepatomegalia, somente para mencionar alguns exemplos.

O objetivo da presente invenção é tornar disponível uma composição farmacêutica imunomoduladora que exibe propriedades aperfeiçoadas, não somente com relação às propriedades terapêuticas, tais como eficácia e extensão de aplicação, mas também propriedades farmacológicas e técnicas, tais como facilidade de fabricação, estocagem, misturação e administração.

Sumário da Invenção

a presente invenção se refere a um complexo terapeuticamente útil, em particular se refere a um complexo imunomodulador de acordo com as reivindicações anexas. A invenção será descrita em maiores detalhes através da descrição e exemplos a seguir.

Descrição

A invenção disponibiliza um complexo de equilíbrio reversível de alfa-fetoproteina e N-araquildonoil aminoetilfosfato, em particular um complexo não covalente equilibrado de N-araquildonoil aminoetilfosfato (N-AAP), um metabólito de ácido araquidônico e alfa-fetoproteina (AFP) de alta pureza, por exemplo AFP isolada a partir de sangue de cordão umbilical humano com mais de 90% de pureza. A estrutura química da parte não proteica do complexo está apresentada abaixo:

CH3 (CH2) 4 (CH=CHCH2) 4CH2CH2CONHCH2CH2OPO (OH) 2

0 complexo inventivo pode conter seus componentes em razões molares altamente variadas, tais como a partir de uma razão equimolar até uma significante abundância de N-AAP em relação à AFP. Normalmente, o complexo contém de 1 até 300 moles de N-AAP por mol de AFP. O complexo inventivo pode ser obtido pela adição de uma solução de etanol de N-AAP em uma solução diluída de água de AFP seguido pela ultrafiltração, dita ultrafiltração resultando em concentração da solução e remoção da N-AAP que permaneceu não ligada à AFP. A concentração de AFP na solução varia de 0,1 a 2 mg/ml e aquela da N_AAP varia de 0,005 até 30 mg/ml.

No complexo inventivo, a proteína é ligada reversível a uma ou mais moléculas do ligante, porém de forma surpreendente com uma micela, contendo até 300 moléculas de N-AAP. É conhecido, que os ligantes naturais de AFP semelhantes aos ácidos araquidônico e docosohexanóico, etc., são moderadamente solúveis em água. Se uma solução concentrada de etanol dessas substâncias é injetada na água sob condições especiais, obtém-se uma solução coloidal. As partículas coloidais obtidas (micelas) contem cerca de 50 a cerca de 300 ou mais moléculas do lipídeo. A adição de ácidos graxos insaturados - ligantes AFP à solução aquosa de AFP, resulta na formação de complexos de proteina-lipídeo.

As propriedades desses complexos foram insuficientemente estudadas, porém é possível assumir que suas formações ocorrem não somente devido ao fragmento hidrofóbico da molécula proteica, mas também é estipulado pela participação do(s) centro(s) ativo(s) de AFP. Foram fracassadas as tentativas para produzir complexos de AFP com outros ácidos graxos, não sendo os ligantes a essa proteína, a saber com outros ácidos graxos. As alterações de peso da molécula da proteína como julgado pela filtração por gel é uma evidência da existência de complexos de AFP com as "micelas de seus ligantes naturais.

Em uma modalidade, o peso molecular da AFP incorporada no complexo com seu ligante natural ou seu derivado (por exemplo N-AAP) aumenta em aproximadamente 2 vezes., enquanto a filtração por gel de AFP com micelas de ácido palmitoil não resultou em alterações do volume de eluiçào em comparação com aquele para a AFP livre. A micela continha cerca de 200-300 moléculas de lipídeo. As preparações obtidas de complexos de AFP com as micelas de seus ligantes naturais são caracterizadas como complexos reversíveis de proteina- lipideo, porém ao mesmo tempo possuem as propriedades de proteolipossomas (Degrip W. J., Biochem J. Mar., 1. 330, p. 667-674, 1998).

Em uma outra modalidade, o peso molecular da AFP incorporada no complexo com seu ligante natural ou seu derivado (por exemplo N-AAP) aumenta em aproximadamente 2-3 vezes. As micelas continham cerca de 100-300 moléculas de lipideo. As preparações obtidas de complexos de AFP com as micelas de seus iigantes naturais ou metabólitos são caracterizadas como complexos reversíveis de proteina-lipideo, porém ao mesmo tempo possuem as propriedades de proteolipossomas.

Foi mostrado que a AFP entra nas células através de pequenas vesiculas e endossomas e se movimenta para corpos multivesiculares e elementos tubulares vesiculares localizados na região centroesférica de Golgi, para serem finalmente recicladas de volta para o interior do meio (Geuskens M., et al., Microsc. Res. Tech., v. 28, p. 297-307, 1994).

Com base nos dados de literatura e em resultados experimentais obtidos pelo presente inventor, é sugerido que os complexos reversíveis de AFP com N-AAP penetra no interior dos linfócitos através de endocitose intermediada por receptor de AFP. Por um lado, o complexo de AFP/N-AAP no interior dos linfócitos poderia aparentemente regular a síntese de fosfolipideos como os componentes estruturais da membrana celular. Por outro lado, a N-AAP é uma fonte de ácido araquidônico que é ainda incorporado no interior das estruturas fosfolipídicas.

A influências dos complexos de AFP/N-AAP, bem como seus componentes básicos sobre a resposta imune humoral, foi estimada pela contagem da quantidade de células formadoras de anticorpos (AFC) no baço. Experimentalmente, provou-se que a própria N-AAP não exibe atividade imunogênica. A relativa quantidade de células de AFC no quinto dia após a injeção de -H-AAP em animais imunizados com eritrócitos de ovelha, não foi significativamente alterada em comparação com as séries de controle. A administração da mesma dosagem do complexo inventivo de AFP/N-AAP (razão de AFP/N-AAP de 1:200) mostrou que a quantidade relativa de AFC aumentou em 87% e a quantidade total de AFC aumentou em 162% no quinto dia após a injeção, em comparação com a quantidade de células em animais imunizados somente com

eritrócitos de ovelha.

Uma administração do complexo inventivo em razões de AFP/N-AAP de 1:100 ou 1:300, mostrou uma atividade imunoestimuladora levemente diminuída do complexo. No quinto dia após a injeção de um complexo 1:100, a quantidade aparente de AFC tinha aumentado em 30% e a quantidade total em 79%. Para um complexo a 1:300, o aumento na quantidade aparente de AFC foi de 48,3%, e para a quantidade total de célula de 103,3%. Os resultados mostram um significante efeito do complexo dentro do intervalo de 1:100 - 1:300, com um efeito aperfeiçoado que corresponde à razão de 1:200 de AFP/N- AAP. Todavia, a razão de AFP/N-AAP pode ser variada dentro de um mais amplo intervalo, e.g., 1:1 1:10.000.

A AFP sozinha, administrada em correspondentes doses, reduz ou não afeta significativamente as características imunogênicas dos eritrócitos de ovelha em camundongos.

A AFP foi isolada a partir ao sangue do cordão umbilical de humanos pela cromatografia de imunoafinidade sobre anticorpos monoclonais contra a AFP imobilizada em Sepharose®, cromatografia de imunoafinidade em anticorpos policlonais nas proteínas de sangue humano normal e filtração em gel sobre Sephacryl® S-200. A preparação de AFP assim obtida foi mais pura em 99% e não continha impurezas de baixo peso molecular e manteve completamente sua atividade biológica.

Outras fontes de AFP podem ser purificadas e/ou a AFP pode ser modificada a partir de outros mamíferos, por exemplo a partir de mamíferos geneticamente modificados, ou a partir de cultura de células. Preferivelmente, a AFP é fabricada de maneira biotecnológica, usando uma cultura de célula de células geneticamente modificadas expressando a AFP humana. Com conhecimento da seqüência de nucleotídeos que codificam a AFP humana, essa pode ser inserida em um hospedeiro, junto com promotores necessários e outra informação da seqüência, por exemplo seqüências que influenciam a expressão extracelular de AFP. A AFP é coletada . a partir da cultura de célula e purificada por cromatografia, e pode ser ainda purificada por filtração em gel. Em qualquer caso, o método de produção precisa envolver etapas, que assegurem que o produto final está livre de pirogenes e possíveis contaminantes virais e bactérias. Métodos de produção adequados podem, por exemplo, ser encontrado? no campo da produção de interferon.

De acordo com uma modalidade da invenção, o complexo de AFP/N-AAP é usado como um agente terapêutico, ou usado para a fabricação de uma preparação terapêutica, possivelmente contendo um agente imunoestimulador, e.g., para o tratamento de imuno deficiências. 0 complexo também pode ser usado para a fabricação de uma preparação imunoestimuladora.

De acordo com uma modalidade preferida, o complexo inventivo é usado para o tratamento de imuno desordens associadas com a terapia do câncer. O complexo inventivo também pode ser usado para a fabricação de uma preparação farmacêutica para o tratamento de câncer. Exemplos dessas desordens ou imuno deficiências como uma conseqüência do tratamento do câncer incluem a neutropenia.

O complexo inventivo também pode ser usado como um agente profilático em pacientes suscetíveis à infeções, ou para a fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento desses pacientes.

Desta forma, a invenção também se refere a métodos para o tratamento de imuno deficiências, onde um complexo reversível de equilíbrio de acordo com a presente invenção é administrado em um mamífero. Preferivelmente, o dito complexo é administrado intravenosamente. Preparação da forma médica: A composição ativa pode ser administrada intravenosamer.te De forma alternativa, para simplificar a estocagem e manuseio, a composição pode ser preparada como um pó estéril para preparação extemporânea de soluções estéreis injetáveis ou dispersões. Em todos os casos, a forma precisa ser estéril e precisa ser fluida até uma extensão que permita fácil manuseio pela seringa e dispositivos similares. Além disso, a preparação precisa ser estável sob condições de fabricação e estocagem e precisa ser protegida contra a ação de contaminação de microrganismos tais como bactérias e fungos.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação de AFP e N-AAP em uma quantidade requerida de água, ultrafiltração (concentração) da solução seguido por esterilização em filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem à vácuo ou de secagem adequada por congelamento que produzem um pó dos ingredientes ativos a partir de soluções previamente filtradas estéreis a partir das mesmas.

Para introdução direta de um complexo aos pacientes, uma preparação esterilizada é primeiramente injetada em uma solução salina fisiológica (100 - 500 ml) ou em uma solução proteica (albumina) então intravenosamente administrada a um paciente. Quando é usada uma preparação liofilizada, ela deve ser previamente dissolvida em 2 - 10 ml de solução esterilizada (água destilada, solução salina fisiológica ou solução de albumina) quando então a solução esterilizada obtida é adicionada a 100 SCO ml de solução fisiológica ou solução proteica para introdução intravenosa, o mesmo como no caso de uso das soluções.

As dosagens terapêuticas efetivas são em intervalo de 2 mg/kg a 7 mg/kg para N-AAP e de 0,2 mg/kg a 0,7 mg/kg para a AFP.

Exemplos

Exemplo 1: Isolamento de AFP humana

1 1 de sangue de cordão umbilical foi incubado durante 1 hora sob agitação continua com 25 ml de Sepharose® com anticorpos monoclonais imobilizados contra AFP. Após o término da incubação, o gel foi lavado com tampão de bicarbonato 0,1M, pH 8,3 e a AFP foi eluida com tampão de 0,05M glicina-HCL, pH 2,5. O eluado foi então cromatograficamente purificado de proteínas de lastro. A coluna continha 25 ml de Sepharose® com anticorpos policlonais imobilizados contra proteínas normais de sangue humano (1 mg/ml para gel empacotado). O eluado que contém AFP foi concentrado seguido pela aplicação de Sephacryl® S-200 (coluna 1,5 χ 120 cm). O eluado AFP foi liofilizado. A preparação de AFP assim obtida foi 99% mais pura, não contendo impurezas de baixo peso molecular e manteve completamente a atividade biológica. A matriz de imunoafinidade para o isolamento de AFP foi preparada por meio de anticorpos monoclona-is imobilizadores de anti-AFP isolados de liquido ascite de ratos (AFP-Ab) sobre BrCN-Sepharose®. 30 mg de AFP-Ab dissolvido em 10 ml de tampão de bicarbonato foram então adicionados à 25 ml de BrCN-Sepharose® condensado e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. A AFP-Ab- -Sepharose® obtida foi lavada com 0,5 1 de tampão de bicarbonato. A matriz de afinidade continha cerca de 1 mg de AFP-Ab por 1 ml de gel condensado.

A matriz de imunoafinidade para a purificação de AFP de proteínas de soro foi preparada por meio de anticorpos policlonais imobilizadores contra proteínas normais de soro humano sobre BrCN-Sepharose . 30 mg de anticorpos dissolvidos em 10 ml de tampão de bicarbonato foram então adicionados à 25 ml de BrCN- Sepharose® condensada e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. O imunosorbente obtido foi lavado com o, 5 1 de tampão de bicarbonato. A matriz final de afinidade continha cerca de 1 mg de anticorpos imobilizados por 1 ml de gel condensado.

Exemplo 2: Síntese de N-AAP

305 mg (1 mmol) de ácido araquidônico (Sigma Chemical Co.) foi dissolvido em 3 ml de acetonitrila contendo 0,14 ml de trietilamina. A mistura foi resfriada para -15°C seguido pela adição de 130 ml de butil formiato e incubada em uma determinada temperatura. O precipitado de hidrocloreto de trietilamina foi separado após 30 minutos. Assim obtida a solução de anidrido misturado, foi então adicionada a 1 ml de metanol contendo 0,12 ml de etanolamina. A mistura foi agitada durante 15 minutos a 0°C e então transferida para a temperatura ambiente. Após 2 horas, a mistura foi diluída com 10 ml de IN HCl e extraída com éter (2 χ 20 ml). A extração de éter foi lavada com água e então secada em sulfato de sódio anidro. A solução foi então evaporada até a secura e a substância foi dissolvida em 5 ml de acetona e submetida a uma coluna de óxido de alumínio com altura de 2 cm (10 g, básico, grau 11 acc para Brockman). A coluna foi lavada com 30 ml de acetona. O eluado foi evaporado e ainda secado sob pressão à vácuo. Assim a N-araquidonoil etanolamina obtida foi mostrada ser pura como avaliado a partir dos dados TLC de gel de sílica (ácido benzenodioxana acídico, 25:5:1). Então 5 ml de piridina contendo 400 mg de piridinium 2-cianoetil fosfato, foram adicionados seguido por 620 mg de diciclohexil carboiimida. O frasco foi enchido com argônio e a mistura foi mantida à temperatura ambiente durante 20 horas. Após o que, 1 ml de água foi adicionado e agitado durante mais 30 minutos. O precipitado de N,N- diciclohexil-uréia foi separado via filtração, a água e a piridina foram evaporadas. O produto de reação araquidonoil aminoetil, 2-cianoetil fosfato foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel que lava a coluna com misturas de clorofórmio-metanol com conteúdo aumentado de metanol. As frações foram submetidas a TLC (clorofórmio-metanol-água, 65,25:4, Rf = 0,63) e aquelas frações, que foram manchadas após espalhamento das placas com reagente dstector de fosfolipídeo, foram unidas, secadas, e dissolvidas em 1,5 ml de tetrahidrofurano. A solução obtida foi adicionada em gotas à 5 ml de IN NaOH, pré-resfriadas a O0C. Após 20 minutos de agitação o pH foi ajustado para 2-3 e então a mistura foi extraída com clorofórmio- metanol 2:1 (v/v). A extração foi lavada com metanol- água 10:9, evaporada e submetida a cromatografia em coluna de sílica gel que lava a coluna com misturas de clorofórmio-metanol com conteúdo aumentado de metanol. As frações foram submetidas a TLC (clorofórmio-metanol- água, 65,25:4, v/v/v, Rf = 0,3) e aquelas frações, que foram manchadas após espalhamento das placas com reagente detector de fosfolipídeo, foram unidas e secadas. O resultado final de arquidonoil aminoetil fosfato (N-AAP) foi 150 mg (35%). Calculado: P 7,26. Encontrado: P 7,14. Espectro IR (película: v, cm 1J 1070, 1220, 1555, 1650. H-NMR (d, CDCl3) 0,88 (3H, t, CH3), 1,30 (8H, s, CH2), 2, 00-2, 40 (6H, m, 2 grupos CH2CH=CH e CH2CO), 2,70-2, 90 (6H, wid. S, 3CH=CHCH2CH=CH), 3,48 (2H, t, NCH2), 5, 24-5, 44 (8H, m, CH=CH).

Exemplo 3: AFP ligando com N-AAP

Para determinar a afinidade da N-AAP para a AFP humana, foi usado uma substituição competitiva de [5,6,8,9,11,12,14,15 - 3H] araquidônico a partir do local de ligação da proteína. Em tubos contendo 0,05 nM de AFP em 1 ml de 0,1M de tampão de bicarbonato e 0,7 nM de ácido [3H] araquidônico e foram adicionadas as quantidades aumentadas de ácido araquidônico ou N-AAP (5 - 5000 nM). Os tubos foram incubados durante 2 horas à temperatura ambiente. Para separar as frações ligadas à proteína e as frações livres de ácido araquidônico [3H], foi adicionado 0,5 ml de suspensão 0,5% de carbono ativado em cada tubo e incubado à 4°C durante 30 minutos. O carbono foi sedimentado por centrifugação a 3000 g, foram adicionadas alíquotas à 10 ml de mistura cintilante e os frascos foram medidos em contador beta.

Os parâmetros de ligação de ácido araquidônico e N-AAP e o número de locais de ligação por molécula de proteína foram calculados para Scatchard (Scatchard O., Ann. N.Y. Acad. Sei. 51, p. 660-664, 1949).

Com base em três determinações independentes o Ka para a AFP com ácido araquidônico foi encontrado ser 6 107 M-1 e η > 1,2. Para a N-AAP, a constante inibição de ligação de ácido araquidônico com AFP (Ki) foi 3 IO6 M 1.

Exemplo 4: Preparação de complexo de N-AAP com_AFP humano

50 mg de AFP (0,75 mmol) foi dissolvido em 150 ml de solução fisiológica. 35 mg 75 mmol) de N-AAP dissolvido em 5 ml de etanol foi adicionado à solução obtida. A mistura foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente (20 - 25°C). 0 complexo obtido de N-AAP com AFP foi concentrado para 10 ml usando Sartocon Micro "Sartorius" para compostos de alto peso molecular com um pedaço de membrana .de 20.000 Da. A solução final foi esterilizada com· um Filtro Seringa Minisart® SRP de ponta de seringa, "Sartorius" uma membrana de tamanho de poro de 0,22 μ. A preparação concentrada esterilizada foi distribuída em 10 frascos de 1 ml cada um. Os frascos foram soprados com corrente de argônio, firmemente fechados e estocados a 4 - 8°C.

Exemplo 5: Influência de AFP na resposta imuno humoral

A AFP foi intravenosamente administrada à 10 ratos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) em uma dosagem de 0,009 mg per capita. Simultaneamente, uma suspensão a 5% de eritrócitos de ovelha foi injetada peritoneamente (0,2 ml per capita) aos animais de controle e aos animais experimentais. Os animais de controle também foram injetados, intravenosamente, com um igual volume de solução isotônica de NaCl.

O efeito da AFP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baço de acordo com Cunningham (Cunningham A. J., Nature, v. 207, p. 1106-1107, 1965) (por IO6 de células de baço e por baço).

Foi mostrado que a dosagem administrada de AFP resultou em uma quantidade relativa de 30% menos de AFC no quinto dia após a injeção de suspensão de eritrócitos de ovelha em comparação com o grupo de ~controle (366,2 + 40,8 para os animais de controle e 255,5 + 13 para as séries experimentais, por 10 células, P < 0,05). Todavia, a quantidade total de AFC não havia sido significativamente alterada (27,2 + 5,7 103 per baço para o grupo de controle e 23,6 + 1 5 10 para as séries experimentais, P > 0,05).

Exemplo 6: Influência da N-AAP na resposta imuno humoral

A N-AAP foi intravenosamente administrada à 10 ratos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) em uma dosagem de 0,09 mg per capita. Simultaneamente, uma suspensão a 5% de eritrócitos de ovelha foi injetada peritoneamente (0,2 ml per capita). As séries de controle foram injetadas, intravenosamente, com 0,15 ml de solução isotônica de NaCl. 0 efeito da N-AAP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baço de acordo com Cunningham (IO6 células do baço e por baço).

A quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção foi 342,2 + 28,5 para as séries experimentais, P > 0,05. A quantidade total de AFC foi 27,2 + 5,7 IO3 para o grupo de controle e 36,0 + 8,7 103 para as séries experimentais, P > 0,05. O dado obtido mostra que a própria N-AAP não possui atividade imunogênica em si.

Exemplo 7: Influência do complexo AFP/N-AAP (1:200) na resposta imuno humoral

0, 15 ml do complexo de AFP/N-AAP foi intravenosamente administrado à 10 ratos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) em uma dosagem de 0,009 mg de AFP e 0,09 mg de N-AAP per capita. Simultaneamente, uma suspensão a 5% de eritrócitos de ovelha foi injetada peritoneamente (0,2 ml per capita). As series de controle foram injetadas, intravenosamente, com volumes iguais de solução isotônica de NaCl. O efeito do complexo de AFP/N-AAP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baço de acordo com Cunningham (por IO6 células do baço e por baço).

A quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção foi 366,2 + 40, 8 para os animais de controle e 686,7 + 89,5 para as séries experimentais, P > 0,05. A quantidade total de AFC foi 27,2 + 5,3 IO3 para o grupo de controle e 71,0 + 18,7 IO3 para as séries experimentais, P < 0,05.

Assim, a quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção aumentou 87% e a quantidade total de AFC aumentou 162% em comparação com a quantidade de células nos ✓ animais imunizados somente com eritrócitos de ovelha. O dado obtido provou que naqueles animais que recebem AFP (0,009 mg per capita, ver exemplo 5) combinado com injeções de eritrócitos de ovelha, a quantidade relativa de AFC aumentou 169% e a quantidade total de AFC 203%.

Exemplo 8: Influência do complexo AFP/N-AAP (1:100) na resposta imuno humoral

0,15 ml do complexo de AFP/N-AAP foi intravenosamente administrado à 10 ratos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) em uma dosagem de 0,009 mg de AFP e 0,045 mg de N-AAP per capita. Simultaneamente, uma suspensão a 5% de eritrócitos de ovelha foi injetada peritoneamente (0,2 ml per capita). As séries de controle foram injetadas, intravenosamente, com volumes iguais de solução isotônica de NaCl. O efeito do complexo de AFP/N-AAP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baço de acordo com Cunningham (por 106 células do baço e por baço) .

A quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção foi 366, 2 + 40, 8 para os animais de controle e 476,2 + 28,1 para as séries experimentais, P < 0,05. A quantidade total de AFC foi 27,2 + 5,7 103 para o grupo de controle e 48,0 + 6,2 103 para as séries experimentais, P < 0,05.

Assim, a quantidade aparente de AFC no quinto dia após a injeção aumentou 30% e a quantidade total de AFC aumentou 79% em comparação com a quantidade de células nos animais imunizados somente com eritrócitos de ovelha. O dado obtido provou que naqueles animais que recebem AFP (0,009 mg per capita, ver exemplo 5) combinado com injeções de eritrócitos de ovelha, a quantidade aparente de AFC aumentou 86,6% e a quantidade total de AFC 103,4%.

Exemplo 9: Influência do complexo AFP/N-AAP (1:300)na resposta imuno humoral 0,15 ml do complexo de AFP/N-AAP foi intravenosamente administrado à 10 ratos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) em uma dosagem ce 0,009 mg de AFP e 0,135 mg de N-AAP per capita. Simultaneamente, uma suspensão a 5% de eritrócitos de ovelha foi injetada peritoneamente (0,2 ml per capita). As séries de controle foram injetadas, intravenosamente, com volumes iguais de solução isotônica de NaCl. O efeito do complexo de AFP/N-AAP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baço de acordo com Cunningham (por IO6 células do baço e por baço).

A quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção foi 366,2 + 40, 8 para os animais de controle e 543,2 + 50,2 para as séries experimentais, P < 0,05. A quantidade total de AFC foi 27,2 + 5,7 IO3 para o grupo de controle e 55,3 + 5,3 IO3 para as séries experimentais, P < 0,05.

Assim, a quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção aumentou 48,3% e a quantidade total de AFC aumentou 103% em comparação com a quantidade de células nos animais imunizados somente com eritrócitos de ovelha. O dado obtido provou que naqueles animais que recebem AFP (0, 009 mg per capita, ver exemplo 5) combinado com injeções de eritrócitos de ovelha, a quantidade relativa de AFC aumentou 112,8% e a quantidade total de AFC 134,3%. Parte Experimental adicionada durante o ano de prioridade:

De forma a determinar a razão molar entre AFP e N- AAP nos complexos, foi realizada a ultrafiltraçào ou (e) cromatografia em gel na presença de [ H]-N-AAP. 0 presente inventor realizou cromatografia de gel por exclusão dos complexos AFP com N-AAP em diferentes concentrações de componentes - 1 mol AFP por 800, 1600 e 2400 moles de N-AAP, para estimativa da capacidade máxima de ligação de AFP. Os dados obtidos indicam que a razão de AFP/N-AAP nos complexos está entre 1/100 e 1/300. Além disso, essas razões molares de AFP/N-AAP nos complexos depende das concentrações iniciais dos componentes na solução. Assim, as concentrações iniciais de 1 mol de AFP por 800 moles de N-AAP apresenta uma razão próxima à 1/100 (AFP/N-AAP) no complexo; concentrações de 1 mol de AFP por 1600 moles de N-AAP apresenta uma razão próxima à 1/200 (AFP/N- AAP) no complexo; concentrações de 1 mol de AFP por 2400 moles de N-AAP apresenta uma razão próxima à 1/300 (AFP/N-AAP) no complexo.

Exemplo 10: Síntese de N-AAP

Ácido araquidônico (152 mg, 0,5 mmol) e trietilamina (52 mg, 051 mmol) foram dissolvidos 3 ml de acetonitrila seca e resfriado para -15°C, e foi adicionado 70 mg (0,51 mmol) de butil cloroformato. Após 30 minutos, a mistura livre de hidrocloreto de trietilamina precipitado foi pipetado em uma solução de 2-aminoetanol (61 mg, 1 mmol) em 1 ml de metanol, a agitação foi continuada durante 15 minutos a -15°C, então, a mistura obtida foi deixada arrefecer até a temperatura ambiente. Após 2 horas, foi adicionado 0,5 M HCL, e a mistura foi extraída com éter (20 ml) . O extrato foi lavado, então secado com Na2S04, e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em 2 ml de clorofórmio e purificado por cromatografia em coluna (2x2 cm) em óxido de alumínio (básico, Brockmann II). A eluição da coluna com clorofórmio - metanol (9:1 v/v) e evaporação das frações apropriadas produziu 165 mg (95%) de N-araquidonoilaminoetan-2-ol) como óleo: TLC [benzeno-dioxano-ácido acético (25:5:1 v/v/v)] Rf 0,4.

Uma solução de piridinium cianoetilfosfato (2 mmol) em piridina anidra (3 ml) foi adicionada à N- acilaminoetan-2-ol. N,N'-diciclohexilcarboiimida (413 mg, 2 mmol) foi então adicionado e a mistura foi agitada à temperatura ambiente. Após 20 horas, a mistura foi resfriada para 0°C, foi adicionada água (0,5 ml) e, após agitação durante 30 minutos a temperatura ambiente, a N,N'-diciclohexiluréia precipitada foi separada pela filtração. 0 filtrado foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo obtido foi fracionado por cromatografia de coluna pequena em sílica gel. 0 desejado N-acilamino álcool fosforilado foi eluído a partir de coluna com clorofórmio - metanol(70-60:30-40, v/v) . A composição de eluados foi controlada por TLC em 60 placas de sílica gel [clorofórmio - metanol - NH3 aq. (9:7:2, v/v/v) usando um atomizado de molibdato para detectar as manchas. As frações apropriadas foram combinadas, evaporadas até a secura em vácuo e o resíduo foi dissolvido em 1 ml de tetrahidrofurano. Aquela solução foi adicionada, gota à gota durante um período de 5 minutos, resfriada (banho de gelo), agitada em 1,5 M NaOH aq. (4 ml). Após mais 25 minutos, a mistura foi acidificada com 1 N HCl para um pH de 2,3 e extraída com clorofórmio-metanol (2:1, v/v). 0 extrato foi lavado com metanol-água (10:9, v/v), concentrado sob vácuo e aplicado à uma coluna de sílica gel. 0 produto desejado foi eluído a partir de coluna com clorofórmio-metanol (30-20 : 70-80, v/v), as frações contendo substância pura manchadas em placas TLC com atomizado de molibdato foram combinadas e evaporadas até a secura para produzir 88 mg (41%) de (N-AAP): Rf 0,10-0,15 [clorofórmio-metanol]-NH3 aq. (9:7:2 v/v/v); 1H-NMR (CD3SOCD3, 200 MHz) δ 0,9-1,0 (t, 3H, (D-CH3) ; 1,3 (s, 8H, 4CH2) ; 2,0-2,4 (m, 6H, 2CH2CH=CH e CH2CO); 2,7-2,9 (br s, 6H, 3HC=CHCH2CH=CH); 3,4-3,5 (br s, 2H, CH2NH); 3,9-4,0 (br s, 2H, CH2OP); 5,2-5,4 (br s, 8H, 4HC=CH); 8,2-8,4 (m, 3H, NH e 2POH).

Exemplo 11: Determinação do peso molecular do complexo AFP humana-NAA-P

Sephacryl® S-300-HR e marcadores de peso molecular de filtração de gel, i.e., proteínas possuindo uma faixa de pesos moleculares de 29 kD a 700 kD (kit MW- GF-1000) foram comprados da Sigma Chemical Co. [5,6,8,9,11,12,1 15- 3H], o ácido araquidônico foi comprado da Amersham International, Reino Unido. Uma coluna de filtração em gel (1,0 χ 9-0 cm) com Sephacrvl® S-300-HR foi padronizada com essas proteínas como marcadores de peso molecular- Foi usado um tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 7,4) contendo 100 mM como tampão de equilíbrio no teste.

Amostras de complexos de AFP (0,5 mg) com diferentes quantidades de N-AAP (2,5 mg, 5 mg e 7,5 mg) no volume 0,5 ml foram analisadas na coluna padronizada com Sephacryl® S-300-HR. A detecção de complexos de AFP foi realizada pela medida da absorbância a 280 nm ou contagem se tiver sido incorporado rótulo radioativo [125I] na molécula AFP e [3H] na N-AAP.

Foi mostrado que os complexos de AFP e N-AAP eluem a partir de uma coluna de exclusão molecular nas posições equivalentes a essas das proteínas cujos pesos moleculares estão na faixa de 120 kD a 180 kD. Esse dado indica, consequentemente, que a proporção de AFP/N-AAP nos complexos é de cerca de 1/100 - 300 moles.

Exemplo 12: Influência do complexo de AFP de rato/N-AAP na resposta imuno humoral

AFP de rato foi isolada a partir de soro neonatal de rato. Alfa-fetoproteína IgG de soro monoespecífico anti-rato foi acoplada à Sepharose 4B (volume empacotado de 4,5 mg/ml de gel) ativada com brometo de cianogênio para produzir uma matriz de imunoafinidade.

A condição de eluição acídica foi como descrito previamente (Calvo, M., et al., J. Chromatogr. v. 328, p. 392-395, 1985). Similar à AFP humana, os complexos de AFP de rato/N-AAP revelam forte efeito na resposta imuno humoral em camundongos (exemplo 11). Assim, a quantidade relativa de AEC no quinto dia após a injeção aumentou 195% e a quantidade total de AEC aumentou 175% em comparação com a quantidade das células nos animais imunizados somente com eritrócitos de ovelha. Esses experimentos permitem esboçar uma conclusão de que ambos os complexos de AFP humana/N-AAP e complexos de AFP de rato/N-AAP poderiam ser usados como preparações terapêuticas efetivas. Poderia ser criada uma preparação análoga se usar-se AFP obtida a partir de outros animais, de cultura de célula, AFP geneticamente modificada. Deve ser necessariamente levado em consideração diversas razões: custo, disponibilidade, risco de infeções virais, possibilidades na obtenção de autorização para a produção, etc., em qualquer caso especifico.

De forma a determinar o efeito do complexo inventivo, 0,15 ml do complexo de AFP/N-AAP foi administrado intravenosamente à 10 camundongos machos de linhagem CBA (peso 18-22 g) na dose de 0, 009 mg de AFP de rato e 0,09 mg de N-AAP per capita.

Simultaneamente, foi injetado 5% de suspensão de eritrócitos de ovelha peritenealmente (0,2 ml per capita). As séries de controle foram injetadas intravenosamente com iguais volumes de solução isotônica de NaCl. O efeito do complexo de AFP de rato/N-AAP na resposta imuno humoral foi analisado pela contagem da quantidade de AFC no baco de acordo cora Cunningham (por 10^6 de células de baço e por òaço).

A quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção foi 338,8 ± 67,9 para animais de controle e 659 ± 38,4 para séries experimentais, P < 0,05. A quantidade total de AFC foi 51,2 ± 13,5'10^3 para o grupo de controle e 89,4 ± 11,8'10^3 para as séries experimentais, P < 0,05. A AFP de rato não exibe atividade imunogênica. A quantidade relativa de AFC foi 425, 1 ± 42, 1 para animais de controle e 428, 1 ± 11,5 para séries experimentais, P > 0,05. A quantidade total de AFC foi 65,4 ± 6,8'10^3 para o grupo de controle e 60,3 ± 13,5'10^3 para as séries experimentais, P > 0,05.

Assim, a quantidade relativa de AFC no quinto dia após a injeção aumentou 195% e a quantidade total de AFC aumentou 175% em comparação com a quantidade das células nos animais imunizados somente com eritrócitos de ovelha.

Exemplo 13; Estudos de toxidade

A toxidade de N-AAP foi estudada em camundongos machos de raça aleatória (19-24 g). Uma solução aquosa de N-AAP foi injetada uma vez vagarosamente na veia do rabo dos camundongos em uma faixa de dosagem de 40-70 mg/kg. Cada grupo de camundongo incluía 6 animais, ao menos. A taxação de toxidade aguda foi realizada de acordo com o método de Litchfield et. al. (Litchfield J. T., Wilcoxon F., J. Pharmacol. Exptl. Therap., vol. 96, ρ. 99-103, 1949) . A toxidade aguda de N-AAP foi mostrada ser como segue:

DL5O = 63 (54, 8 : 72, 5) mg/kg em p = 0,05;

DL10 = 4 6 mg/kg;

DL90 = 87 mg/kg;

O índice terapêutico é 10.

O presente inventor testou complexos de AFP/N-AAP nas proporções - 1/100, 1/200 e 1/300 de maneira a estimar a influência desses complexos na resposta imuno humoral em camundongos (exemplos 8-10). Todos os complexos apresentados revelam atividade biológica em todos os experimentos. O complexo AFP/N-AAP mostrou possuir um efeito mais potente na resposta imuno humoral, na proporção de 1:200 mol/mol.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a suas modalidades preferidas, que constituem o melhor modo atualmente conhecido dos inventores, deve ser entendido que várias alterações e modificações seriam óbvias a um especialista na arte, sem se afastar do escopo da invenção, a qual está determinado nas reivindicações aqui anexadas.

Claims

1. Complexo reversível de equilíbrio de alfa- fetoproteina (AFP) e um derivado de ácido graxo poli- insaturado caracterizado por o complexo conter ácido graxo araquidonoil aminoetil fosfato (N-AAP) em uma concentração no intervalo de 100 a 300 moles por mol de AFP.

2. Complexo reversível de equilíbrio de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a concentração de N-AAP ser de cerca de 200 moles por mol de AFP.

3. Complexo reversível de equilíbrio de acordo a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a AFP ser AFP humana isolada do soro do cordão umbilical de humanos.

4. Complexo reversível de equilíbrio de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para uso como um agente imunoestimulador, e.g.r para o tratamento de imunodeficiências.

5. Complexo reversível de equilíbrio de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para uso como um agente para o tratamento de imunodeficiências que ocorrem como conseqüência do tratamento de câncer, e.g., neutropenia.

6. Complexo reversível de equilíbrio de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para uso como um agente profilático em pacientes suscetíveis a infecções.

7. Preparação liofilizada caracterizado por conter um complexo reversível de equilíbrio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Solução injetável caracterizado por conter quantidades terapeuticamente eficazes de um complexo reversível de equilíbrio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Composição farmacêutica para o tratamento de imunodeficiências caracterizado por a dita composição conter como ingrediente ativo um complexo reversível de equilíbrio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.