JPH01250399A - トリグラミン、血小板凝集抑制性ポリペプチド - Google Patents
トリグラミン、血小板凝集抑制性ポリペプチドInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
■
本発明は、血小板の凝集の有効な抑制剤である低分子量
ポリペプチドであるトリグラミンに関する。
ポリペプチドであるトリグラミンに関する。
発」L例]L皿
糖蛋白質II b−■a (GPII b−GPma)
複合体と会合する特異的受容体とフィブリノーゲンとの
相互作用が血小板の凝集にとって必須であることが証明
されている。刺激されていない血小板はフィブリ/−ゲ
ンと結合せず、したがって循環系で凝集しない、血小板
がADP、エピネフリン、トロンビン又はプロスタグラ
ンジンエンドペルオキシドのようなアゴニストによって
刺激されると、GPn b−GPma複合体と会合した
フィブリノーゲン受容体が血小板表面に露出するように
なり、フィブリノーゲンと結合し、続いて血小板を凝集
させることになる。一般に説明されているのは、ADP
が生理学的条件下でのフィブリノーゲン受容体の露出に
必須の媒介物であるということである0組織の損傷中に
ADPが血小板の凝集を起させるのに十分な量で形成さ
れることが証拠により示唆されている。
複合体と会合する特異的受容体とフィブリノーゲンとの
相互作用が血小板の凝集にとって必須であることが証明
されている。刺激されていない血小板はフィブリ/−ゲ
ンと結合せず、したがって循環系で凝集しない、血小板
がADP、エピネフリン、トロンビン又はプロスタグラ
ンジンエンドペルオキシドのようなアゴニストによって
刺激されると、GPn b−GPma複合体と会合した
フィブリノーゲン受容体が血小板表面に露出するように
なり、フィブリノーゲンと結合し、続いて血小板を凝集
させることになる。一般に説明されているのは、ADP
が生理学的条件下でのフィブリノーゲン受容体の露出に
必須の媒介物であるということである0組織の損傷中に
ADPが血小板の凝集を起させるのに十分な量で形成さ
れることが証拠により示唆されている。
シー、オーヤン(c 、 o u y a n g)及
びティー、ハン(T、Huang)の両氏は、バイオシ
ミカ暑二〇バイオフィジカ・アクタ(B i o c
him、Biophy、Acta)757、p、332
〜341 (1983)において、アオハブ(Trim
eresurus gramineuS)の毒液から
得られた血小板凝集抑制性物質の粗製の製剤を報告して
いる。この物質は、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過によって単離される。アスパラギン酸、グルタ
ミン酸及びシスティンに富む酸性ホスホリパーゼAとし
て記載された。また、オーヤン氏らは、5DS−ポリア
クリルアミドゲルTi電気泳動及び円板式電気泳動によ
ってその製剤中に12.4kdの単一バンドを同定した
。さらに、彼らは109個のアミノ酸残基を基にして1
1.682の推定最小分子量を報告している。
びティー、ハン(T、Huang)の両氏は、バイオシ
ミカ暑二〇バイオフィジカ・アクタ(B i o c
him、Biophy、Acta)757、p、332
〜341 (1983)において、アオハブ(Trim
eresurus gramineuS)の毒液から
得られた血小板凝集抑制性物質の粗製の製剤を報告して
いる。この物質は、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過によって単離される。アスパラギン酸、グルタ
ミン酸及びシスティンに富む酸性ホスホリパーゼAとし
て記載された。また、オーヤン氏らは、5DS−ポリア
クリルアミドゲルTi電気泳動及び円板式電気泳動によ
ってその製剤中に12.4kdの単一バンドを同定した
。さらに、彼らは109個のアミノ酸残基を基にして1
1.682の推定最小分子量を報告している。
しかし、オーヤン氏らの因子の有効性にもかかわらず、
この物質のホスホリパーゼA活性は、赤血球に対するホ
スホリパーゼAの溶血作用のために、該物質を臨床的に
使用することを不適当にしている。さらに、純粋でない
物質は原料の毒液に由来する1種以上の汚染性毒素を含
有するかもしれない、ヘビ溝中に見出されるある種の毒
素がナノグラム量でヒトに対して毒性であることが知ら
れている。
この物質のホスホリパーゼA活性は、赤血球に対するホ
スホリパーゼAの溶血作用のために、該物質を臨床的に
使用することを不適当にしている。さらに、純粋でない
物質は原料の毒液に由来する1種以上の汚染性毒素を含
有するかもしれない、ヘビ溝中に見出されるある種の毒
素がナノグラム量でヒトに対して毒性であることが知ら
れている。
魚」LのJ[眉
本発明者は、オーヤン氏らにより主張された109個の
アミノ酸からなる蛋白質が実際の血小板凝集抑制因子を
含有する純粋でない混合物にすぎないことを見出した。
アミノ酸からなる蛋白質が実際の血小板凝集抑制因子を
含有する純粋でない混合物にすぎないことを見出した。
本発明者は、アオハブからホスホリパーゼA汚染物を含
まない実買上純粋な化学的形態で血小板凝集抑制因子を
得た。この活性な血小板凝集抑制因子(これはトリグラ
ミン(trigramin)と命名された)は、化学的
均一性まで精製された。
まない実買上純粋な化学的形態で血小板凝集抑制因子を
得た。この活性な血小板凝集抑制因子(これはトリグラ
ミン(trigramin)と命名された)は、化学的
均一性まで精製された。
実質上純粋な化学的形態のトリグラミンは、次のアミノ
酸配列 EAGEDCDCGSPANPCCDAATCKLI
PGAQCGEGLCCDQC3FIEEGTVCRI
ARGDDLDDYCNGR3AGCPRNPFH (ここで、アミノ酸についての記号は、下記のような認
められた生化学的意味を有する。
酸配列 EAGEDCDCGSPANPCCDAATCKLI
PGAQCGEGLCCDQC3FIEEGTVCRI
ARGDDLDDYCNGR3AGCPRNPFH (ここで、アミノ酸についての記号は、下記のような認
められた生化学的意味を有する。
u 7二二盈1]
K リジン
Hヒスチジン
Rアルギニン
D アスパラギン酸
N アスパラギン
T スレオニン
S セリン
E グルタミン酸
Q グルタミン
P プロリン
G グリシン
A アラニン
Cハーフシスチン
V バリン
M メチオニン
■ インロイシン
L ロイシン
Y チロシン
F フェニルアラニン
W トリプトファン )
を有する72個のアミノ酸よりなるポリペプチドである
。
。
また1本発明は、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発
された凝集を抑制するための、ホスホリパーゼA汚染物
を実質上台まないトリグラミンの製剤に関する。
された凝集を抑制するための、ホスホリパーゼA汚染物
を実質上台まないトリグラミンの製剤に関する。
また1本発明は、ヒト血小板に対するフィブリノーゲン
の結合を抑制しかつヒト血小板のフィブリノーゲンで誘
発される凝集を抑制するための方法に係る。この方法に
よれば、ヒト血小板は実質上純粋な化学的形態でトリグ
ラミンを含有する製剤とインキュベートされる。したが
って、トリグラミンは、ヒトの血流中での血小板凝集の
発生を抑制するためヒトに投与することができる。
の結合を抑制しかつヒト血小板のフィブリノーゲンで誘
発される凝集を抑制するための方法に係る。この方法に
よれば、ヒト血小板は実質上純粋な化学的形態でトリグ
ラミンを含有する製剤とインキュベートされる。したが
って、トリグラミンは、ヒトの血流中での血小板凝集の
発生を抑制するためヒトに投与することができる。
、 ″ 1
トリグラミンは次のように精製される。まず、オーヤン
氏らの方法(前記のBiochim、Biophys、
Acta757、p、332〜341(1983))に
従ってホスホリパーゼA活性を宥するa調製物を得る0
次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC
)によってトリグラミンを化学的均一性まで最終精製す
る。
氏らの方法(前記のBiochim、Biophys、
Acta757、p、332〜341(1983))に
従ってホスホリパーゼA活性を宥するa調製物を得る0
次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC
)によってトリグラミンを化学的均一性まで最終精製す
る。
11叛iユIJ
アオハブ(Trimeresurus gramfn
eus)の毒液を集め、遠心分離し、凍結乾燥し、無水
CaC1zを入れたデシケータ内に一20℃で貯蔵する
。この毒液をまず次のようにDEAEセファデックスA
−50カラムクロマトグラフイーによって12個の両分
に分離する。
eus)の毒液を集め、遠心分離し、凍結乾燥し、無水
CaC1zを入れたデシケータ内に一20℃で貯蔵する
。この毒液をまず次のようにDEAEセファデックスA
−50カラムクロマトグラフイーによって12個の両分
に分離する。
DEAE−セフ デークスA−50カラム ロマトグラ
フ −: DEAE−セファデックスA−50を充填し
たカラム(3,2X100cm)に毒液1gを入れる。
フ −: DEAE−セファデックスA−50を充填し
たカラム(3,2X100cm)に毒液1gを入れる。
混合容器中の0.005M酢酸アンモニウム(pHはア
ンモニア水溶液により8.0に調節する)1000m見
及び受器中の0.25M酢酸アンモニウム(pHは氷酢
酸により6.0に調節する)looomJLによってS
−段階の勾配溶離を行う0次いで、混合容器中の0.2
5M酢酸アンモニウム(pH6,0)800ml及び受
器中の1M酢酸アンモニウム(pH5,2)1000m
見によって第二段階の勾配溶離を行う、流量を16〜1
8m交/hに調節し、試験管1本当り6 m lの溶出
液を集める。流出物は分光光度計(例えば、LKB社製
のrLKBUvicordJ)によって278nm及び
5℃で連続的にモニターする。
ンモニア水溶液により8.0に調節する)1000m見
及び受器中の0.25M酢酸アンモニウム(pHは氷酢
酸により6.0に調節する)looomJLによってS
−段階の勾配溶離を行う0次いで、混合容器中の0.2
5M酢酸アンモニウム(pH6,0)800ml及び受
器中の1M酢酸アンモニウム(pH5,2)1000m
見によって第二段階の勾配溶離を行う、流量を16〜1
8m交/hに調節し、試験管1本当り6 m lの溶出
液を集める。流出物は分光光度計(例えば、LKB社製
のrLKBUvicordJ)によって278nm及び
5℃で連続的にモニターする。
毒液は、前記のDEAE−セファデックスA−50カラ
ムによって12個の両分に分離される。
ムによって12個の両分に分離される。
第一段階の勾配溶離では8個の画分が得られ、他の4f
lの両分は第二段階の溶離で得られた0次いで画分12
を次のようにセファデックスG−75カラムで再分別す
る。
lの両分は第二段階の溶離で得られた0次いで画分12
を次のようにセファデックスG−75カラムで再分別す
る。
セフ デークスG−75クロマトグラフ −:このカラ
ムは0.005M重炭酸アンモニウム(pH7,8)中
で調製されたセファデックスよりなる。カラムの大きさ
は毒液の量に従う、セファデックスG−75カラムから
の溶離を0.005M重炭酸アンモニウムで行う、流量
は18m見/hに調節する。試験管1本当り3m文の溶
出液を集める。
ムは0.005M重炭酸アンモニウム(pH7,8)中
で調製されたセファデックスよりなる。カラムの大きさ
は毒液の量に従う、セファデックスG−75カラムから
の溶離を0.005M重炭酸アンモニウムで行う、流量
は18m見/hに調節する。試験管1本当り3m文の溶
出液を集める。
セフ −−クスG−50クロマトグラフ −:セファデ
ックスG−75カラムからの三番目の副次画分であって
、トロンビン(0,IU/mJL)によって誘発される
血小板凝集に対して活性を持っている両分をセファデッ
クスG−50で単一ピークが得られるまで3回再分別す
る。溶離剤として重炭酸アンモニウム(0,005M、
pH7゜8)を使用する。得られた粗製物質を次のよう
にしてさらに精製する。
ックスG−75カラムからの三番目の副次画分であって
、トロンビン(0,IU/mJL)によって誘発される
血小板凝集に対して活性を持っている両分をセファデッ
クスG−50で単一ピークが得られるまで3回再分別す
る。溶離剤として重炭酸アンモニウム(0,005M、
pH7゜8)を使用する。得られた粗製物質を次のよう
にしてさらに精製する。
−−一 で トリグラミン
大きい細孔のC−18シリカマトリツクス(例えば、r
Vydac TPRPJ 、ザセパレーションズ・グ
ループ社、ヘスバリア、Ca)を入れた高性能液体クロ
マトグラフィーカラム(250X4.6mm)を0.1
%トリプルオル酢酸中で20℃で平衡化させる0次いで
、上で調製した粗製物質150pgを0.15M N
aC1200g1に加えたものを上記カラムに1.0m
JL/ m t nの流量で注入する。カラムを3分間
洗浄する。0〜55%アセトニトリルの勾配を用いて5
0分間にわたり両分を溶離する。37分間の保持時間の
後に溶出する第一成分は、ホスホリパーゼA活性のない
純粋なトリグラミンを含む、精製された物質の均一性は
銀添加物(lpg)を用いた5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって確認される。トリグラミンは、
20%ゲル上で、約9kdの見かけ分子量の単一バンド
として現れる。
Vydac TPRPJ 、ザセパレーションズ・グ
ループ社、ヘスバリア、Ca)を入れた高性能液体クロ
マトグラフィーカラム(250X4.6mm)を0.1
%トリプルオル酢酸中で20℃で平衡化させる0次いで
、上で調製した粗製物質150pgを0.15M N
aC1200g1に加えたものを上記カラムに1.0m
JL/ m t nの流量で注入する。カラムを3分間
洗浄する。0〜55%アセトニトリルの勾配を用いて5
0分間にわたり両分を溶離する。37分間の保持時間の
後に溶出する第一成分は、ホスホリパーゼA活性のない
純粋なトリグラミンを含む、精製された物質の均一性は
銀添加物(lpg)を用いた5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって確認される。トリグラミンは、
20%ゲル上で、約9kdの見かけ分子量の単一バンド
として現れる。
このHPLCで精製されたトリグラミンのアミノ醸配列
は、この物質をピリジルエチル化してシスティン残基を
S−ピリジルエチルシスティン(エドマン分解中に安定
なシスティン誘導体)に転化した後に決定される。その
ままのS−ピリジルエチルトリグラミンをNH2−末端
配列決定処理に付すが、これは35個の明瞭な残基を生
じる。さらに、キモトリプシン、トリプシン及びスタフ
ィロコッカス・オウレウス(S、aureus)V8プ
ロテアーゼによるS−ピリジルエチルトリグラミンの慎
重な蛋白質加水分解によって配列決定を行い、さらに個
々に分離された解裂断片の配列決定を行う、このように
して、トリグラミンの72個のアミノ酸残基についての
完全な配列が得られた。
は、この物質をピリジルエチル化してシスティン残基を
S−ピリジルエチルシスティン(エドマン分解中に安定
なシスティン誘導体)に転化した後に決定される。その
ままのS−ピリジルエチルトリグラミンをNH2−末端
配列決定処理に付すが、これは35個の明瞭な残基を生
じる。さらに、キモトリプシン、トリプシン及びスタフ
ィロコッカス・オウレウス(S、aureus)V8プ
ロテアーゼによるS−ピリジルエチルトリグラミンの慎
重な蛋白質加水分解によって配列決定を行い、さらに個
々に分離された解裂断片の配列決定を行う、このように
して、トリグラミンの72個のアミノ酸残基についての
完全な配列が得られた。
トリグラミンは、G P II b −G P m a
複合体と会合した血小板上のフィブリノーゲン受容体(
この受容体はADPによって露出する)に対するフィブ
リノーゲンの結合を特異的にかつ競争的に抑制すること
によって血小板の凝集を抑制する。
複合体と会合した血小板上のフィブリノーゲン受容体(
この受容体はADPによって露出する)に対するフィブ
リノーゲンの結合を特異的にかつ競争的に抑制すること
によって血小板の凝集を抑制する。
さらに、トリグラミンは、フィブリノーゲンと一緒にな
って血小板を凝集させ又は表面に粘着させるホンウィル
ブランド因子(yon Willebrand f
actor)の結合を抑制する。
って血小板を凝集させ又は表面に粘着させるホンウィル
ブランド因子(yon Willebrand f
actor)の結合を抑制する。
本発明者の実験は、トリグラミンがGPIIb−GP[
na複合体に特異的に結合すること並びにトリグラミン
が該複合体と会合した受容体に対するフィブリノーゲン
及びホンウィルブランド因子の結合を競争的に妨げるこ
とを立証するものである。
na複合体に特異的に結合すること並びにトリグラミン
が該複合体と会合した受容体に対するフィブリノーゲン
及びホンウィルブランド因子の結合を競争的に妨げるこ
とを立証するものである。
下記の実験は、トリグラミンが血小板に対するフィブリ
ノーゲンの結合を抑制できることを例示する。マスター
ド(Mustard)氏らの方法(プリティシュ、ジャ
ーナル、オブ、ヘマトロジ−(Brtt 、J、Hae
mat 、 22.p。
ノーゲンの結合を抑制できることを例示する。マスター
ド(Mustard)氏らの方法(プリティシュ、ジャ
ーナル、オブ、ヘマトロジ−(Brtt 、J、Hae
mat 、 22.p。
193〜204(1972))に従って、洗浄されたヒ
ト血小板懸濁液を調製し、これを3.5mg/mlのウ
シ血清アルブミン(シグマ、フラクションV)を含有す
るチロイドのフルブミン溶液(pH7,35)に懸濁さ
せた。この血小板懸濁液(約5X10雲個の血小板7m
文)の420終愛に1jゞニーフイブリノーゲンio#
uを添加した。この懸濁液にある一定量のトリグラミン
を添加し、次いで3分後にADPIOpiを添加した(
最終濃度10ILモル)、ADPを添加した後。
ト血小板懸濁液を調製し、これを3.5mg/mlのウ
シ血清アルブミン(シグマ、フラクションV)を含有す
るチロイドのフルブミン溶液(pH7,35)に懸濁さ
せた。この血小板懸濁液(約5X10雲個の血小板7m
文)の420終愛に1jゞニーフイブリノーゲンio#
uを添加した。この懸濁液にある一定量のトリグラミン
を添加し、次いで3分後にADPIOpiを添加した(
最終濃度10ILモル)、ADPを添加した後。
血小板懸濁液をさらに約10分間ゆっくりと振盪し、イ
ンキニーベートした0次いで、この血小板懸濁液の40
0klをエッペンドルフ遠心機において15,0OOG
でシリコーンオイルを通して遠心分離した。血小板球に
結合した125I−フィブリノーゲンの量を測定した。
ンキニーベートした0次いで、この血小板懸濁液の40
0klをエッペンドルフ遠心機において15,0OOG
でシリコーンオイルを通して遠心分離した。血小板球に
結合した125I−フィブリノーゲンの量を測定した。
フィブリノーゲンの非特異的結合を6mM EDTA
の存在下で測定した。これによりフィブリノーゲンの結
合のIC,。
の存在下で測定した。これによりフィブリノーゲンの結
合のIC,。
、即ち50%抑制率を決定した。
第1図は、トリグラミンの不存在下(○−O)又は存在
下(0,51Lg/mJl、ローロ;1.Ogg/ml
、ムーム)での、lOルモルADPにより刺激されたヒ
ト血小板に対するu9x−フィブリノーゲンの結合の二
重逆数プロットである。
下(0,51Lg/mJl、ローロ;1.Ogg/ml
、ムーム)での、lOルモルADPにより刺激されたヒ
ト血小板に対するu9x−フィブリノーゲンの結合の二
重逆数プロットである。
第1図に示すように、トリグラミンは、ADP(10終
モル)で刺激された血小板に対する+2に■−2イブリ
ノーゲンの結合を濃度に依存する形で2.8〜5.6X
101MのICff6でもって抑制した。このデータは
、2 X 10”” Mの抑制定数Kiでもってトリグ
ラミンの競争的抑制機構と一致する。
モル)で刺激された血小板に対する+2に■−2イブリ
ノーゲンの結合を濃度に依存する形で2.8〜5.6X
101MのICff6でもって抑制した。このデータは
、2 X 10”” Mの抑制定数Kiでもってトリグ
ラミンの競争的抑制機構と一致する。
また、トリグラミンは、α−キモトリプシンで処理した
血小板に対する+zj;x−フィブリノーゲンの結合を
l 、 I X 10−” MのIC,。でもって抑制
することが認められ、したがって露出したフィブリノー
ゲン受容体に対する直接的効果を示している(データは
示さない)、減少した量(2X10−6M)のトリグラ
ミンはADPで刺激された血小板に対する′2ゝI−フ
ィブリノーゲンの結合を抑制しなかった(データは示さ
ない)。
血小板に対する+zj;x−フィブリノーゲンの結合を
l 、 I X 10−” MのIC,。でもって抑制
することが認められ、したがって露出したフィブリノー
ゲン受容体に対する直接的効果を示している(データは
示さない)、減少した量(2X10−6M)のトリグラ
ミンはADPで刺激された血小板に対する′2ゝI−フ
ィブリノーゲンの結合を抑制しなかった(データは示さ
ない)。
下記の実験は、ADPで刺激された血小板及びキモトリ
プシンで処理した血小板の血小板凝集の抑制にトリグラ
ミンが有効であることを立証する。血小板懸濁液を前記
のように調製した。α−キモトリプシン(シグマ、等級
Is)で処理した血小板は、コルネスキ−(Korne
cki)氏らにより、ジャーナル・バイオロジカルQケ
ミスト リ − (J、Biol、Chem、258
、 p 。
プシンで処理した血小板の血小板凝集の抑制にトリグラ
ミンが有効であることを立証する。血小板懸濁液を前記
のように調製した。α−キモトリプシン(シグマ、等級
Is)で処理した血小板は、コルネスキ−(Korne
cki)氏らにより、ジャーナル・バイオロジカルQケ
ミスト リ − (J、Biol、Chem、258
、 p 。
9349〜9356 (1983))に記載のように調
製した。ただし、この場合の血小板とキモトリプシンと
のインキュベーション時間は45分から20分に短縮し
た。
製した。ただし、この場合の血小板とキモトリプシンと
のインキュベーション時間は45分から20分に短縮し
た。
種々の薬量のトリグラミン(0,25〜5.0gg/m
文)を血小板懸濁液(3XIO”個の血小板7m文)4
20牌見に添加した。1分間後に10ル見のADP(1
0gモル)及び10終文のフィブリノーゲン(200p
g)を添加して血小板の凝集を開始させた。また、キモ
トリプシンで処理した血小板の凝集を誘発させるためフ
ィブリノーゲンのみ(ADPは用いない)を用いる上記
と同じ操作を行った。それぞれの系における血小板凝集
の程度をポーン(B o r n)氏らによりジャーナ
ル・オブ・フィジオロジ−(J、Ph7sio1.(L
ond、))168、p、178〜195 (1963
)に記載の濁度測定法によって37℃で測定した。AD
Pで刺激された血小板の凝集のトリグラミンによる抑制
のIC,。値 は1 、3 X 10−’ Mであった
。キモトリプシンで処理した血小板のトリグラミンによ
る抑制のIC,。
文)を血小板懸濁液(3XIO”個の血小板7m文)4
20牌見に添加した。1分間後に10ル見のADP(1
0gモル)及び10終文のフィブリノーゲン(200p
g)を添加して血小板の凝集を開始させた。また、キモ
トリプシンで処理した血小板の凝集を誘発させるためフ
ィブリノーゲンのみ(ADPは用いない)を用いる上記
と同じ操作を行った。それぞれの系における血小板凝集
の程度をポーン(B o r n)氏らによりジャーナ
ル・オブ・フィジオロジ−(J、Ph7sio1.(L
ond、))168、p、178〜195 (1963
)に記載の濁度測定法によって37℃で測定した。AD
Pで刺激された血小板の凝集のトリグラミンによる抑制
のIC,。値 は1 、3 X 10−’ Mであった
。キモトリプシンで処理した血小板のトリグラミンによ
る抑制のIC,。
値は2 、8 X l 01Mであった。データを第2
図に示す、第2図は、ADPで刺激された血小板(Δ−
Δ)又はキモトリプシン(CT)で処理した血小板(0
−0)のフィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対
するトリグラミンの濃度に依存する抑制効果をプロット
したものである。200 #Lg / m Jlのフィ
ブリノーゲン及び10JLモルのADPを使用した、各
データの点は、少なくとも5回の実験の平均を表す。
図に示す、第2図は、ADPで刺激された血小板(Δ−
Δ)又はキモトリプシン(CT)で処理した血小板(0
−0)のフィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対
するトリグラミンの濃度に依存する抑制効果をプロット
したものである。200 #Lg / m Jlのフィ
ブリノーゲン及び10JLモルのADPを使用した、各
データの点は、少なくとも5回の実験の平均を表す。
キモトリプシンで処理した血小板は表面上に露出したフ
ィブリノーゲン受容体を有するのでそれらがフィブリノ
ーゲンと直接相互作用することが知られている。特定の
理論にしばられることを欲しないが、キモトリプシンで
処理した血小板のフィブリノーゲンで誘発された凝集に
対するトリグラミンの抑制効果は、トリグラミンが血小
板膜上のフィブリノーゲン受容体と直接相互作用するこ
とを示している。
ィブリノーゲン受容体を有するのでそれらがフィブリノ
ーゲンと直接相互作用することが知られている。特定の
理論にしばられることを欲しないが、キモトリプシンで
処理した血小板のフィブリノーゲンで誘発された凝集に
対するトリグラミンの抑制効果は、トリグラミンが血小
板膜上のフィブリノーゲン受容体と直接相互作用するこ
とを示している。
また、トリグラミンは、安定なプロスタグランジンエン
ドペルオキシド類似体である9、11ジデオキシ−9,
11−メタノエポキシ−PGFz−α(2,51Lモル
)及びトロンビン(0,5ユニー/ ) / m l
)により誘発される血小板凝集を濃度に依存する形で抑
制した。
ドペルオキシド類似体である9、11ジデオキシ−9,
11−メタノエポキシ−PGFz−α(2,51Lモル
)及びトロンビン(0,5ユニー/ ) / m l
)により誘発される血小板凝集を濃度に依存する形で抑
制した。
さらに、血小板に富む血漿中では、トリグラミンは、A
DP(10uLモル)、エピネフリン(50ILモル)
、9.11−ジデオキシ−9,11−メタノエポキシ−
PGFz−α(2,5ルモル)及びアラキドン酸ナトリ
ウム(200−モル)によりそれぞれ誘発される血小板
凝集を2〜4XlO−’ MのICi、値でもって抑制
した。
DP(10uLモル)、エピネフリン(50ILモル)
、9.11−ジデオキシ−9,11−メタノエポキシ−
PGFz−α(2,5ルモル)及びアラキドン酸ナトリ
ウム(200−モル)によりそれぞれ誘発される血小板
凝集を2〜4XlO−’ MのICi、値でもって抑制
した。
ヒト血小板に対するurエニートリグラミンの結合と7
2ゝI−フィブリノーゲンの結合との間にはいくつかの
類似性が存在する0両リガンドの結合は、EDTAによ
り; GPII b−GPma複合体と相1作用するモ
ノクロナール抗体(コラ−(CotIer)氏、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J
、Cl1n、Invest、)76、p、101−10
8 (1985)及びペンネット(Bennett)氏
ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−滲オプーサイエンス・才ブ・ザ・USA(Pro
c、Nat 1.Acad、sci、U、s。
2ゝI−フィブリノーゲンの結合との間にはいくつかの
類似性が存在する0両リガンドの結合は、EDTAによ
り; GPII b−GPma複合体と相1作用するモ
ノクロナール抗体(コラ−(CotIer)氏、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J
、Cl1n、Invest、)76、p、101−10
8 (1985)及びペンネット(Bennett)氏
ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−滲オプーサイエンス・才ブ・ザ・USA(Pro
c、Nat 1.Acad、sci、U、s。
A)1副、p、2417〜2421 (1983))
により;フィブリノーゲン分子上の推定血小板結合個所
を表わす合成ペプチドArg−Gly−ASP−5er
(ガードナー(Gartner)ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル−ケミ ス ト リ − (
J 、Bi o l 、Chem、)
260、p、11891−11894(1985
)及びプロ (Plow)氏ら、同上Proc、Nat
I 、Acad、Sci 、U、S、A、82゜p、
8057〜8061 (1985))により;γ−釦の
C末端部分のチロシルペンタデカペプチド Gl
y−Gin−Gin−His−His −Leu−G
ly−Gly−Ala−Lys−Gln−A 1 a−
G l y−As p−Va l (クロツェヴイアク
(Kloczewiak)氏ら、バイオケ ミ ス
ト リ −(Biochemistry)
2旦、P、1767〜1774 (1984))に
よりそれぞれ抑制される。トリグラミンもフィブリノー
ゲンもグランラマン氏血小板無力症の患者の血小板に十
分に結合することは認められなかった。これらの患者は
GPIIb−GPma複合体が不足している。フィブリ
ノーゲンは休眠している血小板に対しては結合せず、し
たがってADPによるか又は蛋白質加水分解酵素処理に
よる血小板の刺激がフィブリノーゲン結合個所を露出さ
せるための要件である。他方、休眠している血小板。
により;フィブリノーゲン分子上の推定血小板結合個所
を表わす合成ペプチドArg−Gly−ASP−5er
(ガードナー(Gartner)ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル−ケミ ス ト リ − (
J 、Bi o l 、Chem、)
260、p、11891−11894(1985
)及びプロ (Plow)氏ら、同上Proc、Nat
I 、Acad、Sci 、U、S、A、82゜p、
8057〜8061 (1985))により;γ−釦の
C末端部分のチロシルペンタデカペプチド Gl
y−Gin−Gin−His−His −Leu−G
ly−Gly−Ala−Lys−Gln−A 1 a−
G l y−As p−Va l (クロツェヴイアク
(Kloczewiak)氏ら、バイオケ ミ ス
ト リ −(Biochemistry)
2旦、P、1767〜1774 (1984))に
よりそれぞれ抑制される。トリグラミンもフィブリノー
ゲンもグランラマン氏血小板無力症の患者の血小板に十
分に結合することは認められなかった。これらの患者は
GPIIb−GPma複合体が不足している。フィブリ
ノーゲンは休眠している血小板に対しては結合せず、し
たがってADPによるか又は蛋白質加水分解酵素処理に
よる血小板の刺激がフィブリノーゲン結合個所を露出さ
せるための要件である。他方、休眠している血小板。
ADPで刺激された血小板及びキモトリプシンで処理し
た血小板上のトリグラミン結合個所の数は類似しており
、ADPによって露出したフィブリノーゲン結合個所の
総数の50%にもなる。
た血小板上のトリグラミン結合個所の数は類似しており
、ADPによって露出したフィブリノーゲン結合個所の
総数の50%にもなる。
ADPで刺激された血小板に対する11ゝI−)リグラ
ミンの結合親和性は、解離定数に基づいて判断すると、
ADPで刺激された血小板に対するハ9I−フィブリノ
ーゲンの結合親和性よりもほぼ15倍大きい、したがっ
て、モノクロナール抗体及び合成ペプチドの双方とも、
血小板に対するフィブリノーゲンの結合をADPで刺激
された血小板に対するトリグラミンの結合よりも有効に
抑制することが認められた。ADPで刺激された血小板
に対するトリグラミンの結合親和性はモノクロナール抗
体の結合親和性と類似している。それは血小板に対する
合成ペプチドの結合親和性よりも数倍大きい。
ミンの結合親和性は、解離定数に基づいて判断すると、
ADPで刺激された血小板に対するハ9I−フィブリノ
ーゲンの結合親和性よりもほぼ15倍大きい、したがっ
て、モノクロナール抗体及び合成ペプチドの双方とも、
血小板に対するフィブリノーゲンの結合をADPで刺激
された血小板に対するトリグラミンの結合よりも有効に
抑制することが認められた。ADPで刺激された血小板
に対するトリグラミンの結合親和性はモノクロナール抗
体の結合親和性と類似している。それは血小板に対する
合成ペプチドの結合親和性よりも数倍大きい。
また、本発明者は、10−” Mの濃度でのトリグラミ
ンがトロンビンで刺激されたヒト血小板に対する高度に
精製されたホンウィルブランド因子の結合を特異的に妨
げることを立証した。第5図は、トロンビン(o、su
/m見)で刺激された血小板に対するl2rI−ホンウ
ィルブランド因子の結合に及ぼすトリグラミンの効果を
示す、第5図は、トロンビン(0,5U/mJL)で活
性化された血小板(○−○)及びリストセチン(0,7
5m g / m l )で誘発された血小板(ローロ
)に対する12ゞI−ホンウィルブランド因子(VWF
)の結合のトリグラミンによる抑制率をプロットしたも
のである。ホンウィルブランド因子の最終濃度は5 p
−g/rniであった。ホンウィルブランド因子の全特
異的結合量は対照側試料において380±55 n g
/ 10 ”血小板であった。これに対して、トリグ
ラミンは、リストセチン(0,75mg/m文)で刺激
された血小板に対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げない(対照例、754f140ng/10”血小板
)、ホンウィルブランド因子がトロンビンで刺激された
血小板上のGPIrb−GPma複合体及びリストセチ
ンで刺激された血小板上のGPIbに対して結合するこ
とは周知である。したがって、本発明者は、トリグラミ
ンがGPIbに対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げないものと結論する。
ンがトロンビンで刺激されたヒト血小板に対する高度に
精製されたホンウィルブランド因子の結合を特異的に妨
げることを立証した。第5図は、トロンビン(o、su
/m見)で刺激された血小板に対するl2rI−ホンウ
ィルブランド因子の結合に及ぼすトリグラミンの効果を
示す、第5図は、トロンビン(0,5U/mJL)で活
性化された血小板(○−○)及びリストセチン(0,7
5m g / m l )で誘発された血小板(ローロ
)に対する12ゞI−ホンウィルブランド因子(VWF
)の結合のトリグラミンによる抑制率をプロットしたも
のである。ホンウィルブランド因子の最終濃度は5 p
−g/rniであった。ホンウィルブランド因子の全特
異的結合量は対照側試料において380±55 n g
/ 10 ”血小板であった。これに対して、トリグ
ラミンは、リストセチン(0,75mg/m文)で刺激
された血小板に対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げない(対照例、754f140ng/10”血小板
)、ホンウィルブランド因子がトロンビンで刺激された
血小板上のGPIrb−GPma複合体及びリストセチ
ンで刺激された血小板上のGPIbに対して結合するこ
とは周知である。したがって、本発明者は、トリグラミ
ンがGPIbに対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げないものと結論する。
特定の理論にしばられることを欲しないが、トリグラミ
ンはGPITb−GPma複合体におけるフィブリノー
ゲンの領分と同じ領分に結合し得るか、又はフィブリノ
ーゲン受容体の領分に極めて近接して結合し得る。
ンはGPITb−GPma複合体におけるフィブリノー
ゲンの領分と同じ領分に結合し得るか、又はフィブリノ
ーゲン受容体の領分に極めて近接して結合し得る。
また、本発明者は、トリグラミンとGPma及びビトロ
ネクチン受容体を含有する黒色腫細胞との間の相互作用
を確認した。トリグラミンは、フィブロネクチンで覆わ
れた基質に対する該細胞の付着を妨げ、細胞の拡がりを
抑制する。この試験では、0.2nモルのトリグラミン
の生物活性はペプチドであるグリシン−アルギニン−グ
リシン−アスパラギン酸−セリン(GRGDS)の10
0nモルに相当した。この確認は、マウスにおける黒色
細胞線の転移をGRGDSにより抑止するためのハンフ
リーズ(Humphries)氏らの成功した努力(サ
イエンス(Science)233、p、467〜47
0)に鑑みて興味がある。
ネクチン受容体を含有する黒色腫細胞との間の相互作用
を確認した。トリグラミンは、フィブロネクチンで覆わ
れた基質に対する該細胞の付着を妨げ、細胞の拡がりを
抑制する。この試験では、0.2nモルのトリグラミン
の生物活性はペプチドであるグリシン−アルギニン−グ
リシン−アスパラギン酸−セリン(GRGDS)の10
0nモルに相当した。この確認は、マウスにおける黒色
細胞線の転移をGRGDSにより抑止するためのハンフ
リーズ(Humphries)氏らの成功した努力(サ
イエンス(Science)233、p、467〜47
0)に鑑みて興味がある。
血小板の凝集を抑制するため慣用されている方法は、血
小板の刺激を抑制することに頼っている。他方、トリグ
ラミンは、血小板の凝集を起させるフィブリノーゲンの
結合の直接的な競争的抑制剤トシテ作用する。GPrl
b−GPma複合体に対するモノクロナール抗体は可
能性ある血小板凝集抑制剤であるが、モノクロナール抗
体は非常に大きい分子である。これらは一般に180k
d又はそれ以上の分子量を有する。このような分子、特
にネズミに由来するモノクロナール抗体はヒトにおける
免疫原であることが知られている。
小板の刺激を抑制することに頼っている。他方、トリグ
ラミンは、血小板の凝集を起させるフィブリノーゲンの
結合の直接的な競争的抑制剤トシテ作用する。GPrl
b−GPma複合体に対するモノクロナール抗体は可
能性ある血小板凝集抑制剤であるが、モノクロナール抗
体は非常に大きい分子である。これらは一般に180k
d又はそれ以上の分子量を有する。このような分子、特
にネズミに由来するモノクロナール抗体はヒトにおける
免疫原であることが知られている。
他方、トリグラミンは分子量が8kdの比較的小さいポ
リペプチドである。したがって、トリグラミンは、モノ
クロナール抗体よりもはるかに免疫原性が少ないことが
期待される。さらに、GPllb−GPma複合体に対
するフィブリノーゲンの結合を競争的に抑制させる際の
トリグラミンの作用は非常に特異的である。トリグラミ
ンは、免疫原性を伴なうことなくモノクロナール抗体の
特異的な領分及び高い結合親和性を持っている。
リペプチドである。したがって、トリグラミンは、モノ
クロナール抗体よりもはるかに免疫原性が少ないことが
期待される。さらに、GPllb−GPma複合体に対
するフィブリノーゲンの結合を競争的に抑制させる際の
トリグラミンの作用は非常に特異的である。トリグラミ
ンは、免疫原性を伴なうことなくモノクロナール抗体の
特異的な領分及び高い結合親和性を持っている。
また、トリグラミンは、止血性血小板栓塞の形成の抑制
を望むいかなる状況においても投与することができる。
を望むいかなる状況においても投与することができる。
トリグラミンは循環系から迅速に除去されるものと思わ
れる。トリグラミンは、有効性持続時間が短い強力な血
液凝固防止剤が必要である状況において血小板凝集を抑
制するのに特に有用である。したがって、トリグラミン
は、動脈や臓器の取扱い並びに血小板と人工表面との相
互作用が血小板の凝集及び消耗を生じさせるような末梢
動脈の手術(動脈の接合)及び心臓血管手術において有
用であろう、凝集した血小板は血栓塞栓症を形成させる
恐れがある。トリグラミンはこれらの外科患者に対して
血小板の消耗を防ぐため投与することができる。
れる。トリグラミンは、有効性持続時間が短い強力な血
液凝固防止剤が必要である状況において血小板凝集を抑
制するのに特に有用である。したがって、トリグラミン
は、動脈や臓器の取扱い並びに血小板と人工表面との相
互作用が血小板の凝集及び消耗を生じさせるような末梢
動脈の手術(動脈の接合)及び心臓血管手術において有
用であろう、凝集した血小板は血栓塞栓症を形成させる
恐れがある。トリグラミンはこれらの外科患者に対して
血小板の消耗を防ぐため投与することができる。
体外の血液循環は、血液に酸素を付与するために心臓血
管手術に日常的に使用されている。血小板は体外の循環
回路の表面に粘着する。この粘着は、血小板膜上のG
P II b / m aと循環回路の表面に吸着され
たフィブリノーゲンとの間の相互作用に左右される(グ
ラスツコ(Gluszko)氏ら、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・フィジオロジ−(Amer、J、Phys
fol、)25ヱ、P、H615〜621.1987)
、人工表面から離れた血小板は、そこなわれた止血機構
を示す、トリグラミンはこのような粘着を防止するため
に投与することができる。
管手術に日常的に使用されている。血小板は体外の循環
回路の表面に粘着する。この粘着は、血小板膜上のG
P II b / m aと循環回路の表面に吸着され
たフィブリノーゲンとの間の相互作用に左右される(グ
ラスツコ(Gluszko)氏ら、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・フィジオロジ−(Amer、J、Phys
fol、)25ヱ、P、H615〜621.1987)
、人工表面から離れた血小板は、そこなわれた止血機構
を示す、トリグラミンはこのような粘着を防止するため
に投与することができる。
また、トリグラミンが、傷害の際の有効な止血に対して
重大である、血小板膜上の糖蛋白fiIbとホンウィル
ブランド因子との間の相互作用を妨げないことは有益で
ある。このために、そしてトリグラミンの止血効果が短
時間であるために、トリグラミンは外科患者における正
常な止血の再開を妨げない、正常な出血時間への迅速な
復帰はトリグラミン投与の停ととともに起る。
重大である、血小板膜上の糖蛋白fiIbとホンウィル
ブランド因子との間の相互作用を妨げないことは有益で
ある。このために、そしてトリグラミンの止血効果が短
時間であるために、トリグラミンは外科患者における正
常な止血の再開を妨げない、正常な出血時間への迅速な
復帰はトリグラミン投与の停ととともに起る。
トリグラミンのその他の用途としては、血栓溶解療法を
中止した後の血小板血栓塞栓症の予防並びに冠状動脈及
びその他の動脈の血管形成術後の血小板血栓塞栓症の予
防が含まれよう、多くの臨床センターにおいてこれらの
処置を受けた患者は、トリグラミンと比較して弱い血小
板凝集抑制剤である抗血小板薬剤を既に投与されている
。
中止した後の血小板血栓塞栓症の予防並びに冠状動脈及
びその他の動脈の血管形成術後の血小板血栓塞栓症の予
防が含まれよう、多くの臨床センターにおいてこれらの
処置を受けた患者は、トリグラミンと比較して弱い血小
板凝集抑制剤である抗血小板薬剤を既に投与されている
。
また、トリグラミンはある種の腫瘍細胞(例えば黒色腫
)及び転移の拡がりを予防するのに有用であり得る。こ
れは、トリグラミンが黒色腫細胞の付着及び拡がりを抑
止することが認められたためである。
)及び転移の拡がりを予防するのに有用であり得る。こ
れは、トリグラミンが黒色腫細胞の付着及び拡がりを抑
止することが認められたためである。
トリグラミンは、これを血流中に相当な量で供給させる
簡便な手段のいずれによっても投与することができる。
簡便な手段のいずれによっても投与することができる。
好ましい投与経路としては今のところ静脈内投与が考慮
される。トリグラミンは水溶性であり、したがって溶液
状で有効に投与することができる。
される。トリグラミンは水溶性であり、したがって溶液
状で有効に投与することができる。
トリグラミンは蛋白質加水分解に対して比較的安定であ
り、したがって経口投与も実施可能である。経口投与は
、適当なバインダー材料で賦形させたトリグラミンの錠
剤、カプセルなどの形態をとる。
り、したがって経口投与も実施可能である。経口投与は
、適当なバインダー材料で賦形させたトリグラミンの錠
剤、カプセルなどの形態をとる。
トリグラミンのインビボでの作用効果を下記のハムスタ
ーでの研究によって立証する。
ーでの研究によって立証する。
ハムス −での
雌の黄色シリアンハムスター(体重90〜150g)を
随意に飼料及び水をとれるように維持した。ただし、ハ
ムスターをこの実験に使用する前は一夜断食させた。麻
酔剤(65m g / k gのナトリウムベンドパル
ビタール、腹腔内)を投与した後、手術の用意のため毛
をそった。自然呼吸を容易にするため気管にポリエチレ
ン(PE−100)チューブを差し込んだ、補足的な麻
酔剤用の並びに各種の制御剤及び実験用薬剤の投与用の
静脈内経路を作るため右の股静服にカニュールの差し込
みを行った。また、動脈血圧を連続的にモニターするた
めカテーテルを右の頚動脈に導入し、直腸温度プローブ
も挿入した。動物体の温度は加熱用パッド及びランプに
よって37℃に維持シた。
随意に飼料及び水をとれるように維持した。ただし、ハ
ムスターをこの実験に使用する前は一夜断食させた。麻
酔剤(65m g / k gのナトリウムベンドパル
ビタール、腹腔内)を投与した後、手術の用意のため毛
をそった。自然呼吸を容易にするため気管にポリエチレ
ン(PE−100)チューブを差し込んだ、補足的な麻
酔剤用の並びに各種の制御剤及び実験用薬剤の投与用の
静脈内経路を作るため右の股静服にカニュールの差し込
みを行った。また、動脈血圧を連続的にモニターするた
めカテーテルを右の頚動脈に導入し、直腸温度プローブ
も挿入した。動物体の温度は加熱用パッド及びランプに
よって37℃に維持シた。
毛をそった下腹部を中央線に沿って切開することにより
開き、小腸の一部を外に出し、ルーサイト製目視台上に
垂れ下げた。露出した組織は、加温した(37℃)哺乳
動物用リンゲル溶液を連続的に注ぎかけることによって
加温加湿状態に保持した。実験溶液を右の股静脈にバー
バードポンプにより0.199m1/m1n17)流量
で10分間注入した。小腸壁と腸間膜の接合部にある動
脈管(外径lOO〜200gm)を、注入を開始してか
ら4分後に切断した。血液は、上記の注ぎかけ系によっ
て流し去り、廃液は目視台を取り囲む凹みから真空によ
って除去した。出血はツアイス社製の解剖用顕微fi(
20X)により観察し、切断時から止血性栓塞の形成に
よる出血の停止までの出血時間を記録した。各動物はそ
れ自身の対照例として使用し、そして出血時間は両者と
も塩水及び選定された実験用薬剤の注入中に決定した0
反復測定がその後の出血時間応答に影響しないことを保
障するため、トリグラミンの代りに第二の塩水注入によ
って6匹の動物を評価した。これらの2回の塩水注入の
平均出血時間の間には差異は見出されなかった。さらに
4匹の動物にトリグラミンを注入するとともに、それが
全身血圧に直接的な効果を及ぼすかどうか決定するため
に動脈自圧を連続的にモニターした。さらに、絶対的対
照例とするために1匹のハムスターにPCIz類似体(
2ng/kg/m1n)のイロプルロスト(11op[
rost)(ペンレックス番うボラトリーズ社、シダー
・クノールズ、NJ)を投与した。この動物では、出血
は、注入を完了してから約9分後までは止まらなかった
。
開き、小腸の一部を外に出し、ルーサイト製目視台上に
垂れ下げた。露出した組織は、加温した(37℃)哺乳
動物用リンゲル溶液を連続的に注ぎかけることによって
加温加湿状態に保持した。実験溶液を右の股静脈にバー
バードポンプにより0.199m1/m1n17)流量
で10分間注入した。小腸壁と腸間膜の接合部にある動
脈管(外径lOO〜200gm)を、注入を開始してか
ら4分後に切断した。血液は、上記の注ぎかけ系によっ
て流し去り、廃液は目視台を取り囲む凹みから真空によ
って除去した。出血はツアイス社製の解剖用顕微fi(
20X)により観察し、切断時から止血性栓塞の形成に
よる出血の停止までの出血時間を記録した。各動物はそ
れ自身の対照例として使用し、そして出血時間は両者と
も塩水及び選定された実験用薬剤の注入中に決定した0
反復測定がその後の出血時間応答に影響しないことを保
障するため、トリグラミンの代りに第二の塩水注入によ
って6匹の動物を評価した。これらの2回の塩水注入の
平均出血時間の間には差異は見出されなかった。さらに
4匹の動物にトリグラミンを注入するとともに、それが
全身血圧に直接的な効果を及ぼすかどうか決定するため
に動脈自圧を連続的にモニターした。さらに、絶対的対
照例とするために1匹のハムスターにPCIz類似体(
2ng/kg/m1n)のイロプルロスト(11op[
rost)(ペンレックス番うボラトリーズ社、シダー
・クノールズ、NJ)を投与した。この動物では、出血
は、注入を完了してから約9分後までは止まらなかった
。
連続的に注入されたトリグラミンは、3.02分±0.
43の対照側出血時間を基準として、薬量に依存する形
でハムスターの腸間膜の出血時間を著しく増大させた。
43の対照側出血時間を基準として、薬量に依存する形
でハムスターの腸間膜の出血時間を著しく増大させた。
第3図を参照されたい、第3図は、ハムスターの腸間膜
損傷部からの出血時間に対するトリグラミンの連続注入
のインビボでの効果をプロットしたものである。また、
トリグラミン注入を停止させると出血時間が正常値に迅
速に復帰した。第4図を参照されたい、第4図は、トリ
グラミン(804g / k g / m i n )
の注入前、注入中及び注入後のハムスターの腸間膜から
の出血時間の棒グラフである。
損傷部からの出血時間に対するトリグラミンの連続注入
のインビボでの効果をプロットしたものである。また、
トリグラミン注入を停止させると出血時間が正常値に迅
速に復帰した。第4図を参照されたい、第4図は、トリ
グラミン(804g / k g / m i n )
の注入前、注入中及び注入後のハムスターの腸間膜から
の出血時間の棒グラフである。
本発明者は、アオハブの毒液からトリグラミンを単離す
るのに成功した。前記した精製法に従ってその他のハブ
属(Trfmeresurus)から単離し得る蛋白質
であって、前記した分子と同−の又は実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する蛋白質は本発明の範囲内に包含され
ることを理解されたい。
るのに成功した。前記した精製法に従ってその他のハブ
属(Trfmeresurus)から単離し得る蛋白質
であって、前記した分子と同−の又は実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する蛋白質は本発明の範囲内に包含され
ることを理解されたい。
未発明に従ってトリグラミンを化学的均一性まで精製す
ることがこの分子のアミノ酸配列決定を可能にした。こ
の分子はまず第一に天然源であるアオハブの毒液から精
製されたが、トリグラミンは当業者に知られた遺伝子工
学技術によって製造できることも意図される。しかして
、本明細書に開示したトリグラミンのアミノ酸配列に基
づいて、このアミノ酸配列に相当する合成遺伝子を有利
に製造し、この遺伝子を適当なりローニング中介物によ
って適当な宿主に導入することができる。また別法とし
て、アオハブの毒液産生細胞から天然遺伝子を取得し1
次いで組換え及びクローニングを行なうことによってト
リグラミンを製造し得ることが意図される。したがって
1本発明の範囲は本明細書に開示したクロマトグラフ操
作に従うことによって単離されたトリグラミンに限られ
ないのみならず、遺伝子工学技術に従って製造し得るト
リグラミンをも包含することが理解される。
ることがこの分子のアミノ酸配列決定を可能にした。こ
の分子はまず第一に天然源であるアオハブの毒液から精
製されたが、トリグラミンは当業者に知られた遺伝子工
学技術によって製造できることも意図される。しかして
、本明細書に開示したトリグラミンのアミノ酸配列に基
づいて、このアミノ酸配列に相当する合成遺伝子を有利
に製造し、この遺伝子を適当なりローニング中介物によ
って適当な宿主に導入することができる。また別法とし
て、アオハブの毒液産生細胞から天然遺伝子を取得し1
次いで組換え及びクローニングを行なうことによってト
リグラミンを製造し得ることが意図される。したがって
1本発明の範囲は本明細書に開示したクロマトグラフ操
作に従うことによって単離されたトリグラミンに限られ
ないのみならず、遺伝子工学技術に従って製造し得るト
リグラミンをも包含することが理解される。
本発明は、その精神又は必須の特色から逸脱することな
く、その他の特別の形で具体化でき、したがって本発明
の範囲を示すものとして特許請求の範囲を参照すべきで
ある。
く、その他の特別の形で具体化でき、したがって本発明
の範囲を示すものとして特許請求の範囲を参照すべきで
ある。
第1図は、トリグラミンの不存在下(0−0)又は存在
下(0、54g / m i、ロー0.1.0h g
/ m i、ムーム)テの、10ルモルADPにより刺
激されたヒト血小板に対する129■−フィブリノーゲ
ンの結合の二重逆数プロットである。 第2図は、ADPで刺激された血小板(Δ−Δ)又はキ
モトリプシン(CT)で処理した血小板(0−0)のフ
ィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対するトリグ
ラミンの濃度に債存する抑制効果をプロットしたもので
ある。 第3図は、ハムスターの腸間膜損傷部からの出血時間に
対するトリグラミンの連続注入のインビボでの効果をプ
ロットしたものである・第4図は、トリグラミン(80
JLg/kg/m1n)の注入前、注入中及び注入後の
/Xムスターの腸間膜からの出血時間の棒グラフである
。 第5図は、トロンビン(0,5U/m文)で活性化され
た血小板(0−0)及びリストセチン(0,75mg/
m又)で誘発された血小板(ローロ)に対する12g■
−ホンウィルブランド因子(VWF)の結合のトリグラ
ミンによる抑制率をプロットしたものである。 べ Fl(iURE I FIGURE 2 〔トリグラミン コ、νg/ml 出血時間 (min)
下(0、54g / m i、ロー0.1.0h g
/ m i、ムーム)テの、10ルモルADPにより刺
激されたヒト血小板に対する129■−フィブリノーゲ
ンの結合の二重逆数プロットである。 第2図は、ADPで刺激された血小板(Δ−Δ)又はキ
モトリプシン(CT)で処理した血小板(0−0)のフ
ィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対するトリグ
ラミンの濃度に債存する抑制効果をプロットしたもので
ある。 第3図は、ハムスターの腸間膜損傷部からの出血時間に
対するトリグラミンの連続注入のインビボでの効果をプ
ロットしたものである・第4図は、トリグラミン(80
JLg/kg/m1n)の注入前、注入中及び注入後の
/Xムスターの腸間膜からの出血時間の棒グラフである
。 第5図は、トロンビン(0,5U/m文)で活性化され
た血小板(0−0)及びリストセチン(0,75mg/
m又)で誘発された血小板(ローロ)に対する12g■
−ホンウィルブランド因子(VWF)の結合のトリグラ
ミンによる抑制率をプロットしたものである。 べ Fl(iURE I FIGURE 2 〔トリグラミン コ、νg/ml 出血時間 (min)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する実質上純粋な化学的形態のポリペプチド。 2)次式 【遺伝子配列があります】 のポリペプチドからなり、ホスホリパーゼA汚染物を含
まない、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発される凝
集を抑制するための製剤。 3)ポリペプチドが実質上純粋な化学的形態にある請求
項2記載の製剤。 4)ヒト血小板を請求項1記載のポリペプチドとインキ
ュベートすることからなる、ヒト血小板に対するフィブ
リノーゲンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノ
ーゲンで誘発される凝集を抑制する方法。 5)ヒト血小板を請求項2記載の製剤とインキュベート
することからなる、ヒト血小板に対するフィブリノーゲ
ンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノーゲンで
誘発される凝集を抑制する方法。 6)ヒト血小板を請求項3記載の製剤とインキュベート
することからなる、ヒト血小板に対するフィブリノーゲ
ンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノーゲンで
誘発される凝集を抑制する方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12197287A | 1987-11-18 | 1987-11-18 | |
US16566188A | 1988-03-08 | 1988-03-08 | |
US121972 | 1988-03-08 | ||
US165661 | 1988-03-08 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH01250399A true JPH01250399A (ja) | 1989-10-05 |
JPH0631317B2 JPH0631317B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=26820025
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP63284044A Expired - Lifetime JPH0631317B2 (ja) | 1987-11-18 | 1988-11-11 | トリグラミン、血小板凝集抑制性ポリペプチド |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0317053B1 (ja) |
JP (1) | JPH0631317B2 (ja) |
DE (1) | DE3886175T2 (ja) |
ES (1) | ES2060654T3 (ja) |
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US5827821A (en) * | 1987-12-10 | 1998-10-27 | The Burnham Institute | Conformationally stabilized cell adhesion peptides |
NZ228710A (en) * | 1988-04-22 | 1992-10-28 | Merck & Co Inc | Modified "echistatin" and anti-clotting pharmaceutical composition |
US5196403A (en) * | 1989-01-27 | 1993-03-23 | Biogen, Inc. | Method of inhibiting platelet activation |
US5182260A (en) * | 1989-01-27 | 1993-01-26 | Biogen, Inc. | Dna sequences encoding snake venom inhibitors of platelet activation processes for producing those inhibitors and compositions using them |
EP0382451A3 (en) * | 1989-02-07 | 1991-05-29 | Merck & Co. Inc. | Viper venom polypeptides and variants |
EP0382538A3 (en) * | 1989-02-09 | 1991-10-23 | Merck & Co. Inc. | A process for the preparation of cysteine-rich polypeptides, including echistatin |
US5686566A (en) * | 1989-06-16 | 1997-11-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5318899A (en) * | 1989-06-16 | 1994-06-07 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5795867A (en) * | 1989-06-16 | 1998-08-18 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5384309A (en) * | 1989-07-17 | 1995-01-24 | Genentech, Inc. | Cyclized peptides and their use as platelet aggregation inhibitors |
US5612311A (en) * | 1990-04-06 | 1997-03-18 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
US5672585A (en) * | 1990-04-06 | 1997-09-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
AU660926B2 (en) * | 1990-04-06 | 1995-07-13 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
US5648330A (en) * | 1990-04-06 | 1997-07-15 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating vascular graft occlusion |
US6521594B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-02-18 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
US5780303A (en) * | 1990-04-06 | 1998-07-14 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
US5242810A (en) * | 1990-12-07 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Bifunctional inhibitors of thrombin and platelet activation |
JPH06509551A (ja) * | 1991-04-05 | 1994-10-27 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | Gp II↓bIII↓aに対する高い特異性を有する血小板凝集阻害剤 |
US7018627B1 (en) | 1995-06-07 | 2006-03-28 | Icos Corporation | Macrophage derived chemokine (MDC), MDC analogs, MDC inhibitor substances, and uses thereof |
-
1988
- 1988-08-24 DE DE88307818T patent/DE3886175T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-24 EP EP88307818A patent/EP0317053B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-24 ES ES88307818T patent/ES2060654T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-11 JP JP63284044A patent/JPH0631317B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0317053B1 (en) | 1993-12-08 |
EP0317053A2 (en) | 1989-05-24 |
ES2060654T3 (es) | 1994-12-01 |
JPH0631317B2 (ja) | 1994-04-27 |
EP0317053A3 (en) | 1990-07-25 |
DE3886175T2 (de) | 1994-04-07 |
DE3886175D1 (de) | 1994-01-20 |
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