JPH0570364A - 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方法 - Google Patents
骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方法Info
- Publication number
- JPH0570364A JPH0570364A JP3001930A JP193091A JPH0570364A JP H0570364 A JPH0570364 A JP H0570364A JP 3001930 A JP3001930 A JP 3001930A JP 193091 A JP193091 A JP 193091A JP H0570364 A JPH0570364 A JP H0570364A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cys
- asp
- gly
- bone
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【目的】 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方
法。 【構成】 一般式 X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y （式中、ＸはＨ、少なくとも１つのアミノ酸、ＹはＯ
Ｈ、少なくとも１つのアミノ酸、Ｒは各々、同一又は異
なるアミノ酸である。）で表わされるポリペプチドであ
り、骨への破骨細胞付着を阻害する組成物である。
法。 【構成】 一般式 X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y （式中、ＸはＨ、少なくとも１つのアミノ酸、ＹはＯ
Ｈ、少なくとも１つのアミノ酸、Ｒは各々、同一又は異
なるアミノ酸である。）で表わされるポリペプチドであ
り、骨への破骨細胞付着を阻害する組成物である。
Description
【０００１】本発明は骨への破骨細胞の付着を阻害する
ためのポリペプチド類に関する。
ためのポリペプチド類に関する。
【０００２】本発明は、一般的に血小板へのフィブリノ
ーゲン及び他のタンパク質の結合を阻害し、血小板の凝
集を阻害し及び骨への破骨細胞付着を阻害することを含
めた細胞付着の調節に関する。
ーゲン及び他のタンパク質の結合を阻害し、血小板の凝
集を阻害し及び骨への破骨細胞付着を阻害することを含
めた細胞付着の調節に関する。
【０００３】フィブリノーゲンは血漿中に存在する糖タ
ンパク質であって、血小板凝集及びフィブリン形成に関
与する。血小板はすべての哺乳動物の血液中にみられる
細胞様無核断片であって、血液凝固に関与する。フィブ
リノーゲンとレセプターの血小板膜糖タンパク質複合体
IIｂ／IIIaとの相互作用は、正常な血小板機能に必須で
あることが知られている。
ンパク質であって、血小板凝集及びフィブリン形成に関
与する。血小板はすべての哺乳動物の血液中にみられる
細胞様無核断片であって、血液凝固に関与する。フィブ
リノーゲンとレセプターの血小板膜糖タンパク質複合体
IIｂ／IIIaとの相互作用は、正常な血小板機能に必須で
あることが知られている。
【０００４】血管がダメージをうけると、血小板は破壊
された内皮下表面に付着する。続いて付着した血小板は
生物活性成分を放出して凝集する。凝集は特異的血小板
膜レセプターへのトロンビン、エピネフリン又はＡＤＰ
のような作動剤の結合によって開始される。作動剤によ
る刺激の結果、血小板表面の潜在的フィブリノーゲンレ
セプターを露出させ、フィブリノーゲンを糖タンパク質
IIｂ／IIIa複合体に結合させる。
された内皮下表面に付着する。続いて付着した血小板は
生物活性成分を放出して凝集する。凝集は特異的血小板
膜レセプターへのトロンビン、エピネフリン又はＡＤＰ
のような作動剤の結合によって開始される。作動剤によ
る刺激の結果、血小板表面の潜在的フィブリノーゲンレ
セプターを露出させ、フィブリノーゲンを糖タンパク質
IIｂ／IIIa複合体に結合させる。
【０００５】血小板凝集及び付着のメカニズムを研究す
るため天然産物及び合成ペプチドを用いる試みが行われ
た。血小板凝集阻害タンパク質は様々なヘビ毒液から単
離された。しかしながら、これらタンパク質による血小
板凝集阻害メカニズムの研究は構造情報の欠如のせいで
妨げられていた。
るため天然産物及び合成ペプチドを用いる試みが行われ
た。血小板凝集阻害タンパク質は様々なヘビ毒液から単
離された。しかしながら、これらタンパク質による血小
板凝集阻害メカニズムの研究は構造情報の欠如のせいで
妨げられていた。
【０００６】最近、トリグラミンと呼ばれる毒ペプチド
がやや詳細に特徴付けられた〔ハーンら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８７年、第
２６２巻、第１６１５７−１６１６３頁（Huang et a
l.,J. of Biol. Chem.,1987、262 、pp.16157-16163)
及び１９８７年１１月１８日付で出願された米国特許出
願第121,972 号明細書参照〕。そのペプチドは血小板膜
上の糖タンパク質IIｂ／IIIa複合体へのフィブリノーゲ
ン結合を競合的に阻害することが報告された。そのペプ
チドはArg-Gly-Asp 配列を含んでおり、これはＣＯＯＨ
末端残基に近いと考えられる。ラウスラチ及びピアシュ
バッチャー、サイエンス、１９８７年、第２３８巻、第
４９１−４９７頁（Rouslahti and Pierschbacher, Sci
ence, 1987、238 、pp. 491-497)では細胞外基質中及び
血液中に存在するフィブロネクチン、ビトロネクチン、
オステオポンチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、
フィブリノーゲン及びフォンビルブライト因子のような
付着タンパク質について記載している。そのタンパク質
はそれらの細胞認識部位としてトリペプチドのアルギニ
ン−グリシン−アスパラギン酸を含んでいる。そのトリ
ペプチドは２つの膜架橋サブユニットのあるヘテロダイ
マータンパク質である一連の構造関連レセプターインテ
グリンのうち少なくとも１つによって認識される。著者
らは、各タンパク質におけるトリペプチド配列のコンホ
メーションが認識特異性上重要かもしれないと述べてい
る。チェレシュ、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、１９８７年、
第８４巻、第６４７１−６４７５頁（Cheresh, Proc. N
at'l. Acad. Sci. USA、1987、84、pp.6471-6475) では
ヒト内皮細胞により発現されるArg-Gly-Asp 向付着レセ
プターについて記載しているが、これは血小板上のIIｂ
／IIIa複合体と構造上類似するものの、抗原上及び機能
上異なる。そのレセプターはフィブリノーゲン、フォン
ビルブラント因子及びビトロネクチンへの内皮細胞付着
に直接関与している。ピアシュバッチャー及びラウスラ
チ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、１９８７年、第２６２巻、第３６号、第１７２９４
−１７２９８頁では、トリペプチド配列Arg-Gly-Asp 含
有ペプチドの結合特異性に対する配列Arg-Gly-Asp-Xaa
の立体化学の影響について記載している。プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、第５９８５−５９８
８頁において、同著者らは付着促進活性を留めたフィブ
ロネクチンの細胞認識部位の変種について記載してい
る。テトラペプチドArg-Gly-Asp-Ser は大きな付着糖タ
ンパク質フィブロネクチンにおいて細胞により認識され
る最小構造として記載されている。-Arg-Gly-Asp-Ser-
部分を有するペプチドは米国特許第4,589,881 号及び第
4,614,517 号明細書で記載されている。フィブロネクチ
ンと同様の細胞付着活性を有する-Arg-Gly-Asp-R部分
（ＲはThr 、Cys又は他のアミノ酸から選択される) を
有したペプチドは米国特許第4,578,079 号明細書で記載
されている。ルゲリ（Ruggeri)ら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、１９８６年、第８３巻、第５７０８−５７１２頁で
は長さ１６残基にデザインされた一連の合成ペプチドに
ついて記載するが、これは血小板へのフィブリノーゲン
結合を阻害する配列Arg-Gly-Asp-Val を含んでいる。ゴ
ールドら、サーキュレーション、第７７巻、第３号、１
９８８年３月、第６７０−６７７頁（Gold et al., Cir
culation、77、3 、March 1988、pp.670-677) では、冠
動脈血栓溶解及び再閉塞に関してヒト血小板ＧＰIIｂ／
IIIaレセプターに対する組換え一本鎖組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター及びネズミモノクローナル抗体
（７Ｅ３）のF(ab′)2断片のボーラス（bolus)注射の効
果について記載している。ゴールドらは、血小板GPIIｂ
／IIIaレセプターに対するモノクローナル抗体７Ｅ３の
F(ab′)2断片の注射が組換え一本鎖組織型プラスミノー
ゲンアクチベーターとの血栓溶解を促進して再閉塞を防
止することをみつけた。
がやや詳細に特徴付けられた〔ハーンら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８７年、第
２６２巻、第１６１５７−１６１６３頁（Huang et a
l.,J. of Biol. Chem.,1987、262 、pp.16157-16163)
及び１９８７年１１月１８日付で出願された米国特許出
願第121,972 号明細書参照〕。そのペプチドは血小板膜
上の糖タンパク質IIｂ／IIIa複合体へのフィブリノーゲ
ン結合を競合的に阻害することが報告された。そのペプ
チドはArg-Gly-Asp 配列を含んでおり、これはＣＯＯＨ
末端残基に近いと考えられる。ラウスラチ及びピアシュ
バッチャー、サイエンス、１９８７年、第２３８巻、第
４９１−４９７頁（Rouslahti and Pierschbacher, Sci
ence, 1987、238 、pp. 491-497)では細胞外基質中及び
血液中に存在するフィブロネクチン、ビトロネクチン、
オステオポンチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、
フィブリノーゲン及びフォンビルブライト因子のような
付着タンパク質について記載している。そのタンパク質
はそれらの細胞認識部位としてトリペプチドのアルギニ
ン−グリシン−アスパラギン酸を含んでいる。そのトリ
ペプチドは２つの膜架橋サブユニットのあるヘテロダイ
マータンパク質である一連の構造関連レセプターインテ
グリンのうち少なくとも１つによって認識される。著者
らは、各タンパク質におけるトリペプチド配列のコンホ
メーションが認識特異性上重要かもしれないと述べてい
る。チェレシュ、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、１９８７年、
第８４巻、第６４７１−６４７５頁（Cheresh, Proc. N
at'l. Acad. Sci. USA、1987、84、pp.6471-6475) では
ヒト内皮細胞により発現されるArg-Gly-Asp 向付着レセ
プターについて記載しているが、これは血小板上のIIｂ
／IIIa複合体と構造上類似するものの、抗原上及び機能
上異なる。そのレセプターはフィブリノーゲン、フォン
ビルブラント因子及びビトロネクチンへの内皮細胞付着
に直接関与している。ピアシュバッチャー及びラウスラ
チ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、１９８７年、第２６２巻、第３６号、第１７２９４
−１７２９８頁では、トリペプチド配列Arg-Gly-Asp 含
有ペプチドの結合特異性に対する配列Arg-Gly-Asp-Xaa
の立体化学の影響について記載している。プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、第５９８５−５９８
８頁において、同著者らは付着促進活性を留めたフィブ
ロネクチンの細胞認識部位の変種について記載してい
る。テトラペプチドArg-Gly-Asp-Ser は大きな付着糖タ
ンパク質フィブロネクチンにおいて細胞により認識され
る最小構造として記載されている。-Arg-Gly-Asp-Ser-
部分を有するペプチドは米国特許第4,589,881 号及び第
4,614,517 号明細書で記載されている。フィブロネクチ
ンと同様の細胞付着活性を有する-Arg-Gly-Asp-R部分
（ＲはThr 、Cys又は他のアミノ酸から選択される) を
有したペプチドは米国特許第4,578,079 号明細書で記載
されている。ルゲリ（Ruggeri)ら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、１９８６年、第８３巻、第５７０８−５７１２頁で
は長さ１６残基にデザインされた一連の合成ペプチドに
ついて記載するが、これは血小板へのフィブリノーゲン
結合を阻害する配列Arg-Gly-Asp-Val を含んでいる。ゴ
ールドら、サーキュレーション、第７７巻、第３号、１
９８８年３月、第６７０−６７７頁（Gold et al., Cir
culation、77、3 、March 1988、pp.670-677) では、冠
動脈血栓溶解及び再閉塞に関してヒト血小板ＧＰIIｂ／
IIIaレセプターに対する組換え一本鎖組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター及びネズミモノクローナル抗体
（７Ｅ３）のF(ab′)2断片のボーラス（bolus)注射の効
果について記載している。ゴールドらは、血小板GPIIｂ
／IIIaレセプターに対するモノクローナル抗体７Ｅ３の
F(ab′)2断片の注射が組換え一本鎖組織型プラスミノー
ゲンアクチベーターとの血栓溶解を促進して再閉塞を防
止することをみつけた。
【０００７】トリペプチド配列Arg-Gly-Asp はフィブロ
ネクチン及びビトロネクチンの細胞付着促進効果を倍化
又は阻害しうるある種のポリペプチド中に存在すること
が知られているが、ポリペプチド中他のアミノ酸の結合
特異性に対する影響についてはほとんど理解されていな
い。本出願人らはトリペプチド配列Arg-Gly-Asp を含ん
だポリペプチドについて同定かつ精製したが、これは血
小板凝集阻害剤であって、トリペプチドの位置からみて
特定箇所に位置したシステイン残基を有している。特定
位置のシステインアミノ酸は血小板凝集を阻害しうるこ
れらポリペプチドの能力に有意の影響を与えるらしい。
ネクチン及びビトロネクチンの細胞付着促進効果を倍化
又は阻害しうるある種のポリペプチド中に存在すること
が知られているが、ポリペプチド中他のアミノ酸の結合
特異性に対する影響についてはほとんど理解されていな
い。本出願人らはトリペプチド配列Arg-Gly-Asp を含ん
だポリペプチドについて同定かつ精製したが、これは血
小板凝集阻害剤であって、トリペプチドの位置からみて
特定箇所に位置したシステイン残基を有している。特定
位置のシステインアミノ酸は血小板凝集を阻害しうるこ
れらポリペプチドの能力に有意の影響を与えるらしい。
【０００８】長鎖オリゴデオキシヌクレオチドの化学的
合成に関して信頼しうる方法及び装置の出現が天然遺伝
子の単離及び発現に代わる遺伝子合成を実現可能にした
〔カルチャーズ（Caruthers)、サイエンス、第２３０
巻、１９８５年、第２８１−２８５頁；フェレッティ
（Ferretti) ら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、１
９８６年、第５９９−６０３頁；ウォスニック（Wosnic
k)ら、ジーン（Gene) 、第６０巻、１９８７年、第１１
５−１２７頁；ナッサル（Nassal) 、ジーン、第６６
巻、１９８８年、第２７９−２９４頁；ベル（Bell)
ら、ジーン、第６３巻、１９８８年、第１５５−１６１
頁〕。その技術は小さな天然タンパク質を発現及び工学
処理する上で特に有用である。しかしながら、細菌宿主
で発現される多くの真核細胞タンパク質は不安定である
〔タニグチら、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７７巻、１９
８０年、第５２３０−５２３３頁；デービス（Davis)
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻、１９８１年、第
５３７６−５３８０頁；シェン（Shen) 、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ、第８１巻、１９８４年、第４６２７−４６３
１頁；レニック（Lennick)ら、ジーン、第６１巻、１９
８７年、第１０３−１１２頁〕。不安定性を回避するた
めに常用される方法は、細菌タンパク質についてコード
するヌクレオチド配列に対象遺伝子を融合させて融合タ
ンパク質を産生し、それにより真核細胞タンパク質を保
護することである。多数の化学試薬及びプロテアーゼが
融合タンパク質において様々なアミノ酸部位を開裂する
と報告された。臭化シアンは効果的かつ選択的にメチオ
ニンで開裂する〔サビジら、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー、ハース及びチマシェルフ編集、アカデミック
プレス、ニューヨーク、第47巻、１９７７年、第４５９
−４６９頁（Savige et al., Methods in Enzymology,
Hirs and Timashelff eds., Academic Press, New Yor
k、47(1977)、pp.459-469; ナガイら、ネーチャー（Nat
ure) 、第３０９巻、１９８４年、第８１０−８１２
頁；スゾカ（Szoka)ら、ＤＮＡ、第５巻、１９８６年、
第１１−２０頁；ハフィー（Haffey) ら、ＤＮＡ、第６
巻、１９８７年、第５６５−５７１頁〕。
合成に関して信頼しうる方法及び装置の出現が天然遺伝
子の単離及び発現に代わる遺伝子合成を実現可能にした
〔カルチャーズ（Caruthers)、サイエンス、第２３０
巻、１９８５年、第２８１−２８５頁；フェレッティ
（Ferretti) ら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、１
９８６年、第５９９−６０３頁；ウォスニック（Wosnic
k)ら、ジーン（Gene) 、第６０巻、１９８７年、第１１
５−１２７頁；ナッサル（Nassal) 、ジーン、第６６
巻、１９８８年、第２７９−２９４頁；ベル（Bell)
ら、ジーン、第６３巻、１９８８年、第１５５−１６１
頁〕。その技術は小さな天然タンパク質を発現及び工学
処理する上で特に有用である。しかしながら、細菌宿主
で発現される多くの真核細胞タンパク質は不安定である
〔タニグチら、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７７巻、１９
８０年、第５２３０−５２３３頁；デービス（Davis)
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻、１９８１年、第
５３７６−５３８０頁；シェン（Shen) 、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ、第８１巻、１９８４年、第４６２７−４６３
１頁；レニック（Lennick)ら、ジーン、第６１巻、１９
８７年、第１０３−１１２頁〕。不安定性を回避するた
めに常用される方法は、細菌タンパク質についてコード
するヌクレオチド配列に対象遺伝子を融合させて融合タ
ンパク質を産生し、それにより真核細胞タンパク質を保
護することである。多数の化学試薬及びプロテアーゼが
融合タンパク質において様々なアミノ酸部位を開裂する
と報告された。臭化シアンは効果的かつ選択的にメチオ
ニンで開裂する〔サビジら、メソッズ・イン・エンザイ
モロジー、ハース及びチマシェルフ編集、アカデミック
プレス、ニューヨーク、第47巻、１９７７年、第４５９
−４６９頁（Savige et al., Methods in Enzymology,
Hirs and Timashelff eds., Academic Press, New Yor
k、47(1977)、pp.459-469; ナガイら、ネーチャー（Nat
ure) 、第３０９巻、１９８４年、第８１０−８１２
頁；スゾカ（Szoka)ら、ＤＮＡ、第５巻、１９８６年、
第１１−２０頁；ハフィー（Haffey) ら、ＤＮＡ、第６
巻、１９８７年、第５６５−５７１頁〕。
【０００９】破骨細胞は脊椎動物において石灰化組織を
吸収する。骨吸収は骨への付着プロセス、酸及びプロテ
アーゼの分極化分泌並びに骨基質に沿う破骨細胞の活性
運動性の複雑な関係によって進行するらしい〔カネヒサ
及びヒアシュ（Heersche) 、ボーン（Bone) 、第９巻、
第７３−７９頁、１９８８年；バロン（Baron)ら、ジャ
ーナル・オブ・セル・バイオロジー（J. Cell Biol.)、
第１０６巻、第１８６３−１８７２頁、１９８８年；ブ
レア（Blair)ら、サイエンス、第２４５巻、第８５５−
８５７頁、１９８９年；ザンボニン・ザロン（Zambonin
Zallone) ら、エクスペリメンタル・セル・リサーチ
（Exp. Cell Res.) 、第１８２巻、第６４５−６５２
頁、１９８９年〕。吸収上活性な細胞は骨表面にしっか
りと並んでこの界面に特異的構造を形成するが、これは
“透明ゾーン”と呼ばれるアクチンに富む領域で囲まれ
た“ひだ状ボーダー”（ruffled border) と呼ばれる高
らせん状膜からなる〔ベーシス（Vases)、クリニ・オル
トプ・リレート・リサ（Clin.Orthop. Relat. Res.)、
第２２８巻、第２３９−２７１頁、１９８８年；サトー
及びロダン（Rodan)、“細胞形状：決定因子、調節及び
調節役割”、アカデミックプレス社（Academic Press I
nc.)、オーランド、フロリダ州、第３２９−３６２頁、
１９８９年〕。
吸収する。骨吸収は骨への付着プロセス、酸及びプロテ
アーゼの分極化分泌並びに骨基質に沿う破骨細胞の活性
運動性の複雑な関係によって進行するらしい〔カネヒサ
及びヒアシュ（Heersche) 、ボーン（Bone) 、第９巻、
第７３−７９頁、１９８８年；バロン（Baron)ら、ジャ
ーナル・オブ・セル・バイオロジー（J. Cell Biol.)、
第１０６巻、第１８６３−１８７２頁、１９８８年；ブ
レア（Blair)ら、サイエンス、第２４５巻、第８５５−
８５７頁、１９８９年；ザンボニン・ザロン（Zambonin
Zallone) ら、エクスペリメンタル・セル・リサーチ
（Exp. Cell Res.) 、第１８２巻、第６４５−６５２
頁、１９８９年〕。吸収上活性な細胞は骨表面にしっか
りと並んでこの界面に特異的構造を形成するが、これは
“透明ゾーン”と呼ばれるアクチンに富む領域で囲まれ
た“ひだ状ボーダー”（ruffled border) と呼ばれる高
らせん状膜からなる〔ベーシス（Vases)、クリニ・オル
トプ・リレート・リサ（Clin.Orthop. Relat. Res.)、
第２２８巻、第２３９−２７１頁、１９８８年；サトー
及びロダン（Rodan)、“細胞形状：決定因子、調節及び
調節役割”、アカデミックプレス社（Academic Press I
nc.)、オーランド、フロリダ州、第３２９−３６２頁、
１９８９年〕。
【００１０】インテグリン類はヘテロダイマー糖タンパ
ク質であって、Arg-Gly-Asp(ＲＧＤ）配列を認識しかつ
細胞−基質及び細胞−細胞双方の相互作用に関する〔ハ
インズ（Hynes)、セル、第４８巻、第５４９−５５４
頁、１９８７年〕。インテグリン大群は少なくとも４群
に分類され、高ジスルフィド結合β−サブユニットで規
定される。これらＶＬＡ／フィブロネクチン（β１）レ
セプター、白血球Leu-ＣＡＭ／ＣＤ１８（β２）レセプ
ター、β３レセプター及び内皮細胞β４レセプターであ
る〔カジジ（Kajiji) ら、エンボジャーナル（EMBO
J.)、第８巻、第６７３−６８０頁、１９８９年〕。サ
イトアドヘジン（cytoadhesin)とも呼ばれるβ３群は、
血小板凝集に必須である血小板ＧＰIIｂ／IIIa複合体と
破骨細胞、骨芽細胞、骨肉腫及び他の細胞で免疫学上検
出されたビトロネクチンレセプターとを含む〔ホートン
（Horton) ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)、
第４５巻、第５６６３−５６６９頁、１９８５年；デハ
ー（Dedhar) ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ
ー、第１０５巻、第１１７５−１１８２頁、１９８７
年；ザンボニン・ザロンら、１９８９年〕。破骨細胞に
おいて、β３インテグリンは破骨細胞を吸収する透明ゾ
ーンに相当するポドゾーム（podosome) のバンドに局在
化している（ザンボニン・ザロンら、１９８９年）。
ク質であって、Arg-Gly-Asp(ＲＧＤ）配列を認識しかつ
細胞−基質及び細胞−細胞双方の相互作用に関する〔ハ
インズ（Hynes)、セル、第４８巻、第５４９−５５４
頁、１９８７年〕。インテグリン大群は少なくとも４群
に分類され、高ジスルフィド結合β−サブユニットで規
定される。これらＶＬＡ／フィブロネクチン（β１）レ
セプター、白血球Leu-ＣＡＭ／ＣＤ１８（β２）レセプ
ター、β３レセプター及び内皮細胞β４レセプターであ
る〔カジジ（Kajiji) ら、エンボジャーナル（EMBO
J.)、第８巻、第６７３−６８０頁、１９８９年〕。サ
イトアドヘジン（cytoadhesin)とも呼ばれるβ３群は、
血小板凝集に必須である血小板ＧＰIIｂ／IIIa複合体と
破骨細胞、骨芽細胞、骨肉腫及び他の細胞で免疫学上検
出されたビトロネクチンレセプターとを含む〔ホートン
（Horton) ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)、
第４５巻、第５６６３−５６６９頁、１９８５年；デハ
ー（Dedhar) ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ
ー、第１０５巻、第１１７５−１１８２頁、１９８７
年；ザンボニン・ザロンら、１９８９年〕。破骨細胞に
おいて、β３インテグリンは破骨細胞を吸収する透明ゾ
ーンに相当するポドゾーム（podosome) のバンドに局在
化している（ザンボニン・ザロンら、１９８９年）。
【００１１】本発明はフィブリノーゲンレセプター拮抗
剤ポリペプチドに関しそれらはフィブリノーゲン−血小
板結合を阻害して下記一般式Ｉを有することを特徴とす
る： X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y (I) 上記式中ＸはＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；
ＹはＯＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；各Ｒは
同一又は異なるいずれかのアミノ酸である。式Ｉに属す
るポリペプチドには下記式Ｉａのポリペプチドがある： H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H (Ia) 上記式中Chは少なくとも１つのアミノ酸を表す；Cxは少
なくとも１つのアミノ酸を表す；各Ｒは同一又は異なる
アミノ酸を表す。本発明のポリペプチドは様々なヘビ、
例えばトリメレスラス・グラミネウス（Trimeresurus g
ramineus) 、エチス・カリナタス（Echis carinatus)、
アグキストロドン・ピスシボラス（Agkistrodon pisciv
orus) 、ビチス・アリエタンス（Bitis arietans) 及び
エリストコフィス・マクマホニイ（Eristocophis macma
honii)の毒液から精製された。これらのポリペプチド
は、ヒト血小板へのフィブリノーゲン結合を阻害しかつ
ヒト血小板のフィブリノーゲン誘導凝集を阻害する上で
有用である。これらのポリペプチドは下記精製操作に従
いヘビ毒液から精製される。それらはシステインに富
み、共通配列-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-
を含むが、ここで各Ｒは同一又は異なるいずれかのアミ
ノ酸を表す。本出願人らは結合メカニズムに関していか
なる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、システ
インアミノ酸の位置はポリペプチドの三次元構造、剛性
度及び結合特異性を決定する上で重要な役割を果たすと
考えられる。
剤ポリペプチドに関しそれらはフィブリノーゲン−血小
板結合を阻害して下記一般式Ｉを有することを特徴とす
る： X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y (I) 上記式中ＸはＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；
ＹはＯＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；各Ｒは
同一又は異なるいずれかのアミノ酸である。式Ｉに属す
るポリペプチドには下記式Ｉａのポリペプチドがある： H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H (Ia) 上記式中Chは少なくとも１つのアミノ酸を表す；Cxは少
なくとも１つのアミノ酸を表す；各Ｒは同一又は異なる
アミノ酸を表す。本発明のポリペプチドは様々なヘビ、
例えばトリメレスラス・グラミネウス（Trimeresurus g
ramineus) 、エチス・カリナタス（Echis carinatus)、
アグキストロドン・ピスシボラス（Agkistrodon pisciv
orus) 、ビチス・アリエタンス（Bitis arietans) 及び
エリストコフィス・マクマホニイ（Eristocophis macma
honii)の毒液から精製された。これらのポリペプチド
は、ヒト血小板へのフィブリノーゲン結合を阻害しかつ
ヒト血小板のフィブリノーゲン誘導凝集を阻害する上で
有用である。これらのポリペプチドは下記精製操作に従
いヘビ毒液から精製される。それらはシステインに富
み、共通配列-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-
を含むが、ここで各Ｒは同一又は異なるいずれかのアミ
ノ酸を表す。本出願人らは結合メカニズムに関していか
なる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、システ
インアミノ酸の位置はポリペプチドの三次元構造、剛性
度及び結合特異性を決定する上で重要な役割を果たすと
考えられる。
【００１２】本発明は下記一般式の血小板凝集阻害剤に
ついてコードする遺伝子又は縮重相当物にも関する： Ｘ−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ
−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｃｙｓ−Ｙ 上記式中ＸはＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；
ＹはＯＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；各Ｒは
同一又は異なるいずれかのアミノ酸である。本発明の好
ましい遺伝子は修正されたエチスタチンについてコード
している。エチスタチンは配列番号：１に示される：天
然タンパク質の２８位におけるメチオニンは組換えエチ
スタチンにおいてロイシンで置き換えられている。合成
遺伝子は、大腸菌 ｃｈｅＢ及び cheＹ遺伝子複合体の
部分をプラスミドｐＵＣ１３（１９８８年１１月５日付
で出願された米国特許出願第145,800 号) に挿入して組
立てられた発現ベクターｐＪＣ２６４を用いて大腸菌
〔ＭＢ−５３８５；ＡＴＣＣ受理第67873 号；１２３０
１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド
州２０８５２ＵＳＡのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Calture Collection)
に寄託〕で発現される。本株の微生物はブタペスト条約
下で寄託されたが、寄託微生物の一般人への入手性に関
するいかなる制限もその特許の許可時に確定的に取除か
れるであろう。r-leu ２８−エチスタチン遺伝子の高レ
ベル発現は、発現ベクター中における大腸菌 cheＹ遺伝
子との融合によって実現された。組換え-leu２８−エチ
スタチンは cheＹタンパク質とエチスタチンとの間に遺
伝的に挿入されたメチオニンにおける臭化シアン開裂に
よって融合タンパク質から遊離され、逆相ＨＰＬＣで均
一に精製され、高次構造を復元した。高次構造の復元さ
れたr-leu２８−エチスタチンは血小板凝集を阻害する
点で天然エチスタチンと区別しえないが、これは２８位
のメチオニンがこの血小板凝集阻害剤の生物活性にとり
必須でないことを示唆している。
ついてコードする遺伝子又は縮重相当物にも関する： Ｘ−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ
−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｃｙｓ−Ｙ 上記式中ＸはＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；
ＹはＯＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；各Ｒは
同一又は異なるいずれかのアミノ酸である。本発明の好
ましい遺伝子は修正されたエチスタチンについてコード
している。エチスタチンは配列番号：１に示される：天
然タンパク質の２８位におけるメチオニンは組換えエチ
スタチンにおいてロイシンで置き換えられている。合成
遺伝子は、大腸菌 ｃｈｅＢ及び cheＹ遺伝子複合体の
部分をプラスミドｐＵＣ１３（１９８８年１１月５日付
で出願された米国特許出願第145,800 号) に挿入して組
立てられた発現ベクターｐＪＣ２６４を用いて大腸菌
〔ＭＢ−５３８５；ＡＴＣＣ受理第67873 号；１２３０
１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド
州２０８５２ＵＳＡのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Calture Collection)
に寄託〕で発現される。本株の微生物はブタペスト条約
下で寄託されたが、寄託微生物の一般人への入手性に関
するいかなる制限もその特許の許可時に確定的に取除か
れるであろう。r-leu ２８−エチスタチン遺伝子の高レ
ベル発現は、発現ベクター中における大腸菌 cheＹ遺伝
子との融合によって実現された。組換え-leu２８−エチ
スタチンは cheＹタンパク質とエチスタチンとの間に遺
伝的に挿入されたメチオニンにおける臭化シアン開裂に
よって融合タンパク質から遊離され、逆相ＨＰＬＣで均
一に精製され、高次構造を復元した。高次構造の復元さ
れたr-leu２８−エチスタチンは血小板凝集を阻害する
点で天然エチスタチンと区別しえないが、これは２８位
のメチオニンがこの血小板凝集阻害剤の生物活性にとり
必須でないことを示唆している。
【００１３】本発明は、本発明のタンパク質を用いた血
小板凝集阻害用組成物及び本発明の組換えタンパク質の
産生に有用な発現ベクターにも関する。
小板凝集阻害用組成物及び本発明の組換えタンパク質の
産生に有用な発現ベクターにも関する。
【００１４】本発明は式Ｉの合成ポリペプチド及びその
合成方法をも含む。本発明は、本発明のポリペプチドの
有効量を骨に投与することにより骨への破骨細胞付着を
阻害するための組成物及び方法にも関する。
合成方法をも含む。本発明は、本発明のポリペプチドの
有効量を骨に投与することにより骨への破骨細胞付着を
阻害するための組成物及び方法にも関する。
【００１５】ここで用いられる天然タンパク質は対応遺
伝子から産生される全鎖長タンパク質に関する。組換え
タンパク質は、望ましいタンパク質の遺伝子又はｃＤＮ
Ａの単離及び望ましいタンパク質を過剰産生する細胞を
作成するためのその精製遺伝子又はｃＤＮＡの使用に関
与する。ここで用いられる微異質形とはＤＮＡの単一遺
伝子単位から産生されるタンパク質であって翻訳後に構
造修正される単一遺伝子産物に関する。しかしながら、
これらの構造的修正の結果として、タンパク質の活性に
関しいかなる有意の変化もおこさない。修正は生体内
（インビボ）又は単離及び精製プロセスのいずれでおき
てもよい。生体内（インビボ）修正の結果、格別限定さ
れないがＮ末端でのアセチル化、タンパク質分解、グリ
コシル化又はホスホリル化が起こるであろう。タンパク
質分解としては、１以上の末端アミノ酸が順次酵素的に
開裂されて原遺伝子産物よりも少ないアミノ酸を有する
微異質形を生じる外タンパク質分解がある。タンパク質
分解には、アミノ酸配列内の特定位置でペプチドを開裂
するエンドプロテアーゼの作用に基づく内タンパク質分
解修正も含む。同様の修正は精製プロセスで生じること
があり、結果として微異質形を生じる。精製時におきる
最も普通の修正はタンパク質分解である。
伝子から産生される全鎖長タンパク質に関する。組換え
タンパク質は、望ましいタンパク質の遺伝子又はｃＤＮ
Ａの単離及び望ましいタンパク質を過剰産生する細胞を
作成するためのその精製遺伝子又はｃＤＮＡの使用に関
与する。ここで用いられる微異質形とはＤＮＡの単一遺
伝子単位から産生されるタンパク質であって翻訳後に構
造修正される単一遺伝子産物に関する。しかしながら、
これらの構造的修正の結果として、タンパク質の活性に
関しいかなる有意の変化もおこさない。修正は生体内
（インビボ）又は単離及び精製プロセスのいずれでおき
てもよい。生体内（インビボ）修正の結果、格別限定さ
れないがＮ末端でのアセチル化、タンパク質分解、グリ
コシル化又はホスホリル化が起こるであろう。タンパク
質分解としては、１以上の末端アミノ酸が順次酵素的に
開裂されて原遺伝子産物よりも少ないアミノ酸を有する
微異質形を生じる外タンパク質分解がある。タンパク質
分解には、アミノ酸配列内の特定位置でペプチドを開裂
するエンドプロテアーゼの作用に基づく内タンパク質分
解修正も含む。同様の修正は精製プロセスで生じること
があり、結果として微異質形を生じる。精製時におきる
最も普通の修正はタンパク質分解である。
【００１６】組換えＤＮＡ技術とは、異なる細胞、通常
異なる生物からの遺伝情報ＤＮＡセグメントをそのＤＮ
Ａが得られた生物外で端部対端部結合させて、原ＤＮＡ
がコードするタンパク質を産生することになる細胞内に
このハイブリッドＤＮＡを組込む技術としてここでは定
義される。遺伝情報ＤＮＡ又はｍＲＮＡは単離され、適
切なクローニングベクターに組込まれ、適切な宿主細胞
中に形質導入される。ここで用いられるクローニングベ
クターは特定の実験外来ＤＮＡの組込みを可能にするＤ
ＮＡ配列として定義され、その組合せＤＮＡは安定的に
存在しかつ実験ＤＮＡにより指図されるタンパク質を発
現しうる宿主細胞中に導入される。ベクターＤＮＡと組
合された外来ＤＮＡは、組合せ技術から得られる組換え
ＤＮＡ分子を構成する。クローニングベクターとしては
プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス及びコスミ
ドがある。発現ベクターは、適切な宿主中における遺伝
子クローン化コピーの転写及びそれらｍＲＮＡの翻訳に
必要なＤＮＡ配列としてここでは定義される。このよう
なベクターは細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞のよう
な様々な細胞において原核又は真核細胞いずれかの遺伝
子を発現させるために用いることができる。タンパク質
はいくつかのウイルス系で発現させてもよい。適切に組
立てられた発現ベクターは、宿主細胞中における自己複
製用の複製源、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー
数及び強プロモーターを含んでいるべきである。プロモ
ーターはＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように
ＲＮＡポリメラーゼを指示するＤＮＡ配列として定義さ
れる。強プロモーターとはｍＲＮＡを高頻度で開始させ
るものである。発現ベクターとしては格別限定されず、
クローニングベクター、修正クローニングベクター、特
にデザインされたプラスミド又はウイルスがある。
異なる生物からの遺伝情報ＤＮＡセグメントをそのＤＮ
Ａが得られた生物外で端部対端部結合させて、原ＤＮＡ
がコードするタンパク質を産生することになる細胞内に
このハイブリッドＤＮＡを組込む技術としてここでは定
義される。遺伝情報ＤＮＡ又はｍＲＮＡは単離され、適
切なクローニングベクターに組込まれ、適切な宿主細胞
中に形質導入される。ここで用いられるクローニングベ
クターは特定の実験外来ＤＮＡの組込みを可能にするＤ
ＮＡ配列として定義され、その組合せＤＮＡは安定的に
存在しかつ実験ＤＮＡにより指図されるタンパク質を発
現しうる宿主細胞中に導入される。ベクターＤＮＡと組
合された外来ＤＮＡは、組合せ技術から得られる組換え
ＤＮＡ分子を構成する。クローニングベクターとしては
プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス及びコスミ
ドがある。発現ベクターは、適切な宿主中における遺伝
子クローン化コピーの転写及びそれらｍＲＮＡの翻訳に
必要なＤＮＡ配列としてここでは定義される。このよう
なベクターは細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞のよう
な様々な細胞において原核又は真核細胞いずれかの遺伝
子を発現させるために用いることができる。タンパク質
はいくつかのウイルス系で発現させてもよい。適切に組
立てられた発現ベクターは、宿主細胞中における自己複
製用の複製源、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー
数及び強プロモーターを含んでいるべきである。プロモ
ーターはＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように
ＲＮＡポリメラーゼを指示するＤＮＡ配列として定義さ
れる。強プロモーターとはｍＲＮＡを高頻度で開始させ
るものである。発現ベクターとしては格別限定されず、
クローニングベクター、修正クローニングベクター、特
にデザインされたプラスミド又はウイルスがある。
【００１７】本発明のタンパク質は格別限定されず、そ
れらが血小板凝集阻害活性を留めているかぎり、天然タ
ンパク質の規定遺伝子により特定される完全タンパク質
として又はそのいずれかの断片もしくはサブユニットと
して又は完全タンパク質、その断片もしくはサブユニッ
トのハイブリッドとして存在してよい。ここで用いられ
る完全タンパク質とは、適切な遺伝子から産生される全
鎖長ポリペプチドに関する。完全タンパク質は適切なヘ
ビ毒の精製により又は対応組換え体由来遺伝子産物の適
切な発現ベクターでの発現により得てもよい。タンパク
質断片又はサブユニットとは、完全タンパク質よりも少
ないアミノ酸を有しかつ天然タンパク質と同様の条件下
で血小板凝集を阻害しうる能力を留めたタンパク質のい
ずれかの部分に関する。ハイブリッドタンパク質として
は格別限定されず、発現ベクター内における複数遺伝子
の発現に基づくタンパク質又は融合タンパク質がある。
融合タンパク質とは、発現ベクターによりコードされる
限定数のアミノ酸が発現されて発現が特定血小板凝集阻
害ポリペプチドへのそれらの結合を生じるものとして定
義される。複数遺伝子に基づくタンパク質としては、血
小板凝集阻害を高める第二ポリペプチド又はペプチドに
ペプチド結合で結合された特定ポリペプチドがある。
れらが血小板凝集阻害活性を留めているかぎり、天然タ
ンパク質の規定遺伝子により特定される完全タンパク質
として又はそのいずれかの断片もしくはサブユニットと
して又は完全タンパク質、その断片もしくはサブユニッ
トのハイブリッドとして存在してよい。ここで用いられ
る完全タンパク質とは、適切な遺伝子から産生される全
鎖長ポリペプチドに関する。完全タンパク質は適切なヘ
ビ毒の精製により又は対応組換え体由来遺伝子産物の適
切な発現ベクターでの発現により得てもよい。タンパク
質断片又はサブユニットとは、完全タンパク質よりも少
ないアミノ酸を有しかつ天然タンパク質と同様の条件下
で血小板凝集を阻害しうる能力を留めたタンパク質のい
ずれかの部分に関する。ハイブリッドタンパク質として
は格別限定されず、発現ベクター内における複数遺伝子
の発現に基づくタンパク質又は融合タンパク質がある。
融合タンパク質とは、発現ベクターによりコードされる
限定数のアミノ酸が発現されて発現が特定血小板凝集阻
害ポリペプチドへのそれらの結合を生じるものとして定
義される。複数遺伝子に基づくタンパク質としては、血
小板凝集阻害を高める第二ポリペプチド又はペプチドに
ペプチド結合で結合された特定ポリペプチドがある。
【００１８】本発明の範囲内に属するポリペプチドは、
トリメレスラス・グラミネウス、エチス・カリナタス、
アグキストロドン・ピスシボラス、ビチス・アリエタン
ス及びエリストコフィス・マクマホニイのヘビ毒液から
単離された。これらポリペプチドのすべては強力な血小
板凝集阻害剤である。
トリメレスラス・グラミネウス、エチス・カリナタス、
アグキストロドン・ピスシボラス、ビチス・アリエタン
ス及びエリストコフィス・マクマホニイのヘビ毒液から
単離された。これらポリペプチドのすべては強力な血小
板凝集阻害剤である。
【００１９】エチス・カリナタス毒液から単離された阻
害剤の配列は配列番号：２である。この阻害剤は以下の
エチスタチンと称される。
害剤の配列は配列番号：２である。この阻害剤は以下の
エチスタチンと称される。
【００２０】アグキストロドン・ピスシボラス毒液から
単離された阻害剤の配列は配列番号：３である。 あるアミノ酸の同定はこの時点で不明であり、４６番目
のアミノ酸以後の配列の同定も不明である。それにもか
かわらず本阻害剤は本発明の範囲内に属すると考えら
れ、以下アグキストロスタチンと称される。
単離された阻害剤の配列は配列番号：３である。 あるアミノ酸の同定はこの時点で不明であり、４６番目
のアミノ酸以後の配列の同定も不明である。それにもか
かわらず本阻害剤は本発明の範囲内に属すると考えら
れ、以下アグキストロスタチンと称される。
【００２１】ビチス・アリエタンス毒液から単離された
阻害剤の１配列は配列番号４である。本阻害剤は以下の
ビチスタチン１と称される。ビチス・アリエタンス毒液
から単離された阻害剤のもう１つの配列は配列番号：５
である。 本阻害剤は以下のビチスタチン２と称される。ビチス・
アリエタンス毒液から単離された阻害剤のもう１つの配
列は配列番号：６である。 本阻害剤は以下のビチスタチン３と称される。
阻害剤の１配列は配列番号４である。本阻害剤は以下の
ビチスタチン１と称される。ビチス・アリエタンス毒液
から単離された阻害剤のもう１つの配列は配列番号：５
である。 本阻害剤は以下のビチスタチン２と称される。ビチス・
アリエタンス毒液から単離された阻害剤のもう１つの配
列は配列番号：６である。 本阻害剤は以下のビチスタチン３と称される。
【００２２】エリストコフィス・マクマホニイ毒液から
単離された阻害剤の配列は配列番号：７である。 本阻害剤は以下エリストスタチンと称される。
単離された阻害剤の配列は配列番号：７である。 本阻害剤は以下エリストスタチンと称される。
【００２３】ビチス・アリエタンス毒液から単離された
阻害剤のもう１つの配列は配列番号：８である。 ビチスタチン４と称されるこのポリペプチドは、反復血
栓形成のイヌモデルにおいてインビトロ（試験管内）、
エキソビトロ（生体外）及びインビボ（生体内）で評価
される血小板凝集の強力な阻害剤である。ビチスタチン
４は用量応答抗血栓効果を示したが、１０μｇ／kg i.
v.(静注) が閾値抗凝集用量であり、１００μｇ／kg i.
v.(静注) では血小板凝集の完全阻害を示す。
阻害剤のもう１つの配列は配列番号：８である。 ビチスタチン４と称されるこのポリペプチドは、反復血
栓形成のイヌモデルにおいてインビトロ（試験管内）、
エキソビトロ（生体外）及びインビボ（生体内）で評価
される血小板凝集の強力な阻害剤である。ビチスタチン
４は用量応答抗血栓効果を示したが、１０μｇ／kg i.
v.(静注) が閾値抗凝集用量であり、１００μｇ／kg i.
v.(静注) では血小板凝集の完全阻害を示す。
【００２４】前記配列は式Ｉで定義される配列に属する
ポリペプチドの具体例であって、本発明の範囲を制限す
ると解釈されるべきではない。それらはアミノ酸配列決
定により決定された。天然対立遺伝子バリエーションも
存在することが理解されるであろう。これらのバリエー
ションは全体配列中におけるアミノ酸差異により又は前
記配列中におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転も
しくは付加により証明してもよい。
ポリペプチドの具体例であって、本発明の範囲を制限す
ると解釈されるべきではない。それらはアミノ酸配列決
定により決定された。天然対立遺伝子バリエーションも
存在することが理解されるであろう。これらのバリエー
ションは全体配列中におけるアミノ酸差異により又は前
記配列中におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転も
しくは付加により証明してもよい。
【００２５】実施例１方法 物質 −エチス・カリナタスの毒液はユタ州ソールトレー
クシティのマイアミ・サーペンタリウム・ラボラトリー
ズ（Miami Serpentarium Laboratories)から購入した。
低分子量ペプチド標準、セファデックスＧ−５０及びモ
ノＳＦＰＬＣ（Mono SFPLC) カラムはファルマシア社
（Pharmacia, Inc.)から得た。サーバリト・プレコート
（Servalyt Precote) 等電点電気泳動ゲルはサーバ・フ
ァイン・バイオケミカルズ社（Serva Fine Biochemical
s, Inc.)から購入し、等電点電気泳動マーカータンパク
質はＢＤＨケミカルズ社（BDH Chemicals, Ltd.)から購
入し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムはバイダック（Vydac)の
製品であった。
クシティのマイアミ・サーペンタリウム・ラボラトリー
ズ（Miami Serpentarium Laboratories)から購入した。
低分子量ペプチド標準、セファデックスＧ−５０及びモ
ノＳＦＰＬＣ（Mono SFPLC) カラムはファルマシア社
（Pharmacia, Inc.)から得た。サーバリト・プレコート
（Servalyt Precote) 等電点電気泳動ゲルはサーバ・フ
ァイン・バイオケミカルズ社（Serva Fine Biochemical
s, Inc.)から購入し、等電点電気泳動マーカータンパク
質はＢＤＨケミカルズ社（BDH Chemicals, Ltd.)から購
入し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムはバイダック（Vydac)の
製品であった。
【００２６】血小板の調製 ウサギ全血をニュージーランド白ウサギから集めた。血
液を２００xgで１０分間遠心した。上澄の血小板に富む
血漿をアピラーゼ（２０μｇ／ml）及びＰＧＥ1 （５ng
／ml）の存在下８００xgで１５分間遠心した。ペレット
を洗浄緩衝液（１３８mM NaCl 、2.９mM KCl、0.３１mM
Na2HPO4、１mM MgCl2、pH6.５の５mM HEPES、５mMグル
コース、0.１％ NaHCO3 、１mM EGTA 及び0.３５％牛血
清アルブミン）１０mlに再懸濁した。アピラービを最終
濃度２０μｇ／mlまで加えた。再懸濁されたペレットを
８００xgで１５分間遠心し、しかる後２回目として同一
緩衝液で洗浄した。次いで洗浄された血小板を濃度２〜
５×１０8 細胞／mlでpH7.４の無ＥＧＴＡ洗浄緩衝液に
懸濁した。
液を２００xgで１０分間遠心した。上澄の血小板に富む
血漿をアピラーゼ（２０μｇ／ml）及びＰＧＥ1 （５ng
／ml）の存在下８００xgで１５分間遠心した。ペレット
を洗浄緩衝液（１３８mM NaCl 、2.９mM KCl、0.３１mM
Na2HPO4、１mM MgCl2、pH6.５の５mM HEPES、５mMグル
コース、0.１％ NaHCO3 、１mM EGTA 及び0.３５％牛血
清アルブミン）１０mlに再懸濁した。アピラービを最終
濃度２０μｇ／mlまで加えた。再懸濁されたペレットを
８００xgで１５分間遠心し、しかる後２回目として同一
緩衝液で洗浄した。次いで洗浄された血小板を濃度２〜
５×１０8 細胞／mlでpH7.４の無ＥＧＴＡ洗浄緩衝液に
懸濁した。
【００２７】血小板凝集アッセイ 血小板凝集は凝集計において３７℃で測定した。反応混
合液は洗浄された血小板（２〜５×１０8 細胞／ml）、
フィブリノーゲン（１００μｇ／ml）、Ca2+（１mM) 、
ＡＤＰ（１０μＭ）、エピネフリン（２μｇ／ml）及び
試験される血小板凝集阻害剤分画を含有していた。凝集
は他の成分が加えられてから１分間後にＡＤＰ及びエピ
ネフリンを加えることで開始させた。反応は少なくとも
２分間続けた。凝集の阻害度は阻害剤の非存在下で観察
された凝集の百分率として表示された。
合液は洗浄された血小板（２〜５×１０8 細胞／ml）、
フィブリノーゲン（１００μｇ／ml）、Ca2+（１mM) 、
ＡＤＰ（１０μＭ）、エピネフリン（２μｇ／ml）及び
試験される血小板凝集阻害剤分画を含有していた。凝集
は他の成分が加えられてから１分間後にＡＤＰ及びエピ
ネフリンを加えることで開始させた。反応は少なくとも
２分間続けた。凝集の阻害度は阻害剤の非存在下で観察
された凝集の百分率として表示された。
【００２８】エチスタチンの精製 ウサギ血小板凝集アッセイは精製時における活性をモニ
ターするために用いた。エチス・カリナタス凍結乾燥毒
液（１ｇ）を２０mM ＤＴＴ含有pH7.７の１０mM炭酸水
素アンモニウム１２mlに溶解した。室温で１５分間後、
溶液を45,000xgで４５分間遠心した。ペレットを捨て、
上澄を平衡化されたセファデックスＧ−５０の2.５×１
２５cmカラムにのせ、４℃においてpH5.３の１０mM Ｍ
ＥＳで溶出させた。血小板凝集阻害活性含有分画をプー
ルし、減圧濃縮した。セファデックスＧ−１５のカラム
で脱塩後、タンパク質１０〜１３mgをpH5.３の１０mM
ＭＥＳで平衡化させたモノＳ ＦＰＬＣカラムにのせ
た。結合タンパク質を４℃において０〜0.３Ｍ NaClか
らpH5.３の１０mM ＭＥＳまでの直線勾配で分別した。
流速は0.６ml／min であった。阻害活性は約0.１７Ｍ N
aCl で単一ピークとして溶出した。プールされた活性を
水中0.１％（v/v)トリフルオロ酢酸で平衡化されたＣ１
８逆相ＨＰＬＣカラムに直接のせた。カラムを室温にお
いて0.１％水性ＴＦＡ中の多相アセトニトリル勾配によ
り流速0.７ml／min で展開した。阻害活性は１７％のア
セトニトリル濃度で単一ピークとして溶出した。揮発性
物質を減圧遠心しかる後凍結乾燥で除去した。得られた
タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、
等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣでの再クロマトグラフィ
ー及びＮ末端配列決定により判断したところ均一であっ
た。我々がエチスタチンと命名した精製タンパク質の収
量は、出発物質１ｇから2.２mgであった。
ターするために用いた。エチス・カリナタス凍結乾燥毒
液（１ｇ）を２０mM ＤＴＴ含有pH7.７の１０mM炭酸水
素アンモニウム１２mlに溶解した。室温で１５分間後、
溶液を45,000xgで４５分間遠心した。ペレットを捨て、
上澄を平衡化されたセファデックスＧ−５０の2.５×１
２５cmカラムにのせ、４℃においてpH5.３の１０mM Ｍ
ＥＳで溶出させた。血小板凝集阻害活性含有分画をプー
ルし、減圧濃縮した。セファデックスＧ−１５のカラム
で脱塩後、タンパク質１０〜１３mgをpH5.３の１０mM
ＭＥＳで平衡化させたモノＳ ＦＰＬＣカラムにのせ
た。結合タンパク質を４℃において０〜0.３Ｍ NaClか
らpH5.３の１０mM ＭＥＳまでの直線勾配で分別した。
流速は0.６ml／min であった。阻害活性は約0.１７Ｍ N
aCl で単一ピークとして溶出した。プールされた活性を
水中0.１％（v/v)トリフルオロ酢酸で平衡化されたＣ１
８逆相ＨＰＬＣカラムに直接のせた。カラムを室温にお
いて0.１％水性ＴＦＡ中の多相アセトニトリル勾配によ
り流速0.７ml／min で展開した。阻害活性は１７％のア
セトニトリル濃度で単一ピークとして溶出した。揮発性
物質を減圧遠心しかる後凍結乾燥で除去した。得られた
タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、
等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣでの再クロマトグラフィ
ー及びＮ末端配列決定により判断したところ均一であっ
た。我々がエチスタチンと命名した精製タンパク質の収
量は、出発物質１ｇから2.２mgであった。
【００２９】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 我々はレムリ（Laemmli)系（ネーチャー、１９７０年、
第２２７巻、第６８０−６８５頁；参考のため本明細書
に組込まれる）の修正法を用いた。濃縮用及び分離用ゲ
ル（1.５mm）は各々８％及び２０％ポリアクリルアミド
を含有していた。尿素（８Ｍ）を分離用ゲルに加えた。
ゲルを８５ボルトで1.５時間しかる後９０ボルトで１７
時間作動させた。タンパク質をクマシーブリリアントブ
ルーＲ−２５０染色で検出した。等電点電気泳動 サーバリト・プレコート（Sewalyt Precote)等電点電気
泳動ゲルを用いた。サンプルをＬＫＢウルトラフォア
（LKB Ultraphore) 装置中１Ｗの一定電力で作動させ
た。ゲルをサーバ・ブルーＷ（Serva Blue W) で染色し
た。
第２２７巻、第６８０−６８５頁；参考のため本明細書
に組込まれる）の修正法を用いた。濃縮用及び分離用ゲ
ル（1.５mm）は各々８％及び２０％ポリアクリルアミド
を含有していた。尿素（８Ｍ）を分離用ゲルに加えた。
ゲルを８５ボルトで1.５時間しかる後９０ボルトで１７
時間作動させた。タンパク質をクマシーブリリアントブ
ルーＲ−２５０染色で検出した。等電点電気泳動 サーバリト・プレコート（Sewalyt Precote)等電点電気
泳動ゲルを用いた。サンプルをＬＫＢウルトラフォア
（LKB Ultraphore) 装置中１Ｗの一定電力で作動させ
た。ゲルをサーバ・ブルーＷ（Serva Blue W) で染色し
た。
【００３０】還元されたカルボキシメチル化エチスタチ
ン エチスタチン（タンパク質0.７５mg）を0.６mlの用量中
0.２８Ｍトリス及び6.７Ｍ塩酸グアニジンの存在下２０
mMＤＴＴで室温にて１時間かけ還元した。次いでヨード
酢酸（0.０６ml）を最終濃度0.１３６Ｍまで加え、アル
キル化を室温で２０分間続けた。還元されたカルボキシ
メチル化エチスタチンをＣ１８逆相ＨＰＬＣで試薬から
単離した。エチスタチンのキモトリプシン開裂 エチスタチンを基質対プロテアーゼ比４０：１（w/w)で
キモトリプシンにより切断した。タンパク質分解反応を
pH7.８の0.２Ｍ炭酸水素アンモニウム中３７℃で４時間
行った。次いで反応混合液を凍結乾燥し、キモトリプシ
ン処理ペプチドを逆相ＨＰＬＣで単離した。
ン エチスタチン（タンパク質0.７５mg）を0.６mlの用量中
0.２８Ｍトリス及び6.７Ｍ塩酸グアニジンの存在下２０
mMＤＴＴで室温にて１時間かけ還元した。次いでヨード
酢酸（0.０６ml）を最終濃度0.１３６Ｍまで加え、アル
キル化を室温で２０分間続けた。還元されたカルボキシ
メチル化エチスタチンをＣ１８逆相ＨＰＬＣで試薬から
単離した。エチスタチンのキモトリプシン開裂 エチスタチンを基質対プロテアーゼ比４０：１（w/w)で
キモトリプシンにより切断した。タンパク質分解反応を
pH7.８の0.２Ｍ炭酸水素アンモニウム中３７℃で４時間
行った。次いで反応混合液を凍結乾燥し、キモトリプシ
ン処理ペプチドを逆相ＨＰＬＣで単離した。
【００３１】アミノ酸配列決定 精製されたエチスタチン及び選択されたキモトリプシン
処理断片は、製造業者供給のシークエンサープログラム
及び試薬を用いてアプライド・バイオシステムズ４７０
Ａシークエンサー（Applied Biosystems 470ASequence
r)による自動タンパク質配列分析に付した。放出された
アミノ酸誘導体をオンラインＨＰＬＣ系の補助で同定し
た。タンパク質決定 タンパク質はローリー（Lowry)ら（ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、１９５１年、第１９３
巻、第２６５−２７５頁；参考のため本明細書に組込ま
れる）の方法により標準として牛血清アルブミンを用い
て決定した。
処理断片は、製造業者供給のシークエンサープログラム
及び試薬を用いてアプライド・バイオシステムズ４７０
Ａシークエンサー（Applied Biosystems 470ASequence
r)による自動タンパク質配列分析に付した。放出された
アミノ酸誘導体をオンラインＨＰＬＣ系の補助で同定し
た。タンパク質決定 タンパク質はローリー（Lowry)ら（ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、１９５１年、第１９３
巻、第２６５−２７５頁；参考のため本明細書に組込ま
れる）の方法により標準として牛血清アルブミンを用い
て決定した。
【００３２】結 果 精製 エチスタチンを３つのクロマトグラフィー工程でエチス
・カリナタスの凍結乾燥毒液の可溶性部分から均一に精
製した。粗毒液中における血小板凝集促進活性の存在の
ため、阻害剤はこの分画中で信頼して検出できなかっ
た。しかしながら、セファデックスＧ−５０でのゲル濾
過後に阻害活性の単一ピークが観察された。この活性を
モノＳ上陽イオン交換ＦＰＬＣで最後にＣ１８逆相ＨＰ
ＬＣで更に精製した。凍結乾燥毒液１ｇから精製エチス
タチン2.２mgを得た。この物質は８Ｍ尿素存在下ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で及び等電点電気泳動
で単一バンドを示した。逆相ＨＰＬＣによる再クロマト
グラフィーで、血小板凝集阻害活性と正確に一致する単
一の対称吸収ピークを生じた。エチスタチン製剤の均一
性に関する更なる確認は、天然又は還元されたカルボキ
シメチル化タンパク質のアミノ酸配列決定で得られた。
最初のシークエンサーサイクルで観察されたアミノ酸残
基だけがグルタミン酸であった。
・カリナタスの凍結乾燥毒液の可溶性部分から均一に精
製した。粗毒液中における血小板凝集促進活性の存在の
ため、阻害剤はこの分画中で信頼して検出できなかっ
た。しかしながら、セファデックスＧ−５０でのゲル濾
過後に阻害活性の単一ピークが観察された。この活性を
モノＳ上陽イオン交換ＦＰＬＣで最後にＣ１８逆相ＨＰ
ＬＣで更に精製した。凍結乾燥毒液１ｇから精製エチス
タチン2.２mgを得た。この物質は８Ｍ尿素存在下ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で及び等電点電気泳動
で単一バンドを示した。逆相ＨＰＬＣによる再クロマト
グラフィーで、血小板凝集阻害活性と正確に一致する単
一の対称吸収ピークを生じた。エチスタチン製剤の均一
性に関する更なる確認は、天然又は還元されたカルボキ
シメチル化タンパク質のアミノ酸配列決定で得られた。
最初のシークエンサーサイクルで観察されたアミノ酸残
基だけがグルタミン酸であった。
【００３３】分子量及び等電点 ８Ｍ尿素存在下２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで
の電気泳動時における還元エチスタチンの見かけ分子量
は５８００ダルトンであった。これはアミノ酸配列（下
記参照）から計算される値と同様である。非還元条件下
においてタンパク質はやや遅く移動したが、これは見か
け分子量７０００ダルトンに相当する。意外にも、天然
エチスタチンがヒドロキシエチルジスルフィドで処理さ
れた場合、見かけ分子量はわずか約４０００ダルトンで
あった。おそらく不完全誘導に基づく副バンドがヒドロ
キシエチルジスルフィド処理エチスタチンで観察され
た。天然及びジスルフィド処理双方のエチスタチンは8.
３のpIを示した。ジチオスレイトール処理で、pI 7.５
の副バンドがpI 8.３の主バンドに加えて検出された。
の電気泳動時における還元エチスタチンの見かけ分子量
は５８００ダルトンであった。これはアミノ酸配列（下
記参照）から計算される値と同様である。非還元条件下
においてタンパク質はやや遅く移動したが、これは見か
け分子量７０００ダルトンに相当する。意外にも、天然
エチスタチンがヒドロキシエチルジスルフィドで処理さ
れた場合、見かけ分子量はわずか約４０００ダルトンで
あった。おそらく不完全誘導に基づく副バンドがヒドロ
キシエチルジスルフィド処理エチスタチンで観察され
た。天然及びジスルフィド処理双方のエチスタチンは8.
３のpIを示した。ジチオスレイトール処理で、pI 7.５
の副バンドがpI 8.３の主バンドに加えて検出された。
【００３４】アミノ酸組成 還元されたカルボキシメチル化タンパク質の加水分解の
２０時間後に得られたエチスタチンのアミノ酸組成は表
１で示されている。この分析で得られた組成をその配列
から予想される場合と比較した（下記参照）。これら２
方法で得られたほとんどの値は近似的に一致した。アミ
ノ酸組成でみられるシステイニル残基の含量（6.７）は
配列から予想される場合(8) よりも低い。これはエチス
タチンの不完全カルボキシメチル化によるものであっ
た。
２０時間後に得られたエチスタチンのアミノ酸組成は表
１で示されている。この分析で得られた組成をその配列
から予想される場合と比較した（下記参照）。これら２
方法で得られたほとんどの値は近似的に一致した。アミ
ノ酸組成でみられるシステイニル残基の含量（6.７）は
配列から予想される場合(8) よりも低い。これはエチス
タチンの不完全カルボキシメチル化によるものであっ
た。
【００３５】
【表１】
【００３６】試験管内（インビトロ）での血小板凝集に
関するエチスタチンの効果 血小板凝集研究では、エチスタチンが0.１Ｍmg／mlフィ
ブリノーゲンの存在下ＡＤＰで誘導されるヒトゲル濾過
血小板凝集を阻害する上でトリグラミンよりも強力であ
ることを示す（ＩＣ50＝３０nM対１５０nM）。エチスタ
チンはＡＤＰコラーゲン、血小板活性化因子又はエピネ
フリンにより誘導されるヒト血小板の凝集を用量３０〜
３００nMで阻害する。
関するエチスタチンの効果 血小板凝集研究では、エチスタチンが0.１Ｍmg／mlフィ
ブリノーゲンの存在下ＡＤＰで誘導されるヒトゲル濾過
血小板凝集を阻害する上でトリグラミンよりも強力であ
ることを示す（ＩＣ50＝３０nM対１５０nM）。エチスタ
チンはＡＤＰコラーゲン、血小板活性化因子又はエピネ
フリンにより誘導されるヒト血小板の凝集を用量３０〜
３００nMで阻害する。
【００３７】ヒト血小板に富む血漿 血液を正常ヒトボランティアから静脈穿刺で3.８％クエ
ン酸ナトリウム0.１容量中に吸引した。血小板に富む血
漿（ＰＲＰ）を４００xgで１２分間遠心により調製し
た。凝集はＡＤＰコラーゲン、血小板活性化因子又はエ
ピネフリンをＰＲＰに加えて行い、シエンコ（Sienco)
凝集計で測定した。
ン酸ナトリウム0.１容量中に吸引した。血小板に富む血
漿（ＰＲＰ）を４００xgで１２分間遠心により調製し
た。凝集はＡＤＰコラーゲン、血小板活性化因子又はエ
ピネフリンをＰＲＰに加えて行い、シエンコ（Sienco)
凝集計で測定した。
【００３８】ヒトゲル濾過血小板 血液を正常ヒトボランティアから静脈穿刺で酸−クエン
酸塩−デキストロース（８５mMクエン酸ナトリウム、６
４mMクエン酸、１１０mMデキストロース）0.１倍容量中
に吸引した。血小板に富む血漿を４００xgで１２分間遠
心により調製した。ＰＧＥ1 （５μｇ／ml）を加え、血
小板を８００xgで１２分間遠心により回収した。血小板
ペレットをヒト血小板緩衝液（１４０mM NaCl、7.９mM
KCl 、3.２mM Na2HPO4 、６mMHEPES 、２％牛血清ア
ルブミン、0.１％デキストロース、pH7.２）に再懸濁
し、ヒト血小板緩衝液で予め平衡化させたセファロース
２Ｂで濾過した。血小板を計数し、ヒト血小板緩衝液で
２×１０8 ／mlに調整した。
酸塩−デキストロース（８５mMクエン酸ナトリウム、６
４mMクエン酸、１１０mMデキストロース）0.１倍容量中
に吸引した。血小板に富む血漿を４００xgで１２分間遠
心により調製した。ＰＧＥ1 （５μｇ／ml）を加え、血
小板を８００xgで１２分間遠心により回収した。血小板
ペレットをヒト血小板緩衝液（１４０mM NaCl、7.９mM
KCl 、3.２mM Na2HPO4 、６mMHEPES 、２％牛血清ア
ルブミン、0.１％デキストロース、pH7.２）に再懸濁
し、ヒト血小板緩衝液で予め平衡化させたセファロース
２Ｂで濾過した。血小板を計数し、ヒト血小板緩衝液で
２×１０8 ／mlに調整した。
【００３９】アミノ酸配列 エチスタチンのアミノ酸配列は還元されたカルボキシメ
チル化タンパク質の自動エドマン分解により得た。その
タンパク質はＮ末端グルタミン酸残基及びＣ末端トレオ
ニンを含めて４９アミノ酸を有し、前記で示される。シ
ステインはエチスタチンの全アミノ酸中８残基、即ち１
６％以上であった。その配列決定は同様の結果で２回繰
返された。天然エチスタチンが配列決定された場合、シ
ステイニル残基が予想されるシークエンサーサイクルに
おいてＰＴＨアミノ酸ピークは観察されず、更にこれら
残基の存在を確認した。これらシステイニル残基のジス
ルフィド状態は不明である。更にその配列の確認は還元
されたカルボキシメチル化タンパク質から単離されたキ
モトリプシン処理ペプチドの分析から得た（表２）。
チル化タンパク質の自動エドマン分解により得た。その
タンパク質はＮ末端グルタミン酸残基及びＣ末端トレオ
ニンを含めて４９アミノ酸を有し、前記で示される。シ
ステインはエチスタチンの全アミノ酸中８残基、即ち１
６％以上であった。その配列決定は同様の結果で２回繰
返された。天然エチスタチンが配列決定された場合、シ
ステイニル残基が予想されるシークエンサーサイクルに
おいてＰＴＨアミノ酸ピークは観察されず、更にこれら
残基の存在を確認した。これらシステイニル残基のジス
ルフィド状態は不明である。更にその配列の確認は還元
されたカルボキシメチル化タンパク質から単離されたキ
モトリプシン処理ペプチドの分析から得た（表２）。
【００４０】
【表２】 エチスタチンは血小板表面上の糖タンパク質IIｂ／IIIa
複合体に結合するあるタンパク質に共通した配列Arg-Gl
y-Asp を残基２４−２６に含んでいる。この配列はフィ
ブリノーゲン分子上における推定血小板結合部位の一部
である。エチスタチンは８Ｍ尿素存在下でＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動時に異常な挙動を示した。天
然タンパク質は配列分析から得られる５４００ダルトン
の値と比較して見かけ分子量７０００ダルトンで移動し
た。非還元条件下において内鎖ジスルフィド結合のある
タンパク質は予想量以下のＳＤＳと通常結合したが、但
し事前の還元では内鎖ジスルフィド結合を欠くタンパク
質でみられるレベルまでＳＤＳ結合性を増加させる〔ピ
ット・リバース（Pitt-Rivers)ら、バイオケミカル・ジ
ャーナル（Biochem. J.)、１９６８年、第１０９巻、第
８２５−８３０頁〕。このためＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動時における還元エチスタチンの移動性増
加は、このタンパク質がその天然コンホメーションにお
いて１以上の内鎖ジスルフィド結合を含むことを示唆し
ている。８０mMジチオスレイトールによる室温で２０分
間のエチスタチン処理で血小板凝集に関するその阻害活
性を完全に破壊した。同様の条件下、８０mMヒドロキシ
エチルジスルフィド処理では阻害活性の５０％を失わせ
た。これらの結果はＳＤＳゲル電気泳動研究の場合と同
様に、１以上の内鎖ジスルフィド結合がその阻害活性に
必要なエチスタチンのコンホメーションを維持する上で
重要な役割を果たすことを示している。
複合体に結合するあるタンパク質に共通した配列Arg-Gl
y-Asp を残基２４−２６に含んでいる。この配列はフィ
ブリノーゲン分子上における推定血小板結合部位の一部
である。エチスタチンは８Ｍ尿素存在下でＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動時に異常な挙動を示した。天
然タンパク質は配列分析から得られる５４００ダルトン
の値と比較して見かけ分子量７０００ダルトンで移動し
た。非還元条件下において内鎖ジスルフィド結合のある
タンパク質は予想量以下のＳＤＳと通常結合したが、但
し事前の還元では内鎖ジスルフィド結合を欠くタンパク
質でみられるレベルまでＳＤＳ結合性を増加させる〔ピ
ット・リバース（Pitt-Rivers)ら、バイオケミカル・ジ
ャーナル（Biochem. J.)、１９６８年、第１０９巻、第
８２５−８３０頁〕。このためＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動時における還元エチスタチンの移動性増
加は、このタンパク質がその天然コンホメーションにお
いて１以上の内鎖ジスルフィド結合を含むことを示唆し
ている。８０mMジチオスレイトールによる室温で２０分
間のエチスタチン処理で血小板凝集に関するその阻害活
性を完全に破壊した。同様の条件下、８０mMヒドロキシ
エチルジスルフィド処理では阻害活性の５０％を失わせ
た。これらの結果はＳＤＳゲル電気泳動研究の場合と同
様に、１以上の内鎖ジスルフィド結合がその阻害活性に
必要なエチスタチンのコンホメーションを維持する上で
重要な役割を果たすことを示している。
【００４１】実施例２ 実施例１で用いられたタンパク質精製及び決定の方法
が、アグキストロドン・ピスシボラス毒液中に存在する
血小板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられ
た。アミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質
は血小板凝集阻害剤の特徴を示した。
が、アグキストロドン・ピスシボラス毒液中に存在する
血小板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられ
た。アミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質
は血小板凝集阻害剤の特徴を示した。
【００４２】実施例３ 実施例１で用いられたタンパク質精製及び決定の方法
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する血小板凝集
阻害剤を単離及び同定するために用いられた。アミノ酸
配列が前記のように同定されるタンパク質は血小板凝集
阻害剤の特徴を示した。
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する血小板凝集
阻害剤を単離及び同定するために用いられた。アミノ酸
配列が前記のように同定されるタンパク質は血小板凝集
阻害剤の特徴を示した。
【００４３】実施例４ 実施例１で用いられたタンパク質精製及び決定の方法
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する第二の血小
板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられた。ア
ミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質は血小
板凝集阻害剤の特徴を示した。
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する第二の血小
板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられた。ア
ミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質は血小
板凝集阻害剤の特徴を示した。
【００４４】実施例５ 実施例１で用いられたタンパク質精製及び決定の方法
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する第三の血小
板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられた。ア
ミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質は血小
板凝集阻害剤の特徴を示した。
が、ビチス・アリエタンス毒液中に存在する第三の血小
板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられた。ア
ミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質は血小
板凝集阻害剤の特徴を示した。
【００４５】実施例６ 実施例１で用いられたタンパク質精製及び決定の方法
が、エリストコフィス・マクマホニイ毒液中に存在する
血小板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられ
た。アミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質
は血小板凝集阻害剤の特徴を示した。本発明による式Ｉ
の様々なポリペプチド類の化学的均一精製で、分子のア
ミノ酸配列決定をなしえた。式Ｉで示されたアミノ酸配
列に基づき、有利に開示アミノ酸配列に対応する合成遺
伝子を製造しかつ適切なクローニングベクターでその遺
伝子を適切な宿主に導入することができる。一方、純粋
なポリペプチドは毒産生細胞から天然遺伝子を得てしか
る後組換え及びクローニングによって製造してもよいと
考えられる。したがって、本発明の範囲はここで開示さ
れたクロマトグラフィー操作に従い単離されたポリペプ
チド又は式Ｉに属するポリペプチドに単に限定されず、
遺伝子工学技術で製造されるようなこれらポリペプチド
も含むと理解される。
が、エリストコフィス・マクマホニイ毒液中に存在する
血小板凝集阻害剤を単離及び同定するために用いられ
た。アミノ酸配列が前記のように同定されるタンパク質
は血小板凝集阻害剤の特徴を示した。本発明による式Ｉ
の様々なポリペプチド類の化学的均一精製で、分子のア
ミノ酸配列決定をなしえた。式Ｉで示されたアミノ酸配
列に基づき、有利に開示アミノ酸配列に対応する合成遺
伝子を製造しかつ適切なクローニングベクターでその遺
伝子を適切な宿主に導入することができる。一方、純粋
なポリペプチドは毒産生細胞から天然遺伝子を得てしか
る後組換え及びクローニングによって製造してもよいと
考えられる。したがって、本発明の範囲はここで開示さ
れたクロマトグラフィー操作に従い単離されたポリペプ
チド又は式Ｉに属するポリペプチドに単に限定されず、
遺伝子工学技術で製造されるようなこれらポリペプチド
も含むと理解される。
【００４６】実施例７ 組換え体-leu２８−エチスタチンに関するＤＮＡ及びプ
ラスミド組立て並びにタンパク質発現 すべての酵素及びＤＮＡ分子量マーカーはニューイング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs)製であっ
た。ジデオキシＤＮＡ配列決定キットはユナイテッド・
ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション社（Unit
ed States Biochemical Corporation Inc.) から購入し
た。コンピテント大腸菌Jm１０９はストラタジェン（St
ratagene) から購入した。すべての他の試薬は分析用又
は電気泳動用グレードであった。すべてのオリゴデオキ
シヌクレオチドはメチルホスホアミジトを用いてアプラ
イド・バイオシステムズ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザ
ーで合成した。濃アンモニアで脱保護後、オリゴデオキ
シヌクレオチドをファルマシアＮＡＰ−１０ゲル濾過カ
ラムで脱塩した。すべてのオリゴデオキシヌクレオチド
をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
したが、但し２つのオリゴデオキシヌクレオチドは双方
の鎖の５′末端で突出していた。キナーゼ処理された相
補的オリゴデオキシヌクレオチドを９５℃に加熱し、し
かる後室温まで徐々に冷却させてアニーリングした。３
種の二本鎖の結合を全容量１３０μｌ中各二本鎖0.５nm
ol、pH7.８の５０mMトリスHCl 、１０mM MgCl2 、２０
mMジチオスレイトール、１mMＡＴＰ、５０μｇ／ml牛血
清アルブミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ４０００単位を含
有した反応混合液中１４℃で１５時間行った。結合混合
物を１０％天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分別
した。組立てられたleu-２８−エチスタチン遺伝子をポ
リアクリルアミドゲルから切出し、電気溶離させた。溶
離された leu２８−エチスタチン遺伝子をキナーゼ処理
し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた後、それを発現ベクターに挿入した。
ラスミド組立て並びにタンパク質発現 すべての酵素及びＤＮＡ分子量マーカーはニューイング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs)製であっ
た。ジデオキシＤＮＡ配列決定キットはユナイテッド・
ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション社（Unit
ed States Biochemical Corporation Inc.) から購入し
た。コンピテント大腸菌Jm１０９はストラタジェン（St
ratagene) から購入した。すべての他の試薬は分析用又
は電気泳動用グレードであった。すべてのオリゴデオキ
シヌクレオチドはメチルホスホアミジトを用いてアプラ
イド・バイオシステムズ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザ
ーで合成した。濃アンモニアで脱保護後、オリゴデオキ
シヌクレオチドをファルマシアＮＡＰ−１０ゲル濾過カ
ラムで脱塩した。すべてのオリゴデオキシヌクレオチド
をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
したが、但し２つのオリゴデオキシヌクレオチドは双方
の鎖の５′末端で突出していた。キナーゼ処理された相
補的オリゴデオキシヌクレオチドを９５℃に加熱し、し
かる後室温まで徐々に冷却させてアニーリングした。３
種の二本鎖の結合を全容量１３０μｌ中各二本鎖0.５nm
ol、pH7.８の５０mMトリスHCl 、１０mM MgCl2 、２０
mMジチオスレイトール、１mMＡＴＰ、５０μｇ／ml牛血
清アルブミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ４０００単位を含
有した反応混合液中１４℃で１５時間行った。結合混合
物を１０％天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分別
した。組立てられたleu-２８−エチスタチン遺伝子をポ
リアクリルアミドゲルから切出し、電気溶離させた。溶
離された leu２８−エチスタチン遺伝子をキナーゼ処理
し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた後、それを発現ベクターに挿入した。
【００４７】ｐＪＣ２６４発現ベクターの組立て cheB遺伝子の３′−４３６bp及びcheY遺伝子の５′−２
６３bp〔マツムラら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（J. Bact.) 、第１６０巻、１９８４年、第３６−
４１頁〕を含んだｐＬＣ１−２８〔B.バッチマン（B. B
achmann)、大腸菌遺伝子ストックセンター（E. coli Ge
netic Stock Center) から入手〕からの７１４bp Hind
III-PstI断片をｐＵＣ１３のHind III及びPstI部位に組
込んでクローニングした。cheY遺伝子に隣接するｐＵＣ
１３のポリリンカー配列中における唯一のEcoRI 部位を
動かすため、PstI及びEcoRI 部位間のポリリンカー配列
を欠失させた。得られた発現ベクターｐＪＣ２６４は、
対象遺伝子をcheY遺伝子と融合させうる唯一のEcoRI 部
位を有している。ｐＵＣ１３及びcheB遺伝子を連結する
Hind III部位は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウ（Klenow) 断片で補充しかつ合成BamH Iリンカーと結
合させることでBamHI部位に変換させた。合成組換え体
leu２８−エチスタチン遺伝子は、下記条件、即ち全容
量２０μｌ中pH7.８の５０mMトリスHCl 、１０mM MgCl
2 、２０mMジチオスレイトール、１mM ＡＴＰ、５０μ
ｇ／ml牛血清アルブミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ８００
単位の存在下において前記で得た合成 leu２８−エチス
タチン遺伝子の１／３をEcoRI 切断ｐＪＣ２６４ 0.１
μｇと結合させることによりｐＪＣ２６４のEcoRI部位
に挿入した。結合は１４℃で１５時間行った。
６３bp〔マツムラら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（J. Bact.) 、第１６０巻、１９８４年、第３６−
４１頁〕を含んだｐＬＣ１−２８〔B.バッチマン（B. B
achmann)、大腸菌遺伝子ストックセンター（E. coli Ge
netic Stock Center) から入手〕からの７１４bp Hind
III-PstI断片をｐＵＣ１３のHind III及びPstI部位に組
込んでクローニングした。cheY遺伝子に隣接するｐＵＣ
１３のポリリンカー配列中における唯一のEcoRI 部位を
動かすため、PstI及びEcoRI 部位間のポリリンカー配列
を欠失させた。得られた発現ベクターｐＪＣ２６４は、
対象遺伝子をcheY遺伝子と融合させうる唯一のEcoRI 部
位を有している。ｐＵＣ１３及びcheB遺伝子を連結する
Hind III部位は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウ（Klenow) 断片で補充しかつ合成BamH Iリンカーと結
合させることでBamHI部位に変換させた。合成組換え体
leu２８−エチスタチン遺伝子は、下記条件、即ち全容
量２０μｌ中pH7.８の５０mMトリスHCl 、１０mM MgCl
2 、２０mMジチオスレイトール、１mM ＡＴＰ、５０μ
ｇ／ml牛血清アルブミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ８００
単位の存在下において前記で得た合成 leu２８−エチス
タチン遺伝子の１／３をEcoRI 切断ｐＪＣ２６４ 0.１
μｇと結合させることによりｐＪＣ２６４のEcoRI部位
に挿入した。結合は１４℃で１５時間行った。
【００４８】受容細菌の形質転換及び陽性クローンの同
定 挿入された r-leu２８−エチスタチン遺伝子を含んだｐ
ＪＣ２６４発現ベクターの１／３（７μｌ）を用いて、
標準条件下でＪＭ１０９コンピテント細胞５０mlを形質
転換させた。 r-leu２８−エチスタチン遺伝子を含むク
ローンを制限地図作成により選択した。エチスタチンに
関するコード配列の存在はジデオキシ配列分析により確
認した。
定 挿入された r-leu２８−エチスタチン遺伝子を含んだｐ
ＪＣ２６４発現ベクターの１／３（７μｌ）を用いて、
標準条件下でＪＭ１０９コンピテント細胞５０mlを形質
転換させた。 r-leu２８−エチスタチン遺伝子を含むク
ローンを制限地図作成により選択した。エチスタチンに
関するコード配列の存在はジデオキシ配列分析により確
認した。
【００４９】細胞増殖及び融合タンパク質ペレットの製
造 培養物を一夜種培養物（１％v/v)で接種し、アンピシリ
ン１００μｇ／ml含有ＬＢ培地で増殖させた。細胞密度
がＯＤ600 読取り値0.２〜0.３に達したとき、ＩＰＴＧ
を最終濃度１mMまで加えた。細胞を更に１０時間の増殖
後遠心により回収した。培養液３０００mlからの細胞ペ
レットを最終容量５０mlまで水に懸濁し、大チップ装備
フィッシャー・ソニック・ディスメンブレーター・モデ
ル３００（Fisher Sonic Dismembrator Model 300)を用
い４℃で１０分間最大出力で音波処理した。音波処理混
合液を20,000xgで１５分間遠心した。ペレットを水８ml
に再懸濁し、pH7.４の１５mMトリスHCl 及び0.５Ｍ Na
Cl中５０％スクロース上に入れた。ＳＷ２８ベックマン
ローター（SW28 Beckman rotor) 中６℃、13,000rpm で
３０分間遠心後、不溶性 cheY-Leu ２８−エチスタチン
融合タンパク質含有ペレットを水６mlに再懸濁した。
造 培養物を一夜種培養物（１％v/v)で接種し、アンピシリ
ン１００μｇ／ml含有ＬＢ培地で増殖させた。細胞密度
がＯＤ600 読取り値0.２〜0.３に達したとき、ＩＰＴＧ
を最終濃度１mMまで加えた。細胞を更に１０時間の増殖
後遠心により回収した。培養液３０００mlからの細胞ペ
レットを最終容量５０mlまで水に懸濁し、大チップ装備
フィッシャー・ソニック・ディスメンブレーター・モデ
ル３００（Fisher Sonic Dismembrator Model 300)を用
い４℃で１０分間最大出力で音波処理した。音波処理混
合液を20,000xgで１５分間遠心した。ペレットを水８ml
に再懸濁し、pH7.４の１５mMトリスHCl 及び0.５Ｍ Na
Cl中５０％スクロース上に入れた。ＳＷ２８ベックマン
ローター（SW28 Beckman rotor) 中６℃、13,000rpm で
３０分間遠心後、不溶性 cheY-Leu ２８−エチスタチン
融合タンパク質含有ペレットを水６mlに再懸濁した。
【００５０】融合タンパク質の開裂 培養液１０００mlからの融合タンパク質含有ペレットを
全容量１３ml中の７０％ギ酸中６０mM臭化シアンで開裂
させた。反応を室温で１５時間続けた。試薬を大量透析
及び凍結乾燥により除去した。
全容量１３ml中の７０％ギ酸中６０mM臭化シアンで開裂
させた。反応を室温で１５時間続けた。試薬を大量透析
及び凍結乾燥により除去した。
【００５１】組換え体-leu 28-エチスタチンの精製及び
高次構造の復元（リホールディング） 開裂された融合タンパク質を最初６０℃で５分間８Ｍグ
アニジンHCl で変性し、しかる後0.３５Ｍトリス塩基及
び６ＭグアニジンHCl の存在下室温にて１０分間0.１５
Ｍジチオスレイトールで還元した。還元されたLeu-２８
エチスタチンを0.１％トリフルオロ酢酸の存在下０〜６
５％アセトニトリル勾配でＣ１８逆相ＨＰＬＣにより精
製した。ＨＰＬＣ精製r-leu ２８−エチスタチンを0.１
Ｍ酢酸アンモニウム中タンパク質濃度0.２mg／mlで酸化
的に高次構造を復元した。高次構造の復元反応は約１２
時間毎に１回渦巻式に混合して室温で７２時間続けた。
高次構造の復元（リホールディング） 開裂された融合タンパク質を最初６０℃で５分間８Ｍグ
アニジンHCl で変性し、しかる後0.３５Ｍトリス塩基及
び６ＭグアニジンHCl の存在下室温にて１０分間0.１５
Ｍジチオスレイトールで還元した。還元されたLeu-２８
エチスタチンを0.１％トリフルオロ酢酸の存在下０〜６
５％アセトニトリル勾配でＣ１８逆相ＨＰＬＣにより精
製した。ＨＰＬＣ精製r-leu ２８−エチスタチンを0.１
Ｍ酢酸アンモニウム中タンパク質濃度0.２mg／mlで酸化
的に高次構造を復元した。高次構造の復元反応は約１２
時間毎に１回渦巻式に混合して室温で７２時間続けた。
【００５２】血小板凝集アッセイ 血小板凝集は光透過の増加により測定した。簡単にいえ
ば、r-leu ２８−エチスタチンをゲル濾過ヒト血小板
（２×１０8 細胞／ml）、フィブリノーゲン（１００μ
ｇ／ml）及びＣa2+ （１mM）含有反応混合液に加えた。
血小板凝集は他成分の添加１分間後にＡＤＰ（最終濃度
１０μＭ）を加えて開始させた。凝集率又は程度はエチ
スタチン非存在下で得られる最大光透過度の百分率とし
て表示した。
ば、r-leu ２８−エチスタチンをゲル濾過ヒト血小板
（２×１０8 細胞／ml）、フィブリノーゲン（１００μ
ｇ／ml）及びＣa2+ （１mM）含有反応混合液に加えた。
血小板凝集は他成分の添加１分間後にＡＤＰ（最終濃度
１０μＭ）を加えて開始させた。凝集率又は程度はエチ
スタチン非存在下で得られる最大光透過度の百分率とし
て表示した。
【００５３】
【数１】
【００５４】合成遺伝子のデザイン及び組立て 天然エチスタチンはｐＩ8.３の４９アミノ酸残基の一本
鎖ポリペプチドである。合成r-leu ２８−エチスタチン
遺伝子をデザインし、大腸菌cheＹ遺伝子と融合させ
た。他のヘビ毒源から単離された血小板凝集阻害剤の一
次構造は、メチオニン２８がこの阻害剤群で保存された
アミノ酸でないことを示した（ハーンら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６２巻、第
１６１５７−１６１６３頁、１９８７年）。したがっ
て、エチスタチンの２８位メチオニンをロイシンで置き
換え、メチオニンを cheＹタンパク質と組換え体-leu２
８エチスタチンとの間に挿入して、臭化シアン開裂部位
を形成させた。２つのEcoRI 付着末端を発現ベクターに
結合させるため隣接末端でデザインした。停止コドンを
３′−隣接EcoRI 部位のすぐ上流に挿入した。合成r-le
u ２８−エチスタチン遺伝子は、結合部位にKpnI及びAv
aI制限部位を含む３つの二本鎖断片から組立てた。好ま
しい大腸菌コドンを構造遺伝子で用いたが、但し制限部
位を意図的に作成した。組立てられた遺伝子は制限地図
作成及びＤＮＡ配列分析により確認した。
鎖ポリペプチドである。合成r-leu ２８−エチスタチン
遺伝子をデザインし、大腸菌cheＹ遺伝子と融合させ
た。他のヘビ毒源から単離された血小板凝集阻害剤の一
次構造は、メチオニン２８がこの阻害剤群で保存された
アミノ酸でないことを示した（ハーンら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６２巻、第
１６１５７−１６１６３頁、１９８７年）。したがっ
て、エチスタチンの２８位メチオニンをロイシンで置き
換え、メチオニンを cheＹタンパク質と組換え体-leu２
８エチスタチンとの間に挿入して、臭化シアン開裂部位
を形成させた。２つのEcoRI 付着末端を発現ベクターに
結合させるため隣接末端でデザインした。停止コドンを
３′−隣接EcoRI 部位のすぐ上流に挿入した。合成r-le
u ２８−エチスタチン遺伝子は、結合部位にKpnI及びAv
aI制限部位を含む３つの二本鎖断片から組立てた。好ま
しい大腸菌コドンを構造遺伝子で用いたが、但し制限部
位を意図的に作成した。組立てられた遺伝子は制限地図
作成及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【００５５】発現ベクターの組立て 大腸菌で r-leu２８−エチスタチンを発現させるため、
発現ベクターｐＪＣ２６４を用いた。そのベクターは既
に大腸菌で豊富かつ安定に発現されることが示された大
腸菌 cheＹタンパク質のアミノ末端８８アミノ酸につい
てコードする遺伝子を含んでいる（マツムラら、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー、第１６０巻、第３６−
４１頁、１９８４年）。このベクターにおける CheＹ遺
伝子発現はｐＵＣ１３からの大腸菌lac プロモーター−
オペレーターでコントロールされる〔メッシング（Mess
ing)、メソッズ・イン・エンザイモロジー、ウー（Wu)
ら編集、アカデミックプレス（Academic Press) 、ニュ
ーヨーク、第１０１巻、第２０−７８頁、１９８３
年〕。ｐＪＣ２６４中の cheＹ遺伝子に続いて、唯一の
PstI及びEcoRI 部位は新規オープン読取り枠のクローニ
ング及び cheＹ融合タンパク質としてそれらの誘導可能
な発現を容易化する。合成 r-leu２８−エチスタチン遺
伝子をｐＪＣ２６４のEcoRI 部位に挿入した。このベク
ターは現発現系以上の利点をいくつか有している。 Che
Ｙ融合体は通常高レベルで発現される〔下記及びベイリ
ー（Bailey) ら、ジャーナル・オブ・インダストリアル
・マイクロバイオロジー（J. Indust. Micro.)、第２
巻、第４７−５２頁、１９８７年参照〕。そのベクター
は高コピー数プラスミドｐＵＣ１３から誘導され（メッ
シング、メソッズ、イン・エンザイモロジー、ウーら編
集、アカデミック・プレス、ニューヨーク、第１０１
巻、１９８３年、第２０−７８頁）、効率的複製が観察
される高発現レベルに寄与しているのであろう。CheＹ
融合タンパク質は通常不溶性封入体としてみられる。こ
の不溶性は融合タンパク質の精製で活用することができ
る。タンパク質の不溶性は細胞内プロテアーゼによるそ
の分解も防止するかもしれない。小サイズの CheＹ部分
のために、対象タンパク質の質量比はより大きくて更に
普通に用いられるβ−ガラクトシダーゼとの融合で得ら
れる場合よりも高い。最後に、 CheＹタンパク質中でシ
ステイン残基が不存在であれば融合タンパク質における
不正確なジスルフィド結合形成の潜在的問題を回避しう
る。
発現ベクターｐＪＣ２６４を用いた。そのベクターは既
に大腸菌で豊富かつ安定に発現されることが示された大
腸菌 cheＹタンパク質のアミノ末端８８アミノ酸につい
てコードする遺伝子を含んでいる（マツムラら、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー、第１６０巻、第３６−
４１頁、１９８４年）。このベクターにおける CheＹ遺
伝子発現はｐＵＣ１３からの大腸菌lac プロモーター−
オペレーターでコントロールされる〔メッシング（Mess
ing)、メソッズ・イン・エンザイモロジー、ウー（Wu)
ら編集、アカデミックプレス（Academic Press) 、ニュ
ーヨーク、第１０１巻、第２０−７８頁、１９８３
年〕。ｐＪＣ２６４中の cheＹ遺伝子に続いて、唯一の
PstI及びEcoRI 部位は新規オープン読取り枠のクローニ
ング及び cheＹ融合タンパク質としてそれらの誘導可能
な発現を容易化する。合成 r-leu２８−エチスタチン遺
伝子をｐＪＣ２６４のEcoRI 部位に挿入した。このベク
ターは現発現系以上の利点をいくつか有している。 Che
Ｙ融合体は通常高レベルで発現される〔下記及びベイリ
ー（Bailey) ら、ジャーナル・オブ・インダストリアル
・マイクロバイオロジー（J. Indust. Micro.)、第２
巻、第４７−５２頁、１９８７年参照〕。そのベクター
は高コピー数プラスミドｐＵＣ１３から誘導され（メッ
シング、メソッズ、イン・エンザイモロジー、ウーら編
集、アカデミック・プレス、ニューヨーク、第１０１
巻、１９８３年、第２０−７８頁）、効率的複製が観察
される高発現レベルに寄与しているのであろう。CheＹ
融合タンパク質は通常不溶性封入体としてみられる。こ
の不溶性は融合タンパク質の精製で活用することができ
る。タンパク質の不溶性は細胞内プロテアーゼによるそ
の分解も防止するかもしれない。小サイズの CheＹ部分
のために、対象タンパク質の質量比はより大きくて更に
普通に用いられるβ−ガラクトシダーゼとの融合で得ら
れる場合よりも高い。最後に、 CheＹタンパク質中でシ
ステイン残基が不存在であれば融合タンパク質における
不正確なジスルフィド結合形成の潜在的問題を回避しう
る。
【００５６】組換え体−leu ２８−エチスタチンの発現 大腸菌ＪＭ１０９での組換え体-leu２８−エチスタチン
の発現を前記のようにＩＰＴＧで誘導した。誘導後に異
なる時間で発現産物を１４％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析した。誘導２時間後、予想分子
量 cheＹ−エチスタチン融合タンパク質のポリペプチド
（１4.５kDa)を全細胞溶解物中から検出した。誘導６時
間後、このタンパク質は全細胞タンパク質の少なくとも
２０％とみられる最大レベルまで蓄積した。発現タンパ
ク質は細胞の音波処理後不溶性であったが、これは封入
体が発現時に形成されたことを示している。音波処理ペ
レットを組換え体-leu２８−エチスタチンの単離のため
臭化シアン開裂に付した。
の発現を前記のようにＩＰＴＧで誘導した。誘導後に異
なる時間で発現産物を１４％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析した。誘導２時間後、予想分子
量 cheＹ−エチスタチン融合タンパク質のポリペプチド
（１4.５kDa)を全細胞溶解物中から検出した。誘導６時
間後、このタンパク質は全細胞タンパク質の少なくとも
２０％とみられる最大レベルまで蓄積した。発現タンパ
ク質は細胞の音波処理後不溶性であったが、これは封入
体が発現時に形成されたことを示している。音波処理ペ
レットを組換え体-leu２８−エチスタチンの単離のため
臭化シアン開裂に付した。
【００５７】組換え体−leu ２８−エチスタチンの精製
及び復元 臭化シアン開裂されたタンパク質を精製前に６Ｍグアニ
ジンHCl 存在下過剰のジチオスレイトールで還元した。
逆相ＨＰＬＣによる還元タンパク質の分別では、還元さ
れた天然エチスタチンの場合と同様の保持時間を有する
ピークを示した。このピークからのタンパク質のアミノ
酸配列分析では、それが純度９０％以上の組換え体-leu
２８−エチスタチンを含むことを示した。還元エチスタ
チンはＨＰＬＣ時に0.１％トリフルオロ酢酸（約pH２）
中に存在していたため、組換え体-leu２８−エチスタチ
ン内におけるチオール−ジスルフィド交換反応は非常に
遅いと予想された。したがって、凍結乾燥エチスタチン
を更に変性及び還元させずに0.１Ｍ酢酸アンモニウム存
在下で直接高次構造を復元させた。不活性タンパク質の
復元はチオール／ジスルフィド混合物を復元溶液に加え
ることで促進されることが提案された〔タム（Tam)ら、
ネーチャー、第３０９巻、１９８４年、第３７６−３７
８頁〕。我々は６ＭグアニジンHCl 存在下0.５mMジチオ
スレイトール及び１mM酸化ジチオスレイトールで組換え
体-leu２８−エチスタチンを復元させた。しかしなが
ら、高次構造の復元されたエチスタチンの収量はかかる
条件下で増えなかった。正確にホールドされたエチスタ
チンは逆相ＨＰＬＣで未ホールド種から単離した。ＨＰ
ＬＣプロフィールでは、３０％以上の還元エチスタチン
が所定条件下で正確にホールドされていることを示し
た。精製操作で得られる正確にホールドされた純粋エチ
スタチンの量は細胞培養物１リットル当たり約1.５mgと
見積もられた。組換え体-leu２８−エチスタチンを天然
エチスタチンよりやや高濃度のアセトニトリルでＣ１８
カラムから溶出させた。これは天然エチスタチンの２８
位メチオニンを組換え体-leu２８−エチスタチンでロイ
シンに代えた結果であろう。組換え体-leu２８−エチス
タチンのＮ末端アミノ酸配列を自動エドマン分解で決定
した。Ｎ末端から残基３２までの配列は、残基２８にお
けるロイシンからメチオニンへの置換を除き天然配列と
同一であることがわかった。
及び復元 臭化シアン開裂されたタンパク質を精製前に６Ｍグアニ
ジンHCl 存在下過剰のジチオスレイトールで還元した。
逆相ＨＰＬＣによる還元タンパク質の分別では、還元さ
れた天然エチスタチンの場合と同様の保持時間を有する
ピークを示した。このピークからのタンパク質のアミノ
酸配列分析では、それが純度９０％以上の組換え体-leu
２８−エチスタチンを含むことを示した。還元エチスタ
チンはＨＰＬＣ時に0.１％トリフルオロ酢酸（約pH２）
中に存在していたため、組換え体-leu２８−エチスタチ
ン内におけるチオール−ジスルフィド交換反応は非常に
遅いと予想された。したがって、凍結乾燥エチスタチン
を更に変性及び還元させずに0.１Ｍ酢酸アンモニウム存
在下で直接高次構造を復元させた。不活性タンパク質の
復元はチオール／ジスルフィド混合物を復元溶液に加え
ることで促進されることが提案された〔タム（Tam)ら、
ネーチャー、第３０９巻、１９８４年、第３７６−３７
８頁〕。我々は６ＭグアニジンHCl 存在下0.５mMジチオ
スレイトール及び１mM酸化ジチオスレイトールで組換え
体-leu２８−エチスタチンを復元させた。しかしなが
ら、高次構造の復元されたエチスタチンの収量はかかる
条件下で増えなかった。正確にホールドされたエチスタ
チンは逆相ＨＰＬＣで未ホールド種から単離した。ＨＰ
ＬＣプロフィールでは、３０％以上の還元エチスタチン
が所定条件下で正確にホールドされていることを示し
た。精製操作で得られる正確にホールドされた純粋エチ
スタチンの量は細胞培養物１リットル当たり約1.５mgと
見積もられた。組換え体-leu２８−エチスタチンを天然
エチスタチンよりやや高濃度のアセトニトリルでＣ１８
カラムから溶出させた。これは天然エチスタチンの２８
位メチオニンを組換え体-leu２８−エチスタチンでロイ
シンに代えた結果であろう。組換え体-leu２８−エチス
タチンのＮ末端アミノ酸配列を自動エドマン分解で決定
した。Ｎ末端から残基３２までの配列は、残基２８にお
けるロイシンからメチオニンへの置換を除き天然配列と
同一であることがわかった。
【００５８】組換え体−leu ２８−エチスタチンの生物
活性 組換え体-leu２８−及び天然エチスタチンの生物活性比
較は表５で示されている。エチスタチンによる血小板凝
集阻害はＡＤＰ添加後ヒトフィブリノーゲン及びCaCl2
の存在下で測定した。天然エチスタチンと同様に組換え
体タンパク質はＡＤＰ添加後光透過度の初期減少に影響
を与えなかったが、これは阻害剤が血小板活性化に影響
を与えなかったことを示している。組換え体-leu２８−
エチスタチン及び天然エチスタチンは、凝集率又は程度
に関して測定したところ、同様のＩＣ50で血小板凝集を
阻害した。したがって、組換え体-leu２８−エチスタチ
ンは血小板凝集に影響を与えうるその能力に関して天然
エチスタチンと同一のようである。その結果は、天然エ
チスタチン中２８位におけるメチオニンの存在がこの血
小板凝集阻害剤の正確なホールディング及び生物活性に
関し必須でないことを示唆している。
活性 組換え体-leu２８−及び天然エチスタチンの生物活性比
較は表５で示されている。エチスタチンによる血小板凝
集阻害はＡＤＰ添加後ヒトフィブリノーゲン及びCaCl2
の存在下で測定した。天然エチスタチンと同様に組換え
体タンパク質はＡＤＰ添加後光透過度の初期減少に影響
を与えなかったが、これは阻害剤が血小板活性化に影響
を与えなかったことを示している。組換え体-leu２８−
エチスタチン及び天然エチスタチンは、凝集率又は程度
に関して測定したところ、同様のＩＣ50で血小板凝集を
阻害した。したがって、組換え体-leu２８−エチスタチ
ンは血小板凝集に影響を与えうるその能力に関して天然
エチスタチンと同一のようである。その結果は、天然エ
チスタチン中２８位におけるメチオニンの存在がこの血
小板凝集阻害剤の正確なホールディング及び生物活性に
関し必須でないことを示唆している。
【００５９】組換えＤＮＡ技術の使用で、例えば基本Ｄ
ＮＡの部位特定変異誘発により得られる単一又は複数ア
ミノ酸置換、欠失、付加又は代替で様々に修正された誘
導ポリペプチドを製造しうる可能性も存在している。誘
導ポリペプチドで生じるこのようなすべての対立遺伝子
バリエーション及び修正は、必須の特徴的血小板凝集阻
害活性が本質的に未変化のままであるかぎり本発明の範
囲内に含まれる。ポリペプチドは(1）その最初のアミノ
酸としてメチオニン（ＡＴＧ出発シグナルコドン挿入の
せいで構造遺伝子の前に存在する）を有するように、
(2) メチオニンが細胞内又は細胞外で開裂されてその通
常最初のアミノ酸を有するように、(3) 慣用的シグナル
ポリペプチド以外のそのシグナルポリペプチド又は複合
タンパク質と共に（シグナルポリペプチド又は複合体は
細胞内又は細胞外環境下で特に開裂可能である）（英国
特許出願公開第2,007,676A号明細書参照）あるいは(4)
いかなる余分で不要なポリペプチドも開裂する必要なく
成熟形として直接発現により製造される。後者は、発現
ビヒクル（vehicle)タンパク質をそのシグナルペプチド
と共に発現するようデザインされた場合に所定宿主がシ
グナルペプチドを除去しないか又は効率的にしえないと
き特に重要である。いずれにしても、こうして産生され
た様々な形の血小板凝集阻害剤は回収されて、様々な血
管症状又は疾患の治療用にそれを適合させうるレベルま
で精製される。
ＮＡの部位特定変異誘発により得られる単一又は複数ア
ミノ酸置換、欠失、付加又は代替で様々に修正された誘
導ポリペプチドを製造しうる可能性も存在している。誘
導ポリペプチドで生じるこのようなすべての対立遺伝子
バリエーション及び修正は、必須の特徴的血小板凝集阻
害活性が本質的に未変化のままであるかぎり本発明の範
囲内に含まれる。ポリペプチドは(1）その最初のアミノ
酸としてメチオニン（ＡＴＧ出発シグナルコドン挿入の
せいで構造遺伝子の前に存在する）を有するように、
(2) メチオニンが細胞内又は細胞外で開裂されてその通
常最初のアミノ酸を有するように、(3) 慣用的シグナル
ポリペプチド以外のそのシグナルポリペプチド又は複合
タンパク質と共に（シグナルポリペプチド又は複合体は
細胞内又は細胞外環境下で特に開裂可能である）（英国
特許出願公開第2,007,676A号明細書参照）あるいは(4)
いかなる余分で不要なポリペプチドも開裂する必要なく
成熟形として直接発現により製造される。後者は、発現
ビヒクル（vehicle)タンパク質をそのシグナルペプチド
と共に発現するようデザインされた場合に所定宿主がシ
グナルペプチドを除去しないか又は効率的にしえないと
き特に重要である。いずれにしても、こうして産生され
た様々な形の血小板凝集阻害剤は回収されて、様々な血
管症状又は疾患の治療用にそれを適合させうるレベルま
で精製される。
【００６０】式Ｉの合成ポリペプチド 本発明のポリペプチドはメリフィールド（Merrifield)
、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエ
ティ（J. Am. Chem. Soc.)、第８５巻、第２１４９頁、
１９６４年で記載されるような固相合成を用いて製造し
てもよいが、ハウテン（Houghten) 、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、
第８２巻、第５１３２頁、１９８５年の合成のような当
業界で公知の他の相当化学合成法も利用可能なある。固
相合成は１９８２年１月２１日付でリビア（Rivier) ら
に発行された米国特許第4,244,946 号明細書で一般的に
記載されるように保護アミノ酸を適切な樹脂にカップリ
ングさせてペプチドのＣ末端から開始されるが、その開
始は参考のため本明細書に組込まれる。この一般的タイ
プの合成例は米国特許第4,305,872 号及び第4,316,891
号明細書で記載されている。４１残基ポリペプチドの固
相合成に関する説明はサイエンス、第２１３巻、第１３
９４−１３９７頁（１９８１年９月）のベール（Vale)
らによる論文で記載されているが、これはジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０３
巻、第３１７８頁、１９８１年のメルケ（Marke)らによ
る論文でみられる合成の更に詳細な説明である。
、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエ
ティ（J. Am. Chem. Soc.)、第８５巻、第２１４９頁、
１９６４年で記載されるような固相合成を用いて製造し
てもよいが、ハウテン（Houghten) 、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、
第８２巻、第５１３２頁、１９８５年の合成のような当
業界で公知の他の相当化学合成法も利用可能なある。固
相合成は１９８２年１月２１日付でリビア（Rivier) ら
に発行された米国特許第4,244,946 号明細書で一般的に
記載されるように保護アミノ酸を適切な樹脂にカップリ
ングさせてペプチドのＣ末端から開始されるが、その開
始は参考のため本明細書に組込まれる。この一般的タイ
プの合成例は米国特許第4,305,872 号及び第4,316,891
号明細書で記載されている。４１残基ポリペプチドの固
相合成に関する説明はサイエンス、第２１３巻、第１３
９４−１３９７頁（１９８１年９月）のベール（Vale)
らによる論文で記載されているが、これはジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１０３
巻、第３１７８頁、１９８１年のメルケ（Marke)らによ
る論文でみられる合成の更に詳細な説明である。
【００６１】ポリペプチドを合成する場合、適切に保護
されたα−アミノ基を有するカルボキシル末端アミノ酸
をクロロメチル化ポリスチレン樹脂等にカップリングさ
せる。塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸を用いるよう
なα−アミノ保護基の除去後に、合成の次のステップを
進めることができる。特定アミノ保護基除去用の他の標
準開裂試薬及び条件も公開文献で示されるように用いて
よい。次いで残りのα−アミノ及び側鎖保護アミノ酸は
樹脂に結合された中間化合物を得るため望ましい順序で
段階的にカップリングさせる。合成で各アミノ酸を別々
に加える代わりに、それらの一部を成長固相鎖への付加
前に互いにカップリングさせてもよい。適切なカップリ
ング試薬の選択は当業者の技術的範囲内に属する。
されたα−アミノ基を有するカルボキシル末端アミノ酸
をクロロメチル化ポリスチレン樹脂等にカップリングさ
せる。塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸を用いるよう
なα−アミノ保護基の除去後に、合成の次のステップを
進めることができる。特定アミノ保護基除去用の他の標
準開裂試薬及び条件も公開文献で示されるように用いて
よい。次いで残りのα−アミノ及び側鎖保護アミノ酸は
樹脂に結合された中間化合物を得るため望ましい順序で
段階的にカップリングさせる。合成で各アミノ酸を別々
に加える代わりに、それらの一部を成長固相鎖への付加
前に互いにカップリングさせてもよい。適切なカップリ
ング試薬の選択は当業者の技術的範囲内に属する。
【００６２】鎖が完全に組立られた後基が最終的に除去
されるまで、様々なアミノ酸部分の不安定側鎖基をその
部位で適切な保護基により保護しておくことはペプチド
の化学合成に共通している。アミノ酸又は断片における
α−アミノ基の保護も共通であって、その全体はカルボ
キシル基で反応するが、しかる後α−アミノ保護基を選
択的に除去させてその箇所で次の反応を行う。したがっ
て、合成ステップとしてペプチド鎖中に望ましい配列で
位置した各アミノ酸残基を含みこれら様々な残基が側鎖
保護基を有する中間化合物が製造されることは共通であ
る。次いでこれらの保護基は精製後に得られる望ましい
生成物を製造するように普通実質上同時に除去される。
望ましいアミノ酸配列が完成した後、中間ペプチドは樹
脂からペプチドを開裂させるだけでなく残りすべての側
鎖保護基を開裂させる液体ＨＦのような試薬との処理で
樹脂支持体から除去される。次いでポリペプチドは、リ
ビアら、“ペプチド：構造及び生物学的機能”（Peptid
es : Structure and Biological Function) 、１９７９
年、第１２５−１２８頁で記載されるようにゲル浸透し
かる後セミプレパラティブＨＰＬＣによって精製するこ
とができる。少なくとも９３％以上の純度（存在するす
べてのペプチドに基づく）が妥当に入手可能であって、
臨床試験及び／又は使用上好ましい。純度９８％が実用
的であるが、しかしながらあるインビトロ（試験管内）
適用のためには更に低い純度であっても許容しうる。し
たがって、ポリペプチドは実質上純粋な形である場合に
有用と考えられるが、この適用目的にとってそれは存在
する全ペプチドに基づき少なくとも約５０重量％を意味
する。本発明の様々なポリペプチドの例及び合成方法が
以下で示されている。
されるまで、様々なアミノ酸部分の不安定側鎖基をその
部位で適切な保護基により保護しておくことはペプチド
の化学合成に共通している。アミノ酸又は断片における
α−アミノ基の保護も共通であって、その全体はカルボ
キシル基で反応するが、しかる後α−アミノ保護基を選
択的に除去させてその箇所で次の反応を行う。したがっ
て、合成ステップとしてペプチド鎖中に望ましい配列で
位置した各アミノ酸残基を含みこれら様々な残基が側鎖
保護基を有する中間化合物が製造されることは共通であ
る。次いでこれらの保護基は精製後に得られる望ましい
生成物を製造するように普通実質上同時に除去される。
望ましいアミノ酸配列が完成した後、中間ペプチドは樹
脂からペプチドを開裂させるだけでなく残りすべての側
鎖保護基を開裂させる液体ＨＦのような試薬との処理で
樹脂支持体から除去される。次いでポリペプチドは、リ
ビアら、“ペプチド：構造及び生物学的機能”（Peptid
es : Structure and Biological Function) 、１９７９
年、第１２５−１２８頁で記載されるようにゲル浸透し
かる後セミプレパラティブＨＰＬＣによって精製するこ
とができる。少なくとも９３％以上の純度（存在するす
べてのペプチドに基づく）が妥当に入手可能であって、
臨床試験及び／又は使用上好ましい。純度９８％が実用
的であるが、しかしながらあるインビトロ（試験管内）
適用のためには更に低い純度であっても許容しうる。し
たがって、ポリペプチドは実質上純粋な形である場合に
有用と考えられるが、この適用目的にとってそれは存在
する全ペプチドに基づき少なくとも約５０重量％を意味
する。本発明の様々なポリペプチドの例及び合成方法が
以下で示されている。
【００６３】実施例８ アプライト・バイオシステムズ４３０Ａ（ＡＢＩ）ペプ
チドシンセサイザーでの合成に必要なＢoc−Ｏ−ベンジ
ルトレオニン−ＰＡＭ樹脂、Ｂoc保護アミノ酸及び他の
すべての試薬は製造業者から得た。側鎖保護Asp 、Glu
及びHis はビーチャム社（Bachem, Inc.)から供給され
た。溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び塩化メ
チレン（CH2Cl2) はバーディック・アンド・ジャクソン
（Burdick and Jackson)から得た。ジチオスレイトール
（ＤＴＴ）はベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethesda R
es. Labs)から購入した。ジチオエリトリトール（ＤＴ
Ｔ）はケミカル・ダイナミックス（Chemical Dynamics)
から得た。ｐ−クレゾール及びｐ−チオクレゾールはア
ルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Co.)から
得た。エチスタチン合成 Boc-Thr(Bzl)O-Pam-樹脂0.５０mM（0.６９ｇ）（樹脂１
ｇ当たりThr 0.７２mMで置換）から出発し、ＡＢＩ自動
ペプチドシンセサイザーを用いて合成を段階的に行っ
た。ケント及びクラーク−ルイス、１９８５年、生物学
及び医学における合成ペプチド、プロシ・ラブシステム
ズ・リサ・シンポ、編集アリタロら、エルスビア、オラ
ンダ、第２９頁−５７頁〔Kent and Clark-Lewis(1985)
SyntheticPeptides in Biology and Medicine, Proc. L
absystems Res. Symp., Eds. Alitalo et al., Elsevie
r, Netherlands, pp. 29-57 〕。アミノ酸は製造業者の
プレパックカートリッジ（各２mM）を用いて導入した。
側鎖保護はArg(Tos)、Asp(OcHz) 、Cys(Meb)、Glu(OcH
z) 、His(Bom)、 Lys〔Z(Cl) 〕、Ser(Bzl)、Thr(Bz
l)、 Tyr〔Z(Br) 〕であった。〔Tos,トシル；cHz 、シ
クロヘキシル；Meb 、４−メチルベンジル；Z(Cl) 、２
−クロロベンジルオキシカルボニル；Bom 、ベンジルオ
キシメチル；Bzl 、ベンジル；Z(Br) 、２−ブロモベン
ジルオキシカルボニル〕。対称無水物との二重カップリ
ング（CH2Cl2しかる後ＤＭＦとの溶媒交換で行う）をAr
g(Tos)、Asn 及びHis(Bom)以外のすべてのBoc 保護アミ
ノ酸に関して用いたが、その際ＤＭＦ中ヒドロキシベン
ゾトリアゾールエステルを二重カップリングプロトコー
ルで用いた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）脱保護中にお
けるCys 及びMet の望ましくない酸触媒酸化から保護す
るため〔ドレーパー（Draper) ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.)、第１６
巻、第１３２６−１３２９頁、１９７３年〕、0.１％
（wt／v)ＤＴＥを除去剤として加えた。Ｎ末端Glu のカ
ップリング後にBoc 基をＴＦＡで除去し、ペプチド−樹
脂を乾燥させた。Ｎ末端脱保護ペプチド−樹脂の最終重
量は4.１５ｇであった。
チドシンセサイザーでの合成に必要なＢoc−Ｏ−ベンジ
ルトレオニン−ＰＡＭ樹脂、Ｂoc保護アミノ酸及び他の
すべての試薬は製造業者から得た。側鎖保護Asp 、Glu
及びHis はビーチャム社（Bachem, Inc.)から供給され
た。溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び塩化メ
チレン（CH2Cl2) はバーディック・アンド・ジャクソン
（Burdick and Jackson)から得た。ジチオスレイトール
（ＤＴＴ）はベセスダ・リサーチ・ラブス（Bethesda R
es. Labs)から購入した。ジチオエリトリトール（ＤＴ
Ｔ）はケミカル・ダイナミックス（Chemical Dynamics)
から得た。ｐ−クレゾール及びｐ−チオクレゾールはア
ルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Co.)から
得た。エチスタチン合成 Boc-Thr(Bzl)O-Pam-樹脂0.５０mM（0.６９ｇ）（樹脂１
ｇ当たりThr 0.７２mMで置換）から出発し、ＡＢＩ自動
ペプチドシンセサイザーを用いて合成を段階的に行っ
た。ケント及びクラーク−ルイス、１９８５年、生物学
及び医学における合成ペプチド、プロシ・ラブシステム
ズ・リサ・シンポ、編集アリタロら、エルスビア、オラ
ンダ、第２９頁−５７頁〔Kent and Clark-Lewis(1985)
SyntheticPeptides in Biology and Medicine, Proc. L
absystems Res. Symp., Eds. Alitalo et al., Elsevie
r, Netherlands, pp. 29-57 〕。アミノ酸は製造業者の
プレパックカートリッジ（各２mM）を用いて導入した。
側鎖保護はArg(Tos)、Asp(OcHz) 、Cys(Meb)、Glu(OcH
z) 、His(Bom)、 Lys〔Z(Cl) 〕、Ser(Bzl)、Thr(Bz
l)、 Tyr〔Z(Br) 〕であった。〔Tos,トシル；cHz 、シ
クロヘキシル；Meb 、４−メチルベンジル；Z(Cl) 、２
−クロロベンジルオキシカルボニル；Bom 、ベンジルオ
キシメチル；Bzl 、ベンジル；Z(Br) 、２−ブロモベン
ジルオキシカルボニル〕。対称無水物との二重カップリ
ング（CH2Cl2しかる後ＤＭＦとの溶媒交換で行う）をAr
g(Tos)、Asn 及びHis(Bom)以外のすべてのBoc 保護アミ
ノ酸に関して用いたが、その際ＤＭＦ中ヒドロキシベン
ゾトリアゾールエステルを二重カップリングプロトコー
ルで用いた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）脱保護中にお
けるCys 及びMet の望ましくない酸触媒酸化から保護す
るため〔ドレーパー（Draper) ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.)、第１６
巻、第１３２６−１３２９頁、１９７３年〕、0.１％
（wt／v)ＤＴＥを除去剤として加えた。Ｎ末端Glu のカ
ップリング後にBoc 基をＴＦＡで除去し、ペプチド−樹
脂を乾燥させた。Ｎ末端脱保護ペプチド−樹脂の最終重
量は4.１５ｇであった。
【００６４】ＨＦ開裂及び酸化 組立てられたペプチド−樹脂（2.０ｇ）をＨＦ装置〔ペ
ニンスラ・ラブズ社（Peninusula Labs. Inc.)、タイプ
１Ｂ〕中で１：１（ｖ：ｖ）ｐ−チオクレゾール／ｐ−
クレゾール３mlの混合液に懸濁した。系を機械真空ポン
プで排気し、ＨＦを液体窒素冷却により凝縮させた（３
０ml）。０〜５℃で1.５時間撹拌後、反応混合液を液体
窒素トラップを用い減圧下で蒸発させた（２０〜３０分
間）。残渣をエーテルで摩砕し、濾過し、更にエーテル
で３回洗浄した。濾過された残渣を直ちに希酢酸の撹拌
溶液（0.４％／H2O)４リットルに移した。数分間の撹拌
後、混合液のpHを水酸化アンモニウムで8.０に調整し
た。濾過で樹脂を除去後、粗酸化生成物を５℃（１８時
間）しかる後環境温度で（１９〜２０℃）で３日間撹拌
せずに維持した。分析ＨＰＬＣを用いて酸化の進行をモ
ニターした。定性的エルマン（Ellman) 試験〔ハビーブ
（Habeeb) 、メソッズ・イン・エンザイモロジー、１９
７２年、編集ヒアーズ（Hirs)及びチマシェフ（Timashe
ff)、アカデミックプレス、ニューヨーク、第４５７−
４６４頁〕を用いて、精製処理前における遊離スルフヒ
ドリル基の消失をモニターした。この試験は残留ｐ−チ
オクレゾールを除去するため凍結乾燥されたサンプル１
mlで行った。
ニンスラ・ラブズ社（Peninusula Labs. Inc.)、タイプ
１Ｂ〕中で１：１（ｖ：ｖ）ｐ−チオクレゾール／ｐ−
クレゾール３mlの混合液に懸濁した。系を機械真空ポン
プで排気し、ＨＦを液体窒素冷却により凝縮させた（３
０ml）。０〜５℃で1.５時間撹拌後、反応混合液を液体
窒素トラップを用い減圧下で蒸発させた（２０〜３０分
間）。残渣をエーテルで摩砕し、濾過し、更にエーテル
で３回洗浄した。濾過された残渣を直ちに希酢酸の撹拌
溶液（0.４％／H2O)４リットルに移した。数分間の撹拌
後、混合液のpHを水酸化アンモニウムで8.０に調整し
た。濾過で樹脂を除去後、粗酸化生成物を５℃（１８時
間）しかる後環境温度で（１９〜２０℃）で３日間撹拌
せずに維持した。分析ＨＰＬＣを用いて酸化の進行をモ
ニターした。定性的エルマン（Ellman) 試験〔ハビーブ
（Habeeb) 、メソッズ・イン・エンザイモロジー、１９
７２年、編集ヒアーズ（Hirs)及びチマシェフ（Timashe
ff)、アカデミックプレス、ニューヨーク、第４５７−
４６４頁〕を用いて、精製処理前における遊離スルフヒ
ドリル基の消失をモニターした。この試験は残留ｐ−チ
オクレゾールを除去するため凍結乾燥されたサンプル１
mlで行った。
【００６５】粗製酸化エチスタチンの精製 粗製酸化溶液（４リットル）を酢酸（１０ml）の添加で
酸性化し、Ｃ18シリカ（５×３０cm、１５ｍ、３００
Ａ）カートリッジ〔ウォーターズ・アソシエーツ（Wate
rs Associates)〕に直接ポンプ注入した。生成物をプレ
パラティブＨＰＬＣ〔セパレーションズ・テクノロジー
社（Separations Technology, Inc.) 〕で精製した。ス
テップ勾配（１００ml増量）を１リットルから作り出
し、その各々について移動相の濃度を連続的に増加させ
た。流速７０ml／min で生成物を溶出させた。ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ（バイダックＣ18、２１８ＴＰ５４１５）で調べ
て均一な（＞９５％）分画をプールし、凍結乾燥して、
生成物７２mgを得た。半純粋生成物は生成物ピークのシ
ヨルダーとしてより低極性の成分で汚染されていた。そ
の生成物を前記と同様に再度ＨＰＬＣに付して更に精製
し、エチスタチン（５４mg）を得た。0.２５mMの出発物
質からみて、この重量は全収量の４％である。均一性は
分析ＨＰＬＣで実証した。合成生成物と天然物質との同
時注入では単一ピークを示した。生成物は６Ｎ HCl で
加水分解後アミノ酸分析により（表３）及び自動エドマ
ン分解（ＡＢＩ４７０Ａプロテインシークエンサー）に
よって更に特徴付けた。
酸性化し、Ｃ18シリカ（５×３０cm、１５ｍ、３００
Ａ）カートリッジ〔ウォーターズ・アソシエーツ（Wate
rs Associates)〕に直接ポンプ注入した。生成物をプレ
パラティブＨＰＬＣ〔セパレーションズ・テクノロジー
社（Separations Technology, Inc.) 〕で精製した。ス
テップ勾配（１００ml増量）を１リットルから作り出
し、その各々について移動相の濃度を連続的に増加させ
た。流速７０ml／min で生成物を溶出させた。ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ（バイダックＣ18、２１８ＴＰ５４１５）で調べ
て均一な（＞９５％）分画をプールし、凍結乾燥して、
生成物７２mgを得た。半純粋生成物は生成物ピークのシ
ヨルダーとしてより低極性の成分で汚染されていた。そ
の生成物を前記と同様に再度ＨＰＬＣに付して更に精製
し、エチスタチン（５４mg）を得た。0.２５mMの出発物
質からみて、この重量は全収量の４％である。均一性は
分析ＨＰＬＣで実証した。合成生成物と天然物質との同
時注入では単一ピークを示した。生成物は６Ｎ HCl で
加水分解後アミノ酸分析により（表３）及び自動エドマ
ン分解（ＡＢＩ４７０Ａプロテインシークエンサー）に
よって更に特徴付けた。
【００６６】
【表３】 最大1.９％の試演率が観察された。第一ステップからの
ＰＴＨアミノ酸の高収率は、Ｃ末端Glu からピロGlu へ
の環化が生じなかったことも示した。
ＰＴＨアミノ酸の高収率は、Ｃ末端Glu からピロGlu へ
の環化が生じなかったことも示した。
【００６７】合成エチスタチンの還元及び高次構造の復
元 合成エチスタチン（0.５０mg）をpH8.０の0.０７Ｍ酢酸
アンモニウム（１０mMＤＴＴ）１mlに溶解し、還元過程
しかる後分析ＨＰＬＣに付した。１時間後、出発物質は
定量的に単一の還元生成物に変換された。径１２mmの１
０００ＭＷカットオフセルロースチュービング〔スペク
トラム・メディカル社（Spectrum Medical Ind.)〕を用
いた0.０７Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH8.０）（４リ
ットル）に対する還元生成物の透析（２４時間）でエチ
スタチンのみを得た。エチスタチンが再酸化前にその完
全還元形で存在していることを証明するため、合成エチ
スタチンのＤＴＴ還元を前記のように但し６Ｍ塩酸グア
ニジン存在下で繰返した。分析ＨＰＬＣでは、還元生成
物が同一時間を有することを確認した。セミプレパラテ
ィブＨＰＬＣによる還元エチスタチンの単離しかる後定
量的エルマン分析（ハビーブ、前掲）では、生成物がオ
クタヒドロ形であることを示した。
元 合成エチスタチン（0.５０mg）をpH8.０の0.０７Ｍ酢酸
アンモニウム（１０mMＤＴＴ）１mlに溶解し、還元過程
しかる後分析ＨＰＬＣに付した。１時間後、出発物質は
定量的に単一の還元生成物に変換された。径１２mmの１
０００ＭＷカットオフセルロースチュービング〔スペク
トラム・メディカル社（Spectrum Medical Ind.)〕を用
いた0.０７Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH8.０）（４リ
ットル）に対する還元生成物の透析（２４時間）でエチ
スタチンのみを得た。エチスタチンが再酸化前にその完
全還元形で存在していることを証明するため、合成エチ
スタチンのＤＴＴ還元を前記のように但し６Ｍ塩酸グア
ニジン存在下で繰返した。分析ＨＰＬＣでは、還元生成
物が同一時間を有することを確認した。セミプレパラテ
ィブＨＰＬＣによる還元エチスタチンの単離しかる後定
量的エルマン分析（ハビーブ、前掲）では、生成物がオ
クタヒドロ形であることを示した。
【００６８】血小板凝集アッセイ 血小板凝集をクロノログ（chronolog)凝集計において３
７℃で測定した。反応混合液は洗浄された血小板（２×
１０8 ／ml）、フィブリノーゲン（１００mg／ml）、Ca
2+（１mM）及び試験される血小板凝集阻害剤分画を含有
していた。凝集は他成分が添加されてから１分間後に１
０mM ＡＤＰを加えることで開始した。反応を少なくと
も２分間続けた。凝集阻害度は阻害剤非存在下で観察さ
れる凝集率の百分率として表示した。合成エチスタチン
は天然エチスタチンの場合と区別しえない化学的及び生
物学的性質を有している（表４）。
７℃で測定した。反応混合液は洗浄された血小板（２×
１０8 ／ml）、フィブリノーゲン（１００mg／ml）、Ca
2+（１mM）及び試験される血小板凝集阻害剤分画を含有
していた。凝集は他成分が添加されてから１分間後に１
０mM ＡＤＰを加えることで開始した。反応を少なくと
も２分間続けた。凝集阻害度は阻害剤非存在下で観察さ
れる凝集率の百分率として表示した。合成エチスタチン
は天然エチスタチンの場合と区別しえない化学的及び生
物学的性質を有している（表４）。
【００６９】
【表４】 ヒト血小板凝集率を５０％（ＩＣ50）阻害させる上で必
要なペプチド濃度はドナー２〜４例の血小板を用いて調
べた。測定は各ドナーにつき２回行った。
要なペプチド濃度はドナー２〜４例の血小板を用いて調
べた。測定は各ドナーにつき２回行った。
【００７０】実施例９〜２０ 実施例８で記載されたエチスタチンを製造する一般的合
成操作に従い、エチスタチンに類似した配列を有しかつ
一般式Ｉに属する多数のポリペプチドを製造した。
成操作に従い、エチスタチンに類似した配列を有しかつ
一般式Ｉに属する多数のポリペプチドを製造した。
【００７１】
【表５】 上記略称は様々な合成ポリペプチドについて示してい
る。実施例９〜１５及び１８において、置換された配列
位置数及び天然残基に代わる残基が示されている（例え
ば、実施例９において、天然エチスタチンで存在する２
７位の残基はPheで置き換えられている）。残基１〜２
６及び２８−４９は天然エチスタチンと同一である。実
施例１６、１７、１９及び２０はカルボキシル末端側の
残基が除かれた配列である（例えば、実施例２０におい
て、残基４２−４９は除かれている）。実施例１８のme
t ＳＯはメチオニンスルホキシドを表す。
る。実施例９〜１５及び１８において、置換された配列
位置数及び天然残基に代わる残基が示されている（例え
ば、実施例９において、天然エチスタチンで存在する２
７位の残基はPheで置き換えられている）。残基１〜２
６及び２８−４９は天然エチスタチンと同一である。実
施例１６、１７、１９及び２０はカルボキシル末端側の
残基が除かれた配列である（例えば、実施例２０におい
て、残基４２−４９は除かれている）。実施例１８のme
t ＳＯはメチオニンスルホキシドを表す。
【００７２】治療有用性 本発明のポリペプチドは、ヒト又は哺乳動物血小板凝集
又は付着の阻害が望まれるいかなる状況下において投与
してもよい。本発明のポリペプチドは急速に循環系から
排出され、短時間で強い抗血栓有効性が必要とされる状
況下で血小板凝集を阻害させる上で特に有用である。こ
のため、それらは動脈及び器官の処置及び／又は血小板
と人工表面との相互作用で血小板凝集及び消費を招く心
血管手術並びに抹消動脈手術（動脈移植、頚動脈内膜切
除）において有用性を有するであろう。凝集血小板は血
栓及び血栓塞栓を形成することがある。本発明のポリペ
プチドは血栓及び血栓塞栓の形成を防止するためこれら
の手術患者に投与してもよい。体外循環が血液に酸素供
給するため心血管手術でルーチンに用いられる。血小板
は体外循環路の表面に付着する。付着は血小板膜上のＧ
ＰIIｂ／IIIaと循環路表面に吸着されたフィブリノーゲ
ンとの相互作用に依存している〔グルツコ（Gluszko)
ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー
（Amer. J. Physiol.)、１９８７年、第２５２巻Ｈ、第
６１５−６２１頁〕。人工表面から放出された血小板は
障害のある止血機能を示す。本発明のポリペプチドは付
着を妨げるために投与してもよい。
又は付着の阻害が望まれるいかなる状況下において投与
してもよい。本発明のポリペプチドは急速に循環系から
排出され、短時間で強い抗血栓有効性が必要とされる状
況下で血小板凝集を阻害させる上で特に有用である。こ
のため、それらは動脈及び器官の処置及び／又は血小板
と人工表面との相互作用で血小板凝集及び消費を招く心
血管手術並びに抹消動脈手術（動脈移植、頚動脈内膜切
除）において有用性を有するであろう。凝集血小板は血
栓及び血栓塞栓を形成することがある。本発明のポリペ
プチドは血栓及び血栓塞栓の形成を防止するためこれら
の手術患者に投与してもよい。体外循環が血液に酸素供
給するため心血管手術でルーチンに用いられる。血小板
は体外循環路の表面に付着する。付着は血小板膜上のＧ
ＰIIｂ／IIIaと循環路表面に吸着されたフィブリノーゲ
ンとの相互作用に依存している〔グルツコ（Gluszko)
ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー
（Amer. J. Physiol.)、１９８７年、第２５２巻Ｈ、第
６１５−６２１頁〕。人工表面から放出された血小板は
障害のある止血機能を示す。本発明のポリペプチドは付
着を妨げるために投与してもよい。
【００７３】これらポリペプチドの他の適用としては、
血栓溶解療法中及びその後における血小板血栓、血栓塞
栓及び再閉塞の防止並びに冠動脈及び他の動脈の血管形
成術後及び冠動脈バイパス処置後における血小板血栓、
血栓塞栓及び再閉塞の予防がある。多数の臨床センター
において、これらの処置に付された患者は本発明のポリ
ペプチドと比較して弱い血小板凝集阻害剤である抗血小
板剤を既に投与されている。本発明のポリペプチドは心
筋梗塞を防止するために用いてもよい。これらのポリペ
プチドは血流中に実質的量でデリバリーするいずれかの
慣用的手段で投与される。それらは血小板凝集を阻害す
るためプラスミノーゲンアクチベーター又はストレプト
キナーゼのような血栓溶解剤と組合せてもよい。それら
はヘパリン、アスピリン又はワルファリンのような抗凝
血剤とも組合せてよい。静脈内投与が現在好ましい投与
経路と考えられる。それらは水に可溶性であり、したが
って溶液として有効に投与しうる。１つの適用例におい
て、適量のエチスタチンが血管形成術をうける心臓発作
患者に静脈内投与される。投与は血管形成術中又はその
数分前に行うが、血小板凝集を阻害する上で十分な量、
例えば約0.０５〜２μＭの定常状態血漿濃度に到達しう
る量で行う。患者がバイパス手術をうける必要がある場
合、エチスタチン投与は直ちに停止され、アスピリン又
はモノクローナル抗体（例えば７Ｅ３、ゴールドら参
照）のような他の物質でおきる手術時の合併症を引きお
こさず、その効果は投与中止後も数時間続く。
血栓溶解療法中及びその後における血小板血栓、血栓塞
栓及び再閉塞の防止並びに冠動脈及び他の動脈の血管形
成術後及び冠動脈バイパス処置後における血小板血栓、
血栓塞栓及び再閉塞の予防がある。多数の臨床センター
において、これらの処置に付された患者は本発明のポリ
ペプチドと比較して弱い血小板凝集阻害剤である抗血小
板剤を既に投与されている。本発明のポリペプチドは心
筋梗塞を防止するために用いてもよい。これらのポリペ
プチドは血流中に実質的量でデリバリーするいずれかの
慣用的手段で投与される。それらは血小板凝集を阻害す
るためプラスミノーゲンアクチベーター又はストレプト
キナーゼのような血栓溶解剤と組合せてもよい。それら
はヘパリン、アスピリン又はワルファリンのような抗凝
血剤とも組合せてよい。静脈内投与が現在好ましい投与
経路と考えられる。それらは水に可溶性であり、したが
って溶液として有効に投与しうる。１つの適用例におい
て、適量のエチスタチンが血管形成術をうける心臓発作
患者に静脈内投与される。投与は血管形成術中又はその
数分前に行うが、血小板凝集を阻害する上で十分な量、
例えば約0.０５〜２μＭの定常状態血漿濃度に到達しう
る量で行う。患者がバイパス手術をうける必要がある場
合、エチスタチン投与は直ちに停止され、アスピリン又
はモノクローナル抗体（例えば７Ｅ３、ゴールドら参
照）のような他の物質でおきる手術時の合併症を引きお
こさず、その効果は投与中止後も数時間続く。
【００７４】本発明は組換え一本鎖組織型プラスミノー
ゲンアクチベーター又はストレプトキナーゼ及び配列 H
2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H
（各Ｒは同一又は異なるいずれかのアミノ酸を表す）を
有するポリペプチドを含む組成物にも関する。本発明は
患者において血栓溶解を促進しかつ再閉塞を防止する方
法にも関するが、その場合組換え一本鎖組織型プラスミ
ノーゲンアクチベーターの量及び配列 H2N-(Ch)-Cys-R-
R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H（各Ｒは同一又
は異なるいずれかのアミノ酸を表す）を有するポリペプ
チドの量を患者に投与する。
ゲンアクチベーター又はストレプトキナーゼ及び配列 H
2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H
（各Ｒは同一又は異なるいずれかのアミノ酸を表す）を
有するポリペプチドを含む組成物にも関する。本発明は
患者において血栓溶解を促進しかつ再閉塞を防止する方
法にも関するが、その場合組換え一本鎖組織型プラスミ
ノーゲンアクチベーターの量及び配列 H2N-(Ch)-Cys-R-
R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H（各Ｒは同一又
は異なるいずれかのアミノ酸を表す）を有するポリペプ
チドの量を患者に投与する。
【００７５】本発明のポリペプチドは骨への破骨細胞付
着を調節するために投与してもよい。径４００ミクロン
以内の大きな多核細胞であって吸着及び骨組織の除去に
関して機能する豊富な好酸性細胞質を有する破骨細胞
は、骨吸収メカニズムの一部として骨に結合するインテ
グリンレセプターを用いる。骨スライスアッセイ〔アー
ネット（Arnett) 及びデンプスター（Dempster) 、エン
ドクリノロジー（Endocrinology)、第１２０巻、第１９
８２７頁、１９８８年〕では、エチスタチンがラット破
骨細胞による骨スライスの孔形成を0.１mMのＩＣ50で阻
害することを示す。標識骨粒子からの〔3H〕プロリン放
出によると、ニワトリ破骨細胞吸収のＩＣ50は１００mM
であった。比較すると、ＲＧＤＳ合成テトラペプチドは
ラット又はニワトリ吸収をＩＣ50 0.１mMで阻害した。
〔3H〕プロリンで標識されたニワトリ破骨細胞と骨粒子
との付着実験で、エチスタチンの作用メカニズムは骨へ
の破骨細胞結合を阻害することであると確認した。エチ
スタチンは１nMカルシトニン又は１μＭプロスタグラン
ジンＥ2 に関して考えられたように破骨細胞ラメリポジ
ウムの収縮を誘導する。
着を調節するために投与してもよい。径４００ミクロン
以内の大きな多核細胞であって吸着及び骨組織の除去に
関して機能する豊富な好酸性細胞質を有する破骨細胞
は、骨吸収メカニズムの一部として骨に結合するインテ
グリンレセプターを用いる。骨スライスアッセイ〔アー
ネット（Arnett) 及びデンプスター（Dempster) 、エン
ドクリノロジー（Endocrinology)、第１２０巻、第１９
８２７頁、１９８８年〕では、エチスタチンがラット破
骨細胞による骨スライスの孔形成を0.１mMのＩＣ50で阻
害することを示す。標識骨粒子からの〔3H〕プロリン放
出によると、ニワトリ破骨細胞吸収のＩＣ50は１００mM
であった。比較すると、ＲＧＤＳ合成テトラペプチドは
ラット又はニワトリ吸収をＩＣ50 0.１mMで阻害した。
〔3H〕プロリンで標識されたニワトリ破骨細胞と骨粒子
との付着実験で、エチスタチンの作用メカニズムは骨へ
の破骨細胞結合を阻害することであると確認した。エチ
スタチンは１nMカルシトニン又は１μＭプロスタグラン
ジンＥ2 に関して考えられたように破骨細胞ラメリポジ
ウムの収縮を誘導する。
【００７６】実施例２１ 破骨細胞をチャンバース（Chambers) ら、ジャーナル・
オブ・セル・サイエンス（J. Cell Sci.) 、第６６巻、
第３８３−３９９頁、１９８４年で記載されるように１
〜３日令ラットの長骨から単離した。大腿骨、脛骨及び
上腕骨を軟組織からきれいに切出し、外科用メスで裂き
かつ削って、pH７〜7.２の１９９培地＋１０％熱不活化
牛胎児血清＋１００Ｕ／ml抗生物質〔ペニシリンＧ、ス
トレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ギブコ（Gibc
o)、ニューヨーク〕に入れた。広孔ピペットで６０回静
かに出入れした後、細胞懸濁液を１１０μｍナイロンメ
ッシュ〔スペクトラ（Spectra)〕に通し、プラスチック
皿〔コスター(Costar) 、ケンブリッジ、マサチューセ
ッツ州〕、No. １カバースリップ〔コーニング（Cornin
g)、ニューヨーク〕、ガラスキュベット〔ハーミナス
（Herminus) 〕又は骨スライスに等分した( アーネット
及びデンプスター、エンドクリノロジー、第１２０巻、
第６０２−６０８頁、１９８７年）。ラット破骨細胞培
養物に関するすべての実験は単離後最初の２４時間以内
に行った。産卵メンドリの長骨から破骨細胞をザンボニ
ン・ザロンら、１９８９年及びブレアー（Blair)ら、ジ
ャーナル・オブ・セル・バイオロジー、第１０２巻、第
１１６４−１１７２頁、１９８６年の方法により単離し
た。髄様骨はCa不足食〔５０７０Ｃ−９、プリナ・ミル
ズ社（Purina Mills Inc.)、セントルイス〕で３〜６週
間飼育された産卵メンドリ〔デカルブＸＬ（Dekalb X
L)〕の分割大腿骨及び脛骨から外科用メスで回収した。
ＰＢＳ中４℃で洗浄後、懸濁液を１１０μｍナイロンメ
ッシュに通し、しかる後0.２％ NaCl 中３７℃で３分間
浸透ショックを与えて、赤血球を溶解させた。細胞を３
５０xg（５分間、４℃）で回収し、破骨細胞を５０mlチ
ューブ（フィッシャー）中４℃で９０分間７０％血清で
沈降させた。次いで底液５mlを３ステップ（1.０７３、
1.０９９、1.１４３ｇ／cm3 ）ニコデンツ（Nycodenz)
勾配〔アキュレート（Accurate) 、コネチカット〕上に
入れ、４℃、３５０xgで２０分間回転させた。下部第一
バンド（単球）から上部ペレットまでの細胞をプール
し、４℃でpH７〜7.２のα−ＭＥＭ＋１０％血清＋抗生
物質（ギブコ）＋５μｇ／ml（シトシン−１−β−Ｄ−
アラビノフラノシド（シグマ）に再懸濁した。トリパン
ブルー（ギブコ）排除細胞を血球計数器（フィッシャ
ー）で直ちに計数し、４８ウェルプレート（コスター）
のウェル、No. １カバースリップ又はキュベット（フィ
ッシャー）当たり１〜２×１０6 全細胞（赤血球は計数
せず）で等分した。破骨細胞は典型的には全細胞群の１
０〜５０％であったが、但し例外的収率も場合により観
察された。
オブ・セル・サイエンス（J. Cell Sci.) 、第６６巻、
第３８３−３９９頁、１９８４年で記載されるように１
〜３日令ラットの長骨から単離した。大腿骨、脛骨及び
上腕骨を軟組織からきれいに切出し、外科用メスで裂き
かつ削って、pH７〜7.２の１９９培地＋１０％熱不活化
牛胎児血清＋１００Ｕ／ml抗生物質〔ペニシリンＧ、ス
トレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ギブコ（Gibc
o)、ニューヨーク〕に入れた。広孔ピペットで６０回静
かに出入れした後、細胞懸濁液を１１０μｍナイロンメ
ッシュ〔スペクトラ（Spectra)〕に通し、プラスチック
皿〔コスター(Costar) 、ケンブリッジ、マサチューセ
ッツ州〕、No. １カバースリップ〔コーニング（Cornin
g)、ニューヨーク〕、ガラスキュベット〔ハーミナス
（Herminus) 〕又は骨スライスに等分した( アーネット
及びデンプスター、エンドクリノロジー、第１２０巻、
第６０２−６０８頁、１９８７年）。ラット破骨細胞培
養物に関するすべての実験は単離後最初の２４時間以内
に行った。産卵メンドリの長骨から破骨細胞をザンボニ
ン・ザロンら、１９８９年及びブレアー（Blair)ら、ジ
ャーナル・オブ・セル・バイオロジー、第１０２巻、第
１１６４−１１７２頁、１９８６年の方法により単離し
た。髄様骨はCa不足食〔５０７０Ｃ−９、プリナ・ミル
ズ社（Purina Mills Inc.)、セントルイス〕で３〜６週
間飼育された産卵メンドリ〔デカルブＸＬ（Dekalb X
L)〕の分割大腿骨及び脛骨から外科用メスで回収した。
ＰＢＳ中４℃で洗浄後、懸濁液を１１０μｍナイロンメ
ッシュに通し、しかる後0.２％ NaCl 中３７℃で３分間
浸透ショックを与えて、赤血球を溶解させた。細胞を３
５０xg（５分間、４℃）で回収し、破骨細胞を５０mlチ
ューブ（フィッシャー）中４℃で９０分間７０％血清で
沈降させた。次いで底液５mlを３ステップ（1.０７３、
1.０９９、1.１４３ｇ／cm3 ）ニコデンツ（Nycodenz)
勾配〔アキュレート（Accurate) 、コネチカット〕上に
入れ、４℃、３５０xgで２０分間回転させた。下部第一
バンド（単球）から上部ペレットまでの細胞をプール
し、４℃でpH７〜7.２のα−ＭＥＭ＋１０％血清＋抗生
物質（ギブコ）＋５μｇ／ml（シトシン−１−β−Ｄ−
アラビノフラノシド（シグマ）に再懸濁した。トリパン
ブルー（ギブコ）排除細胞を血球計数器（フィッシャ
ー）で直ちに計数し、４８ウェルプレート（コスター）
のウェル、No. １カバースリップ又はキュベット（フィ
ッシャー）当たり１〜２×１０6 全細胞（赤血球は計数
せず）で等分した。破骨細胞は典型的には全細胞群の１
０〜５０％であったが、但し例外的収率も場合により観
察された。
【００７７】吸収アッセイ ラット及びあるニワトリ破骨細胞の吸収は、アーネット
及びデンプスター、１９８６年で記載されるように低速
ダイヤモンドノコギリで切断された牛大腿骨の骨幹〔イ
ソメット（Isomet) 、ビュラー社（Buehler Ltd.) 、レ
イクグラフ、イリノイ州〕からの骨スライス（4.４×4.
４×0.２mm）を用いて測定した。７０％エタノール中４
℃で貯蔵されたスライスを９６ウェルプレート（コスタ
ー）中でラット細胞の場合完全１９９培地0.１ml又はニ
ワトリ細胞の場合完全α−ＭＥＭ培地に入れて再水和さ
せた。湿潤CO2-空気中３７℃でラット破骨細胞及びＲＧ
Ｄ含有ペプチド〔メルク（Merck)〕と共に１５〜１８時
間のインキュベート後、骨スライスをアーネット及びデ
ンプスター、１９８６年で記載されるように失活させ、
固定し、脱水し、１％トルイジンブルーで染色させた。
吸収孔を直交ポラライザー及び回転式λ／４プレートで
反射光マイクロスコピーにより定量した〔サトー及びグ
ラッサー（Grasser)、ジャーナル・オブ・ボーン・ミネ
・リサ（J. Bone Min. Res.)、印刷中〕。ニワトリ破骨
細胞による吸収はブレアら、１９８６年で記載されるよ
うに標識骨粒子からの〔3H〕プロリン放出を測定するこ
とで追跡した。４８ウェルプレート（コスター）中のニ
ワトリ細胞を完全α−ＭＥＭ培地で３回洗浄し、しかる
後〔3H〕プロリンで標識された破砕ラット骨の２０〜５
３μm 粒子１００μｇと共に１〜３日間インキュベート
した。〔3H〕プロリンで標識された骨は２１日令ラット
に１４日間〔3H〕プロリン（１mCi ／ラット／日）を注
入することで得られ、しかる後骨をブレアら、１９８６
年で記載されるようにラットから切取り、脱水し、破壊
し、篩分けした。時間の関数としての吸収試験（図１ａ
及び１ｂ）では、培養５〜６日目にニワトリ細胞の最大
破骨細胞活性を示した。したがって、１日間の吸収実験
において、未標識骨粒子（５０μｇ、＜２０μm 分画）
を最初３日目にニワトリ細胞に加え、しかる後５日目に
標識骨（１００μｇ、２０〜５３μm ）＋試験化合物
（メルク）を加えた。一方、標識骨（１００μｇ）＋化
合物を３日目に加え、培地を６日目にＬＫＢ液体シンチ
レーションカウンターで計数してもよい。
及びデンプスター、１９８６年で記載されるように低速
ダイヤモンドノコギリで切断された牛大腿骨の骨幹〔イ
ソメット（Isomet) 、ビュラー社（Buehler Ltd.) 、レ
イクグラフ、イリノイ州〕からの骨スライス（4.４×4.
４×0.２mm）を用いて測定した。７０％エタノール中４
℃で貯蔵されたスライスを９６ウェルプレート（コスタ
ー）中でラット細胞の場合完全１９９培地0.１ml又はニ
ワトリ細胞の場合完全α−ＭＥＭ培地に入れて再水和さ
せた。湿潤CO2-空気中３７℃でラット破骨細胞及びＲＧ
Ｄ含有ペプチド〔メルク（Merck)〕と共に１５〜１８時
間のインキュベート後、骨スライスをアーネット及びデ
ンプスター、１９８６年で記載されるように失活させ、
固定し、脱水し、１％トルイジンブルーで染色させた。
吸収孔を直交ポラライザー及び回転式λ／４プレートで
反射光マイクロスコピーにより定量した〔サトー及びグ
ラッサー（Grasser)、ジャーナル・オブ・ボーン・ミネ
・リサ（J. Bone Min. Res.)、印刷中〕。ニワトリ破骨
細胞による吸収はブレアら、１９８６年で記載されるよ
うに標識骨粒子からの〔3H〕プロリン放出を測定するこ
とで追跡した。４８ウェルプレート（コスター）中のニ
ワトリ細胞を完全α−ＭＥＭ培地で３回洗浄し、しかる
後〔3H〕プロリンで標識された破砕ラット骨の２０〜５
３μm 粒子１００μｇと共に１〜３日間インキュベート
した。〔3H〕プロリンで標識された骨は２１日令ラット
に１４日間〔3H〕プロリン（１mCi ／ラット／日）を注
入することで得られ、しかる後骨をブレアら、１９８６
年で記載されるようにラットから切取り、脱水し、破壊
し、篩分けした。時間の関数としての吸収試験（図１ａ
及び１ｂ）では、培養５〜６日目にニワトリ細胞の最大
破骨細胞活性を示した。したがって、１日間の吸収実験
において、未標識骨粒子（５０μｇ、＜２０μm 分画）
を最初３日目にニワトリ細胞に加え、しかる後５日目に
標識骨（１００μｇ、２０〜５３μm ）＋試験化合物
（メルク）を加えた。一方、標識骨（１００μｇ）＋化
合物を３日目に加え、培地を６日目にＬＫＢ液体シンチ
レーションカウンターで計数してもよい。
【００７８】付着アッセイ 〔3H〕プロリン標識骨粒子（２０〜５３μm ）の付着性
は遊離及び結合プールを調べることで経時的に追跡し
た。４８ウェルプレート中のニワトリ破骨細胞に標識骨
粒子１００μｇを加えた。遊離とは培養物を培地と共に
３回撹拌することで遊離される粒子として規定された。
結合とは１Ｎ NaOH中で６時間のインキュベート及び２
回の撹拌後に遊離される粒子として規定された。全細胞
を後者の処理で完全に破壊した。次いでサンプルをパッ
カード３０６オキシダイザー（Packard 306 oxidizer)
〔キャンベラ社（Camberra Inst.) 、ニュージャージー
州〕で灰化し、計数した（ＬＫＢ）。
は遊離及び結合プールを調べることで経時的に追跡し
た。４８ウェルプレート中のニワトリ破骨細胞に標識骨
粒子１００μｇを加えた。遊離とは培養物を培地と共に
３回撹拌することで遊離される粒子として規定された。
結合とは１Ｎ NaOH中で６時間のインキュベート及び２
回の撹拌後に遊離される粒子として規定された。全細胞
を後者の処理で完全に破壊した。次いでサンプルをパッ
カード３０６オキシダイザー（Packard 306 oxidizer)
〔キャンベラ社（Camberra Inst.) 、ニュージャージー
州〕で灰化し、計数した（ＬＫＢ）。
【００７９】アデニル酸シクラーゼアッセイ ニワトリ破骨細胞を１μCi〔3H〕アデニン〔ＮＥＮリサ
ーチ・プロダクツ（NEN Research Products)、ボスト
ン、マサチューセッツ州〕と共に３７℃で２時間インキ
ュベートし、洗浄し、試験化合物の非存在下又は存在下
で１mMイソブチルメチルキサンチン（シグマ）と共に１
０分間インキュベートした。〔3H〕ｃＡＭＰを他のヌク
レオチドからカラム分離し、サロモン（Salomon)ら、ア
ナライティカル・バイオケミストリー（Anal. Bioche
m.) 、第５８巻、第５４１頁、１９７４年で記載される
ように計数した。
ーチ・プロダクツ（NEN Research Products)、ボスト
ン、マサチューセッツ州〕と共に３７℃で２時間インキ
ュベートし、洗浄し、試験化合物の非存在下又は存在下
で１mMイソブチルメチルキサンチン（シグマ）と共に１
０分間インキュベートした。〔3H〕ｃＡＭＰを他のヌク
レオチドからカラム分離し、サロモン（Salomon)ら、ア
ナライティカル・バイオケミストリー（Anal. Bioche
m.) 、第５８巻、第５４１頁、１９７４年で記載される
ように計数した。
【００８０】還元エチスタチン ジチオスレイトール３０mgと共にＧｎ緩衝液（６Ｍグア
ニジンHCl 、１mM ＥＤＴＡ、５０mMトリス、pH8.２）
0.４mlに溶解されたエチスタチン（２mg）を流し、Ｎ2
下でシールし、４０℃で９０分間インキュベートした。
次いでヨードアセトアミド８５mgを混合液に加え、Ｎ2
下４０℃で４０分間インキュベートした。反応混合液を
Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣ（ウォーターズ）によるクロマト
グラフィーに付し、分画を乾燥し、プロテインシークエ
ンサー〔モデル４７０Ａ、アプライド・バイオシステム
ズ；ガン（Gan)ら、１９８８年参照〕で分析した。
ニジンHCl 、１mM ＥＤＴＡ、５０mMトリス、pH8.２）
0.４mlに溶解されたエチスタチン（２mg）を流し、Ｎ2
下でシールし、４０℃で９０分間インキュベートした。
次いでヨードアセトアミド８５mgを混合液に加え、Ｎ2
下４０℃で４０分間インキュベートした。反応混合液を
Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣ（ウォーターズ）によるクロマト
グラフィーに付し、分画を乾燥し、プロテインシークエ
ンサー〔モデル４７０Ａ、アプライド・バイオシステム
ズ；ガン（Gan)ら、１９８８年参照〕で分析した。
【００８１】ＲＧＤ含有ペプチドは骨吸収を阻害するこ
とが観察された（図２ａ及び２ｂ）。〔3H〕プロリンで
標識された２０〜５３μm 骨粒子と共にニワトリ破骨細
胞を又は牛大腿骨の骨幹からの骨スライスと共にラット
破骨細胞を異なる濃度のＲＧＤＳ（●）、エチスタチン
（□）又はプロスタグランジンＥ2 （△）と一緒にイン
キュベートした。ニワトリ（２ａ）及びラット（２ｂ）
破骨細胞はＲＧＤＳテトラペプチド（ＩＣ50＝１０〜１
００μＭニワトリ、１００μＭラット）よりもエチスタ
チン（ＩＣ50＝0.１μＭニワトリ、0.１nMラット）に対
して感受性であった。ラット破骨細胞の吸収活性は１日
間吸収アッセイにおいてニワトリ破骨細胞と比較しエチ
スタチンに対して１０3 倍感受性であったが、しかしな
がら３例中２例のデータでは３日間ニワトリ破骨細胞に
加えられたエチスタチンが１μＭ以内で再吸収に関し有
意の効果を有することを示さず、これはエチスタチンが
培養中経時的に分解することを示唆している。比較とし
て、プロスタグランジンＥ2 はニワトリ破骨細胞の吸収
をＩＣ50＝１μＭで阻害した。チャンバースら、エンド
クリノロジー、第１１６巻、第２３４−２３９頁、１９
８５年；アーネット及びデンプスター、１９８７年参
照。
とが観察された（図２ａ及び２ｂ）。〔3H〕プロリンで
標識された２０〜５３μm 骨粒子と共にニワトリ破骨細
胞を又は牛大腿骨の骨幹からの骨スライスと共にラット
破骨細胞を異なる濃度のＲＧＤＳ（●）、エチスタチン
（□）又はプロスタグランジンＥ2 （△）と一緒にイン
キュベートした。ニワトリ（２ａ）及びラット（２ｂ）
破骨細胞はＲＧＤＳテトラペプチド（ＩＣ50＝１０〜１
００μＭニワトリ、１００μＭラット）よりもエチスタ
チン（ＩＣ50＝0.１μＭニワトリ、0.１nMラット）に対
して感受性であった。ラット破骨細胞の吸収活性は１日
間吸収アッセイにおいてニワトリ破骨細胞と比較しエチ
スタチンに対して１０3 倍感受性であったが、しかしな
がら３例中２例のデータでは３日間ニワトリ破骨細胞に
加えられたエチスタチンが１μＭ以内で再吸収に関し有
意の効果を有することを示さず、これはエチスタチンが
培養中経時的に分解することを示唆している。比較とし
て、プロスタグランジンＥ2 はニワトリ破骨細胞の吸収
をＩＣ50＝１μＭで阻害した。チャンバースら、エンド
クリノロジー、第１１６巻、第２３４−２３９頁、１９
８５年；アーネット及びデンプスター、１９８７年参
照。
【００８２】骨吸収を阻害する上で合成エチスタチン中
におけるＲＧＤ配列の重要性を調べるため、非荷電アラ
ニンがアルギニンに代わったAla24 エチスタチンと共に
破骨細胞をインキュベートした（図３ａ）。エチスタチ
ンのＲＧＤ配列中においてアルギニンに代わる置換は、
ニワトリ（○）又はラット（●）破骨細胞の吸収活性に
関して１ｐＭ〜１０μＭの範囲内で有意の効果を示さな
かった（Ｐ＞0.０７、スチューデントｔ検定）。これら
のデータは、合成エチスタチンのＲＧＤ配列中における
Arg が骨吸収を阻害する上で重要であることを示唆して
いる。
におけるＲＧＤ配列の重要性を調べるため、非荷電アラ
ニンがアルギニンに代わったAla24 エチスタチンと共に
破骨細胞をインキュベートした（図３ａ）。エチスタチ
ンのＲＧＤ配列中においてアルギニンに代わる置換は、
ニワトリ（○）又はラット（●）破骨細胞の吸収活性に
関して１ｐＭ〜１０μＭの範囲内で有意の効果を示さな
かった（Ｐ＞0.０７、スチューデントｔ検定）。これら
のデータは、合成エチスタチンのＲＧＤ配列中における
Arg が骨吸収を阻害する上で重要であることを示唆して
いる。
【００８３】吸収に影響を与える上で合成エチスタチン
中４つのジスルフィド結合の構造関与について理解する
ため、破骨細胞を還元エチスタチンと共にインキュベー
トした（図３ｂ）。合成エチスタチン中全部で８つのシ
ステインは配列分析によるとカルボキサミドメチル化さ
れていることが確認されたが、但し残りの配列はもとの
ままであった。還元エチスタチンはほとんど阻害効果を
示さなかったが、これは三次構造も吸収を阻害する上で
重要であることを示唆している。追加研究ではニワトリ
破骨細胞に３日間加えられたエチスタチンがAla24 又は
還元エチスタチンの用量応答曲線と区別しえないことを
示したが、これはエチスタチンが培養中経時的に分解す
ることを示唆している。
中４つのジスルフィド結合の構造関与について理解する
ため、破骨細胞を還元エチスタチンと共にインキュベー
トした（図３ｂ）。合成エチスタチン中全部で８つのシ
ステインは配列分析によるとカルボキサミドメチル化さ
れていることが確認されたが、但し残りの配列はもとの
ままであった。還元エチスタチンはほとんど阻害効果を
示さなかったが、これは三次構造も吸収を阻害する上で
重要であることを示唆している。追加研究ではニワトリ
破骨細胞に３日間加えられたエチスタチンがAla24 又は
還元エチスタチンの用量応答曲線と区別しえないことを
示したが、これはエチスタチンが培養中経時的に分解す
ることを示唆している。
【００８４】付着実験では、合成エチスタチンが骨に結
合することから破骨細胞を妨げること示した（図４）。
〔3H〕プロリンで標識された骨の遊離及び結合粒子を３
７℃で５〜６日間の培養後ニワトリ破骨細胞と共にイン
キュベート時間の関数として調べた。合成エチスタチン
（□）（１００nM）は破骨細胞への骨粒子の付着を１５
０分間以内で有意に阻害した。Ala24 エチスタチン
（○）（１０nM）は破骨細胞への骨付着の動態に関して
有意の効果を有さなかった。このエチスタチン濃度にお
いて、吸収は４０％まで阻害されたが、破骨細胞形態に
関してほとんど効果を示さなかった。これらのデータは
ＲＧＤ配列が骨への破骨細胞付着にとり必要であること
を示し、しかも吸収の阻害が骨への結合動態を長期化さ
せるのに寄与しうることを示唆している。
合することから破骨細胞を妨げること示した（図４）。
〔3H〕プロリンで標識された骨の遊離及び結合粒子を３
７℃で５〜６日間の培養後ニワトリ破骨細胞と共にイン
キュベート時間の関数として調べた。合成エチスタチン
（□）（１００nM）は破骨細胞への骨粒子の付着を１５
０分間以内で有意に阻害した。Ala24 エチスタチン
（○）（１０nM）は破骨細胞への骨付着の動態に関して
有意の効果を有さなかった。このエチスタチン濃度にお
いて、吸収は４０％まで阻害されたが、破骨細胞形態に
関してほとんど効果を示さなかった。これらのデータは
ＲＧＤ配列が骨への破骨細胞付着にとり必要であること
を示し、しかも吸収の阻害が骨への結合動態を長期化さ
せるのに寄与しうることを示唆している。
【００８５】エチスタチンに対する抗体との免疫ケイ光
では、合成エチスタチンが近くの単核細胞又はニワトリ
破骨細胞よりもラット破骨細胞と結合することを示し
た。合成エチスタチン（７nM）とインキュベートされた
ラット及びニワトリ破骨細胞の１日間平行接触では、ニ
ワトリよりもラットの破骨細胞と強い染色を示した。エ
チスタチンケイ光はラット破骨細胞のいたるところで観
察されたが、ニワトリ破骨細胞の場合にはラメリポジウ
ムの端部及び細胞／ガラス界面の斑点領域に主に局在化
していた。これらの構造はラット及びニワトリ双方の破
骨細胞においてビトロネクチンレセプターに対する抗体
で染色されたポドゾームのようであった（ザンボニン・
ザロンら、１９８９年）。エチスタチン１０μＭ以内の
高濃度では、ニワトリ破骨細胞の染色は７nMにおけるラ
ット破骨細胞の場合に近かった。これらのデータは、ラ
ット破骨細胞が単核細胞又はニワトリ破骨細胞よりもエ
チスタチンと高い親和性を有することを確認している。
では、合成エチスタチンが近くの単核細胞又はニワトリ
破骨細胞よりもラット破骨細胞と結合することを示し
た。合成エチスタチン（７nM）とインキュベートされた
ラット及びニワトリ破骨細胞の１日間平行接触では、ニ
ワトリよりもラットの破骨細胞と強い染色を示した。エ
チスタチンケイ光はラット破骨細胞のいたるところで観
察されたが、ニワトリ破骨細胞の場合にはラメリポジウ
ムの端部及び細胞／ガラス界面の斑点領域に主に局在化
していた。これらの構造はラット及びニワトリ双方の破
骨細胞においてビトロネクチンレセプターに対する抗体
で染色されたポドゾームのようであった（ザンボニン・
ザロンら、１９８９年）。エチスタチン１０μＭ以内の
高濃度では、ニワトリ破骨細胞の染色は７nMにおけるラ
ット破骨細胞の場合に近かった。これらのデータは、ラ
ット破骨細胞が単核細胞又はニワトリ破骨細胞よりもエ
チスタチンと高い親和性を有することを確認している。
【００８６】ＲＧＤ含有ペプチドは破骨細胞ラメリポジ
ウムの収縮を誘導することが観察された。ラット又はニ
ワトリ破骨細胞を異なる濃度のＲＧＤＳ、エチスタチン
及びAla24 エチスタチンと共にインキュベートした。こ
れらすべてのペプチドは形態学的変化を誘導したが、但
しガラス上で単離１日後のラット破骨細胞はＲＧＤＳペ
プチドと比較して１０5 倍低い濃度のエチスタチン（4.
３nM）でラメリポジウムを収縮させた。この濃度におい
て、ラメリポジウムに対する効果は近くの単核細胞に関
して観察されなかった。同様の応答はAla24 エチスタチ
ンに関して但し高濃度（３４nM）で観察された。ラット
破骨細胞のラメリポジウムは２時間以内にわたり追跡し
たところ１０μＭ ＲＧＤＳ、４３ｐＭエチスタチン又
は3.４nMAla24 エチスタチンで収縮しなかった。これら
の濃度において、ラメリポジウムの伸張／収縮及び波打
ち運動性は増加した。単離１日後に観察されたニワトリ
破骨細胞は同濃度のＲＧＤＳペプチド（0.１mM）に応答
してラメリポジウムを収縮させたが、但しラット破骨細
胞と比較して１０3 倍高い濃度のエチスタチン（６μ
Ｍ）を要した。
ウムの収縮を誘導することが観察された。ラット又はニ
ワトリ破骨細胞を異なる濃度のＲＧＤＳ、エチスタチン
及びAla24 エチスタチンと共にインキュベートした。こ
れらすべてのペプチドは形態学的変化を誘導したが、但
しガラス上で単離１日後のラット破骨細胞はＲＧＤＳペ
プチドと比較して１０5 倍低い濃度のエチスタチン（4.
３nM）でラメリポジウムを収縮させた。この濃度におい
て、ラメリポジウムに対する効果は近くの単核細胞に関
して観察されなかった。同様の応答はAla24 エチスタチ
ンに関して但し高濃度（３４nM）で観察された。ラット
破骨細胞のラメリポジウムは２時間以内にわたり追跡し
たところ１０μＭ ＲＧＤＳ、４３ｐＭエチスタチン又
は3.４nMAla24 エチスタチンで収縮しなかった。これら
の濃度において、ラメリポジウムの伸張／収縮及び波打
ち運動性は増加した。単離１日後に観察されたニワトリ
破骨細胞は同濃度のＲＧＤＳペプチド（0.１mM）に応答
してラメリポジウムを収縮させたが、但しラット破骨細
胞と比較して１０3 倍高い濃度のエチスタチン（６μ
Ｍ）を要した。
【００８７】骨基質への破骨細胞結合を阻害するため、
本発明のポリペプチドは静脈内、皮下、経口、経直腸、
局所、非経口、経眼、経鼻、経口腔及びその他の投与を
含めたいくつかの方法のうち１つで患者に投与される。
剤形としては錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、
カプセル、クリーム、軟膏、エアゾールその他がある。
投与されるポリペプチドの量は骨への破骨細胞付着を阻
害しうる量、例えば骨中で約0.１〜１０nM、好ましい約
１nMの濃度に達しうる量である。骨への破骨細胞付着を
阻害するために適した医薬組成物は、活性成分として本
発明のポリペプチド又はその薬学上許容される塩と薬学
上許容されるキャリアとを含んでいる。“薬学上許容さ
れる塩”という用語は、無機及び有機酸及び塩基を含め
た薬学上許容される無毒性の酸又は塩基から製造される
塩に関する。本組成物としては経口、経直腸、経眼、経
肺、経鼻、経皮、局所又は非経口（皮下、筋肉内及び静
脈内を含む）投与に適した組成物があるが、但しいずれ
か所定のケースにおいて最も適した経路は治療される症
状の性質及び程度並びに活性成分の性質に依存してい
る。それらは単位投薬形として供給されることが都合よ
く、調剤業界で周知のいずれかの方法で製造される。
本発明のポリペプチドは静脈内、皮下、経口、経直腸、
局所、非経口、経眼、経鼻、経口腔及びその他の投与を
含めたいくつかの方法のうち１つで患者に投与される。
剤形としては錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、
カプセル、クリーム、軟膏、エアゾールその他がある。
投与されるポリペプチドの量は骨への破骨細胞付着を阻
害しうる量、例えば骨中で約0.１〜１０nM、好ましい約
１nMの濃度に達しうる量である。骨への破骨細胞付着を
阻害するために適した医薬組成物は、活性成分として本
発明のポリペプチド又はその薬学上許容される塩と薬学
上許容されるキャリアとを含んでいる。“薬学上許容さ
れる塩”という用語は、無機及び有機酸及び塩基を含め
た薬学上許容される無毒性の酸又は塩基から製造される
塩に関する。本組成物としては経口、経直腸、経眼、経
肺、経鼻、経皮、局所又は非経口（皮下、筋肉内及び静
脈内を含む）投与に適した組成物があるが、但しいずれ
か所定のケースにおいて最も適した経路は治療される症
状の性質及び程度並びに活性成分の性質に依存してい
る。それらは単位投薬形として供給されることが都合よ
く、調剤業界で周知のいずれかの方法で製造される。
【００８８】実用上、本発明のポリペプチドは慣用的医
薬配合技術に従い製剤キャリアと完全混合された活性成
分として混合することができる。キャリアは例えば経口
又は非経口（静脈内を含む）のような投与で望まれる製
剤形に応じて様々な形をとってよい。経口投薬形用の組
成物を製造する際には、例えば懸濁液、エリキシル及び
溶液のような経口液体製剤の場合で例えば水、グリコー
ル、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤等のよう
なキャリア又は例えば粉末、カプセル及び錠剤のような
経口固体製剤の場合でデンプン、糖、微結晶セルロー
ス、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のよう
なキャリアの如きいずれか通常の製剤媒体が使用可能で
ある。それらの粉末容易性の理由から錠剤及びカプセル
が最も有利な経口投薬単位形であるが、その場合におい
て固体製剤キャリアが明らかに用いられる。所望であれ
ば、錠剤は標準的技術で糖衣化又は腸溶性コーティング
してもよい。前記通常の剤形に加えて、本ポリペプチド
は制御的放出手段及び／又は送出し（デリバリー）器具
で投与してもよい。
薬配合技術に従い製剤キャリアと完全混合された活性成
分として混合することができる。キャリアは例えば経口
又は非経口（静脈内を含む）のような投与で望まれる製
剤形に応じて様々な形をとってよい。経口投薬形用の組
成物を製造する際には、例えば懸濁液、エリキシル及び
溶液のような経口液体製剤の場合で例えば水、グリコー
ル、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤等のよう
なキャリア又は例えば粉末、カプセル及び錠剤のような
経口固体製剤の場合でデンプン、糖、微結晶セルロー
ス、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のよう
なキャリアの如きいずれか通常の製剤媒体が使用可能で
ある。それらの粉末容易性の理由から錠剤及びカプセル
が最も有利な経口投薬単位形であるが、その場合におい
て固体製剤キャリアが明らかに用いられる。所望であれ
ば、錠剤は標準的技術で糖衣化又は腸溶性コーティング
してもよい。前記通常の剤形に加えて、本ポリペプチド
は制御的放出手段及び／又は送出し（デリバリー）器具
で投与してもよい。
【００８９】経口投与用に適した本発明の医薬組成物は
カプセル、カシュ剤又は錠剤のような個別的単位として
供給してもよく、各々が粉末又は顆粒としてあるいは水
性液体，非水性液体、水中油型エマルジョン又は油中水
型液体エマルジョンの溶液又は懸濁液として既定量の活
性成分を含有している。このような組成物はいかなる調
剤方法で製造してもよいが、但しすべての方法が１種以
上の必須成分からなるキャリアと活性成分とを配合する
工程を含んでいる。一般に、本組成物は活性成分を液体
キャリア、微細固体キリャア又は双方と均一かつ完全に
混合し、しかる後必要であれば製品を所望の供給品に成
形して製造される。例えば、錠剤は場合により１種以上
の補助成分と共に圧縮又は成形して製造される。圧縮錠
剤は適切な機械において場合により結合剤、滑沢剤、不
活性希釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合させて活性成
分を粉末又は顆粒のような易流動形に圧縮することによ
り製造してもよい。成形錠剤は不活性液体希釈剤で湿潤
された粒末化合物の混合物を適切な機械で成形すること
により製造してもよい。骨への破骨細胞付着を阻害する
ために好ましい方法では、エチスタチン及び薬学上許容
されるキャリアからなる組成物を患者に投与する。
カプセル、カシュ剤又は錠剤のような個別的単位として
供給してもよく、各々が粉末又は顆粒としてあるいは水
性液体，非水性液体、水中油型エマルジョン又は油中水
型液体エマルジョンの溶液又は懸濁液として既定量の活
性成分を含有している。このような組成物はいかなる調
剤方法で製造してもよいが、但しすべての方法が１種以
上の必須成分からなるキャリアと活性成分とを配合する
工程を含んでいる。一般に、本組成物は活性成分を液体
キャリア、微細固体キリャア又は双方と均一かつ完全に
混合し、しかる後必要であれば製品を所望の供給品に成
形して製造される。例えば、錠剤は場合により１種以上
の補助成分と共に圧縮又は成形して製造される。圧縮錠
剤は適切な機械において場合により結合剤、滑沢剤、不
活性希釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合させて活性成
分を粉末又は顆粒のような易流動形に圧縮することによ
り製造してもよい。成形錠剤は不活性液体希釈剤で湿潤
された粒末化合物の混合物を適切な機械で成形すること
により製造してもよい。骨への破骨細胞付着を阻害する
ために好ましい方法では、エチスタチン及び薬学上許容
されるキャリアからなる組成物を患者に投与する。
【００９０】実施例２２骨への破骨細胞付着を阻害する
ための組成物は、骨中で１nM濃度の活性成分に到達させ
るため静脈内投与用に製造される。本組成物は無菌塩水
中エチスタチンの等張溶液であって、その場合のエチス
タチン濃度は１μＭである。
ための組成物は、骨中で１nM濃度の活性成分に到達させ
るため静脈内投与用に製造される。本組成物は無菌塩水
中エチスタチンの等張溶液であって、その場合のエチス
タチン濃度は１μＭである。
【００９１】
【配列表】配列番号 ：１ 配列の長さ：４９ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys 1 5 10 Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg 15 20 Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr 25 30 35 Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 40 45 Thr
【００９２】配列番号 ：２ 配列の長さ：４９ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys 1 5 10 Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg 15 20 Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr 25 30 35 Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 40 45 Thr
【００９３】配列番号 ：３ 配列の長さ：４６ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Gln Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp Ala Ala Thr 1 5 10 Cys Lys Leu Yhr Pro Gly Ser Gln Cys Ala Glu Gly 15 20 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Lys Phe Ile Lys Ala Gly 25 30 35 Xaa Ile Cys Xaa Arg Ala Arg Gly Asp Asn... 40 45
【００９４】配列番号 ：４ 配列の長さ：８３ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Pro Val Cys Gly Asn Glu Leu Leu Glu Glu 1 5 10 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Cys 15 20 Gln Asp Arg Cys Cys Asn Ala Ala Thr Cys Lys Keu 25 30 35 Thr Pro Gly Ser Gln Cys Asn His Gly Glu Cys Cys 40 45 Asp Gln Cys Lys Phe Lys Lys Ala Arg Thr Val Cys 50 55 60 Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys 65 70 Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys Pro Trp Asn His 75 80
【００９５】配列番号 ：５ 配列の長さ：８３ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Pro Val Cys Gly Asn Glu Leu Leu Glu Gln 1 5 10 Gly Glu Asp Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Cys 15 20 Gln Asp Gln Cys Cys Asn Ala Ala Thr Cys Lys Leu 25 30 35 Thr Pro Gly Ser Gln Cys Asn His Gly Glu Cys Cys 40 45 Asp Gln Cys Lys Phe Lys Lys Ala Arg Thr Val Cys 50 55 60 Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys 65 70 Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys Pro Trp Asn His 75 80
【００９６】配列番号 ：６ 配列の長さ：８４ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ser Pro Pro Val Cys Gly Asn Lys Leu Leu Glu 1 5 10 Glu Gly Glu Asp Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn 15 20 Cys Gln Asp Gln Cys Cys Asn Ala Ala Thr Cys Lys 25 30 35 Leu Thr Pro Gly Ser Gln Cys Asn His Gly Glu Cys 40 45 Cys Asp Gln Cys Lys Phe Lys Lys Ala Arg Thr Val 50 55 60 Cys Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr 65 70 Cys Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys Pro Trp Asn His 75 80
【００９７】配列番号 ：７ 配列の長さ：４９ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Glu Glu Pro Cys Ala Thr Gly Pro Cys Cys Arg 1 5 10 Arg Cys Lys Phe Lys Arg Ala Gly Lys Val Cys Arg 15 20 Val Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys Thr 25 30 35 Gly Lys Ser Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro Trp Asn 40 ４５ His.
【００９８】配列番号 ：８ 配列の長さ：８３ 配列の型 ：アミノ鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Pro Val Cys Gly Asn Glu Llu Leu Glu Gln 1 5 10 Gly Glu Asp Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Cys 15 20 Gln Asp Gln Cys Cys Asn Ala Ala Thr Cys Lys Leu 25 30 35 Thr Pro Gly Ser Gln Cys Asn His Gly Glu Cys Cys 40 45 Asp Gln Cys Lys Phe Lys Lys Ala Arg Thr Val Cys 50 55 60 Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys 65 70 Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys Pro Trp Asn His 75 80
【図１ａ】ニワトリ破骨細胞活性に関する骨の孔数と培
養日数との関係を示した説明図である。
養日数との関係を示した説明図である。
【図１ｂ】ニワトリ破骨細胞活性に関する骨量と培養日
数との関係を示した説明図である。
数との関係を示した説明図である。
【図２ａ】ニワトリ破骨細胞活性に関する吸収率と各用
量のエチスタチン、ＲＧＤＳ及びPGE2 との関係を示し
た説明図である。
量のエチスタチン、ＲＧＤＳ及びPGE2 との関係を示し
た説明図である。
【図２ｂ】ラット破骨細胞に関する吸収率と各用量のエ
チスタチン及びＲＧＤＳとの関係を示した説明図であ
る。
チスタチン及びＲＧＤＳとの関係を示した説明図であ
る。
【図３ａ】ニワトリ及びラット破骨細胞に関する吸収率
と各用量のAla24 エチスタチンとの関係を示した説明図
である。
と各用量のAla24 エチスタチンとの関係を示した説明図
である。
【図３ｂ】ニワトリ及びラット破骨細胞に関する吸収率
と各用量の還元エチスタチンとの関係を示した説明図で
ある。
と各用量の還元エチスタチンとの関係を示した説明図で
ある。
【図４】破骨細胞付着阻害に関するエチスタチン及びAl
a24 エチスタチンの効果を経時的に示した説明図であ
る。
a24 エチスタチンの効果を経時的に示した説明図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ウイリアム エー．グラツサー アメリカ合衆国，18901 ペンシルヴアニ ア，ニユー ブリテン，カルーセル サー クル 82 (72)発明者 ロバート ジエー．ゴウルド アメリカ合衆国，18054 ペンシルヴアニ ア，グリーンレーン，グラヴエル パイク 973
Claims (4)
- 【請求項１】 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物で
あって、 下記一般式を有するポリペプチド： X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y （上記式中ＸはＨ又は少なくとも１つのアミノ酸であ
る；ＹはＯＨ又は少なくとも１つのアミノ酸である；各
Ｒは同一又は異なるいずれかのアミノ酸である）又はそ
のポリペプチドの薬学上許容される塩の有効量及び薬学
上許容されるキャリアを含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 下記ポリペプチド： Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys 1 5 10 Phe Leu Lys Glu Gly Thr Ile Cys Lys Arg Ala Arg 15 20 Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr 25 30 35 Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 40 45 Thr 又はそのポリペプチドの薬学上許容される塩及び薬学上
許容されるキャリアを含む、請求項１記載の骨への破骨
細胞付着を阻害する組成物。 - 【請求項３】 患者において骨への破骨細胞付着を阻害
するための方法であって、患者に請求項１記載の組成物
を投与することを特徴とする方法。 - 【請求項４】 患者において骨への破骨細胞付着を阻害
するための方法であって、患者に請求項２記載の組成物
を投与することを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46368590A | 1990-01-11 | 1990-01-11 | |
| US463685 | 1990-01-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0570364A true JPH0570364A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=23840957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3001930A Withdrawn JPH0570364A (ja) | 1990-01-11 | 1991-01-11 | 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0437367A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0570364A (ja) |
| CA (1) | CA2033928A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672585A (en) * | 1990-04-06 | 1997-09-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US5780303A (en) * | 1990-04-06 | 1998-07-14 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US6521594B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-02-18 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US6017877A (en) * | 1990-04-06 | 2000-01-25 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US5204350A (en) * | 1991-08-09 | 1993-04-20 | Merck & Co., Inc. | Method of inhibiting osteoclast-mediated bone resorption by administration of n-heterocyclicalkyl-substituted phenyl derivatives |
| US5217994A (en) * | 1991-08-09 | 1993-06-08 | Merck & Co., Inc. | Method of inhibiting osteoclast-mediated bone resorption by administration of aminoalkyl-substituted phenyl derivatives |
| US5770565A (en) * | 1994-04-13 | 1998-06-23 | La Jolla Cancer Research Center | Peptides for reducing or inhibiting bone resorption |
-
1991
- 1991-01-10 CA CA002033928A patent/CA2033928A1/en not_active Abandoned
- 1991-01-10 EP EP19910300179 patent/EP0437367A3/en not_active Withdrawn
- 1991-01-11 JP JP3001930A patent/JPH0570364A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2033928A1 (en) | 1991-07-12 |
| EP0437367A3 (en) | 1992-07-08 |
| EP0437367A2 (en) | 1991-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3281370B2 (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| JP2755351B2 (ja) | 抗―凝集ペプチド | |
| US5461034A (en) | Osteogenic growth polypeptides identified from regenerating bone marrow | |
| EP0775711B1 (en) | Peptide having antithrombotic activity and process for producing the same | |
| EP0338634B1 (en) | Viper venom polypeptides and genetic expression | |
| EP0220241B1 (en) | Purified protein having angiogenic activity and methods of preparation | |
| EP0317053B1 (en) | Trigramin- a platelet aggregation inhibiting polypeptide | |
| JPH06503474A (ja) | トロンビンおよび血小板活性化の二機能性阻害剤 | |
| EP0382451A2 (en) | Viper venom Polypeptides and variants | |
| RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
| JPH06502407A (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| WO1993016709A1 (en) | Therapeutic domains of von willebrand factor | |
| RU2109816C1 (ru) | Рекомбинантный полипептид, способ ингибирования агрегации тромбоцитов, рекомбинантная плазмидная днк (варианты), рекомбинантный штамм e.coli (варианты), способ получения полипептида | |
| US5849702A (en) | Cloning and production of human von Willebrand factor GPIB binding domain polypeptides and methods of using same | |
| JP2872255B2 (ja) | ファクター▲ｖｉｉｉ▼の高収量生産法 | |
| JPH0570364A (ja) | 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方法 | |
| Knight et al. | Functional expression of bitistatin, a disintegrin with potential use in molecular imaging of thromboembolic disease | |
| WO1990015072A1 (en) | Platelet aggregation inhibitors and related molecules | |
| JPH0733337B2 (ja) | 血小板のコラーゲンへの付着をブロックする方法 | |
| US5232912A (en) | Anticoagulant peptides | |
| EP0382538A3 (en) | A process for the preparation of cysteine-rich polypeptides, including echistatin | |
| AU645077C (en) | Cloning and production of human von willebrand factor GPIb binding domain polypeptides and methods of using same | |
| JPH05504559A (ja) | メルカプタンまたはスルフィド基含有の抗―凝集ペプチド | |
| JPH03506039A (ja) | 転移防止性ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980514 |