JPH06502407A - 血小板凝集阻害剤 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 血小板凝集阻害量 発明の分野 本発明の血小板凝集の阻害剤に関する。具体的には、本発明は、血小板凝集の最 終的な共通経路のアンタゴニスト（拮抗剤）として作用することができ、強力な 抗血栓症剤として作用するトリペプチド配列−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−を含む ペプチドに関する。さらに本発明は、血小板凝集と細胞内接着の遮断を要する疾 患におけるこれら阻害剤の医療的応用に関する。

発明の背景 血小板は全血中に認められる粒子であり、血栓形成と血液凝固に関与することが 知られている。血小板の表面には貫膜糖タンパク質受容体ＧＰＩＩゎＴＩＬが存 在し、これが凝固過程に関与することが知られている。ＧＰＩｌ、ＩＩｌ、はア ルファ・サブユニットとベータ・サブユニットからなる非共有結合的なカルシウ ムイオン依存性へテロニ量複合体であり（ジエニングスら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅ＋ｎ、　（１９８２）２５７．１０４５８）、タンパク質リガンド（配 位子）を結合することができる。この糖タンパク質受容体はトリペプチドアミノ 酸配列Ａｒｇ−Ｇ］　ｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含有するタンパクタンパク質リガ ンドはフィブリノーゲンである。フィブリノーゲンはＡα９５−９７とＡα５７ ２−５７４に位置する２つのＲＧＤ配列を含有しくトウーリトル。

アール・エフ、ワット、ケイ・ダブリュ・ケイ、コルトレル、ビー・エイ、スト ロング。

るという証拠は、主として結合および阻害データ並びに合成ＲＧＤペプチド（ガ ードナー、ティ・ケイ及びベネソト、ジエイーニス（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．１１８９１−１１８９４　；プロウ、イー・エフ、 ビア／ユバツバ−、エム・ディ、ルオスラーチ、イー。

マルグエリエ、ノー・エイ及びジンスバーグ、エム・エイチ（１９８５）　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　８２．８０５７−８０６１　； 　ハバースティック、ディ・エム、コーワン、ジエイ・エフ。

ヤマダ、ケイ・エム及びサントロ、ニス（１９＋１１５）　Ｂｌｏｏｄ　６６、 ９４６−９５２）　；ドゥソウザ、ニス・イー、ジンスバーグ、エム・エイチ、 ラム、ニス−シー・ティ及びブロウ、イー・エフ（１９８ｇ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅａ＋、　２６３．３９４３−３９５１）およびガンマ鎖カルボキン末 端頚縁体（クロクゼウィンク、エム、ティセンス。ニス、ベドナレク、エム・エ イ、サコン、エム及びホイガー、ジエイ（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｓｔｒ ｙ　２８．２９１５−２９１９）による研究から導かれている。後者の研究では ガンマ鎖カルボキン末端ドデカペプチドのアミノ酸置換はすべてその類縁体の阻 害活性を減じたが、例外としてＡ　Ｉ　ａ４０８（即ちＧＤの直前）をＡｒｇで 置換した場合にのみ阻害効力が６倍増大した（ティモンスら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｊｓｔｒＹ　２＆　２９］９−２９２３（１９８９）をも参照のこと）。

Ｇ　ＰＩｌ、ＨＬのフィブリノーゲンとの相互作用は血管が損傷を受けた時に放 出もしくはａ露されるある種の因子によって刺激される。様々な生理学的刺激物 質及び可溶性媒介物質を含む複数の因子が数種の経路を介して血小板の活性化を 開始する。これらの経路では共通する最終段階として、血小板表面上のＧ　ＰＩ ｌ、ＨＴ、受容体の活性化及びそれに続くそのフィブリノーゲンへの結合、さら にその後に凝集および血栓形成が起こる。これらの相互作用ゆえに、ＧＰＩＩｂ ＩＩＴ、は血小板凝集系の重要な成分である（ピテラら、　５ｃｉｅｎｃｅ（１ ９８６）２３１．１５５９）。したがって、ＧＰｒｌ、ＩＩｌ、のＡｒｇ−Ｇａ ｙ−Ａｓｐ含有含有タンパクツィブリノーゲンなど）との相互作用を阻害するこ とは、血栓形成を調節する１つの方法である。この結合相互作用を防止する阻害 剤はなんらかの刺激による血小板の活性化と拮抗するであろうから、重要な抗血 栓症特性を有するであろう。

しかし、ＲＧＤ配列を含有するタンパク質およびペプチドは、Ｇ　ＰＩｌ、ＩＩ ｌ、以外にもい（つかの池の細胞接着受容体にリガンドとして認識されることが わかっている。これらの細胞接着受容体はインテグリン類として知られているヘ テロニ量体タンパク質受容体ファミリーからなる（ジンスバーグ、エム・ヘイチ 、ロフタス、ジェイ・シーおよびブロウ、イー−ｘ〕（１９８８）　Ｔｈｒｏｍ ｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｂａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　５９゜１−６：ハインズ、アー ル・オー（１９８８）　Ｃｅ１ｌ　４ｇ、５４９−５５４）。ＲＧＤ含有リガン ドに結合することが明らかにされている他の受容体にはビトロネクチン受容体（ ＶｎＲ）およびフィブロネクチン受容体（Ｆ　ｎ　Ｒ）がある（ピテラら（１９ ８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ωｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ２．５７６６−５ ７７０　、ビテラら（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４０．１９１−１．９８　＋サン シェラ−マドリッドら（１９８３）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、　１５ｇ、１７ ８５−１８０３）。さらに、他のインテグリン受容体もＲＧＤ含有リガンドと相 互作用することが発見され得ると考えられている。したがって特に有用な抗血栓 症剤は、他のインテグリン類とそれらの内因性リガンドの間の相互作用には作用 することなく、ＲＧＤ含有タンパク質と血小板ＧＰＩ１、ＩＩｌ、受容体の間の 相互作用を特異的に阻害するものであろう。

多くの一般的な人間の障害は、血管内の血栓および塞栓を導く高血栓状態に関連 することを特徴とする。これらは梗塞、発作および静脈炎を導く医学的罹患率の 主たる原因であり、また発作および心肺閉塞による死亡率の主たる原因でもある 。アテローム性動脈硬化症の患者は様々な理由による動脈血栓塞栓的徴候を起こ しやすい。アテローム性動脈硬化斑は血小板栓と血栓の病巣を形成し、ミれらが 血管の狭窄化とｗｉ塞を導き、心筋と脳の虚血性疾患をもたらす。これは血管形 成術や動脈内膜切除などの手術と同時もしくはその後に起こり得る。剥がれて循 環系に放出された血栓は異なる器官、とりわけ脳、四肢、心臓および腎臓の梗塞 を引き起こす。

動脈血栓症に関与することに加えて、血小板は静脈血栓症にも役割を果たし得る 。そのような患者の大部分は先行する危険因子を持たず、静脈血栓静脈炎を起こ し、次いで原因がわからないまま肺閉塞を起こす。静脈血栓を形成する他の患者 はこれらの症候群にかかりやすいことが知られている潜在的な疾患を有する。

これらの患者のうちの幾人かは凝固亢進を正常に防止する因子（アンチトンロン ビン−３など）の遺伝的もしくは後天的な欠損症であり得る。他の患者は腫瘍塊 など静脈流に機械的な支障があり、それが低流量状態と血栓症を導（。悪性腫瘍 の、を者は、理由は不明瞭であるが血栓症的徴候の発生率が高い。現在利用でき る薬剤によるこの状況下での抗血栓症療法は危険であり、また効果がないことも 多い。

血液が補綴的合成心臓弁などの人工的な表面や体外潅流装置を通過する患者は血 小板栓、血栓および塞栓の発生する危険にさらされている。例えば人工心臓弁を 持つ患者については連続的に抗凝固処置することが標準的な治療である。しかし いずれの場合にも、妥当な抗凝固処置にもかかられずまだ血小板の活性化および 塞栓形成が起こり得る。

したがって、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、人工心臓弁、癌を伴う患 者および発作、静脈炎または肺閉塞の経歴を有する患者を含む、大きなカテゴリ ーに属する患者は限定的もしくは慢性的な抗血栓症療法の候補である。利用でき る治療剤の数は限られており、これらの大部分は循環中の凝固因子のレベルを抑 制もしくは減少させることによって作用する。これらの薬剤は、血小板凝集と接 着の傾向の増大にしばしば関与する、患者の持つ潜在的な血液学的問題に対して は効果がないことが多い。またこれらは患者に異常な出血を起こしやすくするも のでもある。アスピリンなどの利用可能な抗血小板剤は血小板活性化過程の一部 を阻害するにすぎず、それゆえに治療としては充分でないことも多い。

したがって、血小板活性化の最終的な共通経路、即ちＧＰＩＩｂＩＩｌ、受容体 に対するフィブリノーゲンの結合を有効に阻害する薬剤は高血栓状態を特徴とす る上述の大きい障害群で有用であるにちがいない。本発明は新しい組成物、即ち 天然のアミノ酸の一部および非天然のアミノ酸の一部に存し得るポリペプチド並 びに非ベブチンル部分であるそのような物質を意図するものである。この新しい 組成物は、Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ含有ペプチド（とりわけフィブ リノーゲン）のＧＰＩｌ、ＩＩｌ、複合体との相互作用を妨害し、それによって 血小板凝集を防止すると考えられる。血小板凝集は循環系中の血小板栓、塞栓お よび血栓の形成における初期段階であると同定されており、これらは次いて心血 管の合併症および疾患に積極的な役割を果たすことが明らかにされている。Ｇ　 Ｐ　Ｉｌ、ＩＩＩ、複合体に対するフィブリノーゲン結合の阻害は、動物におい て効果的な抗血栓症治療であることが示されている（エイチ・ケイ・ゴールドら 、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９８８）７７、６７０−６７７　；ティ”ヤス ダら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　（１９８ｇ）８１．１２８４−１ ２９１　；ビー・ニス・コラ−ら、　Ｂｌｏｏｄ（１９８U）６ ８、７８３−７８６）。

環状／スルフィドを含むいくつかの合成ペプチドが血小板に対するフィブリノー ゲン結合の阻害剤として開示されており、これらはすべてＡｒｇ−Ｇａｙ−Ａｓ ｐ配列を含有する。米国特許第４６８３．２９１号；ＷＯ３９１０５１５０；Ｅ Ｐｏ　０　３１９　５０６　Ａ２；ＥＰＯＯ３４１９１５Ａ２；ブロクら、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８５）８２．８０５７ −８０６１　；ルッゲリら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ堰A　 ＵＳＡ（１９ ８６）８３．５７０８−５７１２　：　ハバースティックら、　Ｂｌｏｏｄ（１ ９８５）６６、９４６−９５２　；ブロクら、Ｂｌｏ。

ｄ（１９８７）７０．１１０−］、１５　：エフ・エイフ・アリら、　Ｐｒｏｃ 、　Ｅｌｅｖｅｎｔｈ　Ａｍｅｒ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙ奄吹A　（１ ９９０）９４−９６　：エム・ピアシュバー７ハー及びイー・ルオスラーチ、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８７）２６２、１７２９４−１７２９８ 　：および上記刊行物に引用されている文献を参照のこと。これらＡ　ｒ　ｇ− Ｇ　］　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ含有ペプチドは拮抗阻害剤としてＧ　ＰＩｌ、ＩＩｌ、 受容体に関してフィブリノーゲンと競合するよう作用すると考えられている。

ＲＧＤアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸または類縁体で置換され ている合成ペプチドも記述されている。ＥＰＯＯ３６８４８６Ａ２は、血小板凝 集検定において、対応するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−２ｌ量体より約１０倍活性 が低いＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−２ｌ量体を開示している。アリら、　「Ｐｅｐ ｔｉｄｅｓ：　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙＪ　、第１１回アメリカペプチドシンポジウム会報、９４〜９６頁、リビ アー及びマーシャル編、ＥＳＣＯＭ、ライデン（１９９０）は、血小板凝集検定 における配列Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　］　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ−５ｅ　ｒへの修飾について 記述している。この配列中のＡｒｇをＬｙｓに置換すると他のほとんどの置換体 と同様に効力が著しく減少した。同様に、環状ＲＧＤペプチドについてもＡｒｇ 残基の修飾（Ｎ、　Ｎ’　Ｊ：　ｔ　２ｌＭ”）によって効力が１０倍低下した 。

ガースキーら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６ ４０２２−４（１２６（１９８９）は、鋸状鱗被毒ヘビ、エチス・カリナツス（ Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ）の毒液から得られる強力な血小板凝集阻害剤 について記述している。これらの著者らはこの阻害剤が−Ａ　ｒ　ｇ”−Ｇ　Ｉ 　ｙ−Ａｓｐ−という配列を含有する４９アミノ酸タンパク質であって、これが ＩＣ，。

＝３．３Ｘ１０−”Ｍを有し、Ａ　ｒ　ｇ　２４をオルニチン（Ｏｒｎ）で置換 することによって作成した変異型阻害剤［Ｏｒ　ｎ　”］エチスタチンは３倍低 い効力を有すると報告している。０ｒｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含有するテトラ ペプチドも効力が１０〜５０倍低いと記述されている。

デイホノフ・データベースを検索したところ、ＫＧＤという配列が２１９３回出 現することがわかった（ＲＧＤの２０２６と比較のこと）。ＫＧＤ配列を含有す るタンパク質のうち、胎磐抗凝固物質タンパク質（ＰＡＰ）とりポコルチンファ ミリーの他の２つの構成要素が抗凝固剤活性を有すると報告されている（フナコ ンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６５５７２−５５７８（１９８７））。し かし、これらのタンパク質がフィブリノーゲンのＧ　ＰＩｌ、ＩＩｌ、受容体と の結合を阻害することによって血小板活性化の最終的な共通経路を阻害すること は報告されておらず、むしろ抗凝固剤活性はプロトロンビン活性化の阻害並びに ホスホリパーゼＡ２の阻害とそれに続くプロスタグランジン放出によるものとさ れている。

・　千オニーチル結合を有する数種の合成環状ペプチドが合成されている。ゲロ ら。

Ｂｉａｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｒｒ＋、　（１９１１ １４）１２０．８４０−８４５は、ペプチド結合が［ＣＨ２|８］ 基に置換されているソマトスフチンの疑似へキサペプチド類縁体について記述し ている。さらにエドワーズら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ 、　Ｃｏ１ｍ、　（１９８６）２３６．７３０−７３６は、チオメチレンエーテ ル結合を含有する直鎖状および環状エンケファリン疑似ペプチド類縁体の生物学 的活性を比較している。ペプチドが［ＣＨ２−５］で置換されている他のエンケ ファリン関連疑似ペプチドと大環状化合物も記述されている（スバトラら、　Ｂ ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９８６）２５．２２９−２４４　；スバトラら、　Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８８）４４．８Q１ −８３３）。

これらの文献はいずれもアミノ酸配列ＫＧＤを含有し高い血小板凝集阻害活性を 有するペプチドを開示していない。これらの文献はいずれも他のインテグリン受 容体と比較してＧＰＨ，１１１，受容体に高い特異性を有するペプチドを開示し ていない。さらには、これらの文献のいずれにも、開環に対して安定な−Ｌｙｓ −Ｇ］　ｙ−Ａｓｐ−または−０ｒｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのいずれがを含有する小 環状ペプチドであって、フィブリノーゲン／ＧＰＩＩゎＩｎ、ＥＬｒ　ＳＡに関 してビトロネクチン／ビトロネクチン受容体ＥＬＩＳＡまたはフィブロネクチン ／フィブロネクチン受容体Ｅ１ｊＳＡよりも高い阻害効力を有するものは記述さ れていない。

したがって、高い血小板凝固阻害活性を有するペプチドを生産することが本発明 の目的である。また、ＧＰＩｌ、ＩＩｌ、受容体に対して高い特異性を有するペ プチドを提供することも本発明のさらなる目的である。さらにまた、開環に対し て安定であって上述の特性を有する小環状ペプチドを生産することも、もう１つ の目的である。出血時間の増大など生体内での副作用が軽減されている血小板凝 集阻害剤を提供すること、また随意に、寿命の増大したそのような阻害剤を提供 することも本発明のさらなる目的である。

本発明のこれらの目的および他の目的は本発明を総括して考慮すれば明らかにな るであろう。

発明の要約 本発明の目的はＸａａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐという配列を含有し他のインテ グリン受容体と比較してＧＰＩｌ、ＩＩＩ、受容体に高い特異性を有するポリペ プチドを提供することによって達成される（ここにＸａａはオルニチン（Ｏｒｎ ）またはリジン（Ｌｙｓ）を表す）。好ましくは、本ペプチドはＬｙ　ｓ−Ｇ　 ｌ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐという配列を含有し、約３４５アミノ酸より少ない残基を含 有する。また好ましくは本ペプチドは環内に５〜１０アミノ酸を有する環状ペプ チドである。最も好ましくは、本環状ペプチドはその環状体の環を形成する５ア ミノ酸を有する。より好ましくは、本環状ペプチドの環は約１７〜約１８原子を 含有し、最も好ましくは１８原子を含有する。本発明の特に好ましい化合物は下 記構造を有するポリペプチドである：Ｅ式中、 Ｘａａｌはαアミノ基を介して２に結合しているＤまたはＬａ−アミノ酸を表し 、Ｘａａ、はＯｒｎまたはＬｙｓを表し、）（ａａｌｌｔ側鎖を介してｚ１重結 合しているＤまたはＬａ−アミノ酸を表し、Ｚはアミド結合、ジスルフィド、Ｃ ＯＣＨ２Ｓ　、　ＣＯＣＨ２Ｓ　ＯｌまたはＣ０ＣＨ（Ｃ，Ｒ５）Ｓを表し、 ＲはＯＨまたはＮＨ，を表すコ また好ましくは、上記環がＤアミノ酸を含有し、最も好ましくほこのＤアミノ酸 が上記トリペプチド配列のＬｙｓに結合しているであろう。

本発明は広義には、ＧＰＩｌ、ＩＩｌ、によって媒介される血小板機能の阻害剤 として有用であり、かつ、血栓形成の防止に有用なペプチド誘導体に関する。本 発明の好ましい化合物は式Ｉで表される化合物および医薬的に許容されるその塩 である： ［式中、Ｒ１とＲ１は同一であるか、もしくは異なり、Ｃ３〜Ｃ＋２アルケノキ ン、 Ｃ＠〜Ｃ＋Ｚアリールオキシ、 ジＣ３〜８アルキルアミノ−Ｃ，−Ｃ，アルコキシ、群：アルキルアミノエトキ ／、ニコチノイルアミノエトキシ、およびスクシンアミドエトキシから選択され るアシルアミノ−Ｃ，−Ｃ，アルコキン、ピバロイルレオキンエトキシ、 Ｃε〜Ｃ１□アリール−Ｃ，−Ｃ，アルコキノ（ここにアリール基は非置換であ るか、もしくは次の基、ニトロ、ハｌニア（Ｆ、　ＣＩ、Ｂｒ、、Ｉ）、Ｃ，〜 Ｃ，アルコキシ、およびアミノの１またはそれ以上で置換されている）ヒドロキ シ−０２〜Ｃ８アルコキン、 ジヒドロキシ−Ｃ３〜Ｃ８アルコキ／、およびＮＲ＋ｏＲ＋＋　ＩここにＲ１゜ とＲ３１は同一であるか、もしくは異なり、水素、０１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜 Ｃ８アルケニル、Ｃ６〜ＣＩ２アリール（ここにアリール基は非置換であるか、 もしくは次の基：ニトロ、ハロ（Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキン 、およびアミノの１またはそれ以上で置換されている）、０６〜Ｃ８２アリール −〇、〜Ｃ，アルキル（ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基： ニトロ、ハロ（ＦＳＣｌ、Ｂｒ、Ｉ）、０１〜Ｃ４アルフキシ、およびアミノの １またはそれ以上で置換されている）を表す）から選択される。

Ｒ６、Ｒ８、Ｒ３、Ｒｏ、Ｒ７、Ｒ８は同一であるか、もしくは異なり、水素、 Ｃ６〜ＣＩ２アリール（ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基： ニトロ、ハロ（ＦＳＣｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ｃ、〜Ｃ＠アルキル、ハｏ−Ｃ＋〜Ｃ１ １アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、アミノ、フェニルオキシ、フェニル、アセ トアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ，アルキルアミノ、０１〜Ｃ，アルキルア ミノ、０６〜ＣＩ２アロイル、Ｃ，−Ｃ，アルカノイル、およびヒドロキシ−Ｃ ，−Ｃ，アルキルの１またはそれ以上で置換されている） 置換または非置換の分枝状または直鎖状Ｃ１〜ＣＵアルキルにこに置換基はハロ （ＦｌＣＩＳＢｒｌ　■）、Ｃ，〜Ｃ，Ｃａアルキル＠〜Ｃ＋２アリールオキシ （ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基・ニトロ、ヒドロキシ、 ハロ（ＦＳＣｌ、ＢｒＳ　Ｔ）、Ｃ，〜Ｃ，Ｃａアルキルｌ−Ｃｌ１アルコキシ 、アミン、フェニルオキシ、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ，−Ｃ，アルキ ルアミノ、Ｃ２〜ＣＳアルキルアミノ、Ｃ６〜Ｃ＋Ｚアロイル、およびＣ，−Ｃ ，アルカノイルの１またはそれ以上で置換されている）、イソチオウレイド、０ ３〜Ｃ７シクロアルキル、ウレイド、アミノ、ｃＩ〜Ｃ８アルキルアミノ、ジＣ １〜Ｃ８アルキルアミノ、ヒドロキシ、アミノ−０２〜Ｃ８アルキルチオ、アミ ノ−０２〜Ｃ８アルコキン、アセトアミド、ベンズアミド（ここにフェニル基は 非置換であるか、もしくは次の基：ニトロ、ヒドロキシ、ハロ（Ｆ％ＣＩ、Ｂｒ 、■）、０１〜Ｃ８アルキル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシ、アミノ、フェニルオキシ 、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ３〜Ｃ８アル キルアミノ、Ｃ６〜Ｃ＋Ｚアロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイルの１または それ以上で置換されている）、０６〜０１２アリールアミノ（ここにアリール基 は非置換であるか、もしくは次の基　ニトロ、ヒドロキシ、ハ０（ＦＳＣ］、Ｂ ｒ、Ｉ）、Ｃ，〜Ｃ，Ｃａアルキル、〜Ｃ，Ｃａアルキルミノ、フェニルオキシ 、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８アル キルアミノ、０６〜ＣＩ２アロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイルの１または それ以上で置換されている）、グアニジノ、フタルイミド、メルカプト、０１〜 Ｃ，アルキルチオ、Ｃ６〜ＣＩ□アリールチオ、カルボキン、カルボキノアミド 、カルボ−ｃ、−Ｃｓアルコキン、Ｃ６〜Ｃ１□アリール（ここに了り−ル基は 非置換であるか、もしくは次の基、ニトロ、ヒドロキシ、ハロ、０１〜Ｃ８アル キル、Ｃ３〜Ｃ８アルコキン、アミノ、フェニルオキシ、アセトアミド、ベンズ アミド、）ＣＩ−Ｃｓアルキルアミノ、ＣＩ〜Ｃ８アルキルアミノ、ヒドロキシ −Ｃ，−Ｃ，アルキル、０６〜ＣＩ２アロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイル の１またはそれ以上て置換されている）、および複素芳香［（ここに複素環基は ５〜１０環原子を有し、２原子までの０．Ｎ、またはＳヘテロ原子を含有する） から選択される）から選択される。

Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ６、またはＲ７とＲ８は、随意に独立して、互いに結合し て４〜７原子からなる炭素環またはへテロ環基にこにヘテロ原子は０、Ｓ、また はＮＲ，、（ここにＲ，□は水素、ｃ、−Ｃａアルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル 、Ｃ６〜Ｃ＋Ｚアリール、０６〜ＣＩ２アリール−Ｃ３〜Ｃｓアルキル、Ｃ，− Ｃ，アルカノイル、およびＣ６〜Ｃ１□アロイルから選択される）から選択され る）を形成してもよい。

Ｒ４は水素、Ｃ，−Ｃ，アルキル、Ｃ８〜Ｃ１゜シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ＋Ｚ アリール、およびＣ６〜ＣＩ□アリール−０１〜Ｃ８アルキルから選択される。

Ｒ２またはＲ３は随意にＲ１と結合してピペリジン、ピロリジンまたはチアゾリ ジン環を形成してもよい。

Ｒ１４は水素、Ｃ，−Ｃｓアルキル、Ｃ，〜Ｃ，Ｃａアルキル６〜ＣＩ２アリー ル、およびＣ６〜Ｃ１□アリール−ＣＩ−Ｃａアルキルから選択される。

Ｘは１個の０またはＳ原子、ｌまたは２個のＯ原子を保持する１個のＳ原子、Ｎ Ｒ，３（ここにＲＩ３は水素、Ｃ＋　””　Ｃ＊アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニ ル、Ｃ６〜Ｃｌ２アリール、Ｃ６〜Ｃｌ２アリールーＣ８〜Ｃ８アルキル、Ｃ３ 〜Ｃ８アルカノイル、およびＣ６〜Ｃ＋２アロイルを表す）、およびＣ６〜Ｃ１ １アリール、Ｃ３〜Ｃ８アルカノイル、（ＣＨ２）ｋ（ここにｋは０から５まで の整数を表す）から選択される。

ｎは１から６までの整数を表す。

ｍは０から４までの整数を表す。］ 特に断らない限り、本明細書においてアルキル、アルケニルおよびアルキニルと は、それぞれ−重結合、二重結合および三重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭 化水素鎖を意味する。０６〜Ｃｌ２アリール基とは非置換の芳香族環もしくは融 合環（例えばフェニルやナフチルなど）を意味する。ヘテロとはへテロ原子０． Ｎ。

またはＳを意味する。複素芳香環基は５〜１０環原子を有し、４個までのへテロ 原子を含有する。ハロゲンまたはハロとはＦ、ＣＩ、Ｂｒ、または■原子を意味 する。アルコキシとはＯに結合したアルキル基を意味する。

Ｃ３〜Ｃ８アルキルまたはＣ２〜Ｃ８アルケニル基の例にはメチル、エチル、プ ロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシ ル、ビニル、アリル、ブテニルなどが含まれる。０３〜Ｃ３゜／クロアルキル基 の例にはシクロプロピル、ノクロペンチル、ノクロヘキシルなどが含まれる。複 素芳香環基にはピリジル、チェニル、フリル、インドリル、ベンズチェニル、イ ミダゾリル、チアゾリル、キノリニル、およびイソキノリニルが含まれるが、こ れらに限定されない。

本発明は式■の化合物を製造する方法を包含する。

本発明は哺乳動物中の血小板凝集を減じる方法をも包含する。この方法には本発 明の化合物の治療的有効量を単独で、あるいは医薬的に許容される担体と組み合 わせて投与することが含まれる。この一般的な方法は血栓形成傾向が増大してい る哺乳動物を処置するためにも適用することができる。

さらに、本発明は哺乳動物中の血小板凝集を減じるため、もしくは血栓形成傾向 が増大している哺乳動物を処置するため、あるいは哺乳動物においてリガンドの Ｇ　Ｐ　ｌＴｂｌｌ１．に対する結合を阻害するための物質に関し、ここにこれ ら組成物のそれぞれは式■で定義される環状ペプチドの１またはそれ以上を活性 成分として含有する。

発明の詳細な説明 本発明は、ＫＧＤ含有ポリペプチドが血小板凝集の強力な阻害剤であり、かつ、 Ｆｇ／ＧＰＩＬＪＨ，ＥＬＩＳＡにおいて強力な阻害剤であるという驚くべき発 見の結果である。強力なＫＧＤ含有阻害剤のほとんどは小環状ペプチドであるの で、これらのペプチドが好ましい。

また、本ＫＧＤペプチドがフィブロネクチン（Ｆｎ）／フィブロネクチン受容体 （Ｆ　ｎ　Ｒ）相互作用およびビトロネクチン（Ｖ　ｎ　）／ビトロネクチン受 容体（ＶｎＲ）相互作用の弱い阻害剤であるということも発見した。様々なＫＧ Ｄ含有ポリペプチドの阻害を比較したところ、ＩＣ，。で決定した阻害効力がＦ 　ｇ　／　Ｇ　Ｐ　Ｉｌ、ＩＩＩ。

ＥＩｊＳＡではＶｎ／ＶｎＲＥＬＩＳＡの場合よりも１０〜５００倍高い（即ち ＩＣ５，が低い）ことがわかった。このように本ペプチドはＧ　Ｐ　ＩＩ、ＩＩ ｌ、受容体に対して高い特異性を示す。この高い特異性がこれら抗血栓症化合物 の副作用の数および重篤度を減少させるであろうと考えられる。これらの化合物 は哺乳動物において出血時間の本質的な増大を伴うことなく高い血小板凝集阻害 を示すに違いない。

本発明のポリペプチドは化学合成によって、あるいは組換え技術を使用して製造 することができる。これらの方法は当該技術分野では公知である。化学合成、と りわけ固相台或は、短い（例えば５０残基未渦の）ポリペプチドや非天然アミノ 酸もしくは珍しいアミノ酸（例えばＤ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸 など）を含有するものにとって好ましい。組換え法はかなり長いポリペプチドや ＫＧＤ配列を含有する突然変異または変種ペプチドにとって好ましい。組換え法 を選択する場合には、合成遺伝子を新規に構築してもよいし、例えばカセット突 然変異誘発法などによって天然の遺伝子に突然変異を導入してもよい。以下に一 般的な組換え法の典型例について説明する。

一般的組換え法　組換えＤＮＡ技術を用いることによって、精製したタンパク質 およびそのアミノ酸配列からＫＧＤ含有タンパク質を製造することができる。

簡略化した形で述べると、これらの技術はタンパク質の天然または合成の遺伝子 を得、それを適当なベクター中に挿入し、そのベクターを適当な宿主細胞に挿入 し、その宿主細胞を培養することにより該遺伝子を発現させ、それによって生産 されるタンパク質を精製することを意図するものである。

幾分より具体的に述べると、ＫＧＤ含有タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を クローン化し、便利な宿主中でそれを発現させ得るように操作する。親ポリペプ チドをフード化するＤＮＡはゲノムライブラリーから、あるいはそのタンパク質 を発現している細胞から得られるｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡから、もしくは そのＤＮＡ配列を合成的に構築することによって得ることができる（サムプルツ ク、ジエイ、フリッチュ、イー・エフ及びマニアティス、ティ（１９８９）　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ（第２版）、コールド・スプリング・ハーバ −・ラボラトリ−、ニューヨーク）。

次に親ＤＮＡを適当なプラスミドまたはベクター中に挿入し、これを用いて宿主 細胞を形質転換する。一般に、その宿主細胞に適合する種から誘導した複製およ び制御配列を含有するプラスミドベクターをこれらの宿主と組み合わせて使用す る。通常ベクターは、複製部位並びに形質転換された細胞中で表現型選択を提供 することができるタンパク質をコード化する配列を保持している。

例えば、大腸菌種から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて大腸菌 を形質転換することができる（マンデル、エムら（１９７０）　Ｊ、　）ｌｏｌ 、　Ｂｉｏｌ、　５３．１５４）。

プラスミドｐＢＲ３２２はアンピンリンとテトラサイクリン耐性のための遺伝子 を含有しているので、容易な選択手段を提供する。他のベクターは、発現に際し てしばしば重要である異なるプロモーターなどの異なる特徴を含む。例えばプラ スミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、およびｐＰＬ−ラムダはｔａｃ、ｔｒ ｐ、またはＰ、プロモーターを伴う現在利用できる発現ベクターである（ファル マシア・バイオテクノロジー）。

好ましいベクターはｐＢ０４７５である。このベクターは大腸菌とファージのた めの複製起点を含有し、これらはこのベクターのこのような宿主間での往復を可 能にするので、それによって突然変異誘発と発現の両方が容易になる（カンユン グハム。ビーら（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．１３３０−１３３６ 　＋ウエルス、ジェイ及びカンユングハム。ビー、同時係属出願Ｗ０９０１０４ ７８８（１９９０年５月３日公開）。他の好ましいベクターはｐＲＩＴ５および ｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマンア・バイオテクノロジー）である。これらのへフタ− は適当なプロモーターとそれに続（プロティンへの２ドメインを含有しており、 これらのベクター中に挿入された遺伝子を融合タンパク質として発現させること が可能になっている。これらのベクターに関するさらなる議論は下記文中に認め られよう。

上述のベクターの関連する特徴を組み合わせることによって標準的な技術を用い て他の好ましいベクターを構築することができる。関連する特徴にはプロモータ ー、リポソーム結合部位、デコルシンまたはオルナチン遺伝子融合物（プロティ ンＡのＺドメインとデコルシンまたはオルナチンとそのリンカ−）、抗生物質耐 性マーカー（標識）、および適当な複製起点が含まれる。

宿生細胞は原核であっても真核であってもよい。親ポリペプチド、部分置換され たポリペプチド、残基置換されたポリペプチドおよびポリペプチド変種を製造す るためにＤＮＡ配列をクローニングし発現させるには原核細胞が好ましい。例え ば大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７ ７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）および大腸菌ｃ６００およびＣ６００ｈｆ　］ 、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ−１原栄養体／ＡＴＣＣ番号２７３２５）、 枯草菌などのバチルス属、およびネズミチフス菌やセラチア・マルセサンスなど の他の腸内細菌域および種々のシュードモナス種と同様に使用することができる 。好ましい原核生物は大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生 物によって発現された場合、ポリペプチドは典型的にはＮ−末端にメチオニンか ホルミルメチオニンを含有し、グリコリル化されない。融合タンパク質の場合、 Ｎ−末端のメチオニンまたはホルミルメチオニン残基が融合タンパク質のアミノ 末端か、もしくは融合タンパク質のシグナル配列のアミノ末端に存在する。当然 のことながら、これらの例は限定ではなく例示を意図するものである。

原核生物に加えて、酵母培養や多細胞生物由来の細胞などの真核生物を使用する こともできる。原則としてそのような細胞培養のいずれでも利用できる。しか増 殖は再現可能な手法になっている（　ｒＴｉｓｓｕｒｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＪ　、 アカデミツク・ブレ入りルセ及びバダーリン編（１９７３））。このような有用 な宿主細胞系の例はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵 巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ２Ｂ５．２９３、ＢＨＫ、Ｃ０８−７およびＭＤＣＫ細 胞系である。

遺伝子融合物　上記手法の変法は、所望のタンパク質をコード化する遺伝子がベ クター中でもう１つのタンパク質もしくはもう１つのタンパク質の断片をコード 化する遺伝子に結合している遺伝子融合物の使用を意図するものである。これに よって所望のタンパク質（ここではＫＧＤ含有タンパク質）がもう１つのタンパ ク質との融合物として宿主細胞によって生産されることになる。「他の」タンパ ク質はその細胞によって分泌され得るタンパク質またはペプチドであることが多 く、それによって所望のタンパク質を培養培地から単離・精製することが可能に なり、所望のタンパク質が細胞の内部に残る場合に起こる宿主細胞の破壊という 必要性が排除される。別法として、融合タンパク質を細胞内で発現させることも できる。高度に発現される融合タンパク質を使用することは有用である。

遺伝子融合物の使用は、必須ではないけれども、大腸菌中での異種タンパク質の 発現とそれに続くそれら遺伝子産物の精製を容易にし得る（ハリス、ティ・ジエ イ・アール（３９８３）、　ｒＧｅｎｅｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪ　、 　ウィリアムソン、アール編、アカデミツク、ロンドン９第４巻、１２７頁；ウ ーレン、エム、モクス、　）（１９８９）　ｌ１ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｆｆｉｏ １．　（印刷中））。プロティンＡ（より具体的にはプロティンＡの２ドメイン ）のＩｇＧに対する結合は融合されたタンパク質を精製するための「アフィニテ ィー操作」を提供するので、プロティンＡ融合物は頻繁に使用される。大腸菌中 で直接発現させると多（異種タンパク質が分解されるが、融合タンパク質として 発現させると安定であることも明らかにされている（マーストン、エフ・エイ・ オー（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　２４０．１）。

融合タンパク質として発現したＫＧＤ含有タンパク質は適切に折り畳まれて天然 の構造を与えるか、あるいは天然の構造を得るための折り畳みを必要とし得る。

適切に折り畳まれた融合タンパク質はＧ　ＰＩｌ、ＩＩｌ、アンタゴニストおよ び血小板凝集の阻害剤として活性かつ有用であり得る。より好ましいものは、当 該技術分野で公知の方法によって融合タンパク質から得られる、正しく折り畳ま れた「天然の」タンパク質であろう。メチオニンで切断する臭化シアンやａｓｎ とｇｌｙの間を切断するヒドロキシルアミンなどの化学物質を用いて融合タンパ ク質を切断することができる。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、ＫＧＤ含有タ ンパク質遺伝子の５゛末端の直前にこれらのアミノ酸をコード化するヌクレオチ ド塩基対を挿入することができる。

別法として融合タンパク質のタンパク質加水分解的切断を使用することもでき、 これについては最近総説が刊行されている（カーター、ビー（１９９０）、　ｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　：　Ｆｒｏｍ　１ｌｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｔｏ　Ｌａｒｇｅ−３ｃａｌｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｓi　、ラディッ シュ、エム・アール、ウィルソン、アール・シー、ベイントン、シー・ノー及び ビルダー、ニス・イー編、アメリカ化学会シンポジウム・シリーズ第４２７号、 第１３章、１８１−１９３）。

因子Ｘａ、トロンビン、ズブチリシンおよび突然変異体などのプロテアーゼ並び に他のいくつかが融合タンパク質の切断に成功裏に使用されている。典型的には 、使用するプロテアーゼによる分解に対して敏感なペプチドリンカ−を、「他の 」タンパク質（例えばプロティンＡのＺドメイン）と目的のＫＧＤ含有タンパク 質との間に挿入する。組換えＤＮＡ法を用いて、リンカ−をコード化するヌクレ オチド塩基対を、他のタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子断片の間に挿 入する。次いで、正しいリンカ−を含有する部分的に精製された融合タンパク質 のタンパク質加水分解的切断を、天然の融合タンパク質か、あるいは還元または 変性させた融合タンパク質に対して行うことができる。

融合タンパク質として発現させる場合、タンパク質は適切に折り畳まれているこ ともあろうし、適切には折り畳まれていないこともあろう。また、切断部位を含 有する特定のペプチドリンカ−はプロテアーゼに接近できる場合もあろうし、接 近できない場合もあろう。これらの因子は融合タンパク質を変性および再折り畳 みさせなければならないかどうか、また、そうであればこれらの操作を切断の前 に使用するか、切断の後に使用するかを決定する。

変性と再折り畳みが必要な場合、典型的には、タンパク質を塩酸グアニジンなど のカオトロープで処理し、次いで、例えば還元型および酸化型ジチオスレイトー ルまたはグルタチオンを含有する酸化還元緩衝液を用いて、目的のタンパク質が その天然の構造に再折り畳みされるように適当な比率、ｐＨおよび温度で処理す る。

（以下余白） 一般的化学合成法　ペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて調製しない場合、上述 のように当該技術分野で公知の他の等価な化学合成法を使用することもできるが 、メリフィールド、Ｊ、＾ｍ、　ＣｈｅＩｆｉ、　Ｓｏｃ、　（１９６３）８５ ．２１４９に概説されているような固相合成法を用いてペプチドを調製する二と が好ましい。好適な樹脂に保護されたα−アミノ酸を結合することによってペプ チドのＣ−末端から固相合成を開始する。

このような出発物質は、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂にエス テル結合を介して、あるいはＢ）ＩＡ樹脂やＭＢＨＡ樹脂にアミド結合を介して 、ａ−アミノ保護アミノ酸を結合させることによって調製することができる。ヒ ドロキシメチル樹脂の調製についてはボダンスキーら、　Ｃｈｅｗ、　Ｉｎｓ、 　（Ｌｏｎｄｏ口Ｘ１９６６）３８゜１５９７−１５９８に記述されている。ク ロロメチル化樹脂はバイオラッド・ラボラトリーズ（カリフォルニア州すッチモ ノド）およびラブ・システム、インコーホレイテッドから市販されている。この ような樹脂の調製はステユアートら、　ｒｓｏｌｊｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｊｄ ｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＪ　（フリーマン・アンド・カンパニー、サンフラッジ スコ、１９６９）の第１章１〜６頁に記述されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹 脂支持体は市販されており、一般に、合成される所望のポリペプチドが非置換ア ミドをそのＣ−末端に有する場合にのみ使用される。

当該技術分野でよく知られているペプチド結合形成技術を用いてペプチド鎖にア ミノ酸を結合する。１つの方法にはカルボキシル基がペプチド断片の遊離のＮ− 末端アミノ基との反応に対してより敏感になるような誘導体にアミノ酸を変換す ることが含まれる。例えば、保護されたアミノ酸をクロロギ酸エチル、クロロギ 酸エチル、クロロギ酸５ｅＣ−ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル などの酸塩化物と反応させることにより、アミノ酸を混成無水物に変換すること がてきる。別法として、２．４．５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロ ロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエ ステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、または１−ヒドロキシベンゾ トリアゾールから形成されるエステルなどの活性エステルにアミノ酸を変換する こともてきる。

もう１つの結合法にはＮ、Ｎ−ジクロロへキシルカルボジイミドやＮ、Ｎ’−ジ イソプロピルカルボジイミドなどの好適なカップリング試薬の使用が含まれる。

当業者には明白な他の適当なカップリング試薬はイー・グロス及びジエイ・メイ エンホフｙ　−ｒＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｔｔｒ ｕｃｔｕｒｅ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻：　Ｍａｊｏｒ　Ｍ■狽■ ａｄｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｅｔｉｄｅ　Ｂｏｎｄ　ＦｏｒｍａｔｉｏｎＪ　（アカデ ミツク・プレス、ニューヨーク、　１９７９）に開示されている。

活性なα−アミノ官能基が関与する副反応を防止するために、結合反応の間、ペ プチド合成に使用する各アミノ酸のα−アミノ基が保護されていなければならな いことを理解すべきである。また、ある種のアミノ酸は反応性の側鎖官能基（例 えばスフルヒドリル、アミノ、カルボキシル、およびヒドロキシル）を含有する こと、並びに、そのような官能基も開始段階および以降の結合段階の両方の間そ の部位で起こる化学反応を防止するために適切な保護基で保護されていなければ ならないことを理解すべきである。当該技術分野で公知の好適な保護基はイー・ グロス及びジェイ・メイエンホフ７−　ｒ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　Ａ ｎａｌｙｓｉｓ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｂｉ。

１ｏｇｙ、第３巻：　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇ ｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｅｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓi　（ア ペプチドを合成する際に使用すべき特定の側鎖保護基を選択するにあたっては、 下記の一般的規則に従う。α−アミノ保護基は、（ａ）結合反応中に使用する条 件下でα−アミノ官能基を不活性にしなければならず、（ｂ）結合反応後に側鎖 保護基を除去せずかつペプチド断片の構造を変化させない条件下で容易に除去可 能でなければならず、かつ、（Ｃ）結合直前の活性化時にラセミ化する可能性を 排除しなければならない。側鎖保護基は、（ａ）結合反応中に使用する条件下で 側鎖官能基を不活性にしなければならず、（ｂ）α−アミノ保護基を除去する際 に使用する条件下で安定でなければならず、かつ、（Ｃ）所望のアミノ酸ペプチ ドの完結時にペプチド鎖の構造を変化させない反応条件下で容易に除去可能でな ければならない。

ペプチド合成に有用であることが知られている保護基はそれらの除去に使用する 物質との反応性が異なるということは当業者には明らかであろう。例えば、トリ フェニルメチルや２−（ｐ−ビフェニルイル）イソプロピルオキシカルボニルな どのいくつかの保護基は温和な酸性条件下で極めて不安定であり、切断すること ができる。ｔ−プチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アリルオキ７カルポニ ル、アダマンチルオキシカルボニル、および叶メトキンベンジルオキシカルボニ ルなどの他の保護基は不安定性が低く、その除去にはトリフルオロ酢酸、塩酸、 酢酸中の三フッ化ホウ素など適度に強い酸が必要である。ベンジルオキシカルボ ニル（ＣＢＺまたはＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジル オキ７カルボニル、ンクロアルキルオキシ力ルボニル、およびイソプロピルオキ ／カルボニルなどさらに異なる保護基はさらに不安定性が低く、それらの除去に はフッ化水素、臭化水素、あるいはトリフルオロ酢酸中のボロン・トリフルオロ アセテートなど、より強い酸が必要である。有用なアミノ酸保護基の種類には下 記のものが含まれる。

（１）α−アミノ基用には、（ａ）フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭ ＯＣ）、ＣＢＺ、および置換ＣＢＺ（例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニ ル、ｐ−６−ニトロベンジルオキ７カルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカル ボニル、およびｐ−メトキ／ベンジルオキ７カルボニル、Ｏ−クロロベンジルオ キシカルボニル、２，４−ジクロロペンンルオキシ力ルボニル、２．６−ジクオ ロロペンジルオキシカルポ二など）などの芳香族ウレタン型保護基：　（ｂ）Ｂ ＯＣＳ　ｔ−アミルオキシ力ルボニル、イソプロピルオキソカルボニル、２−（ 叶ビフェニルイル）イソプロピルオキ／カルボニル、アリルオキ７カルポニルな どの脂肪族ウレタン型保護基、（Ｃ）クロロベンジルオキシカルボニル、アダマ ンチルオキシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニルなどのンクロア ルキルウレタン型保護基：および（ｄ）アリルオキ、カルボニルがある。好まし いα−アミノ保護基はＢＯＣまたはＦＭＯＣである。

（２）Ｌｙｓ中に存在する側鎖アミノ基については、ＢＯＣＳｌ）−クロロベン ジルオキシカルボニルなど上記（１）に記載の基のいずれによっても保護できる 。

（３）Ａｒｇのグアニジノ基については、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチ ルオキシカルボニル、２．２．５．７．８−ペンタメチルクロマン−６−スルホ ニルまたは２．３．６−）ジメチル−４−メトキノフェニルスルホニル、あるい はＢＯＣで保護できる。

（４）Ｓｅｒ、Ｔｂｒ、またはＴｙｒのヒドロキシル基については、例えばｔ− ブチルなどの０１〜Ｃ，アルキル、ベンジル（Ｂ　Ｚ　Ｌ）、置換ＢＺＬ（例え ばｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、０−クロ ロベンジル、および２．６−ジクロロベンジルなど）によって保護できる。

（５）ＡｓｐまたはＧｌｕのカルボキシル基については、例えば、ＢＺＬ、ｔ− ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルなどの基を用いるエステル化によって 保護することができる。

（６）Ｈｉ　ｓのイミダゾール窒素については、トシル基が使用に適する。

（７）Ｔｙｒのフェノール性水酸基については、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒ ｔ−ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４〜ブロモベンジル、および ２．６−ジクロロベンジルなどが使用に適する。好ましい保護基は２．６−ジク ロロベンジルである。

（８）ＡｓｎまたはＧｌｎの側鎖アミノ基には、キサンチル（Ｘａｎ）の使用が 好ましい。

（９）Ｍｅ　ｔについては、このアミノ酸は保護せずにおくのが好ましい。

（１０）Ｃｙｓのチオ基には、ｐ−メトキンベンジルが典型的に使用される。

ＬｙｓなどのＣ−末端アミノ酸は適当に選択した保護基（Ｌｙｓの場合にはＢＯ Ｃ）でそのＮ−アミノ位を保護する。ＢＯＣ−Ｌｙｓ−○Ｈは、ホリキら、　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（１９７ｇ）１６５−１６８に記載の方法に従 って、あるいはイソプロピルカルボジイミドを用いて撹拌しながら約２５℃で２ 時間処理することによって、ベンジルヒドリルアミンまたはクロロメチル化樹脂 に最初に結合させることができる。ＢＯＣ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合した 後、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）あるいはＴＦＡ単独を用いる ことなどにより、そのα−アミノ保護基を除去する。この脱保護は約０℃乃至室 温で行われる。ジオキサン中のＨＣＩなど他の標準的な切断試薬および特定のα −アミノ保護基の除去に関する条件はジュログー及びルブツ（上記）第１章、７ ２〜７５頁に記述されている。

α−アミノ保護基の除去後、残存するα−アミノおよび側鎖保護アミノ酸を所望 の順番で結合させる。この合成において各アミノ酸を個別に添加する代わりに、 いくつかを固相合成装置に添加する前に互いに結合させておいてもよい。適当な カップリング試薬の選択は当該技術分野の技術による。Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへ キンルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドはカップリング試薬 として特に好適である。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列を固相反応装置に導入し、ジメチルホルムア ミド（ＤＭＦ）またはＣＨｚＣＩ２もしくはその混合物からなる媒質中で結合を 適切に行う。不完全な結合が起こった場合には、次のアミノ酸の結合に先立って Ｎ−アミノ保護基を除去する前に結合操作を繰り返す。各合成段階で結合反応の 成否を監視することができる。この合成を監視する好ましい方法は、カイザーら 、＾ｎａ１．　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　（１９７０）３４．５９５に記述されている ニンヒドリン反応によるものである。

結合反応はよく知られた方法、例えばバイオサーチ９５００ペプチド・ノンセサ イザ＝（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９５００　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚ ｅｒ）を用いて自動的に行うことができる。

所望のペプチド配列が完結した時に、その保護ペプチドを樹脂支持体から切り離 し、すべての保護基を除去しなければならない。この切断反応と保護基の除去は 同時に、もしくは段階的に適切に行われる。樹脂支持体がクロロメチル化ポリス チレン樹脂である場合は、ペプチドを樹脂に固定している結合はＣ−末端残基の 遊離のカルボキシル基と樹脂基盤上に数多く存在するクロロメチル基のうちの１ つとの間に形成されたエステル結合である。この固定している結合がエステル結 合の分解と樹脂基盤への浸透が可能であることが知られている試薬によって切断 され得ることは理解されるであろう。特に便利な方法は液体無水フッ化水素での 処理による方法である。この試薬はペプチドを樹脂から切り離すばかりでなく、 すべての保護基をも除去するであろう。したがって、この試薬の使用により完全 に脱保護されたペプチドが直接径られるであろう。クロロメチル化樹脂を使用す る場合、フッ化水素処理は遊離ペプチド酸の生成をもたらす。ベンズヒドリルア ミン樹脂を使用する場合、フッ化水素処理により遊離のペプチドアミンが直接も たらされる。アニソールおよびジメチルスルホキッドの存在下０℃で１時間のフ ッ化水素との反応によって、側鎖保護基の除去とペプチドの樹脂からの切り離し が同時に達成されるであろう。

保護基を除去することなくペプチドを切り離したい場合には、保護されたペプチ ド−樹脂を加メタノール分解に付してＣ−末端カルボキシル基がメチル化されて いる保護ペプチドを得る。次に、このメチルエステルを温和なアルカリ性条件下 で加水分解することにより遊離のＣ−末端カルボキシル基を得る。次に、液体フ ッ化水素などの強酸での処理によってペプチド鎖上の保護基を除去する。特に有 用な加メタノール分解技術はムーアら、　ｒＰｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｐｒｏｃ、　 Ｆｉｆｔｈ　Ａｍｅｒ、　Ｐｅｐｔ、　Ｓｙｍｐ、　Ｊ　。

エム・グツドマン及びジエイ・メレンホファー編（ジョン・ウィリー、ニューヨ ーク。

１９７７）、　５１８〜５２１頁の技術であり、この技術では保護ペプチド−樹 脂をクラウンエーテルの存在下でメタノールとシアン化カリウムで処理する。

クロロメチル化樹脂を使用する場合に保護ペプチドを樹脂から切断するもう１つ の方法は、加アンモニア分解によるか、もしくはヒドラジンでの処理によるもの である。所望であれば、得られたＣ−末端アミドまたはヒドラジドを加水分解し て遊離のＣ−末端カルボキシル基にすることができ、また保護基を都合よく除去 することができる。

Ｎ−末端α−アミノ基上に存在する保護基を、保護されたペプチドの支持体から の切り離しの前かもしくは後に弁別的に除去し得ることも理解されるであろう。

本発明のポリペプチドの精製は典型的な場合、調製用ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを 含む）や、ゲル濾過、イオン交換、分配クロマトグラフィー、アフィニティーク ロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）あるいは向流分配など他 の公知のクロマトグラフィー技術などの従来の手法を用いて達成される。

多官能性架橋試薬（化合物１を含む）を用いて単量体路を多官能性ポリマー間で 直接的もしくは間接的に架橋することにより、ポリペプチド鎖をポリマー化（多 量体化）する。通常は、２つの実質上同一なポリペプチドを二官能性架橋試薬を 用いてそれらのＣまたはＮ末端で架橋する。末端アミノおよび／またはカルボキ シル基を架橋するためにこの試薬を用いる。適当な架橋試薬を選択することによ っては１つのペプチドのアルファ・アミノがもう１つのポリペプチドの末端カル ボキシル基に架橋されるが、一般的には両末端カルボキシル基または両末端アミ ノ基を互いに架橋する。好ましくは、ポリペプチドのＣ−末端をシスティンで置 換する。当該技術分野でよく知られた条件下で末端システィン間にジスルフィド 結合を形成させることができ、それによってポリペプチド鎖が架橋される。例え ば、ジスルフィド橋は遊離の７ステインの金属触媒酸化によって、あるいは適当 に修飾したンステイン残基の核置換によって都合よ（生成する。架橋試薬の選択 はそのポリペプチド中に存在するアミノ酸の活性側鎖の同定に依存するであろう 。

例えばノスルフィド架橋は、そのポリペプチド中でＣ−末端以外の追加部位にシ スティンが存在する場合には好ましくなかろう。メチレン橋で架橋されたペプチ ドも本発明の範囲に包含される。

Ｎ−末端アミノ基とＣ−末端カルボキシル基の他にペプチド上で好ましい架橋部 位には、リジン残基上にあるイプシロン・アミノ基、並びに、そのペプチドの内 部残基もしくは隣接配列中に導入した残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カ ルボキシル、スルフヒドリルおよびヒドロキシル基が含まれる。外部から架橋試 薬を添加することによる架橋は、例えば、当業者には公知のいくかの試薬のいず れかを用いて、例えばポリペプチドのカルボジイミド処理によって、好適に行わ れる。好適な多官能性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例には、１，１−ビス （ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン；グルタルアルデヒド：４−アジドサ リチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスフノンイミドエステル（ブラッグ 及びホウ、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９７５）１ ６７、３１１−３２１　＋アンジャネイラ及びスタロス、　Ｉｎｔ、　ＪＰｅｐ 　Ｐｒｏ、　Ｒｅｓ、　（１９８７）３０．１１７−１２４）　：　３　、３− ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）およびジメチルアジピミダデー ト・二塩酸塩（ザーン、＾ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｗ、　（１９５５）６７、５６１ −５７２　：ゴールデン及びハリソン、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２ ）２１．３８６２−３８６６）などのジスクシンイミノルエステルを含むホモ三 官能性イミドエステル；ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能 性マレイミド、スペリン酸ジスクシンイミジル（ノヴイックら、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｔｎ、　（１９ＦＩＤ２６２．８４８３−Ｆｔ４８７）、　スペリ ン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（り一及びコンラッド、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　（１９１１ｉ５）１３４．５１８−５２５）　ニ一端にヒドロキシス クシンイミド基を持ち、他端にマレイミド基を持つものを含む、ヘテロ三官能性 架橋試薬（ロマンッ及びフェアバンクス、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　（１９７６）１６７、３１１−３２１　；アンジャネユラ及びスタ ロス（上記）：パルティスら、Ｊ、Ｐｒｏ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８３）２．２ ６３−２７７　；ヴエルトマンら、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　（１９ ８３）１．１４８|１５２　； ヨスタケら、Ｊ、　Ｂｉａｃｈｅｍ、　（１９ｇ２）９２．１４２３−１４２４ ）　：　４−（Ｎ−マレイミドメチル）フクロヘキサン−１−カルボン酸スクシ ンイミジル（ＳＭＣＣ）（マハンら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９ ８７）１６２．１６３−１７０）　；スルホ−ＳＭＣＣ（ハシダら、Ｊ、　Ａｐ ｐｌｊｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８４）６．５６−６３）　：　ｍ−マレ イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスフノンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ −ＭＢＳ；４−（ｐ−マレイミドフェニル）ラフ酸スクシンイミジル（ＳＭＰＨ ）＋スルホー８ＭＰＢ；（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸Ｎ−スクシンイ ミジル（ＳＪＡＢ）；スルホ−８ＩＡＢ：ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）：およびＮ−ヒドロキシスルホ スクシンイミドが含まれる。メチル−３［（ｐ−アジドフェニル）ジチオコブロ ピオイミダデートなどの架橋試薬は、光の存在下で架橋を形成することができる 光活性化中間体を与える。必要であれば、ジアルギニニル基の側鎖などの感受性 残基を架橋の間保護しておき、その後に保護基を除去する。

複数架橋をすることができるポリマーは間接架橋試薬として機能する。例えば臭 化ンアン活性化炭水化物および米国特許第３９５９０８０号、第３９６９２８７ 号、第３６９１０１６号、第４１９５１２８号、第４２４７６４２号、第４２２ ９５３７号、第４０５５６３５号及び第４３３０４４０号に記述されている系は 本明細書記載のペプチドを架橋するために好適に変更される。ペプチドのアミノ 基への架橋は塩化シアヌール酸、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド活性基 （ＰＥＧアルフキシト士ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ ＋ＤＭＳＯおよび酢酸無水物、あるいはＰＥＧ塩化物＋４−ヒドロキシベンズア ルデヒドのフェノキノド）に基づく公知の化学によって達成される。スクシンイ ミジル活性エステル、活性化ジチオカーボネー）ＰＥＧ、およびクロロギ酸２゜ ４．５−トリクロロフェニル−またはクロロギ酸ｐ〜ニトロフェニルー活性化Ｐ ＥＧも有用である。カルボキシル基はカルボジイミドを用いてＰＥＧアミンを結 合することによって誘導体化される。しかし通常は架橋試薬は多官能性ポリマー ではなく、分子量５００未満の小分子である。

本発明のポリペプチドを環化することにより立体配座的に安定化させることもで きる。通常は、２またはそれ以上の反復するペプチド配列であって、各内部ペプ チドが実賞上同じ配列を有するペプチド配列を含有する環状オリゴマーを形成す るように、１つのペプチドのＮおよびＣ末端ドメインを本発明のもう１つのペプ チドの対応するドメインに共有結合させることによってペプチドを環化する。

さらに、環化したペプチド（シクロオリゴマーであるか、シクロモノマーである かにかかわらない）を架橋して２乃至６ベブチドを含む１〜３環構造を形成させ る。α−アミノと主鎖カルボキシル基を介してペプチドを共有結合（頭−原型） させないことが好ましく、むしろＮおよびＣ−末端ドメイン中に位置する残基の 側鎖を介して架橋する。したがって連結部位は一般的には残基の側鎖間であろう 。

［ここにＡとＢは本発明のペプチドを表し、同一であるか、もしくは異なる。Ａ とＢは単一のペプチドであるかもしくは２またはそれ以上のそのようなペプチド の頭−原型ポリマーである。Ｃは１またはそれ以上の結合、もしくは架橋部分を 表す。］ 本発明が意図する七ノーまたはポリー環化ペプチドを製造するのに適した方法自 体は数多く知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化はＬｙｓ／ＡｓｐのためのＦｍ。

Ｃ／９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を伴う固相支持体上のＮα−Ｂ ｏｃ−アミノ酸を用いて達成されており、この工程はピペリジン処理とそれに続 （環化によって完結する。

環状または二環状ペプチドの調製に際してＧｌｕおよびＬｙｓ側鎖も架橋されて おり、このペプチドはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学によっ て合成される。このペプチドを上記樹脂から切り離し、脱保護する。希釈したメ チルホルムアミド中のジフェニエルホスホリルアンドを用いて環状ペプチドを形 成させる。別法ニツイては、ンラーら、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ ｅｓ、　（１９８５）２５．１７１−１７７を参照のこと。また、米国特許第４ ５４７４８９号をも参照のこと。

ジスルフィド架橋または環化されたペプチドは従来法によって生成する。ペルト ンらの方法（Ｊ］ｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８６）２９．２３７０−２３７５ ）は好適であるが、ただし、シクロモノマーの生産についてペルトンらが記述し ている希釈反応混合物よりも濃縮された溶液で行うことによって、より高率のシ クロオリゴマーが生産される。この化学は二量体またはシクロオリゴマーまたは シクロモノマーの合成に有用である。またチオメチレン橋（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８４）２５．２０６７−２０６８）も有用である。

コブイーら、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８５）２８．５８３をも参 照のこと。

所望の環状または多量体ペプチドをゲル濾過とそれに続く逆相高圧液体クロマト グラフィーもしくは他の従来法によって精製する。ペプチドを滅菌濾過し、従来 の薬学的に許容される賦形剤中に製剤化する。

特定の化学合成法　式Ｉの生成物および好ましい置換体は下記方法の１つを用い ることにより、あるいは当該技術分野で公知の他の方法（例えばスパトラら、Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９ｇ＆）４４．８２１−８３３とそれに引用されてい る文献を参照のこと）で製造することができる。置換基の定義は特に注記しない かぎり式Ｉについての定義と同じである。

方法Ａ 中間体ｎで表されるポリマー支持体に結合したペプチド誘導体を標準的技術によ る個々のアミノ酸誘導体の逐次的結合によって調製することができる（メリフィ ールド、アール・ビー、Ｊ、＾ｔａ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　（１９６３）８ ５．２１４９−２１５４　＋ステユアート、ジエイ・エム及びヤング３．；エイ ・ディ、　ｒｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ（ １９８４）Ｊ　（ピアス・ケミカル・カンパニー、イリノリ州ロックフォード） および上記刊行物に引用されている追加の文献）。テトラペプチド誘導体ＩＩを 得たら、末端アミノ基を適当なカルボン酸誘導体ＩＩＩでアシル化する。ＩＶを 得るためのアシル化は、ＩＩＩのカルボン酸基の活性化を必要とするい（つかの 標準的方法を用いて行うことができる。例えば、等モル量のジシクロへキシルカ ルボジイミドまたは関連カルボジイミド試薬の添加によって活性化が得られる。

所望であれば、１−ヒドロキシベンズトリアゾールやＮ−ヒドロキシスクシンイ ミドなどの添加物を導入してもよい。

別法として、ハロ誘導体へ変換することによってカルボキシル基を活性化するこ とができる。例えば、上記酸をもしそれが望ましければジクロロメタン、トルエ ンまたは二塩化エチレンなどの相溶性溶媒中の塩化チオニルまたは塩化オキサリ ルで処理することにより、塩化物を得ることができる。置換基Ｗは、基Ｘで容易 に置換され得るように選択する。好適な置換基Ｗは、例えば臭素やヨウ素などの ハロ原子、あるいはメタンスルホニルオキシや叶トルエンスルホニルオキシおよ び関連するスルホン酸エステルなどの活性化された酸素官能基である。

樹脂結合中間体Ｖへの環化は、ＲＩ６を除去して核基Ｘを選択的に露出させ、Ｘ が基Ｗと置換して新しい化学結合を形成し得るようすることによって達成するる 。樹脂相溶性溶媒の例はジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、あるい はジクロロメタンなどである。

アミドまたは置換アミドを与える基であってもよい。ＲＩ、はｔｅｒｔ−ブチル オキソカルボニルなどの保護基であってもよい。環化したペプチド産物のポリマ ー樹脂からの最終的な切り離しは、使用する樹脂の種類および環化したペプチド と樹脂の間の化学結合に応じて様々な方法で行うことができる。例えば樹脂が多 量化したｐ−アルコキシベンジルアルコール誘導体から誘導されたものであると すれば、ペプチド−樹脂結合の切断をトルフルオロ酢酸などの強酸を用いて行う ことができる。それが望ましければ、フェノール、アニソールおよびエタンジチ オールなどの添加物をこの反応系に加えてもよい。

基Ｒ，とＲＩ５は、所望であれば、環化したペプチドのポリマー樹脂からの切断 と同時に切断され得るように選択することができる。そのような化学基の例は、 切断によってＲｓ＝ＯＨを与えるＲｅ＝ｔ−ブチルオキシであり、また切断によ ってＲ＋　ｓ　＝　Ｈを与えるＲＩｓ＝ｔ−ブチルオキソカルボニルである。こ のようにして得られる粗生成物をクロマトグラフィーや他の化学的生成法を用い てさらに精製することによりＩを得ることができる。

所望であればＩのさらなる誘導体化を行うことができる。例えば、ＸがＳである 場合、■を化学量論的量の酸化剤（３−クロロ過酸化安息香酸または類似の試薬 など）で処理することにより、ＸがＳＯであるスルホン誘導体が生成するであろ う。過剰量の酸化剤を使用すればＸがＸＯ２であるスルホン誘導体が得られるで あろう。

（以下余白） 方法Ｂ 別法として、上記方法Ａで調製される直線状ペプチド誘導体ＩＶを環化の前に樹 脂から切り離してＶＩを得ることもできる。例えばＴＶをポリスチレン樹脂上で 合成する場合、この切断は液体フッ化水素を用いて行うことができる。基Ｒ＠、 Ｒ３５およびＲ１６は所望であればこれらの条件下で同時に切断することができ る。

同時の切断が望まれる場合に好適な置換基の例は、Ｒ８がｔ−ブチルオキ／、ベ ンジルオキシまたはシクロへキシルオキジであり、ＲＩｓがｔ−ブチルオキソカ ルボニルであり、ＸがＯもしくはＳであればＲ３６がトリフェニルメチルまたは ｐ−メチルベンジルであり、あるいはＸがＮ　Ｒ＋　！であればＲＩ６がｔ−ブ チルオキソカルボニルである。これらの基の切断によって、Ｒ９はＯＨに、ＲＩ ＭとＲ１６は水素になるであろう。次いで、ペプチド誘導体Ｖ　Ｉを水酸化アン モニウムなどの弱塩基の存在下溶液中で環化させる。基Ｗは方法Ａで記述した通 りである。次に、得られた粗製Ｉを上記方法Ａで述べたように精製することがで きる。

精製したＩを方法Ａで記述したようにさらに変換することができる。さらに、所 望であれば、ＸがＮＲ，、でありＲＩ３が水素である場合に、■を例えば塩化ア セチル、酢酸無水物または塩化ベンゾイル、塩化メタンスルホニルあるいは塩化 ｐ−トルエンスルホニルなどでアシル化することができる。

方法Ｃ ポリマー樹脂または他の固体支持体を使用することなく、溶液中のアミノ酸誘導 体の逐次的な結合によって中間体Ｖｌを調製することができる。液相ペプチド合 成に有用な方法は化学的な文献に詳細に報告されており、当業者には公知である （ホウベンーヴエイルｒＭｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　 ＣｈｅｔｎｉｅＪ第４版、第１５巻、ジョーン・チーム・フエアラーク、シュテ ユトガルト、　１９７４）。結合された置換基Ｒ３、Ｒｏ、Ｒ１５およびＲ１６ は、上記方法ＡおよびＢに記述したように、同時にあるいは逐次的に変換し得る ように選択することができる。上記方法Ｂに記述した条件下でＲ１６がＨである Ｖｌを環化することにより、式■の化合物が得られるであろう。

本明細書に記述した工程に必要な出発物質は文献公知であるか、もしくは既知の 出発物質と既知の方法を用いて調製することができる。

異性体生成物 式Ｉの生成物のなかで、４つの同一でない置換基に結合している炭素原子は不斉 である。したがって、これらの化合物はジアステレオマー、エナンチオマーもし くはそれらの混合物として存在し得る。上記の合成ではラセミ体、エナンチオマ ーまたはジアステレオマーを出発物質もしくは中間体として使用することができ る。このような合成から得られるジアステレオマー生成物はクロマトグラフィー もしくは結晶化法によって分離することができる。同様に、エナンチオマー生成 物の混合物も同じ技術を用いて、あるいは当該技術分野で公知の他の方法によっ て分離することができる。式■の化合物中に不斉炭素原子が存在する場合、その それぞれは２つの立体配置（ＲまたはＳ）のうちの１つであり得、両方とも本発 明の範囲に包含される。（ＣＨ２）い側鎖と（ＣＨ２）、側鎖を保持する炭素原 子は一般にＳ立体配置を有することが好まれる。置換基Ｒ２とＲ３を保持する炭 素原子は一般にＤアミノ酸の立体配置に対応する立体配置を有することが好まれ る。この立体配置はＲ２とＲ３の化学的組成に応じてＲかＳに割り当てられる。

本発明に記述される化合物は遊離の酸または塩基として単離され得るし、あるい は様々な無機および有機の酸および塩基の塩に変換することもできる。このよう な塩は本発明の範囲に包含される。このような塩の例には、アンモニウム、ナト リウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムなどの金属塩、ジクロロヘキ シルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基との塩、およびアルギ ニンまたはリジンなどのアミノ酸との塩が含まれる。無機および有機の酸の塩も 同様にして、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メ タンスルホン酸、リンゴ酸、フマル酸などを用いて調製することができる。非毒 性の生理学的に適合し得る塩は特に有用であるが、他のあまり望ましくない塩も 単離および生成の工程では用途を有し得る。

上述の塩の調製にはいくかの方法が有用であり、それらは当業者には公知である 。例えば、式１の化合物の遊離酸型または遊離塩基型を１モル等量またはそれ以 上の所望の酸または塩基と、その塩が不溶になる溶媒または溶媒混合物中で反応 させるか、あるいは水のような溶媒中で反応させた後、留去、蒸溜または凍結乾 燥によって溶媒を除去する。別法として、生成物の遊離酸型または遊離塩基型を イオン交換樹脂に通して所望の塩を形成させるか、もしくは生成物の１つの塩型 を同じ一般的工程を用いて別の塩型に変換することができる。

本発明に記述される化合物は、フィブリノーゲンの血小板上のその受容体である ＧＰＩＬＩＩＬへの結合を阻害し、それゆえに哺乳動物における血小板の凝集と 循環系中の血小板栓、塞栓および血栓の形成を防止する。血栓塞栓障害は血液血 小板の凝集しやすさと直接的に関連することが明らかにされている。血管形成術 や血栓溶解療法などの医学的手法にさらされた哺乳動物は特に血栓形成を起こし やすい。血管形成術後の血栓形成を阻害するために本発明化合物を使用すること ができる。これらは組織プラスミノーゲン活性化因子およびその誘導体（米国特 許第４７５２６０３号、第４７６６０７５号、第４７７７０４３号、ＥＰ１９９ ５７４、ＥＰ０２３８３０４、ＥＰ２２８８６２、ＥＰ２９７８６０、ＰＣＴＷ ０８９１０４３６８、ＰＣＴ　ＷＯ３９１００１９７）、ストレプトキナーゼお よびその誘導体、あるいはウロキナーゼおよびその誘導体などの血栓溶解剤と組 み合わせて、血栓溶解療法後の動脈再閉塞を防止するために使用することもでき る。上記血栓溶解剤と組み合わせて使用する場合、本発明化合物は抗血栓溶解剤 の前に、あるいは同時に、あるいはその後に投与することができる。腎臓透析、 血液酸素投与、心臓カテーテル挿入および類似の医学的手法にさらされた哺乳動 物並びにある種の補綴的装置を装着した哺乳動物も血栓塞栓障害を起こしやすい 。

生理学的条件もまた、既知の原因を伴って、あるいは既知の原因を伴わずに、血 栓塞栓障害を導き得る。したがって、本明細書に記載の化合物は哺乳動物の血栓 塞栓障害を治療する際に有用である。また本明細書に記載の化合物を抗凝固療法 の補助として、例えばアスピリン、ヘパリンまたはワルファリンおよび他の抗凝 固剤と組み合わせて使用することもできる。本明細書に記載する化合物のこれら の障害および関連する障害への適用は当業者には明らかであろう。

血小板阻害検定 フィブリノーゲン−血小板相互作用の阻害の評価をインビトロ受容体結合検定と インビトロ血小板凝集阻害検定を規準として行う。

精製したヒト血小板ＧＰＩ１．ＩＩ１．受容体へのフィブリノーゲン結合の阻害 を測定するナックマンとラングの方法（Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　 （＋９８２）６９．２６３−２６９）に基づく改良フィブリノーゲン−ＧＰＩｌ 、ＩＩｌ、　ＥＬ　Ｉ　ＳＡを用いて、式Ｉの化合物のインビトロ生物学的活性 を監視した。リビンスカらの方法（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１ｉｎ、　Ｍｅｄ、　（ １９７４）８４．５０９−５１６）でヒトフィブリノーゲンをｍ製した。フィッ ツジェラルドらの方法（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８５）１５１．１６９−１７７）で血小板ＧＰＩ１． ＩＩ１．を調製した。

微量滴定プレートをフィブリノーゲン（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した後、０．５ ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＡＣＴＳ緩衝液（ＴＡＣＴＳ緩衝液 は２０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７，５）、０．０２％アジ化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カル／ウム、００５％ツウィーン２０．１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有す る）で遮断する。このプレートを０．０１％ツウィーン２０の入ったリン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、測定すべき試料を添加し、次いでＴＡＣＴＳ、０． ５％ＢＳＡ中の可溶化したＧ　ＰＩＩｂＩＩｌ、受容体（４０μｇ／ｍｌ）を加 える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ネズミ抗血小板モノクローナ ル抗体ＡＰ３（ビー・ジエイー二、−７ンら、　Ｂｌｏｏｄ（１９８５）６５． ２２７−２３２）を加える。もう１回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ に結合したヤギ抗マウスＩｇＧを加える。最終的な洗浄を行い、展開試薬緩衝液 （１０ｍｇ　ｏ〜フェニレンジアミン・二塩酸塩、０゜０２１２％過酸化水素、 ０．２２ｍＭ　クエン酸塩、５０ｍＭ　リン酸塩（ｐＨ５０））を加え、次いで 発色するまでインキュベートする。ＩＮ硫酸で反応を停止させ、４９２ｎｍの吸 光度を記録する。

ＧＰＩｌ、ＩＩｌ、　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定に加えて、ヒト血小板豊富血漿（ＰＲ Ｐ）で血小板凝集検定を行うこともできる。アスピリンまたは関連する薬物を少 なくとも２週間摂取していなかった供給者から５０ｍ１のヒト全血（９部）を３ ．６％クエン酸ナトリウム（１部）に採取する。この血液を２２℃で１６０Ｘｇ で１０分間遠心分離した後、５分間静置し、次いでＰＲＰをデカントする。２０ ００ｘｇで２５分間の遠心分離後、血小板の乏しい血漿（Ｐ　Ｐ　Ｐ）を残りの 血液から単離する。ＰＲＰの血小板数をＰＰＰで約ａｏｏｏｏｏに調節した。

ＰＲＰ２２５μＪ十試験試料の希釈物または対照（ＰＢＳ）２５μｍをクロノ− ログ・ホール・ブラッド・アブレボメーター（Ｃｈｒｏｎｏ−１部ｇマｈｏｌｅ 　Ｂｌｏｏｄ　Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）中２５℃で５分間インキュベートす る。凝集剤（コラーゲン、Ｉｍｇ／ｍｌ；Ｕ４６６１９．１１００ｎ／ｍｌ　； もしくはＡＤＰ、８μＭ）を加え、血小板凝集を記録する。

血栓塞栓障害の管理において、本発明の化合物を、経口投与用の錠剤、カプセル 剤またはエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射可能な投与用の滅菌溶液剤また は懸濁剤などの組成物で使用することができる。本発明の化合物を用いる治療を 必要とする動物に至適な効能を与える投与量で投与することができる。投与量と 投与の方法は動物間で異なり、体重、食事、同時投薬および医学界の当業者の知 るその他の因子に依存するであろう。

所望の純度を有する本発明の環状ポリペプチドを生理学的に許容される担体、賦 形剤、または安定化剤と混合することにより、貯蔵または投与のために本環状ポ リペプチドの投与製剤を調製する。このような物質は使用する投与量と濃度で受 容者にとって非毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および 他の有機酸塩などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリアルギニンな ど低分子量（約１０残基未満）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または 免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー 、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸 、セルロースやその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含 む単糖、三糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール やソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの対イオンおよび／または ツウィーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面 活性剤が含まれる。

治療的投与に使用すべき本発明環状ポリペプチドの投与製剤は滅菌状態でなけれ ばならない。滅菌性は０．２ミクロン膜などの滅菌濾過膜を通して濾過すること によって容易に達成される。環状ポリペプチド製剤は通常は凍結乾燥型か水溶液 として保存されるであろう。環状ポリペプチド調製物のｐＨは典型的には３と１ １の間であり、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８であろう。上記賦 形剤、担体、または安定化剤のうちのいくつかの使用により、環状ポリペプチド 塩の形成がもたらされることは理解されるであろう。好ましい投与経路は皮下注 射針によるものであるが、坐剤、エアゾル剤、経口投与製剤および軟膏、ドロッ プおよび皮膚パッチなどの局部製剤なども他の投与法として考えられる。

治療的環状ポリペプチド製剤は一般に滅菌注入口の付いた容器、例えば静脈内溶 液バッグまたは皮下注射針で突き刺すことができる蓋の付いたバイアルなどに入 れられる。

治療的有効投与量はインビトロ法かインビボ法にいずれかで決定される。治療的 有効投与量を評価する１つの方法は、環状ペプチド：シクロ−Ｓ−アセチル−Ｇ Ｉｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＯＨを採用して、ＧＰＩｌ、ＩＩＩ、 血小板受容体に対するフィブリノーゲンの結合を阻害する５０％阻害濃度（ＩＣ ｓ。）を決定することからなる。同様に、同じ環状ペプチドを用いる血小板凝集 検定でＪＣ，、を測定する。このようなインビトロ検定技術に基づいて治療的有 効投与量範囲を決定でよく知られている方法によって、各環状ポリペプチドにつ いて個別に吸収効率を決定しなＩすればならない。

治療的投与量の範囲は約０．００ｉｎＭ−１，０ｍＭであり、より好ましくは０ ゜ｉｎＭ　〜１００　μＭ、最も好ましくは１．ＯｎＭ　〜５０ｔｔＭである。

どと混合する。これらの組成物中の活性成分の量は表記の範囲内で好適な投与量 が得られるような量とする。

錠剤、カプセル剤などに組み込み得る代表的な佐剤はアカシア、トウモロコシ与 単位の物理的形状の改良剤として使用することができる。シロップやエリキンル 剤は活性化合物、ショ糖などの甘味料、プロピルパラベンなどの保存剤、着色料 およびサクランボなどの香料を含有することができる。注射用の滅菌組成物は従 来の医薬的方法に従って製剤化することができる。例えば水や天然の植物油（例 えばゴマ油、ピーナツ油または綿実油）などの賦形剤やオレイン酸エチルなどの 合成脂肪賦形剤に活性化合物を溶解または懸濁することが望ましいであろう。緩 衝剤、保存剤、抗酸化剤などを許容されている医薬的方法に従って組み込むこと もできる。

実施例 以下の実施例では、中間体や最終産物に言及する際に、一般的なα−アミノ酸を 標準的な３文字アミノ酸コードで記述することがある。一般的なα−アミノ酸と はｍＲＮＡの指示の下にタンパク質に組み込まれるアミノ酸を意味する。標準的 な略号はｒＴｈｅ　Ｍｅｒｋ　ＩｎｄｅｘＪ第１０版、　Ｍｉｓｃ−２〜１Ｉｉ ｓｃ−３ページに列挙されている。

特に指定しない限り、一般的なα−アミノ酸はそのアルファ炭素原子で天然の（ もしくはｒＬ−Ｊ）立体配置を有する。前にｒＤＪが付いているコードは一般的 なα−アミノ酸とは反対のエナンチオマーであることを意味する。ノルロイシン （Ｎｌｅ）およびオルニチン（Ｏｒｎ）などの珍しいあるいは修飾されたα−ア ミノ酸は米国特許商標局公報１１１４ＴＭＯＧ（１９９０年５月１５日）に記述 されているように指定する。生成物または中間体の名前の前に「シクロ」が付い ている場合には、そのペプチドが式ＩやＶの化合物のように環化されていること を意味するものとする。

実施例１ ブロモアセチル−Ｇ］　ｙ−Ｌｙｓ−ＧＩ　ｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＯＨ２％架橋 ポリスチレン樹脂（メリフィールド樹脂）上での標準的な固相ペプチド合成によ って表記化合物を保護された形態で調製する。樹脂結合中間体を液体フッ化水素 で処理することにより、樹脂からのペプチドの切り離しと同時に表記化合物から の保護基の切断が起こる。この粗製ペプチドを、１０ミクロン、３００オングス トローム・ポアサイズのＣ−１８バツキングを含有する４、６ｍｍｘ２５０ｍｍ カラムを用いる逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製す る。カラムの溶出を、８０分間かけて０％〜４０％アセトニトリルに直線的に移 行するアセトニトリル１０．１％トリフルオロ酢酸水溶液勾配で行う。表記化合 物は１４分で溶出する。

実施例２ シフｏ−３−アセチル−Ｇｌｙ、−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−○Ｈ実施 例１で調製した化合物を脱イオン水に溶解しく１ｍｇ／ｍｌ）、その溶液のｐＨ を水酸化アンモニウムで７．０〜８．５に調節する。周囲温度で４時間撹拌した 後、その反応溶液をトリフルオロ酢酸でｐＨ３，０〜３．５に酸性化し、次いで 凍結乾燥する。得られた粗生成物を実施例１に記載の条件を用いるＨＰＬＣで精 製する。所望の表記化合物は１１分後に溶出する。

実施例３ シクロ−８−アセチル−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＯＨｐ−ア ルコキンベンジルアルコール樹脂上でフルオレニルメトキンカルボニル（ＦＭＯ Ｃ）保護基化学を使用する標準的な固相ペプチド合成法を用いて、ブロモアセチ ル−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ｔ−プチルオキシカルボニル）−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ （ベーターを一ブチル）−Ｃｙ　ｓ　（Ｓ−トリフェニルメチル）−０−（ポリ マー樹脂）を調製する。樹脂結合ペプチドをジクロロメタン中の１％トリフルオ ロ酢酸溶液で繰り返し処理することによってＳ−）リフェニルメチル基が切断さ れ、これは溶液の明黄色によって立証される。この黄色が消失するまで処理を続 ける（樹脂結合ペプチド１ｇあたり約１５リツトルの上記切断溶液が必要である ）。Ｓ−トリフェニルメチル基の完全な切断後、樹脂結合ペプチドをＮ、Ｎ−ジ メチルアセトアミド中の５％Ｎ−メチルホルホリン溶液で数回洗浄し、次いで、 純粋なＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミド中で１２時間振盪することによって環化を 完了させる。環化した樹脂結合ペプチドを、１％フェノール、１％アニソールお よび１％エタンジチオールの入った（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸で処理すること により、所望の生成物の樹脂からの切断と残存する保護基の切断が同時に達成さ れる。この粗生成物を実施例２に記述したように精製することにより上述と同じ 表記化合物が得られる。

実施例４ 式Ｉの他の化合物の合成 実施例１および２に記述した方法を用いて、表■に挙げる化合物を調製すること ができる。これらの化合物はｍ＝１およびｎ＝３、Ｒ１及びＲ１がＯＨ，Ｒ，、 が水素で、ＸがＳである式■によって表される。粗生成物を実施例２に記述した ようにＨＰＬＣを用いて精製する。

Ｌｙｓのα＝二アミノに結合させる際にＢｏｃ−Ｇａｙの代わりに下記のアミノ 酸誘導体を用いることによって下記に示す置換基Ｒ２とＲ３を得ることができる 。

Ｂｏａ−グリシジを用いる場合にはＲ２とＲ８は共に水素（Ｈ）である。

アミノ酸誘導体　Ｒ２Ｒ３ Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ　メチル　Ｈ Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ　Ｈメチル Ｂｏｃ−Ｌ−Ｖａｔ　２−プロピル　ＨＢｏｃ−Ｄ−〜’ａｌ　Ｈ２−プロピル Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ　Ｈ１−ヒドロキシ−１−エチルＢｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ　１− ヒドロキシ−１−エチル　ＨＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ　ＨカルボキシアミドメチルＢ ｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ　カルボキンアミドメチル　ＨＢｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ　Ｈ２−カ ルボキノアミドエチルＢｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ　２−カルボキノアミドエチルＨＢｏ ｃ−Ｄ−（０−２−Ｈ４−ヒドロキシベンジルブロモベンジルオキシ カルボニル）Ｔｙｒ Ｂｏｃ−Ｌ−（○−２−４−ヒドロキシベンジル　ＨＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ　Ｈベ ンジル Ｂ　ｏ　ｃ−Ｌ−Ｐ　ｈ　ｅ　ベンジル　ＨＢｏａ−Ｄ−Ｌｅｕ　Ｈ２−メチル −１−プロピルＢｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ　２−メチル−１−プロピル　ＨＢｏｃ−Ｄ −Ｍｅｔ　Ｈ２−メチルチオエチルＢｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ　２−メチルチオエチル 　ＨＢｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ　Ｈ、１−ブチル Ｂｏｃ−Ｌ−Ｎｌｅ　１−ブチル　Ｈ Ｂｏｃ−Ｄｌｌｅ　Ｈ２−ブチル Ｂｏｃ−Ｌ−１１ｅ　２−ブチル　Ｈ Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ　Ｈカルボキシメチル（β−０−〕〕タロヘキシル Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ　カルボキシメチル　Ｈ（β−０−ンクロヘキシル） Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ　Ｈ２−カルボキシエチル（７−０−シクロヘキシル） Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ　２−カルホキ／エチル　Ｈ（７−０−シクロヘキシル） Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｄ−（０−Ｈヒドロキシメチルベンジル）Ｓｅｒ Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｌ−（０−ヒドロキシメチル　Ｈベンジル）Ｓｅｒ Ｂｏｃ−Ｄ−（Ｎ”−Ｈ４−イミダゾリルメチルＢｏｃ−Ｌ（Ｎ”−４−イミダ ゾリルメチル　ＨＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ　Ｈ３−インドリルメチルＢｏｃ−Ｌ−Ｔ ｒｐ　３−インドリルメチル　ＨＢｏｃ−Ｄ−（Ｎ’−Ｈ４−アミノ−１−プチ ルＢｏｃ−Ｌ−（Ｎ’−３−アミノ−１−プロピル　ＨＢｏｃ−Ｌ−ＰｒｏはＲ ２＋Ｒ４＝　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を与える。

Ｂｏｃ−Ｄ−ＰｒｏはＲ，＋Ｒ，＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を与える。

上記アミノ酸誘導体と組み合わせて、実施例１においてブロモ酢酸の代わりに下 記の置換されたブロモ酢酸を用いることにより、様々な置換基をＲ６、Ｒ６に有 する表１に示す化合物を得ることができる。上記のアミノ酸誘導体と組み合わせ てブロモ酢酸を用いた場合にはＲ５とＲ６は水素（Ｈ）である。

１−ナフチル−α−ブロモ酢酸 ２−ナフチル−α−ブロモ酢酸 フェニル−α〜ブロモ酢１１ ２−トリフルオロメチルフェニル−α−ブロモ酢酸３−トリフルオロメチルフェ ニル−α−ブロモ酢酸４−トリフルオロメチルフェニル−α−ブロモ酢酸４−ビ フェニル−α−ブロモ酢酸 ２−ブロモプロピオン酸 ２−ブロモラフ酸 ２−ブロモベンクン酸 実施例１においてＬ−システィンをＬ−ベニジルアミンに代えると、Ｒ７とＲ８ がメチルである表１中の化合物が得られる。

選択された式１の化合物 Ｒ２Ｒｓ　Ｒ４Ｒｓ、Ｒｓ　Ｒｔ　ＲｓＨ（４）　（４）　Ｈ，Ｈ，ＨＨ Ｈｌ−ヒドロキシ−ＨＨ，ＨＨＨ ｌ−エチル ＨＨＨＨ，１−ナフチル　ＨＨ ＨＨＨＨ，４−ビフェニル　ＨＨ Ｈ４−ヒドロキシ−ＨＨ，ＨＨＨ ＨＨＨＨ，ＨＣＨｓ　ＣＨ２ Ｒ３−プロピル　ＨＨ，ＨＨＨ メチル Ｈ４−イミダゾリル−ＨＨ，ＨＨＨ ＨＨＨＨ，４−ビフェニル　ＨＨ ＨＨＨＨ，１−ナフチル　Ｈ）（ Ｈ４−ヒドロキシ−ＨＨ，ＨＣＨｓ　ＣＨｓＨＨＨＨ，２−ナフチル　ＨＨ Ｈカルボキシメチル　ＨＨ，ＨＨＨ メチルフェニル ＨＨＨＨ，ＣＨ３ＨＨ ＨＨＨＨ，ペンタフルオロ−ＨＨ フェニル ２−カルボ　ＨＨＨ，ＨＨＨ ＨＨＨＨ，４−）リフルオロ−ＨＨ メチルフェニル ２−カルボ　ＨＨＨ，ＨＨＨ キンエチル カルボキシＨＨＨ，ＨＨＨ エチル 実施例５ シクロ−８−アセチル−（Ｄ−Ｔｙｒ）−Ｌｙｓ−ＧＩ　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｃｙｓ −ＮＨ２４−メチルベンジルヒドリルアミン樹脂上での標準的Ｂｏｃ−合成法を 用いてまず実施例１に記載の如く直線状ペプチドを得ることにより表記化合物の 合成を行う。フッ化水素を用いてこの直線状ペプチドを樹脂から切断した後、実 施例２に記載の如く環化してＨＰＬＣ精製後に表記化合物を得る。この手法を用 いることにより、下記化合物が同様に得られる。

ツク０−８−７セチルー（Ｄ−ＡＩ　ａ）−Ｌｙｓ−Ｇ　］　］ｙ−Ａｓｐ−Ｃ ｙｓ−ＮＨ２ツクローＳアセチル−（Ｄ−Ｖａ　Ｉ）−Ｌｙｓ−ＧＩ　ｙ−Ａｓ ｐ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ンクロ−３−アセチル−（Ｄ−Ｌｅｕ）−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ− Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＮＨｚンクローＳ−アセチル−（Ｄ−１１ｅ）−Ｌｙｓ−Ｇｌ 　ｙ−Ａｓｐ−ＣｙＳ−ＮＨ２ンクロ−８−アセチル−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｌｙｓ −ＧＩ　ｙ−Ａｓｐ−ＣｙＳ−ＮＨ２ンクロ−５−アセチル−（Ｄ−Ｐｒｏ）− Ｌｙｓ−ＧＩ　ｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＮＨｚンクｏ−８−アセチル−Ｇｌｙ−Ｌ ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＮＨ２実施例６ シフｏ−８−アセチル−ＧＩ　ｙ−Ｌｙｓ−ＧＩ　ｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＯＨ・ スルホキシド実施例２で得られる精製産物を１０ｍｇ／ｍ＋の濃度で水に溶解す る。この溶液のｐＨを７に調節する。過酸化水素の５０％溶液を加えて最終濃度 が３％過酸化水素になるようにし、得られた反応混合物を室温で終夜撹拌する。

この溶液を直接オクタデシルシリル逆相クロマトグラフィーカラムに充填する。

上記反応で生成したスルホキシド異性体を水中１％トリフルオロ酢酸中のアセト ニトリルの直線的勾配で溶出させる。

実施例７ Ｇ　ＰＩｌ、ＩＩｌ、に対するフィブリノーゲン結合の阻害微量滴定プレートを フィブリノーゲン（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した後、０．５％ＢＳＡを含有する ＴＡＣＴＳ緩衝液（ＴＡＣＴＳ緩衝液は２０ｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ７，５）、 ０．０２％アジ化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、０．０５％ツウィーン２ ０．１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する）で遮断する。このプレートを０．０ １％ツウィーン２０の入ったリン酸緩衝食塩水で洗浄し、測定すべき試料の希釈 物を添加し、次いでＴＡＣＴＳ、０．５％ＢＳＡ中の可溶化したＩｌ、ＩＩｌ、 受容体（４０μｇ／ｍｌ）を加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し 、ネズミ抗血小板モノクローナル抗体ＡＰ３（１μｇ／ｍｌ）を加える。もう１ 回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧを加 える。最終的な洗浄を行い、展開試薬緩衝液（１０ｍｇ　ｏ−フェニレンジアミ ン・二塩酸塩、０．０２１２％過酸化水素、０．２２ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭ リン酸塩（ｐＨ５，０））を加え、次いで発色するまでインキュベートする。Ｉ Ｎ硫酸で反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を記録し、ＩＣ，。値を決定する 。

実施例８ ビトロネクチン受容体に対するビトロネクチン結合の阻害ａ、９６穴微量滴定プ レート（ヌンク・マキシソーブ）を、ＰＢＳ中１５μｇ／ｍｌにしたヒトビトロ ネクチンで被覆する。１ウエルあたり５０μｍを用いる。４℃で終夜インキュベ ートする。

ｂ、被覆溶液を除去する。プレートを検定緩衝液（５０ｍＭ　トリス、１００ｍ ＭＮａＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣＬ、１ｍＭ　ＭｇＣ］ｚ、１ｍＭ　ＭｎＣ］ｚ、ｐ Ｈ７，４）に３．５％ＢＳＡを加えたちの２００μｍで１回洗浄する。１５０μ ｍ検定緩衝液／ウェルを追加する。室温で１時間プレートを遮断する。

Ｃ１試験化合物を検定緩衝液中に調製する。精製したヒトビトロネクチン受容体 を５０μｇ／ｍｌ濃度に調製する。

ｄ、２５μ■の試験化合物または緩衝液対照をプレートに加える。２５μｍの受 容体溶液をプレートに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。

ｅ、インキュベーション中に抗体溶液を調製する。４　Ｂ　１２ｍａ　ｂ（β３ 特異的抗体）を、検定緩衝液中１ニア５００のウサギＦ（ａ　ｂ’）２抗ネズミ Ｆｃ−ＨＲＰ複合体（ペルーフリーズ）と１：１６５０で混合する。

ｆ　プレートをデカントする。ＰＢＳ、０．０５％ツウィーン２０で４回（１５ ０μＩ／ウエル）洗浄する。１ウエルあたり５０μｍの抗体溶液を加える。室温 で振盪しながら１時間インキュベートする。

ｇ、０ＰＤ（オルトフェニレンジアミン）基質を、リン酸塩−クエン酸塩１５ｍ Ｉ中に１０ｍｇ０ＰＤ（シグマ）として調製する。次に、この溶液に６μｍの３ ０％Ｈ２Ｏ２を加える。これを使用する５分前に行うこと。

ｈ、ＰＢＳ／ツウィーン２０でプレートを４回洗浄する。７５μｍのＯＰＤ溶液 を各ウェルに加える。２０〜３０分間反応を進行させる。７５μ■のＬＭ　Ｈａ ｓ０４を加えて反応を停止させる。４９２ｎｍの吸光度を読み取る。

ＧＰＩＩゎＩＩＬに対するフィブリノーゲン結合の阻害剤としてのこれら環状ポ リペプチドの効能ゆえに、また本明細書で明らかにしたようにこれらの環状ポリ ペプチドの製造が実行可能であるがゆえに、本発明は高血栓状態に関連する、あ るいは高血栓状態によって特徴づけられる大きい障害群の治療に適用することが できる。そのような障害の典型例は、高血栓状態を正常に防止する因子の遺伝的 もしくは後天的な欠損症、血管形成術や血栓溶解療法などの医学的手法、補綴的 合成心臓弁、体外潅流装置および腫瘍塊など血流の機械的な支障、アテローム性 動脈硬化症、および冠状動脈疾患である。

本明細書では必然的にいくつかの特定の方法および物質を参照して本発明を議論 した。これら特定の方法および物質に関する議論は決して本発明の範囲の限定を 成すものではなく、本発明の範囲は本発明の目的を達成するに適したあらゆる代 替法および物質のいずれにも及ぶものと理解されるべきである。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９１０７８０９ Ｓ＾　５３２９２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約３４５アミノ酸残基未満を有し、ＡＤＰで誘発されるヒト血小板凝集を阻 害することができるトリペプチド配列Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するポリペ プチド。 ２．Ｆｇ／ＧＰＩＩｂＩＩＩ■固相ＥＬＩＳＡにおいて約１００ｎＭ未満のＩＣ ５０を有する請求の範囲第１項のポリペプチド。 ３．約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する請求の範囲第２項のポリペプチド。 ４．環状ポリペプチドであって、その環が該トリペプチド配列を含有する請求の 範囲第２項のポリペプチド。 ５．約２０α−アミノ酸残基からなる請求の範囲第４項のポリペプチド。 ６．１０α−アミノ酸残基未満からなる請求の範囲第５項のポリペブチド。 ７．環が少なくとも１つのα−アミノ酸の側鎖を通して伸延している請求の範囲 第６項のポリペプチド。 ８．合成ポリペプチドである請求の範囲第２項のポリペプチド。 ９．さらにビトロネクチン／ビトロネクチン受容体（Ｖｎ／ＶｎＲ）固相ＥＬＩ ＳＡにおいて１００ｎＭより高いＩＣ５０を有する請求の範囲第３項のポリペプ チド。 １０．リポコルテンまたはカルバクチンタンパク質ファミリーの構成要素でない 請求の範囲第１項のポリペプチド。 １１．該ファミリー構成要素が群：胎盤抗凝固物質タンパク質（ＰＡＰ）、リポ コルテンＩおよびリポコルチンＨから選択される請求の範囲第１０項のポリペプ チド。 １２．下記構造を有する請求の範囲第７項のポリペプチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここに、 Ｘａａ１はαアミノ基を介してＺに結合しているＤまたはＬα−アミノ酸を表し 、Ｘａａ２はＯｒｎまたはＬｙｓを表し、Ｘａａ３は側鎖を介してＺに結合して いるＤまたはＬα−アミノ酸を表し、Ｚはアミド結合、ジスルフィド、ＣＯＣＨ ２Ｓ、ＣＯＣＨ２ＳＯ、またはＣＯＣＨ（Ｃ３Ｈ５）Ｓを表し、 ＲはＯＨまたはＮＨ２を表す。］ １３．Ｘａａ１がＧｌｙまたはＤα−アミノ酸であり、Ｘａａ２がＬｙｓであり 、Ｘａａ３がＣｙｓである請求の範囲第１２項のポリペプチド。 １４．Ｘａａか群：【配列があります】およびＤ−Ｔｒｐから選択され、 Ｘａａ２がＬｙｓであり、Ｘａａ３が群：Ｃｙｓおよびアミノアジピン酸から選 択される請求の範囲第１３項のポリペプチド。 １５．ＺがＣＯＣＨ２ＳまたはＣＯＣＨ（Ｃ６Ｈ５）Ｓである請求の範囲第１４ 項のポリペプチド。 １６．トリペプチド配列Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するポリペプチドであっ て、Ｘａａがオルニチン（Ｏｒｎ）またはリジン（Ｌｙｓ）であり、Ｆｇ／ＧＰ ＩＩｂＩＩＩ■固相ＥＬＩＳＡにおいてＶｎ／ＶｎＲ固相ＥＬＩＳＡでそのポリ ペプチドが有するよりも高い阻害効力を有し、かつ、胎盤抗凝固物質タンパク質 （ＰＡＰ）、［Ｏｒｎ２４］エチスタチン、Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅお よびＯｒｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐではないポリペプチド。 １７．Ｆｇ／ＧＰＩＩｂＩＩＩ■ＥＬＩＳＡにおいて約１００ｎＭ未満のＩＣ５ ０を有する請求の範囲第１６項のポリペプチド。 １８．Ｆｇ／ＧＰＨｂＩＩＩ■ＥＬＩＳＡにおいて約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を 有する請求の範囲第１７項のポリペプチド。 １９．Ｆｇ／ＧＰＩＩｂＩＩＩ■ＥＬＩＳＡにおける障害効力がＶｎ／ＶｎＲＥ ＬＩＳＡにおけるよりも１０倍以上高い請求の範囲第１８項のポリペプチド。 ２０．Ｆｇ／ＧＰＩＩｂＩＩＩ■ＥＬＩＳＡにおける阻害効力がＶｎ／ＶｎＲＥ ＬＩＳＡにおけるよりも１００倍以上高い請求の範囲第１９項のポリペブチド。 ２１．環状ポリペプチドであって、その環内に該トリペプチド配列がある請求の 範囲第１９項のポリペプチド。 ２２，４乃至１０アミノ酸からなる請求の範囲第２１項のポリペプチド。 ２３．環が少なくとも１つのψアミノ酸側鎖の側鎖を通して伸延している請求の 範囲第２２項のポリペプチド。 ２４．核σアミノ酸がＣｙｓである請求の範囲第２３項のポリペプチド。 ２５．合成ポリペプチドである請求の範囲第１６項のポリペブチド。 ２６．下記式１で表される請求の範囲第２２項のポリペプチドおよび医薬的に許 容されるその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１とＲ９は同一であるか、もしくは異なり、ヒドロキシ、 Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、 Ｃ３〜Ｃ１２アルケノキシ、 Ｃ６〜Ｃ１２アリールオキシ、 ジＣ１〜８アルキルアミノ−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、群：アセチルアミノエトキ シ、ニコチノイルアミノエトキシ、およびスクシンアミドエトキシから選択され るアシルアミノ−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ピバロイルオキシエトキシ、 Ｃ６〜Ｃ１２アリール−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ（ここにアリール基は非置換であ るか、もしくは次の基：ニトロ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ４アル コキシ、およびアミノの１またはそれ以上で置換されている）、ヒドロキシ−Ｃ ２〜Ｃ８アルコキシ、 ジヒドロキシ−Ｃ３〜Ｃ８アルコキシ、およびＮＲ１０Ｒ１１にこにＲ１０とＲ １１は同一であるか、もしくは異なり、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８ アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール（ここにアリール基は非置換であるか、もし くは次の基：ニトロ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、お よびアミノの１またはそれ以上で置換されている）、Ｃ８〜Ｃ１２アリール−Ｃ １〜Ｃ８アルキル（ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基：ニト ロ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、およびアミノの１ま たはそれ以上で置換されている）を表す）、から選択される。 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一であるか、もしくは異なり、水素、 Ｃ６〜Ｃ１２アリール（ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基： ニトロ、ヒドロキシ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、ハロ −Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、アミノ、フェニルオキシ、フェ ニル、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８ アルキルアミノ、Ｃ６〜Ｃ１２アロイル、Ｃ１〜Ｃ８アルカノイル、およびヒド ロキシ−Ｃ１〜Ｃ８アルキルの１またはそれ以上で置換されている）、置換また は非置換の分枝状または直鎖状Ｃ１〜Ｃ１２アルキルにこに置換基はハロ（Ｆ、 Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ６〜Ｃ１２アリールオキシ（ここ にアリール基は非置換であるか、もしくは次の基：ニトロ、ヒドロキシ、ハロ（ Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、アミノ、 フェニルオキシ、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、 Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ６〜Ｃ１２アロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノ イルの１またはそれ以上で置換されている）、イソチオウレイド、Ｃ３〜Ｃ７シ クロアルキル、ウレイド、アミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ８ア ルキルアミノ、ヒドロキシ、アミノ−Ｃ２〜Ｃ８アルキルチオ、アミノ−Ｃ２〜 Ｃ８アルコキシ、アセトアミド、ベンズアミド（ここにフェニル基は非置換であ るか、もしくは次の基：ニトロ、ヒドロキシ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ １〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、アミノ、フェニルオキシ、アセト了 ミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ 、Ｃ６〜Ｃ１２アロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイルの１またはそれ以上で 置換されている）、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアミノ（ここにアリール基は非置換で あるか、もしくは次の基：ニトロ、ヒドロキシ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ １〜Ｃ８アルコキシ、アミノ、フェニルオキシ、アセトアミド、ベンズアミド、 ジＣ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ６〜Ｃ１２アロイ ル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイルの１またはそれ以上で置換されている）、グ アニジノ、フタルイミド、メルカプト、Ｃ１〜Ｃ８アルキルチオ、Ｃ６〜Ｃ１２ アリールチオ、カルボキシ、カルボキシアミド、カルボーＣ１〜Ｃ８アルコキシ 、Ｃ６〜Ｃ１２アリール（ここにアリール基は非置換であるか、もしくは次の基 ：ニトロ、ヒドロキシ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ア ミノ、フェニルオキシ、アセトアミド、ベンズアミド、ジＣ１〜Ｃ８アルキルア ミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ６〜Ｃ １２アロイル、およびＣ１〜Ｃ８アルカノイルの１またはそれ以上で置換されて いる）、および複素芳香環（ここに複素環基は５〜１０環原子を有し、２原子ま でのＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を含有する）から選択される）、から選択され る。 Ｒ２とＲ３、Ｒ５とＲ６、またはＲ７とＲ８は、随意に独立して、互いに結合し て４〜７原子からなる炭素環またはヘテロ環基にこにヘテロ原子はＯ、Ｓ、また はＮＲ１２（ここにＲ１２は水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル 、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、Ｃ６〜Ｃ１２アリール−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜 Ｃ８アルカノイル、およびＣ６〜Ｃ１２アロイルから選択される）から選択され る）を形成してもよい。 Ｒ４は水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１２ アリール、およびＣ６〜Ｃ１２アリール−Ｃ１〜Ｃ８アルキルから選択される。 Ｒ２またはＲ３は防毒にＲ４と結合してピペリジン、ピロリジンまたはチアゾリ ジン環を形成してもよい。 Ｒ１４は水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリ ール、およびＣ６〜Ｃ１２アリール−Ｃ１〜Ｃ８アルキルから選択される。 Ｘは１個のＯまたはＳ原子、１または２個のＯ原子を保持する１個のＳ原子、Ｎ Ｒ１３（ここにＲ１３は水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル、Ｃ ６〜Ｃ１２アリール、Ｃ６〜Ｃ１２アリール−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ アルカノイル、およびＣ６〜Ｃ１２アロイルを表す）、およびＣ６〜Ｃ１２アリ ール、Ｃ１〜Ｃ８アルカノイル、（ＣＨ２）ｋ（ここにｋは０から５までの整数 を表す）から選択される。 ｎは１から６までの整数を表す。 ｍは０から４までの整数を表す。］ ２７．医薬的に許容される賦形剤および請求の範囲第２６項の化合物からなる医 薬組成物。 ２８．血小板凝集を随喜する方法であって、請求の範囲第２６項の化合物の血小 板凝集阻害量を投与することからなる方法。 ２９．哺乳動物における血小板凝集を軽減する方法であって、その哺乳動物に請 求の範囲第２６項に規定される物質の医薬的有効量を投与することからなる方法 。 ３０．血栓形成の傾向が増大している哺乳動物を治療する方法であって、その哺 乳動物に請求の範囲第２６項に規定される物質の医薬的有効量を投与することか らなる方法。 ３１．請求の範囲第１２項に規定される物質からなる、哺乳動物における血小板 凝集を軽減する物質。 ３２．請求の範囲第１２項に規定される物質からなる、血栓形成の傾向が増大し ている哺乳動物を治療するための物質。 ３３．請求の範囲第１２項に規定される物質からなる、哺乳動物中で血小板に対 するフィブリノーゲン結合を阻害する物質。 ３４．血栓形成の傾向が増大している哺乳動物を治療する方法であって、請求の 範囲第２６項に規定される物質の医薬的有効量を血栓溶解剤と組み合わせて投与 することからなる方法。 ３５．血栓形成の傾向が増大している哺乳動物を治療する方法であって、請求の 範囲第２６項に規定される物質の医薬的有効量を抗凝固剤と組み合わせて投与す ることからなる方法。 ３６．血栓形成の傾向が増大している哺乳動物を治療する方法であって、請求の 範囲第２６項に規定される物質の医薬的有効量を血管形成術の後に投与すること からなる方柱。 ３７．該環状体が環内に１７または１８原子を含有する請求の範囲第２６項の環 状ペプチド。 ３８．該環状ペプチドが少なくとも１つのＤ−ａ−アミノ酸を含有する請求の範 囲第３７項の環状ペプチド。 ３９．該Ｄ−アミノ酸がＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列以外の該環状体内のいずれ かの位置にある請求の範囲第３８項の環状ペプチド。