JP3281370B2 - 血小板凝集阻害剤 - Google Patents

血小板凝集阻害剤

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、種々の蛇毒から単離および精製された血小
板凝集阻害剤であるペプチドに、あるいは血小板凝集阻
害剤に関連するペプチドの群に、関する。これらのペプ
チドは、血小板に関連する虚血性疾患の処置、および予
防のための治療剤として有用である。さらに詳細には、
本発明は、血小板の接着および凝集に関与する接着性タ
ンパク質に対する特異的レセプターを阻害する。ペプチ
ドに関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドの検
出法、および蛇毒から実質的に均一にまで精製する方
法、さらに、合成的に、および組み換えDNA技術を用い
て、活性なペプチドを調製するためにこれらのポリペプ
チドのアミノ酸一次配列を用いる工程を記載する。
背景技術 ほとんどの欧米社会において、心臓疾患は第一の死亡
原因である。心臓疾患による死亡は、アテローム性動脈
硬化症、および動脈硬化症から始まる血小板依存性虚血
性症候群にしばしば誘発される。この血小板依存性虚血
性症候群は、急性心筋梗塞、慢性の不定アンギナ、一過
性の虚血性発作および卒中、末梢血管の疾患、動脈性血
栓症、子かん前症、塞栓症、再狭窄および／あるいは血
管形成術、頸動脈内膜切除術、血管移植での吻合、およ
び心臓血管系装置（たとえば留置カテーテル、あるいは
「体外循環装置」のバイパス）の常時装着、の後の血栓
症を含むが、これらに限定されない。これらの症候群
は、血管壁上か、あるいは血管内腔での血液介在性媒介
物質による血小板の活性化から始まり、血流を制限する
血栓を形成する血小板凝集によって顕在化すると考えら
れている、種々の狭窄性および閉塞性の血管障害を示
す。
多くの研究が、血小板凝集および血栓形成の機序を理
解するのに貢献してきた。血小板は、血管内腔が狭くな
ること、斑形成、および異物の存在（例えば、カテーテ
ル）などのような、種々の血管損傷に反応する。これら
の損傷に対する血小板の反応は、血小板の接着および活
性化、および、強力な細胞分裂促進因子を含む血小板顆
粒成分の放出を含む一連の出来事である。活性化された
血小板凝集は、フィブリンの形成を引き起こし、それは
血栓をさらに安定化する。
これらの反応を調節する機序については、現在では多
くのことが知られている。未刺激の血小板は、ラミニン
（VLA 2、VLA 6）、およびコラーゲン（VLA 2、GPIV、
その他）を含む、いくつかの接着性タンパク質に対する
レセプターを有するが、血小板の内皮下層への最初の接
着は、固定されたフォン・ウィルブランド因子への血小
板の膜糖タンパク質（GP）I bの結合に媒介されると考
えられている。それに続く血小板の活性化は、ADP、エ
ピネフィリン、トロンビン、コラーゲン、およびトロン
ボキサンA2を含む既知の生理学的拮抗物質の１つ、ある
いはそれ以上によって開始される。
血小板凝集は、血小板膜表面のGP II b−III a複合体
により媒介される。GP II b−III aは、未刺激の血小板
表面に非活性型で存在する。血小板が、接着および生理
学的拮抗物質により活性化されると、GP II b−III aも
活性化されて、フィブリノーゲン（Fg）、フォン・ウィ
ルブランド因子（vWF）、およびフィブロネクチン（F
n）のレセプターとなる（Phillipsら、Blood（1988）7
1:831−843を参照）；しかし、インビボでの血小板凝集
および血栓形成の主要な原因は、フィブリノーゲンおよ
び／あるいはフォン・ウィルブランド因子の結合である
と考えられている。従って、フィブリノーゲンあるいは
フォン・ウィルブランド因子のGP II b−III aへの結合
を特異的に阻害する物質は、血小板凝集を阻害し、イン
ビボで血栓形成を阻害する物質の候補となり得る。
血小板GP II b−III aは現在では、「インテグリン」
と総称される、構造的に関連している接着性タンパク質
のレセプターのスーパーファミリーの一員であることが
知られている。GP II b−III aのように、今日までに知
られているインテグリンの全ては、大きい方のα−サブ
ユニット（例えばGP II b）および、小さい方のβ−サ
ブユニット（例えばGP III a）の、２つのサブユニット
分子からなる。インテグリンサブユニットの既知の配列
間には高い相同性があり、共通の先駆物質から進化した
ことを示唆する。インテグリンは種々の細胞接着におい
て機能し、白血球、内皮細胞、平滑筋細胞、および血管
系の他の細胞に見い出されている。インテグリンは広く
分布しているが、GP II b−III aは血小板に局在してい
るので、インテグリンは広く分布しているので、好まし
い抗凝集剤は、他のインテグリンとは対照的に、選択的
にGP II b−III aを阻害し得る。
接着性タンパク質の活性化血小板への結合を阻害し、
血小板凝集を阻害する、いくつかのクラスのペプチドが
開示されている（Hawigerら、アメリカ合衆国特許No.4,
661,471;およびRouslahtiら、アメリカ合衆国特許No.4,
614,517;4,578,079;4,792,525;および英国特許No.GB2,2
07,922Aを参照）。ペプチドの１つのクラスでは、RGD配
列が重要であり、テトラペプチド配列、RGDS、RGDT、RG
DCがとりわけ使用されてきた。アミノ酸配列RGDXは、F
g、Vn、vWFおよびFnを含む種々の接着性タンパク質に見
い出される。この配列が、接着性タンパク質の接着性タ
ンパク質レセプターとの相互作用において、重要な役割
を果たすことが証明されている。なぜならば、この配列
を有するペプチドが接着性タンパク質の結合を阻害する
からである。たとえば、Pierschbacher,M.D.ら、J Biol
Chem（1987）262:17294−17298;Ruggeriら、Proc Natl
Acad Sci USA（1986）83:5708−5712;およびRouslahti
ら、Cell（1986）44:517−518を参照のこと。この配列
を有するテトラペプチドは、1989年６月７日公開のEP出
願No.319,506に開示されている。RGD配列のアルギニン
のかわりにホモアルギニンを有する短いペプチドは、19
89年８月24日公開のPCT出願WO89/07609に開示されてい
る。
RGD含有ペプチドにおいて可能な構造的多様性が、Pie
rschbacher,M.D.ら、J Biol Chem（前出）によって研究
されている。これらの研究で、RGD含有配列の操作は、
フィブロネクチンあるいはビトロネクチンの基質への結
合に対する阻害に関連する活性に影響するだけでなく、
２つのリガンドの結合に差異を生じることが判明した。
フィブロネクチンの細胞接着領域からとったペプチド配
列GRGDSPCが、モデルペプチドとして使用された。Ｌ−A
rgのＤ−Argへの置換のようなある種の置換は、どちら
のリガンドの結合にも影響しないようであるが、Glyを
Ｄ−Alaに、あるいはＬ−AspをＤ−Aspに置換すると阻
害活性を破壊した。Ｌ−SerのＤ−Serへの置換は、ビト
ロネクチンのビトロネクチンレセプターとの相互作用に
対する阻害を低下させたが、フィブロネクチンのフィブ
ロネクチンレセプターとの相互作用にはほとんど効果が
なかった。SerをAsnに置換すると、フィブロネクチンの
結合に対する阻害が促進され、ビトロネクチンの結合に
対する効果が低下したペプチドが得られた。Serを他の
アミノ酸に置換すると、他の効果を生じた。Serをスレ
オニンに置換すると、ビトロネクチンレセプターへの結
合に対するペプチドによる阻害は増強され、Ｌ−Proに
置換すると、活性のないペプチドになった。Gly−Pen−
Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro−Cys−Alaの配列の環状
ペプチドもまた調製され、ここで「Pen」はペニシラミ
ンであり、ジスルフィド橋がPenとCysとの間に形成され
た。筆者の考えでは、ペニシラミンは環に構造的拘束を
増加する機能を有し、一方、Ｎ端末のGlyおよびカルボ
キシ末端のAlaは、遊離のアミノ基およびカルボキシル
基を環から離すために付加された。この環状ペプチド
は、ビトロネクチンの結合を、環状化前の同ペプチドよ
りも強く阻害し得たが、フィブロネクチンの結合に対す
る阻害には効果がなかった。
最近、アルキル化された「Ｒ」残基を有するように、
RGD配列を改変した抗血栓ペプチドが、Samanen,J.ら、J
Cell Biochem（1990）Suppl 14A:A229により報告され
た。RGD含有ペプチドにおける構造／活性の関係の総説
が、Ali,F.E.らにより、Marshallら編、Proc 11th Am P
eptide Symp,ESCOM Leiden 1990中に公表された。
1989年11月15日公開のヨーロッパ特許出願公開No.34
1,915は、一つは直線状で、もう一方は環状の、２つの
グループのペプチドを開示し、これらは血小板GP II b
−III aレセプターに結合し、従ってvWF、フィブロネク
チン、およびフィブリノーゲン−フィブリンへの結合能
を阻害すると言われている。これらのペプチドの結合の
特異性に関するデータは開示されていない。この環状ペ
プチドのグループには、Ｄ−あるいはＬ−ホモアルギニ
ン、ジメチルあるいはジエチルアルギニン、リシン、あ
るいはこれらの残基のα−アルキル化誘導体によって、
Ｒが置換されたRGD配列の改変が含まれる。最小の環状
構造は、ジスルフィド橋を形成する２つの残基に挟まれ
た「Ｒ」GD配列のみで構成されている。
阻害性ペプチドの別のクラスは、フィブリノーゲンの
γ鎖に由来するカルボキシル末端配列を基にした12個の
ペプチド配列、HHLGGAQKAGDVを使用する（Kloczewiak
ら、Biochemistry（1989）28:2915−2919;Timmonsら、
（同誌）2919−2923;アメリカ合衆国特許4,661,471（前
出）;EP出願No.298,820）。この配列は、FgおよびvWFの
GP II b−III aへの結合、および、それに続く血小板凝
集を阻害するが、このペプチドの有用性は限られてい
る。なぜならば、血小板レセプターとの相互作用の親和
性が低いからである（IC50＝10−100uM）。
最近、いくつかのグループが、GP II b−III a複合体
に非常に高い親和性を有する、新しいクラスの低分子量
ポリペプチド因子を、蛇毒から単離し、特徴付けた。Hu
ang,T.−F.ら、J Biol Chem（1987）262:16157−16163;
Huang,T.−F.ら、Biochemistry（1989）28:661−666
は、Trimeresurus gramineusから単離された、RGDおよ
び６個のジスルフィド橋を有する、72個のアミノ酸ペプ
チドである、トリグラミン（trigramin）の一次構造を
報告している。Gan,Z.−R.ら、J Biol Chem（1988）26
3:19827−19832は、Echis carinatusから単離され、こ
れもまた、RGDおよび４個の推定上のジスルフィド橋を
有する、49個のアミノ酸のペプチドである、エキスタチ
ン（echistatin）の特性および構造を報告している。Wi
lliams,J.A.ら、FASEB Journal（1989）3:A310,Abstr.N
o.487mは、関連ペプチドである、エレガンチン（elegan
tin）、アルボラブリン（albolabrin）、およびフラボ
ビリジン（flavoviridin）、の配列および特性を報告し
ている。さらに、ビチスタチン（bitistatin）の特徴
が、Shebuski,R.J.ら、J Biol Chem（1989）264:21550
−21556により報告された；また、Agkistrodon piscivo
rus piscivorusのPAIが、Chao,B.H.ら、Proc Natl Acad
Sci USA（1989）86:8050−8054により報告された。蛇
毒からの種々のGP II b−III aの拮抗物質の間の関係
は、Dennis,M.S.ら、Proc Natl Acad Sci USA（1989）8
7:2471−2475により検討された。
このヘビ毒の阻害性ペプチドのグループには、Niewia
rowski,S.ら、Thromb Haemostas（1989）62:319（Abst
r.SY−XIV−５）によって報告された、Trimeresurus al
bolabrisから単離されたアルボラブリン、T.elegansか
ら単離されたエレガンチン、T.flavoviridisから単離さ
れたフラボビリジン、Bothrops atroxから単離されたバ
トロキソスタチン（batroxostatin）、Bitis arietans
から単離されたビチスタチンが含まれる。さらに、アプ
ラギン（applaggin）が、Chao,B.ら、Thromb Haemostas
（1989）62:50（Abstr.120）によってAgkistrodon p.pi
scivorusから精製され、報告された。また、Huang,T.F.
ら、Thromb haemostas（1989）62:48（Abstr.112）によ
って、Agkistrodon halysからハリシン（halysin）が精
製され、報告された。これらのペプチドの全ては、高い
度合の配列の相同性を示す。さらに、今日までに報告さ
れている、接着性タンパク質のインテグリンレセプター
への結合を阻害する、蛇毒からのペプチドの全ては、RG
D配列を有する。
報告されているこれらの蛇毒因子は、インビトロでは
強力な血小板凝集阻害物質であるが、これらのペプチド
はまた、ビトロネクチンレセプターおよびフィブロネク
チンレセプターのような、他の接着性タンパク質レセプ
ターに高い親和性で結合する（Knudsen,K.A.ら、Exp Ce
ll Res（1988）179:42−49;Rucinski,B.ら、Thromb Hae
mostas（1989）62:50（Abstr.120））。この蛇毒因子の
GP II b−III aに対する特異性の欠如は、血栓形成阻害
剤として、それらを治療に使用する際の望ましくない性
質である。なぜならば、それらは、血管系の他の細胞の
接着性に作用する可能性を有し、特にインテグリンに媒
介される接着に作用する可能性を有しているためであ
る。
血小板血栓の阻害剤を作製するために開発された他の
方法は、活性化血小板への接着性タンパク質の結合を阻
害するマウス抗GP II b−III aモノクローナル抗体の使
用であった。これらのモノクローナル抗体は、イヌにお
いて、組織プラスミノゲン活性化因子で再還流した後の
冠状動脈の再閉塞を防ぐのに使用され（Yasuda,T.ら、J
Clin Invest（1988）81:1284−1291）、そして重度に
狭窄している、損傷したイヌ冠状動脈の周期的流量低下
を防ぐのにも使用された。ヒトにおける、そのようなモ
ノクローナル抗体の使用の潜在的副作用は、その長期に
継続する作用、およびそれらの潜在的免疫原性の結果で
あり得る。
明かに、望ましくない血栓形成の予防、あるいは、少
なくとも軽減するために、付加的治療的処置法が必要と
される。特に、恒常性をみださず、他の細胞接着に作用
せずに、特定の位置で血栓形成を阻害あるいは抑制し得
る治療剤は、大きな治療的利益をもたらすであろう。理
想的には、これらの薬剤は、強力で、GP II b−III aに
特異的で、ほとんどの患者に非免疫原的であるべきであ
る；さらに、それらは投与が簡単で、安定で、生産する
のに経済的であるべきである。さらに、これらの薬剤
は、一過性に作用するべきで、長期の恒常性に影響する
ことなく血栓形成の最も初期の段階で機能し得るべきで
ある。本発明は、これらを満たし、他の関連する必要性
を満たす。
発明の開示 本発明は、血小板凝集に媒介される血栓形成を特異的
に阻害する、蛇毒あるいは他の生物学的原料からの、低
分子量（＜10kd）の因子を同定するための、簡潔なスク
リーニング法を提供する。この方法は、血小板をADPの
ような適当な刺激で処置すると、血小板の表面でのフィ
ブリノーゲンおよび／あるいはvWFのGP II b−III aへ
の結合を介して、血小板凝集がまづ影響されるという、
知識の利点を使用する。これらの規準を使用して、すな
わち、単離されたレセプターへのフィブリノーゲンおよ
び／あるいはvWFの結合の阻害、および、フィブロネク
チンレセプターへのフィブロネクチン（Fn）の結合（Fn
/FnR結合）の阻害、およびビトロネクチンレセプターへ
のビトロネクチンの結合（Vn/VnR結合）の阻害、に関す
る類似の規準、さらに、GP II b−III aへのFnおよびVn
の結合のような、他の因子の結合を規準として、血小板
凝集阻害剤（PAI）の特異性のプロフィールが、迅速
に、且つ簡便に得られる。この方法は、広範囲のパネル
の蛇毒にPAIが存在するか存在しないかのスクリーニン
グおよび特徴付け、このパネルから同定されたPAIに、
他のインテグリンと対照的なGP II b−III aへの結合阻
害の特異性の特徴付け、および、これらのPAIの誘導体
である活性なペプチドの同定に使用される。
従って、１つの観点では、本発明は生物学的液体中の
PAIの存在あるいは非存在を迅速にスクリーニングする
方法を目指し、その方法は、フィブリノーゲン存在下の
テスト反応で、単離されたGP II b−III aとその液体を
接触させる工程、および、このテスト反応でGP II b−I
II aに結合したフィブリノーゲンの量を、コントロール
反応でGP II b−III aに結合したフィブリノーゲンの量
と比較する工程を包含する。この方法は、さらに、PAI
の特異性を特徴付けるために、FnとFnレセプターを、Vn
とVnレセプターを、FnとGP II b−III aを、あるいはvW
FとGP II b−III aを接触させる、テストおよびコント
ロール反応工程を含み得る。
他の観点では、本発明は、本発明の方法に従って活性
な蛇毒中に同定され、それから単離し得る、単離された
形態の新規のPAIを目指す。特に、本発明は単離された
形態のPAIに関し、それは以下のものから単離し得る： Echis colorata,Eristicophis macmahonii;A.hypnal
e,A.acutus,A.piscivorous leucostoma,A.piscivorus c
onanti;Bothrops asper;Bothrops cotiara,B.jararaca,
B.jararacussu,B.lansbergi,B.medusa,B.nasuta,B.neuw
iedi,B.pradoi,B.schlegli;Crotalus atrox,C.basilicu
s,C.cerastes cerastes,C.durissus durissus,C.duriss
us totonatacus,C.horridus horridus,C.molossus molo
ssus,C.ruber ruber,C.viridis cereberus,Crotalus v.
helleri,Crotalus v.lutosus,Crotalus v.oreganus,Cro
talus v.viridis;Lachesis mutas;Sistrurus catenatus
tergeminus,and Sistrurus milarus barbouri. 好ましい単離された形態のPAIは、次のものから得ら
れるPAIから調製されるか、あるいは次のものから得ら
れるPAIのアミノ酸配列を有する:Eristicophis macmaho
nii（エリスチコピン、eristicophin）;Bothrops cotia
ra（コチアリン、cotiarin）;B.jararacussu;Crotalus
atrox（クロタトロキシン、crotatroxin）;Crotalus ba
silicus（バシリシン、basilicin）;C.cerastes cerast
es（セラスチン、cerastin）;C.durissus totanatacus
（デュリシン、durissin）;C.durissus durissus（デュ
リシン）;C.h.horridus（ホリジン、horridin）;Crotal
us m.molossus（モロシン、molossin）;C.ruber ruber
（ルベリン、ruberin）;Crotalus viridis lutosus（ル
トシン、lutosin）;C.v.viridis（ビリジン、viridi
n）;Crotalus v.oreganus（オレガニン、oreganin）;Cr
otalus v.helleri;Lachesis mutas（ラチェシン、lache
sin）;Sistrurus catenatus tergeminus（テルゲミニ
ン、tergeminin）；およびS.milarus barbouri（バルボ
ウリン、barbourin）。
エリスチコピン、コチアリン、クロタトロキシン、セ
ラスチン、デュリシン、ホリジン、ルベリン、ラチェシ
ン、バシリシン、ルトシン、モロシン、オレガニン、ビ
リジン、テルゲミニン、およびバルボウリンが特に好ま
しい。
本発明は、さらに、先端切断された形態、および／あ
るいは、改変された形態の天然のペプチドである、およ
び／あるいは、１つ、あるいはそれ以上のペプチド結合
が、−CH2NH−あるいは−CH2CH2−のような他の結合に
置換された、上述のアミノ酸配列のペプチドを含む。
好ましい観点では、本発明は、本発明の方法で同定さ
れ得る、活性な蛇毒から調製され得る、フィブリノーゲ
ン（Fg）および／あるいはフォン・ウィルブランド因子
（vWF）のGP II b−III aへの結合を特異的に阻害する
と示された、単離された形態のPAI、およびそれらの先
端切断された形態および／あるいは改変された形態に関
する。
さらに他の好ましい観点では、本発明は、接着性タン
パク質レセプターへの結合に対応する配列が配列KGDを
含む、単離された形態の蛇毒のPAIに関する。
他の主要な観点では、本発明は、ビトロネクチンレセ
プターへのビトロネクチンの結合、あるいはフィブロネ
クチンレセプターへのフィブロネクチンの結合の阻害効
力より実質的に高い効力で、GP II b−III aへのFgある
いはvWFの結合を阻害し得る、血小板凝集阻害剤である
ペプチドのグループ、あるいはペプチド関連化合物全般
を目指す。これらのペプチドは、先行技術のPAIタンパ
ク質に見られるRGDX結合配列の部位に、結合配列Ｋ＊GD
Xを有することで特徴付けられる。Ｋ＊は、置換され
た、あるいは置換されていない、構造式R1 2N（CH2）4CH
NHCO−のリシン残基である。ここで、各R1は、各々、
Ｈ、あるいは、隣接した窒素の塩基性を破壊しないよう
に十分に電子を供与する置換基であり、１つ、あるいは
２つのメチレン残基が、下記のように、任意に０あるい
はＳで置換され得る。S.milarus barbouriから単離され
るバルボウリンPAIは、この一連のペプチドの１つの実
例である。しかし、このペプチドの短い方の形態もま
た、およびペプチド鎖のどこかに１−10個のアミノ酸配
列の改変をさらに含んだ、および／あるいは、ペプチド
結合が他の結合に置換されている、アナログ配列もま
た、使用され得る。他の実例となる実施態様には、天然
のRGDX配列がＫ＊GDXに置換される、単離されたPAIペプ
チドが含まれる。バルボウリンの場合のように、これら
の単離されたPAIは天然の形態、あるいは先端切断され
た形態であり得、および／あるいは、１−10個のアミノ
酸配列の置換あるいは欠失を含み得、および／あるい
は、ペプチド結合に置換した非ペプチド結合を有し得
る。
本発明の範囲内に入る化合物の他のグループは、RGD
あるいはＫ＊GD配列のグリシン残基がサルコシル残基に
置換されていること以外は、前述の化合物について述べ
た通りである。この化合物のクラスは、関連のRGD、あ
るいはＫ＊GD含有ペプチドの効力および特異性を保持す
る。
他の実例となる実施態様のグループは、特異的PAI活
性を有する次の構造式のペプチド、あるいは改変された
ペプチドである： ここで、Ｋ＊は、上述のように、置換された、あるいは
置換されない、構造式、R1 2N（CH2）4CHNHCO−のリシン
残基であり； 各R1は、各々Ｈ、アルキル（１−6C）、あるいは、どち
らか１つのR1はR2−Ｃ＝NR3であり； R2は、Ｈ、アルキル（１−6C）、あるいは、置換され
た、あるいは置換されていないフェニル基あるいはベン
ジル基で、あるいは、各R4が各々、Ｈあるいはアルキル
（１−6C）であるNR4 2であり；そして R3が、Ｈ、アルキル（１−6C）、フェニルあるいはベン
ジルであり；あるいは R2−Ｃ＝NR3が、ｍが２−３の整数で、各R5が各々、Ｈ
あるいはアルキル（１−6C）である、次のものからなる
群から選択された基であり； そして、該０あるいはＳは他の異なる原子に隣接しない
という条件で、１つ、あるいは２つの（CH2）が０ある
いはＳで置換され得； AA1は、小さい、中性の（極性あるいは非極性）アミノ
酸であり、n1は０−３の整数であり； AA2は、中性で、非極性の大きな（芳香族あるいは芳香
族でない）、あるいは極性の芳香族アミノ酸であり、n2
は０−３の整数であり； AA3は、プロリン残基、あるいは（以下に定義するよう
に）改変されたプロリン残基であり、n3は０−１の整数
であり； AA4は、中性で小さいアミノ酸、あるいはそのＮ−アル
キル化された形態であり、n4は０−３の整数であり； 各X1およびX2は各々、示されている環状化合物を得るた
めにX1およびX2の間に結合を形成し得る残基であり；そ
して 各Y1およびY2は各々、影響のない置換基で有り得るか、
あるいは存在しない； １つ、あるいはそれ以上のペプチド結合は、任意に、−
CH2NH−、−CH2S−、−CH2CH2−、−CH＝CH−（シスお
よびトランス）、−COCH2−、−CH（OH）CH2−、および
−CH2SO−からなる群から選択される結合に置換され
得； ただし、n3が０である場合は、次のいづれかである； １）n2とn4の合計は、少なくとも２でなければならな
い；あるいは ２）Ｋ＊は、Har、あるいはＫ以外のものでなければな
らない；あるいは ３）X1およびX2の少なくとも１つは、cys（Ｃ）、ペニ
シラミン（Pen）、あるいは２−アミノ−3,3−シクロペ
ンタンメチレン−３−メルカプトプロピオン酸（APmp）
以外のものでなければならない；あるいは ４）Y1あるいはY2は、少なくとも１個のアミノ酸残基を
有しなければならない；あるいは ５）１つ、あるいはそれ以上のペプチド結合が前記他の
結合に置換されている。
本発明の他の観点は、これらの、および他の関連ペプ
チドの合成、それらのインビトロでの合成法、これらの
化合物を含む薬学的組成物、および、これらの化合物お
よび組成物を用いて血小板凝集および血栓形成を阻害す
る方法、に関係する組み換え法および物質材料に関係す
る。
図面の簡単な説明 図１は、部分精製された蛇毒による、GP II b−III a
へのフィブリノーゲンの結合の阻害を示す。
図２は、フィブリノーゲン/GP II b−III a、および
ビトロネクチン／ビトロネクチンレセプターアッセイの
両方における、粗製毒をセントリコン−10で限外濾過し
た液による、接着阻害作用を投与量を横軸として示す。
図３は、Eristicophis macmahoniの毒からの粗製PAI
のHPLCのプロフィールを示す。斜線部分は生物活性画分
を含む。。
図４は、図３のPAI画分のHPLCプロフィールを示す。
斜線部分は生物活性画分を含む。
図５は、図４のPAI画分の分析用HPLCのプロフィール
を示す。
図６は、エリスチコピン、バルボウリン、テルゲミニ
ン、セラスチン、ルベリン、ラチェシン、コチアリン、
クロタトロキシン、ホリジン、ルトシン、ビリジン、モ
ロシン、バシシリン、デュリシン、ジャララシン（jara
racin）、セレベリン（cereberin）およびオレガニン、
およびその酵素消化によるフラグメントを、自動化エド
マン分解法により決定し、完全なアミノ酸配列を示す。
図７は、粗製のSistrurus c.tergeminus毒のＧ−50画
分から得たPAIのHPLCのプロフィールを示す。
図８は、図７のPAI画分のHPLCのプロフィールを示
す。
図９は、精製された図８のPAIの、いくつかのレセプ
ターアッセイでの結合阻害における活性を示す。
図10は、粗製のSistrurus m.barbouriの毒のＧ−50の
画分から得た血小板凝集阻害剤のHPLCプロフィールを示
す。斜線部分は生物活性画分を含む。
図11は、図10の活性PAI画分のHPLCプロフィールを示
す。
図12は、多くのPAIのアミノ酸配列とバルボウリンの
それとの比較である。
図13は、Lachesis mutasの毒の粗製PAIのHPLCプロフ
ィールを示す。斜線部分は生物活性画分を含む。
図14は、図13のPAI活性画分のHPLCプロフィールを示
す。斜線部分は生物活性画分を含む。
図15は、図14のLachesis mutasのPAI画分の分析用HPL
Cプロフィールを示す。
図16は、Crotalus viridis viridisの毒の粗製PAIのH
PLCプロフィールを示す。斜線部分は生物活性画分を含
む。
図17は、図16のPAI画分のHPLCプロフィールを示す。
図18は、エキスタチンと比較した、精製された蛇毒ペ
プチドの、フィブリノーゲン/GP II b−III a結合阻害
における投与量に対応する効果を示す。
図19は、エキスタチンと比較した、精製された蛇毒ペ
プチドの、富血小板血漿（PRP）中での、ADP（4uM）に
誘起されたヒトの血小板凝集阻害における投与量に対応
する効果を示す。
図20は、C.c.cerastesの毒のHPLC画分の活性プロフィ
ールを示す。
図21は、図20の活性画分のHPLC分析の結果を示す。
図22は、C.ruber ruberのHPLCでのPAI画分の活性プロ
フィールを示す。
図23は、C.atroxから得た均一なペプチドの分析用Ｃ
−18カラムからの溶出画分の活性プロフィールを示す。
図24は、Bothrops cotiaraから単離された均一なペプ
チドの分析用HPLCプロフィールを示す。
図25は、GP II b−III aへのフィブリノーゲンの結合
阻害、およびビトロネクチンレセプターへのビトロネク
チンの結合阻害に対する、精製されたコチアリンの投与
量に対応した効果を示す。
図26は、GP II b−III aへのフィブリノーゲンの結
合、およびビトロネクチンレセプターへのビトロネクチ
ンの結合に対する、精製された蛇毒ペプチドの効果を示
す。
図27は、GP II b−III aおよびビトロネクチンレセプ
ターに関する、アナログ＃１である［E28L41C64］バル
ボウリン（28−73）の結合活性の結果を示す。
図28は、合成エリスチコピンアナログが、GP II b−I
II aへのフィブリノーゲンの結合を阻害する能力を有す
ること、および、ビトロネクチンレセプターへのビトロ
ネクチンの結合を阻害する能力がないことを示す。
図29は、線状および環状RGDW化合物、および、線状お
よび環状KGDW化合物の、GP II b−III aへのフィブリノ
ーゲンの結合を阻害する能力を示す。
図30は、種々のKGDWアナログが、GP II b−III aへの
フィブリノーゲンの結合を阻害し得る能力、およびビト
ロネクチンレセプターへのビトロネクチンの結合を阻害
し得る能力を示す。
図31は、種々の天然および合成血小板凝集阻害剤が、
ビトロネクチンへのM21メラノーマ細胞の接着を阻害す
る能力を示す。
図32は、RGDSおよび環状RGD化合物が、ビトロネクチ
ンへのM21メラノーマ細胞の接着阻止の能力を有し、そ
して、環状KGDWアナログが、ビトロネクチンへのM21メ
ラノーマ細胞の接着阻止の能力を欠いていることを示
す。
図33は、アナログ番号60であるMpr−（Har）−Ｇ−Ｄ
−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2の、血小板の凝集阻害、およびビト
ロネクチンへの細胞接着における活性を示す。
図34は、アナログ番号19であるMpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ
−Ｐ−Ｃ−NH2の、図33と同様の活性を示す。
図35は、血栓症モデルの開胸犬（フォルツモデル、Fo
lts Model）での周期的血流量低下（CFRs）の発生を示
す。
図36は、10mgの丸薬投与量の、血栓症モデルの開胸犬
（フォルツモデル）で発生したCFRsに対する効果を示
す。
図37は、40mgの丸薬投与量の、血栓症モデルの開胸犬
（フォルツモデル）で発生したCFRsに対する効果を示
す。
図38は、バルボウリン（１−73）のアミノ酸配列をコ
ードする全長DNA配列を示す。
図39は、PhoAリーダー配列に連結された、［Ｍ−1L4
1］バルボウリン（１−73）をコードするDNA配列を示
す。
図40は、細菌で発現されるためにPhoAリーダー配列に
連結された、アナログ＃１をコードするDNA配列を示
す。
図41は、アナログ＃１をコードするDNAを得るためのP
CR反応で使用される、オリゴヌクレオチドを示す。アナ
ログに含まれるアミノ酸は太い活字で示されている。
図42は、アナログ＃１をコードするDNAの反復配列の
連結部配列を示す。
図43は、先端切断されたバルボウリン遺伝子を反復配
列させた、図を示す。
発明を実施するための形態 本発明は、本発明のアッセイ法により活性と同定さ
れ、蛇毒から単離され得る、血小板凝集阻害剤（PA
I）、および、同様の構造を有し、固相ペプチド合成
法、あるいは組み換え法、のようなインビトロの標準
法、あるいはそれらの組み合わせにより、合成される化
合物を提供する。ある種のこれらの阻害剤は、血小板凝
集阻害だけに特異的であり、インテグリンファミリーの
他の結合を阻害しない。他は異なる特異性の範囲を有す
る。以下の項目に、天然の蛇毒PAIの単離;RGDの代わり
にＫ＊GD配列を導入することにより、例えばビトロネク
チン／ビトロネクチンレセプター相互作用を阻害するよ
りも、血小板凝集阻害において、実質的に高い効力を有
する阻害剤の設計；これらのペプチドの合成法；組み換
え技術による生産法；本発明のペプチドに対する抗体;P
AIを含む蛇毒の同定を可能にするアッセイ法；および、
本発明のPAIの投与および有用性を記述する。
PAIという用語は、例えば、Gan,Z.−R.ら、およびHua
ng,T.−F.ら（前出）に記載されているような標準的ア
ッセイで、刺激された血小板の凝集を防ぎ得る因子を意
味する。これらのアッセイでは、洗浄された血小板をフ
ィブリノーゲン、Ca+2,およびテストされる材料と混合
する。血小板は、ADP（あるいは他の既知の刺激剤、あ
るいはそれらの組み合わせ）で刺激され、例えば市販さ
れている凝集反応測定器を用いて、凝集（あるいはその
欠如）を測定する。
本発明のいくつかのPAIは、フィブリノーゲン、およ
び／あるいは、vWFのGP II b−III aへの結合阻害に特
異的であると同定される。特異性とは、程度に関する表
現の一つと理解される。従って、FgあるいはvWFのGP II
b−III aへの結合阻害に特異的なPAIは、この結合を、
FnのFnRへの結合、あるいはVnのVnRへの結合より実質的
に強く阻害する。「実質的に強く」とは、任意のPAI濃
度における阻害％が少なくとも２倍か、あるいは、Fgあ
るいはvWF/GP II b−III a結合の50％阻害を起こすPAI
濃度が、他のリガンド／レセプター結合のそれの少なく
とも２倍少ないことを意味する。
単離された天然PAIおよび精製法 本発明の血小板凝集阻害剤（PAI）には、以下に述べ
るように、「活性」と同定された、すなわち、以下本明
細書に述べる本発明の方法で、PAIを有することが見い
出された、蛇毒からの単離された形態に調製され得る、
低分子量のペプチドが含まれる。
本発明の方法は、ビトロネクチンレセプターおよびフ
ィブロネクチンレセプターのような他のインテグリンへ
の結合とは対照的に、GP II b−III aへの結合を選択的
に阻害する蛇毒中の有効なPAIの存在の、迅速な同定お
よび特徴付けを可能にする。そのような同定、および、
任意の最適な特徴付けによって、PAIは、本明細書に説
明され、当分野に開示されている種々の標準技術を用い
て単離、精製し得る。例えば、分子量に基づく分離（典
型的には、＜10kdの物質の回収）、イオン交換クロマト
グラフィー、および逆相HPLCの組み合わせが使用され得
る。他の技術も使用され得るが、いかなる活性蛇毒のPA
Iにも適用し得る実用的な方法は、以下の通りである： 約10−1000mgの毒を希酢酸に溶解し、セファデックス
Ｇ−50のようなサイズ分離カラムにかけ、同じ溶媒を用
いて溶出した。画分の活性を、本発明のFg/GP II b−II
I a結合アッセイ、標準的血小板凝集アッセイ（PAA）、
あるいはGP II b−III aの接着性タンパク質結合活性に
よるいかなる類似のアッセイを用いてアッセイした。あ
るいは、毒の画分の＜10kd画分は、限外濾過を用いて回
収し得、そして同様にアッセイした。
次に、いづれかの方法で単離された低MW画分を、Wate
rsから購入できるＣ−18 Delta Pak逆相HPLCカラムのよ
うな調製用Ｃ−18 HPLCカラムに、0.1％のトリフルオロ
酢酸（TFA）/8％アセトニトリルで平衡化した後にかけ
た。次に、吸着されたPAIを0.1％TFA中の８％−60％の
アセトニトリルの濃度勾配を用いて溶出する。勾配のス
ロープ、および流速は、日常的手段で最適に調整する。
活性画分は、PAA、あるいは本発明のレセプター結合法
によって測定される。次に、活性画分をプール、濃縮
し、そして分析用HPLCあるいはSDS−PAGEを用いて、均
一性を調べた。さらに、逆相HPLCでの濃度勾配による精
製が、均一なPAIが回収されるまで行われる。
前述の、あるいは他の精製法により得られる本発明の
PAIには、以下のものからなる群から選択される毒のPAI
が、含まれる； Echis colorata,Eristicophis macmahonii;A.hypnal
e,A.acutus,A.piscivorous leucostoma,A.piscivorus c
onanti;Bothrops asper;Bothrops cotiara,B.jararaca,
B.jararacussu,B.lansbergi,B.medusa,B.nasuta,B.neuw
iedi,B.pradoi,B.schlegle;Crotalus atrox,C.basilicu
s,C.cerastes cerastes,C.durissus durissus,C.duriss
us totonatacus,C.horridus horridus,C.molossus molo
ssus,C.ruber ruber,C.viridis cereberus,Crotalus v.
helleri,Crotalus v.lutosus,Crotalus v.oreganus,Cro
talus v.viridis;Lachesis mutas;Sistrurus catenatus
tergeminus,and Sistrurus milarus barbouri. 以下のものから得られる毒から調整される、あるい
は、それらのアミノ酸配列を有する、単離された形態の
PAIが好ましい;Eristicophis macmahonii（エリスチコ
ピン）;Bothrops cotiara（コチアリン）;B.jararacuss
u;Crotalus atrox（クロタトロキシン）;Crotalus basi
licus（バシリシン）;C.cerastes cerastes（セラスチ
ン）;C.durissus totonatacus（デュリシン）;Crotalus
d.durissus（デュリシン）;C.h.horridus（ホリジ
ン）;Crotalus m.molossus（モロシン）;C.ruber ruber
（ルベリン）;Crotalus viridis lutosus（ルトシン）;
C.v.viridis（ビリジン）;Crotalus v.oreganus（オレ
ガニン）;Crotalus v.helleri;Lachesis mutas（ラチェ
シン）;Sistrurus catenatus tergeminus（テルゲミニ
ン）；およびS.milarus barbouri（バルボウリン）。特
に好ましいのは、FgあるいはvWF/GP II b−III a結合を
特異的に阻害するPAI、すなわち、Sistrurus m.barbour
iからのPAIである。
エリスチコピン、コチアリン、クロタトロキシン、セ
ラスチン、デュリシン、ホリジン、ルベリン、ラチェシ
ン、バシリシン、ルトシン、モロシン、オレガニン、ビ
リジン、テルゲミニン、およびバルボウリンが特に好ま
しい。
本発明の精製されたPAIは、標準法を用いて配列決定
され得、従って、標準の固相法（特に短い形態のPAI）
を用いての合成、あるいは組み換えによる生産を可能に
する。例えば、Huangら、J Biol Chem（1987）262:1615
7−16163に記載のように、ペプチドをカルボキシアミド
メチル化、あるいはピリジルエチル化した後、Applied
Biosystems Sequenatorを使用し得、その後、0.1％のTF
Aおよびアセトニトリルを用いて、Ｃ−18 Delta Pakカ
ラムでサンプルを脱塩する。
単離された配列が決定されたPAIをin vitroで合成す
る際に、配列を変更し、活性は失わない改変を行い得
る。一般的に、これらの改変された形態は、１個から10
個、好ましくは１個から４個、のアミノ酸の置換で、自
然の形態と異なる、あるいは先頭切断型形態となる。さ
らに、１つあるいはそれ以上のペプチド結合が、以下に
記述する様な別の結合様式に置き換えられ得る。特に好
ましい置換はRGDの置き換えで、Ｋ＊GDにより以下に記
述するような、GP II b−III a特異性が付与される。
Sistrurus m.barbouriのPAIを、均一になるまで精製
し、そして配列決定し、そして「バルボウリン」と命名
した。以前に同定されていたGP II b−III aに対する接
着タンパク質およびGP II b−III aを阻害する蛇毒由来
のペプチドとは異なり、バルボウリンは、当業者に既知
の接着タンパク質に標準的なArg−Gly−Asp配列を含ん
でいない。明白なバルボウリンの結合配列は、Arg−Gly
−Asp−（Trp）である。このペプチドの明白な結合領域
にあるKGD配列の存在は、RGDX配列に基づく小さな合成
ペプチドのArgをLysに置換すると、これらのペプチドの
インテグリンレセプターへの結合能力が著しく減少する
という観察（Pierschbacherらの、Proc Natl Acad Sci
（USA）（1984）81:5985−5988;Williamsらの、Thromb
Res（1987）46:457−471）;Huangらの、J.Biol Chem（1
987）262:16157−16163.から、特に驚くべきことであ
る。例えば、ビトロネクチンがビトロネクチンレセプタ
ーに結合するのを阻止するのに対して、FgおよびvWFがG
P II b−III aに結合するのをバルボウリンペプチドが
阻止する特異性に、この置換が部分的に対応していると
考えられている。
Ｋ＊GDX含有ペプチド 本発明の方法により単離された「バルボウリン」ペプ
チドは、結合配列KGDXを有することが示され、前例のPA
Iに見られるRGDXと対照的である。このPAI配列中のKGDX
の存在は、GP II b−III aに対する選択的な親和性に関
連する様に見受けられ、フィブロネクチンとフィブロネ
クチンレセプターとの場合とは、逆である。配列中のア
ルギニン残基をリシン残基に置換した効果は、以下にさ
らす記述する様に、側鎖の長さの増大および窒素の塩基
性が保持されていること、に関連している様である。驚
くべきことに、増大した活性および特異性に寄与してい
るのは、リシン残基それ自身ではなく、むしろ、アルギ
ニンが置換された側鎖により与えられた空間のようであ
る。従って、結合配列にＫ＊GDXを含有する本発明のペ
プチドは、ビトロネクチンがビトロネクチンレセプター
に対して結合する能力、および、フィブロネクチンがフ
ィブロネクチンレセプターに対して結合する能力、に比
べて、FgあるいはvWFがGP II b−III aに結合するのを
阻止することに対し、実質的により高い能力を持ってい
る。上述の用語、好適な結合を阻止するための「実質的
により高い」能力は、一定の濃度のインヒビターで阻害
のパーセンテージが少なくとも二倍である、あるいは、
FgあるいはvWFがGP II b−III aに結合することに対
し、50％の阻止を引き起こすPAIの濃度が、他のリガン
ドが他のインテグリンに対して結合するのを阻止するよ
りも、少なくとも二倍以上少ない、ことを意味する。
本明細書で用いるＫ＊は、置換されていない、あるい
は、ε−アミノ基上の水素が置換されている、リシン残
基を指す。この置換基は、それらが結合している窒素の
塩基性を保持するために、充分なだけ電子供与性でなけ
ればならない。従って、Ｋ＊は、R1 2N（CH2）4CHNHCO−
の構造のリシン残基であると定義でき、 ここで、各R1は、各々、Ｈ、アルキル（１−６）、あ
るいは、高々一つのR1はR2−Ｃ＝NR3であり、 ここで、R2は、Ｈ、アルキル（１−6C）、あるいは、
置換したあるいは置換していない、フェニルあるいはベ
ンジル基、あるいは、各R4が、各々、Ｈ、あるいはアル
キル（１−6C）である、NR4 2であり、そして、 R3が、Ｈ、アルキル（１−6C）、フェニルあるいはベ
ンジル、あるいは、 R2−Ｃ＝NR3が、以下から構成される群から選択され
る基であり： ここで、ｍは、２から３の整数、そして、各R5は、各
々、Ｈ、あるいはアルキル（１−6C）、であり； そして、ここで、１つあるいは２つの（CH2）を、０あ
るいはＳは他のヘテロ原子に隣接しないという条件で、
０あるいはＳに置き換えることができる。
「アルキル」は、従来定義されている通りで、メチ
ル、エチル、イソプロピル、Ｎ−ヘキシル、２−メチル
ブチル、シクロヘキシル、等の、指定された数の炭素数
の、直鎖あるいは分岐鎖のあるいは環状の炭化水素基で
ある。
R2で表される、フェニルおよびベンジル基は、置換さ
れていないか、あるいは、干渉しない物質で置換され
た、基であり得る。好ましい置換パターンでは、唯一つ
の置換基が、好適には４−位で、芳香核に結合してい
る。好ましい置換基は、特にエチルあるいはメチルの、
アルキル、あるいはフェニル、の様な電子供与性基であ
る。
Ｋ＊の好適な実施態様には、リシン、ホモアルギニ
ン、ホルミルホモアルギニン、オルニチン、アセトイミ
ジルリシン、NGNGエチレン−ホモアルギニン、およびフ
ェニルイミジルリシン、の残基が含まれる。例えば、フ
ェニルイミジルリシン残基は以下の構造式を有してい
る： Ph−Ｃ（＝NH）−NH（CH2）4CH（NH−）CO− 結合の選択的阻止の基本的特徴は、RGDXのＲをＫ＊に
置換する点にあり、本発明の、一つのクラスのペプチド
あるいはペプチド関連化合物は、本来RGDXを結合配列に
含んだ、自然に存在する血漿板凝集阻害剤で、この配列
中のＲをＫ＊に置換することにより改変された形態であ
る。本発明に含まれるのは、この置換を有する変性して
いないペプチド、および、接着タンパク質がGP II b−I
II aに結合するのを選択的に阻止するのに、充分な長さ
のその断片、および、このププチドのこの活性を損なわ
ない位置に、無関係な置換基を有する、断片あるいは全
長のペプチドである。大体、この断片は、立体構造が、
例えば、環状化により、制御できるならば、少なくとも
７個のアミノ酸のペプチド鎖の長さ、そして、その様な
立体的制御ができないならばより長い長さ、に対応する
残基を含む。一般的に、必要なＫ＊GDX配列は別にし
て、１から10個、好適には１から４個、そしてさらに好
適には１から３個、のアミノ酸の置換を、ペプチドのＫ
＊GDXでない領域に有し得る。
加えて、RGDXあるいはＫ＊GDXのＧは、サルコシン残
基で置換し得る。
さらに、１つあるいはそれ以上のペプチド結合を任意
に、還元あるいは離脱により得られる様な、別の結合で
置き換え得る。従って、１つあるいはそれ以上の−CONH
−ペプチド結合をこの技術分野で公知の方法により、例
えば、−CH2NH−、−CH2S−、CH2CH2−、−CH＝CH−
（シスおよびトランス）、−COCH2−、CH（OH）CH2−お
よび−CH2SO−の様な、他のタイプの結合に置き換え得
る。以下の文献は、これらの別の結合部分を含んだペプ
チドアナログの調製を記載している:Spatola,A.F.の、V
ega Data（March 1983）,Vol.1,Issue 3,“Peptide Bac
kbone Modifications"（一般的総説）;B.Weinstein編
の、“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Pe
ptides and Proteins,"Marcel Dekker,New York,（198
3）中のSpatola,A.F.の記載p.267（一般的総説）;Morle
y,J.S.の、Trends Pharm Sci（1980）pp.463−468（一
般的総説）;Hudson,D.らの、Int J Pept Prot Res（197
9）14:177−185（−CH2NH−、CH2CH2−）;Spatola,A.
F.,らの、Life Sci（1986）38:1243−1249（−CH2−
Ｓ）;Hann,M.M.の、J Chem Soc Perkin Trans I（198
2）307−314（−CH−CH−、シスおよびトランス）;Almq
uist,R.G.らの、J Med Chem（1980）23:1392−1398（−
COCH2−）;Jennings−White,C.らの、Tetrahedron Lett
（1982）23:2533−（−COCH2−）;Szelke,M.らの、欧州
特許出願第EP 45665号（1982）CA:97:39405（1982）
（−CH（OH）CH2−）;Holladay,M.W.らの、Tetrahedron
Lett（1983）24:4401−4404（−Ｃ（OH）CH2−）；お
よび、Hruby,V.J.の、Life Sci（1982）31:189−199
（−CH2−Ｓ−）。特に好適なのは、−CH2NH−である。
自然に存在する蛇毒PAIの、断片、および／あるい
は、改変された形態の例には、次の配列の［E28,L41,C
64］バルボウリン（28−73） および、次の配列の［K29］エリスチコピン（４−51） が含まれる。
この表記法では、断片の大きさは名前の後の括弧の中
に断片中に含まれるアミノ酸の数で表記され、そして、
大括弧の中に前置されている文字及び数字は、自然の全
長ペプチド中の指示された位置で指示されたアミノ酸に
置換されていることを示している。従って、上記のバル
ボウリン断片の場合、この断片の長さは自然配列の残基
28から73の範囲を包括し、そして、番号付けられた自然
配列の28、41、および64の位置のアミノ酸が、各々、Gl
u（Ｅ）、Leu（Ｌ）、およびCys（Ｃ）に置き換えられ
ている。
付加的な例として、トリグラミン、エレガンチン、ア
ルボラブリン、クロタトロキシン、フラボビリジン、エ
キスタチン、ビチスタチン、ビリジン、モロシン、ルト
シン、バシリシン、アプラギン（applagin）、ハリシン
（halysin）、ホリジン、テルゲミニン、ラチェシン、
コチアリン、セレベリン、ジャララシン（jararaci
n）、キストリン（kistrin）、エリスチコピン、ビタン
−ａ（bitan−ａ）、およびルベリン／オレガニン、に
見られるRGD配列のアルギニンは、Ｋ＊で置換し得、GP
II b−III aに対して選択的な親和性を有する、特異的
に活性なPAIを与える。さらに、短縮された形態のこれ
らのペプチドは、少なくとも20、好適には少なくとも3
0、そしてより好適には少なくとも40、のアミノ酸を含
み、自然のペプチド、あるいは、その改変された形態、
から調製し得る。さらにあるいは代わりに、RGD/K＊GD
配列と無関係の、１から10個の、好適には１から４個
の、アミノ酸を、好ましくは保存性のアミノ酸置換体
で、置換あるいは改変し得る。保存性のアミノ酸という
用語で、以下に詳細に記述する様に、例えば、酸性のア
ミノ酸残基を酸性のアミノ酸残基で、中性を中性で、塩
基性を塩基性で、等を意味している。
さらに、加えて、実施態様の群には、活性を保持した
まま、RGDあるいはＫ＊GDのグリシン残基をサルコシン
残基で置き換えることが含まれる。かくして、他の方法
で上述した様に、単離および／あるいは改変された活性
PAIを、この置換でさらに改変し得る。
RGDをＫ＊GDに置き換えた、断片および／あるいは蛇
毒からの改変PAIsは、本発明のFg/vWF/GP II b−III a
結合−特異的化合物に含めることができる一方で、本発
明のさらなる実施態様では、特異的に活性なペプチド
は、Ｋ＊GD配列自体の適切な延長が寄与している。この
ことについては、本発明の好適なグループのペプチドあ
るいはペプチド関連化合物は、以下の一般式の環状ペプ
チドである： ここで、Ｋ＊は、上述の様に定義された、置換されたあ
るいは置換されていない、リシン残基であり； AA1は、小型で中性（極性あるいは非極性）のアミノ酸
で、そして、n1は０から３の整数であり； AA2は、中性で非極性大型（芳香族あるいは非芳香族）
のアミノ酸であり、そして、n2は０から３の整数であ
り； AA3は、プロリン残基あるいは改変されたプロリン残基
（以下に定義される様な）であり、そして、n3は０から
１の整数であり； AA4は、中性で小型のアミノ酸あるいはそのＮ−アルキ
ル化型であり、そして、n4は０から３の整数であり； 各X1およびX2は、式に示した様に、各々、X1とX2との間
で環状化合物が得られる結合を形成し得る残基で；そし
て、 各Y1およびY2は、各々、干渉しない置換基であるか、
あるいは存在せず； ここで、１つあるいはそれより多いペプチド結合が、
−CH2NH−、−CH2S−、CH2CH2−、−CH＝CH−（シスお
よびトランス）、−COCH2−、−CH（OH）CH2−、および
−CH2SO−からなる群から選択される結合に、任意に置
き換えられ得る。
ただし、もしもn3が０の場合には、次の内のいづれか
を満足する； １）n2とn4との和が、少なくとも２でなければならな
い；あるいは、 ２）Ｋ＊は、HarあるいはＫ以外のものでなければなら
ない；あるいは、 ３）少なくともX1およびX2の一方は、cys（Ｃ）、ペニ
シラミン（Pen）、あるいは２−アミノ−3,3−シクロペ
ンタンメチレン−３−メルカプトプロピオン酸（APmp）
以外のものでなければならない；あるいは、 ４）Y1あるいはY2は、少なくとも１つのアミノ酸残基を
含有しなければならない；あるいは、 ５）１つあるいはそれ以上のペプチド結合が、前記別の
結合で置き換えられている； Y1およびY2は、０から25個のアミノ酸の延長鎖であり
得、誘導体の形態であり得る。Ｎ−末端延長鎖Y1は、例
えば、アセチル化あるいはアシル化し得;C−末端延長鎖
Y2は、NH2、あるいは、式Ｒ−NH2あるいはR2NHの、一級
あるいは二級アミンでアミド化し得、ここでＲは各々、
メチル、ｎ−ブチル、あるいはｔ−ブチルの様な、１−
4Cの低級アルキル、である。Y1はまた、（Ｈ）あるいは
アシルでもあり得;Y2は、（OH）、NH2、あるいは上述の
アミンであり得る。式（１）の化合物が単環式のペプチ
ドの場合、Y1およびY2は存在しない。
X1およびX2は典型的には、例えばそして最も好ましく
は、ジスルフィド環を形成し得るシステイン残基の様
な、環状化し得るアミノ酸残基である。しかし、ジスル
フィドあるいは他の結合を形成し得る他の残基もまた使
用し得る−−例えば、Pierschbacherらが記載した（前
出）Pen（ペニシラミン）残基、あるいは、Mpr（メルカ
プトプロピオニル）あるいはMvl（メルカプトバレリ
ル）残基である。環状化用の他の共有結合の候補には、
リシン残基の側鎖アミノ基と、グルタミン残基の側鎖カ
ルボキシル基とで、形成されるアミドの様なペプチド結
合、および、スレオニン残基の側鎖アルコールと、アス
パラギン酸残基の側鎖カルボキシル基とで、形成され得
る様なエステル結合が含まれる。鎖の残りの部分とペプ
チド結合（あるいは上述の改変したペプチド結合）を形
成し得る、および、環状化に有効な共有結合をし得る、
ならばいかなる適合残基でも使用し得る。例えば、Ｎ−
末端のNH2とＣ−末端のCOOHとでペプチド結合を直接形
成した、単環式のペプチドがこの範中に含まれる。
上述の様に、一つあるいはそれ以上の指示されたペプ
チド結合を、−CH2NH−、−CH2S−、CH2CH2−、−CH＝C
H−（シスおよびトランス）、−COCH2−、−CH（OH）CH
2−、および−CH2SO−、の様な別の結合で置き換え得
る。
上述のAA1からAA4のアミノ酸の指定の項では、アミノ
酸残基を一般的に４つの大きなサブクラスに細分類し得
る、分類方法に基づいて記述を行った。この分類もま
た、以下にダイアグラム的に示す。
酸性：この残基は、生理学的pHではＨイオンを失うた
めに陰性の荷電を有し、そのためこの残基は、生理学的
pHの水性溶媒中にペプチドが存在しているときに、水性
溶媒に引きつけられ、この残基が含まれているペプチド
の立体構造上の表面の位置へ行く。
塩基性：この残基は、生理学的pHではＨイオンと会合
するために陽性の荷電を有し、そのためこの残基は、生
理学的pHの水性溶媒中にペプチドが存在しているとき
に、水性溶媒に引きつけられ、この残基が含まれている
ペプチドの立体構造上の表面の位置へ行く。
中性／非極性：この残基は、生理学的pHでは荷電して
おらず、そのためこの残基は、水性溶媒中にペプチドが
存在しているときに、水性溶媒に反発され、この残基が
含まれているペプチドの立体構造の内部の位置へ行く。
本明細書ではこれらの残基を「疎水性」とも呼ぶ。
中性／極性：この残基は、生理学的pHでは荷電してお
らず、しかしこの残基は、水性溶媒中にペプチドが存在
しているときに、水性溶媒に引きつけられ、該残基が含
まれているペプチドの立体構造の外側の位置へ行く。
もちろん、各残基分子を統計的に集めれば、ある分子
は荷電しており、ある分子は荷電していない、そして水
性の溶媒からの、大きなあるいは少ない、親和力あるい
は反発力が働く、ことは理解されるべきである。「荷電
した」という用語の定義を実際と適合させると、生理学
的pHにおいて各分子の顕著なパーセンテージ（少なくと
も約25％）が荷電している。極性あるいは非極性である
と分類される、親和力あるいは反発力の度合は便宜的で
あり、そしてそのために、本発明で特に考慮されるアミ
ノ酸が、ある所へあるいは別の所へ特定的に分類され得
る。明確に指定されていない殆どのアミノ酸は、知られ
ている挙動によって分類し得る。
アミノ酸残基はさらに、環式あるいは非環式、芳香族
あるいは非芳香族、および側鎖残基の置換基に関する説
明的分類、小型あるいは大型、に分類し得る。残基は、
カルボキシル炭素である場合を含む、全部で４個のある
いはそれより少ない炭素原子を含むと、小型と考える。
小型残基は、もちろん、非芳香族である。
上述の様式に従った自然のタンパク質のアミノ酸の細
分類は、以下の様になる（以下のダイアグラムも参照） 酸性：アスパラギン酸、およびグルタミン酸； 塩基性／非環式：アルギニン、リシン； 塩基性／環式：ヒスチジン； 中性／極性／小型：グリシン、セリン、およびシステイ
ン； 中性／極性／大型／非芳香族：スレオニン、アスパラギ
ン、グルタミン； 中性／極性／大型／芳香族：チロシン； 中性／非極性／小型：アラニン； 中性／非極性／大型／非芳香族：バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン； 中性／非極性／大型／芳香族：フェニルアラニン、およ
びトリプトファン。
遺伝子にコードされたアミノ酸プロリンは、技術的に
中性／非極性／大型／環式そして非芳香族に分類できる
が、ペプチド鎖の二次構造に対する公知の効果による特
別の例であり、そのために、この定義された群には含め
ず、別に分類する。AA3は、プロリン残基、あるいは
「改変されたプロリン残基」を指定する。知られている
様に、プロリンはカルボキシル基を２−位に有する窒素
含有ヘテロ５員環構造である。改変されたプロリン残基
は、窒素のα位にカルボキシル基を有する窒素含有ヘテ
ロ５員環、あるいは６員環の化合物であり；さらに付加
的なヘテロ環式原子が環中に含まれ得る。従って、改変
されたプロリン残基には、ピペコリン酸（２−カルボキ
シピペリジン、略してPip）残基およびチアゾリジン（T
hz）残基が含まれる。従って、プロリンあるいは改変さ
れたプロリン残基は、次の式で表され、 ここで、１つあるいは２つのメチレン基が、NR、Ｓ、あ
るいはＯで置換され得、そして、どの環上の窒素も、ア
ルキルの様な干渉しない置換基で任意に置換され得る。
遺伝子はコードしていないが、よく見かけるある種の
アミノ酸には、例えば以下のものが含まれる、β−アラ
ニン（β−ala）、あるいは３−アミノプロピオン酸、
４−アミノ酪酸、等の他のω−アミノ酸、α−アミノイ
ソ酪酸（Aib）、サルコシン（Sar）、オルニチン（Or
n）、シトルリン（Cit）、ホモアルギニン（Har）、ｔ
−ブチルアラニン（ｔ−BuA）、ｔ−ブチルグリシン
（ｔ−BuG）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−MeIle）、
フェニルグリシン（Phg）、およびシクロヘキシルアラ
ニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、システイン酸（Cy
a）；ピペコリン酸（Pip）、チアゾリジン（Thz）、２
−ナフチルアラニン（２−Nal）、およびメチオニンス
ルフォキサイド（MSO）。これらはすべて都合よく特定
の分類に含み得る。
上述の定義に従い、 Sarおよびβ−alaは、中性／非極性／小型； ｔ−BuA、ｔ−BuG、Ｎ−MeIle、Nle、およびChaは、
中性／非極性／大型／非芳香族； HarおよびOrnは、塩基性／非環式； Cyaは、酸性； Cit、アセチルLys、およびMSOは、中性／極性／大型
／非芳香族； ２−NalおよびPhgは、中性／非極性／大型／芳香族；
そして Pip、およびThzは、改変されたプロリン残基；であ
る。
以上のことを、以下にダイアグラム的に示した： 種々のω−アミノ酸が、大きさにより、中性／非極性
／小型（β−ala、すなわち、３−アミノプロピオニッ
ク、４−アミノブチリック）、あるいは、大型（その他
のすべて）に分類される。
遺伝子にコードされたアミノ酸の他の置換体も、本発
明の主旨の範囲内でペプチド化合物に含め得、この基本
的構成に分類され得る。
本発明の選択された特定の実施態様を表す構造式にお
いて、アミノ−末端残基およびカルボキシ−末端残基
は、しばしば特定的に示してはいないが、特に指定しな
い限り、生理学的pH値で予測される形態であることを理
解されたい。従って、生理学的pHでは、Ｎ−末端はH+ 2
であり、Ｃ−末端は−O-である、ことは特定の実施例あ
るいは一般式で必ずしも特定もせずまた示してもいない
が、理解願いたい。もちろん、本発明の化合物には、非
生理学的pH値で形成されたものを含む、塩基添加塩およ
び酸添加塩も含まれる。ことわりがない限り、これらの
塩基はＬ−型である；一般式では、指定された残基は、
Ｌ−型あるいはＤ−型のいづれかであり得る。一般に、
本発明のペプチドは、０、１あるいは２個の、好適には
０から１個の、最も好適には０個の、Ｄ−型残基を含
む。示されたペプチドでは、コードされた各残基は、以
下の慣例的なリストに従い、アミノ酸の慣用名に対応す
る一文字記号で適切に示されている：アミノ酸 一文字の記号 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リシン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ スレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ ピログルタミン酸 Ｚ 遺伝子によってコードされていないアミノ酸は、上述
に示した略号で表す。
本明細書に示す特異的ペプチドでは上付きのダガー印
（†）で示されない限り、光学異性体を有するいかなる
アミノ酸残基でもＬ型である。本発明のペプチドの残基
は通常、天然のＬ型光学異性体であるが、１つあるいは
２つの、好ましくは１つの、アミノ酸はＤ型光学異性体
に置換され得る。
さらに、カルボキシ末端あるいはアミノ末端の官能基
を含む、遊離の官能基は、アミド化、アシル化、あるい
は他の置換によって改変され得、それにより例えば、そ
れらの活性に影響することなく化合物の溶解性を変え得
る。
本発明のアミド化されたペプチドの生成において、ア
ナログ化合物は、例えばBoc−AAx−pMBHA−樹脂あるい
はBoc−AAx−BHA−樹脂を用いて、直接合成され得る。
ここでAAxは、以下にさらに詳細に述べる、選択された
所望のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸である。さ
らに、本発明のペプチドは、当分野で周知の手段、ある
いは標準的液相ペプチド合成法、によりペプチドを合成
した後、化学的に、あるいは酵素的にアミド化される。
本発明の新規のペプチドのいくつかの実施態様が推奨
される。Ｋ＊（G/Sar）Ｄ配列のG/Sarは、好ましくはＧ
である。AA1およびAA4は、好ましくはGly、Ala、あるい
はSerであり;n1は好ましくは０−２であり、n4は好まし
くは１−２である。好ましいAA2は、中性／非極性／芳
香族アミノ酸であり、特にトリプトファンおよびフェニ
ルアラニン、とりわけトリプトファンであり、n2は好ま
しくは１である。X1およびX2は好ましくはCys、Mpr、あ
るいはPen（ペニシラミン）残基である。Y1は、好まし
くは、Ｈ、アセチル、あるいはGlyであり;Y2は好ましく
は、−NH2、あるいは−Ａ−NH2である。さらに、Ｃ末端
がアミド化されたY2の形態が一般に好ましい。
従って、本発明のPAIのアナログの好ましい実施態様
には、次の構造式のペプチドが含まれる。これらの全て
は、ジスルフィド橋の形成によって環状の形態を提供し
得るが、これらの結合は特に示されていない；他の環状
の形態は「シクロ」で示される。
本発明のペプチドの化学合成 本発明の範囲の化合物は、例えば、固相ペプチド合成
のような当分野に公知の方法により、化学的に合成され
得る。この合成は、αアミノ基が保護されたアミノ酸を
用いて、ペプチドのカルボキシ末端から開始する。フル
オロエチルメチルオキシカルボニル（Fmoc）のような他
の保護基が適していても、ｔ−ブチルオキシカルボニル
（Boc）保護基が全てのアミノ酸に用いられ得る。例え
ば、Boc−Gly−OH、Boc−Ala−OH、Boc−His（Tos）−O
H（すなわち、選択されたカルボキシ末端のアミノ酸）
が、クロロメチル化されたポリスチレン樹脂固定相、ｐ
−メチルベエンズヒドリルアミン（pMBHA）樹脂あるい
はPAM樹脂にエステル化され得る。ポリスチレン樹脂固
定相は、交架橋剤としての約0.5から２％のジビニルベ
ンゼンとのスチレンのコポリマーが好ましく、これはあ
る種の有機溶媒には完全に不溶性であるポリスチレンポ
リマーを生じる。Stewartら、Solid−Phase Peptide Sy
nthesis（1969）W.H.Freeman Co.,San Franciscoおよび
Merrifield,J Am Chem Soc（1963）85:2149−2154を参
照。これらのそして他のペプチド合成の方法は、さら
に、米国特許No.3,862,925、No.3,842,067、No.3,972,8
59およびNo.4,105,602に示されている。
合成は、例えばApplied BioSystems 430Aあるいは431
Aペプチオド合成機（Foster City,California）を用い
て生産者が示した指示マニュアルに従って、手技合成法
あるいは自動合成法が使用し得る。樹脂からのペプチド
の切り離しは、Lu,G.S.ら、Int J Peptide ＆ Protein
Res（1987）29:545−557に記載されているような「ロー
・ハイ」HF脱保護のプロトコールを用いて行い得る。ヘ
ビ毒PAIのアナログの再構成は、エキスタチンの固相合
成が記載されている、Garsky,V.ら、Proc Natl Acad Sc
i USA（1989）86:4022−4026の方法を用いて行い得る。
本発明のジスルフィド結合のない環状ペプチドは、固
相合成と、米国特許No.4,612,366（発明者Nutt）に概説
されているような一般的な方法を用いての溶液中での環
状構造の形成とを組み合わせて、都合よく調製され得
る。そして、標準的なMerrifield樹脂上で調製された直
鎖状のペプチドを、ヒドラジンを用いて樹脂から切り離
し、その後、対応するアジドの環状化によって、環状ペ
プチドを形成する。
本明細書の開示に従って本発明のアナログ化合物の合
成の過程の間に構築される中間生成物は、それ自身新規
であって有用な化合物あり、従って、本発明の範囲に含
まれることは、ペプチド合成の分野の技術者により容易
に評価される。
組換え体の製造 一方、本発明の選択された化合物は、公知の方法に従
って調製された組換えDNA構築物の発現により製造され
得る。このような製造には、このような化合物の大規模
な量あるいは他の実施態様の提供が望み得る。ペプチド
配列が、比較的に短いので組換え製造は容易であるが、
組換え法による製造は、特に、少なくとも８個のアミノ
酸残基のペプチド合成には、標準的な固相ペプチド合成
によるよりも好ましい。
PAIをコードするDNA配列は、好ましくは、商業的に入
手可能な核酸合成法を用いて調製される。PAIの製造の
ための発現系を組換え宿主で構築する方法はまた、当分
野では一般的に知られている。
発現は、原核宿主あるいは真核宿主において行われ
る。原核生物は、E.coliの種々の株が最も頻繁に用いら
れる。しかし、Bacillus subtilisのようなバチルス、P
seudomomasの様々の種類、または他の菌株などの他の微
生物の株もさらに使用され得る。そのような原核系で
は、宿主に適合した種に由来する複製部位および制御配
列を含有するプラスミドベクターが用いられる。例え
ば、E.coli用の作業用ベクターは、pBR322およびその誘
導体である。通常用いられる原核生物の制御配列は、転
写開始プロモーター、必要に応じてオペレーター、およ
びリボゾーム結合部位の配列が含有されていて、βラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）
プロモーター系、トリプトファン（trp）プロモーター
系、およびλ誘導PLプロモーターのような通常用いられ
るプローモーターと、Ｎ−遺伝子リボゾーム結合部位と
が含有されている。しかし、原核生物に適合する、入手
可能なあらゆるプロモーター系が使用され得る。
真核宿主に有用な発現系には、適切な真核遺伝子由来
のプローモーターが含まれる。酵母に有用なプローモー
ターのクラスには、３−ホスホグリセレートキナーゼの
ような糖分解酵素合成用のプロモーターが含まれる。他
の酵母用のプロモーターには、YEp13から得たエノラー
ゼ遺伝子あるいはLeu2遺伝子からのプルモーターが含ま
れる。
適当な哺乳類のプロモーターには、SV40由来の初期お
よび後期プロモーター、あるいはポリオーマ、アデノウ
イルスII、ウシパピローマウイルスあるいはトリサルコ
ーマウイルス由来のプロモーターのような他のウイルス
プロモーターが含まれる。適当なウイルスおよび哺乳類
のエンハンサーは、上記記載されている。植物細胞が発
現系として用いられる場合には、ノパリン合成プロモー
ターなどが適している。
発現系は、公知の制限酵素法およびライゲーション法
により構築され、そして適当な宿主に形質転換される。
形質転換は、このような細胞に適した標準的な方法に
より行われる。発現系を含んだ細胞を、PAIの生産に適
した条件下に培養し、次に、PAIを回収して精製する。
抗 体 本発明の精製PAIの有用性はさらに、活性ペプチドの
形態のPAIと特異的に免疫反応する抗体の生産にある。
ヘビ毒から単離した、あるいは合成した精製PAIを含
有する組成物は、PAIペプチドと免疫反応する抗体の生
産を促進するのに用いられ得る。種々の脊椎動物、例え
ば、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジおよびニワトリ
に、PAIを投与することを包含する標準的な免疫化のプ
ロトコールは、精製ペプチドと免疫反応する抗血清を生
じる。PAIは、免疫原性を促進するように、適当な血清
アルブミンあるいはキーホールリンペットヘモシアニン
などの適切な抗原性的に中性のキャリアーに都合よく結
合され得る。さらに、結合の代わりに、フリーのペプチ
ドは、メチル化したBSAととに注入され得る。さらに、
免疫された哺乳類の抗体を分泌する細胞は、PAIとの反
応性をスクリーニングし得るモノクローナル抗体を生じ
るように固定し得る。
得られたポリクローナルあるいはモノクローナル抗体
は、生物学的試料中の対応するPAIのレベルを、標準的
な免疫アッセイ法によってアッセイするのに有用であ
る。
本発明のアッセイ 既知の特異性を有する活性なPAIを含有する、ヘビ毒
の開始物質の同定は、本発明のアッセイによって可能に
なる。このアッセイは、GP II b−III a複合体へのフィ
ブリノーゲンの結合をインビトロで阻害する化合物が、
さらにインビボで、トロンビンあるいはヒト血小板のAD
P誘導凝集およびインビボでの血小板血栓の形成を阻害
し得るという観察に基づいている。この観察は、テスト
物質がフィブリノーゲン−GP II b−III a相互作用を途
絶する能力を評価することによって、強力なPAIを得る
ための基礎を提供する。
アッセイでは、例えば、本明細書に引例として掲載さ
れている、Fitzgerald,L.A.ら、Anal Biochem（1985）1
51:169−177に記載されているように、精製された形態
で調製されたGP II b−III aを、ビーズ、テストチュー
ブ、あるいはマイクロタイタープレートなどの固体支持
体上にコートする。次に、コートされた支持体をフィブ
リノーゲンとテスト物質とに接触させて、フィブリノー
ゲンが固定されたGP II b−III aに最大限結合するのに
十分な時間インキュベートする。フィブリノーゲンは、
典型的には約５−50nMの濃度で供給し、所望であれば、
テスト物質は連続希釈して添加し得る。典型的なインキ
ュベーションは、35℃、２−４時間であり、時間と温度
とは相互依存的である。
インキュベーション後、フィブリノーゲンとテスト物
質を含有する溶液を除去し、フィブリノーゲンのGP II
b−III aへの結合を定量することによってフィブリノー
ゲンの結合レベルを測定する。任意の適当な検出法が用
い得るが、放射活性標識、蛍光標識、あるいはビオチン
化標識などを用いた標識フィブリノーゲンが都合よく使
用し得る。このような方法は、よく知られていて、本明
細書で詳しく述べる必要はない。
結果の評価は、通常はテスト基質が含まれていないも
の以外のテストサンプルと同一であるコントロールのサ
ンプルを用いる、この場合、阻害の割合（％）は、基準
を示すコントロール中のFg結合の量を用いて、下記の式
により計算し得る。
IC50のような、阻害効率の他の測定もさらに使用し得
る。
本発明のアッセイ系には、さらに、上記と同じ結合阻
害アッセイによって、Fgのかわりに他の接着タンパク
質、およびGP II b−III aにかわりに他のレセプターを
用いてのPAIの特異性の特徴づけが含まれる。特に、ビ
トロネクチンのビトロネクチンレセプターへの結合、フ
ィブロネクチンのフィブロネクチンレセプターへの結
合、フィブロネクチンのGP II b−III aへの結合、およ
びフィブリノーゲンおよび／またはvWFのGP II B−III
aへの結合の阻害が評価され得る。これらのアッセイ用
の接着タンパク質およびレセプターは、当分野では市販
されている。
他のアッセイ 本発明のプレートアッセイに加えて、血小板凝集阻害
活性および関連の活性用の他のアッセイもまた、上記の
ように市販されている。一般に用いられるアッセイのリ
ストは下記の通りである。
1.前の段落に記載されている特異的なレセプターを用い
るプレートアッセイ。
2.前記掲載のおよび参考として本明細書に援用されてい
る、Gann,Z.R.ら、J Biol Chem（1988）263:19827−198
32、Huang,T.F.ら、J Biol Chem（1987）262:16157−16
163、Biochemistry（1989）28:661−666に記載されてい
るような、血小板凝集に直接適用される標準的なアッセ
イ。
3.下記実施例１およびFolts,J.D.ら、Circulation（197
6）54:365に記載されている、イヌのインビボ血栓症モ
デル。および 4.下記実施例19に記載のようなS35メチオニン標識細胞
を用いての細胞接着への効果。
投与および実用性 本発明のPAIは、血栓形成を阻むのに治療学的に有用
である。このような治療にふさわしい症状には、制限は
ないが、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、急性心
筋梗塞、慢性不安定アンギナ、一過性虚血発作および卒
中、末梢血管症、動脈血栓、子癇前症、塞栓症、血管形
成術、頸動脈血管内膜切除術、血管移植のほう合術後の
restenosisおよび／または血栓、そして心臓脈管装置
（例えば、留置カテーテル、あるいは「体外循環装置」
の血液の側路の）の定時装着が含まれる。これらの症状
は、血管壁での血小板の活性化によって開始されると考
えられる。種々の狭窄および閉塞性の血管異常を示す。
PAIは、不安定アンギナおよび動脈塞硬症あるいは血
栓症での動脈血栓の形成を予防あるいは発育不全にする
のに、および心筋梗塞症（MI）およびMI後の壁の血栓形
成の治療あるいは予防に用いられ得る。脳関連異常に対
しては、一過性虚血発作の治療および予防と、血栓発作
あるいは発生中の発作の治療が含まれる。
PAIはさらに、血小板の凝集、梗塞化、あるいは、腎
臓透析の改良、心肺のバイパス、血液灌流、および血漿
分離交換の改良を含む、体外循環中の消耗の予防に用い
られ得る。
PAIは、血小板凝集、梗塞化、あるいは血管内装置に
関連した消耗を予防し、そして投与は、大動脈内のバル
ーンポンプ、心室の補助装置、および動脈のカテーテル
の実用性を改良する。
PAIはさらに、深層静脈血栓症、IVC、腎臓静脈あるい
は門脈血栓症、および肺静脈血栓症の、静脈血栓症の治
療あるいは予防に有用である。
さらに、血栓性血小板減少症紫斑のような血小板消耗
を含む種々の疾患が治療可能である。
さらに、本発明のPAIは、血小板凝集の阻害が望まれ
る、多くの非治療的な応用にも使用され得る。例えば、
改良された血小板および全血の貯蔵が、ペプチドの十分
な量を添加することにより得られる。このペプチドの量
は、目的の貯蔵時間の長さ、貯蔵の条件、貯蔵物質の最
終的な使用などによって、変化する。
PAIの投与量は、所望の効果および治療の設定によっ
て、広く変化し得る。典型的には、投与量は約0.01から
10mg/kg（体重）、好ましくは、約0.01から0.1mg/kg
（体重）である。投与は、日単位で最高１週間、あるい
は１、２ヶ月ないしそれ以上の静脈内投与のような非経
口的投与が好ましく、それら全てはペプチドの大きさに
よって変化する。ペプチドが十分に小さければ（例え
ば、約８−10個のアミノ酸残基以下）、鼻内、舌下など
の他の投与経路が用いられ得る。
注射液は、溶液あるいは懸濁液、注入の前に溶液ある
いは懸濁液にするのに適した固形、あるいは乳液とし
て、従来の形態に調製され得る。適当な賦形剤には、
水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラク
トース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウ
ム、塩酸システインなどがある。さらに、所望ならば、
加湿剤、pH緩衝剤などの非毒性の付加物質を少量、注入
し得る薬学的組成物に含有し得る。所望であれば、吸収
促進調製物（例えば、リポソーム）がもちいられ得る。
実施例１ ヘビ毒の接着阻害剤のアッセイ A.アッセイの説明−−−プレートアッセイ 精製血小板GP II b−III aレセプターを、Fitzgeral
d,L.A.ら、Anal Biochem（1985）151:169−177に記載の
ように調製した。ビトロネクチンレセプターを、Smith.
J.W.,J Biol Chem（1988）263:18726−18731に記載のよ
うに調製した。精製の後、レセプターを,0.1％トリトン
Ｘ−100中0.1−1.0mg/mlで保存した。
レセプターを、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、1mM Ca
Cl2、pH7.4の溶液で1:200に希釈して、トリトンＸ−100
の濃度をその臨界ミセル濃度をしたまわるようにした
後、各ウエルに100ulずつ加て、96ウエルの平底ELISAプ
レート（Linbro EIA−Plus microtiter plate,Flow Lab
oratories）のウエルをコートした。ウエルを全て４℃
で一夜インキュベートし、次に、吸引して乾燥した。も
う一方、上記の緩衝液中35mg/mlのウシ血清アルブミン
（BSA）を加えて、30℃で２時間インキュベートして非
特異的結合を防ぐためにブロックした。次に、ウエルを
結合緩衝液（50nM Tris−HCl、100mM NaCl、2mM CaC
l2、1mg/ml BSA）で１度洗浄した。
対応するリガンド（フィブリノーゲン、フォン・ウィ
ルブランド因子、あるいはビトロネクチン）を、商業的
に入手可能な試薬および標準的なプロトコールによっ
て、125Iで標識するかあるいはビオチンに結合する。標
識リガンドを、レセプターでコートしたウエルに最終濃
度が10nM（100ul/ウエル）になるように加えて、テスト
サンプルの存在あるいは非存在で、30℃で３時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、吸引して乾燥
し、結合リガンドを定量する。
125I標識リガンドに対しては、タンパク質を250ulのS
DSで可溶化する。ビオチン化したリガンドは、アルカリ
ホスファターゼに結合した抗ビオチン抗体を加えて、そ
の後基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を加え、
405nmでの吸光度を調べて検出する。リガンドのレセプ
ターへの結合を阻害するテストサンプルとともにインキ
ュベートすると、ウエルでの、着色の度合の減少、ある
いは125I量の減少が観察される。
B.クルードの毒中の接着阻害の測定 Sigma Chemical Company（St.Louis,MO）あるいはMia
mi Serpentarium Labs（Salt Lake City,UT）から得
た、68のクルードの凍結乾燥したヘビ毒を1mg/mlの緩衝
液（50mM Tris、100mM NaCl、0.02％アジド、2mM CaC
l2）に溶かした。溶液の1mlを、セントリコン−10（YM
membrane）マイクロコンセントレーター（Amicon,Danve
rs,MA）で限外濾過した。濾液を、パラグラフＡのGP II
b−III a/フィブリノーゲン系を用いたレセプター／リ
ガンドアッセイでのテストサンプルとして使用し、ビオ
チン化フィブリノーゲンを用いて結合を検出した。結果
を表１に示す。
クサリヘビ科（Viperinae）では、あるものには活性
があるが全てではなく、コブラ科（Elapidae）のテスト
された種では全て活性はないことがわかる。
図１には、４つの種の濾液の種々の希釈物の結果が示
されている。最も希釈したもの、すなわち25ul/0.5mlで
も、３つの活性な毒は最大の阻害を示した。
C.血栓症のインビボモデルでのペプチドの活性の測定 精製ペプチドを、Folts（Folts J.D.ら、Circulation
（1976）54:365）に記載のモデルの、イヌの冠動脈にお
ける血栓形成を予防する能力をテストした。このモデル
では、圧縮された冠動脈での流量の減少は、血小板の凝
集物の形成によることが示され、そして、フィブリノー
ゲンのGP II b−III aへの結合をブロックする薬剤が、
これらの流量の減少を予防することが示された（Colle
r,B.S.ら、Blood（1986）68:783）。ペプチドを通常の
生理食塩水に溶かして、末梢静脈に、一回投与した。
D.接着タンパク質への細胞接着に対する精製蛇毒ペプチ
ドの影響 高レベルのヒトロネクチンレセプターを発現するM21
メラノーマ細胞を35Sメチオニンで代謝ラベルしてか
ら、ビトロネクチンでコートされた24ウェル組織培養プ
レートに加えた。37℃で１時間インキュベートして、細
胞を接着させてから、続いて洗浄して非付着細胞を除去
した。洗浄後、付着細胞を可溶化させ、その上清を液体
シンチレションカウンターで測定した。可溶化して得ら
れた上清のcpmを各ウェルに加えた細胞総数のcpmで割っ
て、付着したままの細胞の分数を計算した。精製蛇毒ペ
プチドおよび合成環状ペプチドの細胞接着に対する影響
を、インキュベーション期間中にM21細胞にこれらを加
えて、求めた。
E.接着阻害の特異性 ３種の蛇毒、Sistrurus m.barbouri、Crotalus ruber
ruberおよびCrotalus basilicusの限外濾過液を、節Ａ
に記載のフィブリノーゲン/GP II b−III aおよびビト
ロネクチン／ビトロネクチンレセプターアッセイの両方
について試験した。種々の希釈においてその結果を評価
した。図２に示されるように、Sistrurus m.barbouriの
蛇毒は優先的にフィブリノーゲンのGP II b−III aへの
結合を阻害し;Crotalus ruber ruberの蛇毒は両系の結
合をほぼ同じように阻害し；そしてCrotalus basilicus
の蛇毒はビトロネクチン／ビトロネクチンレセプター結
合を優先的に阻害した。
実施例２〜６および８〜12に述べられている精製にお
いては、血小板の直接凝集阻害によりPAI活性をアッセ
イした。富血小板血漿（PRP）を健全なヒト志願者から
得た。凝集測定器（Chrono−log Corp.）内で、4uMのAD
Pを0.5mlのPRPに添加して、凝集を誘発した。
実施例２〜６の精製PAIのアミノ酸組成分析の結果を
示す表が実施例６の後に記載され、実施例８〜11の分析
結果が実施例８の後に記載されている。
6NのHClによるペプチド加水分解およびモデル126デー
タシステムを備えたベックマン121HC分析機を用いた加
水分解物の分析により、この分析結果を得た。システイ
ン酸は、Mooreの方法（J Biol Chem（1969）230:235−2
37）に従って測定した。トリプトファンは定量しなかっ
た。
実施例２ Eristocophis macmahoniの毒からの血小板凝集阻害剤
（PAI）の精製 Eristocophis macmahoniの毒（Miami Serpentarium L
abs,Lot ＃EM23SZ）45mgを1.0mlの0.5％トリフルオロ酢
酸（TFA）に溶解した溶液を氷上20分間冷却し、14,000r
pmで３分間遠心して不溶物を除去してから、１％TFA含
有の５％アセトニトリルで平衡化した3.9mm×30cmのＣ
−18 Delta Pak逆相HPLCカラム（Waters,Milford,M
A）にかけた。５分間にわたる５％〜15％アセトニトリ
ル濃度勾配（２％／分）を行い、次いで35分間にわたる
15％〜30％アセトニトリル濃度勾配、そして20分間にわ
たり50％アセトニトリル濃度になるように、Waters 60
0E液体クロマトグラーフを用いて濃度勾配を実施した。
濃度勾配の溶出中、流速を1.5ml/分に保ち、カラム溶出
物を２分間の画分でポリプロピレンチューブに集めた。
カラム溶出物を220nm/2.5吸光度単位フルスケール（A
UFS）でモニターした。
Speed−Vac濃縮機（Savant）を用いて、画分を元の容
量の半分になるように濃縮してから、凍結乾燥した。サ
ンプルをさらに1mlの蒸留水で再び溶解した。そしてそ
の一部（10〜50ul）を、富血小板血漿において20uMのAD
Pにより誘発されるヒト血小板凝集に対する阻害活性に
ついて、全血凝集測定器（Chrono−Log Corp.,Havertow
n,PA）を用いてアッセイした。
図３に示されているように、21〜25％アセトニトリル
濃度で溶出される画分に活性が検出された。次いで、こ
れらの画分を凍結乾燥してから、Ｃ−18のHPLCカラムを
もう一度行い、より緩やかなアセトニトリル濃度勾配で
溶出した。その濃度勾配の条件は:8％アセトニトリルか
らなる初期条件に続いて68分間にわたり25％アセトニト
リル（0.25％／分）になる濃度勾配、そして60％アセト
ニトリルまで10分間にわたる濃度勾配である。１分毎に
画分を集め、乾燥し、そして上記のようにヒト血小板の
血小板凝集に対する阻害活性を再びアッセイした。
図４に示されているように、その活性が24％アセトニ
トリルで溶出された。次いで、活性画分を分析HPLCを行
い、220nmで検出した。活性は、図５に示されているよ
うに、単一の対称的な生物活性成分として溶出された。
HPLCで精製された物質のアミノ酸分析により、表２に明
記されているように、このペプチドが７〜８個のシステ
インを含む49アミノ酸残基を含有することがわかった。
カルボキシアミドメチル化したペプチドの自動化エド
マン分解を試みたが、検出可能な配列を得なかった。従
って、この物質の分解をLys−ＣおよびAsp−Ｎエンドプ
ロテイナーゼによって行い、得られた画分を配列決定
し、それを図６に示す。この分析は48残基の配列を示し
た。しかし、この分析では、アミノ酸組成では定量しな
かった２個のトリプトファンが見出され、そのため本来
のペプチドは51個のアミノ酸残基を含有する。従って、
決定された配列から欠けている２個のGlxおよび１個のA
rg残基がおそらくこのペプチドのブロックされたアミノ
末端に存在すると推測された。本来のペプチドのブロッ
クされる性質からは、アミノ末端にあるGlx残基の１つ
がピログルタミン残基であることが最も考えられるの
で、本来の、カルボキシアミドメチル化したペプチドか
ら、ピログルタミルアミノペプチダーゼ（Ｌ−pyroglut
amyl peptide hydrolase,EC 3.4.11.8,Boehringer M
annheim Biochemicals,Indianapolis,IN）によってこの
基を除去した。これには、PodellおよびAbraham（Bioch
em Biophys Res Commun（1978）81:176−185）の述べた
プロトコールを用いた。100ugのペプチドを基質：酵素
が100:1の割合でペプチダーゼによって分解し、次いで
この混合物をWatersの分析用Ｃ−18カラムにより逆相HP
LC精製することによって、自動化エドマン分解に適する
物質を得た。この分析の結果および「エリスチコピン
（eristicophin）」と命名したこのペプチドの全配列の
配置が図６に示されている。
このPAIの完全なアミノ酸配列が図６に示されてい
る。このペプチドは結合領域にRGDを有し、エチスタチ
ンとかなりの相同性を示す。
実施例３ Sistrurus catenatus tergeminusの毒からのPAI精製 Sistrurus c.tergeminusの毒（Miami Serpentarium L
abs,Lot ＃ST6SZ）360mgを7.0mlの0.5M酢酸に溶解し、
それをセファデックスＧ−50ファインカラム（ファルマ
シア、2.5×100cm）にかけた。カラムを0.5M酢酸で平衡
化および溶出した。カラムを約25ml/時の流速で溶出
し、5mlの画分を集めた。それぞれの画分を25ul取り、1
0画分を１グループになるように（すなわち、画分１〜1
0、11〜20、など）プールして、分析のために凍結乾燥
した。乾燥したプール画分を再び水に溶解し、その一部
を、ADP誘発ヒト血小板凝集に対する阻害活性について
アッセイした。活性画分（31〜40）をプールして、凍結
乾燥した。
この物質を2mlの0.5％TFAに溶解し、0.1％TFA含有の
８％アセトニトリルで平衡化した19mm×30cmのＣ−18
Delta Pak逆相HPLCカラム（Waters）にかけた。30分間
にわたる８％〜30％アセトニトリルの濃度勾配、次いで
20分間にわたる60％アセトニトリルになるまでの濃度勾
配を用いて、18ml/分の流速で溶出した。カラム溶出物
を0.2分の画分でポリプロピレンチューブに集め、220nm
/2.2AUFSでモニターした。画分をSpeed−Vac濃縮機（Sa
vant）で濃縮して、凍結乾燥し、そして既述したように
ヒト血小板を用いて抗凝集活性をアッセイした。
図７は、PAI含有画分が24〜25％アセトニトリルのと
ころに溶出することを示す。220nmの検出付きのHPLCを
用いたこれらの活性画分の分析は、図８に示すように、
対称的な生物活性成分を示した。この物質のアミノ酸分
析は、表２に示されているように、12個のシステインを
含む71〜72アミノ酸残基のペプチドを示した。
この精製ペプチドの一部をヨードアセトアミドで還元
およびアルキル化して、そしてＣ−18の逆相HPLCカラム
により精製した。この物質のＮ−末端配列分析により、
23サイクルのエドマン分解において以下のアミノ酸配列
が明らかになった:Glu−Ala−Gly−Glu−Glu−Cys−Asp
−Cys−Gly−Ser−Pro−Ala−Asn−Pro−Cys−Cys−Asp
−Ala−Ala−Thr−Cys−Lys−Leu。
「テルゲミニン（tergeminin）」と命名したこのPAI
の完全なアミノ酸配列が図６に示されている。
この精製ペプチドを、実施例１、節Ａに記載したよう
にレセプターに基づくアッセイについてテストした。10
0nMより低い濃度の純粋のペプチドは、図９に示されて
いるように、GP II b−III aへのFgおよびvWFの結合、
およびビトロネクチンレセプターへのVnおよびvWFの結
合を阻害した。
実施例４ Sistrurus milarus barbouriの毒からの血小板凝集阻害
剤の精製 Sistrurus m.barbouriの毒（Miami Serpentarium Lab
s,Lot ＃SM13SZ）200mgを7.0mlの0.5M酢酸に溶解し、そ
れをセファデックスＧ−50ファインカラム（ファルマシ
ア、2.5×100cm）にかけた。カラムを0.5M酢酸で平衡化
および溶出した。カラムを26ml/時の流速で溶出し、5ml
の画分を集め、そして既述したように抗血小板凝集活性
を分析した。活性画分（41〜50）をプールし、凍結乾燥
した。この物質を2.0mlの0.5％TFAに再び溶解して、実
施例３のように分離用Ｃ−18HPLCカラムにかけ、そして
同様の濃度勾配の条件で溶出した。カラムから溶出され
た0.2分の画分をポリプロピレンチューブに集め、濃縮
し、凍結乾燥して、血小板凝集阻害活性を分析した。
図10は、このHPLCカラムからの活性プロフィールを示
す。活性画分を分析用HPLCにかけ、これにより90％より
高い均一性を示すいくつかの画分（45〜47）が現れた。
分析用Ｃ−18カラムで精製して、対称的なピークを手動
で集め、図11に示されているように、画分46のペプチド
（150ug）を均一になるまで精製した。この物質のアミ
ノ酸分析により、表２に明記されているように、12個の
システインを含む71〜72アミノ酸のペプチドが示され
た。
この精製ペプチド（150ug）を300ulの反応バッファー
（6MグアニジンHCl、0.25M Tris−HCl、20mM EDTA、2
0mMジチオスレイトール（DTT）、pH7.5）に、室温にて
1.5時間溶解し、還元した。次いで、さらに１時間で室
温において3ulの４−ビニルピリジン（Aldrich）と反応
させた。200ulの１％TFAの添加によりこの反応を停止し
て、分析用Ｃ−18HPLCカラムにかけて、そして0.1％TFA
含有のアセトニトリル水溶液で、８％アセトニトリルか
ら出発して、20分間にわたり25％アセトニトリルまで濃
度を上げ、さらに10分間にわたり60％アセトニトリルに
なるまでの濃度勾配を行った。
このピリジルエチル化した物質の一部を、上記のよう
にＮ−末端配列決定した。エンドプロテイナーゼLys−
ＣおよびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎで処理して、Ｃ
−３あるいはＣ−18逆相HPLCカラムのいずれかからアセ
トニトリル／水/TFAの濃度勾配溶出により分離されたペ
プチド断片を用いて、この還元およびアルキル化ペプチ
ドを徹底的にタンパク質分解して切断した。この完全な
ペプチドのＮ−末端および分離されたタンパク質分解断
片のアミノ酸配列を、Yarden,Yら（Nature（1986）323:
226）に記載の方法で、自動化エドマン分解を用いて気
相シーケンサーで決定した。
「バルボウリン（barbourin）」と命名したこの分離
されたペプチドの完全なアミノ酸配列が、タンパク質分
解断片の配列と共に、図６に示されている。この配列と
他の蛇毒接着阻害剤の配列との比較が図12に示されてい
る。
実施例５ Lachesis mutasの毒からのPAIの精製 Lachesis mutasの毒（Miami Serpentarium Labs,Lot
＃LM15FZ）99mgを2.0mlの0.5％トリフルオロ酢酸に溶解
した溶液を氷上20分間冷却し、14,000rpmで３分間遠心
して不溶物を除去してから、0.1％トリフルオロ酢酸含
有の５％アセトニトリルで平衡化した3.9mm×30cmのＣ
−18Delta Pak逆相HPLCカラム（Waters）にかけた。５
分間にわたる５％〜15％アセトニトリル濃度勾配で、次
いで35分間にわたる30％になるように濃度を上げ（２％
／分）、そして続いて20分間にわたり60％アセトニトリ
ルになるように濃度勾配を行った。流速を1.5ml/分に保
ち、そしてカラム溶出物を220nm/3.0AUFSにおいてモニ
ターした。２分間の画分を集め、Speed−Vacで濃縮し
て、凍結乾燥した。画分を血小板凝集阻害活性について
アッセイした。
図13には、18％アセトニトリルのところに溶出される
活性画分が示されている。これらの画分をもう一度Ｃ−
18カラムにかけ、５〜28％アセトニトリルの40分間濃度
勾配からなるより緩やかな濃度勾配条件を用いて行っ
た。１分間の画分を集め、濃縮し、凍結乾燥してから、
血小板凝集阻害活性についてアッセイした。その結果が
図14に示されている。これらの画分を分析用Ｃ−18カラ
ムにかけ、その溶出したピーク画分の中央部分を手で集
めた。この溶出した物質が、図15に示されているよう
に、単一の対称的なピークである。これのアミノ酸分析
により、表２に示されているように、12個のシステイン
を含む72〜73アミノ酸のペプチドが示された。
「ラチェシン（lachesin）」と呼ばれるこのPAIの完
全なアミノ酸配列が図６に示されている。
実施例６ Crotalus viridis viridisの毒からのPAIの精製 Crotalus viridis viridisの毒（Sigma Chemical C
o.,Lot ＃24F−0534）47mgを1mlの0.5％トリフルオロ酢
酸に溶解した溶液を氷上20分間冷却し、14,000rpmで３
分間遠心して不溶物を除去してから、0.1％トリフルオ
ロ酢酸含有の５％アセトニトリルで平衡化した3.9mm×3
0cmのＣ−18 Delta Pak逆相HPLCカラム（Waters）に
かけた。５分間にわたる５％〜15％アセトニトリル濃度
勾配（２％／分）で、次いで35分間で15％から30％アセ
トニトリルになるように濃度勾配を行い、そして60分間
にわたり60％アセトニトリルになるように濃度勾配を行
った。濃度勾配の間では、流速を1.5ml/分に保ち、そし
てカラム溶出物を２分間の画分でポリプロピレンチュー
ブに集めた。カラム溶出物を220nm/3.0AUFSにおいてモ
ニターした。画分を濃縮し、凍結乾燥して、血小板凝集
阻害活性についてアッセイした。
その活性画分、それが図16に示されている18〜19％ア
セトニトリルのところにある画分を、48分間にわたる８
％〜20％アセトニトリル濃度勾配（0.25％／分）による
Ｃ−18HPLCカラムを行った。画分を濃縮し、凍結乾燥し
て、活性をテストした。活性のある画分を、10分間にわ
たる８〜16％アセトニトリル、15分間にわたる16〜20％
アセトニトリル、そしてさらに10分間にわたり60％にな
るような濃度勾配でＣ−18カラムを行った。この溶出物
を220nmでモニターしながら、手で個々のピークをポリ
プロピレンチューブに集めた。分析用HPLCを用いたこの
活性ピークの再分析により、図17に示されている結果が
得られた。このピークのアミノ酸分析は、表２に明記さ
れているように、12個のシステインを含む72〜73アミノ
酸残基のペプチドを示した「ピリジン（viridin）」と
呼ばれるこのPAIの完全なアミノ酸配列が図６に示さ
れ、図12において他のPAIと比較されている。
実施例７ 精製PAIとエチスタチンとの比較 実施例２および４に記載の精製ペプチド、エリスチコ
ピンおよびバルボウリンを、49アミノ酸残基のペプチ
ド、エチスタチンと、実施例１、節Ａの記載に従って、
フィブリノーゲンのGP II b−III aへの結合における阻
害について比較した。図18は、これらの精製PAIがこの
アッセイにおいて標準エチスタチンより２〜３倍有効で
あることを示す。
Echis carinatus、Sistrurus m.barbouriおよびErist
icophis macmahoniの毒から均一になるまで精製したペ
プチドを、ADP誘発血小板凝集アッセイについて、エチ
スタチンと比較した。精製した蛇毒ペプチドの濃度を上
げて、表示の濃度で（プレーインキュベートせずに）添
加した（図19）。Eristicophis macmahoniおよびSistru
rus m.barbouri由来の蛇毒ペプチドがエチスタチンより
少なくとも２倍有効であって、これが前記のフィブリノ
ーゲンのGP II b−III aへの結合阻害で観察された能力
と程度が一致した。
実施例８ Crotalus cerastes cerastesの毒からのPAIの精製 Crotalus c.cerastesの毒（Miami Serpentarium Lab
s,Lot ＃CE4SZ）1gを7.0mlの0.5M酢酸に溶解し、それを
セファデックスＧ−50ファインカラム（ファルマシア、
2.5×100cm）にかけた。カラムを0.5M酢酸で平衡化およ
び溶出した。カラムを25ml/時の流速で溶出し、5mlの画
分をポリプロピレンチューブに集めた。これらの画分の
一部の溶液を用いて、既述されたように凝集に対する阻
害活性をアッセイした。活性画分（71〜80）をプールし
て、凍結乾燥した。乾燥物を、実施例３に記載のよう
に、再び2.0mlの0.5％TFAに溶解し、遠心して不溶物を
除き、それを分離用Ｃ−18のWatersのHPLCカラムを行
い、実施例３に記載のような濃度勾配の溶出条件を用い
て溶出した。カラムから溶出された画分をポリプロピレ
ンチューブに集め、それを濃縮して、血小板凝集阻害活
性について分析した。図20には、このHPLC分画の活性プ
ロフィールが示されている。
血小板凝集阻害活性を有する活性画分をプールして、
凍結乾燥した。これをもう一度分離用Ｃ−18HPLCカラム
を行って、同様の濃度勾配で溶出した。手で画分をポリ
プロピレンチューブに集め、前記のように血小板凝集阻
害活性のアッセイを再び行った。活性画分を実施例４に
記載の条件に従って分析用Ｃ−18カラムで分析して、均
一の画分をプールして、凍結乾燥した。本物質の分析用
HPLC分析が図21に示されている。
精製ペプチドのアミノ酸分析を行い、表３に明記され
ているように、これが12個のシステインを含む73〜74ア
ミノ酸のペプチドであったことが明らかになった。
この精製ペプチド（450ug）を750ulの反応バッファー
（6Mグアニジン−HCl、0.25M Tris−HCl、20mM EDT
A、20mMジチオスレイトール（DTT）、pH7.50）で、室温
にて1.5時間溶解して、このペプチドを充分に還元し
た。この後、室温において１時間で過剰量のヨードアセ
トアミド（Fluka、16mg）と反応させた。500ulの１％TF
Aの添加によりこの反応を停止して、分析用Ｃ−18HPLC
カラムにおいて、20分間の８％〜25％アセトニトリル濃
度勾配を行い、そしてさらに10分間にわたり60％アセト
ニトリルになるような濃度勾配を行った。UV吸収ピーク
を手で1.5mlのエッペンドルフチューブに集め、それを
乾燥した。
このカルボキシアミドメチル化したペプチドの一部を
Ｎ−末端配列決定した。エンドプロテイナーゼLys−Ｃ
およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎを用いて、このカ
ルボキシアミドメチル化したペプチドを徹底的にタンパ
ク質分解して切断した。これらの消化により得られたペ
プチド断片を、Ｃ−３あるいはＣ−18の逆相HPLCカラム
のいずれかでアセトニトリル／水/TFAの濃度勾配の溶出
条件により分離した。実施例４に記載のように、アミノ
酸配列を決定した。「セラスチン（cerastin）」の決定
された完全なアミノ酸配列が図６に示され、図12におい
て他のPAIの配列と比較されている。
実施例９ Crotalus ruber ruberの毒からのPAIの精製 Crotalus ruber ruberの毒（Miami Serpentarium Lab
s,Lot ＃CF17SZ）1gを8mlの0.5M酢酸に溶解し、それを
0.5M酢酸で室温にて平衡化したセファデックスＧ−50フ
ァインカラム（ファルマシア、2.5×100cm）に充填し、
溶出した。このカラムを25ml/時の流速で溶出して、5ml
の画分をポリプロピレンチューブに集めた。画分の一部
の溶液を、述べられたように血小板凝集阻害活性につい
てアッセイした。活性画分（61〜70）をプールして、凍
結乾燥した。乾燥物質を再び2.0mlの0.5％TFAに溶解し
た。不溶物を遠心で除き、述べられたように、それを分
離用Ｃ−18のWaterのHPLCカラムに充填し、実施例３に
記載のような濃度勾配の条件を用いて溶出した。ポリプ
ロピレンチューブに集めた画分をSpeed−Vac濃縮機で濃
縮して、血小板凝集阻害活性について分析した。
図22には、このHPLC分画の活性プロフィールが示され
ている。個々の活性画分を凍結乾燥した。画分49および
50をプールし、分析用Ｃ−18逆相カラムに充填し、実施
例４に記載のように、８％〜25％アセトニトリルの20分
間濃度勾配を行って、次いで10分間にわたる69％アセト
ニトリルになるようなアセトニトリル濃度勾配からなる
条件により溶出した。結果として、均一のペプチドが得
られ、「ルベリン（ruberin）」と命名した。カルボキ
シアミドメチル化したペプチドの自動化エドマン分解に
より、図６に示されている配列が得られる。
実施例10 Crotalus atroxからのPAIの精製 1gのCrotalus atroxの毒（Miami Serpentarium Labs,
Lot ＃CX16AZ）を10mlの0.5M酢酸に溶解し、0.5M酢酸で
平衡化したセファデックスＧ−50ファインカラム（ファ
ルマシア、2.5x110cm）にかけ、室温にて、0.5M酢酸で
流した。カラムは流速25ml/時で、ポリプロピレンチュ
ーブに5mlづつ集めながら流した。画分の一部を前述の
方法で血小板凝集阻害活性をアッセイした。活性画分
（81−100）を集め、凍結乾燥した。乾燥物は2.0mlの0.
5％TFAに再溶解し、調製用Ｃ−18 HPLCに載せ、実施例
３に記載した方法で溶出した。カラムからの画分はポリ
プロピレンチューブに集め、スピードバック（Speed−v
ac）濃縮機で濃縮し、前記と同様に血小板凝集阻害活性
をアッセイした。活性画分は再度分析用Ｃ−18 HPLCに
かけ均一なペプチドを生じた（図23）。この物質のアミ
ノ酸分析によると、表３に示すように、ペプチドは12個
のシステイン残基を含む72個のアミノ酸を有していた。
単離したペプチド、クロタトロキシン、のアミノ酸配列
は図６に示す。
実施例11 Bothrops cotiaraからのPAIの精製 680mgのBothrops cotiara毒（Miami Serpentarium La
bs,Lot ＃B05SZ）を10mlの0.5M酢酸に溶解し、0.5M酢酸
で平衡化したセファデックスＧ−50ファインカラム（フ
ァルマシア、2.5x110cm）にかけ、0.5M酢酸で溶出し
た。カラムは流速25ml/時で、ポリプロピレンチューブ
に5mlづつ集めながら流した。画分の一部を前述の方法
で血小板凝集阻害活性をアッセイした。活性画分（71−
90）を集め、凍結乾燥した。乾燥物は2.0mlの0.5％TFA
に再溶解し、ウォーターズ調製用Ｃ−18逆相HPLCに負荷
して、実施例３に記載した条件で溶出した。画分はポリ
プロピレンチューブに集め、スピードバック濃縮機で濃
縮し、血小板凝集阻害活性をアッセイした。活性画分は
それぞれ凍結乾燥した。数個のピーク画分は、実施例４
に記載したように、再度分析用Ｃ−18HPLCにかけた。分
析用HPLCによる均一なペプチドの様子は（図24）に示
す。この物質のアミノ酸分析によると、表３に示すよう
に、ペプチドは12個のシステイン残基を含む72個のアミ
ノ酸を有していた。我々が“コチアリン”と呼ぶこのペ
プチドの完全なアミノ酸配列は図６と図12に示す。
精製ペプチドは実施例１に記載されたレセプターアッ
セイでテストした。最初の結果ではコチアリンは低濃度
で（１−4nM）ビトロネクチンのビトロネクチンレセプ
ターへの結合を特異的に阻害したが、一方、図25に示さ
れるように、フィブリノーゲンのGP II b−III aへの結
合阻害活性は同濃度で相当低かった；しかし、その後の
実験ではこの結果を証明できなかった。
実施例12 Crotalus viridis lutosusからのPAIの精製 A. 1gのCrotalus viridis lutosusの毒（Miami Serpen
tarium Labs,Lot ＃CL18SZ）を8mlの0.5M酢酸に溶解
し、0.5M酢酸で平衡化したセファデックスＧ−50ファイ
ンカラム（ファルマシア、2.5x110cm）にかけ、0.5M酢
酸で溶出した。カラムは流速25ml/時で流し、ポリプロ
ピレンチューブに5mlづつ集めた。画分の一部は前述の
方法で血小板凝集阻害活性をアッセイした。画分（71−
100）を集め、凍結乾燥した。乾燥物は2.0mlの0.5TFAに
再溶解し、不溶物を遠心分離で除き、調製用Ｃ−18ウオ
ーターズ逆相カラムにかけ、実施例３に記載した条件で
濃度勾配溶出を行った。カラムからの画分はポリプロピ
レンチューブに集め、スピードバック濃縮機で濃縮し、
血小板凝集阻害活性を分析した。活性画分はそれぞれの
チューブで凍結乾燥した。活性ピークの画分は、実施例
４に記載したように、アセトニトリルの濃度勾配を用い
て再度分析用Ｃ−18ウオーターズ逆相カラムにかけた。
手で1.5mlエッペンドルフチューブに画分を集め、均一
な画分を集めて凍結乾燥した。この物質の分析用HPLCは
一本の対称的なピークを示した。我々が“ルトシン”と
呼ぶこのペプチドの完全なアミノ酸配列は図６と図12に
示す。
B. パラグラフＡと同様の方法で、B.jararacussu,C.ba
silicus,C.durissus durissus,C.v.oreganus,C.h.horri
dus,C.v.helleri,C.durissus totonactus and C.m.molo
ssusからのPAIを単離精製した。これらのペプチドのい
くつかのアミノ酸組成は表３に示した。
C.h.horridus,C.basilicus,C.m.molossus,C.v.oreganus
およびC.d.durissusからの、それぞれホリジン、バシリ
シン、モロシン、オレガニンおよびデュリシンと命名さ
れたPAIのアミノ酸配列は、図６に示す。実施例１−12
の精製されたペプチドについてのリセプター結合データ
は図26に示す。
以下の実施例13−16において、ペプチドはアプライド
バイオシステムズ 431A ペプチド合成機による固相技
術で合成され、HOBt活性エステルとして活性化されたｔ
−BOCアミノ酸を用いて、製造指針に従って合成され
た。簡単にいえば以下のようにして、Boc−AA1...AA
（ｎ−１）−AA（ｎ）−Ｏ−PAM−ポリスチレン樹脂を
調製する。
1/2mmolの選択したBoc−AA（ｎ）−Ｏ−PAM−ポリス
チレン樹脂を以下の計画により処理してBoc−AA（ｎ−
１）−OHを取り込ませた。
１）TFA脱保護:DCM溶解の30％TFA、３分、DCM溶解の50
％TFA、16分 ２）洗浄および中和:DCM洗浄（５回）、３分、DCM溶解
の５％DIEA、２分、NMP溶解の５％DIEA、２分、NMP洗浄
（６回）、５分 ３）カップリング:NMP中の４当量のBoc−AA−HOBtエス
テル（予備活性化、55分）、38分、DMSOを加えて15％DM
SO/85％NMPとする、16分、3.8当量のDIEA、５分 ４）洗浄および樹脂試料:NMP洗浄、３分 ５）キャッピング:10％無水酢酸、NMP中の５％NMP、８
分 ６）洗浄:DCM洗浄（６回）、４分。
実施例13 アナログ＃１の調製 ［E28L41C64］バルボウリン（28−73）:E−Ｃ−Ａ−Ｄ
−Ｇ−Ｌ−Ｃ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−
Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｎ−Ｄ
−Ｄ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｑ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｃ−Ｐ−Ｒ−
Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｙ−Ｇ 1/2mmolのPAM−Gly樹脂（0.6meq/g、アプライドバイ
オシステムズ、フォスターシティー、CA）を必要なアミ
ノ酸（順番に導入する）とともに工程Ａに供した。Boc
保護されたアミノ酸は以下の側鎖が保護されている:Arg
（Tos）,Asp（OcHex）,Cys（４−MeBzl）,Glu（OcHe
x）,Lys（Cl−Ｚ）,Thr（OBzl）,Trp（CHO）およびTyr
（Br−Ｚ）。完全に保護されたペプチド樹脂鎖を組立た
て後、アミノ末端のBoc−基をTFAで除去し、樹脂をTFA
−塩の形態で乾燥した。樹脂（1.3g）に“ローハイ"HF
脱保護のプロトコールを適用した後、“真空で"HFを除
去した。乾燥されたペプチド−樹脂混合物は粗フリッテ
ィドファネル（fritted funnel）（粗面）にエーテルと
ともに移し、さらに数回エーテルとクロロホルムで交互
に洗浄し有機保護基の大部分と脱保護に使用したスキャ
ベンジャーを除去した。
ペプチド混合物は0.4％酢酸2Lに移し、pHを濃NH4OHで
7.99に調整した。樹脂は溶液から濾別し、溶液は攪拌せ
ずに４℃、20時間静置した。これを室温まで温め、再び
攪拌せずに３日間放置した。沈澱物は濾過して除き、上
澄は酢酸でpHを3.0に調整し、凍結乾燥した。
この粗生成物は0.5M酢酸8mlに溶解し、0.5M酢酸で平
衡化したセファデックスＧ−50ファインカラム（2.5x10
0cm）にかけた。カラムは流速20ml/時で流し、ポリプロ
ピレンチューブに4mlづつ集めた。画分の一部を乾燥
し、水に再溶解して、前述の方法で血小板凝集阻害活性
をテストした。活性画分（71−90）をプールし、凍結乾
燥した。
乾燥物（66mg）は2.0mlの0.1M酢酸に再溶解し、予め
0.1％TFAを含有する８％アセトニトリルで平衡化した調
製用Ｃ−18ウオーターズ逆相カラムにかけた。８％から
20％アセトニトリルの濃度勾配を10分で行った。40分で
30％アセトニトリル濃度にする緩慢な勾配を行った。カ
ラムは18ml/分の流速で溶出し、画分（12秒）はポリプ
ロピレンチューブに集めた。画分はスピードバック濃縮
機で1.0mlまで濃縮し、そのうち10μｌで血小板凝集阻
害活性をテストした。
活性画分（29−32）はそれぞれ凍結乾燥し、分析用Ｃ
−18 HPLCカラムでアセトニトリルの８−30％濃度勾配
にかけて分析した。画分29と30をプールし、0.5％TFA1.
0ml中で分析用HPLCにかけた。メジューピークを手で集
め、凍結乾燥して1.6mgの純粋なペプチドを得た。
この物質のアミノ酸分析により、ペプチドの同一性が
確認できた。この物質の、フィブリノーゲンのGP II b
−III aに対する結合およびビトロネクチンのVnRに対す
る結合の阻害能は図26と27に示す。これらのデータはこ
のアナログがGP II b−III aに高い親和性を有すること
およびこれに比較して、VnRに対して１μＭ濃度に至る
までは親和性が欠けることを示す。
実施例14 アナログ＃２の調製：［K29］エリスチコピン（４−5
1）:E−Ｅ−Ｐ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ｒ−Ｒ
−Ｃ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｋ−Ｖ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−
Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｋ
−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｃ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｇ 1/2mmolのPAM−Gly樹脂（0.6meq/g、アプライドバイ
オシステムズ、フォスターシティー、CA）を必要なアミ
ノ酸（順番に導入する）とともに工程Ａに供した。Boc
保護されたアミノ酸は以下の側鎖が保護されている:Arg
（Tos）,Asp（OcHex）,Cys（４−MeBzl）,Glu（Ｏ−cHe
x）,Lys（Cl−Ｚ）,Ser（OBzl）,THr（OBzl）,Trp（CH
O）およびTyr（Br−Ｚ）。このペプチドの開裂、再折り
畳み及び精製は先の実施例と同じであった。このアナロ
グのリセプター結合データは図26と28に記載されてい
る。
実施例15 アナログ＃３の調製:G−Ｃ−Ｇ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−
Ｃ−Ａ−NH2 1/2mmolのpMBHA樹脂（0.72meq/g、アプライドバイオ
システムズ、フォスターシティー、CA）を必要なアミノ
酸（順番に導入する）とともに工程Ａに供した。Boc保
護されたアミノ酸は以下の側鎖が保護されている:Asp
（Ｏ−cHex）,Cys（４−MeBzl），およびLys（Cl−
Ｚ）。保護されたペプチド−樹脂の組立が終了した後、
アミノ末端のBoc基をTFAで除き、樹脂はそのTFA塩とし
て乾燥した。樹脂（1.54g）を10％アニソール、２％エ
チルメチルスルファイドを含有する無水フッ化水素（H
F）で−10℃、30分処理し、さらに０℃、30分処理し
た。HFは真空下除去しペプチド／樹脂混合物はジエチル
エーテルに懸濁し、クロロホルムとエーテルで交互に３
回洗浄した。最後のエーテル洗浄の後、ペプチドは2.0M
酢酸で樹脂から抽出し、水で希釈して凍結乾燥した。
粗ペプチド（370mg）を脱酸素した10mM NH4OAc、pH8
に溶解して0.5mg/mlとし、やや過剰の0.01Mフェリシア
ン化カリウム（K3Fe（CN）６）溶液を滴下して酸化し、
さらに20分攪拌して、酢酸でpHを５に調整した。ペプチ
ド溶液はダウエックス（Dowex）AG3x4陰イオン交換樹脂
で攪拌しながら15分、処理し、樹脂を濾別し、水で希釈
し凍結乾燥して粗環状ペプチドを得た。粗環状ペプチド
（392mg）をセファデックスＧ−25Fで0.5M酢酸を溶出液
として脱塩し、次に、CM−セファロース（ファルマシ
ア）のイオン交換クロマトグラフィーで、pH4.5、10mM
NH4OAc溶液に100mM NH4OAcを添加する濃度勾配で溶出す
ることにより精製した。HPLC分析で最低90％の純度を有
する画分を集め、水から数回凍結乾燥して175mgを得
た。最終精製はウォーターズのＣ−18逆相カラムで調製
用HPLCをアセトニトリル／水/TFAの濃度勾配で行い、精
製ペプチドを得た。このアナログのリセプター結合デー
タは図26、29および30に記載されている。
実施例16 その他のアナログの調製 以下のアナログはほとんどの場合は実施例15の記載と
同様に行った。
しかし、以下に示すアナログ＃60はBajusz,S.,ら.,FE
BS Letts（1980）110:85−87の方法を用いてアナログ＃
19のリジン残基側鎖のグアニジン化を経由して、溶液中
で調製した。
1mgのアナログ＃19をジイソプロピルエチルアミン（D
IEA）存在下、1mlの無水エタノール中で1mgの１−アミ
ジノ−３、５−ジメチルピラゾロール硝酸塩（アルドリ
ッチ）と室温で４日反応させた。生産物のアナログ＃60
は、Ｃ−18カラムの逆相HPLCで、0.1％トリフルオロ酢
酸中のアセトニトリルの濃度勾配により、過剰の試薬と
出発物質から精製した。この物質900μｇが、精製され
単離された。
実施例 17 ペプチドのPAI活性 上記の標準的な凝集阻害アッセイでテストした時、ア
ナログ＃３〜５のADP誘導ヒト血小板凝集阻害のIC50値
は５μＭであった。しかし、アナログ＃６のIC50値は20
0μＭ以上で、アナログ＃７は100μＭであった。このア
ッセイでの本発明のアナログのIC50値は以下のとおりで
ある。
実施例 18 直鎖対環状ペプチドの活性 プレートアッセイでフィブリノーゲンのGP II b−III
aへの結合阻害をテストしたところ、直鎖のRGDW−NH2
の活性は環状のGCGRGDWPCA−NH2とは非常によく似てい
た（図29）。対照的に、直鎖のKGDW−NH2は環状のGCGKG
DWPCA−NH2よりはるかに効果は弱かった（図29）。RGDW
化合物でなく、KGDW化合物については環状化はペプチド
のフィブリノーゲンのGP II b−III aへの結合阻害能を
顕著に高めた。
実施例 19 合成ペプチドのプレート結合アッセイ 実施例17で合成されたペプチドは、直接血小板凝集阻
害活性を評価することに加え、前述の本発明のプレート
アッセイでもテストした。アナログ４〜８の結果を図30
に示す。図に示されるように、これらのアナログは、ビ
トロネクチンのビトロネクチンリセプターへの結合と比
較して、フィブリノーゲンのGP II b−III aへの結合
を、程度は異なるが、特異的に阻害することができる。
アナログ＃４はこのグループの中でも最も大きな差異が
ある。一方、アナログ＃７と＃５はまた完全に特異的で
あり、優れた血小板凝集阻害活性を有する。
実施例 20 細胞接着に対する精製ペプチドの効果 M21メラノーマ細胞を35S−メチオニンでラベルし、精
製ヘビ毒ペプチドの各濃度の存在下、ビトロネクチンで
コートしたプレートに添加した。細胞接着は40頁のセク
ションＣで記載したように、インキュベートし、洗浄し
た後、残存する細胞を溶解して測定した。図31に示され
るように、バルボウリンもペプチド１（先端切断型バル
ボウリン）も、実施例２および３で示されるように血小
板凝集阻害の強力な阻害剤であるにも係わらず、細胞の
ビトロネクチンへの接着に有意な効果はなかった。対照
的に、コチアリンはビトロネクチンのビトロネクチンリ
セプターへの結合を強力に阻害する能力を有するが、ビ
トロネクチンへの細胞の接着を非常に強く阻害した。同
様な実験をペプチド＃３、ＫをＲで置換したペプチド＃
３（GCGRGDWPCA−NH2）およびRGDSを用いてM21細胞のビ
トロネクチンへの接着を調べた。図32に示されるよう
に、RGDSとGCGRGDWPCA−NH2は強力な細胞接着阻害剤で
あるが、GCGKGDWPCA−NH2は60μＭまで効果がないこと
がわかる。
実施例 21 アナログ＃60と19の比較 上記アナログ＃60と19はＫ＊GDXの配列を有する本発
明のペプチドであり、Ｋ＊実施態様を除いて同一であ
る。アナログ＃60は Mpr−（Har）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2 で表され、アナログ＃19は Mpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2 で表される。
これらのアナログを、標準血小板凝集阻害アッセイと
上記実施例20の細胞接着アッセイで試験した。結果は図
33と34に示す。図33に示すように、アナログ＃60は目に
見えない程低濃度で血小板凝集阻害に有効であり、細胞
のビトロネクチンへの細胞接着阻害効果は比較的小さか
った。図34はアナログ＃19は特異性と同様良好な血小板
凝集阻害活性を有するが、そのアナログであるアナログ
＃60と比較して血小板凝集阻害活性は低かった。アナロ
グ＃60の血小板阻害のIC50は約0.15nMであり、アナログ
＃19のIC50は約1nMであった。
実施例 22 イヌ冠動脈の血栓症のフォルツモデル（Folt's model） A.開胸イヌにおける周期的流量減少（CFRs）の誘発 20Kgのイヌの左冠動脈前下行枝（LAD）上に閉塞器を
装着し、前述の方法を行った。電磁流量計およびドップ
ラー流量計で測定した相および平均の血流量を図35に示
す。
B.環状GCGKGDWPCA−NH2（アナログ＃３）の開胸イヌに
おけるCFRsに対する効果 10mgのこのペプチドを、上記イヌの末梢静脈に注入し
た。LADにおける血流パターンは前述の通りであり、図3
6に示す。流量減少の傾きの減少にみられるように、CFR
sの一部の除去が認められる。さらに、コントロール
（Ａ）と同程度までは流量が減少していないことも認め
られる。
C.40mgのアナログ＃３の二度目の注入を末梢静脈に行っ
た。図37に示すように、CFRsの完全な除去はLADで全流
量が回復されたことを示す。
実施例 23 バルボウリンペプチドの発現ベクターの構築 全長の［L41］バルボウリンペプチド（１−73）をコ
ードする遺伝子は、図38に示す合成オリゴヌクレオチド
から、通常の方法でキナーゼ処理、アニールし、EcoR I
−Hind III消化したM13mp18に連結して構築した。バク
テリアのアルカリフォスファターゼ遺伝子（phoA）シグ
ナル配列（Watson,M.E.E.のNucleic Acids Research（1
984）12:5145）をバルボウリン構築物に添加した。この
添加は、図39に示されるように、［L41］バルボウリン
（１−73）構築物のEcoR I/Nco I部位に合成オリゴヌク
レオチドを連結して導入して行った。すべての構成物の
塩基配列はサンガーのダイデオキシチェーンターミネー
ション法により確認した。
このペプチドの先端切断型もまた合成オリゴヌクレオ
チドから構成され、それは全長分子のうちアミノ酸28〜
73をコードする。二つの、Q28をE28へおよびA64をC64へ
の変換はKunkelらのMeth Enzymol（1987）154:367に記
載の部位特異的変異導入により導入した。phoAシグナル
配列を前述のように先端切断型に加えた（図40）。さら
に、E.coli熱安定エンテロキシンII（Picken,R.W.,ら.I
nfect Immun（1983）42:269）を、EcoR IおよびNco Iに
適合する末端を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて
先端切断型に付加した。あらゆるバクテリアの分泌用の
構築物は、クローンテック（CLONTECH Lab.Inc）から購
入したバクテリアの発現ベクターpPROK−１（Brosius,
J.,Gene（1984）27:151,および同誌:161）、にEcoR Iお
よびHind IIIをもちいてサブクローンした。
所望の題記ペプチドのタンデム反復配列をコードする
遺伝子は以下のように調製した。L41およびC64を含む全
長のバルボウリンペプチド１〜73から、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）を用いて、マルチマー化ユニットを調製
した。
図41はPCR合成に使用したオリゴヌクレオチドを示
す。PCR反応は、Saiki,R.K.,らのScience（1988）239:4
87の方法に従った。生じるポリマーの結合は図42に示さ
れるように配列のいずれかの末端にメチオニンを有し、
また構成物に所望の制限部位を提供する。
タンデム反復配列は個々のマルチマー形成の構成要素
から作成され、例えば、EcoR I/Hind IIIで切断したM13
mp18ベクター中でEcoR I/BamH I断片をBgl II/Hind III
断片に接続することにより、ダイマーが作成される。得
られたダイマーはEcoR IとBamH Iで再び処理し、Bgl II
/Hind III断片に接続することにより、トライマーが得
られる。所望のサイズが得られるまでこれを繰り返す。
この構築過程は図43に図示される。
次にマルチマーの組み込みはE.coliベクターpKK233−
２（Amann,E.ら、Gene（1985）40:183,クロンテックか
ら購入）をNco I/Hind IIIで切断し、Nco I/BamH Iモノ
マーサブ断片とBgl II/Hind IIIマルチマーサブ断片と
を連結して行った。
融合蛋白の発現には、上記処理したベクターととも
に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子の少し改変したアミノ末端部分（アミノ酸１−7
2）（Chang,C.N.ら、Gene（1987）55:189）を含むNco I
−EcoR Iサブ断片とマルチマー構成物のEcoR I−Hind I
IIサブ断片とが使用された。
実施例 24 組換え遺伝子の発現 上記全ての組換えプラスミドからの蛋白の発現は適当
なE.coli宿主細胞へトランスフェクションした後、Kana
mariら、Gene（1988）66:295に従って誘導した。生産物
はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動および富血小板血漿中でのADP誘発血小板凝集阻害
活性により特徴を調べた。マルチマー蛋白は精製の後、
臭化シアン分解でモノマーユニットに変え、上記のよう
にアッセイした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ４８３，２２９ (32)優先日 平成２年２月20日(1990．2．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ウルフ，デイビッド ローレンス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303 パロ アルト，ベルビュー ド ライブ 2142 (72)発明者 チャロ，イスラエル エフ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549 ラファイエット，ハッピー ホ ロー コート 224 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖ ｏｌ．69（1982），ｐ．263−269 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，Ｖｏｌ．80（1983），ｐ．2417− 2421 Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．71，Ｎｏ．４ （1988），ｐ．831−843 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，Ｖｏｌ．87（1989），ｐ．2471− 2475 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．262，Ｎｏ．33（1987），ｐ．16157 −16163 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．264，Ｎｏ．36（1988），ｐ．19827 −19832 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/745 A61K 38/36 A61P 7/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血小板凝集阻害（PAI）ポリペプチドであ
    って、ビトロネクチンレセプターに対するビトロネクチ
    ンの結合またはフィブロネクチンレセプターに対するフ
    ィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質上強力
    に、GP II b−III aに対するフィブリノーゲン（Fg）ま
    たはフォン・ウィルブランド因子（vWF）の結合を阻害
    する能力を有し、ここで、一定濃度のPAIでの、GP II b
    −III aに対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィ
    ルブランド因子の結合の阻害についての阻害のパーセン
    トが、ビトロネクチンレセプターに対するビトロネクチ
    ンの結合の阻害またはフィブロネクチンレセプターに対
    するフィブロネクチンの結合の阻害についての阻害のパ
    ーセントの少なくとも２倍であるか、あるいは、50％の
    阻害を引き起こすPAIの濃度が、GP II b−III aに対す
    るフィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブランド因子
    の結合の阻害に対して、ビトロネクチンレセブターに対
    するビトロネクチンの結合またはフィブロネクチンに対
    するフィブロネクチンの結合の阻害に対してよりも少な
    くとも２倍少ないものであり、 アミノ酸配列： またはその改変および／または先端切断型を含有し、こ
    こで、改変型はKGD部分以外の配列の配列において１〜1
    0のアミノ酸が置換されているか、または１〜数個のペ
    プチド結合が、−CH2NH−，−CH2S−，−CH2CH2−，−C
    H＝CH−，−COCH2−，−CH（OH）CH2−及び−CH2SO−か
    らなる群より選択された代替結合により置換されている
    ことを意味し、先端切断型は、KGD配列を含んでなる少
    なくとも20アミノ酸を意味する、血小板凝集阻害ポリペ
    プチド。
  2. 【請求項２】血小板凝集阻害（PAI）ポリペプチドであ
    って、ビトロネクチンレセプターに対するビトロネクチ
    ンの結合またはフィブロネクチンレセプターに対するフ
    ィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質上強力
    に、GP II b−III aに対するフィブリノーゲン（Fg）ま
    たはフォン・ウィルブランド因子（vWF）の結合を阻害
    する能力を有し、ここで、一定濃度のPAIで、GP II b−
    III aに対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィル
    ブランド因子の結合の阻害についての阻害のパーセント
    が、ビトロネクチンレセプターに対するビトロネクチン
    の結合の阻害またはフィブロネクチンレセプターに対す
    るフィブロネクチンの結合の阻害についての阻害のパー
    セントの少なくとも２倍であるか、あるいは、50％の阻
    害を引き起こすPAIの濃度が、GP II b−III aに対する
    フィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブランド因子の
    結合の阻害に対して、ビトロネクチンレセブターに対す
    るビトロネクチンの結合またはフィブロネクチンに対す
    るフィブロネクチンの結合の阻害に対してよりも少なく
    とも２倍少ないものであり、 次のアミノ酸配列： において１もしくは数個のアミノ酸が欠失および／また
    は付加されたアミノ酸配列またはその改変および／また
    は先端切断型を含み、ここで、改変型はKGD部分以外の
    配列の配列において１〜10のアミノ酸が置換されている
    か、または１〜数個のペプチド結合が、−CH2NH−，−C
    H2S−，−CH2CH2−，−CH＝CH−，−COCH2−，−CH（O
    H）CH2−及び−CH2SO−からなる群より選択された代替
    結合により置換されていることを意味し、先端切断型
    は、KGD配列を含んでなる少なくとも20アミノ酸を意味
    する、血小板凝集阻害ポリペプチド。
  3. 【請求項３】ビトロネクチンレセプターに対するビトロ
    ネクチンの結合またはフィブロネクチンレセプターに対
    するフィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質上
    より強力に、GP II b−III aに対するFgまたはvWFの結
    合を阻害する能力を有し、ここで、一定濃度のPAIで
    の、GP II b−III aに対するフィブリノーゲンまたはフ
    ォン・ウィルブランド因子の結合の阻害についての阻害
    のパーセントが、ビトロネクチンレセプターに対するビ
    トロネクチンの結合の阻害またはフィブロネクチンレセ
    プターに対するフィブロネクチンの結合の阻害について
    の阻害のパーセントの少なくとも２倍であるか、あるい
    は、50％の阻害を引き起こすPAIの濃度が、GP II b−II
    I aに対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブ
    ランド因子の結合の阻害に対して、ビトロネクチンレセ
    ブターに対するビトロネクチンの結合またはフィブロネ
    クチンに対するフィブロネクチンの結合の阻害に対して
    よりも少なくとも２倍少ないものである、PAIポリペプ
    チドであって、RGDあるいはKGDを含む、トリグラミン
    （trigramin）、エチスタチン（echistatin）、エレガ
    ンチン（elegantin）、アルボラブリン（albolabri
    n）、ラチェシン、フラボビリジン（flavoviridin）、
    エリスチコピン、テルゲミニン、アプラギン（applaggi
    n）、ビチスタチン（bitistatin）、ルベリン、セラス
    チン、コチアリン、クロタトロキシン、ホリジン、バシ
    リシン、ルトシン、モロシン、デュリシン、ジャララシ
    ン（jararacin）、セレベリン（cereberin）、オレガニ
    ン、ビリジン、およびバルボウリンからなる群から選択
    される、天然に存在するPAIまたはその先端切断型およ
    び／または改変型の一次構造を有し、ここで、改変型は
    KGD部分以外の配列の配列において１〜10のアミノ酸が
    置換されているか、または１〜数個のペプチド結合が、
    −CH2NH−，−CH2S−，−CH2CH2−，−CH＝CH−，−COC
    H2−，−CH（OH）CH2−及び−CH2SO−からなる群より選
    択された代替結合により置換されていることを意味し、
    先端切断型は、KGD配列を含んでなる少なくとも20アミ
    ノ酸を意味するものであり、該PAIまたはその先端切断
    型および／または改変型中に存在するRGD配列のＲ残基
    がＫ＊で置き代わり、あるいは該PAIまたはその先端切
    断型および／または改変型中に存在するKGD配列のＫ残
    基が、Ｋではない実施態様Ｋ＊で置き代わり、 ここでＫ＊は下式で表されるリジン残基であり、 R1 2N（CH2）4CHNHCO− 〔ここで各R1は独立にH,C1〜C6のアルキルであるか、ま
    たはどちらか一つのR1がR2−Ｃ＝NR3であり、 （ここでR2はH,C1〜C6のアルキル、または置換されるか
    非置換のフェニル残基またはベンジル残基であるか、あ
    るいはNR4 2であって各R4は独立にＨまたはC1〜C6のアル
    キルであり、そしてR3はH,C1〜C6のアルキル、フェニル
    またはベンジルであるか、またはR2−Ｃ−NR3は以下の
    群から選択される基であり、 ここでｍは２〜３の整数であり、各R5は独立にＨまたは
    C1〜C6のアルキルであり、）〕； そして１つまたは２つの（CH2）は、他の異種原子に隣
    接しないＯまたはＳで置換されていてもよい、前記ポリ
    ペプチド。
  4. 【請求項４】ビトロネクチンレセプターに対するビトロ
    ネクチンの結合またはフィブロネクチンレセプターに対
    するフィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質上
    より強力に、GP II b−III aに対するFgまたはvWFの結
    合を阻害する能力を有し、ここで、一定濃度のPAIで
    の、GP II b−III aに対するフィブリノーゲンまたはフ
    ォン・ウィルブランド因子の結合の阻害についての阻害
    のパーセントが、ビトロネクチンレセプターに対するビ
    トロネクチンの結合の阻害またはフィブロネクチンレセ
    プターに対するフィブロネクチンの結合の阻害について
    の阻害のパーセントの少なくとも２倍であるか、あるい
    は、50％の阻害を引き起こすPAIの濃度が、GP II b−II
    I aに対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブ
    ランド因子の結合の阻害に対して、ビトロネクチンレセ
    ブターに対するビトロネクチンの結合またはフィブロネ
    クチンに対するフィブロネクチンの結合の阻害に対して
    よりも少なくとも２倍少ないものである、PAIポリペプ
    チドであって、RGDあるいはKGDを含む天然に存在する、
    トリグラミン（trigramin）、エチスタチン（echistati
    n）、エレガンチン（elegantin）、アルボラブリン（al
    bolabrin）、ラチェシン、フラボビリジン（flavovirid
    in）、エリスチコピン、テルゲミニン、アプラギン（ap
    plaggin）、ビチスタチン（bitistatin）、ルベリン、
    セラスチン、コチアリン、クロタトロキシン、ホリジ
    ン、バシリシン、ルトシン、モロシン、デュリシン、ジ
    ャララシン（jararacin）、セレベリン（cereberin）、
    オレガニン、ビリジン、およびバルボウリンからなる群
    から選択される、PAIまたはその先端切断型および／ま
    たは改変型の一次構造において、１もしくは数個のアミ
    ノ酸が欠失および／または付加されたアミノ酸配列また
    はその先端切断型および／または改変型のアミノ酸配列
    を有し、ここで、改変型はKGD部分以外の配列の配列に
    おいて１〜10のアミノ酸が置換されているか、または１
    〜数個のペプチド結合が、−CH2NH−，−CH2S−，−CH2
    CH2−，−CH＝CH−，−COCH2−，−CH（OH）CH2−及び
    −CH2SO−からなる群より選択された代替結合により置
    換されていることを意味し、先端切断型は、KGD配列を
    含んでなる少なくとも20アミノ酸を意味するものであ
    り、該PAIまたはその先端切断型および／または改変型
    中に存在するRGD配列のＲ残基がＫ＊で置き代わり、あ
    るいは該PAIまたはその先端切断型および／または改変
    型中に存在するKGD配列のＫ残基が、Ｋではない実施態
    様Ｋ＊で置き代わり、 ここでＫ＊は下式で表されるリジン残基であり、 R1 2N（CH2）4CHNHCO− 〔ここで各R1は独立にH,C1〜C6のアルキルであるか、ま
    たはどちらか一つのR1がR2−Ｃ＝NR3であり、 （ここでR2はH,C1〜C6のアルキル、または置換されるか
    非置換のフェニル残基またはベンジル残基であるか、あ
    るいはNR4 2であって各R4は独立にＨまたはC1〜C6のアル
    キルであり、そしてR3はH,C1〜C6のアルキル、フェニル
    またはベンジルであるか、またはR2−Ｃ−NR3は以下の
    群から選択される基であり、 ここでｍは２〜３の整数であり、各R5は独立にＨまたは
    C1〜C6のアルキルであり、）〕； そして１つまたは２つの（CH2）は、他の異種原子に隣
    接しないＯまたはＳで置換されていてもよい、前記ポリ
    ペプチド。
  5. 【請求項５】ビトロネクチンレセプターに対するビトロ
    ネクチンの結合またはフィブロネクチンレセプターに対
    するフィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質上
    より強力に、GP II b−III aに対するFgまたはvWFの結
    合を阻害する能力があり、ここで、一定濃度のPAIで
    の、GP II b−III aに対するフィブリノーゲンまたはフ
    ォン・ウィルブランド因子の結合の阻害についての阻害
    のパーセントが、ビトロネクチンレセプターに対するビ
    トロネクチンの結合の阻害またはフィブロネクチンレセ
    プターに対するフィブロネクチンの結合の阻害について
    の阻害のパーセントの少なくとも２倍であるか、あるい
    は、50％の阻害を引き起こすPAIの濃度が、GP II b−II
    I aに対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブ
    ランド因子の結合の阻害に対して、ビトロネクチンレセ
    ブターに対するビトロネクチンの結合またはフィブロネ
    クチンに対するフィブロネクチンの結合の阻害に対して
    よりも少なくとも２倍少ないものである、特異的血小板
    凝集阻害（PAI）ポリペプチドであって、該PAIは下式で
    表され、 ここでＫ＊は下式で表されるリジン残基であり、 R1 2N（CH2）4CHNHCO− 〔ここで各R1は独立にH,C1〜C6のアルキル、またはどち
    らか一つのR1がR2−Ｃ＝NR3であり、 （ここでR2はH,C1〜C6のアルキル、または置換されるか
    非置換のフェニル残基またはベンジル残基であるか、あ
    るいはNR4 2であって各R4は独立にＨまたはC1〜C6のアル
    キルであり、そしてR3はH,C1〜C6のアルキル、フェニル
    またはベンジルであるか、またはR2−Ｃ−NR3は以下の
    群から選択される基であり、 ここでｍは２〜３の整数であり、各R5は独立にＨまたは
    C1〜C6のアルキルであり、）〕； そして１つまたは２つの（CH2）は、他の異種原子に隣
    接しないＯまたはＳで置換されていてもよく； AA1およびAA4はGly,AlaおよびSerからなる群から、各々
    独立して選択され、n1は０〜３の整数であり、n4は０〜
    ３の整数であり； AA2はトリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、
    チロシンおよびバリンからなる群から選択され、n2は０
    〜３の整数であり； AA3は下式で表わされるプロリン残基または改変された
    プロリン残基 （式中、１つまたは２つのメチレン基はNR,SまたはＯで
    置換されていてもよく、ＲはＨまたはアルキル）であ
    り、n3は０〜１の整数であり、 各々のX1およびX2は独立して、システイン、メルカプト
    プロピオニル、メルカプトバレリルおよびペニシラミン
    からなる群から選択される残基であり； 各々のY1およびY2は独立して、妨害作用の無い置換基で
    あるか、または存在しなくてもよく； ここで１つまたはそれ以上のペプチド結合は、−CH2NH
    −，−CH2S−，−CH2CH2−、シスおよびトランスの−CH
    ＝CH−，−COCH2−，−CH（OH）CH2−および−CH2SO−
    からなる群より選択される結合で、随意に置き換えられ
    てもよく： 但し、n3が０の場合には、 １）n2およびn4の合計が少なくとも２でなければなら
    ず；または ２）Ｋ＊がHarまたはＫ以外のものでなければならず；
    または ３）１つまたはそれ以上のペプチド結合が、前記代替結
    合で置き換えられている、いずれかである前記ポリペプ
    チド。
  6. 【請求項６】前記Y1が、Ｈ、アシル、またはペプチド残
    基またはその誘導型であるか、または存在せず、前記Y2
    が、OH,NH2またはペプチド残基またはその誘導型である
    か、または存在しない、請求項５に記載のPAIポリペプ
    チド。
  7. 【請求項７】前記Y2が、NH2,−Ａ−NH2、または存在し
    ない、請求項６に記載のPAIポリペプチド。
  8. 【請求項８】前記Y1が、Ｈ、アセチル、Ｇ、または存在
    しない、請求項６に記載のPAIポリペプチド。
  9. 【請求項９】前記X1およびX2が、システイン（Ｃ）、メ
    ルカプトプロピオニル（Mpr）およびペニシラミン（Pe
    n）からなる群から選択される、請求項５に記載のPAIポ
    リペプチド。
  10. 【請求項１０】前記AA1がＧであり、n1が０または１で
    ある、請求項５に記載のPAIポリペプチド。
  11. 【請求項１１】前記AA2が、W,F,L、ＹおよびＶからなる
    群から選択される、請求項５記載のPAIポリペプチド。
  12. 【請求項１２】前記AA2がＷである、請求項11に記載のP
    AIポリペプチド。
  13. 【請求項１３】前記Ｋ＊がK,Har、アセチミジル−Lys、
    またはフェニルイミジル−Lysである、請求項５に記載
    のPAIポリペプチド。
  14. 【請求項１４】ビトロネクチンレセプターに対するビト
    ロネクチンの結合またはフィブロネクチンレセプターに
    対するフィブロネクチンの結合を阻害するよりも、実質
    上強力に、GP II b−III aに対するフィブリノーゲンま
    たはフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害する能力
    を有し、ここで、一定濃度のPAIでの、GP II b−III a
    に対するフィブリノーゲンまたはフォン・ウィルブラン
    ド因子の結合の阻害についての阻害のパーセントが、ビ
    トロネクチンレセプターに対するビトロネクチンの結合
    の阻害またはフィブロネクチンレセプターに対するフィ
    ブロネクチンの結合の阻害についての阻害のパーセント
    の少なくとも２倍であるか、あるいは、50％の阻害を引
    き起こすPAIの濃度が、GP II b−III aに対するフィブ
    リノーゲンまたはフォン・ウィルブランド因子の結合の
    阻害に対して、ビトロネクチンレセブターに対するビト
    ロネクチンの結合またはフィブロネクチンに対するフィ
    ブロネクチンの結合の阻害に対してよりも少なくとも２
    倍少ないものである、以下の群から選択される、PAIポ
    リペプチド。
  15. 【請求項１５】以下の群から選択される、請求項14に記
    載のPAIポリペプチド。
  16. 【請求項１６】以下の群から選択される、請求項15に記
    載のPAIポリペプチド。
  17. 【請求項１７】Mpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2であ
    る、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  18. 【請求項１８】Mpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ（ホルミル）−Ｐ
    −Ｃ−NH2である、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  19. 【請求項１９】Mvl−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2であ
    る、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  20. 【請求項２０】Mpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Pen−NH2で
    ある、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  21. 【請求項２１】Mpr−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−（Pip）−Pen−N
    H2である、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  22. 【請求項２２】Mpr−（Har）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH
    2である、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  23. 【請求項２３】Mpr−（Har）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Pen−N
    H2である、請求項16に記載のPAIポリペプチド。
  24. 【請求項２４】Mpr−（アセトイミジル−Lys）−Ｇ−Ｄ
    −Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2である、請求項16に記載のPAIポリペ
    プチド。
  25. 【請求項２５】Mpr−（アセトイミジル−Lys）−Ｇ−Ｄ
    −Ｗ−Ｐ−Pen−NH2である、請求項16に記載のPAIポリ
    ペプチド。
  26. 【請求項２６】Mpr−（フェニルイミジル−Lys）−Ｇ−
    Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−NH2である、請求項16に記載のPAIポリ
    ペプチド。
  27. 【請求項２７】Mpr−Har−Ｇ−Ｄ−Ｗ−（3,4−デヒド
    ロ−Pro）−Ｃ−NH2である、請求項16に記載のPAIポリ
    ペプチド。
  28. 【請求項２８】請求項１〜15のいずれか１項に記載のPA
    Iポリペプチドを血栓形成を防止する有効量で、薬学的
    に許容される賦形剤と混合して含有する、血栓形成を防
    止するための薬学的組成物。
  29. 【請求項２９】請求項１〜15のいずれか１項に記載のPA
    Iポリペプチドを血小板に関連した虚血性症候群を治療
    するのに有効量で、薬学的に許容される賦形剤と混合し
    て含有する、血小板に関連した虚血性症候群を治療する
    ための薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】体外の血液循環の間に血小板の損失を防
    止する方法であって、被験体から取り出された血液に、
    請求項１〜15のいずれか１項に記載のPAIポリペプチド
    を接触させることを包含する、方法。
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