HU216318B

HU216318B - Eljárás a vérlemezkék aggregálódását gátló szerek, és az előállításukhoz alkalmas DNS-szekvenciák, vektorok és gazdasejtek előállítására

Info

Publication number: HU216318B
Application number: HU905490A
Authority: HU
Inventors: Israel F. Charo; Robert M. Scarborough; David Lawrence Wolf
Original assignee: Cor Therapeutics Inc.
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1999-06-28
Also published as: JP3281370B2; AU6036990A; NO982249D0; CA2059124A1; HUT59835A; JPH05500750A; NO312965B1; DE19975072I2; EP0477295B1; FI104364B; FI915919A0; NO914962D0; ATE146969T1; US5958732A; DE69029579T2; DE69029579D1; EP0477295A1; NO2000008I2; NL990043I1; DE19975072I1

Abstract

A találmány tárgya eljárás tisztítőtt, vérlemezke-aggregálódást gátló(VAG) szer előállítására, melynek sőrán kígyóméregből a fibrinőgénés/vagy vőn Willebrandt-faktőr GP IIb–IIIa-hőz kötő ését specifikűsangátló, és a vitrőnektin kötődését a vitrőnektin-receptőrhőz vagy afibrinőgén kötődését a fibrinőgénreceptőrhőz viszőnylag kevésbégátőlni képes VAG-kőmpőnenst izőlálják. Ugyancsak találmány tárgya afenti szer rekőmbináns előállításáhőz szükséges nűkleinsav-szekvencia,az azt tartalmazó vektőrők és gazdasejtek előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya

A találmány olyan peptidek csoportjára vagy azok származékaira vonatkozik, amelyeket különböző kígyómérgekből izoláltunk, tisztítottunk, és gátolják a vérlemezkék (trombociták) összeállását (aggregálódását) (VÁG). Ezek a peptidek hasznos gyógyító anyagok a vérlemezkékkel kapcsolatos vérzési rendellenességek kezelésében, illetve megelőzésében. Konkrétabban, a találmány olyan peptidekre vonatkozik, amelyek blokkolják a vérlemezkék megtapadásában és összeállásában részt vevő adhéziós proteinek specifikus receptorait. Továbbá, a találmányban leírjuk a fenti proteinek kimutatására és a megfelelő homogenitású anyag kígyóméregből történő tisztítására szolgáló módszereket, csakúgy, mint ezen polipeptidek elsődleges aminosavszekvenciáinak felhasználásával történő aktív fehérjék készítését, akár szintetikus úton, akár rekombináns DNS-módszereken keresztül.

Irodalmi háttér

A legtöbb nyugati társadalomban az elhalálozás elsődleges oka a szívbetegség. A szívbetegség következtében bekövetkező halál gyakran a vérlemezkefüggő vérzési szindrómák hatására következik be, amelyeket az atherosclerosis és az arteriosclerosis iniciálnak, és közéjük tartoznak még az akut szívizominfarktus, krónikus unstabil angina, átmeneti iszkémia vagy iszkémiás roham, perifériális keringési betegségek, arteriális trombózis, praeclampsia, embólia, érplasztikát követő resztenózis és/vagy trombózis, nyaki verőér endarteritis, átültetett szövetek ezen egybenyílása, krónikus kardiovaszkuláris eszközök (például behelyezett katéter vagy összenövések). Ezekről az ér-összehúzódási és elzáródás! rendellenességeket reprezentáló szindrómákról feltételezik, hogy a véredények falán vagy a lumenben, vér eredetű mediátorokkal történő trombocitaaktiválás váltja ki őket, amely a vér áramlását csökkentő vértesieket képző vérlemezke-aggregátumok képződésében nyilvánul meg.

Számos tanulmány járult hozzá a vérlemezke-aggregálódás és a vérrögképződés mechanizmusának megértéséhez. A vérlemezkék válaszolnak a véredények különböző sérüléseire, mint a lumen szűkülése, plakkképződés, az idegen testek megjelenése (például katéter) és ehhez hasonlók. A vérlemezkék válasza ezekre a sérülésekre olyan tulajdonságok következménye, mint az összetapadás és az aktiválódás, valamint a vérlemezke-részecskék komponenseinek kiszabadulása, amelyek közé tartoznak például a sejtes mitogén faktorok. Az aktivált vérlemezke-aggregátumok indukálják a fibrin képződését, amely tovább stabilizálja a trombusokat.

Elég sokat tudunk azokról a mechanizmusokról, amelyek ezeket a válaszreakciókat szabályozzák. Bár a stimulálatlan vérlemezkék rendelkeznek az adhéziós fehérjék receptoraival [ilyenek például a lamininreceptorok (VLA 2, VLA 6) és a kollagénreceptorok (VLA 2, GPIV stb.)], úgy tűnik, hogy a vérlemezkék kezdeti megtapadása a szubendotéliumhoz a vérlemezke glikoprotein membránnak (GP) az immobilizált von Willebrand-faktorhoz való kötődésén keresztül történik. Az ezt követő vérlemezke-aktiválást egy vagy több ismert fiziológiai tényező iniciálja, mint például ADP, epinefrin, trombin, kollagén és a tromboxán A2.

A vérlemezke aggregálódása a felületén lévő GP Ilb-IIIa komplexen keresztül megy végbe, A GP Ilb-IIIa komplex inaktív formában található a stimulálatlan vérlemezkék felületén. Amikor a vérlemezkék az adhézió és a fiziológiai tényezők által aktiválódnak, a GP Ilb-IIIa komplex szintén aktivált formába kerül, úgyhogy receptorként szerepel a fibrinogén (Fg), a von Willebrand-faktor (vWF) és a fibronektin (Fn) számára, amint azt Phillips és munkatársai, Blood (1988) 77:831-843 leírják. Ugyanakkor a fibrinogén és/vagy a von Willebrand-faktor kötődése az, amelyről feltételezik, hogy elsődlegesen felelős a vérlemezkék aggregálódásáért és a vérrög képződéséért in vivő körülmények között. Ezért azok az anyagok, amelyek specifikusan gátolják a fibrinogén vagy a von Willebrand-faktor kötődését a GP Ilb-IIIa komplexhez, megakadályozzák a vérlemezkék aggregálódását, és jelöltek lehetnek az in vivő vérrögképződés gátlására.

A vérlemezke GP Ilb-IIIa komplexéről most már tudjuk, hogy a strukturálisan összefüggő adhéziós fehérjereceptor család tagja, amelyet összefoglalóan „integrineknek” neveznek. Csakúgy, mint a GP Ilb-IIIa, valamennyi integrin két alegységből áll, a nagyobb alfa-alegységből (például a GP Ilb) és a kisebb béta-alegységből (például a GP Illa). Az integrin alegységek ismert szekvenciái közötti homológia foka meglehetősen magas, ami jelzi, hogy az integrinek egy közös őstől származnak. Az integrinek a sejtek adhéziójában vesznek részt, és megtalálhatók a leukocitákban, az endotéliális sejtekben, a simaizom sejtjeiben és a keringési rendszer egyéb sejtjeiben. Mivel az integrinek széles körben elterjedtek, míg a GP Ilb-IIIa csak a vérlemezkékre korlátozódik, a legjobb aggregálódást gátló szer szelektíven gátolná a GP Ilb-IIIa-t az egyéb integrinekkel szemben.

Számos peptidcsoportot leírtak, amelyek blokkolják az adhéziós fehérjék kötődését az aktivált vérlemezkékhez, és így megakadályozzák a vérlemezkék aggregálódását (például Hawiger és munkatársai, 4,661,471 US szabadalom; Rouslahti és munkatársai, 4,614,517 számú, 4,578,079 számú, 4,792,525 számú US szabadalom; és a GB 2,207,922A számú egyesült királyságbeli szabadalom). A peptidek egyik osztályában az RGDszekvencia kritikus, és specifikusan az RGDS-, RGDT-, RGDC-szekvencíákat használják. Az RGDX aminosavszekvenciát megtalálták több, különböző adhéziós fehérjében, például Fg, Vn, vWF és Fn. A szekvenciáról kimutatták, hogy fontos szerepet játszik az adhéziós fehéijék és receptoraik közötti kölcsönhatás során, mert ezen szekvenciát tartalmazó peptidek blokkolják az adhéziós fehérjék kötődését, amint azt az alábbi közleményekben leírták: Pierschbacher, M. D. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1987), 262: 17294-17298; Ruggeri és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1986), 53:5708-5712; Rouslahti és munkatársai, Cell (1986) 44:517-518. Ezen szekvenciát tartalmazó tetrapeptideket közzétettek az 1989. június 7-én publikált 319, 506 közzétételi számú EP találmányban. Az RGD-szek2 venciákban az arginin helyett homoarginint tartalmazó rövid peptideket a WO 89/07609 számú, 1989. augusztus 24-én közzétett PCT találmányban írták le.

Az RGD-tartalmú peptidekben megengedett strukturális variációkat Pierschbacher, M. D. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (fentebb) fedezték fel. Kutatásaik során azt találták, hogy az RGD-tartalmú szekvenciák manipulálása nemcsak a fibronektin vagy a vitronektin szubsztráthoz kötődésének gátlására vonatkozó aktivitásra van hatással, de befolyásolhatja a két ligand kötődése közötti különbséget is. Modellpeptidként a GRDSPC szekvenciájú peptidet használták, amelyet a fíbronektinsejt összetapadási doménjéből vettek. Bizonyos helyettesítések, mint például az L-Arg D-Arg-ra történő kicserélése úgy tűnik, hogy nincs hatással a ligand kötődésére sem, de a D-Ala kicserélése Gly-re, vagy a D-Asp helyettesítése L-Asp-val elrontja az inhibíciós aktivitást. Míg a D-Ser helyettesítése L-Ser-nel csökkentette a vitronektin és receptora közötti kölcsönhatás gátlását, addig nagyon kis hatással volt a fibronektin és receptora közötti kölcsönhatásra; az Asn helyettesítése Ser-nel azt eredményezte a peptidben, hogy megnőtt a fibronektin kötődésének gátlása, és csökkent a vitronektin kötődésére gyakorolt hatás. Egyéb, Ser-nel történt helyettesítéseknek nem volt hatásuk. Treonin kicserélése Ser-re egy olyan peptidet eredményezett, amelyben megnövekedett a vitronektinreceptorhoz történő kötődés gátlása; az L-Pro helyettesítése inaktív fehéijéhez vezetett. Ciklikus peptidet is készítettek a Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-ProCys-Ala szekvenciából, ahol a „Pen” penicillinamin és a diszulfídhíd a Pen és Cys között jön létre. A szerzők szerint a penicillinamin funkciója a gyűrű szerkezeti stabilitásának növelése, mivelhogy az N-terminális Gly és a karboxiterminális Alá hozzáadódott a szabad amino- és karboxicsoportok gyűrűn belüli távolságához. Ez a gyűrűs peptid képes volt sokkal erősebben gátolni a vitronektin kötődését, mint a ciklizálás előtti peptid, de hatástalan volt a fibronektin kötődésének gátlásában.

Az utóbbi időben Sámánén és munkatársai J. Cell. Biochem. (1990) Suppl. 14A :A229 közleményükben leírtak egy trombózis elleni peptidet, amelyben az RGD-szekvenciában az „R”-származék alkilálva van. A szerkezet és a biológiai aktivitás közötti összefüggés áttekintését Ali, F. E. és munkatársai publikálták a Proc. llth Am Peptide Symp, Marshall és munkatársai (szerkesztők) ESCOM Leiden 1990 összefoglalóban.

Az 1989. november 15-én nyilvánosságra hozott 341,915 közzétételi számú európai szabadalomban leírnak két peptidcsoportot, az egyik lineáris, a másik ciklikus, amelyekről azt mondják, hogy kötődnek a vérlemezkék GP Ilb-IIIa receptorához, és így gátolják annak vWF, fibronektin és fibrinogén-fibrin megkötő képességét. Ezen peptidek kötődésének specifitására vonatkozó adatokat nem közölnek. A ciklikus peptidek csoportja tartalmazza az RGD-szekvencia módosításait, amelyekben az R ki van cserélve D- vagy L-homoargininre, dimetil- vagy dietil-argininre, lizinre, vagy ezeknek egy alfa-helyzetben alkilált származékára. A minimális ciklikus szerkezet pusztán az „R”GDszekvenciából áll, amely diszulfidhidat képező származék között van összekapcsolva.

A gátlópeptidek egy külön osztálya olyan peptidszekvenciát használ fel, amelynek karboxiterminális szekvenciája a fibrinogén gamma-láncából származó dodekapeptid: HHLG-GAQKAGDV [Kloczewiak és munkatársai, Biochemistry (1989), 25:2915-2919; Timmons és munkatársai (Ibid), 2919-2923, 4,661,471 számú US szabadalom; 298,280 számú EP találmány]. Bár ez a szekvencia meggátolja a vWF és a Fg kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz és az ezt követő vérlemezke-aggregálódást, a peptid használhatóságát korlátozza, hogy az affinitása a vérlemezke-receptorhoz alacsony (IC₅₀=10-100 μΜ).

Az utóbbi időben számos csoport izolált kígyóméregből és jellemzett alacsony molekulasúlyú polipeptidfaktorokat, amelyeknek affinitása különösen nagy a GP Ilb-IIIa komplexhez. Huang, T.-F. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1987), 262·. 16 157-16 163; Huang, T.-F. és munkatársai, Biochemistry (1989), 28:661-666 közleményeikben leírják a trugramin elsődleges szerkezetét, egy RGD-motívumot és 6 diszulfidhidat tartalmazó 72 aminosavból álló peptidet, amelyet a Trimeresurus gramineus-bó\ izoláltak. Gan, Z.-R. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1989), 263:19827-19 832 leírják az Echis carinatus-bó\ izolált echistatin tulajdonságait és szerkezetét, amely egy 49 aminosavból álló peptid, és szintén tartalmaz RGD-motívumot és 4 feltételezett diszulfidhidat. Williams, J. A. és munkatársai, FASEB Journal (1989), 3: A310, Abstr. No. 487m beszámolnak a rokon peptidek, az elegantin, alborabrin és flavoviridin szekvenciájáról és tulajdonságairól. Továbbá a bitistatin jellemzését Shebusky, R. J. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1989), 264:21 550- 21556 írják le; az Agkistrodon piscivorus piscivorus-bó\ származó VAGról Chao, Β. H. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), 56:8050-8054 számoltak be. A kígyómérgekből származó különböző GP Ilb-IIIa antagonisták közötti összefüggést Dennis, M. S. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), 57:2471-2475 diszkutálják meg.

A kígyóméregből izolált inhibitorpeptidek csoportja magában foglalja a Trimeresurus alborabris-bó\ izolált alborabrint, a T. e/egans-ból izolált elegantint, a T. flavoviridis-ból izolált flavoviridint, a Bothrops alrox-ból izolált batroxostatint, a Niewiarowski, S. és munkatársai, Thromb Haemostas (1989), 62:319 (Abstr. SY-XIV-5) által leírt, a Bitis arietans-ból izolált bitistatint. Az appiagint az Agkistrodon p. piscivorus-ból izolálták, és Chao, B. és munkatársai, Thromb Haemostas (1989), 62:50 (Abstr. 120) írták le, a halusint az Agkistrodon halys-ból tisztították, és Huang, T. F. és munkatársai számoltak be róla a Thromb Haemostas (1989), 62:48 (Abstr. 112) számában. Valamennyi peptid magas fokú homológiát mutat. Ráadásul valamennyi közölt peptid, amelyet kígyóméregből izoláltak, és gátolják az adhéziós fehéqék kötődését az integrinreceptorokhoz, tartalmazza az RGD-szekvenciát.

Bár ezek a közölt kígyóméregfaktorok hatásos aggregációinhibitorok in vitro, ezek a peptidek az adhé3

HU 216 318 Β zióspeptid-receptorok egyéb csoportjához is, mint például a vitronektin- és a fibronektin-receptorok, nagy affinitással kötődnek Rnudsen, B. és munkatársai, Exp. Cell. Rés. (1988), 779:42-49, valamint Rucinski, B. és munkatársai, Thromb haemostas (1989), 62:50 (Abstr. 120) közleményei szerint. A kígyóméregfaktorok spécii! tásának hiánya a GP Ilb-IIIa komplexre nem kívánatos a vérrögképződés gátlását szolgáló terápiás célokra történő felhasználás során, mert emiatt potenciálisan hatással lehetnek az érrendszerben lévő egyéb sejtek adhéziós tulajdonságaira, különösen azoknál, ahol az adhézió az integrineken keresztül történik.

A vérlemezke-trombusokat gátló szerek készítésére kifejlesztett egyéb megközelítés a murin anti-GP Ilb-IIIa monoklonális ellenanyagok használata volt, amelyek blokkolják az adhéziós proteineknek a kezelt vérlemezkékhez történő kötődését. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat használták a szívkoszorúér-elzáródások megakadályozására kutyában, szöveti plazmonogén aktivátorral végzett átáramoltatás után [Yasuda, T. és munkatársai, J. Clin. Invest. (1988), 81: 1284-1291] és a ciklikus áramláscsökkenés megakadályozására sérült kutyafélék szívkoszorú artériáiban nagyfokú érszűkület esetén. Ilyen monoklonális ellenanyag használatának lehetséges mellékhatása emberekben jelentkezhet a hosszú ideig tartó hatások és a lehetséges immunológiai válaszok miatt.

Természetes, hogy további terápiás célokat szolgáló diéta szükséges a nemkívánatos vérrögképződés megelőzésére vagy legalább enyhítésére. Különleges esetekben a vérrögképződés gátlására vagy blokkolására specifikus helyeken képes terápiás szerek, amelyek nem változtatják meg a hemosztázist és nincsenek hatással egyéb sejtes adhéziókra, előnyösen lennének használhatók kezelési célokra. Ideális esetben ezeknek hatásosnak, GP Ilb-IIIa komplexre specifikusnak és a legtöbb beteg esetében nem immunogéneknek kellene lenniük; legyenek még könnyen alkalmazhatók, stabilan és gazdaságosan előállíthatok is. További követelmény még, hogy ezek a szerek átmenetileg hassanak, és ne lépjenek kölcsönhatásba a hosszú idejű hemosztázissal. A találmány mindezeknek és még egyéb követelményeknek is eleget tesz.

A találmány leírása

A találmány egy egyszerű átvizsgálást eljáráson alapul a kígyóméregben vagy egyéb biológiai forrásokban lévő alacsony molekulatömegű (<10 kd) faktorok azonosítására, amelyek specifikusan gátolják a vérlemezkeaggregálódáson keresztül történő vérrögképződést. Az eljárás felhasználja annak megértését, hogy a vérlemezkék aggregálódására elsősorban a fibrinogén és/vagy a vWF GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődése van hatással, amikor a vérlemezkéket a megfelelő szerekkel kezeljük, mint például az ADP. Ezen feltételek felhasználásával, mármint hogy a fibrinogén és/vagy a vWF izolált receptorokhoz történő kötődésének gátlása és egyéb analóg feltételek, amelyek a fibronektinnek (Fn) a fibronektin-receptorhoz (Fn/FnR) való kötődésére, és a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz (Vn/VnR) való kötődésére, csakúgy, mint egyéb más faktorok, mint az Fn és Vn GP Ilb-IIIa-hoz való kötődésére vonatkoznak, a vérlemezke-aggregálódás gátlására gyorsan és kényelmesen kaphatunk specifikus profilt. Ezt a megközelítést használtuk a kígyómérgek széles körének átvizsgálására és jellemzésére, hogy vajon tartalmaznak-e VAG-ot, a belőlük azonosított VÁG specifitásának jellemzésére, abból a szempontból, hogy milyen a GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődés gátlásának specifitása az egyéb integrinekhez viszonyítva, és aktív peptidek azonosítására, amelyek ezen VAG-szerek származékai.

Az egyik szempont szerint a találmány a biológiai folyadékok gyors átvizsgálásának módszerén alapul, amellyel megállapítható a VÁG jelenléte vagy hiánya, és amely módszer magában foglalja a folyadék érintkezésbe hozását az izolált GP Ilb-IIIa komplexszel a tesztreakcióban, fibrinogén jelenlétében, és ebben a tesztreakcióban a GP Ilb-IIIa-hoz kötött fibrinogén mennyiségének összehasonlítását a kontrollreakcióban a GP Ilb-IIIa-hoz kötött fibrinogén mennyiségével. A módszer magában foglalja továbbá a teszt- és a kontrollreakciókat, amelyek tartalmazzák az Fn kontaktusba hozását az Fn-receptorral, a Vn kontaktusba hozását a Vn-receptorral, az Fn-t a GP Ilb-IIIa-val vagy a vWF-et a GP Ilb-IIIa-val, annak érdekében, hogy jellemezzük a VÁG specificitását.

Egy másik szempont szerint a találmány izolált formában lévő új VAG-szerek előállítására irányul, amelyeket a találmány módszere alapján azonosítottunk, és izolálhatok az aktív kígyóméregből. Különösen vonatkozik a találmány azokra a VAG-szerek izolált formáira, amelyek Echis colorata, Eristicophis macmahonii,

A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorous conanti, Bothrops asper, Bothrops cotiara,

B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus,

C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis, Lachesis mutas, Sistrurus catenatus tergeminus és Sistrurus milarus barbouri kígyófajokból izolálhatóak.

Azokat az izolált formában lévő és aminosavszekvenciával bíró VAG-szereket részesítjük előnyben, amelyeket az alábbi fajokból készítettünk: Eristicophis macmahonii (eristicophin), Bothrops cotiara (cotiarin), B. jararacussu, Crotalus atrox (crotatroxin), Crotalus basilicus (basilicin), C. cerastes cerastes (cerastin), C. durissus totonatacus (durissin), C. durissus durissus (durissin), C. h. horridus (horridin), Crotalus m. molossus (molossin), C. ruber ruber (ruberin), Crotalus viridis lutosus (lutosin), C. v. viridis (viridin), Crotalus v. oreganus (oreganin), Crotalus v. helleri, Lachesis mutas (lachesin), Sistrurus catenatus tergeminus (tergeminin) és 5. milarus barbouri (barbourin).

Különösen kedveltek az eristicophin, cotiarin, crotatroxin, cerastin, durissin, horridin, ruberin, lachesin, basilicin, lutosin, molossin, oreganin, viridin, tergeminin és barbourin.

A találmány szintén magában foglalja a fent leírt szekvenciájú peptidek előállítását, amelyek a természet4 ben előforduló peptidek csonkított és/vagy módosított formái és/vagy azokat, amelyekben egy, illetve több peptidkötést egyéb kötés(ek)re cseréltünk, mint például -CH₂-NH- vagy -CH₂CH₂-.

Egy leginkább hangsúlyozott szempontból a találmány azon izolált VAG-szerek és azok csonkított és/vagy módosított formái előállítására vonatkozik, amelyek a fenti módszerrel aktívnak bizonyult kígyóméregből azonosíthatók, és kimutattuk róluk, hogy specifikusan gátolják a fibrinogén (Fn) és a von Willebrand-faktor (vWF) kötődését.

Még egy másik szempont szerint a találmány a kígyóméreg VAG-szerének izolált formájára vonatkozik, amelyben az adhéziósprotein-receptorhoz való kötődésért felelős szekvencia magában foglalja a KGD-szekvenciát.

Egy másik fő szempont szerint a találmány általában peptidek vagy peptidszerű komponensek előállítására vonatkozik, amelyek vérlemezke-aggregálódást gátlók, és nagyobb mértékben képesek az Fg vagy a vWF GP Ilb—Illa komplexhez való kötődésének gátlására, mint amilyen mértékben gátolják a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz vagy fibronektinnek a fibronektinreceptorhoz való kötődését. Ezeket a peptideket azzal lehet jellemezni, hogy az első mesterséges VAG-ban talált RGDX kötőszekvencia helyett K*GDX a kötőszekvencia. A K* egy szubsztituált vagy nem szubsztituált, az

-R'₂N(CH₂)₄CHNHCOképletű lizilszármazék, ahol az R¹ lehet H vagy egy szubsztituens, amely megfelelő elektrondonor, így nem változtatja meg a szomszédos nitrogén bázikus jellegét, és ahol egy vagy két metilénszármazék tetszés szerint helyettesíthető O-nel, S-nel, amint azt fentebb leírtuk. A 5. milarus barbouri-bó\ izolált barbourin vérlemezke-aggregálódást gátló szer az egyik képviselője ennek a peptidsorozatnak. Ennek a pepiidnek rövidebb formái is használhatók, csakúgy, mint az analóg szekvenciák, amelyek szintén 1-10 aminosavszármazék-módosulást tartalmaznak valahol a peptidláncban és/vagy egyes peptidkötések másikra vannak cserélve. A natív RGDX-szekvenciájú, izolált VAG-peptidek egyéb illusztris képviselői közé tartoznak azok, amelyekben a K*GDX-szekvencia található. Csakúgy, mint a barbourin esetében, a többi izolált VÁG is előfordulhat natív formában vagy megcsonkítva, és/vagy tartalmazhat 1-10 aminosavszármazék szubsztitúciót vagy deléciót, és/vagy lehetnek benne peptidkötésekre cserélt nem peptidkötések.

A találmány tárgykörébe eső egyéb komponensek csoportja az, amelyben a már említett komponenseket leírtuk, kivétel, ha az RGD- vagy K*GD-szekvenciában a glicilszármazékot szarkozilszármazék helyettesíti. A komponensek ezen osztálya megtartja az adott RGDvagy K*GD-tartalmú peptidek képességét és specifitását.

A képviselők egy másik csoportjába olyan peptidek vagy módosított peptidek tartoznak, amelyek specifikus VAG-aktivitással rendelkeznek, és képletük a következő :

Yj-X^AA.jH.-K^G/Sar-D-ÍAA^-ÍAAjb-(AA₄)_n4-X₂-Y₂ (1) ahol K* az R'₂N(CH₂)₄CHNHCO képlet szubsztituált vagy nem szubsztituált lizilszármazéka, ahol minden R¹ lehet H, alkil (1-6 C), vagy legtöbbször R²-C=NR³, ahol R² lehet H, alkil (1-6 C), szubsztituált, illetve nem szubsztituált fenil- vagy benzilszármazék, vagy NR⁴2, amelyben R⁴ H vagy alkil (1-6 C) csoport és

R³ lehet H, alkil (1-6 C), fenil, benzil, vagy

R²-C=NR³ az alábbi képletekből választott gyök lehet

ahol m értéke 2-3, és minden R⁵ lehet H vagy alkil (1-6 C) csoport, és amelyekben egy vagy két (CH₂)-t O vagy S helyettesítheti, és az O, illetve S szomszédságában nem fordul elő másik heteroatom;

AA[ egy kis semleges (poláris vagy nempoláris) aminosav, és ni 0-3 közé eső egész szám;

AA₂ egy semleges, nempoláris, nagy (aromás vagy nem aromás), vagy poláris aromás aminosav, és n2 0-3 közé eső egész szám;

AAj egy prolinszármazék vagy módosított prolinszármazék (amint azt lentebb meghatározzuk), és n3 0 vagy 1;

AA₄ egy semleges, kis aminosav, vagy annak Nalkilált formája, és n40-3 közé eső egész szám;

valamennyi X! és X₂ olyan származékok, amelyek képesek kötéseket létrehozni az X] és X₂ között, és ezáltal ciklikus komponenst képezni; és valamennyi Y! és Y₂ reakcióba nem lépő szubsztituensek, vagy hiányozhatnak is;

amelyben egy vagy több peptidkötés tetszőlegesen helyettesíthető az alábbi kötések közül bármelyikkel: -CH₂NH-, -CH₂S-, CH₂CH₂-, -CH=CH- (cisz és transz), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- és -CH₂SO-;

azzal a feltevéssel, hogy n3=0; akkor

1) n2 és n4 összege legalább 2 kell hogy legyen;

2) K* nem lehet Har vagy K; vagy

3) X[ és X₂ közül legalább az egyik nem lehet Cys (C), penicillinamin (Pen) vagy 2-amino-3,3-ciklopentán-metilén-3-merkapto-propionsav (APmp); vagy

4) Yj vagy Y₂ legalább egy aminosavszármazék legyen;

5) egy vagy több peptidkötést a nevezett egyéb kötés helyettesít.

A találmány egyéb szempontjai ezen peptidek vagy a rokon peptidek szintézisével összefüggő rekombináns módszerekre és anyagokra, az in vitro szintézis módszerére, ezeket az összetevőket tartalmazó gyógyászati összetételekre, és azokra a módszerekre vonatkoznak, amelyek ezen komponensek és összetételek felhaszná5 lásával gátolják a vérlemezkék aggregálódását és a vérrög képződését.

A rajzok rövid leírása

Az 1. ábra bemutatja a fíbrinogén GP Ilb-IIIa-hoz való kötődésének gátlását részlegesen tisztított kígyóméreggel.

A 2. ábra bemutatja a méreg Centricon-10 ultraszűrlet adhéziógátlásának mennyiségi viszonyait mind fibrinogén/GP Ilb-IIIa, mind vitronektin/vitronektinreceptor tesztekben.

A 3. ábra bemutatja az Eristicophis macmahonii mérgéből származó tisztítatlan VÁG HPLC-képét. A vonalkázott terület a biológiailag aktív frakciót tartalmazza.

A 4. ábra bemutatja a 3. ábra VÁG-frakciójának HPLC-képét. A vonalkázott terület a biológiailag aktív frakció.

Az 5. ábra bemutatja a 4. ábra VAG-frakciójának analitikai HPLC-képét.

A 6. ábra bemutatja a következő peptidek aminosavszekvenciáit: eristicophin, barbourin, tergeminin, cerastin, ruberin, lachesin, cotiarin, crotatroxin, horridin, lutosin, viridin, molossin, basilicin, durissin, jararacin, cereberin és oreganin, valamint az automata Edman-roncsolással meghatározott, enzimmel emésztett fragmenteket.

A 7. ábra bemutatja a Sistrurus c. tergeminus mérgének G-50-es gélen végzett VAG-ffakcionálásának HPLC-képét.

A 8. ábra bemutatja a 7. ábra VAG-frakciójának HPLC-képét.

A 9. ábra bemutatja a 8. ábra tisztított VAG-frakciójának aktivitását a kötődés gátlásában néhány receptorral végzett teszt esetében.

A 10. ábra bemutatja a Sistrurus m. barbouri mérgéből G-50-es gélen végzett frakcionálással kapott vérlemezke-aggregálódást gátló HPLC-képét. A vonalkázott terület a biológiailag aktív frakció.

All. ábra bemutatja a 10. ábra aktív VAG-frakciójának HPLC-képét.

A 12. ábra összehasonlítja számos VÁG aminosavszekvenciáját a barbourinnal.

A 13. ábra bemutatja a Lachesis mutas mérgéből származó, tisztítatlan VÁG HPLC-képét. A vonalkázott terület tartalmazza a biológiailag aktív frakciókat.

A 14. ábra bemutatja a 13. ábra aktív VAG-frakcióinak HPLC-képét. A vonalkázott terület tartalmazza a biológiailag aktív frakciókat.

A 15. ábra bemutatja a Lachesis mutas-ból származó, a 14. ábrán bemutatott aktív VAG-frakció analitikai HPLC-profilját.

A 16. ábra bemutatja a Crotalis viridis viridis mérgéből származó, tisztítatlan VÁG HPLC-képét. A vonalkázott terület tartalmazza a biológiailag aktív frakciókat.

A 17. ábra bemutatja a 16. ábra VAG-frakcióinak HPLC-képét.

A 18. ábra bemutatja a tisztított, kígyóméreg eredetű peptidek mennyiségi viszonyainak hatását a fibrinogén/GP Ilb-IIIa kötés gátlására, az echistatinhoz viszonyítva.

A 19. ábra bemutatja a tisztított, kígyóméreg eredetű peptidek mennyiségi viszonyainak hatását, az ADPvel (4 μΜ) indukált emberi vérlemezke-aggregálódás gátlására a vérlemezkében gazdag plazmában (PRP), echistatinhoz viszonyítva.

A 20. ábra bemutatja a C. c. cerastes mérgéből HPLC-vel elválasztott VÁG aktivitási profilját.

A 21. ábra bemutatja a 20. ábra aktív frakcióinak HPLC-elemzésének eredményeit.

A 22. ábra bemutatja a C. ruber ruber mérgéből HPLC-vel elválasztott VÁG aktivitási profilját.

A 23. ábra bemutatja a C. atrox-ból kapott homogén peptiddel analitikai C-18 oszlopon végzett elemzés aktivitási profilját.

A 24. ábra bemutatja a Bothrops cotiara-ból izolált homogén peptid analitikai HPLC-profilját.

A 25. ábra bemutatja a tisztított cotiarin mennyiségi viszonyainak hatásait a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIahoz és a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz való kötődésének gátlására.

A 26. ábra bemutatja a kígyóméregből tisztított peptidek hatását a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz és a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz való kötődésének gátlására.

A 27. ábra bemutatja az #1 analóg {[E²⁸, L⁴¹, C⁶⁴]barbourin(28—73)} kötési aktivitásának eredményeit, a GP Ilb-IIIa és vitronektin-receptorhoz képest.

A 28. ábra bemutatja a szintetikus eristicophin analógnak a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését gátló képességét, és azt, hogy nem képes gátolni a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz való kötődését.

A 29. ábra bemutatja a lineáris és ciklikus RGDWkomponenseknek és a lineáris és ciklikus KGDW-komponenseknek a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését gátló képességét.

A 30. ábra bemutatja a különböző KGDW analógok azon képességeit, hogy gátolják a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését és a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz való kötődését.

A 31. ábra bemutatja a különböző természetes és szintetikus vérlemezke-aggregálódást gátló szerek azon képességeit, hogy gátolják az M21 melanoma sejt megtapadását a vitronektinhez.

A 32. ábra bemutatja az RGDS és a ciklikus RGDkomponens azon képességét, hogy gátolják az M21 melanoma sejtek megtapadását a vitronektinhez, és hogy a ciklikus KGDW analóg nem képes gátolni az M21 melanoma sejtek vitronektinhez való kötődését.

A 33. ábra bemutatja a 60-as számú analóg, Mpr(Har)-G-D-W-P-C-NH₂ aktivitását a vérlemezkék aggregálódásának és a sejtek adhéziójának gátlásában.

A 34. ábra bemutatja a 33. ábrán közölt aktivitást a 19-es számú analóg, az Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂esetében.

A 35. ábra bemutatja a ciklikus áramcsökkenések (CFRs) iniciálását a trombózis nyitott mellkasú kutya modelljén (Folts-modell).

A 36. ábra bemutatja egy 10 mg-os kapszula alkalmazásának hatását a CFR-ekre Folts-modellben.

A 37. ábra bemutatja egy 40 mg-os kapszula alkalmazásának hatását a CFR-ekre Folts-modellben.

A 38. ábra bemutatja a barbourin aminosavszekvenciáját (1-73) kódoló teljes szálú DNS-szekvenciát.

A 39. ábra bemutatja a PhoA vezető szekvenciához ligáit [M-lL41]barbourin(l-73)-at kódoló DNS-szekvenciát.

A 40. ábra bemutatja a baktériumban történő expresszáltatás céljából a PhoA vezető szekvenciához ligáit, az #1 analógot kódoló DNS-szekvenciát.

A 41. ábra bemutatja az #1 analógot kódoló DNSszakasz előállítása során a PCR-reakcióban használt oligonukleotidokat. Az analógban lévő aminosavakat félkövér betűk jelzik.

A 42. ábra bemutatja az #1 analógot kódoló DNS egymás után következő ismétlődéseinek csatlakozószekvenciáit.

A 43. ábra tandem ismétlődésekként mutatja be a csonkított barbourin gene diagramját.

A találmány megvalósítási módjai

A találmány kígyóméregből izolálható vérlemezkeaggregálódást gátló (VÁG) szereket nyújt, amelyeket a találmány tesztrendszerével aktívként azonosítottunk; kínálja továbbá azokat a komponenseket, amelyeknek hasonló szerkezetük van, és a standard in vitro technikákkal szintetizáltuk őket, szilárd fázisú peptidszintézis vagy a rekombináns módszerek vagy ezek kombinációinak felhasználásával. Néhány gátlószer egyedien specifikus a vérlemezke-aggregálódás gátlására, és nem gátol egyéb kötődést az integrinek családján belül. Másoknak különböző a specifitási tartományuk. Az alábbi fejezetekben leírjuk a kígyóméregben természetesen előforduló VÁG izolálását; olyan gátlószerek tervezését, amelyek K*GD-szekvenciának az RGD-szekvencia helyére való beépítése révén lényegesen jobban gátolják a vérlemezkék aggregálódását, mint például vitronektin/vitronektin-receptor kölcsönhatását; ezen peptidek szintézisének módszereit; a rekombináns termelés módszereit; a találmány peptidjei ellen termelt ellenanyagokat; a tesztmódszert, amely lehetővé teszi VAGtartalmú kígyómérgek azonosítását; a találmány VAGszereinek felhasználását és alkalmazását.

A VAG-szer egy faktort jelent, amely képes a kezelt vérlemezkék aggregálódásának megakadályozására a standard tesztekben, amilyeneket például Gan, Z.-R. és munkatársai, és Huang, T.-F. és munkatársai írtak le. Ezekben a tesztekben mosott vérlemezkéket kevertünk össze fibrinogénnel, Ca²⁺-mal és a tesztelni kívánt anyaggal. A vérlemezkéket ADP-vel (vagy egyéb ismert stimulátorral, illetve ezek kombinációjával) kezeltük, és az aggregálódást vagy annak elmaradását például a kereskedelemben hozzáférhető aggrométer felhasználásával mértük.

A találmány tárgyát képező néhány VAG-szert úgy azonosítottunk, mint a fibrinogén és/vagy a vWF GP Ilb-IIIa-hoz való kötődésének specifikus gátlószerét. Ismert, hogy a specificitás különböző fokozatú, így az Fg vagy a vWF GP Ilb-IIIa-hoz való kötődése gátlására „specifikus” VÁG lényegesen jobban gátolja ezt a kötést, mint az Fn FnR-hez, illetve a Vn VnR-hez való kötődését. A „lényegesen jobban” kifejezést azt jelenti, hogy vagy a gátlás %-a legalább kétszer akkora a VÁG egy adott koncentrációjában, vagy a VÁG koncentrációja, amely 50% gátlást okoz, legalább kétszer kevesebb az Fg vagy vWF/GP Ilb-IIIa kötés gátlása esetében, mint más ligand/receptor kötéseknél.

Izolált, természetes VÁG, és tisztítási módszerek

A találmány tárgyát képező vérlemezke-aggregálódást gátló (VÁG) szerek olyan alacsony molekulatömegű peptidekből állnak, amelyeket az alábbiakban leírt módon készíthetünk kígyóméregből, amelyek „aktívnak” bizonyultak, ugyanis a találmány módszerét használva úgy találtuk, hogy tartalmaznak VAG-ot.

A találmány módszere lehetővé teszi a hatásos VÁG jelenlétének kimutatását a kígyóméregben, majd jellemzését, az ilyen VÁG egyéb integrinekhez, mint például a vitronektin- és fibronektin-receptorhoz képest, szelektíven gátolja a GP Ilb-IIIa kötését. Az azonosítást és a kívánt és optimális jellemzést követően a VÁG izolálható és tisztítható az itt bemutatott és a szakirodalomban leírt különböző standard technikák felhasználásával. Például a molekulaméreten alapuló elválasztás (tipikusan a 10 kd alatti anyagok visszanyerésére), az ioncserélő kromatográfia és a reverz fázisú HPLC kombinációi használhatók. Egyéb technikák is alkalmazhatók, de bármely aktív kígyóméregből az alábbi jól kivitelezhető VAG-izolálási módszert javasoljuk:

Körülbelül 10-1000 mg mérget feloldunk hígított ecetsavban, és méret alapján elválasztó oszlopra, például Sephadex-G50-re visszük, és ugyanazzal az oldószerrel eluáljuk. Megmérjük a frakciók aktivitását a találmány Fg/GP Ilb-IIIa kötődési tesztjének alkalmazásával, egy standard vérlemezke-aggregálódási teszttel (VAT=PAA), vagy bármilyen hasonló teszttel, amely az adhéziós proteineknek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötési aktivitására vonatkozik. Egy másik módszerrel a méreg frakciójának 10 kd alatti frakciója ultraszűréssel visszanyerhető és hasonló módon tesztelhető.

A bármelyik módszerrel izolált alacsony molekulatömegű frakciót preparatív, C-18 HPLC-oszlopra, például a Waterstől beszerezhető C-18 Delta Pák reverz fázisú oszlopra vittük, amelyet előzőleg 0,1%-os trifluor-ecetsav (TFA)/8% acetonitril-oldattal telítettünk. A megkötött VAG-ot azután 0,1% TFA 8%-tól 60%-ig terjedő acetonitril-koncentrációjú gradiensével eluáltuk. A koncentráció és a térfogatáram emelkedését a rutineljárások felhasználásával optimalizáltuk. Az aktív frakciókat a VAT-teszttel vagy a találmány receptorkötési módszerével határoztuk meg. Az aktív frakciókat ez után összegyűjtöttük, betöményítettük, és ellenőriztük a homogenitásukat analitikai HPLC és SDS-PAGE alkalmazásával. A továbbiakban rezerv fázisú HPLCgradiens tisztítást alkalmaztunk addig, amíg a visszanyert VÁG homogén nem lett.

A találmány tárgyát képező VAG-szerek hozzáférhetők a fentebb leírt vagy egyéb tisztítási módszerekkel az alábbi csoportba tartozó kígyók mérgeiből: Echis colorata, Eristicophis macmahonii; A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorous conanti; Bothrops asper, Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jara7 racussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli; Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis; Lachesis mutas; Sistrurus catenatus tergeminus és Sistrurus milarus barbouri.

Azokat az izolált formában lévő és ismert aminosavszekvenciával bíró VAG-szereket részesítjük előnyben, amelyeket az alábbi fajokból készítettünk: Eristicophis macmahonii (eristicophin), Bothrops cotiara (cotiarin), B. jararacussu, Crotalus atrox (crotatroxin), Crotalus basilicus (basilicin), C. cerastes cerastes (cerastin), C. durissus totonatacus (durissin), C. durissus durissus (durissin), C. h. horridus (horridin), Crotalus m. molossus (molossin), C. ruber ruber (ruberin), Crotalus viridis lutosus (lutosin), C. v. viridis (viridin), Crotalus v. oreganus (oreganin), Crotalus v. helleri, Lachesis mutas (lachesin), Sistrurus catenatus tergeminus (tergeminin) és A. milarus barbouri (barbourin).

A találmány tárgyát képező tisztított VAG-szerek a standard módszerekkel szekvenálhatók, így lehetővé válik a szintézisük a standard, szilárd fázisú technikákkal (különösen a VAG-ok rövidebb formája esetében), vagy a rekombináns DNS-módszerrel történő előállításuk. A peptid piridil-etilálását vagy karboxi-amidometilálását követően használható például az Applied Biosystem Sequenator rendszere, amint azt Huang és munkatársai, / Bioi. Chem. (1987), 262:16 157-16163 leírják, majd ezt követően történik a minta sótalanítása C-18 Delta Pák oszlopon 0,1% TFA és acetonitril felhasználásával.

Ismert, hogy a meghatározott szekvenciájú, izolált VÁG szekvenciája, ha in vitro szintetizáljuk, módosítható olyan változtatásokkal, amelyek nem teszik tönkre az aktivitást. Általában ezen módosított formák 1-10, még inkább 1 -4 aminosav módosításában különbözni fognak a természetes formáktól vagy csonkított formában jelennek meg. Ráadásul egy vagy több peptidkötést helyettesíthet más kötés is, amint azt lentebb leíijuk. Az egyik különösen kedvelt helyettesítés az RGD kicserélése K*GD-re, a GP Ilb-IIIa specifitás megerősítése végett.

A Sistrurus m. barbouri mérgében lévő VAG-ot homogenitásig tisztítottuk, szekvenáltuk, és elneveztük „barbouriri’-nak. Az eddig azonosított GP Ilb-ÜIa-hoz tapadó fehéijékkel és a kígyóméregből eddig kivont peptidekkel, amelyek blokkolják a GP Ilb-IIIa fünkcióját ellentétben a barbourin nem tartalmazza az adhéziós proteinek irodalomból ismert, standard Arg-Gly-Asp szekvenciát. A barbourinban a Lys-Gly-Asp-(Trp) tűnik a kötőszekvenciának. Különösen meglepő a KGDszekvencia jelenléte a peptid kötőrégiójában annak a megfigyelésnek a fényében, hogy az RGDX-szekvencián alapuló kicsi szintetikus peptidekben a Lys kicserélése Arg-ra drámaian csökkenti ezen peptideknek az integrinreceptorokhoz való kötődését, amint azt Pierschbacher és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984), 67:5985-5988; Williams és munkatársai, Thromb Rés. (1987), 46:457 -471; Huang és munkatársai,/. Bioi. Chem. (1987), 262:16157-16 163 közleményekben leírják. Úgy gondoljuk, hogy ez a szubsztitúció felelős részben az Fg és vWF GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődését gátló barbourinpeptid specificitásáért, illetve például a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz való kötődésének gátlásáért.

A K*GDX-tartalmú peptidek

A találmány módszerével izolált barbourinpeptidről kimutattuk, hogy a kötésért felelős szekvenciája KGDX, ellentétben az eddig a szakterületen megismert egyéb VAG-szerekben talált RGDX-szekvenciával. Úgy tűnik, hogy a KGDX jelenléte a VAG-szekvenciában kapcsolt a GP Ilb-IIIa-hoz preferált affinitással, ami ellentétes a vitronektin- vagy a fibronektin-receptorokkal. A szekvenciában a lizilszármazék argininnel történő helyettesítésének hatása úgy tűnik, hogy kapcsolt az oldallánc megnövekedett hosszával, ami egybeesik a nitrogén megmaradt bázíkusságával, amint azt az alábbiakban leijük. Meglepő módon nem a lizilszármazék az, amely felelős a megnövekedett aktivitásért és specifitásért, hanem a kicserélt arginin homológ kiterjesztésével kapott tér ennek az oka. így a találmány peptidjei, amelyek a kötőszekvenciában K*GDX-szekvenciát tartalmaznak, lényegesen jobban képesek az Fg vagy vWF GP Ilb-IIIa-hoz való kötésének gátlására, mint a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz és a fibronektinnek a fibronektin-receptorhoz való kötésének a gátlására. Mint azt fentebb megállapítottuk, a kívánt kötést „lényegesen jobban” gátolja kifejezés azt jelenti, hogy a gátlás százaléka legalább kétszer nagyobb az adott inhibitorkoncentráció esetén, vagy az 50%-os gátlást okozó VAG-koncentráció legalább kétszer kisebb az Fg-nek, illetve vWF-nak a GP Ilb-IIIa-hoz való kötése esetében, mint az egyéb ligandoknak más integrinekhez való kötődése esetén.

A használt K* egy lizilszármazékra vonatkozik, amely nem szubsztituált, vagy amely az epszilon-aminocsoport hidrogénjei helyett tartalmaz szubsztituenseket. A szubsztituenseknek megfelelő elektrondonoroknak kell lenniük ahhoz, hogy a nitrogénatom, amelyhez kapcsolódnak, megtartsa a bázikusságát. így a K*-t az alábbi képlet lizilszármazékaként határozzuk meg:

-Rⁱ2N(CH₂)₄CHNHCO-, ahol minden R¹ lehet H, alkil (1-6 szénatom) vagy a legtöbb esetben R¹ R²-C=NR³, ahol R² lehet H, alkil (1-6 C), vagy szubsztituált, illetve nem szubsztituált fenil- vagy benzilszármazék, vagy NR⁴2, amelyben R⁴ lehet H vagy alkil (1 -6 C), és

R³ lehet H, alkil (1 - 6 C), fenil vagy benzil, esetleg

R²-C=NR³ az előzőekben már megadott képletekből választott gyök lehet, ahol m értéke 2-3, és minden R⁵ lehet H vagy alkil (1-6 C) csoport, és amelyekben egy vagy két (CH₂)-t O vagy S helyettesítheti, és az O, illetve S szomszédságában nem fordul elő másik heteroatom.

Az „alkil”-t a kényelem kedvéért egyenes vagy elágazó láncú, illetve ciklikus szénhidrogén-származékként határoztuk meg, amely a feltüntetett számú szénatomból áll, mint például a metil, etil, izopropil, n-hexil, 2-metil-butil, ciklohexil és hasonlók.

Az R²-t helyettesítő benzil- vagy fenilszármazékok lehetnek nem szubsztituáltak vagy tartalmazhatnak nem zavaró szubsztituenseket. A kedvező szubsztitúciók azok, amelyekben csak egy szubsztituens kötődött az aromás maghoz, leginkább a 4-es pozícióban. A kedvező szubsztituensek elektront adó szubsztituensek, mint az alkilek, például etil, metil vagy fenil.

A K* kedvező megtestesítői közé tartoznak a lizin, homoarginin, formil-homoarginin, omitin, acetimidil lizin, N^GN^G etilén homoarginin és fenilimidil lizinszármazékok. A fenilimidil lizinszármazék képlete például:

-Ph-C(=NH)-NH(CH₂)₄CH(NH-)CO-.

Úgy tűnik, hogy a kötés kedvező gátlásához elengedhetetlen a K* helyettesítése R-rel az RGDX-motívumban. A találmány peptidjeinek vagy peptidszerű komponenseinek egyik osztálya a természetben előforduló vérlemezke-aggregálódást gátló anyagokból áll, amelyek közönségesen tartalmazzák az RGDX-motívumot a kötőszekvenciában, miáltal ezek a formák módosított állapotban vannak a K* R-re cserélése miatt. A találmányba beletartoznak ezt a szubsztitúciót tartalmazó természetes peptidek csakúgy, mint az adhéziós proteineknek a GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődésének szelektív gátlásához elegendő hosszúságú fragmentjeik, és a fragmentek vagy teljes láncú peptidek, amelyek olyan lényegtelen szubsztitúciókat tartalmaznak a peptid azon pozícióiban, amiben nem rontják el az aktivitást. Amennyiben a konformációt például ciklizálás határozza meg, a fragmentek a legnagyobb részben tartalmazni fognak a legalább 7 aminosavnyi peptidlánc hosszának megfelelő származékokat, és a lánc hosszabb lesz, ha nincs ilyen konformációs kontroll. Általában a K*GDX-motívum mellett szükség van további szek1 46

ECADGLCCDQCRFLKKGTVCRVAKGDWNDDTCTGQSCDCPRNGLYG 28 73 és a [K²⁹]eristicophin(4-51)-et:

51

EEPCATGPCCRRKFKRAGKVCRVAKGDWNNDYCTGKSCDCPRNPWNG 4 51

Ebben az elnevezésben a név után, a kerek zárójelben a fragment mérete található a benne előforduló aminosavak számával jelölve, a szögletes zárójelben a nagybetűk és a számok a teljes láncú peptid számozott pozíciójában lévő aminosavszubsztitúciókat tüntettük fel. így a fenti barbourinfragment esetében a fragment hossza a natív szekvencia 28-73 aminosavak közötti szakaszából származik, és az eredetileg a természetes szekvencia 28, 41 és 64 pozícióiban lévő aminosavakat Glu-ra (E), Leu-ra (L) és Cys-re (C) cseréltük.

További példaként a trigraminban, elegantinban, albolabrinban, crotatroxinban, flavoviridinben, echistatinban, bitistatinban, viridinben, molossinban, lutosinban, basilicinben, applaginban, halysinben, horridinben, tergemininben, lachesinben, cotiarinban, cereberinben, venciára is, ami lehet 1-10, 1-4, vagy még inkább 1-3 aminosavszubsztitúció a peptideknek nem a K*GDX-részében.

Ráadásul az RGDX- vagy K*GDX-motívum G-je szarkozinszármazékkal helyettesíthető.

Továbbá egy vagy több peptidkötés tetszőlegesen kicserélhető helyettesítő kötésre, amelyet redukcióval vagy eliminációval kapunk. így egy vagy több -CONHpeptidkötés kicserélhető más típusú kötésre, mint például -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cisz és transz), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- és -CH₂SO-, a szakterületen ismert módszerekkel. A következő referenciákban megtalálhatók a peptidanalógok készítésének azon módszerei, amelyek magukban foglalják ezeket az egyéb kötési részeket: Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3,,.Peptid Backbone Modifications” (általános áttekintés); Spatola, A. F. in „Chemistiy and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins”, B. Weinstein, ed., Marcell Dekker, New York, p. 267 (1983) (általános áttekintés); Morley, J. S., Trends Pharm. Sci. (1980), pp. 463 -468 (általános áttekintés); Hudson, D. és munkatársai, Int. J. Pept. Prot. Rés. (1979), 14:177-185 (-CH₂NH-, -CH₂CH₂-); Spatola, A. F. és munkatársai, Life Sci. (1986), 35:12431249 (-CH₂S-); Hann, Μ. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982), 307-314 (-CH=CH- cisz és transz); Almquist, R. G. és munkatársai, J. Med. Chem. (1980), 23:1392-1398 (-COCH₂-); Jennings-White, C. és munkatársai, Tetrahedron Lett. (1982), 23:2533 (-COCH₂-); Szelke, M. és munkatársai, European Appln. EP 45665 (1982), CA:97:39405 (1982) [-CH(OH)CH₂-]; Holladay, M. W. és munkatársai, Tetrahedron Lett. (1983), 24:4401-4404 [-CH(OH)CH₂-] és Hruby, V. J., Life Sci. (1982), 37:189-199 (-CH₂S-). Különösen kedvelt a -CH₂NH- kötés.

A fragmentekre és a természetben előforduló kígyóméreg VAG-szerekre példaként megemlíthetjük az alábbi szekvenciájú [E²⁸,L⁴¹,C⁶⁴]barbourin(28-73)-at:

jararacinben, kistrinben, eristicophinban, bitanaban és a ruberin/oreganinban előforduló RGD-szekvencia argininje kicserélhető K*-származékra a GP Ilb-IIIa affinitásra specifikus VÁG előállítása végett. Ráadásul termé50 szetes peptidekből elkészíthető ezen peptidek rövidebb formái, amelyek legalább 20, 30 vagy még inkább 40 aminosavat tartalmaznak. Továbbá, illetve alternatív megoldásként az RGD/K*GD-szekvenciához nem illő 1-10 vagy még inkább 1-4 aminosav helyettesíthető vagy módosítható lehetőség szerint konzervatív aminosavszubsztituensekkel. A konzervatív aminosavszubsztituens alatt értjük például a savas aminosav savas aminosavszármazékkal, semleges semlegessel, bázikus bázikussal stb. történő helyettesítését, amint azt a későbbiek60 ben leírjuk.

Egy másik csoportba tartoznak azok a példák, amelyekben az RGD-, illetve K*GD-szekvencia glicilszármazékát kicseréljük szarkozilra, az aktivitás megtartása mellett. Ily módon az izolált és/vagy a fentebb leírt egyéb módokon módosított VAG-szerek ezzel a helyettesítéssel tovább módosíthatók.

Amíg a kígyóméregből származó fragmentek és/vagy módosított VAG-szerek az RGD K*GD-re történő kicserélésével az Fg/vWF/GP Ilb—Illa kötésre specifikus komponensek közé tartozhatnak, a találmány további képviselői, a specifikus aktivitású fehérjék a K*GD lehetséges kiteijesztésén alapulnak.

Ebben a vonatkozásban a találmány peptidjeinek vagy peptidszerű komponenseinek csoportját az alábbi általános képlettel jellemzett ciklikus peptidek alkotják: Y.-X^AA.jm-K^G/Sar-D-ÍAAAj-fAA^-(AA₄)_n4-X₂-Y₂ (1) ahol K* a fentebb definiált szubsztituált vagy nem szubsztituált lizilszármazék,

AAj egy kis semleges (poláris vagy nempoláris) aminosav, és ni 0-3 közé eső egész szám;

AA₂ egy semleges, nempoláris, nagy (aromás vagy nem aromás) vagy poláris aromás aminosav, és n20-3 közé eső egész szám;

AA₃ egy prolinszármazék vagy módosított prolinszármazék (amint azt lentebb meghatározzuk), és n3 értéke 0 vagy 1;

AA₄ egy semleges, kis aminosav, vagy annak Nalkilált formája, és n4 0-3 közé eső egész szám;

valamennyi Xj és X₂ olyan származékok, amelyek képesek kötéseket létrehozni az X! és X₂ között, és ezáltal ciklikus komponenst képezni; és valamennyi Y, és Y₂ reakcióba nem lépő szubsztituensek, vagy hiányozhatnak is;

amelyben egy vagy több peptidkötés tetszőlegesen helyettesíthető az alábbi kötések közül bármelyikkel: -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cisz és transz), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- és -CH₂SO-;

azzal a feltevéssel, hogy n3=0; akkor

1) n2 és n4 összege legalább 2 kell hogy legyen;

2) K* nem lehet Har vagy K; vagy

3) Xj és X₂ közül legalább az egyik nem lehet Cys (C), penicillinamin (Pen) vagy 2-amino-3,3-ciklopentán-metilén-3-merkapto-propionsav (APmp); vagy

4) Yj vagy Y₂ legalább egy aminosavszármazék legyen;

5) egy vagy több peptidkötést a nevezett egyéb kötés helyettesít.

Y| és Y₂ lehetnek 0-25 aminosavszármazékból álló peptidek vagy azok származékai. Az N-terminális kiterjesztés, az Y [ lehet például acetilált vagy acilált, a Cterminális kiterjesztés, az Y₂ lehet amidált az NH₂-val, illetve az R-NH₂ vagy R₂NH képletű első-, illetve másodrendű amidjaival, amelyekben az R kis szénatomszámú (1 -4 C) alkil, mint metil, n-butil vagy t-butil. Az Y] is lehet H vagy acil; Y₂ lehet -OH, NH₂- vagy egy fenti amin. Ha az (1) képlet komponense egyszerű ciklikus peptid, az Y, és Y₂ hiányoznak.

Az Xj és X₂ tipikusan ciklizálásra képes aminosavszármazékok, mint például a ciszteinszármazékok, amelyek diszulfidgyűrű kialakítására képesek. Mindamellett egyéb diszulfid- vagy más kötés létrehozására képes származék is használható, mint például a Fierschbacher és munkatársai által leírt Pen (penicillinamin) származék, az Mpr (merkapto-propionil) vagy az Mvl (merkapto-valeril) származék. A ciklizálásra lehetőséget biztosító kovalens kötések egyéb típusai közé tartoznak a peptidkötések, mint például a lizilszármazék oldalláncában lévő aminocsoport és a glutamilszármazék oldalláncában lévő karboxicsoport között kialakult amid- és észterkötések, mint például a treoninszármazék oldalláncában lévő alkohol és az aszpartilszármazék oldalláncának karboxilcsoportja közötti észterkötés. Használható bármilyen megfelelő származék, amely képes peptidkötést létrehozni a lánc (vagy a módosított peptidkötés) maradék részével, és a ciklizálás létrehozására képes kovalens kötés képzésére. Ezek közé tartoznak például az egyszerű gyűrűs peptidek, amelyekben közvetlenül az N-terminális -NH₂-csoportja és a karboxiterminális -COOH-csoportja között jön létre a peptidkötés.

Amint azt fentebb leírtuk, egy vagy több kötés kicserélhető más kötéstípusra, mint például -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cisz és transz), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- és -CH₂SO-.

A fenti AAj—AA₄ aminosavszármazékokat megjelöléskor az osztályozási módszer alapján írtuk le, amelyben az aminosavszármazékokat négy alosztályba soroltuk. Ezt az osztályozást az alábbiakban bemutatjuk.

Savas: Az a származék, amelynek fiziológiás pHértéken a H-ion elvesztése miatt negatív töltése van, és vonzza a vizes fázis, így a peptid konformációjában keresi azt a felületi pozíciót, amelyben elhelyezkedhet, amikor a peptid fiziológiás pH-értéken van vizes közegben.

Bázikus: Az a származék, amelynek fiziológiás pHértéken, a H asszociációja miatt pozitív töltése van, és vonzza a vizes fázis, így a peptid konformációjában keresi azt a felületi pozíciót, amelyben elhelyezkedhet, amikor a peptid fiziológiás pH-értéken van vizes közegben.

Semleges/apoláris: Az a származék, amelynek fiziológiás pH-η nincs töltése, és a vizes fázis taszítja, így a peptid konformációjában keresi azokat a belső pozíciókat, amelyben elhelyezkedhet, amikor a peptid vizes közegben van. Ezeket a származékokat „hidrofóboknak” is nevezzük.

Semleges/poláris: Az a származék, amelynek fiziológiás pH-η nincs töltése, és vonzza a vizes oldat, így a peptid konformációjában keresi azt a külső pozíciót, amelyben elhelyezkedik, amikor vizes közegben van.

Ismert természetesen az, hogy az egyedi molekulák statisztikusan megoszlanak töltött és nem töltött származékokra, és nagyobb vagy kisebb arányban lesznek olyanok, amelyeket vonz a vizes fázis, és lesznek, amelyeket taszít. A „töltött” meghatározás azt jelenti, hogy fiziológiás pH-értéken az egyedi molekulák jelentős százaléka (legalább 25%) töltéssel rendelkezik. Az osztályozáshoz szükséges vonzás és taszítás foka, csakúgy, mint a poláris és nempoláris jelleg meghatározása önkényes, ezért az aminosavakat a találmány speciális megfontolásai szerint osztályoztuk. A legtöbb, nem speciálisan nevezett aminosav osztályozható az ismert viselkedésük alapján.

Az aminosavszármazékok tovább osztályozhatók ciklikus és nem ciklikus, illetve aromás és nem aromás aminosavakra. Önként adódó osztályozás a származékok oldalláncában lévő szubsztituensek szerinti, és a méret alapján kicsi vagy nagy osztályokba történő beso- 10 rolás. Kicsinek tartjuk azt a származékot, amely összesen 4 vagy annál kevesebb szénatomot tartalmaz, beleértve a karboxil szénatomját is. A kicsi származékok természetesen soha nem aromásak.

A természetben előforduló aminosavak osztályozása a fenti séma szerint a következő:

Savas: Aszparaginsav és Glutaminsav

Bázikus/nem ciklikus: Arginin, Lizin

Bázikus/ciklikus: Hisztidin

Semleges/poláros/kicsi: Glicin, Szerin és Cisztein

Semleges/poláros/nagy/nem aromás: Treonin,

Aszparagin, Glutamin

Semleges/poláros/nagy/aromás: Tyrozin

Semleges/nem poláros/kicsi: Alanin

Semleges/nem poláros/nagy/nem aromás: Valin,

Izoleucin, Leucin, Metionin

Semleges/nem poláros/nagy/aromás: Fenil-alanin és Triptofán.

A gének által kódolt aminosav a prolin, bár technikailag a semleges/nem poláros/nagy/ciklikus és nem aromás 30 csoport tagjai közé tartozik, a peptidláncok másodlagos szerkezetére gyakorolt ismert hatása miatt egy speciális eset is, meg nem is, ezért ebbe a meghatározott csoportba, de külön osztályozzuk. Az AA₃-at prolinszármazékként vagy „módosított prolinszármazékként” határozzuk meg. 35 A prolin, mint tudjuk, egy öttagú heterociklusos molekula egy karboxilcsoporttal a 2-es pozícióban. A módosított prolinszármazékok valamennyien öt- vagy hattagú heterociklusos molekulák, a nitrogénhez viszonyítva alfa

Az aminosavak osztályozási rendszere

Savas: Glu (E), Asp (D) ; Ciszteinsav

Nem ciklikus: Lys (K), Arg helyzetben lévő karboxilcsoportokkal; ráadásul heteroatomok is tagjai lehetnek a gyűrűnek. így a módosított prolinszármazékok közé tartoznak a pipekolsav-származékok (2-karboxi-piperidin, rövidítve: Pip) és a tiazolidin 5 (Thz). így a prolin- vagy módosított prolinszármazékok a következő képlettel jellemzett anyagok:

(Cya) (R); Orinitin (Orn);

ahol egy vagy két metiléncsoportot NR, S vagy O helyettesíthet, és amelyben bármely, gyűrűben lévő nitro15 gént szubsztituálhat egy nem reagáló csoport, például alkil.

Bizonyos jelentős aminosavak, amelyek genetikailag nem kódoltak, mint például a béta-alanin (béta-ala) vagy egyéb omega-aminosavak, mint például 3-amino20 propionsav, 4-amino-butirilsav stb., alfa-amino-izobutilsav (AiB), szarkozin (Sár), omitin (Om), citrullin (Cit), homoarginin (Har), t-butil-alanin (t-BuA), t-butilglicin (t-BuG), N-metil-izoleucin (N-Melle), fenilglicin (Phg) és ciklohexil-alanin (Cha), norleucin (Nle), 25 ciszteinsav (Cya), pipekolsav (Pip), tiazolidin (Thz), 2naftil-alanin (2-Nal) és a metionin-szulfoxid (MSO). A kényelem kedvéért ezeket is különböző kategóriákba soroltuk.

A fenti meghatározás alapján a Sár és a béta-ala semleges/nem poláros/kicsi; a t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle és Cha semleges/nem poláros/nagy/nem aromás;

a Har és az Om bázikus/nem ciklikus; a Cya savas;

a Cit, Acetil Lys és MSO semleges/poláros/nagy/ nem aromás;

a 2-Nal és Phg semleges/nem poláros/nagy/aromás; a Pip és Thz módosított prolinszármazék.

A fentiek az alábbi ábrán szemléltethetőek:

homoarginin (Har)

Bázikus:!

Ciklikus: His (H)

Az aminosavak osztályozási rendszere (folytatás)

Cys (C) Gin (Q) Xle (I)

Cit	Sár	tBuA
MSO	Beta-ala	tBuG
Acetil Lys	Aib	N-Melle Nle Cha

Phg

A különböző omega-aminosavakat méret alapján a semleges/nem poláros/kicsi (béta-ala, 3-amino-propionsav, 4-amino-butiril) vagy nagy (az összes többi) osztályba soroltuk. Egyéb aminosavszubsztitúciók, amelyek genetikailag kódoltak, szintén beletartozhatnak a találmány tárgykörébe eső peptidek csoportjába, és osztályozhatók e szerint az általános séma szerint.

A találmányt megtestesítőkből választott reprezentánsok képleteiben az amino- és karboxiterminális csoportok, bár gyakran külön nem tüntetjük fel őket, ha másként nem jelezzük, természetszerűleg beletartoznak abba a formába, amelyet a peptidek fiziológiás pH-értéken felvesznek. így az N-terminális H⁺2 és a karboxiterminális CT fiziológiás pH-η jelen van, bár nem szükségszerűen hangsúlyozzuk ki és mutatjuk be akár a speciális, akár az általános képletekben. Természetesen a bázikus és savas sók, amelyek nem fiziológiás pH-értéken képződnek, szintén a találmány komponensei közé tartoznak. Amennyiben másként nem jelezzük, a származékok L-konfigurációban vannak; az általános képletekben a specifikált származékok lehetnek L- vagy D-formában is. Általában a találmány peptidjeiben 0, 1 vagy 2 D-formájú származék van, legkedvezőbb a 0 vagy az 1, de leginkább a 0. A bemutatott peptidekben valamennyi kódolt származék megfelelőjét egy betű jelöli, amely megfelel az aminosav triviális nevének, és az alábbi listában tüntetjük fel:

Aminosav Egybetűs jele

Alanin A

Arginin R

Aszparagin N

Aszparaginsav D

Cisztein C

Glutamin Q

Glutaminsav E

Glicin G

Hisztidin H

Izoleucin I

Leucin L

Lizin K

Metionin M

Fenil-alanin F

Prolin P

Szerin S

Treonin T

Triptofán W

Tirozin Y

Valin V

Piroglutaminsav Z

A genetikailag nem kódolt aminosavakra a fent jelzett rövidítéseket használjuk.

A leírásban bemutatott speciális peptidekben bármely aminosav optikai izomériája az L-forma, illetve amennyiben másként van, jól kifejezően a következő szimbólummal jelöljük (t). Mialatt a találmány peptidjeinek származékai természetes állapotban L optikai izomerek, előfordulhat, hogy egyet vagy kettőt, de az egy kedvezőbb, kicserélünk D-formára.

Szabad funkciós csoportok, amelyekbe beletartoznak a karboxi- és aminoterminálisok is, szintén módo12

HU 216 318 Β síthatók, amidálással, acilálással vagy egyéb szubsztitúcióval, amely például megváltoztatja a komponens oldékonyságát anélkül, hogy hatással lenne az aktivitására.

A találmány amidált peptidjeinek képzésekor közvetlenül szintetizálhatok analóg komponensek, például Boc-AA_x-pMBHA-gyanta vagy Boc-AA_X-BHAgyanta felhasználásával, amelyben az AA_X a tervezett pepiidnek egy karboxiterminális aminosava, amint azt a későbbiekben részletesen leírjuk. Egy másik megoldásként a szintézist követően a találmány peptidjei kémiailag vagy enzimatikusan amidálhatók a szakterületen jól ismert módokon, vagy standard folyadékfázisú peptidszintézis-protokollokkal elkészíthetők.

A találmány de novo peptidjeinek bizonyos képviselőjét előnyben részesítjük. A K*(G/Sar)D-szekvenciában a G/Sar inkább G. Az AAj és az AA₄ inkább Gly, Alá vagy Ser; ni inkább 0-2, n4 pedig 1-2. Az AA₂ esetében a semleges/nem poláros/aromás aminosavak a kedvezőbbek, speciálisan a triptofán és a fenil-alanin, de leginkább a triptofán; n2 értéke leginkább 1. X! és X₂ leginkább Cys, Mpr vagy Pen (penicillinamin) származékok. Y! leginkább H, acetil vagy Gly; Y₂ leginkább -NH₂ vagy -A-NH₂. Általában szintén kedvezőek még az Y₂ C-terminális amidált formái.

így a találmány VAG-analógjainak előnyben részesített képviselői közé tartoznak a következő képletű peptidek. Bár valamennyi képes diszulfidkötéseken keresztül provizórikusán ciklikus formát létrehozni, ezeket a kötéseket nem mutatjuk be külön; egyéb ciklikus formákat „ciklo” kifejezéssel jelöljük.

Az előnyös peptidek

VAG1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-RF-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-GD-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-CD-C-P-R-N-G-L-Y-G

VÁG 2: E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-CK-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-AK-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-KS-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

VÁG 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 7: C-K-G-D-W-C-A-NH₂VÁG 10: C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH₂VÁG 13: C-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 14: C-K-D-L-P-C-NH₂VÁG 15: C-K-G-D-V-P-C-NH₂VÁG 16: C-K-G-D-Y-(OMe)-P-C-NH₂VÁG 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂VÁG 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C-NH₂VÁG 19: Mpr-K-G—D-W-P-C-NH₂VÁG 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C-NH₂VÁG 21: Mpr-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 22: Mpr-K-G-D-L-P-C-NH₂VÁG 23: Mpr-K-G-D-V-P-C-NH₂VÁG 24: Mpr-K-G-D-Y-(OMe)-P-C-NH₂VÁG 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂

VÁG 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C-NH₂VÁG 27: ciklo(G-K-G-D-W-P)

VÁG 28: ciklo(A-K-G-D-W-P)

VÁG 29: ciklo(D-Ala-K-G-D-W-P)

VÁG 30: ciklo(F-K-G-D-W-P)

VÁG 31: ciklo(béta-Ala-K-G-D-W-P)

VÁG 32: ciklo(gamma-Abu-K-G-D-W-P)

VÁG 33: ciklo(R-K-G-D-W-P)

VÁG 34: C-K-G-D-W-G-C-NH₂VÁG 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂VÁG 41: C-K-G-D-I-P-C-NH₂VÁG 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂VÁG 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂VÁG 44: C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂VÁG 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂VÁG49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 52: Mpr-K-G-D-W-P-Penf-NH₂VÁG 54: Mpr-K-G-Df-W-P-Pen-NH₂VÁG 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂VÁG 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂VÁG 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂VÁG 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 61: Mpr-K-G-D-W—P-Ct—NH₂VÁG 62: Mpr-Kf-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-CNH₂

VÁG 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 66: Mpr-(NG,NG-etilén-Har)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 67: Mpr-(N%N<i-etilén-Har)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂VÁG 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 70: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 71: Mpr—Har—Sar-D—W-P-Pen-NH₂VÁG 72: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PPen—NH₂

VÁG 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)C-NH₂

VÁG 75: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-Pen-NH₂Különlegesen előnyösek a következő képletek pép tidjei:

VÁG 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 10: C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH₂VÁG 13: C-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂VÁG 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂VÁG 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂VÁG 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂

VÁG 44: C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂VÁG47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂VÁG 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pent-NH₂VÁG 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂VÁG 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂VÁG 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂VÁG 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 61: Mpr-K-G-D-W-P-Cf-NH₂VÁG 62: Mpr-Kt-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-CNH₂

VÁG 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 66: Mpr-(N^N<’-etilén-Har)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 67: Mpr-(N<\N<^;-etilén-Har)-G-D-W-PPen—NH₂

VÁG 70: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 72: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)C-NH₂.

A találmány peptidjeinek kémiai szintézise

A találmány tárgykörébe eső komponensek kémiailag szintetizálhatok a szakterületen jól ismert módon, mint például a szilárd fázisú peptidszintézis. A szintézist a peptid karboxiterminális végéről kezdtük egy alfaaminocsoportjában védett aminosav felhasználásával. Tbutil-oxi-karbonil (Boc) védőcsoport használható valamennyi aminocsoportra, bár egyéb védőcsoportok, mint például a fluorenil-metil-oxi-karbonil (Fmoc) is megfelelők. Például Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH, Boc-His-(Tos)-OH (a kiválasztott karboxiterminális aminosavak) észterezhetők klór-metilált polisztiréngyanta hordozóhoz, p-metil-benzhidril-amin- (pMBHA) vagy PAM-gyantához. A polisztiréngyanta leginkább a sztirénnek 0,5-2% divinil-benzénnel mint keresztkötő ágenssel alkotott kopolimeqe, amely komponens hatására a polisztirénpolimer oldhatatlanná válik bizonyos szerves oldószerekben, amint azt Stewart és munkatársai, Solid-Phase Peptide Synthesis (1969), W. H. Reeman Co., San Francisco és Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 55:2149-2154 közleményekben leírják. A peptidszintézisnek ezen módszerei és még egyebek is megtalálhatók a 3,862,925, a 3,842,067, a 3,972,859 és a 4,105,602 számú US szabadalmakban.

A szintézis történhet manuálisan és automatikusan is, például az Applied BioSystems 430A vagy 431A peptidszintetizátorral (Foster City, Califomia), a mellékelt kezelési utasításban foglaltaknak megfelelően.

A peptidek lehasítását a gyantáról végezhetjük a Lu, G.-S. és munkatársai, Int. J. Peptide & Protein Rés. (1987), 29:545-557 által leírt „alacsony-magas” HF védéseltávolítási módszer szerint. A kígyóméregben lévő VAG-szerek analógjainak újra összehajtását végezhetjük a Garsky, V. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), 56:4022-4026 eljárása szerint, amely az echistatin szilárd fázisú szintézisét írja le.

A találmány ciklikus peptidjei, amelyek nem rendelkeznek diszulfidkötésekkel, kényelmesen készíthetők a szilárd fázisú szintézis és a ciklikus gyűrű képzését oldatban megvalósító módszer kombinációjával, a 4,612,366 számú US szabadalomban leírt általános módszerek felhasználásával. így a standard Merrifieldgyantán készített peptidek hidrazinnal lehasíthatók a gyantáról, és ezt követően ciklikus peptidek képzése végett a megfelelő aziddal ciklizálhatók.

A peptidszintézis területén általános gyakorlattal rendelkezők azonnal értékelni fogják, hogy az intermedierek, amelyeket a szintézis során alkalmazott leírással összhangban készítünk, analóg komponenseket jelentenek, és így önmagukban is a találmány tárgykörébe esnek.

Rekombináns készítés

Egy másik megoldásként a találmány komponensei a szakterületen jól ismert eljárásokkal készített rekombináns DNS-konstrukciók expresszálásával is előállíthatok. Ilyen előállítási mód kívánatos lehet egyes komponensek nagy mennyiségű vagy alternatív előállítására. Mivel a peptidszekvenciák viszonylagosan rövidek, a rekombináns termelés gyors, bár a rekombináns módon történő termelés különösen kívánatos a standard szilárd fázisú peptidszintézissel szemben a legalább 8 aminosavszármazékból álló peptid esetében.

A VAG-szekvenciát kódoló DNS a kereskedelmi forgalomban hozzáférhető nukleinsavszintézis-módszerekkel állítható elő. A rekombináns gazdákban történő VAG-termelésre szolgáló expressziós rendszer készítésére használt módszerek általánosan ismertek a szakterületen.

A prokarióta és eukarióta gazdák egyaránt befolyásolhatják az expressziót. A prokarióták leggyakrabban a különböző E. coli törzsek képviselői. Egyéb más mikróbatörzsek is használhatók, mint például a bacillusok közül a Bacillus subtilis, a különböző Pseudomonas törzsek vagy egyebek. Az ilyen prokarióta rendszerekben olyan plazmidvektorokat használunk, amelyek replikációs helyet és a gazdával kompatíbilis fajból származó kontrollszekvenciát tartalmaznak. Például az E. coli esetében a leginkább használt vektor a pBR322 és származékai. Általában használnak prokarióta kontroliszekvenciákat, amelyek tartalmaznak a transzkripció iniciálására szolgáló promotereket, esetleg operátorokat a riboszóma kötőhely szekvenciáival, az általánosan használt promoterek közé tartoznak a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz (lac) promoterrendszerek, a triptofán (trp) promoterrendszere és a lambda-eredetű P_L promoter és az N-gén riboszóma kötőhely. Különben bármilyen elérhető, a prokariótákkal kompatíbilis promoterrendszer használható.

Az eukarióta gazdákban használható expressziós rendszerek a megfelelő eukarióta génekből származnak. A promoterek egyik osztálya használható az élesztőben, például tartalmazza a glikolitikus enzimek, mint például a 3-foszfoglicerát kináz szintézisének promoterét. Egyéb élesztő promoterek közé tartoznak a YEp 13-ból kapott enoláz vagy leu-2 génekből származóak.

Megfelelő emlős promoterek közé tartoznak az SV40 korai és késői promoterei vagy egyéb vírus promoterek, amelyek a polióma, adenovírus II, bovin papillóma vírus vagy a madár szarkóma vírusból származnak. A megfelelő virális és emlős enhanszereket fentebb említjük. Növényi sejtek esetében használt expressziós rendszer, például a nopalinszintézis promoter, megfelelő.

Az expressziós rendszereket a jól ismert restrikciós és ligálásos technikákkal készítettük, és a megfelelő gazdákba transzformáltuk.

Az ilyen sejteknek megfelelő transzformációt a standard technikák használatával végeztük. Az expressziós rendszereket hordozó sejteket a VAG-termelésnek megfelelő körülmények között tenyésztettük, és ezután a VAG-ot visszanyertük, és tisztítottuk.

Ellenanyagok

A találmány tisztított VAG-szereinek hozzáférhetősége lehetővé teszi az aktív peptidek ezen formáival specifikus immunreakciót adó ellenanyagok termelését.

A kígyóméregből izolált, tisztított vagy szintetizált VAG-szereket tartalmazó összetételek felhasználhatók a VAG-peptidekkel immunreakcióba lépő ellenanyagok termelésének stimulálására. A standard immunizálási protokollok, amelyek során VAG-ot alkalmazunk a különböző gerincesekben, mint például nyulak, patkányok, egér, birka és csirke, ellenanyagszérumot eredményeznek, amely immunreakcióba lép a tisztított peptidekkel. A VÁG előnyösen konjugáltatható a megfelelő, antigén szempontjából semleges hordozóhoz, mint például a megfelelő szérumalbumin vagy keyhole limpet hemocianin. Továbbá, a konjugáció alternatívájaként a szabad peptidek metilált BSA-val is befecskendezhetők. Az immunizált emlősök ellenanyagot kiválasztó sejtjei folyamatosan fenntarthatóak monoklonális ellenanyag készítésére, amely azután megvizsgálható, hogy reagál-e a VAG-gal.

A kapott poliklonális vagy monoklonális ellenanyag-készítmények hasznosak a megfelelő VÁG szintjének tesztelésére biológiai mintákban a standard immunoteszt eljárások alkalmazásával.

A találmány tesztje

A kígyóméreg kiindulási anyagának, amely aktív és specifikus VAG-szert tartalmaz, azonosítása lehetővé vált a találmány tesztjével. A teszt azon a megfigyelésen alapul, hogy a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődését blokkoló komponensek in vitro szintén képesek gátolni az emberi vérlemezkék trombin- és ADP-indukált aggregálódását, valamint a vérlemezketrombin-képződést in vivő. Ez a megfigyelés alapot nyújt a lehetséges VÁG nyerésére a tesztanyag azon képességének értékelésével, hogy miként szakítja meg a fibrinogén-GP Ilb-IIIa kölcsönhatást.

A teszt során a tisztított formában előállított GP Ilb—Illa-t például Fitzgerald, L. A. és munkatársai, Anal. Biochem. (1985), 757:169-177 által leírt módszer alapján szilárd gyöngy, tesztcső vagy mikrotiterlemez formában hordozóra rétegezzük. A beborított hordozót ezután érintkezésbe hozzuk a fibrinogénnel és a tesztanyaggal, és a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való maximális kötés kialakulásához szükséges ideig inkubáljuk. A fibrinogént általában 5-50 nM koncentrációban alkalmazzuk, és a tesztanyagot, ha kívánatos, hígítási sorozatban adjuk. A tipikus inkubációs idő 2-4 óra 35 °C-on, a hőmérséklet és az idő egymástól kölcsönösen függenek.

Az inkubálás után a fibrinogént és a tesztanyagot tartalmazó oldatot eltávolítjuk, és a fibrinogén kötődésének szintjét megmérjük a fibrinogén-GP Ilb-IIIa kötés mennyiségi meghatározásával. A kimutatásra bármilyen megfelelő módszer használható, de kényelmes a jelölt fibrinogén, például radioaktív, fluoreszcens vagy biotinilált jelekkel alkalmazása. Ilyen módszerek jól ismertek, és részletes kifejtésükre itt nincs szükség.

Az eredmények megbecsülését kontroll alkalmazása segíti, amely rendszerint megegyezik a tesztmintával, azzal a különbséggel, hogy a tesztanyag hiányzik. Ebben az esetben a gátlás százaléka kiszámítható a kontrollmintában mint alapban kapott mennyiség felhasználásával, így kontrollteszt a gátlás %-a=-x 100.

kontroll

A gátlás hatékonyságának mérésére egyéb módszerek is, mint például az IC₅₀ is használhatók.

A találmány tesztrendszerei tartalmazzák továbbá a VÁG specifitásának jellemzését a kötés gátlásának vizsgálata alapján, amely azonos a fenti teszttel, de az Fg számára új adhéziós proteint, a GP Ilb-IIIa számára pedig új receptort használunk. A vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz, a fibronektinnek a fibronektin-receptorhoz, a fibronektinnek a GP Ilb-IIIa komplexhez, és a fibronektinnek és/vagy a vWF-nak a GP Ilb-IIIahoz való kötődésgátlása megállapítható. A tesztekhez való adhéziós proteinek és receptorok hozzáférhetők a szakterületen.

Egyéb tesztek

A találmány lemeztesztjén kívül még egyéb tesztek is hozzáférhetők, amelyekkel meghatározhatók a vérlemezke-aggregálódást gátló és ezzel kapcsolatos aktivitások.

Összefoglalva, az alkalmazott tesztek listája a következő :

1. Az előző fejezetben leírt, specifikus receptorokat felhasználó tesztek.

2. A vérlemezke-aggregálódásra közvetlenül alkalmazott standard tesztek, amelyeket az alábbi közleményekben írnak le: Gann, Z.-R. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1989), 263:19 827-19 832, Huang T. F. és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1987), 262\ 16157-16163, Biochemistry (1989), 25:661-666.

3. Egy kutyában végzett in vivő trombózismodell az

1. példában és Folts, J. D. és munkatársai, Circulation (1976), 54:365 által leírt módon.

4. A 19. példában leírt módon végzett, metioninnal jelölt sejtek felhasználásával, a sejtek adhéziójára gyakorolt hatás vizsgálata.

Alkalmazás és hasznosítás

A találmány VAG-szerei hasznosak a vérrögképződés megelőzésében. Egy ilyen kezelésre indikációk, korlátozás nélkül az aterosclerosis és arteriosclerosis, akut szívizominfarktus, krónikus unstabil angina, átmeneti iszkémia vagy iszkémiás roham, perifériális keringési betegségek, arteriális trombózis, praeclampsia, embólia, érplasztikát követő resztenózis és/vagy trombózis, nyaki verőér endarteritis, átültetett erek egybenyílása, krónikus kardiovaszkuláris eszközök (például behelyezett katéter vagy összenövések). Ezekről az érösszehúzódási és elzáródási rendellenességeket reprezentáló szindrómákról feltételezik, hogy a véredények falán történő vérlemezke-aktiválás a kiváltójuk.

A VAG-ok használhatók az artériás vérrögképződés megakadályozására vagy eltávolítására, csakúgy, mint a szívizominfarktus és az azt követő fali vérrögképződés megelőzésére. Ezek közé tartozik még az agyi rendellenességek vagy átmeneti vérroham és szélhűdés kezelése.

A VAG-ok használhatók még vérlemezke-aggregálódás és érelzáródás megelőzésére, a perifériás keringési rendszerben, például a fejlődő vesedialízis, a kardiopulmonáris bypass vezetékek, hemoperfüziók és a plazmaferezis javítására.

A VAG-ok megelőzik a vérlemezkék aggregálódását, az embólia kialakulását vagy a keringési rendszeren belüli leépülést, és alkalmazásuk az aortán belüli pumpa, szívkamra működését segítők és az arteriális katéterek hasznosítását eredményezi.

A VAG-ok szintén hasznosak a vénás trombózisok vagy a mély vénás trombózisok, az IVC, a vese- vagy máj-kapuértrombózisok és a tüdővéna-trombózisok kezelésében vagy megelőzésében.

Egyéb, különböző vérlemezke-csökkenéssel járó rendellenességek, mint például a thrombopeniás elszíneződés, szintén kezelhetők.

Továbbá a találmány VAG-szerei használhatók számos nem terápiás alkalmazás esetén is, amikor a vérlemezke-aggregálódás gátlása kívánatos. Például elegendő mennyiségű peptid hozzáadásával megemelkedett vérlemezkeszint érhető el. A peptid mennyisége változik a feltételezett tárolási időtől, a tárolás körülményeitől, a tárolt anyag végső felhasználásától stb. függően.

A VÁG adagolása széles tartományban változhat a kívánt hatástól és a terápiás céltól függően. A tipikus adagok 0,01 és 10 mg/kg között, vagy még inkább 0,01-0,1 mg/testsúly kg között vannak. Az alkalmazás parenterális, mint például intravénás adagolás, amelyet naponta adunk egy hétig vagy egy-két hónapig, esetleg tovább is, a peptid méretétől függően. Amennyiben a peptidek eléggé kicsik (kisebbek 8-10 aminosavszármazéknál), egyéb alkalmazási módok is használhatók, mint például az orron át vagy nyelv alá.

Befecskendezhető formában kényelmesen készíthetők akár vizes oldat vagy szuszpenziók, illetve az injekciózás előtt folyadékban történő oldásra vagy szuszpenziókészítésre alkalmas formában, akár emulziókként. Megfelelő kötőanyag például a víz, fiziológiás sóoldat, dextróz, mannitol, laktóz, lecitin, albumin, nátrium-glutamát, cisztein-hidroklorid és egyéb hasonló anyagok. Amennyiben kívánatos, a befecskendezhető gyógyszerek tartalmazhatnak kis mennyiségű nem toxikus kiegészítő anyagokat, mint a nedvesítőszerek, pHpufferolók stb. Ha szükséges, használhatók abszorpciónövelő készítmények (például liposzómák).

1. példa

Teszt a kígyóméreg vérlemezke-adhéziót gátló szerek kimutatására

A. A tesztek leírása - lemeztesztek

A tisztított vérlemezke GP Ilb-Illa-receptort Fitzgerald, L. A. és munkatársai, Anal. Biochem. (1985), 757:169-177 által leírt módon állítottuk elő. A vitronektin-receptort Smith, J. W., J. Bioi. Chem. (1988), 263:18 726-18 731 által leírt módon preparáltuk. A tisztítás után a receptorokat 0,1% Triton X-100 oldatban tároltuk 0,1-1,0 mg/ml koncentrációban.

A receptorokat 1:200 hígítás után felvittük a 96 helyes ELISA-lemezek falára (Linbro EIA-Plus microtiter plate, Flow Laboratories). A hígítást 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH=7,4 oldatban végeztük úgy, hogy a Triton X-100 koncentrációja a kritikus micelláris koncentráció alá csökkenjen, majd 100 μΐ-t adtunk minden egyes mintahelyhez. A mintahelyeket egy éjszakán át inkubáltuk 4 °C-on, majd levegőn kiszárítottuk. A maradék helyeket a fenti pufferben oldott bovin-szérumalbumin (BSA) 35 mg/ml koncentrációban történő hozzáadásával blokkoltuk 2 órán át 30 °Con, a nemspecifikus kötések kialakulásának megakadályozására. A mintahelyeket egyszer mostuk kötőpufferrel (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mg/ml BSA).

A megfelelő ligandokat (fibrinogén, von Willebrand-faktor vagy vitronektin) ^l25I-dal jelöltük, vagy biotinnal konjugáltattuk a kereskedelemben kapható reagensek és standard protokollok felhasználásával. Ajelölt ligandokat 10 nM (100 μΐ/mintahely) végkoncentrációban hozzáadtuk a receptorral borított mintahelyekhez, és 3 órán át inkubáltuk 30 °C-on a tesztmintákkal vagy anélkül. Az inkubálás után a mintahelyeket kiszárítottuk, és meghatároztuk a kötött ligand mennyiségét.

A ¹²⁵I-dal jelölt ligand készítéséhez a fehérjét 250 μΐ SDS-oldatban oldottuk fel. A biotinilált ligandok esetében a kötött fehérjéket alkalikus foszfatázhoz konjugáltatott biotin elleni ellenanyag és a szubsztrát (p-nitrofenil-foszfát) hozzáadásával mutattuk ki, a mintahelyek 405 nm-en mért optikai denzitásának meghatározásával. Azokban a mintahelyekben, amelyek a ligand receptorhoz való kötődését gátló mintákat tartalmaztak, csökkent színintenzitást, illetve ¹²⁵I-tartalmat figyeltünk meg.

B. A nyers méreg adhéziógátlásának meghatározása

Hatvannyolc nyers, liofilizált kígyómérget [amelyek a Sigma Chemical Companytől (St. Louis, MO) vagy a Miami Serpentarium Labstól (Salt Laké City, UT) származtak] 1 mg/ml koncentrációban feloldottunk pufferben (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,02% azid, 2 mM

CaCl₂). Az oldatok 1 ml-nyi mennyiségeit Centrocon 10 (YM membrán) mikrokoncentrátoron végzett ultraszűrésnek vetettük alá. A szűrleteket használtuk tesztmintaként az A fejezetben leírt receptor/ligand tesztben a GP Ilb-IIIa/fibrinogén rendszerben, a kötés kimutatására a biotinilált fibrinogént használva. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

Látható, hogy az aktivitás megtalálható néhány, de nem az összes Viperinae fajban, és hiányzik valamennyi tesztelt Elapidae-ból.

Az 1. ábra bemutatja négy faj esetében a szűrletek különböző hígításával kapott eredményeket. A három aktív méreg még a legnagyobb hígítás esetében is (25 μ1/0,5 ml) maximális gátlást mutatott.

C. A peptidek aktivitásának meghatározása a trombózis egy in vivő modelljében

A tisztított peptideket megvizsgáltuk a vérrögképződés-megakadályozás képesség szempontjából kutyában a szívkoszorúartéria-modellben, amelyet Folts írt le [Folts, J. D. és munkatársai, Circulation (1976), 54:365]. Ebben a modellben az összeszűkült koronaartériákban a véráram csökkenése a vérlemezke-aggregátumok miatt következett be, és azokról a szerekről, amelyek blokkolják a fibrinogén kötődését a GP Ilb-Illa komplexhez, kimutatták, hogy megakadályozzák a véráramcsökkenést, amint azt Coller, B. S. és munkatársai, Blood (1986), 68:783 közleményükben leírják. A peptideket normál fiziológiás sóoldatban oldottuk, és a perifériális vénákban alkalmaztuk egyszeri adagban.

I. táblázat

Centricon 10 oszlopon tisztított kígyómérgek GP Ilb-Illa teszttel átvizsgálva

Elapidok	Aktivitás
Austrelaps superba (Australian Copperhead)	-
Acanthopis antarcticus (Death Adder)	-
Dendroaspis jamesonii (Jameson’s Mamba)	-
Notechis scutatus (Mainland Tiger)	-
Pseudechis colleti guttatus (Blue-bellied)	-
Pseudechis textillis textillis (Common Brown)	-
Oxyuranus scutellatus (Pápuán Taipan)	-
Viperinae (True Vipers)	-
Atheris squamigera (Green Bush Viper)	-
Bitis nasicomus (River Jack)	-
Causus rhombeatus (Rhombic Night Adder)	-
Cerastes cerastes (Desert Homed Viper)	-
Cerastes vipera (Sahara Homed Viper)	-
Echis carinatus (Saw-scaled Viper)	+
Echis colorata (Carpet Viper)	+
Eristicophis macmahonii (Macmahons Viper)	+ +
Pseudocerastes fieldi (Persian Homed Viper)	-
Vipera xanthina xanthina (Ottomans Viper)	-
Vipera ammodytes (Long-nosed Viper)	-

Elapidok	Aktivitás
Vipera r. russelli (Russells Viper)	-
Vipera r. siamensis	-
Vipera palaestinae (Palestina Viper)	-
Crotalinae (Pit Vipers)	+
Agkistrodon rhodostoma (Malayan Pit Viper)	+
Agkistrodon halys biomhoffi (Mamushi)	+
Agkistrodon hypnale (Hump-nosed Viper)	+
Agkistrodon acutus (Sharp-nosed Viper)	+ +
Agkistrodon bilineatus (Mexican Moccasin)	-
Agkistrodon contortrix contortrix	-
Agkistrodon c. laticinctus	-
Agkistrodon c. pictigaster	-
Agkistrodon contortrix mókásén (Northern Copperhead)	-
Agkistrodon piscivorous piscivorous (Eastem Cottonmouth)	-
Agkistrodon piscivorous pleucostoma (Western Cottonmouth)	+
Agkistrodon piscivorous conanti	+
Bothrops asper	+
Bothrops nummifer (Jumping Viper)	-
Bothrops cotiara (Cotiara)	+
Bothrops jararacussu (Jararacussu)
Bothrops jararaca (Jararaca)	+
Bothrops lansbergi	+
Bothrops altemata (Urutu)	-
Bothrops medusa	+
Bothrops neuwiedi	+
Bothrops nasuta	+
Bothrops pradoi	+
Bothrops schlegli (Schlegels Viper)	-
Trimeresurus gramineus (Formosan Green Habu)	-
Trimeresurus flavoviridis (Okinawa Habu)	-
Trimeresurus vagleri	-
Lachesis mutas (Bushmaster)	-
Crotalus durrisus terrificus (Tropical Rattlesnake)	-
Crotalus durissus totonatacus	-
Crotalus durissus durissus	-
Crotalus scutalatus (Mojave Rattlesnake)	-
Crotalus horridus horridus (Timber Rattlesnake)	-
Crotalus horridus atricaudatus (Canebrake RS)	-
Crotalus atrox (Western Diamondback)	-
Crotalus adamanteus (Eastem Diamondback)	-
Crotalus basilicus (Mexican West-coast RS)	+

1. táblázat (folytatás)

Elapidok	Aktivitás
Crotalus molossus molossus (Black-tailed RS)	+
Crotalus ruber ruber (Red Diamondbak RS)	+
Crotalus cerastes cerastes (Mojave sidewinder)	+
Crotalus viridis viridis (Prairie Rattlesnake)
Crotalus v. helleri (Southern pacific RS)	+
Crotalus v. oreganus (Northern pacific RS)	+
Crotalus v. cereberus (Arizona black RS)	+
Crotalus v. lutosus (Great Basin RS)	+
Crotalus v. concolor (Midget-faded RS)	-
Sistrurus catenatus tergeminus (Western sassasauga)	+
Sistrurus milarius barbouri (Sotheastem Pigmy Rattlesnake)	+

D. A tisztított kígyómérgek hatása a sejtek adhéziós proteinekhez való tapadására

Az M21 melanomasejteket, amelyek magas szinten expresszálják a vitronektin-receptort, metabolikus úton megjelöltük ³⁵S-metioninnal, majd vitronektinnel borított 24 mintahelyes szövettenyésztő lemezre tettük. 1 órán keresztül tartó 37 °C-on végzett inkubálás lehetővé tette a sejtek megtapadását, majd ezt követte a meg nem tapadt sejtek lemosása. A mosás után a megtapadt sejteket feloldottuk, és a felülúszót folyadékszcintillációs számlálóba tettük. A megmaradt tapadó sejtek frakciójának arányát úgy számoltuk ki, hogy az oldott felülúszóban mért cpm-értéket osztottuk a mintahelyekhez adott sejtek teljes számában mért cpm-értékkel. A tisztított kígyóméregpeptidek és a szintetikus ciklikus peptidek hatását a sejtek adhéziójára az M21 sejtekkel együtt történt inkubációval határoztuk meg.

E. Az adhéziógátlás specifitása

Három kígyófaj, a Sistrurus m. barbouri, a Crotalus ruber ruber és a Crotalus basilicus mérgéből ultraszűréssel nyert frakcióját megvizsgáltuk az A. fejezetben leírt fibrinogén/GP Ilb-IIIa és vitronektin/vitronektin-receptor tesztekben. Az eredményeket különböző hígításokban értékeltük. Amint azt a 2. ábrán bemutatjuk, a Sistrurus m. barbouri mérge gátolja leginkább a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését; a Crotalis ruber ruber mindkét rendszerben megközelítőleg egyformán gátolja a kötődést; a Crotalus basilicus a vitronektin/vitronektin-receptor kötést gátolja inkább.

A 2-6. és a 8-12. példákban leírt tisztítások során a VAG-aktivitást a vérlemezkék aggregációjának közvetlen gátlásának felhasználásával vizsgáltuk. Önként jelentkező emberekből származott a vérlemezkékben gazdag plazma (PRP). Egy aggregométerben (Chrono-log Corp.) 0,5 ml PRP-oldathoz adott 4 μΜ ADP-vel indukáltuk az aggregálódást. A 6. példa végén található a táblázat, amelyik bemutatja a 2-6. példákban tisztított VAG-ok aminosavösszetétel-meghatározásának eredményeit, míg a 8-11. példákban izoláltakkal kapott eredmények a 8. példa végén láthatók.

Ezeket az eredményeket a peptidek 6N HCl-val végzett hidrolízisével és a hidrolizátumok analizálásával kaptuk. (Az analízist a Beckman 121 HC analizátorral végeztük, amely a Model 126 adatfeldolgozó rendszerrel volt kiegészítve.) A ciszteinsavat Moore, J. Bioi. Chem. (1969), 230:235-237 módszerével határoztuk meg. A triptofánt nem határoztuk meg.

2. példa

Vérlemezke-aggregálódást gátló (VÁG) tisztítása

Eristicophis macmahonii mérgéből mg Eristicophis macmahonii mérgéből (Miami Serpentarium Labs, Lót #EM23SZ) 1,0 ml 0,5% trifluor-ecetsavban (TFS) készült oldatát jégen hűtöttük 20 percig, a nem oldható anyagok eltávolítása végett 3 percig centrifugáltuk 14000 fordulat/perc sebességgel, majd egy 3,9 mmx30 cm méretű C-18 Delta Pák oszlopra vittük, 5% acetonitril-tartalmú 1%-os TFS-sel. Waters 600E folyadékkromatográf felhasználásával 5%-tól 15%-ig teijedő acetonitril gradienssel 5 percig futtattuk (2%/perc), amit 15%-tól 30%-ig terjedő futtatás követett 35 perc alatt, majd ez után 50%-os acetonitril következett 20 percig. A térfogatáram 1,5 ml/perc volt, amelyet végig tartottunk a gradiens során az oszlop teljes teqedelmében, és az oszlopról lejövő elfolyót 2 percenként szedtük össze egy polipropiléncsőbe.

Az oszlopról lejövő frakciókat 220 nm/2,5 abszorbancia egység a teljes skálán (AUFS) mértük.

A frakciókat az eredeti térfogatuk felére töményítettük be Speed-Vac-koncentrátor (Savant) segítségével, majd liofilizáltuk. A mintákat ez után újra előkészítettük 1 ml desztillált vízben, és egységnyi mennyiségeit (10-50 μΐ) használtuk fel annak meghatározására, hogy aggregométerben (Chrono-Log Corp., Havertown, PA) miként gátolja a 20 μΜ ADP-vel indukált vérlemezkeaggregálódást a vérlemezkében gazdag plazmában.

Amint azt a 3. ábrán bemutatjuk, a 21-25% acetonitril-koncentráció között létrejövő frakcióban találtunk aktivitást. Ezeket a frakciókat azután liofilizáltuk, és újra megfuttattuk C-18 HPLC-oszlopon, a következő acetonitril-gradienst használva: A kezdeti körülmények 8% acetonitril volt, azt követte 68 percig tartó (0,25%/perc) 25%-ig tartó gradiens, majd egy újabb 60%-ig, 10 perc alatt. Egyperces frakciókat gyűjtöttünk, megszárítottuk őket, és a fenti módon újra ellenőriztük az emberi vérlemezkék aggregálódására gyakorolt gátlóaktivitásukat.

Amint a 4. ábrán bemutatjuk, az aktivitás a 24% acetonitril-koncentrációnál jött le. Az aktív frakciókat ez után analitikai HPLC-nek vetettük alá 220 nm-en történő detektálással, és eluáltunk egy szimmetrikus, biológiailag aktív komponenst, amint azt az 5. ábrán bemutattuk. A HPLC-vel tisztított anyag aminosavelemzése azt mutatta, hogy a peptid 49 aminosavszármazékból, közötte 7-8 ciszteinből áll, amint az a 2. táblázatban látható.

A karboxi-amido-metilált peptidek automatizált Edman-degradálása nem eredményezett kimutatható szek18

HU 216 318 Β venciát. Ezért az anyag emésztését Lys-C és Asp-N endoproteinázokkal végeztük, amely szekvenálható fragmenteket eredményezett (a szekvenciákat a 6. ábrán mutatjuk be). Ezzel az elemzéssel 48 származékra derült fény. Mivel a szekvenciaelemzés során két triptofánszármazék jött elő, amelyek nem voltak az aminosav-összetételben, az intakt peptid 51 aminosavszármazékot tartalmaz. így a meghatározott szekvenciából hiányzó kettő Glx- és egy Arg-származék volt feltehetően a peptid blokkolt aminoterminális végén. Mivel nagyon valószínű volt, hogy az egyik Glx-származék az intakt peptid aminoterminális végének lezárt természetéhez vezető származék egy piroglutamil-származék volt, egy piroglutamil aminopeptidáz (L-piroglutamil peptid-hidroláz, EC 3.4.11.8, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) enzimmel eltávolítottuk ezt a csoportot az intakt karboxi-metilált peptidről. A használt receptet Podell és Abraham, Biochem. Biophys. Commun. (1978), 57:176-185 írták le. A 100 pg peptid peptidázzal történt emésztése során a 100:1 szubsztrát: enzim arányt alkalmaztuk. Ezt követte a keverék reverz fázisú HPLC-n végzett tisztítása Waters analitikai C-18 oszlopon, amely az automatizált Edmann-degradáláshoz megfelelő anyagot szolgáltatott. A 6. ábrán bemutatjuk az elemzés eredményeit, és az „ eristicophin ”-nak nevezett peptid belső szekvenciájának felhasználását.

A VÁG teljes aminosavszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be. Megtalálható az RGD szekvenciamotívum a kötőrégióban, és jelentős homológiát mutat az echistatinnal.

3. példa

Sistrurus catenatus tergeminus mérgéből származó VÁG tisztítása

Háromszázhatvan mg Sistrurus c. tergeminus mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #ST6SZ) feloldottunk 7,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és Sephadex G-50 fine típusú oszlopra vittük, telítettük, és 0,5 M ecetsavval eluáltuk. Az oszlopot körülbelül 25 ml/óra térfogatárammal eluáltuk, és 5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Minden egyes frakcióból 25 μΐ-t tízesével összeszedtünk (tudniillik 1-10 és 11-20 stb.), és elemzés céljából liofilizáltuk. Az összegyűjtött és megszárított frakciókat újra oldottuk vízben, és megvizsgáltuk egységnyi térfogatainak az ADP-vel indukált emberi vérlemezkék aggregálódását gátló hatását. Az aktív frakciókat (31-40) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk.

Ezt az anyagot oldottuk fel 2 ml 0,5%-os TFS-ben, és vittük egy 19 mmx30 cm méretű Delta Pák reverz fázisú HPLC (Waters), 8% acetonitril-tartalmú 0,1%-os TFS-oldattal telített oszlopra. Egy 8%-tól 30%-ig tartó gradienst futtattunk 30 perc alatt, majd 60% acetonitrilt értünk el 20 perc alatt, 18 ml/perc térfogatárammal. Az oszlopról lefolyó frakciókat 2 percenként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük, és 220 nm/2,2 AUFS-et mértünk. A frakciókat Speed-Vac-koncentrátoron (Savant) betöményítettük, liofilizáltuk, és a korábban leírt módon emberi vérlemezkékkel megnéztük az aggregálódás elleni aktivitásukat.

A 7. ábra bemutatja, hogy a VAG-tartalmú frakciók a 24-25% acetonitril-koncentrációnál jönnek le az oszlopról. Az aktív frakciók HPLC-elemzése, a 220 nm-en mért eredmények a 8. ábrán bemutatott szimmetrikus, biológiailag aktív komponensek jelenlétét mutatták. Ezen anyag aminosavainak elemzése egy 71-72 származékból álló peptidet mutatott, amely, mint a 2. táblázatban látható, 12 ciszteint is tartalmaz.

A tisztított peptid egy részét redukáltuk, és jódacetamiddal alkileztük, majd C-18 reverz fázisú HPLC-oszlopon tisztítottuk. Ezen anyag N-terminális szekvenciájának analízise a következő aminosavszekvenciát eredményezte az Edman-degradálás 23 ciklusa után: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-CysGly-Ser- Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-AlaAla-Thr- Cys-Lys-Leu.

Ezen „ tergeminin ”-nek nevezett VÁG teljes aminosavszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be.

A tisztított peptidet az 1. példa A. pontjában leírt receptoralapú tesztekkel vizsgáltuk. A tiszta peptid, amint azt a 9. ábrán bemutatjuk, kevesebb, mint 100 nM koncentrációban gátolta az Fg és a vWF kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz, illetve a Vn és a vWF kötődését a vitronektin-receptorhoz.

4. példa

Vérlemezke-aggregálódást gátló tisztítása a

Sistrurus milarus barbouri mérgéből

Kétszáz mg Sistrurus milarus barbouri mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #SM13SZ) feloldottunk 7,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és előzőleg telített Sephadex G-50 fine típusú oszlopra (2,5 χ 100 cm) vittük, és 0,5 M ecetsavval eluáltuk. Az oszlopot körülbelül 26 ml/óra térfogatárammal eluáltuk, és 5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, és az előzőekben leírt módon megnéztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitást. Az aktív frakciókat (41-50) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk. Ezt az anyagot oldottuk fel 2 ml 0,5%-os TFS-ben, és vittük egy preparatív C-18 HPLC-oszlopra, és eluáltuk, ugyanazokat a gradienskörülményeket alkalmazva, mint a 3. példában. A kettőtől a tizedik percig terjedő frakciókat polipropiléncsövekbe gyűjtöttük, betöményítettük, liofilizáltuk, és meghatároztuk a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat.

A 10. ábra bemutatja az erről a HPLC-oszlopról kapott aktivitási profilt. Az aktív frakciókat analitikai HPLC-nek vetettük alá, amely azt mutatta, hogy volt néhány frakció (45-47), amely több mint 90%-ban homogén volt. A 46-os frakció peptidjét (150 pg) egy analitikai C-18 oszlopon homogenitásig tisztítottuk, a 11. ábrán bemutatott szimmetrikus csúcs manuális összegyűjtésével. Ezen anyag aminosavanalízise egy 71-72 aminosavból álló peptidet mutatott, amely 12 ciszteinszármazékot tartalmaz, amint azt a 2. táblázatban bemutatjuk.

A tisztított peptidet (150 pg) feloldottuk 300 μΐ reakciópufferben [6 M guanidin HC1, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 20 mM ditiotreitol (DTT), pH=7,5], 1,5 óráig hagytuk szobahőmérsékleten a peptidek redukálása érdekében. Ezt követte 3 μΐ 4-vinil-piridin (Aldrich) reakciója szobahőmérsékleten, egy újabb órá19 ig. A reakciót 200 μΐ 1% TFS hozzáadásával állítottuk le, majd felvittük analitikai C-18 HPLC-oszlopra, és acetonitril gradienssel eluáltuk, 0,1% TFS-tartalmú vizes oldattal. A kezdő acetonitril-koncentráció 8% volt, és 20 perc alatt emeltük 25%-ra, majd további 10 perc alatt 60%-ra.

A piridil-etilált anyag egy részét a fent leírt módon N-terminális-elemzésnek vetettük alá, és elvégeztük a redukált, alkilált peptid teljes proteolitikus hasítását a Lys-C és Asp-N endoproteinázok felhasználásával, a C-3 vagy a C-18 reverz fázisú HPLC-oszlopon, acetonitril/víz/TFS gradiens alkalmazásával, izolált fragmenteken. Az intakt peptid N-terminálisának aminosavszekvenciáját és az izolált proteolitikus fragmenteket Yardén, Y. és munkatársai, Natúré (1986), 323:226 által leírt módon határoztuk meg gázfázisú szekvenátoron, automatizált Edman-degradáció felhasználásával.

Ennek a „barbourin-nak. nevezett, izolált pepiidnek a teljes aminosavszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be a proteolitikus fragmentek szekvenciája mellett. A szekvencia összehasonlítása egyéb, kígyóméregből származó megtapadást gátlókkal a 12. ábrán látható.

5. példa

VÁG tisztítása a Lachesis mutas mérgéből mg Lachesis mutas mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #LM15FZ) feloldottunk 2,0 ml 0,5 %os trifluor-ecetsavban, jégen hűtöttük 20 percig, az oldhatatlan anyagok eltávolítására lecentrifugáltuk 14 000 fordulat/perc sebességgel 3 percig, és fölvittük egy 3,9 mmx30 cm méretű, C-18 Delta Pák reverz fázisú HPLC-oszlopra (Waters), melyet előzőleg 5% acetonitril-tartalmú 0,1%-os trifluor-ecetsawal telítettünk. 5%-tól 15%-ig terjedő acetonitril-koncentrációval futtattunk egy gradienst 5 perc alatt, azután növeltük 30%-ra 5 perc alatt (2%/perc), és folytattuk 60%-ig 20 perc alatt. Az áramlási sebességet 1,5 ml/perc értéken tartottuk, és az oszlopról lejövő frakciókat 220 nm/3,0 AUFS-nél mértük. Két perces frakciókat gyűjtöttünk, Speed-Vackai betöményítettük, és liofilizáltuk őket. Megvizsgáltuk a frakciók vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitását.

A 18. ábra mutatja a 18% acetonitril-koncentrációnál lejövő aktív frakciókat. Ezeket a frakciókat újra futtattuk egy C-18 oszlopon, enyhébb gradienst használva, amely 40 percig tartó 5-28% acetonitrilkoncentráció-emelkedést jelentett. Egyperces frakciókat szedtünk, betöményítettük, liofilizáltuk, és megvizsgáltuk a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat, amelynek eredményeit a 14. ábrán mutatjuk be. Ezeket az aktív frakciókat egy analitikai C-18 oszlopon megfuttattuk, és a lejövő központi csúcs frakcióit kézzel összegyűjtöttük. Az oszlopról lejövő anyagot, amely a

15. ábrán látható szimmetrikus csúcs, aminosavelemzésnek vetettük alá, amely során kiderült, hogy egy 72-73 aminosavból, közötte 12 tisztemből álló peptid, amint azt a 2. táblázatban bemutatjuk.

A „ lachesin ”-nek nevezett VÁG teljes aminosav10 szekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be.

6. példa

VÁG tisztítása a Crotalus viridis viridis mérgéből 47 mg Crotalus viridis viridis mérget (Sigma Che15 mical Co., Lót #24f-0534) feloldottunk 1,0 ml 0,5%-os trifluor-ecetsavban, jégen hűtöttük 20 percig, az oldhatatlan anyagok eltávolítására lecentrifúgáltuk 14000 fordulat/perc sebességgel 3 percig, és felvittük egy 3,9 mmx30 cm méretű, C-18 Delta Pák reverz fázisú

HPLC-oszlopra (Waters), 5% acetonitril-tartalmú 0,1%os trifluor-ecetsawal telítettük. 5%-tól 15%-ig terjedő acetonitril-koncentrációval futtattunk egy gradienst 5 perc alatt (2%/perc), azután következett egy gradiens 15%-ról 30%-ra 35 perc alatt, és folytattuk 60%-ig

60 perc alatt. Az áramlási sebességet 1,5 ml/perc értéken tartottuk a gradiens alatt, és az elfolyót 2 percenként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Az oszlopról lejövő frakciókat 220 nm/3,0 AUFS-nél mértük. A frakciókat betöményítettük, liofilizáltuk őket, majd megvizsgáltuk a frakciók vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitását.

A 16. ábra mutatja a 18-19% acetonitril-koncentrációnál lejövő aktív frakciókat, melyeket újra futtattunk egy C-18 HPLC-oszlopon, 48 percig tartó 8-20% acetonitrilkoncentráció-emelkedést (0,25%/perc) mutató gra35 dienssel. A frakciókat betöményítettük, liofilizáltuk, és megvizsgáltuk az aktivitásukat; az aktív frakciókat egy C-18 oszlopon megfuttattuk a következő gradiensekkel: 8-16% acetonitril-koncentrációt 10 perc alatt, 16-20% acetonitril-koncentrációt 15 perc alatt, majd 10 perc alatt érte el a 60%-ot. Az oszlopról lejövő anyagot 220 nm-en követtük, és az egyedi csúcsokat kézzel összegyűjtöttük polipropiléncsövekbe. Az aktív csúcs analitikai HPLC-n végzett ismételt elemzésekor kapott eredményeket a 17. ábrán mutatjuk be. A csúcson végzett aminosavelemzés45 kor kiderült, hogy ez egy 74-75 aminosavból, közötte 12 tisztemből álló peptid, amint azt a 2. táblázatban bemutatjuk. A „ viridin ”-nek nevezett VÁG teljes aminosavszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be, az egyéb VAGokkal végzett összehasonlítás a 12. ábrán látható.

2. táblázat

A tisztított peptidek aminosav-összetétele

Aminosav	Sistrurus m. barbouri	Sistrurus c. tergeminus	Lachesis mutas	Crotalus v. viridis	Eristicophis macmahonii
Lys	4	3	4	3-4	4
Mis	0	0	0-1	1	0
Arg	4	5	7	5	7

2. táblázat (folytatás)

Aminosav	Sistrurus m. barbouri	Sistrurus c. tergeminus	Lachcsis mutas	Crotalus v. viridis	Eristicophis macmahonii
Asx	11	11	10	11	7
Thr	4	4	2	4	2
Ser	2	2	1	2	1
Glx	6-7	5-6	7	6	4
Pro	4	4	5	6	5
Gly	9	9	9	10	5
Alá	7	8	9	7	3
Cys	12	12	12	12	7
Val	2	2	0	1	2
Met	1	1	0	0	0
He	0	0	2	1	0
Leu	3	3	2	3	0
Tyr	1	1	1	1	1
Phe	1	1	1	1	1
	71-72	71-72	72-73	74-75	49

7. példa

A tisztított VÁG összehasonlítása az echistatinnal

A 2. és 4. példákban leírt módokon tisztított peptideket, az eristicophint és a barbourint összehasonlítottuk a 49 tagból álló peptiddel, az echistatinnal, amely az

1. példa A. pontjában leírtak alapján gátolja a fibrinogén kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz. A 18. ábra szerint ezek a tisztított VAG-ok 2-3-szor hatékonyabbak ebben a tesztben, mint a standard echistatin.

Az Echis carinatus, a Sistrurus m. barbouri és az Eristicophis macmahonii mérgeiből tisztított peptideket az ADP-stimulált vérlemezke-aggregálódási tesztben hasonlítottuk össze az echistatinnal. A tisztított, kígyóméregeredetű peptideket feltüntetett (19. ábra) növekvő koncentrációban (előinkubálás nélkül) adtuk. Az Eristicophis macmahonii és a Sistrurus m. barbouri mérgekből izolált peptidek legalább kétszer olyan hatékonyak voltak, mint az echistatin, összhangban a fentebb leírt, a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését gátló képességben megfigyelt sorrenddel.

8. példa

VÁG tisztítása a Crotalus cerastes cerastes mérgéből

Egy gramm Crotalus c. cerastes-ből származó mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #CE4SZ) feloldottunk 7,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex

G-50 fine (Pharmacia, 2,5 χ 100 cm) oszlopra, melyet előzőleg telítettünk, és 0,5 M-os ecetsavval eluáltuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt, és a frakciókat 5 ml30 énként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Megvizsgáltuk a frakciók egységnyi térfogatainak az aggregáció gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (71 — 80) összegyűjtöttük, és liofílizáltuk. A száraz anyagot újra szuszpendáltuk 2,0 ml 0,5%-os

TFS-ben, az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítottuk, majd egy preparatív C-18 Waters HPLCoszlopra vittük a 3. példában leírt módon, és eluáltuk a 3. példában leírt gradiens eluálási körülményeit alkalmazva. Az oszlopról lejövő frakciókat polipropiléncsö40 vekbe gyűjtöttük, betöményítettük, és elemeztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat. A 20. ábra mutatja a HPLC-elválasztással kapott aktivitásprofilt.

A vérlemezke-aggregálódást gátlásban aktív frakciókat összegyűjtöttük, és liofílizáltuk, majd újra megfuttat45 tűk a preparatív C-18 HPLC-oszlopon, ugyanazon gradienssel eluálva. A frakciókat kézzel összegyűjtöttük polipropiléncsövekbe, és csakúgy, mint az előző lépésben, megnéztük vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat. Az aktív frakciókat egy analitikai C-18 oszlo50 pon elemeztük a 4. példában leírt körülmények alapján, a homogén frakciókat összegyűjtöttük, és liofílizáltuk. Ezen anyag analitikai HPLC-n végzett elemzésének eredményeit a 21. ábrán mutatjuk be.

3. táblázat

Aminosav-összetételek

Aminosav	Crotalus c. cerastes	Crotalus atrox	Crotalus d. durissus	Crotalus totonatacus	Crotalus h. horridus	Bothrops cotiaia
Lys	3	3	3	3	4	3
Mis	0	0	0	0	0-1	0
Arg	5	5	5	5	4	8
Asx	11	10	12	10	10	10
Thr	5	4	4	4	3	2
Ser	1	2	2	2	2	1
Glx	7	6	5-6	5-6	6	8
Pro	5	6-7	4-5	5	7	6
Gly	9	8	10	10	8	8
Alá	7	6	8	8	8	9
Cys	12	12	12	12	10	12
Val	2	2	1	1	3	0
Met	1	0	0	0	1	0
He	0	1	1	1	0	1
Leu	3	3	3	3	2-3	2
Tyr	1	1	1	1	1	0
Phe	1	1	1	1	1	2
Trp	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
	73-74	70-71	72-74	70-72	70-72	72

A tisztított pepiidet aminosavanalízisnek vetettük alá, amelynek során kiderült, hogy, amint az a 3. táblázatban is látható, a peptid 73-74 aminosavból, közöt- 35 tűk 12 ciszteinből áll.

A tisztított peptidet (450 pg) feloldottuk 750 μΐ reakciópufferben [6 M guanidin-HCl, 0,25 M TrisHC1, 20 mM EDTA, 20 mM ditiotreitol (DTT), pH=7,50], a peptid teljes redukciója céljából szobahőmérsékleten hagytuk 1,5 óráig, majd ezt követte a jódacetamid (Fluka, 16 mg) feleslegével végzett 1 órás reakció. A reakciót 500 pl 1%-os TFS hozzáadásával állítottuk le, és egy analitikai C-18 HPLC-oszlopra vittük, majd a következő gradienssel eluáltuk: 20 perc alatt emeltük az acetonitril koncentrációját 8%-ról 25%-ra, majd 10 perc alatt 60%-ra. Az UV elnyelést mutató csúcsot kézzel gyűjtöttük össze egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe, és megszárítottuk.

Ennek a karboxi-metilált pepiidnek egy részét N-terminális-szekvenciaelemzésnek vetettük alá. A karboximetilált peptid teljes proteolitikus hasítását a Lys-C és az Asp-N endoproteinázok felhasználásával végeztük.

Az emésztés utáni keverékből izoláltuk a peptidfragmenteket C-3 vagy C-18 fordított fázisú HPLC-oszlopon acetonitril/víz/TFS gradiens körülményei között. Az aminosavszekvenciát a 4. példában leírt módon határoztuk meg. A „cerastin ” komplett aminosavszekvenciáját a 6. ábrán, az egyéb VAG-okkal való összehasonlítását a

12. ábrán mutatjuk be.

9. példa

VÁG tisztítása a Crotalus ruber ruber mérgéből

Egy gramm Crotalus ruber ruber-6ő\ származó mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #CF17SZ) feloldottunk 8,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex G-50 fine (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) oszlopra, szobahőmérsékleten telítettük, és 0,5 M-os ecetsav40 val eluáltuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt, és a frakciókat 5 ml-enként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Megvizsgáltuk a frakciók egységnyi térfogatainak az aggregáció gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (61-70) összegyűjtöt45 tűk, és liofilizáltuk. A száraz anyagot újra szuszpendáltuk 2,0 ml 0,5%-os TFS-ben. Az oldhatatlan anyagot centrifúgálással eltávolítottuk, majd egy preparatív C-18 Waters HPLC-oszlopra vittük a korábban leírt módon, és eluáltuk a 3. példában leírt gradiens elúciós 50 körülményeit alkalmazva. Az oszlopról lejövő frakciókat polipropiléncsövekbe összegyűjtöttük, Speed-Vackoncentrátoron betöményítettük, és elemeztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat.

A 22. ábra mutatja a HPLC-elválasztással kapott ak55 tivitásprofilt. Az egyedi aktív frakciókat liofilizáltuk. A 49-es és 50-es aktív frakciókat összegyűjtöttük, és egy fordított fázisú C-18 oszlopra vittük, és a 4. példában leírt körülmények alapján eluáltuk: 20 perc alatt emeltük az acetonitril koncentrációját 8%-ról 25%-ra, 60 majd 10 perc alatt 69%-ra, annak érdekében, hogy meg22 kapjuk a „ruberin”-nek nevezett homogén pepiidet. A karboxi-metilált peptid automata Edman-degradációja a 6. ábrán bemutatott szekvenciaeredményt adta.

10. példa

VÁG tisztítása a Crotalus atroxból

Egy gramm Crotalus atrox-böl származó mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #CX16AZ) feloldottunk 10,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex G-50 fine (Pharmacia, 2,5x100 cm) oszlopra, melyet előzőleg szobahőmérsékleten telítettünk, és 0,5 M-os ecetsavval eluáltuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt, és a frakciókat 5 ml-enként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Megvizsgáltuk a frakciók egységnyi térfogatainak az aggregáció gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (81-100) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk. A száraz anyagot újra szuszpendáltuk 2,0 ml 0,5%-os TFS-ben, majd egy preparatív C-l8 Waters HPLC-oszlopra vittük, és eluáltuk a 3. példában leírt módon. Az oszlopról lejövő frakciókat polipropiléncsövekbe összegyűjtöttük, Speed- Vac-koncentrátoron betöményítettük, és a korábban leírt módon elemeztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat.

Az aktív frakciókat újra megfuttattuk a fordított fázisú C-l8 oszlopon annak érdekében, hogy homogén peptidhez jussunk (23. ábra). A karboxi-metilált peptid automata Edman-degradációja a 6. ábrán bemutatott szekvenciaeredményt adta. Ezen anyag aminosavelemzésének eredményeként kiderült, hogy a peptid 70-71 aminosavat, közöttük 12 ciszteinszármazékot tartalmaz, amint az a 3. táblázatban is látható. A „crotatroxin ” izolált peptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán látható.

11. példa

VÁG tisztítása a Bothrops cotiarából

Hatszáznyolcvan milligramm Bothrops cotiara-bíA származó mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #BO5SZ) feloldottunk 10,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex G-50 fine (Pharmacia, 2,5 χ 100 cm) oszlopra, melyet előzőleg telítettünk, és 0,5 M-os ecetsavval eluáltuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt, és a frakciókat 5 ml-enként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Megvizsgáltuk a frakciók egységnyi térfogatainak az aggregáció gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (71-90) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk. A száraz anyagot újra szuszpendáltuk 2,0 ml 0,5%-os TFS-ben, majd egy preparatív C-l8 Waters HPLC-oszlopra vittük. Az oszlopot a 3. példában leírt gradiens elúciós körülményeit alkalmazva eluáltuk. Az oszlopról lejövő frakciókat polipropiléncsövekbe összegyűjtöttük, Speed-Vac-koncentrátoron betöményítettük, és elemeztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat. Az aktív frakciókat egyenként liofilizáltuk.

Néhány csúcsfrakciót újra megfuttattunk az analitikai C-l8 oszlopon a 4. példában leírt módon. A homogén peptid analitikai HPLC-profilját a 24. ábra mutatja. Ezen anyag aminosavanalízisének eredményeképpen kiderült, hogy a peptid 72 aminosavból, közöttük 12 ciszteinből áll, amint azt a 3. táblázat is mutatja. A „cotiarin ”-nak nevezett peptid teljes aminosavszekvenciáját a 6. és a 12. ábrán mutatjuk be.

A tisztított peptidet megvizsgáltuk az 1. példában leírt receptorteszttel. Kezdeti meghatározások azt mutatták, hogy a cotiarin alacsony koncentrációban (1-4 nM) szelektíven gátolja a vitronektin kötődését a vitronektin-receptorhoz, valamint azonos koncentrációk szignifikánsan kevésbé gátolták a fibrinogén kötődését a GP Ilb-Illához, amint az a 25. ábrán is látható. A későbbi kísérletek azonban nem erősítették meg ezt az eredményt.

12. példa

VÁG tisztítása Crotalus viridis lutosusból

A. Egy gramm Crotalus viridis lutosus-bó\ származó mérget (Miami Serpentarium Labs, Lót #CL18SZ) feloldottunk 8,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex G-50 fine (Pharmacia, 2,5 χ 100 cm) oszlopra, amelyet előzőleg szobahőmérsékleten telítettünk, és 0,5 M-os ecetsavval eluáltuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt, és a frakciókat 5 ml-enként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. Megvizsgáltuk a frakciók egységnyi térfogatainak az aggregáció gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (71-100) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk. A száraz anyagot újra szuszpendáltuk 2,0 ml 0,5%-os TFS-ben. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítottuk, majd egy preparatív C-l8 Waters reverz fázisú oszlopra vittük, és eluáltuk a 3. példában leírt gradiens elúciós körülményeit alkalmazva. Az oszlopról lejövő frakciókat polipropiléncsövekbe összegyűjtöttük, Speed-Vackoncentrátoron betöményítettük, és elemeztük a vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitásukat. Az aktív frakciókat az egyedi csöveikben liofilizáltuk. A kiemelkedő aktivitású frakciókat újra megfuttattuk az analitikai C-l8 oszlopon, a 4. példában leírt acetonitril gradienst használva. A frakciókat kézzel gyűjtöttük össze 1,5 mles Eppendorf-csövekbe. A homogén frakciókat összegyűjtöttük, és liofilizáltuk. Az anyag analitikai HPLCelemzése egyetlen szimmetrikus csúcsot mutatott. Ezen „lutosin”-nak nevezett peptid teljes aminosavszekvenciáját a 6. és 12. ábrán mutatjuk be.

B. Az A. fejezetben bemutatotthoz hasonló módon izoláltuk a VAG-okat a B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, C. v. oreganus, C. h. horridus, C. v. helleri, C. durissus totonatacus és C. m. molossus fajokból is. Ezek közül néhány peptid aminosav-összetételét a 3. táblázatban mutatjuk be. A horridinnek, basilicinnek, molossinnak, oreganinnak és durissinnek nevezett VAG-ok aminosavszekvenciái a 6. ábrán láthatóak. Az 1 — 12. példákban leírt tisztított peptidek receptorkötési adatait a 26. ábrán mutatjuk be.

Az alábbi, 13-16. példákban leírt peptideket szilárd fázisú technikával szintetizáltuk egy Applied Biosystems 431A peptidszintetizátoron, HOBt formában aktivált t-Boc aminosavak felhasználásával, a használati utasításban leírtakkal összhangban, amely röviden összefoglalva a Boc-AA[..........AA_<n_₁₎-AA^_n)-O-PAMpolisztiréngyanta képletű peptidekre a következő:

A kiválasztott, Boc-AA_(n)-O-PAM-polisztiréngyanta képletű anyagból másfél mmol-nyit a következő lista szerint kezelünk a Boc-AA_(n,—OH beépítése végett:

1. Védőcsoport-eltávolítás TFS-sel: 30% TFS DCM-ben, 3 perc, 50%-os TFS DCM-ben, 16 perc.

2. Mosások és semlegesítések: DCM-es mosás (5X), 3 perc, 5% DIEA DCM-ben, 2 perc, 5% DIEA NMP-ben, 2 perc. NMP mosás (6X), 5 perc.

3. Párosítás: 4 ekvivalens Boc-AA-HOBt észter NMP-ben (55 perc előaktiválás) 38 perc, DMSO hozzáadása 15% DMSO/85% NMP készítése végett, 16 perc, 3,8 ekvivalens DIEA, 5 perc.

4. Mosás és a minta gyantázása: NMP mosás, 3 perc.

5. Védősapka-felvitel: 10% ecetsavanhidrid, 5% DIEA NMP-ben, 8 perc.

6. Mosás: DCM mosás (6X), 4 perc.

13. példa

Az #l-es analóg, [E^íi,L^,Cf^A]barbourin(28- 73):

E- C—A-D-G-L - C- C-D-O-C-R-F-L-KK- G- T- V- C-R- V-A-K- G-D- W-N-D-DT-C-T-G-O-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G készítése

Egy fél mmol PAM-Gly-gyantát (0,6 mg/g, Applied Biosystems, Forster City, CA) a kívánt aminosavakkal együtt alávetettünk az A. eljárásnak (a beépítés érdekében). A Boc által védett aminosavaknak a következő oldalláncvédelmeik voltak: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Thr(OBzl), Trp(CHO) és Tyr(Br-Z). A teljes védett peptid-gyanta lánc összeállítását követően az aminoterminális Boc-csoportot TFS-sel eltávolítottuk, és a gyantát TFS-só formájában kiszárítottuk. A gyantát (1,3 g) „alacsony-magas” HF védőcsoport-eltávolításnak tettük ki, amelyet a HF eltávolítása követett vákuumban. A szárított peptid-gyanta keveréket egy porózus tölcsérbe (durva) tettük át etil-éterrel, és néhányszor megmostuk váltakozva éterrel és kloroformmal, annak érdekében, hogy eltávolítsuk a legtöbb szerves védőcsoportot és a védtelenítés során használt adalékokat.

A peptidkeveréket 2 L 0,4%-os ecetsavba tettük, és a pH-t NH₄OH-dal beállítottuk 7,99-re. A gyantát kiszűrtük az oldatból, hagytuk leülepedni 4 °C-on, 20 órán keresztül. Ezt követte az oldat felmelegítése szobahőmérsékletre, és ismét állni hagytuk 3 napig, keverés nélkül. A kicsapódott anyagot szűréssel eltávolítottuk, és a felülúszó pH-ját ecetsavval beállítottuk 3,0-ra, majd liofilizáltuk.

A nyers anyagot feloldottuk 8,0 ml 0,5 M-os ecetsavban, és felvittük Sephadex G-50 fme (Pharmacia, 2,5x100 cm) oszlopra, szobahőmérsékleten telítettük, és 0,5 M-os ecetsavval eluáltuk. Az áramlási sebesség 20 ml/óra volt, és a frakciókat 4 ml-enként polipropiléncsövekbe gyűjtöttük. A frakciók egységnyi térfogatát megszárítottuk, vízben újra szuszpendáltuk, és megvizsgáltuk a vérlemezke-aggregálódás gátlására gyakorolt hatását a korábban leírt módon. Az aktív frakciókat (71-90) összegyűjtöttük, és liofilizáltuk.

A száraz anyagot (66 mg) újra oldottuk 2,0 ml

0,1 M-os ecetsavban, majd egy 8% acetonitril-tartalmú

0,1 %-os TFS-oldattal telített preparatív C-18 Waters

HPLC-oszlopra vittük. Egy 8%-ról a 20% acetonitrilkoncentrációt 10 perc alatt elérő, majd egy lassú, a 30%-ot 40 perc alatt elérő gradienst alkalmaztunk. Az oszlopot 18 ml/perc áramlási sebességgel eluáltuk, és a lejövő frakciókat (12 másodperc) polipropiléncsövekbe összegyűjtöttük. Speed-Vac-koncentrátoron 1 ml térfogatra betöményítettük, 10 μΐ-es egységeket megvizsgáltunk vérlemezke-aggregálódási tesztekben.

Az egyedi, aktív frakciókat (29-32) liofilizáltuk, és analitikai C-18 HPLC-oszlopon elemeztük 8-30% acetonitril gradienssel. A 29 és 30 frakciókat összegyűjtöttük, és analitikai oszlopra vittük 1,0 ml 0,5%-os TFS-ben. A fő csúcsot kézzel összegyűjtöttük, és liofilizáltuk, így 1,6 mg tiszta peptidet kaptunk.

Ezen anyag aminosavanalízise megerősítette a pepiid azonosságát. A 26. és 27. ábrákon mutatjuk be az anyaggal végzett teszt eredményeit, amelyben vizsgáltuk a fibrinogén-GP Ilb-IIIa és a vitronektin-Vn-receptor kötések gátlásának képességét. Ezek az adatok az analóg nagy affinitását mutatják a GP Ilb-IIIa komplexhez, és az aktivitás viszonylagos hiányát a VnR-hez 1 μΜ koncentráción belül.

14. példa

A #2 analóg, [K^Jeristicophinfd-Ól):

E-E-P-C—A-T-G-P-C-C-R-R-K-F-KR-A-G-K- V-C-R-V-A-K-G-D- W-N-MD-Y-C-T—G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-WN-G

Fél mmol PAM-Gly-gyantát (0,6 mg/g, Applied Biosystems, Forster City, CA) a kívánt aminosavakkal együtt alávetettünk az A. eljárásnak (a beépítés érdekében). A Boc által védett aminosavaknak a következő oldalláncvédelmeik voltak: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(CHO) és Tyr(Br-Z). A peptid hasítása, újra összerakása és a tisztítása azonos volt az előző példákban leírtakkal. Erre az analógra jellemző kötődési adatokat a 26. és 28. ábrán mutatjuk be.

75. példa

A #3 analóg:

G-C-G-K-G-D—W-P-C-A-NH₂ készítése

Fél mmol pMBHA-gyantát (0,72 meq/g, Applied Biosystems, Forster City, CA) a kívánt aminosavakkal együtt alávetettünk az A. eljárásnak (a beépítés érdekében). A Boc által védett aminosavaknak a következő oldalláncvédelmeik voltak: Asp(OcHex), Cys(4MeBzl) és Lys(Cl-Z), Thr(OBzl). A védett peptidgyanta összeállítását követően az aminoterminális Boccsoportot TFS-sel eltávolítottuk, és a gyantát TFS-só formájában szárítottuk meg. A gyantát (1,54 mg) 10% anizolt, 2% etil-metil-szulfidot tartalmazó, vízmentes hidrogén-fluoriddal (HF) kezeltük 30 percen át -10 °Con, és további 30 percig 0 °C-on. A HF-ot vákuumban eltávolítottuk, és a peptid/gyanta keveréket dietil-éterben szuszpendáltuk, amit 3X-i mosás követett felváltva kloroformmal és éterrel. Az utolsó éteres mosás után a peptidet 2,0 M ecetsavval kivontuk a gyantából, desztillált vízzel hígítottuk, és liofilizáltuk.

A nyers peptidet (370 mg) feloldottuk oxigénmentesített, 10 mM NH₄0Ac, pH=8,0 oldatban 0,5 mg/ml végkoncentrációban, és lassan hagytuk oxidálódni, cseppenként feleslegben adagolva a 0,01 M kálium-ferricianid [K₃Fe(CN)₆] oldatot, további 20 percig kevertettük, és ecetsavval beállítottuk a pH=5 értéket. A peptidoldatot DOWEX AG3x4 anioncserélő gyantával kezeltük 15 percig keveréssel, majd a gyantát leszűrtük, és az oldatot vízzel hígítottuk, liofilizáltuk annak érdekében, hogy nyers, ciklizált peptidet kapjunk. A nyers, ciklizált peptidet (392 mg) sótalanítással tisztítottuk Sephadex G-25F oszlopon 0,5 M ecetsavat használva eluensként, amelyet ioncserélő kromatográfia követett CM-Sepharose (Pharmacia) oszlopon 100 mM-tól 10 mM koncentrációig teljedó NH₄OAc-oldatot (pH=4,5) használva gradiens eluálószerként. A frakciókat, amelyek HPLCanalízis alapján legalább 90% tisztaságúak, összegyűjtöttük, és a víz eltávolítására néhányszor liofilizáltuk, és így kaptunk 175 mg-ot. A tiszta peptid előállításának befejező tisztítási lépése HPLC-tisztításból állt egy Waters C-18 reverz fázisú oszlopon, acetonitril/víz/TFS gradienssel. Az analógra vonatkozó receptorkötési adatokat a 26., 29. és 30. ábrákon mutatjuk be.

16. példa

További analógok készítése

A következő analógokat készítettük el, a legtöbb esetben a 15. példában leírthoz hasonló módon. Bár az alant bemutatott 60-as analógot oldatban készítettük a 19-es analógban lévő lizinszármazék oldalláncának guanidizálási lépésén keresztül, Bajusz, S. és munkatársai, FEBS Leets. (1990), 770:85-87 által leírt módszer szerint.

Egy mg 19-es analógot reagáltattunk 1 mg 1 -amino3,5-dimetil-pirazol-nitráttal (Aldrich), 1 ml abszolút etanolban diizopropil-etil-amin (DIEA) jelenlétében, szobahőmérsékleten 4 napig. A terméket, a 60-as analógot, a felesleges reagensektől és kiindulási anyagoktól reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk meg, C-18 oszlopon acetonitril gradienst használva 0,1%-os trifluor-ecetsavban. Kilencszáz mikrogramm anyagot izoláltunk tiszta formában.

#4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂ #5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂ #6: G-C-G-K-G-D-W-C-A-NH₂ #7: G-C-K-G-D-W-C-A-NH₂ #8: Acety-C-K-G-D-C-NH₂ #9: Mpr-K-G-D-Pen-NH₂ #10: C-K-G-D-W-P-C-NH₂ #11: Acetyl-C-R-G-D-Pen-NH₂ #12: C-K-G-D-Y-P-C-NH₂ #13: C-K-G-D-F-P-C-NH₂ #19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂ #34: C-K-G-D-W-G-C-NH₂ #35: C-K-G-E-W-P-C-NH₂ #36: C-Om-G-D-W-P-C-NH₂ #37: C-K-A-D-W-P-C-NH₂ #38: C-K-At-D-W-P-C-NH₂ #39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂ #40: C-K(Formy)-G-D—W-P-C—NH₂#41: C-K-G-D-I-P-C-NH₂ #42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂ #43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂ #44: C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂ #45: C-K-G—D-(NMePhe)-P-C-NH₂ #46: C-H-G-D-W-P-C-NH₂ #47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH₂ #48: Mpr-K-G-D-W-(Formyl)-P-C-NH₂ #49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂ #50: Mpr-K-G-D-Wt-P-Pen-NH₂ #51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂ #52: Mpr-K-G-D-W-P-Pent-NH₂ #53: Mpr-K-G-D-W-Pt-Pen-NH₂ #54: Mpr-K-G-Dt-W-P-Pen-NH₂ #55: Mpr-K-G—D-W-(Thz)-C-NH₂ #56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH₂ #57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂ #58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂ #59: Mpr-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂ #60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂ #61: Mpr-K-G-D-W-P-Ct-NH₂ #62: Mpr-Kf-G-D-W-P-Pen-NH₂ #63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂ #64: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH₂ #65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH₂ #66: Mpr-(N^G,N^G-etil; n-Har)-G-D-W-P-C-NH₂ #67: Mpr-(N^G,N^G-etil; n-Har)-G-D-W-P-PenNH₂ #68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂ #69: Mpr- (Acetimidyl- Lys)-G-D-W-P-C -NH₂ #70: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH₂ #71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH₂ #72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂ #73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro P)-C-NH₂

7. példa

A peptidek VAG-aktivitása

Amikor a fent leírt, standard, aggregálódás gátlását vizsgáló tesztben néztük, a #3-5 analógok IC₅₀-értéke 5 μΜ volt az ADP-vel indukált emberi vérlemezkeaggregálódást gátló képesség tekintetében. Bár a #6-os analóg IC₅₀-értéke 200 μΜ és a #7-es analógé pedig 100 μΜ. A találmány analógjainak ebben a tesztben kapott IC₅₀-értékei a következők:

Analóg Szekvencia kb. IC₅₀ (μΜ)

#3	G-C-G-K-G-D-W-P-C- a-nh₂	5
#4	g-c-k-g-d-w-p-c-a-nh₂	5
#5	C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂	200
#6	G-C-G-K-G-D-W-C- a-nh₂	100
#7	g-c-k-g-d-w-c-a-nh₂	200
#8	Acety-C-K-G-D-C-NH₂	200
#9	Mpr-K-G-D-Pen-NH₂	25
#10	c-k-g-d-w-p-c-nh₂	5
#11	Acetyl-C-R-G-D-Pen-NH₂	5
#12	c-k-g-d-y-p-c-nh₂	12
#13	C-K-G-D-F-P-C-NH₂	20
#19	Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂	1

#34	C-K-G-D-W-G-C-NH₂	100
#35	c-k-g-e-w-p-c-nh₂	300
#36	C-Om-G-D-W-P-C-NH₂	150-2(
#37	C-K-A-D-W-P-C-NH₂	100
#38	C-K-At-D-W-P-C-NH₂	200
#39	C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂	5
#40	C-K(Formy)-G-D-W-P- c-nh₂	200
#41	c-k-g-d-i-p-c-nh₂	100
#42	C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂	20
#43	C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂	50
#44	C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P- c-nh₂	75
#45	C-K-G-D-(NMePhe)-P- c-nh₂	200
#46	c-h-g-d-w-p-c-nh₂	200
#47	Acetyl-C-K-G-D-W-P- c-nh₂	2,5
#48	Mpr-K-G_D-W-(Formyl)-P- c-nh₂	1
#49	Mv1-K-G-D-W-P-C-NH₂	1,5
#50	Mpr-K-G-D-Wt-P-Pen-NH₂	200
#51	Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂	0,75
#52	Mpr-K-G-D-W-P-Pent-NH₂	5
#53	Mpr-K-G-D- W-Pt-Pen-NH₂	200
#54	Mpr-K-G-Dt-W-P-Pen-NH₂	100
#55	Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂	2
#56	Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P- c-nh₂	5
#57	Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P- Pen-NH₂	1
#58	Mvl-K-G-D-W-P—Pen-NH₂	1
#59	Mpr-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂	1
#60	Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂	0,15
#61	Mpr-K-G-D-W-P-Ct-NH₂	15
#62	Mpr-Kt-G-D-W-P-Pen-NH₂	2,5
#63	Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NE	[₂ 0,10
#64	Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D- w-p-c-nh₂	0,25
#68	Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂	3
#69	Mpr- (Acetimidy 1-Ly s)-G- D W-P-C-NH₂	0,5
#70	Mpr- (Phenylimidyl-Lys) - G - DW-P-C-NH₂	0,5
#71	Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH	[₂ 2,5
#72	Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D- W-P-Pen-NH₂	0,5

18. példa

A lineáris peptidek aktivitása a ciklikusakhoz képest Amikor a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa-hoz való kötése gátlását vizsgáltuk lemeztesztben, a lineáris RGDWNH₂ aktivitásban nagyon hasonló volt a ciklikus GCGRGDWPCA-NH₂-hoz (29. ábra). Ezzel ellentétben a lineáris KGDW-NH₂ sokkal hatástalanabb volt, mint a ciklikus GCGKGDWPCA-NH₂ (29. ábra). A KGDWkomponensek esetén, de az RGDW-komponenseknél nem, a ciklizálás lényeges növekedést eredményezett a peptid azon képességében, hogy gátolja a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődését.

19. példa

A szintetikus peptidekre végzett lemez kötődési tesztek eredményei

A 17. példában szintetizált peptideket a találmány fentebb leírt lemeztesztjével szintén megvizsgáltuk annak becslésére, hogy milyen a vérlemezkék aggregálódását közvetlenül gátló képességük. A 4-8 analógok esetében kapott eredményeket a 30. ábrán mutatjuk be. Amint az ábrán jelezzük, ezek az analógok eltérően és különböző mértékben képesek gátolni a fibrinogénnek a GP Ilb-IIIa komplexhez való kötődését összehasonlítva a vitronektin vitronektin-receptorhoz való kötődésével. Úgy tűnik, hogy ebben a csoportban a #4-es analóg a legeltérőbb. Másrészt a #7-es és az #5-ös analógok szintén elég specifikusak, és kitűnő vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitással rendelkeznek.

20. példa

A tisztított peptidek hatása a sejtek adhéziójára

Az M21 melanomasejteket ³⁵S-metioninnal jelöltük, majd vitronektinnel borított lemezekhez adtuk, a feltüntetett koncentrációban jelen lévő, tisztított kígyóméregpeptidekkel együtt. A sejtek megtapadását az inkubálás és a mosás után maradó sejtek leoldása után az 1. példa C. részében leírt módon mértük. Amint a 31. ábrán bemutatjuk, sem a barbourinnak, sem az 1-es pepiidnek (feltételezett barbourin) nincs szignifikáns hatása a sejtek vitronektinhez történő tapadására, bár mindkettő hatásos inhibitora a vérlemezkék aggregálódásának, amint azt a 2. és a 3. példában bemutattuk. Ezzel ellentétben a cotiarin, amely hatásosan gátolja a vitronektin kötődését a vitronektin-receptorhoz, nagyon hatékonynak bizonyult a sejtek vitronektinhez való megtapadásának gátlásában. Hasonló kísérletben vizsgáltuk a #3-as peptidet (a #3-as pepiidben a K van cserélve R (GCGRGDWPCA-NH₂)re, és az RGDS-t az M21 sejtek vitronektinhez való tapadásának szempontjából. Amint a 32. ábrán bemutatjuk, az RGDS és a GCGRGDWPCA-NH₂ a sejtek megtapadásának hatásos inhibitorai, valamint a GCGKGDWPCA-NH₂ hatástalan volt 60 μΜ-ig.

21. példa

A 60-as és a 19-es analógok összehasonlítása

A fentiekben leírt 60-as és 19-es analógok a találmány K*GDX-szekvenciát tartalmazó peptidjei, és a K* kivételével azonosak. A 60-as analóg képlete:

Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂.

A 19-es analóg képlete:

Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂.

Ezeket az analógokat is a standard vérlemezkeaggregálódási teszttel és a 20. példában fentebb leírt sejtadhéziós teszttel vizsgáltuk. Az eredményeket a 33. és 34. ábrákon mutatjuk be. Amint a 33. ábrán bemutatjuk, a 60-as analóg elenyészően kicsi koncentrációban is elegendő a vérlemezke-aggregálódás gátlásához, és viszonylag kevésbé hatékony a sejtek vitronektinhez történő tapadásának megelőzésében. A 34. ábra mutatja, hogy a 19-es analóg jó vérlemezke-aggregálódást gátló aktivitással és specifitással rendelkezik; bár kevésbé aktív a vérlemezke-aggregálódást vizsgáló teszt26 ben, mint partnere, a 60-as analóg. A 60-as analóg IC₅₀értéke a vérlemezke-aggregálódásban megközelítőleg 0,15 nM; a 19-es analóg IC₅₀-je pedig körülbelül 1 nM.

22. példa

A trombózis Folt-modellje kutya szívkoszorú-artériában

A. Ciklikus áramláscsökkenés előidézése kutya nyitott mellkasában. Egy 20 kg-os kutya bal elülső leszálló (LAD) szívkoszorú-artériájában elzárást végeztünk el a korábban leírt módon. A 35. ábrán bemutatjuk az elektromágneses áramlásmérővel mért időszakos és fő véráramot, valamint a Doppler-árampróbát.

B. A ciklikus GCGKGDWPCA-NH₂ (#3-a.s analóg) hatása a CFR-ekre kutya nyitott mellkasában. A peptid 10 mg-os adagját infúzióval juttattuk a kutya perifériális vénájába. A 36. ábrán látható a véráram-mintázat a LAD-ban. Érdekes a CFR-ek részleges hiánya, mely a véráram csökkenésén látható. Szintén érdekes, hogy az áramlás nem csökkent olyan mértékben, mint a kontroll (A) esetében.

C. A #3-as analóg 40 mg-jának második infúzióját is bevittük a perifériális vénába. Amint a 37. ábrán bemutatjuk, a CFR-ek teljes hiánya jelzi, hogy a teljes áramlás helyreállt a LAD-ban.

23. példa

A barbourinpeptideket expresszáló vektorok készítése

A teljes láncú [L^4l]barbourinpeptidet(l-73) kódoló gént szintetikus oligonukleotidokból állítottuk össze, amint az a 38. ábrán látható, amelyeket kinázzal kezeltünk, csatoltunk, és a standard eljárással ligáltunk az EcoRI-HindlII enzimekkel emésztett M13mpl8-ba. A bakteriális alkalikus foszfatáz gén (phoA) szignálszekvenciáját [Watson, Μ. E. E., Nucleic Acids Research (1984), 72:5145] hozzáadtuk a barbourinkonstrukcióhoz. A 39. ábrán bemutatott módon szintetikus oligonukleotidokat ligáltunk az [L⁴¹]barbourin(l-73) konstrukció EcoRI/NcoI helyére. Valamennyi konstrukció nukleotidszekvenciáját Sanger dideoxilánc-terminációs módszerével erősítettük meg.

A peptid csonka változatát, amely a teljes láncú molekulából csak a 28-73 aminosavakat kódolná, szintén elkészítettük szintetikus oligonukleotidokból. Két változtatást vezettünk be: a Q²⁸-at E^2íi-ra és az A^-et C⁶⁴-re cseréltük a Kunkel és munkatársai, Meth. Enzymol. (1987), 154-.3(01 által leírt helyspecifikus mutagenezis felhasználásával. A phoA szignálszekvenciát a fentebb leírt módon (40. ábra) adtuk a megcsonkított változathoz. Továbbá a megcsonkított változathoz hozzáadtuk még az E. coli hőstabil enterotoxin II [Picken, R. W. és munkatársai, Infect. Immun. (1983), 42:269] gén szignálszekvenciáját a szintetikus oligonukleotidok EcoRI és Ncol enzimek hasítóhelyeivel kompatíbilis végeknek a felhasználásával. Valamennyi bakteriális konstrukciót EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázok felhasználásával szubklónoztuk a pPROK-1 bakteriális expressziós vektorba [Brosius I, Gene (1984), 27:151], amely kereskedelmi forgalomban a CLONTECH Láb. Inc.-tői hozzáférhető.

A kívánt peptidek tandem ismétlődéseit kódoló gént polimeráz láncreakció (PCR) felhasználásával készítettük, annak érdekében, hogy többszöröződő egységet állítsunk elő az L⁴¹- és C⁶⁴-tartalmú teljes láncú barbourinpeptidből.

A 41. ábra bemutatja a PCR-szintézisre használt oligonukleotidokat. A PCR-reakciót Saiki, R. K. és munkatársai, Science (1988), 239:487 által leírt módszer szerint hajtottuk végre. A keletkező polimer kapcsolat a szekvencia bármelyik végén tartalmaz metioninokat, amint azt a 42. ábrán bemutatjuk, és biztosítja a beépítéshez a kívánt restrikciós helyeket.

Tandem ismétlődések az egyedi, multimerformáló komponensekből képződnek, például egy EcoRI/BamHI fragment Bgin/HindlII ffagmenthez való ligálásával egy EcoRI/HindlII vágott M13mpl8 vektorban dimer keletkezik. A kapott dimert EcoRI-gyel és BamHI-gyel kivágjuk, és trimer keletkezése érdekében újra ligáljuk egy BglII/HindlII íragmenthez, és így tovább, amíg megkapjuk a kívánt méretet. A konstrukciót a 43. ábrán mutatjuk be.

A multimert ezután a Clontechtől vásárolható pKK233-2 [Amman, E. és munkatársai, Gene (1985), 40:183] E. coli vektorba klónoztuk oly módon, hogy a vektort NcoI/HindlII enzimekkel emésztettük, és az NcoI/BamHI szubífagmentet és a BglII/HindlII multimer szubfragmenteket összeligáltuk.

Fúziós fehérjeként történő expresszió esetén a fenti módon emésztett vektort használtuk egy Ncol-EcoRI szubfragment, amely a koramfenikol-acetil-transzferáz gén [Chang, C. N. és munkatársai, Gene (1987), 55:189] enyhén módosított aminoterminális részét (1-72) tartalmazza, és a multimer konstrukciók EcoRI-HindlII szubfragmentjei mellett.

24. példa

A rekombináns gének expressziója

Valamennyi fent leírt plazmid esetében a fehérje expresszióját Kanamari és munkatársai, Gene (1988), 66:295 által leírtak alapján indukáltuk a megfelelő E. coli gazdatörzsekbe történt transzfekció után. A termékeket nátrium-lauril-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel és az ADP-vel indukált vérlemezke-aggregálódást gátló képességük alapján jellemeztük. A tisztítást követően a multimer fehéijéket cianogén-bromidos hasítással monomer egységekké alakítottuk, és a termékeket a fent leírt módon megvizsgáltuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás tisztított, vérlemezke-aggregálódást gátló (VÁG) szer előállítására, azzal jellemezve, hogy kígyóméregből a fibrinogén és/vagy a von Willebrand-faktor GP Ilb-IIIa-hoz kötődését specifikusan gátló, és a vitronektin kötődését a vitronektin-receptorhoz vagy a fibronektin kötődését a fibronektin-receptorhoz viszonylag kevésbé gátolni képes VAG-komponenst izoláljuk.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tisztított és izolált VÁG vagy annak módosított és/vagy csonkított formájának előállítására, azzal jellemezve, hogy az izolálást az Echis carinatus, Trimeresurus gramineus, T. flavoviridis, T. elegáns, T. alborabris, Bitis arietans, Bothrops atrox, Agkistrodon halys, Agkistrodon p. piscivorus vagy Agkistrodon rhodostoma fajoktól eltérő kígyó mérgéből nyerjük ki.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kígyómérget a következő fajokból álló csoport valamelyik fajából izoláljuk: Echis colorata, Eristcophis macmahonii; A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorous conanti; Bothrops asper, Bothrops cotiara, B.jararaca, B.jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli; Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis; Lachesis mutas; Sistrurus catenatus tergeminus és Sistrurus milarus barbouri.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kígyómérget a következő fajokból álló csoport valamelyik fajából izoláljuk: Eristicophis macmahonii (eristicophin); Bothrops cotiara (cotiarin), B. jararacussu; Crotalus atrox (crotatroxin), Crotalus basilicus (basilicin), C. cerastes cerastes (cerastin), C. durissus totonatacus (durissin), C. durissus durissus (durissin),

C. h. horridus (horridin), Crotalus m. molossus (molossin), C. ruber ruber (ruberin), Crotalus viridis lutosus (lutosin), C. v. viridis (viridin), Crotalus v. oreganus (oreganin), Crotalus v. helleri; Lachesis mutas (lachesin); Sistrurus catenatus tergeminus (tergeminin) és S. milarus barbouri (barbourin).

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolálást és tisztítást a következő lépésekből álló eljárással végezzük:

- a mérget felvisszük egy méret alapján elválasztó oszlopra annak érdekében, hogy 10 kd-nál kisebb molekulasúlyú komponenseket tartalmazó oldatot kapjunk, majd

- ezt a frakciót reverz fázisú HPLC-re visszük, és több frakciót választunk el,

- kivesszük azokat a frakciókat, amelyek gátolják a fibrinogén kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10 kd-nál kisebb frakciót úgy kapjuk, hogy a mérget oszlopkromatográfiának vetjük alá méret alapján elválasztó gél felhasználásával, és több frakciót eluálunk az oszlopról, és izoláljuk azokat a frakciókat, amelyek gátolják a fibrinogén kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítást a következő lépésekkel végezzük:

- a mérget felvisszük egy méret alapján elválasztó oszlopra annak érdekében, hogy 10 kd-nál kisebb molekulasúlyú komponenseket tartalmazó oldatot kapjunk, majd

- ezt a frakciót reverz fázisú HPLC-re visszük, és több frakciót választunk el,

- kivesszük azokat a frakciókat, amelyek gátolják a fibrinogén kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10 kd-nál kisebb frakciót úgy kapjuk, hogy a mérget oszlopkromatográfiának vetjük alá méret alapján elválasztó gél felhasználásával, és több frakciót eluálunk az oszlopról, és izoláljuk azokat a frakciókat, amelyek gátolják a fibrinogén kötődését a GP Ilb-IIIa-hoz.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

9. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított VAG-szert és legalább egy gyógyszerészetileg elfogadott kötőanyagot szokásos adagolási alakra formálunk.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

10. Eljárás a 4. igénypont szerinti VAG-ot vagy annak módosított és/vagy csonkított formáját kódoló DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy kígyóméregben a fibrinogén és/vagy a von Willebrand-faktor GP Ilb-IIIa-hoz kötődését specifikusan gátló, és a vitronektin kötődését a vitronektin-receptorhoz vagy a fibronektin kötődését a fibronektin-receptorhoz viszonylag kevésbé gátolni képes proteint kódoló nukleotidot oligonukleotidok és/vagy nukleinsavak kapcsolásával építjük fel.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

11. Eljárás rekombináns expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy kígyóméregben a fibrinogén és/vagy a von Willebrand-faktor GP Ilb-IIIahoz kötődését specifikusan gátló, és a vitronektin kötődését a vitronektin-receptorhoz vagy a fibronektin kötődését a fibronektin-receptorhoz viszonylag kevésbé gátolni képes proteint kódoló DNS-szekvenciát működőképesen a megfelelő vektorhordozóba inszertáljuk.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

12. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti expressziós vektorral valamely megfelelő gazdasejtet transzformálunk.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

13. Eljárás VÁG termelésére, azzal jellemezve, hogy

-all. igénypont szerinti gazdasejtet a VAG-ot kódoló DNS expresszálásához megfelelő körülmények között tenyésztjük, és

- a keletkezett VAG-ot kinyerjük a tenyészetből.

(Elsőbbsége: 1989. 06. 16.)

14. Az 1. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Lys-Gly-Asp (KGD) aminosavszekvenciát tartalmazó proteint izoláljuk.

(Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő aminosavszekvenciát izoláljuk:

HU 216 318 Β

Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys20

Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-LeuAsp-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys

Val-Cys-Arg-Val-Ala-Lys-Gly-AspGly-Gln-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Argvagy annak módosított és/vagy csonkított formáját. (Elsőbbsége: 1989.06. 16.)

16. Az 1. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan specifikus vérlemezke-aggregálódást gátló (VÁG) anyagot izolálunk, amely az Fg- 15 nek vagy a vWF-nak a GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését lényegesen hatékonyabban képes gátolni, mint a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz vagy a fibronektinnek a fibronektin-receptorhoz való kötődését, és amely VÁG a K*(Sar/G)D aminosavszekvenciából áll, 20 ahol a K* az R¹2N(CH₂)₄CHNHCO képlet lizilszármazéka, ahol minden R¹ lehet H, alkil (1-6 C) vagy R¹legtöbbször R²-C=NR³, ahol R² lehet H, alkil (1-6 C), szubsztituált, illetve 25 nem szubsztituált fenil- vagy benzílszármazék, vagy NR⁴2, amelyben R⁴ H vagy alkil (1 - 6 C) csoport, és

R³ lehet H, alkil (1 - 6 C), fenil, benzil, vagy

R²-C=NR³ az alábbi képletekből választott gyök lehet 30 \_J . \=/.

es

N ^XN (CHR⁵)_ra ahol m értéke 2-3, és minden R⁵ lehet H vagy alkil (1-6 C) csoport, 40 és amelyekben egy vagy két (CH₂)-t O vagy S helyettesítheti, és az O, illetve S szomszédságában nem fordul elő másik heteroatom; és ahol K*(Sar/G)D-t legalább 8 aminosavszármazékból álló ciklikus peptidek tartalmazzák. 45 (Elsőbbsége: 1990.02.20.)

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló VÁG elsődleges struktúrája RGD vagy KGD, illetve ezek csonkított és/vagy módosított formáit izoláljuk, ahol az RGD- 50 szekvenciában vagy annak csonkított és/vagy módosított formájában előforduló R-származékot K*-ra cseréltük, vagy ahol a KGD-szekvenciában vagy annak csonkított és/vagy módosított formájában előforduló K-t K* megtestesítőjére cseréltük, ami nem lehet K. 55 (Elsőbbsége: 1990.02.20.)

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy természetben a kígyóméregben előforduló VAG-ot izoláljuk.

(Elsőbbsége: 1990. 02. 20.) 60

-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys30

- Arg-Pro - Gly- Alá- Gin- Cy s- Ala40

-Arg-Phe-Met-Lys-Lys-Gly-Thr60

Trp-Asn-Asp-Asp-Thr-Cys-Thr70

Asn-Gly-Leu-Tyr-Gly

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi VAG-anyagokat izoláljuk: trigramin, echistatin, elegantin, alborabrin, lachesin, flavoviridin, eristicophin, tergeminin, rhodastomin, appiagin, halysin, bitistatin, ruberin, cerastin, cotiarin, crotatroxin, horridin, basilicin, lutosin, molossin, durissin, jararacin, cereberin, oreganin, viridin és/vagy barbourin.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

20. A 11. igénypont szerinti eljárás rekombináns expressziós rendszer előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t inszertálunk, mely megfelelő gazdába transzformálva képes egy specifikus vérlemezkeaggregálódást gátló (VÁG) anyag kifejezésére, mely anyag képes a Fg vagy a vWF GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését lényegesen hatékonyabban gátolni, mint a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz, illetve a fibronektinnek a fibronektin-receptorhoz való kötődését, és amely VÁG a KGD aminosavszekvenciából áll, amelyet egy legalább nyolc aminosavszármazékból álló peptid tartalmaz.

(Elsőbbsége: 1989. 10.06.)

21. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerinti expressziós rendszerrel megfelelő gazdasejtet transzformálunk.

(Elsőbbsége: 1989. 10. 06.)

22. Eljárás GP Ilb-IIIa specifikus VÁG előállítására, azzal jellemezve, hogy

- a 21. igénypont szerinti gazdasejtet, a VAG-ot kódoló DNS expresszálásához megfelelő körülmények között tenyésztjük, és — a keletkezett VAG-ot kinyerjük a tenyészetből.

(Elsőbbsége: 1989. 10.06.)

23. Az 1. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan specifikus vérlemezke-aggregálódást gátló (VÁG) anyagot izolálunk, amely a Fg vagy a vWF GP Ilb-IIIa-hoz való kötődését lényegesen hatékonyabban képes gátolni, mint a vitronektinnek a vitronektin-receptorhoz vagy a fibronektínnek a fibronektin-receptorhoz való kötődését, és amely VÁG a következő képlettel jellemezhető:

Y,-X₁(AA₁)_nl-K*-G/Sar-D-(AA₂)_n2-(AA₃)_n3(AA₄)_n4-X₂-Y₂ (1) ahol K* az -R!₂N(CH₂)₄CHNHCO képlet szubsztituált vagy nem szubsztituált lizilszármazéka, ahol minden R¹ lehet H, alkil (1-6 C) vagy legtöbbször R²-C=NR³, ahol R² lehet H, alkil (1-6 C), szubsztituált, illetve nem szubsztituált fenil- vagy benzílszármazék, vagy NR⁴2, amelyben R⁴ H vagy alkil (1 - 6 C) csoport, és

R³ lehet H, alkil (1 - 6 C), fenil, benzil, vagy R²-C=NR³ az alábbi képletekből választott gyök lehet

R³ R³ ahol m értéke 2-3, és minden R⁵ lehet H vagy alkil (1-6 C) csoport, és amelyekben egy vagy két (CH₂)-t O vagy S helyettesítheti, és az O, illetve S szomszédságában nem fordul elő másik heteroatom;

AA| egy kis semleges (poláris vagy nempoláris) aminosav, és ni 0-3 közé eső egész szám;

AA₂ egy semleges, nempoláris, nagy (aromás vagy nem aromás), vagy poláris aromás aminosav, és n2 0-3 közé eső egész szám;

AAj egy prolinszármazék vagy módosított prolinszármazék (amint azt lentebb meghatározzuk), és n3 0 vagy 1;

AA₄egy semleges, kis aminosav vagy annak Nalkilált formája, és n40-3 közé eső egész szám;

valamennyi X, és X₂ olyan származékok, amelyek képesek kötéseket létrehozni az X, és X₂ között, és ezáltal ciklikus komponenst képezni; és valamennyi Y, és Y₂ reakcióba nem lépő szubsztituensek, vagy hiányozhatnak is;

amelyben egy vagy több peptidkötés tetszőlegesen helyettesíthető az alábbi kötések közül bármelyikkel: -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cisz és transz), -COOCH₂-, -CH(OH)CH₂- és -CH₂SO-;

azzal a feltevéssel, hogy n3=0; akkor

1) n2 és n4 összege legalább 2 kell hogy legyen;
2) K* nem lehet Har vagy K; vagy
3) X, és X₂ közül legalább az egyik nem lehet Cys (C), penicillinamin (Pen) vagy 2-amino-3,3-ciklopentán-metilén-3-merkapto-propionsav (APmp); vagy
4) Yj vagy Y₂ legalább egy aminosavszármazék legyen;
5) egy vagy több peptidkötést a nevezett egyéb kötés helyettesít.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol Y i lehet H, acil vagy egy peptidszármazék, illetve annak egy leszármaztatott formája, vagy Y, hiányozhat is, és Y₂ lehet OH, NH₂ vagy egy peptid, illetve annak egy leszármaztatott formája, vagy Y₂ hiányozhat is.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

25. A 24. igénypont szerinti összetétel, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol Y₂ azNH₂-A-NH₂, vagy hiányzik.

(Elsőbbsége: 1990. 02. 20.)

26. A 24. igénypont szerinti összetétel, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol Y, lehet H, acetil, G vagy hiányozhat is.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

27. A 23. igénypont szerinti összetétel, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol X, és X₂ cisztein, merkapto-propionil-csoport (Mpr) vagy penicillinamin.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

28. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol AA, G, és n, pedig 0 vagy 1.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

29. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol AA₂ a W, F, L, Y és A aminosav valamelyike.

(Elsőbbsége: 1990. 02. 20.)

30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol AA₂ az W.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

31. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) általános képletű anyagot izolálunk, ahol K* az K, Har, acetimidil-Lys vagy fenilimidil-Lys.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi anyagokat állítjuk elő:

VAG1: E-C-A-D-G—L—C-C-D-Q-C-RF-L—K-K-G-T-V-C—R-V-A-K—GD-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-CD-C-P-R-N-G-L-Y-G

VÁG 2: E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-CK-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-AK.-G—D-W-N-N—D-Y-C-T-G-KS-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

VÁG 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 7: C-K-G-D-W-C-A-NH₂VÁG 10: C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 12: C-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 13: C-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 14: C-K-D-L-P-C-NH₂VÁG 15: C-K-G-D-V-P-C-NH₂VÁG 16: C-K-G-D-Y-(OMe)-P-C-NH₂VÁG 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂VÁG 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C-NH₂VÁG 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C-NH₂VÁG 21: Mpr-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 22: Mpr-K-G-D-L-P-C-NH₂VÁG 23: Mpr-K-G-D-V-P-C-NH₂VÁG 24: Mpr-K-G-D-Y-(OMe)-P-C-NH₂VÁG 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂VÁG 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C-NH₂VÁG 27: ciklo(G-K-G-D-W-P)

VÁG 28: ciklo(A-K-G-D-W-P)

VÁG 29: ciklo(D-Ala-K-G-D-W-P)

VÁG 30: ciklo(F-K-G-D-W-P)

VÁG 31: ciklo(béta-Ala-K-G-D-W-P)

VÁG 32: ciklo(gamma-Abu-K-G-D-W-P)

VÁG 33: ciklo(R-K-G-D-W-P)

VÁG 34: C-K-G-D-W-G-C-NH₂VÁG 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂

VÁG 41: C-K-G-D-I-P-C-NH₂

VÁG 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂VÁG 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂VÁG 44: C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂VÁG 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂VÁG 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pent-NH₂VÁG 54: Mpr-K-G-Df-W-P-Pen-NH₂VÁG 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂VÁG 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂VÁG 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂VÁG 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 61: Mpr-K-G-D-W-P-Ct-NH₂VÁG 62: Mpr-K|-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 66: Mpr-(N^G,N^G-etilén-Har)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 67: Mpr-(N^G,N^G-etilén-Har)-G—D-W-P— Pen-NH₂

VÁG 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂VÁG 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 70: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 72: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydroPro)-C-NH₂

VÁG 75: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-Pen-NH₂(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi peptideket állítjuk elő:

VÁG 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂VÁG 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 10: C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH₂VÁG 13: C-K-G-D-F-P-C-NH₂VÁG 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂VÁG 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂VÁG 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂VÁG 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂VÁG 44: C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂VÁG 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂VÁG49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pent-NH₂VÁG 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂VÁG 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂VÁG 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂

VÁG 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂VÁG 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂VÁG 61: Mpr-K-G-D-W-P-Cf-NH₂VÁG 62: Mpr-Kf-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-CNH₂

VÁG 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 66: Mpr-(N^G,N^G-etilén-Har)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 67: Mpr-(N^G,N^G-etilén-Har)-G-D-W-PPen—NH₂

VÁG 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂VÁG 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 70: Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂

VÁG 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH₂VÁG 72: Mpr—(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂

VÁG 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)C-NH₂ (Elsőbbsége: 1990.02.20.)

34. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 60:

Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

35. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 63:

Mpr-(Har)—G-D-W-P-Pen-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

36. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 70:

Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

37. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 72:

Mpr- (F enilimidil-Lys)- G - D-W-P-Pen-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

38. Eljárás gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy a 13., 15. vagy 23. igénypont szerint előállított VÁG egy adott mennyiségét legalább egy gyógyszerészetileg elfogadott kötőanyaggal keverjük össze.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vérrögképződés gátlására alkalmas készítményt állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vérlemezke-asszociációval kapcsolatos vértelenségi szindrómában szenvedő beteg kezelésére alkalmas gyógyszert állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02. 20.)

41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vér testen kívüli keringése során a vérle31 mezke-elvesztés megelőzésére alkalmas készítményt állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1990. 02. 20.)

42. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákos betegben alkalmas készítményt állítunk elő, mely cotiarint vagy annak Vn/VnR kötést gátló fragmentjét tartalmazza hatékony dózisban.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

43. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi anyagokat állítjuk elő:

[VÁG 3:] G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂[VÁG 4:] G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH₂[VÁG 5:] C-G-K-G-D-W-P-C-NH₂[VÁG 10:] C-K-G-D-W-P-C-NH₂[VÁG 12:] C-K-G-D-Y-P-C-NH₂[VÁG 13:] C-K-G-D-F-P-C-NH₂[VÁG 19:] Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂[VÁG 25:] Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH₂[VÁG 34:] C-K-G-D-W-G-C-NH₂[VÁG 39:] C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH₂[VÁG 42: ] C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH₂[VÁG 43:] C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH₂[VÁG 44:] C-K-G-D-(4-NO₂-Phe)-P-C-NH₂[VÁG 47:] Acetil-C-K-G-D-W-P-C-NH₂[VÁG 48:] Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂[VÁG 49:] Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂[VÁG 51:] Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH₂[VÁG 52:] Mpr-K-G-D-W-P-Penf-NH₂[VÁG 55:] Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH₂[VÁG 57:] Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH₂[VÁG 58:] Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH₂[VÁG 59:] Mpr-K-G-D—W-(Pip)-Pen-NH₂[VÁG 60:] Mpr-(Har)-G-D—W-P-C-NH₂[VÁG 61:] Mpr-K-G-D-W-P-Cf-NH₂[VÁG 62:] Mpr-Kt-G-D-W-P-Pen-NH₂[VÁG 63: ] Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH₂[VÁG 64:] Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂ [VÁG 65:] Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂ [VÁG 66:] Mpr-(NG,NG-etilén-Har)-G-D-W-PC-NH₂ [VÁG 67:] Mpr-(N«, NG-etilén-Har)-G-D-W-PPen-NH₂ [VÁG 68:] Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH₂[VÁG 70:] Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PC-NH₂ [VÁG 71:] Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen-NH₂ [VÁG 72:] Mpr-(Phenylimidil-Lys)-G-D-W-PPen-NH₂ [VÁG 73:]Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydroPro)-C-NH₂ [VÁG 24:] Mpr-K-G-D-Y-(OMe)-P-C-NH₂[VÁG 54:] Mpr-K-G-Dt-W-P-Pen-NH₂vagy gyűrűs formái.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

44. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 19:

Mpr-K-G—D-W-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1989. 10.06.)

45. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 48:

Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

46. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 49:

Mvl-K-G-D-W-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

47. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 51:

Mpr-K-G-D-W—P-Pen-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

48. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 59:

Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990. 02. 20.)

49. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 64:

Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

50. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 65:

Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH₂anyagot állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1990.02.20.)

51. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VÁG 73:

Mpr- Har—G- D - W- (3,4-dehidro-Pro)- C -NH₂anyagot állítjuk elő.