DE69029579T2

DE69029579T2 - Inhibitoren der plättchen-aggregation

Info

Publication number: DE69029579T2
Application number: DE69029579T
Authority: DE
Inventors: Israel F. Lafayette Ca 94549 Charo; Robert M. Belmont Ca 94002 Scarborough; David Lawrence Palo Alto Ca 94303 Wolf
Original assignee: COR Therapeutics Inc
Current assignee: COR Therapeutics Inc
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2010-06-16
Also published as: ATE146969T1; DE69029579D1; DK0477295T3; NO982249L; NO312965B1; WO1990015620A1; NO982249D0; ES2097150T3; NO304267B1; AU636159B2; EP0477295B1; NO914962L; LU90488I2; CA2059124C; FI104364B; DE69029579T3; EP0477295A1; NL990043I1; AU6036990A; US5318899A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Gruppe von Peptiden, die Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren sind oder zu diesen verwandt sind, isoliert und gereinigt aus verschiedenen Schlangengiften. Diese Peptide sind nützlich als Arzneimittel zur Behandlung und Vorbeugung von Blutplättchen-assoziierten ischämischen Störungen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Peptide, die spezifische Rezeptoren für adhesive Proteine, involviert in Blutplättchen-Anheftung und Aggregation, blockieren. Darüberhinaus beschreibt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und zur Reinigung dieser Peptide zur substantiellen Homogenität von Schlangengiften genauso, wie Verfahren zur Verwendung der primären Aminosäuresequenz dieser Polypeptide zur Herstellung aktiver Peptide sowohl synthetisch als auch unter Verwendung von rekombinanten DNA-Methoden.
Herzkrankheiten sind die primäre Todesursache in den meisten westlichen Gesellschaften. Der Tod aufgrund von Herzstörungen wird oft induziert durch Blutplättchen-abhängige ischämische Syndrome, die initiiert werden durch Atherosklerose und Arteriosklerose und schließen in nicht beschränkender Weise ein, akuten Herzinfarkt, chronische unstabile Angina, vorübergehende ischämische Attacken und Anfälle, periphere vaskuläre Krankheiten, arterielle Thrombose, Präklampsie, Embolie, Restenose und/oder Thrombose im Anschluß an Angioplastie, Karotis-Endarteriektomie, Anastomose von vaskulären Transplantaten und chronischen kardiovaskulären Vorrichtungen (z.B. Verweil-Katheter oder Ableitung- "extracorporale Kreislaufvorrichtungen"). Diese Syndrome stellen eine Vielzahl von stenotischen und oklusiven vaskulären Störungen dar, von denen angenommen wird, daß sie durch Blutplättchen-Aktivierung initiiert werden, entweder auf den Gefäßwänden oder innerhalb des Lumens durch vom Blut abstammende Mediatoren. Diese manifestieren sich durch Blutplättchen-Aggregate, die Blutgerinnsel formen, die den Blutfluß begrenzen.
Eine Vielzahl von Studien hat dazu beigetragen, die Mechanismen der Blutplättchen- Aggregation und der Thrombusbildung zu verstehen. Blutplättchen antworten auf eine Vielzahl von Blutgefäß-Verletzungen wie Verengung des Lumens, Plaque-Bildung und die Gegenwart von Fremdkörpern, z.B. Kathetern) und dergleichen. Die Antwort der Blutplättchen auf diese Verletzungen ist eine Sequenz von Ereignissen einschließlich der Blutplättchen-Anheftung und Aktivierung und der Ausschüttung von Blutplättchen-granulären- Komponenten, einschließlich des potentiellen zellulären mitogenen Faktors. Die aktivierten Blutplättchen-Aggregate induzieren die Bildung von Fibrin, das den Thrombus weiter stabilisiert.
Viel ist nun bekannt über die Mechanismen der Regulierung dieser Antworten. Obgleich unstimulierte Blutplättchen Rezeptoren für mehrere adhäsive Proteine enthalten einschließlich Laminin (VLA 2, VLA 6) und Collagen (VLA 2, GPIV, und andere), wird angenommen, daß das anfängliche Anheften der Blutplättchen an das Subendothelium vermittelt wird durch Binden des Blutplättchen-Membranglykoproteins (GP) Ib an den immobilisierten von-Willebrand-Faktor. Die nachfolgende Blutplättchen-Aktivierung kann initiiert werden durch ein oder mehrere der bekannten physiologischen Agonisten einschließlich: ADP, Epinephrin, Thrombin, Collagen und Thromboxan A2.
Die Blutplättchen-Aggregation wird vermittelt durch GP IIb-IIIa-Komplex auf der Blutplättchenmembranoberfläche. GP IIb-IIIa existiert auf der Oberfläche von unstimulierten Blutplättchen in einer inaktiven Form. Wenn die Blutplättchen aktiviert werden durch Adhäsion und die physiologischen Agonisten, wird GP IIb-IIIa ebenfalls aktiviert, so daß es ein Rezeptor wird für Fibrinogen (Fg), von-Willebrand-Faktor (vWF) und Fibronectin (Fn) (vgl. Phillips et al., Blood, 71, 1988, 831-843). Jedoch wird angenommen, daß die Bindung von Fibrinogen und/oder von-Willebrand-Faktor prinzipiell verantwortlich ist für die Blutplättchen-Aggregation und die Thrombusbildung in vivo.
Daher hemmen Substanzen, die spezifisch die Bindung von Fibrinogen oder des von-Willebrand-Faktors an GP IIb-IIIa inhibieren, die Blutplättchen-Aggregation und können Kandidaten sein für die Inhibierung der Thrombusbildung in vivo.
Blutplättchen GP IIb-IIIa ist bekannt als ein Mitglied der Familie von Struktur-verwandten Adhäsionsproteinrezeptoren, gemeinsam bekannt als "Integrine". Wie das GP IIb-IIIa sind alle zur Zeit bekannten Integrine aufgebaut aus zwei Untereinheiten mit einer größeren alpha-Untereinheit (z.B. GP IIb) und einer kleineren beta-Untereinheit (z.B. GP IIIa). Es besteht ein hoher Grad an Homologie zwischen den bekannten Sequenzen der Integrin- Untereinheiten. Dies deutet an, daß die Integrine von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Integrine wirken bei einer Vielzahl von zellulären Adhäsionen und sind gefünden worden in Leukozyten, endothelialen Zellen, glatten Muskelzellen und anderen Zellen des Gefäßsystems. Da Integrine weit verbreitet sind, wohingegen GP IIb-IIIa beschränkt ist auf Blutplättchen, würde ein bevorzugtes Antiaggregationsmittel selektiv GP IIb-IIIa inhibieren, im Gegensatz zu anderen Integrinen.
Mehrere Klassen von Peptiden sind beschrieben worden, die die Bindung von adhäsiven Proteinen zur Aktivierung von Blutplättchen blockieren und die Blutplättchen-Aggregation inhibieren (Gawiger et al., US-PS 4,661,471 und Rouslahti et al., US-Psen 4,614,517, 4,578,079, 4,792,525 und GB-A-2,207,922). In einer Klasse von Peptiden ist die Sequenz RGD kritisch und die Tetrapeptidsequenzen RGDS, RGDT, RGDC sind spezifisch verwendet worden. Die Aminosäuresequenz RGDX wird in einer Vielzahl von adhäsiven Proteinen, einschließlich Fg, Vn, vWF und Fn gefunden. Es ist gezeigt worden, daß diese Sequenz eine wichtige Rolle in der Interaktion von adhäsiven Proteinen mit adhäsiven Proteinrezeptoren spielt, da Peptide, die diese Sequenz enthalten, die Bindung von adhäsiven Proteinen blockieren (Pierschbacher, M.D. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 17294- 17298, Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 1986, 5708-5712 und Rouslahti et al., Cell, 44, 1986, 517-518. Eine Übersicht über Zelladhäsionsprozesse einschließlich einer Übersicht über adhäsive Proteine, die das Tripeptid RGD als ihre Zellerkennungsstelle enthalten, kann gefunden werden bei Rouslahti et al., Science, 238, 1987, 491-491. Tetrapeptide, die diese Sequenz enthalten, sind beschrieben worden in EP-A-3 19,506. Homoarginin-basierende Pentapeptide, die Homoarginin anstelle von Aromin in der Sequenz RGD enthalten, sind beschrieben worden in der PCT-Anmeldung WO 89/07609. Kurze Peptide, enthaltend ein Lysin oder ein Glutamin genauso wie ein Arginin in der Sequenz RGD, sind beschrieben worden, daß sie eine Aktivität als Tumornekrosefaktor- Antagonisten aufweisen (WO 90/06943).
Die strukturellen Variationen, die in RGD-enthaltenden Peptiden erlaubt sind, sind erforscht worden durch Pierschbacher, M.D. et al., 3. Biol. Chem., supra. In diesen Studien ist es gefunden worden, daß das Manipulieren der RGD-enthaltenden Sequenz nicht nur die Aktivität der Inhibierung der Bindung von Fibronectin oder Vitronectin an das Substrat betrifft, sondern ebenfalls die Differenzierung zwischen der Bindung der zwei Liganden betreffen kann. Die Peptidsequenz GRGDSPC, die von der Zellanheftungsdomäne von Fibronectin stammt, ist verwendet worden als Modellpeptid. Gewisse Substitutionen, wie das Ersetzen von L-Arg durch D-Arg, scheinen keinen Effekt für die Bindung von beiden Liganden zu haben. Allerdings zerstört das Ersetzen von Gly durch D-Ala oder von L-Asp durch D-Asp die Inhibierung. Während das Substituieren von L-Ser durch D-Ser die Inhibierung der Vitronectin-Interaktion mit dem Vitronectin-Rezeptor reduziert, wurde nur ein geringer Effekt auf die Fibronectin-Interaktion mit dem Fibronectin-Rezeptor gefunden. Die Ersetzung von Ser durch Asn resultiert in ein Peptid, das eine erhöhte Inhibierung der Fibronectin-Bindung und einen reduzierten Effekt auf die Vitronectin-Bindung zeigt. Andere Substitutionen des Ser-Restes hatten andere Effekte. Die Ersetzung von Ser durch Threonin ergab ein Peptid mit gesteigerter Inhibierung der Bindung an den Vitronectin- Rezeptor. Die Ersetzung von L-Pro führte zu einem inaktiven Peptid. Es wurde ebenfalls ein cyclisches Peptid hergestellt mit der Sequenz Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys- Ala, wobei "Pen" Penicillamin ist und eine Disulfidbrücke gebildet wurde zwischen den Pen- und Cys-Resten. Nach Meinung der Autoren hat Penicillamin die Funktion, die Konformationseinschränkung des Rings zu steigern, wohingegen das N-terminale Gly und das Carboxy-terminale Ala hinzugefügt wurden, um die freie Amino- und Carboxylgruppe weit von dem Ring zu entfernen. Dieses cyclische Peptid war in der Lage, Vitronectin-Bindung stärker zu hemmen, als das gleiche Peptid vor der Cyclisierung. Es war jedoch inaktiv bezüglich der Hemmung der Fibronectin-Bindung.
Kürzlich ist ein antithrombotisches Peptid mit einer Modifizierung der RGD-Sequenz beschrieben worden, bei der der "R" -Rest alkyliert worden ist (Samanen, J. et al., J. Cell. Biochem., Suppl. 14A: A229, 1990. Eine Übersicht über Struktur-Aktivitäts-Beziehungen in RGD-enthaltenden Peptiden ist publiziert worden von Ali, F.E. et al.,in Proc. 11th Am. Peptide Symp., Marshall et al., ed. ESCOM Leiden, 1990.
EP-A-341,915 beschreibt zwei Gruppen von Peptiden, lineare und cyclische, die den Blutplättchen GP IIb-IIIa-Rezeptor binden und so seine Fähigkeit vWF, Fibronectin und Fibrinogen-Fibrin zu binden, hemmen. Es werden keine Daten bereitgestellt, die sich auf die Spezifität der Bindung dieser Peptide beziehen. Die Gruppe der cyclischen Peptide schließt Modifizierungen der RGD-Sequenz ein, wobei das R substituiert ist durch D- oder L- Homoarginin, Dimethyl- oder Diethyl-Arginin, Lysin oder ein alpha-alkyliertes Derivat von diesen Resten. Die minimalen cyclischen Strukturen umfassen einfach die "R" GD- Sequenz, eingeklammert zwischen den zwei Resten, die die Disulfidbrücke bilden.
Eine separate Klasse von inhibitorischen Peptiden nutzt Peptidsequenzen, gestaltet nach der Carboxy-terminalen Sequenz abgeleitet von der gamma-Kette von Fibrinogen, dem Dodecapeptid HHLGGAQKAGDV (Kloczewiak et al., Biochemistry, 28, 1989, 2915-2919. Timmons et al., Ibid, 2919-2923 US-PS 4,661,471, supra, EP-A-298,820). Obgleich diese Sequenz die Bindung von Fg und vWF an GP IIb-IIIa inhibiert und die nachfolgende Blutplättchen-Aggregation, ist die Nützlichkeit dieses Peptids beschränkt, da es eine niedrige Affinität der Wechselwirkung mit den Blutplättchen-Rezeptoren hat (IC&sub5;&sub0; = 10-100 µM).
Kürzlich haben mehrere Gruppen eine neue Klasse von Polypeptid-Faktoren von Schlan gengift, die ein niedriges Molekulargewicht haben, isoliert und charakterisiert, die eine extrem hohe Affinität für den GP IIb-IIIa-Komplex haben. Huang, T. -F. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157-16163, Huang, T.-F. et al., Biochemistry, 28, 1989, 661-666, beschreiben die primäre Struktur von Trigramin, einem 72 Aminosäuren-Peptid, enthaltend RGD und 6 Disulfid-Brücken, isoliert von Trimeresurus gramineus. Gan, Z.-R. et al., J. Biol. Chem., 263, 1988, 19827-19832, beschreiben die Eigenschaften und die Struktur von Echistatin, einem 49 Aminosäuren-Peptid, das ebenfalls RGD enthält und 4 mögliche Disulfid-Brücken, das isoliert wurde von Echis carinatus. Williams, J.A. et al., FASEB Journal, 1989, 3:A310, Abstr. Nr. 487m, beschreibt die Sequenz und Eigenschaften der verwandten Peptide Elegantin, Albolabrin und Flavoviridin. Zusätzlich ist die Charakterisierung von Bitistatin beschrieben worden von Shebuski, R.J. et al., J. Biol. Chem., 264, 1989, 21550-21556 und das PAI von Agkistrodon piscivorus piscivorus ist beschrieben worden von Chao, B.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, 8050-8054. Die Sequenz und Aktivität von einem PAI von Agkistrodon rhodostoma, Kistrin und verschiedenen Varianten von natürlich vorkommenden Kistrin-Polypeptiden ist beschrieben worden in WO 90/15072. Die Beziehung zwischen verschiedenen GP IIb-IIIa-Antagonisten von Schlangengiften ist beschrieben worden von Dennis, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1989, 2471-2475.
Eingeschlossen in dieser Gruppe von inhibitorischen Peptiden von Schlangengiften sind Albolabrin, isoliert von Trimeresurus albolabris, Elegantin, isoliert von T. elegans, Flavoviridin, isoliert von T. flavoviridis, Batroxostatin, isoliert von Bothrops atrox, Bitistatin, isoliert von Bitis arietans, beschrieben von Niewiarowski, S. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 319 (Abstr. SY-XIV-5). Zusätzlich ist Applaggin gereinigt worden von Agkistrodon p. piscivorus und beschrieben worden von Chao, B. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 50 (Abstr. 120) und Halysin, gereinigt von Agkistridon halys, das beschrieben wurde von Huang, T.F. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 48 (Abstr. 112). Alle diese Peptide zeigen einen hohen Grad an Sequenzhomologie. Zusätzlich enthalten alle diese Peptide von Schlangengiften, die die Bindung von adhäsiven Proteinen an Integrin-Rezeptoren hemmen, die RGD-Sequenz. Obwohl diese beschriebenen Schlangengift-Faktoren potentielle Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren in vitro sind, binden diese Peptide ebenfalls mit hoher Affinität an andere Mitglieder der adhäsiven Protein-Rezeptoren, wie Vitronectin- und Fibronectin-Rezeptoren (Knudsen, K.A. et al., Exp. Cell Res., 179, 1988, 42-49, Rucinski, B. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 50 (Abstr. 120). Dieses Fehlen der Spezifität der Schlangengift-Faktoren für GP IIb-IIIa ist eine unerwünschte Eigenschaft für die therapeutische Verwendung als Inhibitoren der Thrombus-Bildung, da sie das Potential haben, die Adhäsionseigenschaften von anderen Zellen im Gefäßsystem, insbesondere solcher Adhäsionen, die durch Integrine vermittelt werden, zu beeinflussen.
Ein anderer Ansatz, entwickelt zur Erzeugung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren, hat Maus anti-GP IIb-IIIa monoklonale Antikörper verwendet, die die Bindung der adhäsiven Proteine an stimulierte Blutplättchen blockiert. Diese monoklonalen Antikörper sind verwendet worden, um einen Wiederverschluß der Koronarartene nach Reperfusion mit Gewebe-Plasminigen-Aktivator in Hunden zu verhindern (Yasuda, T. et al., 3. Clin. Invest., 81, 1988, 1284-1291) und um die Reduktion des Blutflusses in verletzten Koronararterien von Kaninchen mit einem hohen Grad an Stenose zu verhindern. Potentielle Nebenwirkung der Verwendung dieser monoklonalen Antikörper im Menschen können resultieren von ihren lang anhaltenden Wirkungen und ihrem Potential, Immunität zu erzeugen.
Zusätzliche therapeutische Behandlungsmaßnahmen werden benötigt zum Vorbeugen oder wenigstens zur Linderung unerwünschter Thrombus-Bildung. Insbesondere therapeutische Mittel, fähig zur Blockierung oder Inhibierung der Thrombus-Bildung an spezifischen Stellen ohne Gefährdung der Blutstillung und ohne Beeinflussung anderer zellulärer Adhäsionen, wären von großem therapeutischen Nutzen. Idealerweise sollten diese Mittel spezifisch an GP IIb-IIIa binden und für die meisten Patienten keine Immunität erzeugen. Sie sollten darüberhinaus leicht zu verabreichen, stabil und ökonomisch herzustellen sein. Ferner sollten diese Mittel vorübergehend wirken und fähig sein zu frühen Stadien der Thrombus-Bildung zu wirken, ohne die Langzeit-Blutstillung zu beeinflussen. Diese technischen Probleme werden durch die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen dargelegt, gelöst.
Durch die Mittel eines einfachen Screening-Verfahrens ist es möglich, PAI-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, die spezifisch die Thrombus-Bildung vermittelt durch die Blutplättchen-Aggregation zu inhibieren. Dieses Verfahren nutzt das Wissen, daß die Blutplättchen-Aggregation in erster Linie bewirkt wird durch die Bindung von Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa an der Oberfläche der Blutplättchen, wenn die Blutplättchen behandelt werden mit geeigneten Stimuli, wie ADP. Durch die Verwendung dieser Kriterien, d.h. durch die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen und/oder vWF zur Isolierung des Rezeptors und analoger Kriterien, bezogen auf die Inhibierung der Bindung von Fibronectin (Fn) an Fibronectin-Rezeptor (Fn/FnR-Bindung) und Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor (Vn/VnR-Bindung), genauso, wie die Bindung von anderen Faktoren, wie Fn und Vn an GP IIb-IIIa, kann ein spezifisches Profil für den Blutplättchen-Aggregationsinhibitor (PAI) schnell und bequem erhalten werden. Dieser Ansatz ist verwendet worden, um einen umfassenden Panel von Schlangengiften zu screenen und zu charakterisieren auf das Vorkommen oder das Fehlen von PAI, die Spezifität von PAI, identifiziert von diesem Panel bezüglich der Inhibierung der Bindung an GP IIb-IIIa verglichen zur Inhibierung anderer Integrine zu charakterisieren und um aktive Peptide, die Derivate von diesen PAIs sind, zu identifizieren.
Das Screening-Verfahren bezüglich der Gegenwart oder des Fehlens von PM in einer biologischen Flüssigkeit umfaßt das In-Kontakt-Bringen der Flüssigkeit mit GP IIb-IIIa in einer Testreaktion in Gegenwart von Fibrinogen und den Vergleich der Menge von Fibrinogen, gebunden an GP IIb-IIIa in dieser Testreaktion mit der Menge von Fibrinogen, gebunden an GP IIb-IIIa in einer Kontrollreaktion. Dieses Verfahren schließt ferner Test- und Kontrollreaktionen ein, die das In-Kontakt-Bringen von Fn mit Fn-Rezeptor, Vn mit Vn-Rezeptor, Fn mit GP IIb-IIIa oder vWF mit GP IIb-IIIa, um die Spezifität des PAI zu bestimmen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf PAI in isolierter Form, das isoliert werden kann von Echis colorata, Eristicophis macmahonii, A. hynale, A. acutus, A. piscivoruous leucostoma, A. piscivorus conanti, Bothrops asper) Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. Schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis, Lachesis mutas, Sistrurus catenatus tergeminus und Sistrurus milarus barbouri.
Bevorzugte PAIs in isolierter Form werden hergestellt oder haben die Aminosäuresequenzen von denen, die erhalten werden können von Eristicophis macmahonii (Eristicophin), Bothrops cotiara (Cotiarin), B. jararacussu, Crotalus atrox(Crotataroxin), Crotalus basilicus (Basilicin), C. cerastes cerastes (Cerastin), C. durissus totanatacus (Durissin), C. durissus durissus (Durissin), C. h. horridus (Horridin), Crotalus m. molossus (Molossin) C. ruber ruber (Ruberin), Crotalus viridis lutosus (Lutosin), C. v. viridis (Viridin), Crotalus v. oreganus (Oreganin), Crotalus v. helleri, Lachesis mutas (Lachesin), Sistrurus catenatus tergeminus (Tergeminin) und S. milarus barbouri (Barbourin).
Besonders bevorzugt sind Eristicophin, Cotiarin, Crotatroxin, Cerastin, Durissin, Horridin, Ruberin, Lachesin, Basilicin, Lutosin, Molossin, Oreganin, Viridin, Tergeminin und Barbourin.
Die Erfindung schließt ebenfalls Peptide wie beansprucht ein, die gekurzte und/oder modifizierte Formen von natürlich vorkommenden Peptiden sind und/oder bei denen ein oder mehrere Peptidbindungen ersetzt sind durch alternative Bindungen, wie -CH&sub2;NH- oder -CH&sub2;CH&sub2;-.
In einem bevorzugten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf PAI in isolierter Form, das hergestellt werden kann aus aktivem Schlangengift, identifiziert durch das vorstehend genannte Screening-Verfahren und bei dem gezeigt ist, daß es spezifisch die Bindung von
In einem anderen bevorzugten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf PAI von Schlangengift in isolierter Form, wobei die Sequenz verantwortlich für die Bindung an den adhäsiven Protein-Rezeptor die Sequenz KGD einschließt.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt ist die Erfindung auf eine Gruppe von Peptiden oder Peptid-verwandten Verbindungen im allgemeinen gerichtet, die Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren sind, die also in der Lage sind, die Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa zu inhibieren in einem wesentlich größeren Ausmaß, als die Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an den Fibronectin-Rezeptor inhibieren. Diese Peptide sind dadurch charakterisiert, daß sie die Bindungssequenz K*GDX anstelle der RGDX- Bindungssequenz, die in den PAI-Proteinen des Standes der Technik gefünden wird, haben. K* ist ein substituierter oder unsubstituierter Lysylrest der allgemeinen Formel R¹&sub2;N(CH&sub2;)&sub4;CHNHCO-, wobei jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, der ein ausreichender Elektronen-Donor ist, um nicht die Basizität des benachbarten Stickstoffs zu zerstören und wobei ein oder zwei der Methylenreste optional substituiert sein können durch O oder S, wie nachstehend beschrieben. Das Barbourin-PAI, isoliert aus S. milarus barbouri, ist eines, das diese Serie von Peptiden erläutert. Jedoch können kürzere Formen von diesem Peptid ebenfalls verwendet werden, genauso wie analoge Sequenzen, die 1-10 Aminosäurerest-Modifikationen irgendwo in der Peptidkette und/oder Ersatz von Peptidbindungen durch alternative Bindungen enthalten. Andere illustrierende Ausführungsformen schließen isolierte PAI-Peptide ein mit einer nativen RGDX-Sequenz, wobei diese ersetzt ist durch K*GDX. Wie im Fall von Barbourin können diese isolierten PAI-Peptide auch anders als in nativer Form vorliegen oder können verkürzt sein und/oder können 1-10 Aminosäurerestsubstitutionen oder -deletionen enthalten und/oder können Nicht-Peptidbindungen substituiert durch Peptidbindungen haben.
Eine andere Gruppe von Verbindungen, die in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen, umfaßt die vorstehend beschriebenen Verbindungen mit der Ausnahme, daß der Glycylrest in der RGD- oder K*GD-Sequenz ersetzt ist durch einen Sarcosylrest. Diese Klasse von Verbindungen erhält die Potenz und Spezifität der RGD-verwandten - oder K*GD-enthaltenden - Peptide.
Eine andere Gruppe von PAI-Verbindungen, die die vorliegende Erfindung erläutert, sind Peptide oder modifizierte Peptide der allgemeinen Formel
des Anspruchs 10.
Andere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf rekombinante Verfahren und Materialien, die sich auf die Synthese dieser und anderer verwandter Peptide beziehen, Verfahren der in vitro-Synthese dieser und auf pharmazeutische Verbindungen, enthaltend PAI-Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa durch partiell gereinigte Schlangengifte.
Figuren 2A, 2B und 2C zeigen die Dosis-abhängige Adhäsionsinhibierung von Centricon-10-Ultrafiltraten von rohem Schlangengift in Fibrinogen/GP IIb-IIIa und Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Tests. Die Selektivität von Schlangengift-Peptiden in GP IIb-IIIa- und Vitronectin-Rezeptor-Bindungstests ist gezeigt. Sistrurus m. barbouri-Gift ist verwendet in Figur 2A. Crotalus ruber-Gift ist verwendet in Figur 2B. Crotalus basilicus-Gift ist verwendet in Figur 2C.
Figur 3 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Eristicophis macmahoni-Gift. Der querschraffierte Bereich enthält die biologisch aktiven Fraktionen.
Figur 4 zeigt das langsame Gradienten-HPLC-Profil der PAI-Fraktionen von Figur 3. Der quer-schraffierte Bereich enthält die bioaktiven Fraktionen.
Figur 5 zeigt das analytische HPLC-Profil der PAI-Fraktionen aus Figur 4, um gereinigtes PAI aus Eristicophis macmahoni-Gift zu zeigen.
Figur 6 zeigt die vollständige Aminosäuresequenzen von Eristicophin, Barbourin, Tergeminin, Cerastin, Ruberin, Lachesin, Cotiarin, Crotatroxin, Horridin, Lutosin, Viridin, Molossin, Basilicin, Durissin, Jararacin, Cereberin und Oreganin, und Enzymverdaufragmente, bestimmt durch den automatischen Edman-Abbau.
Figur 7 stellt das HPLC-Profil von PAI, erhalten aus G-50-Fraktionen von rohem Sistrurus c. tergeminus-Gift dar. Die quer-schraffierten Bereiche enthalten die bioaktiven Fraktionen.
Figur 8 stellt das HPLC-Profil von PAI-Fraktionen aus Figur 7 dar, um gereinigtes PAI aus Sistrurus catenatus tergeminus-Gift zu zeigen.
Figur 9 zeigt die Aktivität von gereinigtem Tergemin PAI aus Figur 8 bezüglich der Inhibierung der Bindung in verschiedenen Rezeptor-Assays.
Figur 10 zeigt das HPLC-Profil des Blutplättchen-Aggregations-Inhibitors, erhalten aus G- 50-Fraktionen von rohem Sistrurus m. barbouri-Gift. Die quer-schraffierten Bereiche enthalten die bioaktiven Fraktionen.
Figur 11 zeigt das HPLC-Profil von aktiven PAI-Fraktionen aus Figur 10, um gereinigtes PAI aus Sistrurus milarus barbouri-Gift zu zeigen.
Figur 12 vergleicht die Aminosäuresequenzen von einer Anzahl von Schlangengift-PAIs mit dem von Barbourin.
Figur 13 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Lachesis mutas-Gift. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
Figur 14 zeigt das langsame Gradienten-HPLC-Profil von PAI-aktiven Fraktionen aus Figur 13. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
Figur 15 zeigt das analytische HPLC-Profil von PAI-Fraktionen aus Figur 14 aus Lachesis mutas, um gereinigtes PAI aus Lachesis mutas-Gift zu zeigen.
Figur 16 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Crotalus viridis viridis-Gift. Querschraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
Figur 17 zeigt das HPLC-Profil von den PAI-Fraktionen aus Figur 16, um gereinigtes PAI aus Crotalus viridis viridis-Gift zu zeigen.
Figur 18 zeigt die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden, um die Fibrinogen/GP IIb-IIIa-Bindung zu inhibieren, verglichen mit Echistatin.
Figuren 19A, 19B und 19C zeigen die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden, um die ADP (4 µM) induzierte menschliche Blutplättchen-Aggregation in Plättchen-reichem Plasma (PRP) zu inhibieren, verglichen mit Echistatin. Figur 19A zeigt den Effekt von Sistrurus m. barbouri PAI-Barbourin. Figur 19B zeigt den Effekt von Eristicophus macmahoni PAI-Eristicophin. Figur 19C zeigt den Effekt von Echis carnitus PAI-Echistatin.
Figur 20 zeigt das Aktivitätsprofil der HPLC-Fraktionen von C. c. cerastes-Gift. Querschraffierte Bereiche enthalten biologisch aktive Fraktionen.
Figur 21 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse von den aktiven Fraktionen aus Figur 20. um gereinigtes PAI aus Crotalus c. cerastes-Gift zu zeigen.
Figur 22 zeigt das Aktivitätsprofil der HPLC-Fraktion von PAI aus C. ruber ruber. Querschraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktive Fraktion.
Figur 23 zeigt das Aktivitätsprofil einer analytischen C-18-Säule von homogenen Peptiden. erhalten aus C. atrox.
Figur 24 zeigt das analytische HPLC-Profil der homogenen Peptide, isoliert aus Bothrops cotiara.
Figur 25 zeigt die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigtem Cotiarin auf die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor.
Figur 26 zeigt die Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden an der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor. Die Werte zeigen die Konzentration von gereinigten Peptiden, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa oder Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor bei 50% (IC&sub5;&sub0;) inhibiert. Das Symbol "> " zeigt, daß der IC&sub5;&sub0; größer ist als dieser Wert, der die höchste zur Zeit untersuchte Konzentration ist. Man beachte, daß die Substitution des Arginin-Restes in der "RGDW"- Sequenz in Eristicophin durch ein Lysin (KGDW) eine Spezifität für die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa im Vergleich zu Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor vermittelt.
Figur 27 zeigt die Ergebnisse der Bindungsaktivität für das Analogon #1, [E²&sup8;L&sup4;¹C&sup6;&sup4;] Barbourin (28-73) hinsichtlich des GP IIb-IIIa und Vitronectin-Rezeptors.
Figur 28 zeigt die Fähigkeit des synthetischen Eristicophln-Analogons [K²&sup9;]-Eristocophin (4-51), die Bindung von Fibrinogen an GP IIB-Illa zu inhibieren und die Unfähigkeit, die Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren.
Figuren 29A und 29B zeigen die Fähigkeit von linearen und cyclischen RGDW-Verbindungen und linearen und cyclischen KGDW-Verbindungen der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa.
Figuren 30A 30B, 30C, 30D und 30E zeigen die Fähigkeit von verschiedenen KGDW- Analoga, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren und die Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren. Figur 30A zeigt das Analogon #7. Figur 30B zeigt das Analogon #8. Figur 30C zeigt das Analogon #4. Figur 30D zeigt das Analogon #5. Figur 30E zeigt das Analogon #6.
Figur 31 zeigt die Fähigkeit von verschiedenen nativen und synthetischen Blutplättchen- Aggregationsinhibitoren, das Anlagern von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren.
Figur 32 zeigt die Fähigkeit von RGDS und einer cyclischen RGD-Verbindung, die Anlagerung von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren und das Fehlen der Fähigkeit von einem cyclischen KDGW-Analogon, die Anlagerung von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren.
Figur 33 zeigt die Aktivität des Analogons Nummer 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2; bei der Aggregationsinhibierung von Blutplättchen und Zelladhäsion an Vitronectin.
Figur 34 zeigt die Aktivitäten von Figur 33 für das Analogon 19, Mpr-K-G-D-W-P-C- NH&sub2;.
Figur 35 zeigt die Initiation der cyclischen Stromreduzierungen (CFRs) in einem offenen Thorax-Hund-Modell von Thrombose.
Figur 36 zeigt die Effekte einer 10 mg Bolus-Dosis-Verabreichung an dem CFRs, initiiert in dem offenen Thorax-Hund-Modell der Thrombose.
Figur 37 zeigt die Effekte von einer 40 mg Bolus-Dosis-Verabreichung von CFRs, initiiert in dem offenen Thorax-Hund-Modell der Thrombose.
Figur 38 zeigt die DNA-Sequenz voller Länge, die die Aminosäuresequenz von Barbourin (1-73) codiert.
Figur 39 zeigt die DNA-Sequenz, die [M¹, M&sup4;¹] Barbourin (1-73), ligiert an eine PhoA- Signalsequenz codiert.
Figur 40 zeigt die DNA-Sequenz, die das Analogon #1 [E²&sup8;, L&sup4;¹, C&sup6;&sup4;] Barbourin (28-73), verbunden mit einer PhoA-Signalsequenz für die Expression in Bakterien codiert.
Figuren 41A und 41B zeigen Oligonucleotide zur Verwendung in einer PCR-Reaktion, um eine DNA zu erhalten, die das Analogon #1 codiert. Die Aminosäuren, die von dem Analogon per se umfaßt werden, sind in Fettdruck gezeigt.
Figur 42 zeigt die Verbindungssequenz von "tandem repeats" der Analog #1-codierenden DNA-Sequenz.
Figuren 43A und 43B zeigen ein Diagramm des gekürzten Barbourin-Gens als "tandem repeats".
Die Erfindung stellt Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren (PAI-Verbindungen) bereit, die aus Schlangengift isoliert werden können, die in dem erfindungsgemäßen Testverfahren als aktiv identifiziert worden sind. Ferner stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die ähnliche Strukturen haben und synthetisiert worden sind unter Verwendung von Standard-in vitro-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese oder unter Verwendung von rekombinanten Verfahren oder den Kombinationen von diesen Verfahren. Einige dieser Inhibitoren sind einzigartig spezifisch für die Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation und inhibieren nicht alternative Bindungen innerhalb der Integrin-Familie. Andere haben verschiedenen Bereich der Spezifität. Die nachstehenden Abschnitte beschreiben die Isolierung von natürlich vorkommenden PAI-Verbindungen aus Schlangengift, die Gestaltung von Inhibitoren. die ein wesentlich höheres Potential der Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation zeigen, als der Inhibierung z.B. von Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Wechselwirkungen durch Einfügen einer K*GD-Sequenz anstelle von RGD, Verfahren der Synthese dieser Peptide, Verfahren der rekombinanten Herstellung, Antikörper, die die erfindungsgemäßen Peptide binden, Testverfahren, die es erlauben, Schlangengifte zu identifizieren, die PAI enthalten und die Verwendung von den erfindungsgemäßen PAI-Verbindungen als Arzneimittel. PAI bedeutet ein Faktor, der in der Lage ist, die Aggregation von stimulierten Blutplättchen in Standard-Tests zu verhindern, z.B. solche, beschrieben bei Gan, Z. -R. et al., und Huang, T. -F. et al., supra. In diesen Tests werden gewaschene Blutplättchen kombiniert mit Fibrinogen, Calcium&spplus;² und dem zu testenden Material. Blutplättchen werden mit ADP (oder anderen bekannten Stimulatoren oder Kombinationen dieser) stimuliert und die Aggregation (oder das Fehlen hiervon) wird beobachtet unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Aggregometers.
Einige der erfindungsgemäßen PAI sind als spezifisch für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa identifiziert worden. Spezifität wird verstanden als eine Art der Abstufung, so daß eine PAI-Verbindunge "spezifisch für die Inhibierung von Fg oder vWF-Bindung an GP IIb-IIIa" diese Bindung im wesentlich stärker inhibiert als es die Bindung von Fn an FnR oder Vn an VnR inhibiert. Mit dem Begriff "im wesentlichen stärker" ist gemeint, daß entweder die % Inhibierung mindestens zweifach größer ist bei einer vorgegebenen Konzentration von PAI oder daß die Konzentration von PAI, die die 50%-Inhibierung bewirkt, mindestens zweifach niedriger ist für die Fg- oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindungsinhibierung, als für die alternative Ligand/Rezeptor-Bindung.

Isoliertes natives PAI und Reinigungsverfahren

Die erfindungsgemäßen Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren (PAI) schließen ein niedermolekulargewichtige Peptide, die hergestellt werden können in isolierter Form (wie nachstehend beschrieben) aus Schlangengift, das als "aktiv" identifiziert worden ist, d.h. es ist gefunden worden, daß es PAI enthält unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren. die nachstehend beschrieben sind.
Die Erfindung erlaubt die leichte Identifizierung und Charakterisierung der Gegenwart von einem effektiven PAI in Schlangengift, das selektiv die Bindung an GP IIb-IIIa, verglichen mit anderen Integrinen, inhibiert, z.B. die Bindung an den Vitronectin-Rezeptor und den Fibronectin-Rezeptor. Nach dieser Identifizierung und der wahlweisen und optimalen Charakterisierung kann das PAI isoliert und gereinigt werden unter Verwendung einer Vielzahl von Standard-Techniken, die nachstehend und im Stand der Technik beschrieben sind. Zum Beispiel kann eine Kombination der Trennung, basierend auf dem Molekulargewicht (typischerweise Zurückgewinnung von Substanzen < 10 kd), Ionenaustauscherchromatographie und Umkehrphasen-HPLC, verwendet werden. Andere Techniken können ebenfalls entwickelt werden. Ein Verfahren, anwendbar auf PAI aus irgendeinem aktiven Schlangengift, ist wie folgt: Etwa 10-1000 mg Gift wird in verdünnter Essigsäure aufgelöst und auf eine Größenfraktionierungssäule aufgebracht, wie Sephadex G-50 und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Fraktionen werden auf ihre Aktivität untersucht unter Verwendung des Fg/GP IIb-IIIa-Bindungstest der Erfindung, eines Standard-Blutplättchen-Aggregationstests (PAA) oder irgendeinem ähnlichen Test, der auf der adhäsiven Proteinbindungsaktivität von GP IIb-IIIa beruht. Alternativ kann die < 10 kd Fraktion der Fraktion des Gifts wiedergewonnen werden durch Ultrafiltration und auf ähnliche Weise getestet werden.
Die Nieder-MW-Fraktion, isoliert durch beide Verfahren, wird dann auf eine präparative C-18 HPLC-Säule aufgebracht, wie eine C-18 Delta-Pak-Umkehrphasen-HPLC-Säule, erhältlich von Waters, präequilibriert in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) / 8% Acetonitril. Das adsorbierte PAI wird danach eluiert unter Verwendung eines Gradienten von 8% -60% Acetonitril in 0,1 % TFA. Das Gefälle des Gradienten und die Fließrate werden unter Verwendung von Routineverfahren optimiert. Aktive Fraktionen werden durch PAA oder durch das erfindungsgemäße Rezeptorbindungsverfahren bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden dann vereinigt, konzentriert und auf ihre Homogenität getestet unter Verwendung der analytischen HPLC oder SDS-PAGE. Weitere Urnkehrphasen-HPLC-Gradientenreinigungen werden angewendet, bis das wiedergewonnene PAI homogen ist.
Erfindungsgemäße PAIs, erhältlich durch das vorstehende oder andere Reinigungsverfahren schließen solche von den Giften, isoliert aus der Gruppe bestehend aus Echis colorata, Eristicophis mammahonii; A. hypnale, A. acutus, A. piscivorus leucostoma, A. piscivorus conanti; Bothrops asper; Bothorps cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. derastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis; Lachesis mutas; Sistrurus catenatus tergeminus und Sistrurus milarus barbouri ein.
Bevorzugte PAIs in isolierter Form, hergestellt von oder mit den Aminosequenzen von, sind solche, erhältlich aus Eristicophis macmahonii (Eristicophin); Bothrops cotiara (Cotiarin), B. jararacussu; Crotalus atrox (Crotatroxin); C. basilicus (Basilicin); C. derastes cerastes (Cerastin); C. durissus totonatacus (Durissin); Crotalus d. durissus (Durissin), C. h. horridus (Horridin); C. m. molossus (Molossin), C. ruber ruber (Rubenn); C. viridis lutosus (Lutosin), C. v. viridis (Viridin), Crotalus v. oreganus (Oreganin), Crotalus v. helleri, Lachesis mutas (Lachesin), Sistrurus catenatus tergeminus (Tergeminin) und Sistrurus milarus barbouri (Barbourin). Besonders bevorzugt sind PAIs, spezifisch für die Inhibierung der Fg oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindung, z.B. die aus Sistrurus m. barbouri.
Insbesondere bevorzugt sind Eristicophin, Cotiarin, Crotatroxin, Cerastin, Durissin, Horridin, Ruberin, Lachesin, Basilicin, Lutosin, Molossin, Oreganin, Viridin, Tergeminin und Barbourin.
Die gereinigten erfindungsgemäßen PAIs können sequenziert werden unter Verwendung von Standardverfahren. Dies erlaubt die Synthese unter Verwendung von Standard-Festphasen-Techniken (insbesondere für kürzere Formen der PAIs) oder die rekombinante Herstellung. Zum Beispiel kann ein Applied Biosystems Sequenator verwendet werden im Anschluß an die Carboxyamido-Methylierung oder Pyridylethylierung der Peptide, wie bei Huang et al. J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157-16163 beschrieben, gefolgt von der Entsalzung der Proben auf einer C-18 Delta Pak-Säule unter Verwendung von 0,1 % TFA und Acetonitril.
Das isolierte PAI, dessen Sequenz bestimmt ist, kann bei der Synthese in vitro modifiziert werden durch Sequenzveränderungen, die die Aktivität nicht zerstören. Im allgemeinen werden diese modifizierten Formen von den nativen Formen abweichen durch 1-10, vorzugsweise 1-4 Aminosäuresubstitutionen oder werden verkürzte Formen haben. Zusätzlich können eine oder mehrer Peptidbindungen ersetzt werden durch alternative Bindungen, wie nachstehend beschrieben. Eine besonders bevorzugte Substitution ist die Ersetzung von RGD durch K*GD, um GP IIb-IIIa-Spezifität zu verleihen, wie nachstehend beschrieben.
Das PAI von Sistrurus m. barbouri ist zur Homogenität gereinigt worden und sequenziert worden und als Barbourin bezeichnet worden. Anders, als die adhäsiven Proteine von GP IIb-IIIa, die bisher identifiziert worden sind und die Peptide von Schlangengiften, die die GP IIb-IIIa-Funktion blockieren, enthält Barbourin nicht die Standard Arg-Gly-Asp Sequenz der bekannten adhäsiven Proteine. Die scheinbare Bindungssequenz in Barbourin ist Lys-Gly-Asp-(Trp). Das Vorhandensein der KGD-Sequenz in der vermutlichen Bindungsregion dieses Peptids ist besonders überraschend hinsichtlich der Beobachtung, daß das Ersetzen von Arg durch Lys in kleinen synthetischen Peptiden, basierend auf der RGDX-Sequenz, die Fähigkeit dieser Peptide an die Integrin-Rezeptoren stark herabsetzt (Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1984, 5985-5988; Williams et al., Thromb. Res., 46, 1987, 457-471; Huang et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157- 16163). Es wird angenommen, daß diese Substitution teilweise für die Spezifität des Barbourin-Peptids verantwortlich ist, die Fg und vWF-Bindung an GP IIb-IIIa im Gegensatz zur Inhibierung der Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren.

K*GDX-enthaltende Peptide

Die "Barbourin"-Peptide, die durch das erfindungsgemäße Verfahren isoliert worden sind, haben die Bindungssequenz KDGX im Gegensatz zu der RGDX-Sequenz, die in den bekannten PAI-Verbindungen gefunden wird. Das Vorhandensein der KGDX-Sequenz in dieser PAI-Sequenz scheint assoziiert zu sein mit einer bevorzugten Affinität fur GP IIb- IIIa, im Gegensatz zu den Vitronectin- oder Fibronectin-Rezeptoren. Der Effekt der Substitution eines Arginin-Restes durch einen Lysyl-Rest in der Sequenz scheint assoziiert zu sein mit einer angestiegenen Länge der Seitenkette zusammen mit einer Beibehaltung der Basiszität des Stickstoffs, wie weiter nachstehend beschrieben. Überraschenderweise zeigt sich, daß nicht der Lysylrest per se für die gesteigerte Aktivität und Spezifität verantwortlich ist, sondern der Raum, der durch diesen homologen Ausbau durch die Ersetzung des Arginin-Restes bereitgestellt wird. Daher sind die erfindungsgemäßen Peptide, die K*GDX in der Bindungssequenz enthalten, wesentlich stärker in der Lage, die Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa zu inhibieren, verglichen mit ihrer Fähigkeit, die Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor und die Bindung an den Fibronectin-Rezeptor zu inhibieren. Wie vorstehend beschrieben bedeutet "wesentlich stärker" zur Inhibierung der bevorzugten Bindung fähig zu sein, daß der Prozentsatz der Inhibierung mindestens zweifach größer ist bei einer gegebenen Konzentration des Inhibitors oder daß die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens zweifach niedriger ist für die Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa, als fur die Bindung von alternativen Liganden an andere Integrine.
Wie hierin verwendet bedeutet K* einen Lysylrest, der unsubstituiert ist oder der Substitutionen der Wasserstoffatome an der Epsilon-Aminogruppe enthält. Diese Substituenten müssen ausreichende Elektronen-Donatoren sein, um die Basiszität des Stickstoffatoms, an dem sie gebunden sind, aufrechtzuerhalten. Daher ist K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel (R¹)&sub2; N(CH&sub2;)&sub4;-CH(NH-)CO-, wobei jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest ist oder höchstens ein R¹ ist R²-C=NR³, wobei der Rest R² ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest oder ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl- oder Benzylrest ist oder NR&sup4;&sub2; ist, wobei jeder Rest R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C1-6-Alkylrest ist und
R³ ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest ist oder R²-C =NR³ ein Rest ist, ausgewählt aus
wobei m eine ganze Zahl von 2-3 ist und jeder Rest R&sup5; ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C1-6-Alkylrest und wobei 1 oder 2 CH&sub2;-Reste ersetzt sind durch O oder S, mit der Maßgabe, daß O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom sind.
"Alkyl" ist konventionell definiert als eine gerade oder verzweigte Kette oder ein Ring von Kohlenwasserstoffresten der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen, wie Methyl-. Ethyl-, Isopropyl-, N-Hexyl-, 2-Methylbutyl-, Cyclohexylreste und dergleichen.
Die Benzyl- und Phenylreste, dargestellt durch den Rest R², können unsubstituiert oder substituiert sein durch nicht-interferrierende Substituenten. Bevorzugte Substitutionsmuster sind die, in denen nur ein Substituent an den aromatischen Kern gebunden ist, vorzugsweise in der 4-Position. Bevorzugte Substituenten sind Elektronen-Donator-Substituenten wie Alkyl-, insbesondere Ethyl- oder Methyl- oder Phenylreste.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen von K* schließen Lysin-, Homoarginin-, Formylhomoarginin-, Ornithin-, Acetimidyllysin-, NGNG-Ethylen-Homoarginin- und Phenylimidyllysinreste ein. Der Phenylimidyhysylrest hat die Formel:
Ph-C(=NH)-NH(CH&sub2;)&sub4;CH(NH-)CO-.
Ein wesentliches Merkmal der bevorzugten Inhibierung der Bindung scheint in der Substitution von K* fur R in der RGDX-Sequenz zu liegen, einer Klasse von Peptiden oder Peptid-verwandten Verbindungen der vorliegenden Erfindung, umfassend natürlich vorkommende Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren, die ursprünglich RGDX in der Bindungssequenz enthalten, wobei dieser Formen modifiziert werden durch die Substituierung von R durch K* in dieser Sequenz. Eingeschlossen in dieser Erfindung sind native Peptide mit dieser Substitution genauso, wie Fragmente davon, die eine ausreichende Länge haben, um die selektive Inhibierung der Bindung der adhäsiven Proteine an GP IIb-IIIa zu bewirken und Fragmente oder Peptide der vollen Länge, die irrelevante Substitutionen an Positionen des Peptids haben, die deren Aktivität nicht zerstört. Größtenteils werden die Fragmente Reste enthalten, die einer Länge einer Peptidkette von mindestens 7 Aminosäuren entsprechen, wenn die Konformation kontrolliert wird, z.B. durch Cyclisierung und sie werden von größerer Länge sein, wenn eine derartige Konformationskontrolle nicht vorliegt. Im allgemeinen werden neben der notwendigen K*GDX-Sequenz 1-10, vorzugsweise 1-4 und besonders bevorzugt 1-3 Aminosäure-Substitutionen in dem Teil des Peptids sein, der nicht die K*GDX-Sequenz enthält.
Zusätzlich kann das G von RGDX oder K*GDX ersetzt werden durch einen Sarkosinrest.
Zusätzlich können eine oder mehrere Peptidbindungen optional ersetzt werden durch alternative Bindungen wie solche, die durch Reduktion oder Eliminierung erhalten werden. Daher können eine oder mehrere der -CONH-Peptidbindungen durch bekannte Verfahren ersetzt werden durch andere Arten von Resten, wie -CH&sub2;NH-, -CH&sub2;S-, -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CH-(cis und trans), -COCH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2;- und -CH&sub2;SO-. Die folgenden Referenzen beschreiben die Herstellung von Peptidanaloga, die diese alternativen Bindungsreste enthalten: Spatola, A.F., Vega Data (März 1983), Vol 1, Band 3, "Peptide Backbone Modifications" (Übersichtsartikel); Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, Ed., Marcel Dekker, New York, Seite 267 (1983) (Übersichtsartikel); Morley, J.S., Trends Pharm. Sci. (1980), Seiten 463-468 (Übersichtsartikel); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14, 1979, 177-185 (-CH&sub2;NH-, CH&sub2;CH&sub2;-); Spatola, A.F. et al., Life Sci., 38, 1986, 1243-1249 (-CH&sub2;-S); Hann, M.M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., 1982, 307-314 (-CH-CH-, cis und trans); Almquist, R.G. et al., J. Med. Chem., 23, 1980, 1392-1398 (-COCH&sub2;-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett., 23, 1982, 2533 (-COCH&sub2;-); Szelke, M. et al., EP-A-45665 CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH&sub2;-); Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett., 24, 1983, 4401-4404 (-C(OH)CH&sub2;-) und Hruby, V.J., Life Sci., 31, 1982, 189-199 (-CH&sub2;S-). Insbesondere bevorzugt ist -CH&sub2;NH-.
Beispiele von Fragmenten und/oder modifizierten Formen des natürlich vorkommenden Schlangengift-PAIs schließen ein [E²&sup8;, L&sup4;¹, C&sup6;&sup4;] Barbourin (28-73) der Sequenz
und [K²&sup9;) Eristicophin (4-51) der Sequenz
In dieser Bezeichnung ist die Größe des Fragments in runden Klammern nach dem Namen durch die Zahl der Aminosäuren angegeben, die in diesem Fragment eingeschlossen sind und die in eckigen Klammern stehenden Buchstaben und Zahlen geben die Aminossäure- Substitutionen an den bezeichneten Positionen in dem nativen Peptid der vollen Länge an. Das heißt für das vorstehende Barbourin-Fragment, daß die Länge des Fragments die Reste 28-73 der nativen Sequenz umspannt und daß die Aminosäuren ursprünglich an den Positionen 28, 41 und 64 der nativen Sequenz ersetzt worden sind durch Glu (E), Leu (L) und Cys (C).
Als zusätzliche Beispiele kann der Argininrest der RGD-Sequenz, der in Trigramin, Elegantin, Albolabrin, Crotatroxin, Flavoviridin, Echistatin, Bitistatin, Viridin, Molossin, Lutosin, Basilicin, Applagin, Halysin, Horridin, Tergeminin, Lachesin, Cotiarin, Cereberin, Jararacin, Kistrin, Eristicophin, Bitan-a und Ruberin/Oreganin vorkommt, ersetzt werden durch einen K*-Rest, um spezifisch aktive PAIs bereitzustellen mit einer bevorzugten Affinität für GP IIb-IIIa. Zusätzlich können gekurzte Formen dieser Peptide, enthaltend mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 und insbesondere bevorzugt mindestens 40 Aminosäuren hergestellt werden von den nativen Peptiden oder in dieser modifizierten Form. Zusätzlich oder alternativ können 1-10, vorzugsweise 1-4 Aminosäuren unabhängig von der RGD/K*GD-Sequenz substituiert oder modifiziert werden, vorzugsweise durch konservative Aminosäure-Substitutionen. Unter konservativen Aminosäure-Substitutionen wird die Substitution eines sauren Aminosäurerestes für einen sauren Aminosäurerest, einen neutralen für einen neutralen, einen basischen für einen basischen, etc., verstanden, wie nachstehend weiter beschrieben.
Eine weitere Gruppe von Beispielen schließt die ein, bei denen der Glycylrest von RGD oder K*GD ersetzt werden kann durch einen Sarkosylrest bei Beibehaltung der Aktivität. Daher können die aktiven PAIs, die isoliert und/oder modifiziert worden sind, auf anderem Wege, wie vorstehend beschrieben, weiter durch diese Substitution modifiziert werden. Während Fragmente und/oder modifizierte PAIs aus Schlangengift eingeschlossen werden unter den Fg/vWF/GP IIb-IIIa-bindungsspezifischen Bindungen der Erfindung durch Ersetzen von RGD durch K*GD, basieren spezifisch aktive Peptide in weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen auf kompatiblen Verlängerungen der K*DG-Sequenz per se. In dieser Hinsicht ist eine bevorzugte Gruppe von Peptiden oder Peptid-verwandten Verbindungen der Erfindung cyclische Peptide der allgemeinen Formel:
wobei K* ein substituierter oder unsubstituierter Lysylrest, wie in Anspruch 10 definiert, ist;
AA&sub1; ein kleiner, neutraler (polarer oder nicht polarer) Aminosäurerest ist und n&sub1; Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
AA&sub2; ein neutraler, nicht polarer, großer (aromatischer oder nicht aromatischer) oder ein polararomatischer Aminosäurerest ist und n&sub2; Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
AA&sub3; ein Prolinrest oder ein modifizierter Prolinrest wie, wie in Anspruch 10 definiert und n3 Null oder 1 ist;
AA&sub4; ein neutraler, kleiner Aminosäurerest ist oder die N-alkylierte Form hiervon ist und n4 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
jeder Rest X&sub1; und X&sub2; unabhängig ein Rest ist, fähig zur Bildung einer Bindung zwischen X&sub1; und X&sub2;, um eine cyclische Komponente, wie gezeigt, zu bilden;
und jeder Rest Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig ein nicht-interferierender Substituent ist oder abwesend ist;
wobei eine oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls ersetzt sein können durch einen alternativ bindenden Rest, ausgewählt aus -CH&sub2;NH-, -CH&sub2;S-, -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2;- und -CH&sub2;SO-Resten, mit der Maßgabe, daß, wenn n&sub3; Null ist, entweder:
1) die Summe von n&sub2; und n&sub4; mindestens 2 sein muß; oder
2) K* anders ist als Har oder K; oder
3) einer oder mehrere Peptidbindungen ersetzt ist (sind) durch alternative Bindungsrest(e).
Y&sub1; und Y&sub2; können Peptidverlängerungen von 0-25 Aminosäureresten sein und können derivatisiert sein. Die Y&sub1; N-terminalen Verlängerungen können z.B. acetyliert oder auf andere Weise acyliert sein, die Y&sub2; C-terminale Verlängerung kann amidiert sein mit NH&sub2; oder mit einem primären oder sekundären Amin der allgemeinen Formel R-NH&sub2; oder R&sub2;NH, wobei jeder Rest R unabhängig ein Niederalkylrest mit 1-4 C-Atomen, wie ein Methyl-, n-Butyl- oder t-Butylrest ist. Y&sub1; kann ebenfalls ein Wasserstoffatom oder ein Acylrest sein, Y&sub2; kann eine OH-Gruppe, oder ein NH&sub2;-Rest oder ein Amin, wie vorstehend beschrieben, sein. Wenn die Verbindung der allgemeinen Formel (1) ein einfaches cyclisches Peptid ist, fehlen Y&sub1; und Y&sub2;.
X&sub1; und X&sub2; sind typische Aminosäurereste, die zur Cyclisierung fähig sind, wie z.B. und besonders bevorzugt, Cystinreste, fähig einen Disulfidring zu bilden. Jedoch können andere Reste, die fähig sind, Disulfid- oder andere Bindungen zu bilden, ebenfalls verwendet werden, z.B. der Pen (Penicillamin)-Rest, beschrieben bei Pierschbacher et al., supra, oder der Mpr (Mercaptopropionyl)- oder Mvl (Mercaptovaleryl)-Rest. Andere Arten von kovalenten Bindungen zur Cyclisierung, die ebenfalls in Betracht gezogen werden, schließen Peptidbindungen ein, die beispielsweise ein Amid, gebildet zwischen den Seitenketten der Aminogruppe eines Lysylrestes, mit einer Seiten-Carboxylgruppe eines Glutamylrestes und Esterbindungen, wie die, die gebildet werden zwischen Seitenketten -OH-Gruppe eines Threoninrestes mit einer Seitenketten-Carboxylgruppe eines Aspartylrestes. Jeder kompatible Rest, fähig zur Bildung von Peptidbrücken mit dem verbleibenden Teil der Kette (oder modifizierte Peptidbindungen, wie vorstehend beschrieben) und zur Bildung kovalenter Bindungen, um eine Cyclisierung zu bewirken, kann verwendet werden. Dieses schließt z.B. ein einfache cyclische Peptide, wobei eine Peptidbindung direkt gebildet wird zwischen dem NH&sub2;-Rest des N-Terminus und der COOH-Gruppe am C-Terminus.
Wie vorstehend beschrieben können eine oder mehere der angegebenen Peptidbindungen ersetzt werden durch eine substituierte Bindung, wie -CH&sub2;NH-, -CH&sub2;S-, -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2;- und -CH&sub2;SO-.
In der Bezeichnung der vorstehenden Aminosäurereste AA&sub1;-AA&sub4; ist bezug genommen worden auf eine Klassifizierungsmethode, bei der die Aminosäurereste in vier große Unterklassen eingeteilt werden. Diese Klassifizierung ist als Diagramm nachstehend gezeigt.
Sauer: Der Rest hat eine negative Ladung aufgrund der Abgabe eines Wasserstoffions bei physiologischem pH und der Rest wird angezogen von einer wäßrigen Lösung, so daß er die Oberflächenpositionen in der Konformation eines Peptids, in der er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in wäßrigem Medium bei physiologischem pH vorliegt.
Basisch: Der Rest hat eine positive Ladung aufgrund der Anlagerung eines Wasserstoffions bei physiologischem pH-Wert und der Rest wird angezogen von einer wäßrigen Lösung, so daß er die Oberflächenpositionen in der Konformation eines Peptids einnimmt, in der er enthalten ist, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium bei physiologischem pH vorliegt.
Neutral/nicht-polar: Die Reste sind nicht geladen bei einem physiologischen pH und der Rest wird durch wäßrige Lösung abgestoßen, so daß er die inneren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium vorliegt. Diese Reste werden auch als "hydrophob" hier bezeichnet.
Neutral/polar: Die Reste sind nicht geladen bei einem physiologischen pH, aber der Rest wird angezogen durch eine wäßrige Lösung, so daß er die äußeren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium vorliegt.
Es wird davon ausgegangen, daß in einer statistischen Sammlung von individuellen Resten einige Moleküle geladen und einige nicht geladen sind und es wird eine Anziehung oder Abstoßung von dem wäßrigen Medium in einem größeren oder schwächeren Ausmaß geben. Die Definition "geladen" bedeutet einen signifikanten Prozentsatz (mindestens etwa 25%) der individuellen Molekule, die bei physiologischem pH geladen sind. Der Grad der Anziehung oder Abstoßung, erforderlich für die Klassifizierung als polar oder nicht-polar, ist willkürlich und daher sind die spezifisch in Betracht gezogenen Aminosäuren der Erfindung der einen oder anderen Klasse zugeordnet worden. Die meisten nicht spezifisch aufgeführten Aminosäuren können in bekannter Art klassifiziert werden.
Aminosäurereste können ferner subklassifiziert werden als cyclisch oder nicht-cyclisch und aromatisch oder nicht-aromatisch, selbsterklärende Klassifizierung hinsichtlich der Seitenketten-Substitutionsgruppen der Reste und als klein oder groß. Ein Rest wird als klein betrachtet, wenn er eine Gesamtzahl von 4 Kohlenstoffatomen oder weniger enthält, einschließlich des Carboxyl-Kohlenstoffs. Kleine Aminosäuren sind immer nicht-aromatisch. Für die natürlich vorkommenden Protein-Aminosäuren ist die Subklassifikation entsprechend dem vorstehenden Schema wie folgt (siehe auch das nachstehende Diagramm).
Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;
Basisch/nicht-cyclisch: Arginin, Lysin;
Basisch/cyclisch: Histidin;
Neutral/polar/klein: Glycin, Serin und Cystein;
Neutral/polar/groß/nicht-aromatisch: Threonin, Asparagin, Glutamin;
Neutral/polar/groß/aromatisch: Tyrosin;
Neutral/nicht-polar/klein: Alanin;
Neutral/nicht-polar/groß/nicht-aromatisch: Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin;
Neutral/nicht-polar/groß/aromatisch: Phenylalanin und Tryptophan.
Die Aminosäure Prolin, obgleich formal innerhalb der Gruppe neutral/nichtpolarlgroßlcyclisch und nicht-aromatisch, ist ein spezieller Fall hinsichtlich ihres bekannten Effekts auf die sekundäre Konformation der Peptidketten und ist daher nicht in diese definierten Gruppen eingeschlossen, sondern wird separat klassifiziert. AA&sub3; ist ein Prolinrest oder ein "modifizierter Prolinrest". Prolin ist ein 5-gliedriger Stickstoff-Heteroring mit einer Carboxylgruppe in der 2-Position. Modifizierte Prolinreste sind alle 5- oder 6-gliedrige Stickstoff-enthaltende Heteroringe mit Carboxylgruppen in der Position alpha zu dem Stickstoff. Zusätzliche heterocyclische Atome können ebenfalls in den Ring eingeschlossen sein. Daher schließen modifizierte Prolinreste von Reste von Pipecolinsäure (Piperidin-2- carbonsäure, Abkürzung Pip) und Thiazolidin (Thz) ein. Prolin oder modifizierte Prolinreste haben die allgemeine Formel
wobei eine oder zwei der Methylengruppen ersetzt sein können durch NR, S oder O und wobei irgendein Stickstoffatom des Rings gegebenenfalls ersetzt sein kann mit einem nichtinterferierenden Substituenten und R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist.
Bestimmte allgemein auftretende Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code codiert werden, schließen z.B. ein beta-Alanin (beta-Ala) oder andere omega-Aminosäuren, wie 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobutyrsäure, und so weiter, alpha-Aminoisobutyrsäure (Aib), Sarkosin (Sar), Ornithin (Orn), Zitrullin (Cit), Homoarginin (Har), t-Butylalanin (t- BuA), t-Butylglycin (t-BuG), N-Methylisoleucin (N-MeIle), Phenylglycin (Phg) und Cyclohexylalanin (Cha), Norleucin (Nle), Cysteinsäure (Cya), Pipecolinsäure (Pip), Thiazolidin (Thz), 2-Naphthylalanin (2-Nal) und Methioninsulfoxid (MSO). Diese werden ebenfalls in bestimmte Kategorien eingeordnet.
Basierend auf der vorstehenden Definition sind
Sar und beta-ala neutrallnicht-polar/klein;
t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle und Cha sind neutral/nicht-polar/groß/nicht-aromatisch;
Har und Orn sind basisch/nicht-cyclisch;
Cya ist sauer;
Cit, Acetyl Lys und MSO sind neutral/polar/groß/nicht-aromatisch;
2-Nal und Phg sind neutral/nicht-polar/groß/aromatisch; und
Pip und Thz sind modifizierte Prolinreste.
Das vorstehende ist im folgenden graphisch dargestellt: Aminosäure Klassifikationsschema Sauer nichtzyklisch Ornithin Homoarginin basisch Neutral polar nichtaromatisch
Die verschiedenen Omega-Aminosäuren sind klassifiziert entspechend der Größe als neutral/nicht-polar/klein (beta-ala, d.h. 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure) oder große (alle anderen).
Andere Aminosäuresubstitutionen für die genetisch codierten können ebenfalls in die erfindungsgemäßen Peptidverbindungen eingeschlossen werden und können gemäß diesem allgemeinen Schema klassifiziert werden.
In den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, haben die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, obwohl es nicht immer angegeben ist, die Form, die sie bei physiologischen pH-Werten haben, wenn es nicht anders angegeben ist. Daher ist der Amino-Terminus und der Carboxy-Terminus bei einem physiologischen pH geladen und ist vorhanden, obwohl er nicht notwendigerweise spezifiziert und gezeigt ist, sowohl in spezifischen Beispielen, als auch in allgemeinen Formeln. Die basischen und sauren Additionssalze einschließlich derer, die bei nicht-physiologischen pH-Werten gebildet werden, sind ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verbindungen eingeschlossen. Wenn nicht anders vermerkt, sind die Reste in der L-Form. In den allgemeinen Formeln können die spezifischen Reste entweder in der L- oder D-Form vorliegen. Im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Peptide 0, 1 oder 2 D-Reste eingeschlossen, bevorzugt 0 oder 1 und besonders bevorzugt 0. In den gezeigten Peptiden ist jeder codierte Rest im Ein-Buchstaben-Code dargestellt, entsprechend der konventionellen nachstehenden Liste:
Die Aminosäuren, die nicht genetisch codiert werden, werden abgekürzt, wie vorstehend angegeben.
In den spezifischen Peptiden, die in der vorliegenden Anmeldung dargestellt sind, ist die L- Form jedes Aminosäurerestes mit einem optischen Isomer gemeint, soweit es nicht ausdrücklich anders durch ein hochgestelltes Kreuz ( ) angegeben ist. Während die Reste der erfindungsgemäßen Peptide normalerweise in der natürlichen L-Form der optischen Isomere vorkommen, können eine oder zwei, bevorzugt eine Aminosäure ersetzt werden durch die D-Form der optischen Isomere.
Frei funktionelle Gruppen einschließlich der an dem Carboxy- oder Amino-Terminus können ebenfalls modifiziert werden durch Amidierung, Acylierung oder andere Substitutionen, die z.B. die Löslichkeit der Verbindungen verändern, ohne ihre Aktivität zu beeinflussen.
Bei der Bildung von amidierten Peptiden der vorliegenden Erfindung können die Analog- Verbindungen direkt synthetisiert werden, z.B. unter Verwendung von Boc-AAx-pMBHA- Harz- oder Boc-AAx-BHA-Harz, wobei AAx die ausgewählte Carboxy-terminale Aminosäure des gewünschten Peptids ist, wie nachstehend beschrieben. Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide auch chemisch oder enzymatisch amidiert werden nach der Peptidsynthese unter Verwendung von bekannten Mitteln oder hergestellt werden durch Standard-Lösungs-Phasen-Peptidsynthese-Protokolle.
Gewisse Ausführungsformen der de novo-Peptide der Erfindung sind bevorzugt. In der K*(G/Sar)D-Sequenz ist G/Sar bevorzugt G. AA&sub1; und AA&sub4; sind bevorzugt Gly, Ala oder Ser; n1 ist bevorzugt 0-2, n4 ist bevorzugt 1-2. Bevorzugt für AA&sub2; sind neutrale/nichtpolare/aromatische Aminosäuren, insbesondere Tryptophan, Phenylalanin, Leucin, Thyrosin oder Valin, insbesondere Tryptophan; n&sub2; ist bevorzugt 1. X&sub1; und X&sub2; sind bevorzugt Cys, Mpr oder Pen (Penicillamin)-Reste. Y&sub1; ist bevorzugt H, Acetyl oder Gly; Y&sub2; ist bevorzugt -NH&sub2; oder -A-NH&sub2;. Ebenfalls bevorzugt sind im allgemeinen C-terminale amidierte Formen Y&sub2;.
Somit schließen bevorzugte Ausführungsformen von PAI-Analoga der Erfindung Peptide der folgenden Formeln ein. Obgleich alle diese in der Lage sind, durch Bildung von Disulfid-Bindungen in cyclischer Form vorzuliegen, sind diese Bindungen nicht im einzelnen angegeben. Andere cyclische Formen sind durch "cyclo" angegeben.

Bevorzugte Peptide

PAI 1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V- C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G
PAI 2: E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G- K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G
PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;;
PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;
PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 7: C-K-G-D-W-C-A-NH&sub2;;
PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;
PAI 13: C-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;
PAI 14: C-K-G-D-L-P-C-NH&sub2;
PAI 15: C-K--G-D-V-P-C-NH&sub2;
PAI 16: C-K-G-D-Y(OMe)-P-C-NH&sub2;
PAI 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH&sub2;
PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C-NH&sub2;
PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;
PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;
PAI 22: Mpr-K- G-D-L-P-C-NH&sub2;
PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C-NH&sub2;
PAI 24: Mpr-K-G-D-Y(OMe)-P-C-NH&sub2;
PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH&sub2;
PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C-NH&sub2;
PAI 27: cyclo(G-K-G-D-W-P)
PAI 28: cyclo(A-K-G-D-W-P)
PAI 29: cyclo(D-Ala-K-G-D-W-P)
PAI 30: cyclo(F-K-G-D-W-P)
PAI 31: cyclo(beta-Ala-K-G-D-W-P)
PAI 32: cyclo(gamma-Abu-K-G-D-W-P)
PAI 33: cyclo(R-K-G-D-W-P)
PAI 34: C-K-G-D-W-G-C-NH&sub2;
PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH&sub2;
PAI 41: C-K-G-D-I-P-C-NH&sub2;
PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH&sub2;
PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 44: C-K-G-D-( 4-NO&sub2;-Phe)-P-C-NH&sub2;
PAI 47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formyl)-P-C-NH&sub2;
PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen -NH&sub2;
PAI 54: Mpr-K-G-D -W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH&sub2;
PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH&sub2;
PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH&sub2;
PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C -NH&sub2;
PAI 62: Mpr-K -G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 64: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 66: Mpr-(NG,NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 67: Mpr-(NG,NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 69: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 70: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH&sub2;
PAI 72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-PenNH&sub2;
PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH&sub2;
PAI 75: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-Pen-NH&sub2;
Besonders bevorzugt sind Peptide der Formeln
PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;;
PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;;
PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;;
PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;
PAI 13: C-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;
PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH&sub2;
PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH&sub2;
PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH&sub2;
PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 44: C-K-G-D-(4-NO&sub2;-Phe)-P-C-NH&sub2;
PAI 47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formyl)-P-C-NH&sub2;
PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-(D-Pen)-NH&sub2;
PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH&sub2;
PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH&sub2;
PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH&sub2;
PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C -NH&sub2;
PAI 62: Mpr-K -G-D-W-P-C-Pen-NH&sub2;
PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 64: Mpr-(Acetimidyl-Lys-)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 66: Mpr-(NG,NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 67: Mpr-(NG-NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 69: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
PAI 70: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH&sub2;
PAI 72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-PenNH&sub2;
PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH&sub2;
Andere Verbindungen, die als spezifische Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren nützlich sind, schließen ein:
PAI 9: Mpr-K-G-D-Pen-NH&sub2;
PAI 56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH&sub2;; und
PAI 74: Mpr-Har-G-D-Pen-NH&sub2;.

Chemische Synthese von erfindungsgemäßen Peptiden

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können chemisch synthetisiert werden durch bekannte Verfahren, z.B. Festphasen-Peptidsynthese. Die Synthese beginnt am Carboxyterminalen Ende des Peptids unter Verwendung einer alpha-Amino-geschützten Aminosäure. t-Butyloxycarbonyl (Boc)-Schutzgruppen können verwendet werden fur alle Aminogruppen, obgleich andere Schutzgruppen, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ebenfalls geeignet sind. Zum Beispiel können Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH, Boc-His (Tos)-OH, (d.h. ausgewählte Carboxy-terminale Aminosäuren) verestert werden mit Chlor-methyliertem Polystyrol-Trägerharzen, p-Methylbenzhydrylamin (pMBHA) oder PAM-Harzen. Das Polystyrol-Trägerharz ist bevorzugt ein Copolymer von Styrol mit etwa 0,5 bis 2% Divinylbenzen als quervemetzendes Mittel, das das Polystyrolpolymer in bestimmten organischen Lösungsmitteln vollständig unlöslich macht, Stewart, et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 1969, W.H. Freeman Co., San Francisco und Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 1963, 2149-2154. Diese und andere Verfahren der Peptidsynthese sind ebenfalls veranschaulicht in US-Psen 3,862,925, 3,842,067, 3,972,859 und 4,105,602.
Die Synthese kann manuelle Synthesetechniken verwenden oder automatisch ausgeführt werden, z.B. an einem Applied BioSystems 430A oder 43 1A-Peptid-Synthesizer (Foster City, Kalifornien), entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Abspaltung der Peptide von dem Harz kann durchgeführt werden unter Verwendung des "low-high" HF- Protokolls zum Abspalten der Schutzgruppen, wie beschrieben in Lu, G.-S. et al., Int. J. Peptide & Protein Res., 29, 1987, 545-557. Die Rückfaltung der Analoga von Schlangengift-PAIs kann durchgeführt werden unter Verwendung des Verfahrens, beschrieben bei Garsky, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, 4022-4026, die die Festphasensynthese von Echistatin beschreiben.
Die cyclischen Peptide dieser Erfindung, die keine Disulfidbindungen haben, können herkömmlich hergestellt werden durch Kombination der Festphasensynthese und der Bildung der cyclischen Ringstruktur in Lösung unter Verwendung der allgemeinen Verfahren, die beschrieben sind in der US-PS 4,612,366. Somit können lineare Peptide, hergestellt nach Standard-Merrifield-Harz gespalten werden von dem Harz mit Hydrazin, gefolgt von der Cyclisierung des entsprechenden Azids, um cyclische Peptide zu bilden.
Der Fachmann im Bereich der Peptidsynthese wird anerkennen, daß die Intermediate, die konstruiert werden gemäß der vorliegenden Beschreibung während der Synthese der erfindungsgem ßen Analog-Verbindungen selber neue und nützliche Verbindungen sind und in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen.

Rekombinante DNA-Herstellung

Alternativ können ausgewählte erfindungsgemäße Verbindungen hergestellt werden durch Expression von rekombinanten DNA-Konstrukten, hergestellt gemäß bekannten Verfahren. Diese Herstellung kann wünschenswert sein, um große Mengen oder alternative Ausführungsformen dieser Verbindungen bereitzustellen. Da die Peptidsequenzen relativ kurz sind, ist die rekombinante Herstellung erleichtert. Jedoch ist die rekombinante Herstellung besonders bevorzugt über die Standard-Festphasen-Peptidsynthese für Peptide mit mindestens 8 Aminosäureresten.
Die DNA, die das sequenzierte PAI codiert, ist vorzugsweise hergestellt unter Verwendung kommerziell verfügbarer Nucleinsäure-Syntheseverfahren. Verfahren zur Konstruktion von Expressionssystemen für die Herstellung von PAI in Wirten sind bekannt.
Die Expression kann sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Wirten durchgeführt werden. Bei den Prokarionten handelt es sich meistens um verschiedene Stämme von E. coli. Jedoch können ebenfalls andere mikrobiologische Stämme verwendet werden, wie Bazillus, z.B. Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere bakterielle Stämme. In diesen prokaryontischen Systemen werden Plasmid-Vektoren verwendet, die Replikationsorte und Kontrollsequenzen enthalten, abgeleitet von einer Art, die kompatibel mit dem Wirt ist. Zum Beispiel ist pBR322 und seine Derivate ein Arbeits- Vektor für E. coli. Im allgemeinen verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, die Promotoren für die Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit ribosomen Bindungesstellen-Sequenzen, schließen allgemein verwendete Promotoren, wie das beta-Lactamase-(Penicillinase) und Lactase (lac) Promotorsysteme, das Tryptophan (Trp) Promotorsystem und den von Lambda-abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen- Ribosom-Bindungsstelle ein. Jedoch kann jedes erhältliche Promotorsystem, das mit den Prokarioten kompatibel ist, verwendet werden.
Expressionssysteme, die nützlich sind in eukaryontischen Wirten, umfassen Promotoren, abgeleitet von geeigneten eukaryontischen Genen. Eine Klasse von Promotoren, die nützlich ist in Hefe, schließt z.B. Promotoren flir die Synthese von glycolytischen Enzymen ein, z.B. die für 3-Phosphoglyceratkinase. Andere Hefe-Promotoren schließen die des Enolase-Gens oder des Leu2-Gens, erhalten aus YEp13 ein.
Geeignete Säuger-Promotoren schließen die frühen und späten Promotoren des SV40 oder anderer viraler Promotoren wie der, abgeleitet von Polyoma, Adenovirus II, Rinder- Papillomavirus oder Vogel-Sarkomaviren ein. Geeignete virale und Säuger-Enhancer sind vorstehend genannt. Falls Pflanzenzellen als Expressionssystem verwendet werden, ist z.B. der Nopalin-Synthese-Promotor geeignet.
Die Expressionssysteme werden konstruiert unter Verwendung bekannter Restriktions- und Ligationstechniken und werden transformiert in geeignete Wirte.
Die Transformation wird durchgeführt unter Verwendung von Standard-Techniken, die für die jeweiligen Zellen geeignet sind. Die Zellen, die die Expressionssysteme enthalten, werden unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung von PAI kultiviert. Danach wird das PAI gewonnen und gereinigt.

Antikörper

Verfügbarkeit von erfindungsgemäßem gereinigtem PAI erlaubt ebenfalls die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch immunoreaktiv sind mit diesen Formen der aktiven Peptide.
Die Verbindungen, die gereinigtes PAI, isoliert aus Schlangengift oder auf andere Weise synthetisiert, enthalten, können verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, die immunoreaktiv flir das PAI-Peptid sind. Standard-Immunosierungsprotokolle, die die Verabreichung von PAI an verschiedene Vertebraten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse, Schafe und Hühner beinhalten, führen zu Antisera, die immunoreaktiv für das gereinigte Peptid sind. PAI kann vorteilhaft an einen geeigneten antigenisch-neutralen Träger konjugiert werden, wie ein geeignetes Serumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin. um die Immunogenität zu erhöhen. Zusätzlich kann das freie Peptid als eine Alternative zur Konjugation zusammen mit methyliertem BSA injiziiert werden. Darüberhinaus können die Antikörper-produzierenden Zellen des immunisierten Säugers unsterblich gemacht werden, um monoklonale Antikörper-Panels zu erzeugen, die dann bezüglich der Reaktivität mit PAI gescreent werden können.
Die resultierenden polyklonalen oder monoklonalen Antikörper-Zubereitungen sind nützlich in Tests für die Menge des korrespondierenden PAI in biologischen Proben unter Verwendung von Standard-Immuno-Assays.

Der Test auf die Bindung von Fibrinogen an den GP IIb-IIIa-Komplex in vitro

Die Identifizierung von Schlangengift-Ausgangsmaterial, das aktives PAI enthält und welches PAI bekannte Spezifität aufweist, wird durch den erfindungsgemäßen Test ermöglicht. Der Test stützt sich auf die Beobachtung, daß Verbindungen, die die Bindung von Fibrinogen an den GP IIb-IIIa-Komplex in vitro blockieren, ebenfalls in der Lage sind, die Thrombin oder ADP-induzierte Aggregation von menschlichen Blutplättchen und die Bildung von Blutplättchen-Thromben in vivo zu inhibieren. Diese Beobachtung stellt die Basis bereit, um potente PAI zu erhalten durch Abschätzen der Fähigkeit des Testmaterials, die Fibrinogen-GP IIb-IIIa-Interaktionen zu stören.
In dem Test wird ein fester Träger, wie Perlen, Teströhrchen oder Mikrotiterplatten mit dem GP IIb-IIIa in gereingter Form hergestellt, wie bei Fitzgerald, L.A., et al., Anal. Biochem., 151, 1985, 169-177 beschrieben. Der beschichtete Träger wird danach in Kontakt gebracht mit Fibrinogen und dem Testmaterial und für eine ausreichende Zeit inkubiert, um eine maximale Bindung von Fibrinogen an das immobilisierte GP IIb-IIIa zu ermöglichen. Fibrinogen wird typischerweise mit einer Konzentration von etwa 5-50 nM bereitgestellt und das Testmaterial kann, wenn gewünscht, nach einer Serie von Verdünnungen hinzugegeben werden. Typische Inkubationen werden für 2-4 Stunden bei 35ºC durchgeführt. Die Zeit und die Temperatur sind voneinander abhängig.
Nach der Inkubation wird die Lösung, enthaltend das Fibrinogen und das Testmaterial, entfernt und der Level der Bindung von Fibrinogen gemessen durch die Quantifizierung des an GP IIb-IIIa gebundenen Fibrinogens. Jedes geeignete Mittel zum Nachweis kann verwendet werden, aber es ist üblich, markiertes Fibrinogen zu verwenden, z.B. durch Verwendung von radioaktiven, Fluoreszenz- oder Biotin-Markierungen. Solche Verfahren sind bekannt und brauchen nicht erläutert werden.
Die Bestimmung der Ergebnisse wird unterstützt durch das Verwenden einer Kontrollprobe, die gewöhnlich identisch mit der Testprobe ist, mit der Ausnahme, daß Testsubstanz fehlt. In diesem Fall kann der Prozentsatz der Inhibierung halbiert werden unter Verwendung der Menge von Fg, gebunden in der Kontrolle als Bezugsgröße, so daß
Prozentsatz Inhibierung = Kontrolle - Test/Kontrolle x 100
Andere Maßstäbe flir die Wirksamkeit der Inhibierung, wie IC&sub5;&sub0;, können ebenfalls verwendet werden.
Die erfmdungsgemäßen Testsysteme schließen weiterhin die Charakterisierung der PAI- Spezifität ein durch Bindungs-Inhibierungs-Tests, identisch zu dem vorstehenden, wobei andere adhäsive Proteine für Fg und andere Rezeptoren für GP IIb-IIIa eingesetzt werden. Insbesondere kann die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor, von Fibronectin an den Fibronectin-Rezeptor, von Fibronectin an GP IIb-IIIa und Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa bestimmt werden. Die adhäsiven Proteine und Rezeptoren für diese Tests sind erhältlich.

Andere Tests

Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Plattentests sind andere Tests für die Aktivität der Blutplättchen-Aggregationsinhibierung und verwandter Aktivitäten ebenfalls erhältlich, wie vorstehend beschrieben. Zusammengefaßt gibt es folgende allgemein verwendete Tests:
1. Die Plattentests, die spezifische Rezeptoren verwenden, wie in den vorstehenden Absätzen beschrieben;
2. Standard-Tests, die direkt auf die Blutplättchen-Aggregation angewendet werden, wie die, beschrieben bei Gann, Z.-R. et al., J. Biol. Chem., 263, 1988, 19827-19832; Huang. T.F. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157-16163; Biochemistry, 28, 1989, 661-666, vorstehend zitiert und hier eingeschlossen;
3. Ein in vivo-Thrombose-Modell in Hunden, wie nachstehend in Beispiel 1 und bei Folts. J.D. et al., Circulation, 54, 1976, 365 beschrieben; und
4. Die Wirkung auf die Zelladhäsion unter Verwendung von S35 Methionin-markierten Zellen, wie nachstehend in Beispiel 19 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen PAIs sind therapeutisch nützlich, um die Thrombus-Bildung zu verhindern. Indikationen, für die diese Behandlung geeignet ist, schließen, ohne eine Limitierung darzustellen, ein, Atherosclerose und Arteriosclerose, akuter Herzinfarkt, chronische unstabile Angina, vorübergehende ischemische Attacken und Anfälle, periphere vaskuläre Krankheiten, arterielle Thrombose, Präklampsia, Embolie, Restenose und/oder Thrombose im Anschluß an Angioplastie, Carotis-Endarteriektomie, Anastomose von vaskulären Verschlüssen und chronische kardiovaskuläre Vorrichtungen (z.B. Verweil-Katheter oder Ableitungen-"extracorporale Kreislaufvorrichtungen"). Diese Syndrome stellen eine Vielzahl von stenotischen und okklusiven vaskulären Störungen dar, von denen angenommen wird, daß sie durch Blutplättchen-Aktivierung an den Gefäßwänden ausgelöst werden.
Die PAIs können verwendet werden zum Vorbeugen oder zur Unterbrechung der arteriellen Thrombus-Bildung bei unstabiler Angina und arterieller Embolie oder Thrombose genauso, wie zur Behandlung oder zum Vorbeugen eines Mykardialinfarkts (MI) und der muralen Thrombus-Bildung nach einem MI. Bei den Hirn-verwandten Störungen sind die Behandlung oder Vorbeugung von vorübergehenden ischemischen Attacken und die Behandlung von thrombotischen Schlaganfällen oder Schlaganfällen in der Entwicklung eingeschlossen.
Die PAIs können ebenfalls verwendet werden zur Vorbeugung der Blutplättchen-Aggregation, Embolisierung oder der Aufzehrung in extrakorporalen Kreisläufen, einschließlich der Verbesserung der renalen Dialyse, bei kardiopulmonalen By-Pässen, Hämoperfusionen und Plasmapherese.
PAIs verhindern Blutplättchen-Aggregation, Embolisierung oder die Aufzehrung, sozuert mit intravaskulären Geräten und die Verabreichung resultiert in einer verwässerten Nützlichkeit von intraaortalen Ballonpumpen, ventrikularen Hilfsgeräten und arteriellen Kathetern.
Die PAIs sind ebenfalls nützlich bei der Behandlung oder der Vorbeugung von venösen Thrombosen tiefvenöser Thrombose IVC, renalen Venalen- oder portalen Venen-Thrombosen und pulmonalen venösen Thrombosen.
Verschiedene Störungen, die eine Blutplättchen-Aufzehrung betreffen, wie eine thrombotische Werlhofsche Purpura, sind ebenfalls behandelbar.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen PAIs verwendet werden in einer Anzahl von nicht-therapeutischen Anwendungen, bei denen eine Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation erwünscht ist. Zum Beispiel die Verbesserung von Blutplättchen und die Lagerung von Vollblut kann erreicht werden durch Zusatz in ausreichenden Mengen der Peptide, wobei die Menge abhängt von der Länge der Lagerungszeit, den Bedingungen der Lagerung, der letztendlichen Verwendung des gelagerten Materials, etc.
Die PAI-Dosierung kann in einem weiten Bereich variieren, abhängig von den gewünschten Effekten und der therapeutischen Aufgabe. Typische Dosierung liegen zwischen etwa 0,01 und 10 mg/kg, bevorzugt zwischen etwa 0,01 bis 0,1 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung ist vorzugsweise parenteral, wie intravenös auf einer täglichen Basis bis zu einer Woche oder bis zu ein oder zwei Monaten oder mehr, wobei es je nach Peptidgröße variiert. Wenn die Peptide ausreichend klein sind (d.h. kleiner als 8-10 Aminosäurereste), können andere Routen der Verabreichung genutzt werden, wie intranasal, sublingual oder dergleichen.
Injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden in konventionellen Formen, entweder als Flüssigkeitslösungen oder Suspensionen, festen Formen. geeignet für Lösungen oder Suspensionen in Flüssigkeiten vor der Injektion oder als Emulsionen. Geeignete Exzipiens sind z.B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Mannitol, Lactose, Lecithin, Albumin, Natriumglutamat, Cysteinhydrochlorid, oder dergleichen. Zusätzlich können, wenn gewünscht, injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen kleinere Mengen von nicht-toxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie Benetzungsmittel, pH-Puffersubstanzen, und dergleichen. Falls gewünscht, können Absorptions-erhöhende Präparationen (z.B. Liposome) verwendet werden.

Beispiel 1

Test für Schlangengift-Blutplättchen-Adhäsions-Inhibitoren

A. Beschreibung der Assays (Plattentests)

Gereinigter Blutplättchen-GP IIb-IIIa-Rezeptor wurde hergestellt, wie beschrieben bei Fitzgerald, L.A. et al., Anal. Biochem., 151, 1985, 169-177. Vitronectin-Rezeptor wurde hergestellt, wie beschrieben bei Smith, J.W., J. Biol. Chem., 263, 1988, 18726-18731. Nach der Reinigung wurden die Rezeptoren gelagert in 0,1% Triton X-100 bei 0,1-1,0 mg/ml.
Die Rezeptoren wurden auf die Näpfchen einer 96-Näpfchen-Flach-Boden ELISA-Platten (Linbro EIA-Plus-Mikrotiterplatte, Flow Laboratories) nach Verdünnung 1:200 mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM CaCl&sub2;, pH 7,4, um die Triton X-100 Konzentration unter der kritischen mizellaren Konzentration zu reduzieren, aufgebracht und ein Aliquot von 100 µl wurde zu jedem Näpfchen hinzugefügt. Die Näpfchen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert und danach bis zur Trockenheit aspiriert.
Zusätzliche Stellen wurden blockiert durch die Zugabe von 35 mg/ml von Rinderserumalbumin (BSA) in den vorstehenden Puffer für 2 Stunden bei 30ºC, um nicht-spezifische Bindung zu verhindern. Die Näpfchen wurden danach einmal gewaschen mit Bindungspuffer (50 nM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl&sub2;, 1 mg/ml BSA).
Die entsprechenden Liganden (Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor oder Vitronectin) wur den mit ¹²&sup5;I markiert oder mit Biotin konjugiert unter Verwendung von käuflich erhältlichen Reagenzien und Standard-Verfahren. Die markierten Liganden wurden zu den Rezeptor-beschichteten Näpfchen zu einer Endkonzentration von 10 nM (100 µl/Näpfchen) gegeben und für 3 Stunden bei 30ºC in der Gegenwart oder dem Fehlen der Testproben inkubiert. Nach der Irikubation wurden die Näpfchen bis zur Trockenheit aspiriert und die Ligandbindung quantifiziert.
Bei ¹²&sup5;I-markierten Liganden wird das Protein mit 250 µl SDS gelöst. Bei Biotin-markierten Liganden wird das gebundene Protein nachgewiesen durch die Zugabe von Antibiotin- Antikörper, konjugiert an alkalischer Phosphatase, gefolgt von der Zugabe des Substrats (p-Nitrophenylphosphat) und der Bestimmung der optischen Dichte von jedem Näpfchen bei 405 nm. Eine verminderte Farbentwicklung oder ein verminderter ¹²&sup5;I-Gehalt wird beobachtet in Näpfchen, die mit Testproben inkubiert werden, die die Bindung des Liganden an den Rezeptor inhibieren.

B. Bestimmung der Adhäsionsinhibierung in Roh-Gift

68 rohe, lyophylisierte Schlangengift, erhalten entweder von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) oder Miami Serpentanum Labs (Salt Lake City, UT), wurden bei 1 mg/ml aufgelöst in Puffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,02% Azid, 2 mM CaCl&sub2;). Ein ml Aliquot der Lösungen wurde der Ultrafiltration durch Centrocon -10 (YM-Membran) Mikrokonzentrierer (Amicon, Danvers, MA) unterzogen. Die Filtrate wurden als Testproben in dem Rezeptor/Ligand-Test des Abschnitts A unter Verwendung des GP IIb-IIIa/fibrinogen- Systems eingesetzt und die Bindung wurde nachgewiesen unter Verwendung von Biotinmarkiertem Fibrinogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Wie dargestellt, ist die Aktivität vorhanden bei einigen, aber nicht allen Arten von Viperinae, aber sie fehlt in allen getesteten Arten von Elapidae.
Figur 1 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Verdünnungen der Filtrate für vier Arten. Selbst bei der größten Verdünnung (25 µl/0,5 ml) zeigen drei aktive Gifte maximale Inhibierung.

C. Bestimmung der Aktivität von Peptiden in einem in vivo-Modell der Thrombose

Gereinigte Peptide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Thrombus-Bildung in Koronararterien des Hundes in dem von Folts beschriebenen Modell zu inhibieren (Folts J.D. et al., Circulation, 54, 1976, 365). In diesem Modell wurde gezeigt, daß die Fließreduzierung in einer zusammengezogenen Koronarartene auf die Bildung von Blutplättchen-Aggregaten zurückgeht. Weiter ist gezeigt worden, daß Mittel, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa blockieren, diese Fließreduzierung verhindern (Coller B.S. et al., Blood, 68, 1986, 783). Die Peptide wurden aufgelöst in normaler Salzlösung und in eine periphere Vene als eine Einzelgabe verabreicht. TABELLE 1 Centroconr -10 gereinigte Gifte, gescreent in IIb-IIIa Plattentest

D. Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden auf die Zellanlagerung an adhäsive Proteine

M21 Melanoma-Zellen, die große Mengen des Vitronectin-Rezeptors exprimieren, wurden metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin markiert und dann zu 24-Näpfchen-Gewebekulturplatten gegeben, die mit Vitronectin beschichtet waren. Zur Anlagerung wurde eine Inkubationsperiode von 1 Stunde bei 37ºC gewählt. Danach wurden nicht-festgehaltene Zellen durch eine Waschung entfernt. Nach dem Waschen wurden die festgehaltenen Zellen gelöst und die Überstände in einen Flüssigkeits-Scintillationszähler gegeben. Die Fraktion von Zellen, die festgehalten wurde, wurde kalkuliert durch Teilen des cpm in den gelösten Überständen durch den cpm in der Gesamtzahl von Zellen, die zu jedem Näpfchen hinzugegeben wurden. Die Wirkungen von gereinigten Schlangengift-Peptiden und synthetischen cyclischen Peptiden auf die Zelladhäsion wurde bestimmt durch Zugabe dieser zu den M21-Zellen während der Inkubationsperiode.

E. Spezifität der Adhäsionsinhibierung

Ultrafiltrate von drei Arten von Schlangengift, Sistrurus m. barbouri, Crotalus ruber ruber und Crotalus basilicus wurden in dem Fibrinogen/GP IIb-IIIa und Vitronectin/Vitronectin- Rezeptor-Test des Abschnitts A getestet. Die Ergebnisse wurden bei verschiedenen Verdünnungen bestimmt. Wie in Figur 2A gezeigt, inhibiert das Gift von Sistrurus m. barbouri bevorzugt die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa, das Gift von Crotalus ruber ruber inhibiert sowohl die Bindung in beiden Systemen etwa gleichermaßen, wie in Figur 2B gezeigt, und das Gift von Crotalus basilicus inhibiert bevorzugt die Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Bindung, wie in Figur 2C gezeigt.
Bei den Reinigungen, die in den Beispielen 2-6 und 8-12 beschrieben sind, wurde PAI- Aktivität bestimmt durch eine direkte Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation. Blutplättchen-reiches Plasma (PRP) wurde erhalten von einem gesunden menschlichen Freiwilligen. Die Aggregation wurde induziert durch die Zugabe von 4 µM ADP zu 0,5 ml PRP in einem Aggregometer (Chrono-log Corp.).
Eine Tabelle, die die Ergebnisse der Aminosäure-Zusammensetzungs-Analyse von gereinigtem PAI der Beispiele 2-6 darstellt, ist nach dem Beispiel 6 abgebildet. Eine entsprechende Tabelle, die die Ergebnisse für die Beispiele 8-11 zeigt, findet sich im Anschluß an Beispiel 8.
Diese Analyse wurde durchgeführt durch die Hydrolyse der Peptide mit 6 N HCl und der Analysierung der Hydrolysate unter Verwendung eines Beckman 121 HC-Analysators, ausgestattet mit einem Modell 126 Datensystem. Cysteinsäure wurde nach dem Verfahren von Moore, J. Biol. Chem., 230, 1969, 235-237 bestimmt. Triptophan wurde nicht bestimmt.

Beispiel 2

Reinigung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitor (PAI) von Eristocophis macmahoni Gift

Eine Lösung von 45 mg von Eristocophis macmahoni Gift (Miami Serpentanum Labs, Lot #EM23SZ) in 1,0 ml von 0,5 % Trifluoressigsäure (TFA) wurde für 20 Minuten auf Eis gekühlt, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters, Milford, MA) equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 1 % TFA, geladen. Ein Gradient von 5% bis 15% Acetonitril über 5 Minuten (2%/Minute) gefolgt von einem Gradienten von 15 % bis 30% Acetonitril über 35 Minuten und einem Gradienten von 50% Acetonitril über 20 Minuten wurde unter Verwendung eines Waters 600 E Flüssigkeitschromatographen verwendet. Eine Flußrate von 1,5 ml/Minute wurde aufrechterhalten und die Säulenelution wurde in 2 Minuten-Fraktionen in Polypropylen-Röhren gesammelt.
Der Säulenausfluß wurde überwacht bei 220 nm/2,5 absorbance units full scale (AUFS).
Die Fraktionen wurden auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens konzentriert unter Verwendung eines Speed-Vac Konzentrierers (Savant). Danach wurden diese lyophylisiert. Die Proben wurden danach in 1 ml destilliertem Wasser wiederaufgenommen und Aliquots (10-50 µl) wurden auf ihre Fähigkeit, die menschliche Blutplättchen-Aggregation zu inhibieren in Blutplättchen-reichem Plasma induziert durch 20 µM ADP unter Verwendung eines Vollblut-Aggregometers (Chrono-log Corp., Havertown, PA).
Wie in Figur 3 gezeigt, wurde die Aktivität in den Fraktionen gefunden, die bei einer Acetonitrilkonzentration von 21-25% eluieren. Diese Fraktionen wurden dann lyophylisiert und über eine C-18 HPLC-Säule laufengelassen unter Verwendung des folgenden flachen Acetonitril-Gradienten: Die anfänglichen Bedingungen bestehen aus 8% Acetonitril, gefolgt von einem Gradienten von 25% Acetonitril über 68 Minuten (0,25%/Minute), gefolgt von 60% Acetonitril über 10 Minuten. Ein-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und bezüglich der inhibitorischen Aktivität bei der Blutplättchen-Aggregation von menschlichen Blutplättchen untersucht, wie vorstehend beschrieben.
Wie in Figur 4 gezeigt, eluiert die aktive Fraktion bei 24% Acetonitril. Die aktiven Fraktionen wurden danach der analytischen HPLC bei einem Nachweis bei 220 nm unterzogen und eluiert als eine einzelne symmetrische bioaktive Komponente, wie in Figur 5 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse von HPLC-gereüiigtem Material zeigt, daß das Peptid 49 Reste einschließlich 7-8 Cysteine enthält, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Versuche eines automatischen Edman-Abbaus der Carboxyamido-methylierten Peptide führtem zu keinem Erfolg. Daher wurde dieses Material mit Lys-C- und Asp-N-Endoproteinasen abgebaut und die Fragmente sequenziert, wie in Figur 6 gezeigt. Diese Analyse führte zu einer Sequenz von 48 Resten. Da jedoch zwei Tryptophanreste bei dieser Sequenzanalyse bestimmt wurden, die nicht in der Aminosäure-Zusammensetzung bestimmt wurden, enthält das intakte Peptid 51 Aminosäurereste. Zwei Glx-Reste und ein Arg-Rest. die an der bestimmten Sequenz fehlen, sind wahrscheinlich an dem blockierten Amino- Terminus des Peptids vorhanden. Da es sehr wahrscheinlich ist, daß einer der Glx-Reste ein Pyroglutamylrest an dem Amino-Terminus ist, der zur Blockierung des intakten Peptids führt, wurde diese Gruppe von dem intakten Carboxyamido-methylierten Peptid entfernt mit dem Enzym Pyroglutamylaminopeptidase (L-Pyroglutamylpeptidhydrolase, EC 3.4.11.8, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Die bei Podell und Abraham, Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 1978, 176-185, beschriebenen Verfahren wurden durchgeführt. 100 µg des Peptids wurden mit der Peptidase bei einem Substrat zu Enzymverhältnis von 100:1 durchgeführt. Danach wurde eine Umkehrphasen-HPLC- Reinigung des Gemisches auf einer Waters-analytischen C-18-Säule durchgeführt mit einem Material, geeignet für den automatischen Edman-Abbau. Die Ergebnisse dieser Analyse und die Darstellung der ganzen Sequenz dieses Peptids, das "Ensticophin" genannt wurde, ist in Figur 6 gezeigt.
Die gesamte Aminosäuresequenz dieses PAI ist in Figur 6 gezeigt. Dieses Peptid hat die RGD-Sequenz in der Bindungsregion und zeigt starke Homologie zu Echistatin.

Beispiel 3

Reinigung von PAI von Sistrurus catenatus tergeminus Gift

360 mg von Sistrurus c. tergeminus Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #ST6SZ) wurden in 7 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule aufgetragen (Pharmacia, 2,5 x 100 cm), die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von etwa 25 ml/h laufengelassen und 5-ml Fraktionen wurden gesammelt. 25 µl von jeder Fraktion wurden vereinigt zu Gruppen von 10 Fraktionen (d.h. Fraktionen 1-10, 11-20, etc.) und für Analyse lyophilisiert. Die getrockneten zusammengelegten Fraktionen wurden in Wasser wieder aufgelöst. Die Aliquots wurden bezüglich der innibitorischen Aktivität in der ADP-stimulierten Aggregation von menschlichen Blutplättchen untersucht. Die aktiven Fraktionen (31-40) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Dieses Material wurde aufgelöst in 2 ml 0,5% TFA und auf eine 19 mm x 30 cm C-18 Delta Pak Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 8% Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, aufgetragen. Ein Gradient von 8% bis 30% Acetonitril über 30 Minuten und ein 60% Gradient von Acetonitril über 20 Minuten bei einer Fließrate von 18 ml/Min. wurde verwendet. Der Säulenausfluß wurde in Polypropylen-Röhrchen in 0,2 Minuten Fraktionen gesammelt und bei 220 nm/2.2 AUFS überwacht. Die Fraktionen wurden mit einem Speed-Vac -Konzentrierer (Savant) konzentriert, lyophilisiert und bezüglich der Anti-Aggregationsaktivität mit menschlichen Blutplättchen getestet, wie vorstehend beschrieben. Figur 7 zeigt, daß die PAI-enthaltende Fraktion bei einer 24-25 % Acetonitril- Konzentration eluiert. Die Analyse von diesen aktiven Fraktionen unter Verwendung der HPLC mit einem Nachweis bei 220 nm zeigt eine symmetrische bioaktive Komponente, wie in Figur 8 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse von diesem Material zeigt ein Peptid von 71-72 Resten, einschließlich 12 Cysteinen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Ein Teil des gereinigten Peptids wurde reduziert und alkyliert mit Iodacetamid und gereinigt auf einer C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule. N-terminale Sequenzanalyse von diesem Material zeigt die folgende Aminosäuresequenz nach 23 Cyclen des Edman-Abbaus: Glu- Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys- Lys-Leu.
Die vollständige Aminosäuresequenz für dieses PAI, das "Tergeminin" genannt wurde, ist in Figur 6 gezeigt.
Das gereinigte Peptid wurde in dem Rezeptor-basierenden Tests, beschrieben in Beispiel 1, Abschnitt A, getestet. Konzentrationen des gereinigten Peptids von weniger als 100 nM inhibierten die Bindung von Fg und vWF an GP IIb-IIIa und von Vn und vWF an den Vitronectin-Rezeptor, wie in Figur 9 gezeigt.

Beispiel 4

Reinigung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitor von Sistrurus milarus barbouri Gift

200 mg von Sistrurus m. barbouri Gift (Miami Serpentanum Labs, Lot #SM135Z) wurden aufgelöst in 7,0 ml 0,5 M Essigsäure und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibriert und eluiert mit 0,5 M Essigsäure, aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 26 ml/h laufengelassen und 5 ml Fraktionen wurden gesammelt und analysiert bezüglich der Anti-Blutplättchen-Aggregationsaktivität, wie vorstehend beschrieben. Aktive Fraktionen (41-50) wurden vereinigt und lyophllisiert. Dieses Material wurde aufgelöst in 2,0 ml 0,5% TFA und auf eine präparative C-18 HPLC Säule geladen, wie in Beispiel 3 beschrieben, und eluiert unter Verwendung der gleichen Gradienten-Bedingungen. Zwei 10-Minuten-Fraktionen der Säule wurden gesammelt in Polypropylen-Röhrchen, konzentriert, lyophilisiert und analysiert bezüglich der Blutplättchen-Aggregations-inhibitorischen Aktivität.
Figur 10 zeigt das Aktivitätsprofil dieser HPLC-Säule. Die aktiven Fraktionen wurden der analytischen HPLC unterzogen, die mehrere Fraktionen (45-47) zeigten, die mehr als 90% homogen waren. Das Peptid der Fraktion 46 (150 µg) wurde bis zur Homogenität auf einer analytischen C-18 Säule gereinigt mit einer manuellen Sammlung des symmetrischen Peaks, wie in Figur 11 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse dieses Materials zeigte ein Peptid von 71-72 Aminosäuren, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Das gereinigte Peptid (150 µg) wurde aufgelöst in 300 µl Reaktionspuffer (6 M Guanidin- HCl; 0,25 M Tris -HCl, 20 mM EDTA, 20 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,5) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur, um das Peptid zu reduzieren. Danach folgte die Reaktion von 3 µl 4-Vinylpyridin (Aldrich) bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von 200 µl 1 % TFA und auf eine analytische C-18 HPLC-Säule geladen und mit einem Acetonitril-Gradienten in Wasser, enthaltend 0,1 % TFA, beginnend mit 8% Acetonitril und 25% Acetonitril über 20 Minuten und 60% Acetonitril über 10 Minuten eluiert.
Ein Teil dieses Pyridyl-ethylierten Materials wurde der N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, wie vorstehend beschrieben. Eine vollständige proteolytische Spaltung des reduzierten alkylierten Peptids wurde durchgeführt unter Verwendung der Endoproteinase Lys-C und der Endoproteinase Asp-N mit Peptid-Fragmenten isoliert, entweder auf einer C-3 oder einer C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule unter Verwendung einer Acetonitril-Wasser-TFA-Gradienten-Elution. Die Aminosäuresequenz des N-Terminus des intakten Peptids und der isolierten proteolytischen Fragmente wurde bestimmt wie beschrieben bei Yarden, Y. et al., Nature, 323, 1986, 226, unter Verwendung des automatischen Edman-Abbaus auf einem Gasphasen-Sequenzer.
Die vollständige Aminosäuresequenz dieses isolierten Peptids, das als "Barbourin" bezeichnet wurde, ist in Figur 6 zusammen mit den Sequenzen für die proteolytischen Fragmente gezeigt. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen von anderen Schlangengift- Adhäsionsinhibitoren ist in Figur 12 gezeigt.

Beispiel 5

Reinigung von PAI von Lachesis mutas Gift

99 mg von Lachesis mutas Gift (Miami Serpentanum Labs, Lot #LM15FZ) wurden aufgelöst in 2 ml 0,5 % Trifluoressigsäure und auf Eis gekühlt für 20 Minuten, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, gegeben. Ein Gradient von 5% bis 15% Acetonitril über 5 Minuten und nachfolgend ein Gradient von 30% über 35 Minuten (2%/Min.) gefolgt von einem Gradienten von 60% Acetonitril über 20 Minuten wurde über die Säule gegeben. Die Fließrate von 1,5 ml/Min. wurde aufrechterhalten und der Säulenausfluß wurde bei 220 nm/3.0 AUFS überwacht. Zwei-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, in einer Speed-Vac konzentriert und lyophilisiert. Die Fraktionen wurden untersucht auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation.
Figur 13 zeigt die aktiven Fraktionen, die bei 18% Acetonitril eluieren. Diese Fraktionen wurden erneut über eine C-18 Säule gegeben unter Verwendung eines flachen Gradienten, bestehend aus einem 40-minütigen Gradienten von 5-28% Acetonitril. Ein-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert, lyophilisiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 14 gezeigt. Diese aktiven Fraktionen wurden über eine analytische C-18 Säule gegeben und die eluierte zentrale Peak-Fraktion per Hand gesammelt. Das eluierte Material, das, wie in Figur 15 gezeigt, aus einem einzelnen symmetrischen Peak besteht, wurde der Aminosäure-Analyse unterzogen und zeigte ein Peptid von 72-73 Aminosäuren, enthaltend 12 Cysteine, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Die vollständige Aminosäuresequenz dieses PAIs, das "Lachesin" bezeichnet wurde, ist in Figur 6 gezeigt.

Beispiel 6

Reinigung von PAI von Crotalus viridis viridis Gift

47 mg von Crotalus viridis viridis Gift (Sigma Chemical Co., Lot #24F-0534) wurde aufgelöst in 1 ml 0,5% Trifluoressigsäure, auf Eis für 20 Minuten gekühlt, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, geladen. Ein Gradient von 5 % bis 15 % Acetonitril über 5 Minuten (2%/Min.), gefolgt von einem Gradienten von 15% bis 30% Acetonitril über 35 Minuten und nachfolgend von einem Gradienten von 60% Acetontritril über 60 Minuten wurde über die Säule gegeben. Eine Fließrate von 1,5 ml/Mm. wurde über den Gradienten aufrechterhalten und der Säulenausfluß wurde gesammelt in Polypropylen- Röhrchen in 2-Minuten-Fraktionen. Der Säulenausfluß wurde bei 220 nm/3 .0 AUFS überwacht. Die Fraktionen wurden konzentriert, lyophilisiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht.
Die aktiven Fraktionen, die in Figur 16 bei 18-19% Acetonitril gezeigt sind, wurden eine C-18 HPLC-Säule gegeben unter Verwendung eines Gradienten von 8 %-20% Acetonitril über 48 Minuten (0,25%/Min.).
Die Fraktionen wurden konzentriert und lyophilisiert und auf ihre Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden über eine C-18 Säule gegeben unter Verwendung von 8-16% Acetonitril über 10 Minuten, 16-20% Acetonitril über 15 Minuten und nachfolgend von 60% über 10 Minuten.
Der Ausfluß wurde bei 220 nm überwacht, wobei individuelle Peaks per Hand in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Die weitere Analyse des aktiven Peaks auf einer analytischen HPLC-Säule zeigte die in Figur 17 dargestellten Ergebnisse. Die Aminosäureanalyse dieses Peaks zeigte ein 72-73 Reste enthaltendes Peptid, enthaltend 12 Cysteine, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die vollständige Aminosäuresequenz von diesem PAI, das "Viridin" genannt wurde, ist in Figur 6 gezeigt und verglichen mit den anderen PAIs in Figur 12. Tabelle 2 Arninosäure-Zusammensetzung von gereinigten Peptiden

Beispiel 7

Vergleich von gereinigtem PAI mit Echistatin

Die Peptide Eristicophin und Barbourin, die wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben gereinigt wurden, wurden verglichen mit dem 49 Reste enthaltenden Peptid Echistatin bezüglich der Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa, wie in Beispiel 1, Abschnitt A, beschrieben. Figur 18 zeigt, daß diese gereinigten PAIs zwei- bis dreimal wirksamer in diesem Test sind als das Standard-Echistatin.
Die bis zur Homogenität gereinigten Peptide von Echis carinatus, Sistrurus m. barbouri und Eristicophis macmahoni Giften wurden mit Echistatin in dem ADP-stimulierten Blutplättchen-Aggregationstest verglichen. Ansteigende Konzentrationen von gereinigten Schlangengift-Peptiden wurden ohne vorherige Präinkubation mit den angegebenen Konzentrationen hinzugefugt (Figuren 19A, 19B und 19C). Schlangengift-Peptide von Eristicophis macmahoni und Sistrurus m. barbouri waren mindestens zweifach wirksamer als Echistatin bezüglich ihrer Fähigkeit, die beobachtet wurde fur die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa, wie vorstehend beschrieben.

Beispiel 8

Reinigung von PAI von Crotalus cerastes cerastes Gift

1 g von Crotalus c. cerastes Gift (Miami Serpentanum Labs, Lot #CE4SZ) wurde aufgelöst in 7 ml 0,5 M Essigsäure und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 100 cm), equilibriert und eluiert mit 0,5 M Essigsäure, aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots dieser Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität fur die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen (71-80) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2,0 ml 0,5% TFA. resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde dieses Material auf eine präparative C-18 Waters HPLC-Säule, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben, geladen und eluiert unter Anlegen der Gradienten-Elutionsbedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Fraktionen von der Säule wurden gesammelt in Polypropylen-Röhrchen, konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht. Figur 20 zeigt das Aktivitätsprofil von dieser HPLC-Fraktionierung.
Aktive Fraktionen mit inhibitorischer Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation wurden vereinigt und lyophilisiert und auf eine präparative C-18 HPLC-Säule gegeben, eluiert mit dem gleichen Gradienten. Fraktionenen wurden per Hand in Polypropylen-Röhrchen gesammelt und wiederum auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen wurden auf einer analytischen C-18-Säule analysiert unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen und homogene Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die analytische HPLC- Analyse von diesem Material ist in Figur 21 gezeigt.
Gereinigte Peptide wurden der Aminosäureanalyse unterzogen, die ein Peptid von 73-74 Aminosäuren zeigte, enthaltend 12 Cysteinreste, wie in Tabelle 3 gezeigt.
450 µg des gereinigten Peptids wurden in 750 µl Reaktionspuffer (6 M Guanidin-HCl, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 20 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,50) für 1,5 h bei Raumtermperatur aufgelöst, um das Peptid vollständig zu reduzieren. Danach folgte eine Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit einem Überschuß von Iodacetamid (Fluka. 16 mg). Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 500 µl 1 % TFA gestoppt und auf eine analytische C-18 HPLC-Säule geladen. Diese wurde mit einem Gradienten, von 8% bis 25 % Acetonitril über 20 Minuten, danach von 60% Acetonitril über 10 Minuten eluiert. Der UV-absorbierende Peak wurde per Hand in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt und getrocknet.
Ein Teil dieses Carboxyamido-methylierten Peptids wurde der N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen. Die vollständige proteolytische Spaltung des Carboxyamido-methylierten Peptids wurde durchgeführt unter Verwendung der Endoproteinase Lys-C und der Endoproteinase Asp-N. Peptid-Fragmente von diesen Verdauungen wurden entweder über eine C-3 oder eine C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule mit Acetonitril/Wasser/TFA Elutionsgradientenbedingungen isoliert. Die Aminosäuresequenz wurde bestimmt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die vollständige Aminosäuresequenz, die für "Cerastin" bestimmt wurde, ist in Figur 6 gezeigt. Diese ist mit den anderen PAI in Figur 12 verglichen. Tabelle 3 Aminosäure-Zusammensetzungen

Beispiel 9

Reinigung von PAI von Crotalus ruber ruber Gift

1 g von Crotalus ruber ruber Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #CF17SZ) wurde in 8 ml 0,5 molarer Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) aufgetragen, equilibriert bei Raumtemperatur und eluiert mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde laufengelassen mit einer Fließrate von 25 ml/h, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots von diesen Fraktionen wurden bezüglich ihrer inhibitorischen Aktivität fur die Blutplättchen-Aggregation, wie beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen (61-70) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5 % TFA resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt; Das Material wurde auf eine präparative C-18 Waters HPLC-Säule, wie beschrieben, aufgebracht und eluiert mit den Gradientenbedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben wurden. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, mit einem Speed-Vac-Konzentrierer konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität fur die Blutplättchen-Aggregation untersucht.
Figur 22 zeigt das Aktivitätsprofil fur diese HPLC-Fraktionierung. Einzelne aktive Fraktionen wurden lyophilisiert. Fraktionen 49 und 50 wurden vereinigt und auf eine analytische C-18 Umkehrphasen-Säule geladen und eluiert mit den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen, bestehend aus einem Acetonitril-Gradienten von 8% Acetonitril bis 25 % in 25 Minuten, gefolgt von 69% Acetonitril über 10 Minuten, um homogene Peptide zu erhalten, die als "Ruberin" bezeichnet wurden. Der automatische Edman-Abbau der Carboxyamido-methylierten Peptide gab die in Figur 6 gezeigte Sequenz.

Beispiel 10

Reinigung von PAI von Crotalus atrox

1 g von Crotalus atrox Gift (Miami Serpentanum Labs, Lot #CX16AZ) wurde aufgelöst in 10 ml 0,5 molarer Essigsäure und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) aufgebracht. Die Säule wurde equilibriert und bei Raumtemperatur mit 0,5 molarer Essigsäure laufengelassen. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität fur die Blutplättchen-Aggregation, wie vor stehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen (81-100) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5 % TFA aufgelöst und auf eine präparative C-18 HPLC-Säule aufgetragen und laufengelassen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, mit einem Speed-Vac -Konzentrierer konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität flir die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen wurden nochmals über eine analytische C-18-Säule gegeben, um homogene Peptide zu erhalten (Figur 23). Die Aminosäureanalyse dieses Materials zeigte, daß das Peptid 72 Aminosäuren enthält, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des isolierten Peptids, Crotatroxin, ist in Figur 6 gezeigt.

Beispiel 11

Reinigung von PAI von Bothrops cotiara

680 mg von Bothrops cotiara Gift (Miami Serpentanum Labs Lot #B05SZ) wurden in 10 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) geladen, die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen (71-90) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde resuspendiert in 2 ml 0,5% TFA und auf eine präparative C-18-Umkehrphasen-Säule (Waters) aufgebracht. Die Säule wurde eluiert unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, konzentriert mit einem Speed-Vac -Konzentrierer und auf ihre inhibitorische Aktivität flir die Blutplättchen- Aggregation getestet. Aktive Fraktionen wurden einzeln lyophilisiert. Mehrere Peak-Fraktionen wurden erneut über eine analytische C-18-Säule gegeben, wie in Beispiel 4 beschrieben. Das analytische HPLC-Profil des homogenen Peptids ist in Figur 24 gezeigt. Die Aminosäureanalyse dieses Materials zeigte, daß dieses Peptid 72 Aminosäuren enthält, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die vollständige Aminosäuresequenz dieses Peptids, das "Cotiarin" bezeichnet wurde, ist in Figuren 6 und 12 gezeigt.
Das gereinigte Peptid wurde in den in Beispiel 1 beschriebenen Rezeptor-Tests getestet. Die Anfangsbestimmungen zeigten, daß niedrige Konzentrationen von Cotiarin (1-4 nM) selektiv die Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor inhibieren, wohingegen die gleichen Konzentrationen signifikant niedrigere inhibitorische Aktivität hatten bezüglich der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa, wie in Figur 25 gezeigt. Jedoch konnten nachfolgende Experimente dieses Ergebnis nicht bestätigen.

Beispiel 12

Reinigung von PAI von Crotalus viridis lutosus

A. 1 g von Crotalus viridis lutosus Gift (Miami Serpentarium Labs Lot #CL18SZ) wurden in 8 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) aufgetragen, die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen und 5 ml-Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation getestet. Die Fraktionen 71-100 wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5% TFA resuspendiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde das Material auf eine präparative C-18-Umkehrphasen-Säule (Waters) aufgebracht und eluiert mit den Gradienten-Elutionsbedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben wurden. Die Fraktionen der Säule wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, konzentriert mit einem Speed-Vac - Konzentrierer und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation getestet. Aktive Fraktionen wurden in ihren jeweiligen Röhrchen lyophilisiert. Fraktionen mit Peak-Aktivität wurden erneut über eine analytische C-18-Säule (Waters) gegeben unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Acetonitril-Gradienten. Die Fraktionen wurden per Hand in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Homogene Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die analytische HPLC dieses Materials zeigte einen einzelnen symmetrischen Peak. Die vollständige analytische Aminosäuresequenz dieses Peptids, das "Lutosin" genannt wurde, ist in Figuren 6 und 12 gezeigt.
B. In gleicher Weise, wie im vorstehenden Abschnitt A beschrieben, wurden die PAIs von B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, C. v. oreganus, C. h. horridus, C. v. helleri, C. durissus totonactus und von C. m. molossus isoliert und gereinigt. Die Aminosäure-Zusammensetzungen für mehrere dieser Peptide sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der PAIs von C. h. horridus, C. basilicus, C. m. molossus, C. v. oreganus und C. d. durissus, die als Horridin, Basilicin, Molossin, Oreganin und Durissin bezeichnet wurden, sind in Figur 6 gezeigt. Die Rezeptor-Bindungsdaten für die gereinigten Peptide der Beispiele 1-12 sind in Figur 26 gezeigt.
In den nachstehenden Beispielen 13-16 wurden die Peptide durch Festphasen-Technik an einem Applied Biosystems 43 1A-Peptid-Synthesegerät synthetisiert unter Verwendung von t-Boc Aminosäuren, aktiviert als HOBt-aktivierte Ester gemäß den Angaben des Herstellers, die nachfolgend für die Herstellung von Boc-AA1.............. AA(n-1)-AA(n)-O- PAM-Polystyrolhart kurz zusammengefaßt sind.
1,5 mM von ausgewahlten Boc-AA(n)-O-PAM-Polystyrolharz wird fur den Einbau von Boc-AA(n-1)-OH gemäß dem folgenden Plan behandelt:
1) TFA-Abspaltung der Schutzgruppen: 30% TFA in DCM, 3 Minuten, 50% TFA in DCM, 16 Minuten.
2) Waschen und Neutralisieren: 5 x DCM-Waschen für je 3 Minuten, 2 Minuten 5 % DIEA in DCM, 2 Minuten 5 % DIEA in NMP, 6 x NMP-Waschen fur je 5 Minuten.
3) Kopplung: 4 Äquivalente Poc-AA-HOBt-Ester in NMP (voraktiviert 55 Minuten), 38 Minuten, DMSO, um 15% DMSO/85% NMP herzustellen, 16 Minuten, 3,8 Äquivalente DIEA, 5 Minuten.
4) Waschen und Harzen der Probe: 3 Minuten NMP-Waschen.
5) Versehen mit Schutzgruppen: 10% Essigsäureanhydrid, 5% DIEA in NMP, 8 Minuten.
6) Waschen: 6 x DCM-Waschen fur je 4 Minuten.

Beispiel 13

Herstellung des Analogon #1 [E²&sup8;L&sup4;¹C&sup6;&sup4;] Barbourin (28-73):

E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V- A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G
1,5 mM von PAM-Gly-Harz (0,6 meqi/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden Verfahren A unterzogen mit den erforderlichen Aminosäuren (in der entsprechenden Reihenfolge eingefuhrt). Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten Schutzgruppen: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lyse(Cl-Z), Thr(OBzl), Trp(CHO) und Tyr(Br-Z). Nach dem Zusammenbau der vollständigen geschützten Peptid-Harzkette wurde die Amino-terminale Boc-Gruppe mit TFA entfernt und das Harz als TFA-Salz getrocknet. 1,3 g des Harzes wurden dem "low-high"-HF-Verfahren zum Abspalten der Schuztgruppen" unterzogen, gefolgt durch das Entfernen von HF unter vermindertem Druck. Das getrocknete Peptid-Harzgemisch wurde auf einen Frittentrichter (grob) mit Ethylether transferriert und mehrmals abwechselnd gewaschen mit Ether und Chloroform, um die organischen Schutzgruppen und Überreste der Abspaltung der Schutzgruppen zu entfernen.
Das Peptidgemisch wurde in 2 l 0,4% Essigsäure eingebracht und der pH-Wert wurde mit konzentrierter NH&sub4;OH auf 7,99 eingestellt. Das Harz wurde aus dieser Lösung flitriert und die Lösung wurde für 20 Stunden ohne Rühren bei 4ºC stehengelassen. Danach wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und erneut 3 Tage ohne Rühren stehengelassen. Das abgesetzte Material wurde durch Filtration entfernt und der Überstand wurde mit Essigsäure auf den pH-Wert von 3,0 gebracht und lyophilisiert.
Das rohe Material wurde in 8,0 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex G- 50 Säule (2,5 x 100 cm) aufgebracht, die mit 0,5 M Essigsäure equilibriert worden ist. Die Säule wurde mit 20 ml/h laufengelassen und 4 ml-Fraktionen wurden in Polypropylen- Röhrchen gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden getrocknet, in Wasser resuspendiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die aktiven Fraktionen (71-90) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Das getrocknete Material (66 mg) wurde in 2,0 ml 0,1 M Essigsäure aufgelöst und auf eine präparative C-18 Säule (Waters) aufgebracht, die mit 8% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, equilibriert worden war. Ein Gradient von 8% Acetonitril bis 20% über 10 Minuten, gefolgt von einem langsamen Gradienten bis zu 30% Acetonitril über 40 Minuten wurde durchgeführt. Die Säule wurde mit 18 mi/Min,. eluiert und 12 Sekunden-Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt. Die Fraktionen wurden auf einem Speed-Vac- Konzentrierer auf 1,0 ml Volumen konzentriert und 10 µl Aliquots wurden in dem Blutplättchen-Aggregationstest getestet.
Aktive Fraktionen (29-32) wurden einzeln lyophilisiert und auf einer analytischen C-18 HPLC-Säule mit einem 8-30% Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Fraktionen 29 und 30 wurden vereinigt und auf eine analytische Säule mit 1 ml 0,5 % TFA aufgetragen. Der größte Peak wurde manuell gesammelt und lyophilisiert, um 1,6 mg eines reinen Peptids zu erhalten. Die Aminosäureanalyse dieses Materials bestätigt die Identität des Peptids. Der Test dieses Materials auf die Fähigkeit, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und Vitronectin an VnR zu inhibieren, ist in den Figuren 26 und 27 gezeigt. Diese Daten zeigen die hohe Affinität dieses Analogons für GP IIb-IIIa und das relative Fehlen der Affinität für VnR bei Konzentrationen bis zu 1 µM.

Beispiel 14

Herstellung des Analogons #2, [K²&sup9;] Eristicophin (4-51): E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R- V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

1,5 mM vonPAM-Gly-Harz (0,6 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden dem Verfahren mit den erforderlichen Aminosäuren unterzogen (eingeführt in der entsprechenden Reihenfolge). Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(O-cHex), Lys(Cl-Z), Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(CHO) und Tyr(Br-Z). Die Spaltung, Zurückfaltung und Reinigung dieses Peptids wurde wie in den vorstehenden Beispielen durchgeführt. Die Rezeptor- Bindungsdaten dieses Analogons sind in den Figuren 26 und 28 gezeigt.

Beispiel 15

Herstellung des Analogons #3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;

1,5 mM von pMBHA-Harz (0,72 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden dem Verfahren A mit den erforderlichen Aminosäuren (eingeführt in der entsprechenden Reihenfolge) unterzogen. Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen: Asp(O-cHex), Cys(4-MeBzl) und Lys(Cl-Z). Nach dem vollständigen Zusammenbau des geschützten Peptidharzes wurde die Amino-terminale Boc-Gruppe mit TFA entfernt und das Harz als TFA-Salz getrocknet. 1,54 g des Harzes wurden mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF), enthaltend 10% Anisol, 2% Ethylmethylsulfid, für 30 Minuten bei -10ºC und weiteren 30 Minuten bei 0ºC behandelt. Das HF wurde unter reduziertem Druck entfernt und das Peptid/Harzgemisch wurde in Diethylether suspendiert, gefolgt von abwechselnden Waschungen mit Chloroform und 3X Ether. Nach einem letzten Ether-Waschschritt wurde das Peptid von dem Harz mit 2,0 M Essigsäure extrahiert, mit destilliertem Wasser verdünnt und lyophilisiert.
370 mg des rohen Peptids wurden in deoxygenierten 10 mM NH&sub4;OAc, pH 8, aufgelöst zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml und durch tropfenweise Zugabe eines leichten Überschusses von 0,01 M Kaliumferricyanid (K&sub3;Fe(CN)&sub6;)-Lösung oxidiert, für weitere 20 Minuten gerührt und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 5 gebracht. Die Peptidlösung wurde mit DOWEX AG3x4 Anionenaustauscherharz für 15 Minuten unter Rühren behandelt, das Harz wurde filtriert, mit H&sub2;O verdünnt und lyophilisiert, um das rohe cyclisierte Peptid zu erhalten. Das rohe cyclisierte Peptid (392 mg) wurde durch entsalzen auf einer Sephadex G-25F-Säule unter Verwendung von 0,5 M Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt. Danach wurde eine Ionenaustauscherchromatographie an einer CM-Sepharose (Pharmacia)-Säule unter Verwendung eines Elutionsgradienten, erzeugt durch die Zugabe von 100 mM Ammonium OAC zu einer Lösung von 10 mM Ammonium OAC, pH 4,5, gereirügt. Die Fraktionen, die eine Mindestreinheit von 90% bei der HPLC-Analyse hatten, wurden vereinigt und das Wasser durch mehrmaliges lyophilisieren entfernt, um 175 mg zu erhalten. Die letzte Reinigung bestand aus einer präparativen HPLC-Reinigung auf einer C- 18-Umkehrphasen-Säule (Waters) mit einem Acetonitril/Wasser/TFA-Gradienten, um ein gereinigtes Peptid zu erhalten. Die Rezeptor-Bindungsdaten für dieses Analogon sind in den Figuren 26, 29B und 30 gezeigt.

Beispiel 16

Herstellung von zusätzlichen Analga

Die folgenden Analoga wurden in den meisten Fällen in gleicher Weise synthetisiert, wie in Beispiel 15 vorstehend beschrieben.
Jedoch wurde das nachfolgend gezeigt Analogon 60 in einer Lösung hergestellt über eine Guanidierung der Seitenkette des Lysinrestes des Analogons #19 unter Verwendung des Verfahrens von Bajusz, S., et al., FEBS Letts., 110,1980, 85-87.
1 mg des Analogons #19 wurde umgesetzt mit 1 mg von 1-Amidino-3,5-dimethylpyrazolnitrat (Aldrich) in 1 ml absolutem Ethanol in Gegenwart von Dusopropylethylamin (DIEA) bei Raumtemperatur für 4 Tage. Das resultierende Analogon 60 wurde von überschüssigen Reagenzien und Startmaterialien durch Umkehrphasen-HPLC an einer C-18-Säule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure gereinigt. 900 µg dieses Materials wurden in gereinigter Form isoliert.
#4 G-C-K-G-D-W-P--C-A-NH&sub2;
#5 C-G-K-G-D-W-F-C-NH&sub2;
#6 G-C-G-K-G-D-W-C-A-NH&sub2;
#7 G-C-K-G-D-W-C-A-NH&sub2;
#8 Acetyl-C-K-G-D-C-NH&sub2;
#9 Mpr-K-G-D-Pen-NH&sub2;
#10 C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#11 Acetyl-C-R-G-D-Pen-NH&sub2;
#12 C-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;
#13 C-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;
#19 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#34 C-K-G-D-W-G-C-NH&sub2;
#35 C-K-G-E-W-P-C-NH&sub2;
#36 C-Orn-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#37: C-K-A-D-W-P-C-NH&sub2;
*38: C-K-A -D-W-P-C-NH&sub2;
#39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH&sub2;
#40: C-K( Formyl)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#41: C-K-G-D-I-P-C-NH&sub2;
#42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH&sub2;
#43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH&sub2;
#44: C-K-G-D-(4-NO&sub2;-Phe)-P-C-NH&sub2;
#45: C-K-G-D-(NmePhe)-P-C-NH&sub2;
#46: C-H-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#48: Mpr-K-G-D-W( Formyl)-P-C-NH&sub2;
#49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#50: Mpr-K-G-D-W -P-Pen-NH&sub2;
#51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
*52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen -NH&sub2;
#53: Mpr-K-G-D-W-P -Pen-NH&sub2;
#54: Mpr-K-G-D -W-P-Pen-NH&sub2;
#55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH&sub2;
#56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH&sub2;
#57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH&sub2;
#58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH&sub2;
#60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#61: Mpr-K-G-D-W-P-C -NH&sub2;
#62: Mpr-(D-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#64: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#66: Mpr-(NG,NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#67: Mpr-(NG,NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH&sub2;
#69: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;
#70: Mpr-(Phenylimidyl-Lys) =-G-D-W-P-C-NH&sub2;
#71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH&sub2;
#72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-PenNH&sub2;
#73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro P)-C-NH&sub2;

Beispiel 17

PAI-Aktivität der Peptide

In den vorstehend beschriebenen Standard-Aggregationsinhibierungstests zeigten die Analoga #3-5 IC&sub5;&sub0;-Werte von 5 µM bezüglich ihrer Fähigkeit, die ADP-induzierte Aggregation menschlicher Blutplättchen zu inhibieren. Jedoch hatte das Analogon #6 einen IC&sub5;&sub0; von mehr als 200 µM und das Analogon #7 zeigte einen Wert von 100 µM. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für die erfindungsgemäßen Analoga in diesem Test sind wie folgt:

Beispiel 18

Aktivität der linearen Peptide im Vergleich zu cvclischen Peptiden

Bei dem Test auf die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa im Plattentest zeigte das lineare RGDW-NH&sub2; eine sehr ähnliche Aktivität wie das cyclische Peptid GCGRGDWPCA-NH&sub2; (Figur 29A). Im Gegensatz dazu zeigte das lineare Peptid KGDW- NH&sub2; eine sehr viel niedrigere Aktivität als das cyclische Peptid GCGKGDWPCA-NH&sub2; (Figur 29B). Bei den KGDW-Verbindungen zeigte sich im Gegensatz zu den RGDW- Verbindungen durch die Cyclisierung ein auffallender Anstieg der Fähigkeit des Peptids, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren.

Beispiel 19

Ergebnisse der Platten-Bindungstests für synthetische Peptide

Die in Beispiel 17 synthetisierten Peptide wurden zusätzlich zu dem Test bezüglich der Fähigkeit, die Blutplättchen-Aggregation direkt zu inhibieren, in den erfindungsgemäßen Plattentests, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die Ergebnisse für die Analoga 4 bis 8 sind in den Figuren 30C, 30D, 30E, 30A und 30B gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt, waren diese Analoga unterschiedlich in ihrer Fähigkeit, die Bindung von Fibrinogen an GP IIB-IIIA zu inhibieren, verglichen mit der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an den Vitronectin-Rezeptor. Das Analogon #4 zeigte in der Gruppe die größten Unterschiede. Die Analoga #7 und #5 auf der anderen Seite waren ebenfalls sehr spezifisch und hatten ausgezeichnete inhibitorische Aktivitäten für die Blutplättchen-Aggregation.

Beispiel 20

Wirkungen der gereinigten Peptide auf die Zell-Adhäsion

M21 Melanoma-Zellen wurden mit ³&sup5;S-Methionin markiert und dann auf Vitronecvinbeschichtete Platten in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von gereinigten Schlangengift-Peptiden gegeben. Die Zellbindung wurde gemessen durch Lösen der Zellen, die nach einer Inkubation und Waschung, wie in Abschnitt C auf Seite 40 beschrieben, zurückgeblieben waren. Wie in Figur 31 gezeigt, hatte weder Barbourin noch Peptid 1 (gekürztes Barbourin) einen signifikanten Effekt auf die Zell-Adhäsion an Vitronectin, obgleich beide starke Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation waren, wie in den Beispielen 2 und 3 gezeigt. Im Gegensatz dazu war Cotiarin, das ein starker Inhibitor der Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor ist, sehr wirksam in der Inhibierung der Zellbindung an Vitronectin. In einem ähnlichen Experiment wurden Peptid #3, Peptid #3, bei dem K ersetzt war durch R (GCGRGDWPCA-NH&sub2;) und RGDS, untersucht auf M21 Zellbindung an Vitronectin. Wie in Figur 32 gezeigt, sind RGDS und GCGRGDWPCA- NH&sub2; starke Inhibitoren der Zellbindung, wohingegen GCGKGDWPCA-NH&sub2; bis zu einer Konzentration von 60 µM unwirksam war.

Beispiel 21

Vergleich der Analoga 60 und 19

Die vorstehend beschriebenen Analoga 60 und 19 sind erfindungsgemäße Peptide, die die Sequenz K*GDX enthalten und mit Ausnahme der Ausfiihrungsform des K* identisch sind.
Das Analogon 60 hat die folgende Formel:
Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;.
Das Analogon 19 hat die folgende Formel:
Mpr-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;.
Diese Analoga wurden in Standard-Blutplättchen-Aggregationinhibierungstests und unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Zell-Adhäsionstests getestet. Die Ergebnisse sind in den Figuren 33 und 34 gezeigt. Wie in Figur 33 gezeigt, ist das Analogon #60 bei verschwindend kleinen Konzentrationen zur Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation wirksam und ist relativ weniger wirksam bei der Verhinderung der Zell-Adhäsion an Vitronectin. Figur 34 zeigt die gute inhibitorische Aktivität der Blutplättchen-Aggregation und die Spezifität des Analogons #19. Jedoch ist es weniger aktiv in dem Test auf Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation, als das Analogon #60. Das Analogon #60 zeigt einen IC&sub5;&sub0;-Wert bei der Blutplättchen-Aggregation von etwa 0,15 µM. Das Analogon #19 zeigt einen IC&sub5;&sub0;-Wert von etwa 1 µM.

Beispiel 22

Folts Modell der Thrombose in der Koronararterie des Hundes

A. Initiierung der zyklischen Flußreduktionen (CFRs) in einem Hund mit offenem Thorax

Ein Verschluß wurde auf der linken vorderen absteigenden Koronarartene eines 20 kg Hundes wie vorstehend beschrieben plaziert. Die phasischen und mittleren Blutflüsse, gemessen durch eine elektromagnetische (EM) Flußprobe und eine Doppler-Flußprobe sind in Figur 35 gezeigt.

B. Wirkung des zyklischen Peptids GCGKGDWPCA-NH&sub2; (Analogon #3) auf die CFRs in dem offenen Thorax-Hund.

Eine Dosis von 10 mg dieses Peptids wurde in eine periphere Vene im Hund gegeben. In Figur 36 sind die Blutflußmuster in der LAD wie vorstehend beschrieben gezeigt. Man beachte das partielle Ableiten der CFRs, wie durch das absteigende Gefälle der Flußreduzierungen dargestellt. Man beachte ebenfalls, daß der Fluß nicht genauso stark reduziert ist, wie in der Kontrolle (A).
C. Eine zweite Infusion von 40 mg des Analogons #3 wurde in eine periphere Vene gegeben. Wie in Figur 37 gezeigt, deutet die vollständige Ableitung der CFRs an, daß der vollständige Fluß in der LAD wiederhergestellt ist.

Beispiel 23

Konstruktion von Expressionsvektoren für Barbourin-Peptide

Ein Gen, das die volle Länge des [L&sup4;¹] Barbourin-Peptids (1-73) codiert, wurde zusammengebaut aus synthetischen Oligonudeotiden, wie in Figur 38 gezeigt, die durch Kinasebehandlung phosphoryliert wurden, annealed und ligiert wurden in Eco-RI-HindIII-gespaltenen M13mp18 unter Verwendung von Standard-Verfahren. Die Signalsequenz (Watson, M.E.E., Nucleic Acids Research, 12, 1984, 5145) des bakteriellen alkalischen Phosphatase-Gens (phoA) wurde zu dem Barbourin-Konstrukt hinzugefügt durch Ligation synthetischer Oligonudeotide in die EcoRI/NcoI-Stellen des [L&sup4;¹] Barbourin (1-73) Konstrukts, wie in Figur 39 gezeigt. Die Nucleotidsequenzen aller Konstrukte wurden durch das Dideoxy-Kettenterminations-Verfahren von Sanger überprüft.
Eine gekürzte Version dieses Peptids wurde ebenfalls konstruiert von synthetischen Oligonucleotiden, die nur Aminosäuren 28-73 des Vollängen-Moleküls codieren würden. Zwei Änderungen, Q²&sup8; zu E²&sup8; und A&sup6;&sup4; zu C&sup6;&sup4;, wurden eingefügt unter Verwendung der site directed mutagenesis, wie bei Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, 1987, 367, beschrieben. Die phoA-Signalsequenz wurde zu der gekürzten Version hinzugefügt, wie vorstehend beschrieben (figur 40). Zusätzlich wurde die Signalsequenz für das E. Coli hitzestabile Enterotoxin II (Picken, R.W. et al., Infect. Immun., 42, 1983, 269) zur gekürzten Version hinzugegeben unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden mit EcoRI und NcoI kompatiblen Enden. Alle bakteriellen Sekretionskonstrukte wurden subkloniert in den bakteriellen Expressionsvektor pPROK-1 (Brosius, J., Gene, 27, 1984, 151, 161), erhältlich von CLONTECH Lab, Inc. unter Verwendung von EcoRI und HindIII Restriktionsendonucleasen.
Ein Gen, das Tandem-Repeats des gewünschten Peptids codiert, wurde hergestellt unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktin (PCR), um die mulitmere Einheit des Vollängen-Barbourin-Peptids 1-73, enthaltend L41 und C64, herzustellen.
Die Figuren 41A und 41B zeigen die für die PCR-Synthese verwendeten Oligonudeotide. Die PCR-Reaktion wurde durchgeflihrt gemäß dem Verfahren von Saiki, R.K. et al., Science, 239, 1988, 487. Die resultierende Polymer-Verbindung enthält Methionine an jedem Ende der Sequenz, wie in Figur 42 gezeigt, und stellt die gewünschten Restriktionsstellen für das Konstrukt bereit.
Die Tandem-Repeats werden gebildet von individuellen Multimer-bildenden Verbindungen, z.B. durch Ligation eines EcoRI/BamHI-Fragments an ein BglII/HindIII-Fragment in eine M13mp18-Vektorschnittstelle mit EcoRI/HindIII, um ein Dimer zu bilden. Das resultierende Dimer wird mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten und in ein BglII/HindIII-Fragment ligiert, um ein Trimer zu bilden usw., bis die gewünschte Größe erhalten wird. Diese Konstruktion ist in den Figuren 43A und 43B gezeigt.
Das Multimer wurde dann in den E. coli-Vektor pKK233-2 (Amann, E. et al., Ge3ne, 40, 1985, 183, erhältlich von Clontech) ligiert durch Verdau des Vektors mit NcoI/HindIII und Ligation eines Monomer-Subfragments von NcoI/BamHI und eines Multimer-Subfragments von BglII/HindIII.
Für die Expression eines Fusionsproteins wurde der vorstehend verdaute Vektor zusammen mit einem NcoI-EcoRI-Subfragments, enthaltend einen leicht modifizierten Amino-terminalen Teil (Aminosäuren 1-72) des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens (Chang, C.N. et al., Gene, 55, 1987, 189) und EcoRI-HindIII-Subfragmente der multimeren Konstruktionen verwendet.

Beispiel 24

Expression der rekombinanten Gene

Die Proteinexpression von allen rekombinanten Plasmiden, die vorstehend beschrieben sind, wird induziert gemäß Kanaman et al., Gene, 66, 1988, 295, nach Transfektion in geeignete E. coli-Wirtsstämme. Die Produkte werden charakterisiert durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese und durch ihre Fähigkeit, die ADP-induzierte Blutplättchen-Aggregation in Blutplättchen-reichem Plasma zu inhibieren. Nach der Reinigung werden die multimeren Proteine in die monomeren Einheiten umgewandelt durch Cyanobromid-Spaltung und die Produkte wurden, wie vorstehend beschrieben, getestet.

Claims

1. Ein Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid (PAI) oder eine modifizierte und/oder gekürzte Form davon, fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung mindestens zweifach größer ist für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI, oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg- oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindungsinhibierung, als für die Bindungsinhibierung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor.

2. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid oder eine modifizierte und/oder gekürzte Form hiervon gemäß Anspruch 1, erhältlich von Schlangengift mit der Maßgabe, daß das Schlangengift nicht von Echis carinatus, Trimeresurus gramineus, T. flavoviridis, T elegans, T albolabris, Bitis arietans, Bothrops atrox, Agkistrodon halys, Agkistrodon p. piscivorus, oder Agkistrodon rhodostoma ist.

3. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, erhältlich von Schlangengift, ausgewählt aus den Giften von Echis colorata, Eristicophis macmahonii (eristicophin), A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorus conanti, Bothrops asper, Bothrops cotiara (cotiarin), B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, D. schlegi, Crotalus atrox (crotatroxin), C. basilicus (basilicin), C. cerastes cerastes (cerastin), C. durissus durissus) C. durissus totonatacus, C. horridus horridus (horridin), C. molossus molossus (molossin), C. ruber ruber (ruberin), C. viridis cereberus, Crotalus viridis hellen, Crotalus viridis lutosus (lutosin), Crotalus viridis oreganus (oreganin), Crotalus viridis viridis (viridin), Lachesis mutas (lachesin), Sistrurus catenatus tergeminus (tergemin) oder Sistrurus milarus barbouri (barbourin).

4. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Polypeptid aus dem Schlangengift isoliert und gereinigt worden ist durch einen Prozeß, der die Schritte umfaßt:

Aufbringen des Giftes auf eine Säule zur Größenfraktionierung, um eine Lösung mit Komponenten eines Molekulargewichts < 10kd zu erhalten, gefolgt von Unterwerfung der Fraktion der Umkehrphasen-HPLC und Erhalten einer Vielzahl von Fraktionen und Wiedergewinnen der Fraktionen, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa inhibieren.

5. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die < 10kd Fraktion erhalten wird durch Unterwerfung des Giftes einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines Größengels und Eluierung einer Vielzahl von Fraktionen und Isolierung der Fraktionen, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa inhibieren.

6. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Blutplättchen-Aggregationsinhibitor als eine Blutplättchen-Aggregationsinhibitorsequenz die Aminosäuresequenz Lys-Gly-Asp oder Lys-Sar-Asp (-K-G-D oder K-Sar-D-) enthält.

7. Blutplättchen-Aggregatsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 6,umfassend ein Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:

E-A-G-E-E-C-D-C-G-S-P-E-N-P-C-C-D-A-A-T-C-K-L-R- P-G-A-Q-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-M-L-L-G-T-V-C- R-V-A-L-G-D-W-M-D-D-T-C-T-G-Q-S-A-D-C-P-R-N-G- L-Y-G

oder eine modifizierte und/oder gekürzte Form hiervon.

8. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid,fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung mindestens 2-fach größer ist für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI, oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg- oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindungsinhibierung, als für die Bindungsinhibierung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei der Blutplättchen- Aggregationsinhibitor die Aminosäuresequenz K* (Sar/G) D umfaßt, wobei K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel ist,

wobei jeder R¹-Rest unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist oder höchstens ein R¹ ist R²-C=NR³,

wobei R ein Wasserstoffatom, C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest substituiert mit einem Alkyl- oder einem Phenylrest ist oder R² ist NR&sup4;&sub2;, wobei jeder Rest R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist und

R³ ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest oder ein Phenyl- oder ein Benzylrest ist oder R² -C=NR³ ein Rest ist ausgewählt aus:

wobei m eine ganze Zahl von 2-3 ist und jeder Rest R&sup5; ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest und wobei ein oder zwei CH&sub2;- Reste ersetzt sind durch O oder S, mit der Maßgabe, daß O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom ist und wobei die Aminosäuresequenz K* (Sar/G)D in einem zyklischen Peptid von mindestens 8 Aminosäureresten enthalten ist.

9. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 8, welches die Primärstruktur von natürlicherweise vorkommendem Blutplättchen-Aggregationsinhibitor, vorhanden in Schlangengift, hat, enthaltend die Aminosäuresequenz RGD oder KGD oder eine gekürzte und/oder modifizierte Form hiervon, wobei der Rest R in der Aminosäuresequenz RGD, vorkommend in dem Blutplättchen-Aggregationsinhibitor oder in einer gekürzten und/oder modifizierten Form hiervon, ersetzt ist durch K* oder wobei der Rest K in der Aminosäuresequenz KGD, vorkommend in dem Blutplättchen-Aggregationsinhibitor oder in einer gekürzten und/oder modifizierten Form hiervon, ersetzt ist durch eine Ausfiihrungsform von K*, die nicht K ist.

10. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid, fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung mindestens 2-fach größer ist für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg- oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindungsinhibierung, als für die Bindungsinhibierung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibroncetin an Fibronectin-Rezeptor, wobei der Blutplättchen- Aggregationsinhibitor die allgemeine Formel hat,

worin K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel ist,

worin jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist oder höchstens ein Rest R¹ ist R²-C=NR,

worin R² ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest, substituiert mit einem Alkyl- oder einem Phenylrest oder NR&sup4;&sub2; ist,

wobei jeder Rest R unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist und R³ ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest ist oder R²-C=NR³ ein Rest ist ausgewählt aus:

wobei m eine ganze Zahl von 2-3 ist und jeder Rest R&sup5; ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest,

und worin ein oder zwei CH&sub2;-Reste ersetzt sein können durch O oder S, vorbehaltlich, daß O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom ist;

AA&sub1; ein neutraler, polarer oder nicht polarer Aminosäurerest ist, enthaltend 1-4 Kohlenstoffatome und n1 ist 0 oder eine ganze Zahl von 1-3,

AA&sub2; ein neutraler, nicht polarer, großer aromatischer oder nicht aromatischer oder ein polararomatischer Aminosäurerest ist und n2 ist 0 oder eine ganze Zahl von 1-3,

AA&sub3; ein Prolinrest oder ein modifizierter Prolinrest der allgemeinen Formel ist

wobei ein oder zwei der Methylengruppen ersetzt sein können durch NR, S oder O und wobei irgendein Stickstoffatom des Rings gegebenenfalls ersetzt sein kann mit einem nicht-interferierenden Substituenten und R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist und n3 0 oder 1 ist;

AA&sub4; ein neutraler Aminosäurerest, enthaltend 1-4 Kohlenstoffatome oder die N-alkylierte Form hiervon ist und n4 0 oder eine ganze Zahl von 1-3 ist, jeder Rest X&sub1; und X&sub2; unabhängig ein Rest ist, fähig zur Bildung einer Bindung zwischen X&sub1; und X&sub2;, um eine zyklische Komponente wie gezeigt zu bilden und

jeder Rest Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig ein nicht-interferierender Substituent ist oder abwesend ist, wobei ein oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls ersetzt sein können durch einen alternativ bindenden Rest ausgewählt aus CH&sub2;NH-, CH&sub2;S-, CH&sub2;CH&sub2;-, CH=CH- (cis oder trans), COCH&sub2;-, CH(OH)CH&sub2;- oder CH&sub2;SO-Resten mit der Maßgabe, daß, wenn n 0 ist entweder

1) die Summe von n2 und n4 mindestens 2 sein muß; oder

2) K* anders ist als Har (Homoarginin) oder K (Lysin); oder

3) einer oder mehrere Peptidbindungen ersetzt ist (sind) durch alternative Bindungsrest (e).

11. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 10, worin Y&sub1; ein Wasserstoffatom, ein Acylrest oder ein Peptidrest oder eine derivatisierte Form hiervon ist oder fehlt und Y&sub2; ein OH-, NH&sub2;-Rest oder ein Peptidrest oder eine derivatisierte Form hiervon ist oder fehlt.

12. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 11, worin Y&sub2; ein NH&sub2;-, A-NH&sub2;-Rest ist oder fehlt.

13. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 11, worin Y&sub1; ein Wasserstoffatom, ein Acetylrest, Glycin (G) ist oder fehlt.

14. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 10, worin X&sub1; und X&sub2; Cystein- (C), Mercaptopropionyl- (Mpr) oder Penicillarnin- (Pen) Reste sind.

15. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 10, worin AA&sub1; ein Glycin (G) ist und n&sub1; 0 oder 1 ist.

16. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 10, worin AA&sub2; ausgewählt ist aus einem Tryptophan- (W), Phenylalanin- (F), Leucin- (L), Tyrosin- (Y) oder Valin- (V) Rest.

17. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 16, worin AA&sub2; ein Tryptophanrest (W) ist.

18. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 10, worin K* ein Lysin- (K), Homoarginin- (Har), Acetimidyl-Lys- oder Phenylimidyl-Lys- Rest ist.

19. Ein Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid ausgewählt aus:

PAI 1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-LL-L-G-T-V-C-R-V-A-K- G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G

PAI 2: E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V- A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH&sub2;;

PAI 4: G-C-K-G-D-W-p-C-A-NH&sub2;

PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 7: C-K-G-D-W-C-A-NH&sub2;

PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;

PAI 13: C-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;

PAI 14: C-K-G-D-L-P-C-NH&sub2;

PAI 15: C-K-G-D-V-P-C-NH&sub2;

PAI 16: C-K-G-D-Y(Ome)-P-C-NH&sub2;

PAI 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH&sub2;

PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C-NH&sub2;

PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C-NH&sub2;

PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C-NH&sub2;

PAI 22: Mpr-K-G-D-L-P-C-NH&sub2;

PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C-NH&sub2;

PAI 24: Mpr-K-G-D-Y(OME)-P-C-NH&sub2;

PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH&sub2;

PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C-NH&sub2;

PAI 27: cyclo(G-K-G-D-W-P)

PAI 28: cyclo(A-K-G-D-W-P)

PAI 29: cyclo(A -KG-D-W-P)

PAI 30: cyclo(F-K-G-D-W-P)

PAI 31: cyclo(beta-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 32: cyclo(gamma-Abu-K-G-D-W-P)

PAI 33: cyclo(R-K-G-D-W-P)

PAI 34: C-K-G-D-W-G-C-NH&sub2;

PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH&sub2;

PAI 41: C-K-G-D-I-P-C-NH&sub2;

PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH&sub2;

PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 44: C-K-G-D-(4-NO&sub2;-Phe)-P-C-NH&sub2;

PAI 47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formyl)-P-C-NH&sub2;

PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen -NH&sub2;

PAI 54: Mpr-K-G-D -W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH&sub2;

PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Na[)-P-Pen-NH&sub2;

PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH&sub2;

PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C -NH&sub2;

PAI 62: Mpr-K -G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 64: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 66: Mpr (NG, NG'-ethylene-Har)-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 67: Mpr (NG, NG'-ethylene-Har)-GD-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 69: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH&sub2;

PAI 70: Mpr-(Phenyiimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH&sub2;

PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH&sub2;

PAI 72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-PenNH&sub2;

PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH&sub2; or

PAI 75: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-Pen-NH&sub2;.

20. Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa, als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von-Willebrand-Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa mindestens 2- fach größer ist, als die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg oder vWF/GP IIb-IIIa Bindungsinhibierung, als für die Bindungsinhibierung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, und wenn das Polypeptid identisch zu einem natürlichen Schlangengift-Polypeptid ist, das Polypeptid gereinigt ist.

21. Polypeptid nach Anspruch 20 umfassend eine Blutplättchen-Adhäsionssequenz der allgemeinen Formel X-Gly-Asp, worin X ein Lysinrest oder ein an der Epsilon Aminogruppe substituierter Lysinrest ist.

22. Polypeptid nach Anspruch 21, worin die Blutplättchen-Adhäsionssequenz die Formel hat Lys-Gly-Asp-Trp oder ein Derivat dieser Aminosäuresequenz anders als Arg-Gly-Asp- Trp.

23. Polypeptid nach Anspruch 21, worin die Blutplättchen-Adhäsionssequenz die Formel Lys-Gly-Asp hat.

24. Polypeptid nach Anspruch 20, worin das Polypeptid eine Sequenz umfaßt:

Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys- Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cus-Ala-Asp-Gly- Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Met-Lys-Lys-Gly-Thr-Val-Cys-Art- Val-Ala-Lys-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Thr-Cys-Thr-Gly-Gln-Ser-Ala- Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Gly-Leu-Tyr-Gly.

25. Polypeptid nach Anspruch 20, worin das Polypeptid ein Molekulargewicht geringer als 10kd hat.

26. Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid weniger als 10 Aminosäuren enthält.

27. Polypeptid nach Anspruch 25, worin das Polypeptid natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt.

28. Eine DNA, die ein Polypeptid des Anspruchs 27 codiert.

29. Ein rekombinantes Expressionssystem, fähig zur Expression der DNA nach Anspruch 28, wenn in einen kompatiblen Wirt eingeführt.

30. Ein Wirt, transformiert mit dem Expressionsystem nach Anspruch 29.

31. Verfahren zur Herstellung eines Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids nach Anspruch 27, umfassend:

Kultivierung des transformierten Wirts nach Anspruch 30 unter wirksamen Bedingungen zur Expression der Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-codierenden DNA zum Erzeugen des Blutplättchen-Aggregationsinhibitor Polypeptids und Gewinnung des Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids aus der Kultur.

32. Ein rekombinantes Expressionssystem, fähig, wenn eingeführt in einen kompatiblen Wirt, zur Expression einer DNA, codierend ein Blutplättchen-Aggregationsinhibitor Polypeptid fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor oder Fibronectin an Fibronectin-Rezeptor, wobei das Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid die Aminsäuresequenz KGD, die in einer Peptidsequenz von mindestens 8 Aminosäureresten enthalten ist, umfaßt.

33. Ein Wirt, transformiert mit dem Expressionssystem nach Anspruch 32.

34. Ein Verfahren zur Herstellung eines Blutpläffcheninhibitor-Polypeptids nach Anspruch 32, umfassend:

Kultivierung des transformierten Wirts nach Anspruch 37 unter wirksamen Bedingungen zur Expression der Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-codierenden DNA zur Herstellung eines Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids und Gewinnung des Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids aus der Kultur.

35. Ein Arzneimittel, umfassend ein Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypepüd nach einem der Ansprüche 1 bis 27, 31 und 34.

36. Verwendung des Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 27, 31 und 34 zur Herstellung eines Arzneimittels geeignet zur Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation und der Behandlung oder Vorbeugung von Blutplättchenassozierten ischämischen Störungen.