JP2008512097A - アプタマー医薬品化学 - Google Patents

Abstract

本発明は一般には核酸の分野に関連し、より具体的には、治療剤、診断剤として、また、標的の有効性確認などのための研究において有用であるアプタマーに関連する。本発明はさらに、治療剤、診断剤および研究において使用されるアプタマーを強化するための材料および方法に関連する。置換された一本鎖アプタマーを同定する方法であって、ａ）一本鎖アプタマー内のヌクレオチド間連結位置においてリン酸基をホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートに置換する工程；ｂ）置換された一本鎖アプタマーを標的親和性についてアッセイする工程；およびｃ）ホスホロチオエート置換を有しないこと以外は改変された一本鎖アプタマーと同一である出発アプタマーの標的親和性と比較して増大した標的親和性を有する置換された一本鎖アプタマーを同定する工程を含む、方法もまた提供される。

Description

（発明の分野）
本発明は一般には核酸の分野に関連し、より具体的には、治療剤、診断剤として、また、標的の有効性確認などのための研究において有用であるアプタマーに関連する。本発明はさらに、治療剤、診断剤および研究において使用されるアプタマーを強化するための材料および方法に関連する。

（発明の背景）
アプタマーは、古典的なワトソン−クリック塩基対形成とは異なる相互作用によって分子に対する特異的な結合親和性を有する核酸分子である。

アプタマーは、ファージディスプレイによって作製されるペプチド、またはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）と同様に、選択された標的に特異的に結合し、標的の活性または結合相互作用を調節することができ、例えば、結合することにより、アプタマーは、その標的が機能する能力を阻止することができる。ランダム配列のオリゴヌクレオチドからの試験管内選抜プロセスによって発見されたが、アプタマーは、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよび受容体を含めて、１３０を超えるタンパク質について作製されている。典型的なアプタマーはサイズが１０ｋＤａ〜１５ｋＤａ（２０ヌクレオチド〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度〜サブナノモル濃度の親和性によりその標的に結合し、近縁の標的を識別する（例えば、アプタマーは典型的には、同じ遺伝子ファミリーに由来する他のタンパク質とは結合しない）。一連の構造的研究により、アプタマーは、親和性および特異性を抗体−抗原複合体においてもたらす同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合形成、静電的相補性、疎水性接触、立体的排除など）を使用することができることが示されている。

アプタマーは、大きい特異性および親和性、生物学的効力ならびに優れた薬物動態学的性質をはじめとする、治療剤および診断剤として使用するための数多くの望ましい特徴を有する。加えて、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物学的作用因を上回る下記の特異的な競合的利点を提供する：例えば、
１）速度および制御。アプタマーは、治療用リード物質を含めて、最初のリード物質の迅速な作製を可能にする完全な試験管内プロセスによって作製される。試験管内での選択は、アプタマーの特異性および親和性を厳しく制御することを可能にし、また、毒性の標的および非免疫原性の標的の両方に対するリード物質を含めて、様々なリード物質の作製を可能にする。

２）毒性および免疫原性。１つのクラスとしてのアプタマーは、治療的に許容され得る毒性、および、免疫原性を有しないことが明らかにされている。多くのモノクローナル抗体の効力は抗体自身に対する免疫応答によってひどく制限され得るが、アプタマーはＭＨＣを介してＴ細胞によって提示されることができず、また、免疫応答は一般には核酸フラグメントを認識しないように向けられるので、アプタマーに対する抗体を誘発することは極めて困難である。

３）投与。ほとんどの現在承認されている抗体治療剤は（典型的には２時間〜４時間にわたる）静脈内注入によって投与されるが、アプタマーは皮下注射によって投与することができる（皮下投与を介したアプタマーの生物学的利用能はサルでの研究では８０％を超えている（非特許文献１））。良好な溶解性（１５０ｍｇ／ｍＬを超える）および比較的低い分子量（アプタマー：１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）により、アプタマーの週１回の服用量を０．５ｍＬ未満の体積での注射によって送達することができる。加えて、アプタマーの小さいサイズは、抗体または抗体フラグメントが浸透することができない、立体配座的な妨害がある領域の中にアプタマーが浸透することを可能にし、このことは、アプタマーに基づく治療剤または予防のさらに別の利点を提供している。

４）拡張性および費用。治療用アプタマーは化学合成されており、その結果として、製造要求を満たすために必要とされるように容易に規模を変化させることができる。製造規模を変化させる際の様々な困難により現在、いくつかの生物製剤の入手性が制限されており、また、大規模なタンパク質製造設備の資本コストは莫大であるのに対して、大規模なオリゴヌクレオチド合成装置は１つだけで１００ｋｇ／年を超える製造が可能であり、また、あまり大きな初期投資を必要としない。キログラム規模でのアプタマー合成のための現在の原価は＄５００／ｇであると見積もられ、これは、非常に最適化された抗体についての原価と匹敵する。プロセス開発における継続している改善は、５年で原価を＄１００／ｇ未満に低下させることが予想される。

５）安定性。治療用アプタマーは化学的に堅固である。治療用アプタマーは、本質的には熱および変性剤などの因子にさらされた後で活性を回復するように適合化されており、凍結乾燥粉末として室温で（１年を超える）長期間にわたって貯蔵することができる。

さらには、アプタマー発見プロセスはリード物質の改変（例えば、アプタマー配列の最適化およびアプタマー長さの最小化など）を容易に可能にする［非特許文献２］。加えて、２’位での改変（例えば、２’−フルオロおよび２’−Ｏ−Ｍｅなど）を、標的とのアプタマー結合相互作用を損なうことなく、ヌクレアーゼに対する安定化のために利用することができる。例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと。

しかしながら、ヌクレアーゼ抵抗性以外の特性（例えば、標的親和性など）を増大させる目的で、化学的置換をアプタマーに発見後に導入した例はほんの少数にすぎない。例えば、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１；非特許文献１２、および非特許文献１３を参照のこと。

化学的置換が、様々な特性（例えば、増大した標的親和性など）を有するアプタマーを選択することを期待して、アプタマーが発見される転写物のライブラリーに組み込まれている。例えば、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７；非特許文献１８、非特許文献１９を参照のこと。しかしながら、転写を介して転写物のライブラリーに置換を導入することは、所与の種類のすべてのヌクレオチドが同時に置換される「地球的規模の」方法である。このような「地球的規模の」方法では、所望のアプタマー特性（例えば、アプタマー−標的の親和性など）を増大させる単置換の発見が可能になるのではなく、そのような「地球的規模の」方法はアプタマー内の他の位置では許容されないことがある。
Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．７３２：２０３−２１２，１９９９ Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５２２９−５２３４（１９９４） Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１１３６３−１１３７ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２，５２２９−５２３４ Ｋｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５９（１），２５９−２６７ Ｐａｇｒａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，１，６８−７３ Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１０，６８３−６９５（１９９５） Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１０８７−１０９６（１９９７） Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，４２２４−４２３１（１９９８） Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，２２３４−２２４２（１９９８） Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１１２８５−１１２９２（１９９３） Ｋｒａｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，１１０９−１１１６（１９９５） Ｌａｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２８１７−２８２２（１９９４） Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，８８４２−８８５１（２００３） Ｓａｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．，２，２１５−２１６（２００２） Ｍａｓｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１２，１１１１−１１２０（２００４） Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，９６９６−９７０６（２００２） Ｙａｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，５，７０５−７１５（２００４）

ヌクレアーゼ抵抗性に加えて、かつ／または、ヌクレアーゼ抵抗性以外のアプタマーの特性を、例えば、特定の治療基準および／または診断基準を達成するために変化させ、その一方で、そうするために要求される化学的置換の数を最小限に抑えることは有益であると考えられる。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たすための材料および方法を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、疾患の処置における使用、診断適用における使用、および／または、研究（例えば、標的の有効性確認）における使用のためのアプタマーの同定または置換に関連する方法および材料を提供する。

１つの実施形態において、置換を有しないこと以外は置換されたアプタマーと同一であるアプタマーの、標的結合親和性よりも大きい標的結合親和性を有する、標的に結合する置換されたアプタマーを同定する方法が提供される。この方法の１つの実施形態は、ａ）非置換のヌクレオチドを、塩基、糖またはリン酸基の位置あるいは残基において改変された１つだけのヌクレオチドに置換する工程；およびｂ）置換されたアプタマーを標的結合親和性についてアッセイする工程を含む。いくつかの実施形態において、この方法の置換する工程はさらに、少なくとも２つの非改変のヌクレオチドを同じ位置で改変された少なくとも２つのヌクレオチド（例えば、同じ化学的改変を有する少なくとも２つのヌクレオチド）に置換することを含み、一方で、他の実施形態では、置換する工程は、少なくとも２つの非改変のヌクレオチドを異なる位置で改変された少なくとも２つのヌクレオチド（例えば、異なる化学的改変を有する少なくとも２つのヌクレオチド）に置換することを含む。本発明のすべての態様のいくつかの実施形態において、結合親和性における改善ではなく、または、結合親和性における改善に加えて、例えば、機能的アッセイ（例えば、細胞に基づくアッセイなど）におけるアプタマー活性の改善が、置換されたアプタマーおよび／または２回置換されたアプタマーにおいて検出される。本発明のこの方法のいくつかの態様では、アッセイする工程は、機能的アッセイ（例えば、細胞に基づくアッセイなど）においてアプタマーを標的に対する活性についてアッセイすることを含む。

いくつかの実施形態において、置換する工程はさらに、少なくとも３つの非改変のヌクレオチドを同じ位置で置換された少なくとも３つのヌクレオチド（例えば、同じ化学的改変を有する少なくとも３つのヌクレオチド）に置換することを含み、これに対して、他の実施形態では、３つの置換ヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、異なる位置で改変される（例えば、異なる化学的改変を有する）。本発明のこの態様の方法によって同定されるアプタマーもまた提供される。

本発明はまた、リン酸基、糖または塩基の位置での改変を含む置換ヌクレオチドを有しないこと以外は同じヌクレオチド配列を有する第２のアプタマーの同じ標的結合親和性と比較してアプタマーの標的結合親和性を増大させるために選択された置換ヌクレオチドまたは置換された残基を有するヌクレオチド配列を含む、標的に特異的に結合する一本鎖アプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、多くても４つ、多くても３つ、多くても２つまたは多くても１つのヌクレオチド置換または残基置換を含む一本鎖アプタマーを提供し、この場合、置換ヌクレオチドは、塩基、糖またはリン酸基の位置での化学的改変を含み、かつ、一本鎖アプタマーは、置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、置換された一本鎖アプタマーは、置換を有しない第２のアプタマーの活性よりも大きい、アプタマー標的に対する活性を含む。

本発明はまた、置換された一本鎖アプタマーを同定する方法であって、ａ）一本鎖アプタマー内のヌクレオチド間連結位置においてリン酸基をホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートに置換する工程；ｂ）置換された一本鎖アプタマーを標的に対する親和性についてアッセイする工程；およびｃ）ホスホロチオエート置換を有しないこと以外は改変された一本鎖アプタマーと同一である出発アプタマーの標的親和性に対してより大きな標的親和性を有する置換された一本鎖アプタマーを同定する工程を含む方法を提供する。本明細書中で使用される場合、一本鎖アプタマーは、ステムループ構造を有するアプタマーを包含する。本発明のこれらの方法のいくつかの実施形態において、ホスホロチオエート置換は非架橋位置に存在する。本発明は、実質的に純粋な立体化学的混合物（例えば、９５％以上の一方のジアステレオマー）だけでなく、ラセミ混合物を含めて、本発明の様々なアプタマーの立体化学的混合物を包含することが意図される。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様のこの方法の置換する工程はさらに、ホスホロチオエートを化学合成によってヌクレオチド間連結位置において取り込むことを含む。いくつかの実施形態において、置換する工程は、一本鎖アプタマーの３’末端または５’末端における２つのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結位置においてホスホロチオエート置換を取り込むことを含まない。いくつかの実施形態において、置換する工程は、１つだけのホスホロチオエート置換を一本鎖アプタマーに取り込むことを含む。いくつかの実施形態において、１回だけ置換されたホスホロチオエート置換の一本鎖アプタマーは、出発アプタマーの標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きい、または、少なくとも３倍大きい、または、少なくとも４倍大きい、または、少なくとも５倍大きい、標的結合親和性を含む。

本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態では、２回置換された一本鎖アプタマーを得るために、さらなる置換を置換された一本鎖アプタマーに取り込む工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換された一本鎖アプタマーを標的に対する親和性についてアッセイする工程、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する２回置換された一本鎖アプタマーを同定する工程を含む。その一方で、他の実施形態では、本発明のこの態様のこの方法はさらに、２回置換された一本鎖アプタマーを標的に対する親和性についてアッセイすること、および、ホスホロチオエート置換された一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する２回置換された一本鎖アプタマーを同定する工程を含む。いくつかの実施形態において、さらなる置換は、第１のホスホロチオエート置換のリン酸基位置とは異なるリン酸基位置におけるさらなるホスホロチオエート置換である。いくつかの実施形態において、２回置換されたアプタマーが少なくとも２つのホスホロチオエート置換を異なるヌクレオチド位置に含む場合、そのような２回置換されたアプタマーの、標的結合親和性は、非置換の出発アプタマーおよび／または１回置換のアプタマーの、標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きく、または、少なくとも３倍大きく、または、少なくとも４倍大きく、または、少なくとも５倍大きい。

いくつかの実施形態において、さらなる置換は、塩基の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、糖の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドに置換することからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、さらなる置換は、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、さらなる置換は、２’−デオキシイノシンまたは２’−ＯＭｅイノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される。本発明のこの態様のこの方法によって同定されるアプタマーもまた提供される。いくつかの実施形態において、２回置換されたアプタマーが少なくとも２つの異なるタイプの置換を含み、そのうちの１つがホスホロチオエート置換である場合、２回置換されたアプタマーの、標的結合親和性は、非置換の出発アプタマーおよび／または１回改変のアプタマーの、標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きく、または、少なくとも３倍大きく、または、少なくとも４倍大きく、または、少なくとも５倍大きい。

本発明の別の態様では、置換されたアプタマーを同定する方法であって、ａ）イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される置換を出発アプタマーに取り込む工程；ｂ）置換されたアプタマーを標的に対する親和性についてアッセイする工程；およびｃ）置換ヌクレオチドを有しないこと以外は置換されたアプタマーと同一である出発アプタマーの標的親和性に対してより大きな標的親和性を有する置換されたアプタマーを同定する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法の取り込む工程はさらに、置換を化学合成によって出発アプタマーに取り込むことを含む。本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態において、同定された置換されたアプタマーは一本鎖である。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様のこの方法は、別のヌクレオチドをイノシンに置換することを含む。本発明のこの方法のいくつかの実施形態では、イノシンが別のヌクレオチドの代わりに使用され、例えば、プリンの代わりに使用され、その一方で、いくつかの実施形態では、２’−デオキシヌクレオチドが２’−ＯＭｅヌクレオチドの代わりに使用される。いくつかの実施形態において、イノシンが別のヌクレオチドの代わりに使用される場合（例えば、イノシンがプリンの代わりに使用される場合）、置換されたアプタマーの、標的結合親和性は、出発した非置換のアプタマーの、標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きく、または、少なくとも３倍大きく、または、少なくとも４倍大きく、または、少なくとも５倍大きい。いくつかの実施形態において、２’−デオキシヌクレオチドが２’−ＯＭｅヌクレオチドの代わりに置換される場合、標的結合親和性は、出発した非置換のアプタマーの、標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きく、または、少なくとも３倍大きく、または、少なくとも４倍大きく、または、少なくとも５倍大きく、または、少なくとも１０倍大きく、または、少なくとも２０倍大きく、または、少なくとも３０倍大きく、または、少なくとも４０倍大きく、または、少なくとも５０倍大きく、または、少なくとも６０倍大きく、または、少なくとも７０倍大きく、または、少なくとも８０倍大きい。

いくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換されたアプタマーを得るために、第１の置換とは異なるタイプであるさらなる置換を置換されたアプタマーに取り込む工程を含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換されたアプタマーを標的に対する親和性についてアッセイすること、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する２回置換されたアプタマーを同定することを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換されたアプタマーを標的に対する親和性についてアッセイすること、および、置換されたアプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する２回置換されたアプタマーを同定することをさらに含む。本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態において、さらなる置換は、塩基の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、糖の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドに置換することからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、さらなる置換は、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによるヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択され、かつ、さらなる置換は第１の置換とは異なる。いくつかの実施形態において、さらなる置換は、２’−デオキシイノシンまたは２’−ＯＭｅイノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される。本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態において、第１の置換は２’−デオキシによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換であり、さらなる置換はイノシンによる別のヌクレオチドの置換である。

本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換されたアプタマーを得るために、第１の置換と同じタイプではあるが、異なるヌクレオチド位置に存在するさらなる置換を置換されたアプタマーに取り込むことを含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、本方法はさらに、２回置換されたアプタマーを標的に対する親和性についてアッセイすること、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーおよび／または置換されたアプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する２回置換されたアプタマーを同定することを含む。

本発明はまた、ホスホロチオエート改変を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較してより大きい標的結合親和性で標的に特異的に結合する、多くても４つ、多くても３つ、多くても２つまたは多くても１つのホスホロチオエート骨格置換を含む一本鎖アプタマーを提供する。

いくつかの実施形態において、本発明のこの態様のアプタマーは、塩基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、糖の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換からなる群から選択されるさらなるヌクレオチド置換を含み、この場合、置換ヌクレオチドがリン酸基の位置での改変を含むときには、さらなるヌクレオチド置換はホスホロチオエート置換ではない。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様のアプタマーは、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択されるさらなるヌクレオチド置換を含む。

別の実施形態において、本発明のこの態様のアプタマーは、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択されるヌクレオチド置換を含む一本鎖アプタマーを含み、この場合、置換された一本鎖アプタマーは、ヌクレオチド置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較してより大きい標的結合親和性で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様のアプタマーは、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される少なくとも２つのヌクレオチド置換または少なくとも３つのヌクレオチド置換を含み、この場合、そのような２回置換された一本鎖アプタマーは、少なくとも２つのヌクレオチド置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較してより大きい標的結合親和性で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様の２回置換された一本鎖アプタマーは、ヌクレオチド置換のうちの１つを有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較してより大きい標的結合親和性で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本発明のこの態様の３回置換された一本鎖アプタマーは、そのヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つを有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較してより大きい標的結合親和性で標的に特異的に結合する。具体的な実施形態において、ヌクレオチド置換は、２’−ＯＭｅヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチドに置換することである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換は、プリンをイノシンに置換することである。

本発明の別の実施形態では、ホスホロチオエート改変を有しないこと以外は同じヌクレオチド配列を有する第２のアプタマーの標的結合親和性と比較してアプタマーの標的結合親和性を増大させるために選択されたある位置でのリン酸基骨格のホスホロチオエート改変を有するヌクレオチド配列を含む、標的に特異的に結合するアプタマーが提供される。

別の実施形態において、アプタマーを安定化させる方法であって、ａ）改変されたアプタマーを得るために、所定の標的結合親和性を有する出発アプタマーに安定化のための改変を導入する工程、およびｂ）改変されたアプタマーを標的結合親和性についてアッセイする工程を含む方法が提供され、この場合、結合親和性が、置換されたアプタマーをもたらすためにヌクレオチド置換（このヌクレオチド置換は、改変されたアプタマーの、標的結合親和性よりも大きい標的結合親和性を有する置換されたアプタマーをもたらす）を取り込む出発アプタマーの結合親和性よりも小さい。本発明のこの態様のこの方法のいくつかの実施形態において、置換されたアプタマーは、出発アプタマーの、標的結合親和性と実質的に同じである標的結合親和性を含む。いくつかの実施形態において、安定化する改変は、ヌクレアーゼ分解に対するアプタマー抵抗性を増大させるための改変、塩基対の強さを増大させるための改変、加水分解抵抗性を増大させるための改変、および、熱分解に対する抵抗性を増大させるための改変からなる群から選択される改変である。具体的な実施形態において、安定化する改変は、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増大させるための改変である。より具体的な実施形態において、安定化する改変は、別のヌクレオチドを２’−ＯＭｅヌクレオチドに置換することを含み、特に、１個より多くの２’−ＯＭｅによる別のヌクレオチドの置換を取り込むことを含む。いくつかの実施形態において、置換する工程は、塩基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、糖の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換からなる群から選択される置換を含む。具体的な実施形態において、置換は、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、非置換ヌクレオチドを置き換えたホスホロチオエート置換ヌクレオチド、非置換ヌクレオチドを置き換えたホスホロジチオエート置換ヌクレオチド、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される。具体的な実施形態において、置換は、非置換ヌクレオチドに代わって置換されるホスホロチオエート置換のヌクレオチドである。

（発明の詳細な説明）
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が下記の付随する説明に示される。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が次に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点が記載から明らかである。本明細書では、単数形態は、文脈が明らかにそうでないことを示されない限り、複数形態を包含する。別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が優先する。

アプタマーの開発
アプタマーは、本明細書中では核酸リガンドとしてもまた示されるが、古典的なワトソン・クリック塩基対形成とは異なる相互作用を介して分子に対する特異的な結合親和性を有する単離された核酸分子を含む。アプタマーを同定するための好適な方法は、図１に一般的に示され、また、より詳しくは下記に記載される「試験管内人工進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）と題されるプロセスを用いた方法である。リード物質（例えば、治療剤および／または診断剤のリード物質など）として使用されるアプタマー、および／または、標的有効性の確認のためのアプタマーが同定されると、このようなリード物質アプタマーは、所望の基準を達成するために改変することができる。例えば、リード物質アプタマーは、所望の標的についての有用な結合親和性（例えば、親アプタマーの標的結合親和性と同等以上である標的結合親和性）を保持または獲得する、より短いアプタマーを得るために短縮化することができる。リード物質アプタマーの一次ヌクレオチド配列を、例えば、得られるアプタマーの、標的結合親和性を強化するために、１つまたはいくつかの位置で変更することができる。リード物質アプタマーはまた、所望の基準を達成するために化学的に改変することができる。特定の使用のために所望されるアプタマー特性を達成するために、これらの改変技術はどれも使用されないことがあるか、または、これらの改変技術の組合せが使用されることがある。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法
ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、標的分子に対する非常に特異的な結合を有する核酸分子の試験管内進化のための方法であり、例えば、米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称：「核酸リガンド」）および米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３もまたは参照のこと）（発明の名称：「核酸リガンド」）に記載される。ＳＥＬＥＸ^ＴＭによって同定されたそれぞれの核酸リガンド、すなわち、それぞれのアプタマーは、所与の標的化合物または標的分子の特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、核酸が、様々な二次元構造および三次元構造を形成するための十分な能力、そして、モノマー状またはポリマー状であっても、事実上任意の化学化合物に関してリガンドとして作用するために（すなわち、特異的な結合性の対を形成するために）そのモノマーの内部において利用可能な十分な化学的万能性を有するという他にない洞察に基づいている。任意のサイズまたは組成の分子が標的として役立ち得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、開始点として、少なくとも１つの縮重した位置を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依拠する。この方法は典型的には、およそ１０^１４個の異なるオリゴヌクレオチド化学種をサンプリングするために使用されるが、約１０^１８個もの多くの異なるオリゴヌクレオチド化学種をサンプリングするために使用することができる。非常に多数の可能な配列および構造を含有する核酸ライブラリーには、所定の標的についての広範囲の結合親和性が存在する。より大きな標的親和性（より低い解離定数）を有するものが、その標的に結合する可能性が最も大きい。ライブラリーは、結合のために有利な条件のもとで標的と混合され、結合、分配および増幅の段階毎の繰り返しに供される。分配、解離および増幅の最初の繰り返しの後、第２の核酸混合物が作製され、より大きい結合親和性の候補に関して濃縮される。選択工程をさらに次々と行うことにより、最も良いリガンドが段々と有利になる。これと同じ一般的な選択スキームを使用して、結合親和性および結合選択性の事実上任意の所望される基準を達成することができる。多くの場合、得られる核酸混合物は１つだけの配列または少数の配列から主に構成される。その後、これらはクローン化され、配列決定され、そして、純粋なリガンドまたはアプタマーとしての結合親和性について個々に調べることができる。

より具体的には、出発ライブラリーにおけるオリゴヌクレオチドは、改変または非改変のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが可能である。意図されたアプタマー使用では、多くの場合、出発オリゴヌクレオチドライブラリーの組成の選択が知らされる。例えば、治療剤としての使用のために好適なアプタマーは、好ましくは、安価に合成することができ、安全であり、かつ、生体内で安定である。生物学的流体の存在下での安定性もまた、診断適用および標的有効性確認の適用におけるアプタマーの使用のためには重要である場合がある。意図された医学的適応に依存して、野生型のＲＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するその感受性のために生体内での使用のためには十分に安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を、改変されたヌクレオチドをアプタマーに取り込むことによって大きく増大させることができる。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法では、改善された特性（例えば、改善された生体内安定性または改善された送達特性など）をリガンドに付与する改変されたヌクレオチドを含有する高親和性の核酸リガンドを同定することが包含される。そのような改変の例には、糖および／またはリン酸基および／または塩基の位置での化学的改変が含まれる。改変されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸ^ＴＭにより同定された核酸リガンドが、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（これは、リボースの２’位、ピリミジン類の５位およびプリン類の８位で化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する）および米国特許第５，７５６，７０３号（これは、様々な２’修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する）および米国特許第５，５８０，７３７号（これは、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）置換基、２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換基および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基により修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含有する非常に特異的な核酸リガンドを記載する）に記載される。

本発明において意図される核酸リガンドの改変（修飾）には、核酸リガンド塩基に対して、または、全体としての核酸リガンドに対して、さらなる電荷、柔軟性、分極性、疎水性、水素結合形成、静電相互作用および／または流出性を組み入れる他の化学基を提供する様々な改変（修飾）が含まれるが、それらに限定されない。ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を作製するための改変にはまた、１つまたは複数の代替ヌクレオチド間連結、変化させた糖、変化させた塩基、あるいは、それらの組合せが含まれ得る。そのような改変には、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンへの置換、５−ブロモウラシルまたは５−ヨードウラシルへの置換；骨格改変、ホスホロチオエート修飾またはアルキルホスホナート修飾、メチル化、および、非通常型塩基対形成の組合せ（例えば、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアノシンなど）が含まれるが、これらに限定されない。改変にはまた、３’修飾および５’修飾（例えば、キャッピングなど）も含まれ得る。

１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）（式中、それぞれのＲまたはＲ’は独立してＨまたは置換アルキルまたは非置換アルキルである）によって置換されるオリゴヌクレオチドが提供される。様々な連結基を、−Ｏ−連結、−Ｎ−連結または−Ｓ−連結を介して隣接ヌクレオチドに結合することができる。オリゴヌクレオチド内のすべての連結が同一であることは必ずしも要求されない。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、改変された糖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲンまたは脂肪族基で置換されるか、あるいは、エーテルまたはアミンとして官能基化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位が、Ｏ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−アリル基、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリル基またはハロ基のいずれかによって置換される。２’修飾された糖を合成する方法が、例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載される。

２’改変アプタマーを作製するために使用されるＳＥＬＥＸ^ＴＭ法が、例えば、米国仮特許出願第６０／４３０，７６１号（２００２年１２月３日出願）、米国仮特許出願第６０／４８７，４７４号（２００３年７月１５日出願）、米国仮特許出願第６０／５１７，０３９号（２００３年１１月４日出願）、米国特許出願第１０／７２９，５８１号（２００３年１２月３日出願）、米国特許出願第１０／８７３，８５６号（２００４年６月２１日出願、発明の名称：「２’−Ｏ−メチル置換された核酸の試験管内選択のための方法」）および米国仮特許出願第６０／６９６，２９２号（２００５年６月３０日出願、発明の名称：「完全な２’改変を含有する核酸転写物を作製するための改善された材料および方法」）に記載される（これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。

開示された方法では、転写物のプールが、例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、２’−デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ−ヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅ−ヌクレオチドを含む、転写混合物における改変されたヌクレオチドの任意の組合せを使用して作製される。

２’−ＯＨ Ａおよび２’−ＯＨ Ｇと、２’−ＯＭｅ Ｃおよび２’−ＯＭｅ Ｕとを含有する転写混合物は「ｒＲｍＹ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｒＲｍＹ」アプタマーとして示される。２’−デオキシＡおよび２’−デオキシＧと、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃとを含有する転写混合物は「ｄＲｍＹ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｄＲｍＹ」アプタマーとして示される。２’−ＯＨ Ｇと、２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｃおよび２’−ＯＭｅ Ｕとを含有する転写混合物は「ｒＧｍＨ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｒＧｍＨ」アプタマーとして示される。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｇと、２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃと、２’−Ｆ Ｇとを交互に含有する転写混合物は「交互混合物」として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「交互混合物」アプタマーとして示される。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕ、２’−ＯＭｅ Ｃおよび２’−ＯＭｅ Ｇを含有し、前記Ｇの１０％までがリボヌクレオチドである転写混合物は「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーとして示される。２’−Ｆ Ｇと、２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃｉｓとを含有する転写混合物は「ｆＧｍＨ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｆＧｍＨ」アプタマーとして示される。２’−デオキシＧと、２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃとを含有する転写混合物は「ｄＧｍＨ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｄＧｍＨ」アプタマーとして示される。２’−デオキシＡと、２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇおよび２’−ＯＭｅ Ｕとを含有する転写混合物は「ｄＡｍＢ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｄＡｍＢ」アプタマーとして示され、また、すべての２’−ＯＨヌクレオチドを含有する転写混合物は「ｒＮ」混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは、「ｒＮ」アプタマー、「ｒＲｒＹ」アプタマーまたは「ＲＮＡ」アプタマーとして示される。２’−ＯＨアデノシン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸と、２’−デオキシシチジン三リン酸および２’−デオキシチミジン三リン酸とを含有する転写混合物はｒＲｄＹ混合物として示され、その混合物から選択されたアプタマーは「ｒＲｄＹ」アプタマーとして示される。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、２’−ヒドロキシである開始ヌクレオチド以外には、２’−ＯＭｅヌクレオチドのみを含有するアプタマーである。

ＲＮＡライブラリーが出発ライブラリーとして使用されるそのような場合、ＲＮＡライブラリーは典型的には、ＤＮＡライブラリーを合成し、場合によりＰＣＲ増幅し、その後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡライブラリーを試験管内で転写し、転写されたライブラリーを精製することによって作製される。

核酸の出発ライブラリーを含有する混合物を用いて開始するとき、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、（ａ）混合物を結合のために有利な条件のもとで標的と接触させる工程、（ｂ）結合していない核酸を、標的分子に特異的に結合しているそのような核酸から分配する工程、（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程、（ｄ）核酸のリガンド濃縮混合物を作製するために、核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅する工程、および（ｅ）標的分子に対する非常に特異的な高親和性の核酸リガンドを得るために所望されるほどの多数回のサイクルによって、結合、分配、解離および増幅の各工程を繰り返す工程を含む。ＲＮＡアプタマーが選択されているそのような場合には、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法はさらに、（ｉ）核酸−標的複合体から解離させた核酸を、工程（ｄ）における増幅の前に逆転写する工程、および（ｉｉ）工程（ｄ）からの増幅された核酸を、プロセスを再開する前に転写する工程を含む。

選択および増幅のサイクルが、所望する目的が達成されるまで繰り返される。最も一般的な場合には、選択／増幅は結合強度の著しい改善が、サイクルを繰り返したときに達成されなくなるまで続けられる。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの一部として、標的に結合させるために選択された配列は、その後、所望の結合親和性を有する最小限の配列を決定するために場合により最小化される。選択された配列および／または最小化された配列のランダム変異誘発または特異的変異誘発を、場合により、結合親和性を増大させるために、あるいは、配列内のどの位置が結合活性のために不可欠であるかを明らかにするために行うことができる。例えば、「ドープ化再選択」を、アプタマー内または最小化アプタマー内の配列要求を調べるために使用することができる。ドープ化選択は、目的するアプタマー配列に基づいて設計されている合成された縮重プールを用いて行われるＳＥＬＥＸ^ＴＭ試験管内選択繰り返しである。縮重性のレベルは通常、７０％〜８５％の野生型ヌクレオチドに及ぶ。中立的な変異により、または、一部の場合には、配列変化により、親和性の改善がもたらされ得る。各種の要素からなる配列情報を、最小限の結合モチーフを同定するために、かつ／または、最適化努力を助けるために使用することができる。

アプタマー医薬品化学
アプタマー医薬品化学が、アプタマーの特性を改善し、特定の基準（例えば、治療基準）を達成するために使用される。アプタマー医薬品化学が、目的とするアプタマーを選択した後で、典型的には、場合により行われる上記の最小化工程および変異誘発工程の後で行われる。

本発明の１つの実施形態において、アプタマー医薬品化学では、数組の変化体アプタマーが化学合成される戦略が使用される。これらの組の変化体は典型的には、１つの出発ヌクレオチドまたは他の残基の代わりでの１つだけのヌクレオチドまたは他の残基への置換によって親アプタマーとは異なる。置換されたヌクレオチドまたは他の残基は、少なくとも１つの化学的改変によって置換されようとするヌクレオチドまたは他の残基とは異なる。ヌクレオチドに関連して、化学的改変は、ヌクレオチドの塩基位置、糖位置またはリン酸基位置に存在し得る。本発明の方法において、化学的改変がヌクレオチドにおける塩基の位置に存在する場合、その化学的改変は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのグループ内、または、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのグループ内における１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドへの相互変換をもたらさない。

１組の変化体アプタマーの内部において、変化体アプタマーは、置換されたヌクレオチドまたは他の残基（「置換基」）の存在位置によって互いに異なる。これらの変化体は、その後、相互に、また、その親と比較される。１つだけの置換基を含むことが、特定の治療基準を達成するために必要であるすべてであり得るので、特性（特に、結合親和性）における様々な改善が十分に大きくなり得る。

あるいは、単一変化体の１組から集められた情報を、１個より多くの置換されたヌクレオチドまたは他の残基が同時に導入される変化体のさらなる組を設計するために使用することができる。１つの設計方針において、一置換基変化体のすべてが、その一置換基によって治療基準に与えられる改善に基づいてランク付けされ、その上位４つが選ばれ、これら４つの一置換基変化体のすべての可能な２成分組合せ（６つ）、３成分組合せ（４つ）および４成分組合せ（１つ）が合成され、アッセイされる。別の設計方針では、最も良い一置換基変化体が新しい親であると見なされ、この最高ランクの一置換基変化体を含むすべての可能な２重の置換基変化体が合成され、アッセイされる。さらに別の設計方針では、置換が結合親和性に著しく不都合な影響を及ぼさなかった一置換基変化体が他の一置換基変化体と組み合わされ、合成され、アッセイされる。さらには、結合親和性に著しく不都合な影響を及ぼさない一置換基変化体、および／または、結合親和性を増大させた一置換基変化体を第２のタイプの置換と組み合わせ、合成し、アッセイすることができる。例えば、イノシン置換を、非置換の出発アプタマーまたはいずれかの一置換の親に対してより大きな親和性を有する変化体に到達するために、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換と組み合わせることができる。

他の様々な方針を使用することができ、これらの方針を、さらに改善された変化体を同定することを続けながら、置換基の数を徐々に増大するように繰り返し適用することができる。例えば、いくつかの置換方針では、ブロック置換が使用される。具体的には、アプタマーの二次構造を予測することができ、予測された二次構造に基づいて、親アプタマーからのヌクレオチドブロックを、改変されたヌクレオチドブロックで置き換えることができる。例えば、予測された二次構造がステムループ構造を含む場合、予測されたステムに含まれるヌクレオチドブロックを、ループを完成させるヌクレオチドと同様に、改変されたヌクレオチド（例えば、２’−ＯＭｅヌクレオチド）で置き換えることができる。親和性を増大させるブロックは保持される。親和性を増大させないブロックは、そのブロック領域の内部において一置換戦略を使用してさらに特徴づけることができる。

１つの実施形態において、安定化させるための置換（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性のための２’−ＯＭｅ置換）を、置換されたアプタマーの結合親和性を非置換の出発アプタマーに対して実際に低下させるアプタマーに導入することができる。別の置換（例えば、ホスホロチオエート置換）を置換されたアプタマーに導入し、非置換の出発アプタマーの結合親和性と同等以上の結合親和性についてアッセイすることができる。

アプタマー医薬品化学は、特に、置換基の全体的な導入ではなく、むしろ、局所的な導入を調べるための方法として使用することができる。様々なアプタマーが、転写によって作製されるライブラリーにおいて発見されるので、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス時において導入される任意の置換基は全体的に導入されるに違いない。例えば、ホスホロチオエート連結をヌクレオチド間に導入することが所望されるならば、ホスホロチオエート連結をすべてのＡ（またはすべてのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）において単に導入することができる（全体的に置換することができる）。所望の治療基準を達成するためにホスホロチオエートを一部のＡ（または一部のＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）において要求し（局所的に置換され）、しかし、他のＡにおいては許容することができないアプタマーは、このプロセスによって容易に発見することができない。

アプタマー医薬品化学プロセスによって利用することができる置換基のタイプは、ヌクレオチドだけに限定されず、むしろ、固相合成試薬として作製され得る置換基であり、また、オリゴマー合成スキームに導入することができる。アプタマー医薬品化学スキームでは、立体的嵩張り、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正荷電、負荷電、中性荷電、双性イオン、分極性、ヌクレアーゼ抵抗性、立体配座剛性、立体配座柔軟性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換基を含むことができる。アプタマー医薬品化学スキームでは、塩基改変、糖改変またはホスホジエステル連結改変を含むことができる。

治療用アプタマーに関連して有益であると考えられる置換基の種類を検討するとき、下記カテゴリーの１つまたは複数に含まれる置換を導入することが好ましい場合がある：
（１）天然に存在する置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−ＯＭｅのプリン類またはピリミジン類、あるいは、２’−デオキシ−５−メチルシチジン。
（２）承認された治療剤の既に一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート連結のオリゴヌクレオチド。
（３）上記２つのカテゴリーのいずれかに加水分解または分解する置換基、例えば、メチルホスホナート連結のオリゴヌクレオチド。

本発明のアプタマーは、固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；およびＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）および液相法（例えば、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；およびＨｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと）など）を含む、この分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成することができる。

アプタマー治療剤の薬物動態学および生体分布の調節
アプタマーを含めて、オリゴヌクレオチドに基づくすべての治療剤についての薬物動態学的性質を、所望の医薬品適用と一致させるためにそれに合わせて調節することは重要である。細胞外の標的に対して向けられたアプタマーは、（アンチセンスおよびＲＮＡｉに基づく治療剤に関して当てはまるような）細胞内送達に関連する困難を受けないが、そのようなアプタマーは依然として標的器官および標的組織に分布され得なければならず、また、所望の投与様式と一致する期間にわたって体内に留まらなければならない（変化を受けてはならない）。

従って、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態学を変化させるための材料および方法を提供し、具体的には、アプタマーの薬物動態学を調節する能力を提供する。アプタマーの薬物動態学の調節性（すなわち、アプタマーの薬物動態学を調節する能力）は、核酸の化学的組成を変化させるために、改変のための成分（例えば、ＰＥＧポリマー）をアプタマーにコンジュゲート化すること、および／または、改変されたヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−ＯＭｅ）を取り込むことによって達成される。アプタマーの薬物動態学を調節する能力は、既存の治療的適用の改善において、あるいは、新しい治療的適用の開発において使用される。例えば、いくつかの治療的適用において、例えば、迅速な薬物クリアランスまたは薬物遮断が所望され得る抗新生物状況または急性期治療状況では、循環におけるアプタマーの滞留時間を低下させることが望ましい。あるいは、他の治療的適用、例えば、治療剤の全身循環が所望される維持治療では、循環におけるアプタマーの滞留時間を増大させることが望ましい場合がある。

加えて、アプタマーの薬物動態学の調節性は、対象におけるアプタマー治療剤の生体分布を変化させるために使用される。例えば、いくつかの治療的適用では、特定タイプの組織または特定の器官（または一組の器官）を標的とすることを目指してアプタマー治療剤の生体分布を変化させることが望ましい場合がある。これらの適用において、アプタマー治療剤は特定の組織または器官において優先的に蓄積する。他の治療的適用では、所与の疾患、細胞傷害または他の異常な病理に関連する細胞マーカーまたは症状を呈示する組織を標的とし、その結果、アプタマー治療剤が罹患組織において優先的に蓄積するようにすることが望ましい場合がある。例えば、米国仮特許出願第６０／５５０，７９０号（２００４年３月５日出願、発明の名称：「アプタマー治療剤の薬物動態学および生体分布の制御された調節」）および通常出願の米国特許出願第１１／０７５，６４８号（２００５年３月７日出願、発明の名称：「アプタマー治療剤の薬物動態学および生体分布の制御された調節」）に記載されるように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーによるＰＥＧ化）が、ＰＥＧ化されたアプタマー治療剤が炎症組織において優先的に蓄積するように炎症組織を標的とするために使用される。

アプタマー治療剤（例えば、アプタマーコンジュゲート、または、変化した化学的性質（例えば、改変されたヌクレオチド）を有するアプタマー）の薬物動態学プロフィルおよび生体分布プロフィルを明らかにするために、様々なパラメーターがモニターされる。そのようなパラメーターには、例えば、アプタマー組成物の半減期（ｔ_１／２）、血漿クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｓｓ）、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観測された最大血清中濃度または最大血漿中濃度（Ｃ_ｍａｘ）、および、平均滞留時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される用語「ＡＵＣ」は、アプタマー投与後の時間に対するアプタマー治療剤の血漿中濃度のプロットの下側の面積を示す。ＡＵＣ値は、所与のアプタマー治療剤の生物学的利用能（すなわち、アプタマー投与後の循環における投与されたアプタマー治療剤の割合）および／または総クリアランス（ＣＬ）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除かれる速度）を見積もるために使用される。分布容積により、アプタマー治療剤の血漿中濃度が、体内に存在するアプタマー量に関係づけられる。Ｖｓｓが大きいほど、多くのアプタマーが血漿外に見出される（すなわち、管外遊出が多くなる）。

本発明は、アプタマーを調節用成分（例えば、小分子、ペプチドまたはポリマー末端基など）にコンジュゲート化することによって、または、改変されたヌクレオチドをアプタマーに取り込むことによって、安定化されたアプタマー組成物の生体内での薬物動態学および生体分布を制御された様式で調節するための材料および方法を提供する。本明細書中に記載されるように、改変用成分のコンジュゲート化、および／または、ヌクレオチドの化学的組成を変化させることは、循環におけるアプタマー滞留時間および組織に対するアプタマー分布の基本的側面を変化させる。

ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療剤は、腎臓ろ過による除去を受ける。そのため、静脈内投与されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは典型的には、ろ過が阻止され得ない限り、１０分未満の生体内半減期を示す。ろ過の阻止は、血流から組織内への迅速な分布を促進させることによって、または、オリゴヌクレオチドの見かけ分子量を糸球体についての有効サイズカットオフよりも大きくすることによって達成することができる。下記に記載される、ＰＥＧポリマーへの小さい治療剤のコンジュゲート化（ＰＥＧ化）は、循環におけるアプタマーの滞留時間を劇的に長くすることができ、それにより、投薬頻度を減らし、かつ、血管標的に対する有効性を高めることができる。

アプタマーを様々な改変用成分にコンジュゲート化することができ、例えば、高分子量のポリマー（例えば、ＰＥＧ）；ペプチド（例えば、Ｔａｔ（ＨＩＶのＴａｔタンパク質の１３アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオティックタンパク質の第３ヘリックスに由来する１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｖａｃｃｉｎｅ １９（１１−１２）：１３９７−４０５））およびＡｒｇ_７（ポリアルギニン（Ａｒｇ_７）から構成される短い正荷電の細胞透過性ペプチド）（Ｒｏｔｈｂａｒｄ， ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８）））；および小分子（例えば、親油性化合物（例えば、コレステロールなど））などにコンジュゲート化することができる。本明細書中に記載される様々なコンジュゲートの中には、アプタマーの生体内性質がＰＥＧ基との複合体化によって最も顕著に変化するものがある。例えば、２’Ｆおよび２’−ＯＭｅの混合型の改変アプタマー治療剤を２０ｋＤａのＰＥＧポリマーと複合体化することにより、腎臓ろ過が妨げられ、健全な組織および炎症組織の両方へのアプタマー分布が促進される。さらには、２０ｋＤａＰＥＧポリマー−アプタマーコンジュゲートは、アプタマーの腎臓ろ過を防止することにおいて、４０ｋＤａのＰＥＧポリマーとほぼ同じくらい効果的であることが判明している。ＰＥＧ化の１つの効果はアプタマーのクリアランスに対してである一方で、２０ｋＤａ成分の存在によってもたらされる長期間にわたる全身暴露はまた、組織（特に、非常に灌流される器官の組織、および、炎症部位における組織）に対するアプタマーの分布を促進させる。アプタマー−２０ｋＤａＰＥＧポリマーコンジュゲートは、ＰＥＧ化されたアプタマーが炎症組織において優先的に蓄積するように炎症部位へのアプタマー分布をもたらす。一部の場合には、２０ｋＤａのＰＥＧ化アプタマーコンジュゲートは細胞（例えば、腎臓細胞など）の内部を通り抜けることができる。

改変されたヌクレオチドはまた、アプタマーの血漿中クリアランスを調節するために使用することができる。例えば、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅの両方の安定化化学成分を取り込むコンジュゲート化されていないアプタマーは、試験管内および生体内での大きな程度のヌクレアーゼ安定性を示すので、現行世代のアプタマーの代表的なものであり、非改変のアプタマーと比較したとき、血漿からの迅速な喪失（すなわち、迅速な血漿中クリアランス）および組織内への迅速な分布（主に腎臓内への迅速な分布）を示す。

ＰＥＧ誘導体化核酸
上記で記載されたように、高分子量の非免疫原性ポリマーによる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的性質および薬力学的性質を変化させ、これにより、核酸をより効果的な治療剤にする潜在的可能性を有する。活性における好都合な変化には、ヌクレアーゼによる分解に対する増大した抵抗性、腎臓からの低下したろ過、免疫系に対する低下した暴露、および、身体中の治療剤の変化した分布が含まれ得る。

本発明のアプタマー組成物はポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）成分により誘導体化することができる。ＰＡＧにより誘導体化された核酸の例が米国特許出願第１０／７１８，８３３号（２００３年１１月２１日出願）（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に見出される。本発明において使用される典型的なポリマーには、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）（これはまたポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）として知られている）およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が含まれる。加えて、種々のアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のランダム共重合体またはブロック共重合体を多くの適用において使用することができる。その最も一般的な形態において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧなど）は、ヒドロキシル基が両末端に存在する線状ポリマー、すなわち、ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨである。このポリマー（α，ω−ジヒドロキシルポリエチレングリコール）はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表すことができ、この場合、−ＰＥＧ−の記号は下記の構造ユニットを表すことが理解される：−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、式中、ｎは典型的には約４〜約１０，０００の範囲である。

示されるように、ＰＥＧ分子は二官能性であり、「ＰＥＧジオール」と呼ばれることがある。ＰＥＧ分子の末端部分は比較的非反応性のヒドロキシル基（−ＯＨ基）であり、このヒドロキシル基は、ＰＥＧを化合物上の反応性部位において他の化合物に結合させるために活性化することができ、または、官能基成分に変換することができる。そのような活性化されたＰＥＧジオールは本明細書中では二活性化ＰＥＧとして示される。例えば、ＰＥＧジオールの末端成分は、比較的非反応性のヒドロキシル基（−ＯＨ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド由来のスクシンイミジル活性エステル成分で置換することによってアミノ成分との選択的な反応のための活性なカルボナートエステルとして機能化されている。

多くの適用では、ＰＥＧ分子がモノ官能性である（または単一活性化される）ように、ＰＥＧ分子を本質的には非反応性の成分で一方の末端においてキャップ処理することが望ましい。一般には多数の反応部位を活性化ＰＥＧのために示すタンパク質治療剤の場合、二官能性の活性化ＰＥＧは広範囲の架橋をもたらし、これは、良好な機能を持たない凝集物を生じさせる。単一活性化ＰＥＧを作製するために、ＰＥＧジオール分子の末端における一方のヒドロキシル成分が典型的には、非反応性のメトキシ末端成分（−ＯＣＨ_３）により置換される。ＰＥＧ分子の反対側のキャップ化されていない末端は典型的には、表面または分子（例えば、タンパク質など）における反応性部位での結合のために活性化することができる反応性の末端成分に変換される。

ＰＡＧは、水および多くの有機溶媒において溶解可能であり、毒性を有さず、かつ、免疫原性を有しないという性質を典型的には有するポリマーである。ＰＡＧを使用することの１つが、ポリマーを不溶性分子に共有結合的に結合して、得られるＰＡＧ−分子「コンジュゲート」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性薬物のパクリタキセルは、ＰＥＧにカップリングされたとき、水溶性になることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧコンジュゲートは、多くの場合、溶解性および安定性を高めるためだけではなく、分子の血中循環半減期を長くするためにも使用される。

本発明のポリアルキル化化合物は典型的にはサイズが５ｋＤａ〜８０ｋＤａの間であり、しかしながら、任意のサイズを使用することができ、その選択はアプタマーおよび適用に依存する。本発明の他のＰＡＧ化合物はサイズが１０ｋＤａ〜８０ｋＤａの間である。本発明のさらに他のＰＡＧ化合物はサイズが１０ｋＤａ〜６０ｋＤａの間である。例えば、ＰＡＧポリマーは、サイズが少なくとも１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａまたは８０ｋＤａであり得る。そのようなポリマーは線状または分枝状が可能である。いくつかの実施形態において、ポリマーはＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリマーは分枝状ＰＥＧである。さらに別の実施形態において、ポリマーは、図２に示されるような４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧは、図３に示されるようにアプタマーの５’末端に結合する。

生物学的に発現させたタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は典型的には、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。様々なＰＥＧ−核酸コンジュゲートを、同じ反復モノマー合成を使用してＰＥＧを取り込むことによって調製することができる。例えば、ホスホルアミダイト形態への変換によって活性化されたＰＥＧを固相オリゴヌクレオチド合成に組み込むことができる。あるいは、オリゴヌクレオチド合成を反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的な組み込みとともに完了することができる。最も一般には、これは、フリーの第一級アミンを５’末端に付加することによって達成されている（固相合成の最後のカップリング工程において修飾剤のホスホルアミダイトを使用して組み込まれる）。この方法を使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応し、アミンとの結合を形成するように活性化されたＰＥＧ）が、精製されたオリゴヌクレオチドと一緒にされ、カップリング反応が溶液中で行われる。

治療剤の生体分布を変化させるＰＥＧコンジュゲート化の能力は、コンジュゲートの見かけ上のサイズ（例えば、流体力学的半径に関して測定されるようなサイズ）を含む数多くの要因に関係づけられる。より大きいコンジュゲート（１０ｋＤａ超）は、腎臓を介したろ過をより効果的に阻止し、その結果として、小さい高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清中半減期を増大させることが知られている。ろ過を阻止するＰＥＧコンジュゲートの能力は、約５０ｋＤａまでのＰＥＧサイズとともに増大することが示されている（さらなる増大は、半減期が、腎臓を介した除去ではなく、マクロファージ媒介の代謝によって規定されるので、極小さい有益な効果を有する）。

高分子量ＰＥＧ（１０ｋＤａ超）の製造は、困難で、非効率的で、費用がかかり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸コンジュゲートを合成するための経路として、以前の研究は、より高分子量の活性化されたＰＥＧの作製に向けて集中している。そのような分子を作製するための１つの方法では、活性化基を有する中心コアに１個より多くのＰＥＧが結合される分枝状の活性化ＰＥＧの形成が伴う。このようなより高分子量のＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）成分を、ＰＥＧの１つまたは複数を化合物上の反応性部位において他の化合物に結合するために活性化することができ、または、官能基成分に変換することができる。分枝状の活性化ＰＥＧは３つ以上の末端を有することになり、１個より多くの末端が活性化されている場合、そのような活性化されたより高分子量のＰＥＧ分子は本明細書中では多活性化ＰＥＧとして示される。いくつかの場合において、分枝状ＰＥＧ分子におけるすべての末端が活性化されるわけではない。分枝状ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化される場合、そのようなＰＥＧ分子は二活性化ＰＥＧとして示される。分枝状ＰＥＧ分子における末端の１つだけが活性化されるいくつかの場合、そのようなＰＥＧ分子は、単一活性化されているとして示される。この方法の一例として、反応のために続いて活性化される、２つのモノメトキシＰＥＧのリシンコアへの結合によって調製される活性化ＰＥＧが記載されている（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４−２２１，２００３）。

本発明は、多数のＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくはアプタマー）コンジュゲートの合成のための別の費用効果的な経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧにより連結された多量体オリゴヌクレオチド（例えば、二量体化アプタマー）を包含する。本発明はまた、安定化のためのＰＥＧ成分が、アプタマーの種々の部分を隔てるリンカーである高分子量組成物、例えば、高分子量アプタマー組成物の線状配置が、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）_ｎ（式中、ｎは１以上である）であるように、ＰＥＧが１つだけのアプタマー配列の内部でコンジュゲート化される高分子量組成物にも関連する。

本発明の高分子量組成物には、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有する高分子量組成物が含まれる。組成物は典型的には、分子量サイズが１０ｋＤａ〜８０ｋＤａの間である。本発明の高分子量組成物はサイズが少なくとも１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａまたは８０ｋＤａである。

安定化のための部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的性質および薬力学的性質を改善する分子または分子の一部分である。いくつかの場合において、安定化のための成分は、１個より多くのアプタマーまたはアプタマードメインを接近させるか、あるいは、本発明の高分子量アプタマー組成物の低下した全体的な回転自由度をもたらす分子または分子の一部分である。安定化のための成分は、線状または分枝状であり得るポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールなど）、ホモポリマーまたはヘテロポリマーが可能である。安定化のための他の成分には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが含まれる。オリゴヌクレオチドもまた安定化のための成分であり得る；そのようなオリゴヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドおよび／または改変された連結（例えば、ホスホロチオエートなど）を含むことができる。安定化のための成分はアプタマー組成物の構成部分であり得る。すなわち、安定化のための成分はアプタマーに共有結合的に結合される。

本発明の組成物には、１個より多くの核酸成分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール成分に共有結合によりコンジュゲート化される高分子量アプタマー組成物が含まれる。そのようなポリアルキレングリコール成分は安定化のための成分として役立つ。ポリアルキレングリコール成分がどちらかの末端でアプタマーに共有結合により結合され、その結果、ポリアルキレングリコールが１つの分子において複数の核酸成分を結び付けている組成物では、ポリアルキレングリコールは連結成分であると言われる。そのような組成物において、共有結合分子の一次構造は核酸−ＰＡＧ−核酸の線状配置を含む。一例が、核酸−ＰＥＧ−核酸の一次構造を有する組成物である。別の一例が核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の線状配置である。

核酸−ＰＥＧ−核酸コンジュゲートを作製するために、核酸が、１つだけの反応性部位を有するように（例えば、単一活性化されるように）最初に合成される。好ましい実施形態において、このような反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最後の工程として修飾剤のホスホルアミダイトを付加することによって５’末端に導入されたアミノ基である。修飾されたオリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、修飾されたオリゴヌクレオチドが、活性化ＰＥＧの自発的な加水分解を最小限に抑える溶液において高濃度で再構成される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成された溶液は２００ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ８．３）を含有する。コンジュゲートの合成が、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりした段階的な添加によって開始される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールがプロピオン酸スクシンイミジルによる誘導体化によって両方の末端で活性化される（二活性化される）。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートが、完全にコンジュゲート化された化学種、部分的にコンジュゲート化された化学種、および、コンジュゲート化されていない化学種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。連結された多数のＰＡＧ分子（例えば、ランダム共重合体またはブロック共重合体として連結された多数のＰＡＧ分子）、または、より小さいＰＡＧ鎖を、様々な長さ（または分子量）を達成するために連結することができる。非ＰＡＧリンカーを、様々な長さのＰＡＧ鎖との間で使用することができる。

２’−ＯＭｅ修飾、２’−フルオロ修飾および他の改変ヌクレオチド修飾はヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化させ、かつ、生体内でのその半減期を増大させる。３’−３’−ｄＴキャップまたは他のヌクレオチドキャップ、塩基性基またはアミン基はまた、エキソヌクレアーゼ抵抗性を増大させる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号、同第５，６６８，２６４号、同第６，２０７，８１６号および同第６，２２９，００２号を参照のこと（これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。

反応性核酸のＰＡＧ誘導体化
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧコンジュゲートを、モノ官能性の活性化ＰＥＧを、１個より多くの反応性部位を含有する核酸と反応することによって調製することができる。１つの実施形態において、核酸は二反応性であるか、または二活性化され、２つの反応性部位（従来のホスホルアミダイト合成によって、例えば、図４に例示されるような３’−５’−ジＰＥＧ化によってオリゴヌクレオチドに導入された５’−アミノ基および３’−アミノ基）を含有する。代わりの実施形態において、反応性部位は、例えば、第一級アミンを結合するための部位としてピリミジンの５位、プリンの８位またはリボースの２’位を使用して内部位置において導入することができる。そのような実施形態において、核酸は数個の活性化部位または反応性部位を有することができ、多重活性化されると言われる。合成および精製の後、改変されたオリゴヌクレオチドは、自発的な加水分解を最小限に抑えながら、オリゴヌクレオチドの反応性部位との選択的な反応を促進させる条件のもとで単一活性化ＰＥＧと一緒にされる。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧがプロピオン酸スクシンイミジルにより活性化され、カップリング反応がｐＨ８．３で行われる。二置換ＰＥＧの合成を行わせるために、化学量論的過剰なＰＥＧがオリゴヌクレオチドに対して供給される。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートが、完全にコンジュゲート化された化学種、部分的にコンジュゲート化された化学種、および、コンジュゲート化されていない化学種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。

連結ドメインはまた、連結ドメインに結合した１つまたは複数のポリアルキレングリコール成分を有することができる。そのようなＰＡＧは様々な長さが可能であり、組成物の所望する分子量を達成するために適切な組合せで使用することができる。

特定のリンカーの効果がその化学的組成および長さの両方によって影響され得る。長すぎるリンカー、短すぎるリンカー、あるいは、標的との好ましくない立体的相互作用および／またはイオン的相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと標的との間での複合体の形成を妨げる。核酸間の距離をまたぐために必要とされるよりも長いリンカーは、リガンドの有効濃度を減少させることによって結合安定性を低下させ得る。従って、多くの場合、アプタマーの標的親和性を最大にするためにリンカーの組成および長さを最適化することが必要である。

医薬組成物
本発明にはまた、本発明の改変されたアプタマーを含有する医薬組成物が含まれる。いくつかの実施形態において、組成物は体内使用のために好適であり、本発明の薬理学的に活性なアプタマーの効果的な量を単独で、あるいは、１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含む。本発明の化合物は、何らかの毒性がある場合でも、非常に低い毒性を有するという点で特に有用である。

本発明の組成物は、病変（例えば、疾患または障害など）を処置または防止するために、あるいは、患者におけるそのような疾患または障害の症状を緩和するために使用することができる。

本発明の組成物は、本発明のアプタマーが特異的に結合する標的に関連または由来する疾患または障害に苦しむ対象、あるいは、そのような疾患または障害に対する素因を有する対象への投与のために有用である。この方法では、病変に関与する標的（例えば、タンパク質）と結合するアプタマーまたはそのようなアプタマーを含む組成物を患者または対象に投与することが伴い、その結果、標的へのアプタマーの結合が標的の生物学的機能を変化させ、それにより、病変が処置される。

病変を有する患者または対象、すなわち、本発明の方法によって処置される患者または対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物、または、より具体的にはヒトであり得る。

実際には、アプタマーまたはその医薬的に許容され得る塩が、その所望される生物学的活性（例えば、アプタマー標的が標的の受容体に結合することを阻害すること）を発揮するために十分である量で投与される。

本発明の治療用組成物または薬理学的組成物は一般に、アプタマーの効果的な量を、医薬的に許容され得る媒体に溶解または分散されて含む。医薬的に許容され得る媒体またはキャリアには、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬用活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用はこの分野では広く知られている。補助的な有効成分もまた、本発明の治療用組成物に配合することができる。

医薬用組成物または薬理学的組成物の調製が、本開示に照らして当業者には理解される。典型的には、そのような組成物は、注射剤（液体の溶液または懸濁物のいずれかであっても）として；注射に先だって液体への溶解または懸濁に好適な固体形態として；経口投与用の錠剤または他の固形物として；徐放性カプセルとして；あるいは、点眼薬、クリーム、ローション、膏薬および吸入剤などを含む、現在使用されている任意の他の形体で調製することができる。手術分野における特定の領域を処置するための、外科医、内科医または医療従事者による無菌配合物（例えば、生理的食塩水に基づく洗浄液など）の使用もまた特に有用であり得る。組成物はまた、マイクロデバイス、マイクロ粒子またはスポンジを介して送達することができる。

配合されると、治療剤は、投薬配合物と適合し得る様式で、かつ、薬理学的に効果的であるような量で投与される。配合物は様々な投薬形態物（例えば、上記で記載された注射剤溶液のタイプなど）で容易に投与され、しかし、薬物放出カプセルなどもまた用いることができる。

これに関連して、投与される有効成分の量および組成物の体積は、処置される宿主動物に依存する。投与のために必要とされる活性な化合物の正確な量は医師の判断に依存し、かつ、それぞれの個体に対して特有である。

活性な化合物を分散させるために要求される最少体積の組成物が典型的には利用される。好適な投与形態はまた変更可能であり、しかし、最初に化合物を投与し、その結果をモニターし、その後、さらなる間隔でさらなる制御された用量を与えることによって類型化される。

医薬組成物は滅菌することができ、かつ／または、補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤化剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／あるいは緩衝剤など）を含有することができる。加えて、医薬組成物はまた、他の治療的に有益な物質を含有することができる。医薬組成物は、混合、造粒または被覆の従来の方法に従って調製され、典型的には約０．１％〜７５％（好ましくは約１％〜５０％）の有効成分を含有する。

液体、特に、注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製することができる。活性な化合物を医薬的に純粋な溶媒（例えば、水、生理的食塩水、デキストロース水溶液、グリセロールおよびエタノールなど）に溶解するか、または、医薬的に純粋な溶媒（例えば、水、生理的食塩水、デキストロース水溶液、グリセロールおよびエタノールなど）と混合して、それにより、され注射可能な溶液または懸濁物を形成する。加えて、注射に先だって液体に溶解するために好適な固体形態を配合することができる。

本発明の化合物は、静脈内形態（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態または筋肉内形態で投与することができ、これらのすべてが、医薬分野の当業者には広く知られている形態を使用する。注射剤を液体の溶液または懸濁物のいずれかとして従来の形態で調製することができる。

非経口注射剤の投与が一般には、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。加えて、非経口投与のための１つの方法では、米国特許第３，７１０，７９５号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って、一定レベルの投薬量が維持されることを保証する徐放性システムまたは持続性システムの埋め込みが用いられる。

さらに、本発明のための好ましい化合物は、好適な鼻腔内デバイスの局所的な使用による鼻腔内形態（吸入剤）で投与することができ、または、当業者には広く知られている経皮パッチのそのような形態を使用して経皮経路を介して投与することができる。経皮送達システムの形態で投与されるために、投薬は、当然のことではあるが、投与計画期間中を通して断続的ではなく、むしろ連続的である。他の好ましい局所用調製物には、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが含まれ、この場合、有効成分の濃度は典型的には０．０１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。

固体組成物については、賦形剤には、医薬用規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムなどが含まれる。上記で規定された活性な化合物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）をキャリアを使用して、坐薬として配合することができる。いくつかの実施形態において、坐薬は脂肪のエマルションまたは懸濁物から都合良く調製される。

本発明の化合物はまた、リポソーム送達システムの形態で、例えば、小さい単層ベシクル、大きい単層ベシクルおよび多層ベシクルなどで投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する様々なリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態では、脂質化合物の薄膜が、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物を包む脂質層を形成させるために、薬物の水溶液により水和される。例えば、本明細書中に記載されるアプタマー分子が、この分野で知られている方法を使用して構築された、親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。加えて、リポソームは、標的化し、かつ、細胞殺傷を媒介するための細胞毒性剤を内部に運搬するために、その表面にアプタマーを有することができる。核酸に関連した複合体の一例が米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。

本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングすることができる。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール、または、パルミトイル残基により置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御された放出を達成することにおいて有用な一群の生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、および、ヒドロゲルの架橋ブロック共重合体または両親媒性ブロック共重合体）にカップリングすることができる。

所望されるならば、投与される医薬組成物はまた、微量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤化剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤および他の物質（例えば、酢酸ナトリウムおよびトリエタノールアミンオレアートなど）など）を含有することができる。

アプタマーを利用する投薬レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置される疾患の重篤度；投与経路；患者の腎臓機能および肝臓機能；ならびに用いられる具体的なアプタマーまたはその塩を含む様々な要因に従って選択される。通常の技能を有する医師または獣医は、状態の進行を防止または阻止または停止させるために要求される薬物の効果的な量を容易に決定および処方することができる。

本発明の経口投薬量は、示された効果のために使用されるとき、約０．０５ｍｇ／日（経口）〜７５００ｍｇ／日（経口）の範囲である。本発明の組成物は好ましくは、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの有効成分を含有する刻み目付き錠剤の形態で提供される。注入投薬量、鼻腔内投薬量および経皮投薬量は０．０５ｍｇ／日〜７５００ｍｇ／日の範囲である。皮下投薬量、静脈内投薬量および腹腔内投薬量は０．０５ｍｇ／日〜３８００ｍｇ／日の範囲である。本発明の化合物の効果的な血漿中レベルは０．００２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。本発明の化合物は１日１回の服用量で投与することができ、または、１日の総投薬量を１日２回または３回または４回の分割された服用量で投与することができる。

本明細書中に引用されているすべての刊行物および特許文書は、それぞれのそのような刊行物または文書が、参考として本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように参考として本明細書中に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、いずれかが関連の先行技術であることを認めるものとして意図されず、また、その内容または日付に関して何らかの承認をなすものではない。本発明は文書による説明によってこれまで記載されているので、当業者は、本発明が様々な実施形態で実施され得ることを認識し、また、前記の説明および下記の実施例が、下記の請求項の限定ではなく、例示のためであることを認識する。

異なるタンパク質標的に対する大きい親和性および特異性をそれぞれが有する３つのアプタマー（ＡＲＣ９７９、ＡＲＣ４４５およびＡＲＣ１１７２）をＳＥＬＥＸ^ＴＭ法に従って同定し、最小化した。ＡＲＣ９７９（配列番号１）は、２’−デオキシプリンおよび２’−ＯＭｅピリミジンを含有する、ＩＬ−２３に対する３４ヌクレオチドのアプタマー（「ｄＲｍＹ」組成物）であり、下記の配列を有する：

ＡＲＣ４４５（配列番号２）は、２’−デオキシプリンおよび２’−ＯＭｅピリミジンを含有する、ＩｇＥに対する２３ヌクレオチドのアプタマー（「ｄＲｍＹ」組成物）であり、下記の配列を有する：

ＡＲＣ１１７２（配列番号３）は、フォンウィルブラント因子（「ｖＷＦ」）に対する４１ヌクレオチドのＤＮＡアプタマーであり、下記の配列を有する：

アプタマー医薬品化学を、下記に記載されるように、ＡＲＣ９７９、ＡＲＣ４４５およびＡＲＣ１１７２に適用し、それらのそれぞれの親アプタマーまたは出発アプタマーと比較して優れた特性を有する誘導体アプタマーを得た。

本明細書中に記載されるアプタマーの、それらのそれぞれの標的に対する結合親和性を、アプタマー標的解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定を可能にするドットブロット結合アッセイを使用して測定した。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２ＰＡＴＰで５’末端標識し、標的タンパク質の希釈系列と一緒にし、下記に記載される結合反応条件のもとで室温において３０分間インキュベーションした。結合反応液を、Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ｉドットブロット９６ウエル真空ろ過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を使用するニトロセルロースでのろ過によって分析した。３層のろ過媒体を使用し、これは、（下から上に）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧＢ００２ゲルブロットペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）からなった。タンパク質に結合しているＲＮＡがニトロセルロースフィルターに捕捉され、これに対して、タンパク質に結合していないＲＮＡがナイロンフィルターに捕捉される。ゲルブロットペーパーは、それ以外のフィルターのための支持媒体として単に含まれた。ろ過後、フィルター層を分離し、乾燥し、蛍光スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にさらし、Ｓｔｏｒｍ８６０Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロット画像化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量した。

実施例１：ホスホロチオエート置換による増大したアプタマー標的親和性
実施例１Ａ：抗ＩＬ−２３アプタマーのＡＲＣ９７９におけるホスホロチオエート置換
１つだけのホスホロチオエート置換（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を取り込む１組のＡＲＣ９７９（配列番号１）誘導体アプタマーを標準的な合成技術によって化学合成した。各組の誘導体において、１つだけのホスホロチオエート置換をそれぞれのヌクレオチド間連結位置において系統的に導入し、ホスホロチオエート置換が異なるヌクレオチド間位置に存在するアプタマーを有する１組内のそれぞれの誘導体を得た。これらの誘導体をゲル精製し、上記で記載されたドットブロットアッセイを下記の結合反応条件のもとで使用してＩＬ−２３結合についてアッセイした：１ＸＰＢＳ（Ｃａ^＋＋またはＭｇ^＋＋を含まない）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、室温で３０分間のインキュベーション。ＡＲＣ９７９誘導体の結合については、全長ヒトＩＬ−２３の濃度に対して結合したアプタマー割合を、下記の式をデータに対して近似することによってＫ_Ｄを計算するために使用した：
結合アプタマー割合＝大きさ＊（［ＩＬ−２３］／（Ｋ_Ｄ＋［ＩＬ−２３］））＋バックグラウンド結合。

ＡＲＣ９７９における１つだけのホスホロチオエート置換の含有は、出発アプタマーＡＲＣ９７９の結合親和性と比較したとき、ほとんど位置で結合親和性に悪影響を及ぼさなかった（すなわち、著しくより大きいＫ_Ｄ値をもたらす）。６つの位置での２つのヌクレオチドの間でのヌクレオチド間結合における（表１および図５に示されるような）ホスホロチオエート点置換は、改善された標的結合親和性（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）をもたらした。

親のＡＲＣ９７９と比較して増大した親和性を示す、ホスホロチオエートが１つだけのＡＲＣ９７９誘導体についてのヌクレオチド配列が表１に示される。別途記されない限り、表１に示された配列のそれぞれは５’から３’の方向である。いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表１に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、下記の表１に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠けている場合には、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「ｓ」はヌクレオチド間のホスホロチオエート置換を意味する。

実施例１Ｂ：抗ｖＷＦアプタマーにおけるホスホロチオエート置換
１つだけのホスホロチオエート置換（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を取り込む１組のＡＲＣ１１７２（配列番号３）誘導体アプタマーを、標準的な合成技術を使用して化学合成した。各組の誘導体において、１つだけのホスホロチオエート置換をそれぞれのヌクレオチド間連結位置において系統的に導入し、ホスホロチオエート置換が異なるヌクレオチド間位置に存在するアプタマーを有するそれぞれの誘導体組を得た。これらの誘導体をゲル精製し、上記で記載されたドットブロットアッセイを下記の結合反応条件のもとで使用してｖＷＦ結合についてアッセイした：０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む１ＸダルベッコＰＢＳ緩衝液、および、標識されたアプタマーとの２４℃で３０分間のインキュベーション。ＡＲＣ１１７２誘導体アプタマーについてのＫ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

ＡＲＣ１１７２誘導体アプタマーにおける１つだけのホスホロチオエート置換の系統的な含有は、親のＡＲＣ１１７２と比較して、ほとんど位置で結合親和性に悪影響を及ぼさず、また、改善された（すなわち、より低い）Ｋ_Ｄ値を有する１つのアプタマーをもたらした。表２に示されるように、２１位のＧと、２２位のＴとの間での１つだけのホスホロチオエート置換は、親分子のＡＲＣ１１７２に対して親和性における測定可能な改善（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）を示した構築物をもたらした。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表２に記載されるように、γ−^３２Ｐ核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表２に記載されるアプタマーの核酸配列は、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表２に記載されるアプタマーの核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字「ｄ」は２’−デオキシ修飾を意味し、「ｓ」はヌクレオチド間のホスホロチオエート置換を意味する。

安定化のための２’−ＯＭｅ置換を含めて多数の改変をＡＲＣ１１７２（配列番号３）において行って、ＡＲＣ１３６１（配列番号１２）に到達した。ＡＲＣ１３６１（配列番号１２）は、それぞれがホスホロチオエート置換を異なる位置に有する１９個のホスホロチオエート置換されたＡＲＣ１３６１誘導体の１組をもたらした１つだけのホスホロチオエートホスファート骨格改変を導入するための基礎配列として役立った。下記の表３から認められ得るように、ＡＲＣ１３６１に到達するためにＡＲＣ１１７２に導入された多数の置換は結合親和性を約４倍低下させた。１つだけのホスホロチオエート置換は、ＡＲＣ１３６８（配列番号１３）の結合親和性を、ＡＲＣ１３６１（配列番号１２）出発アプタマーに対して４倍を超えて増大させ、親のＡＲＣ１１７２（配列番号３）アプタマーの結合親和性にほぼ匹敵した。

実施例２：イノシン置換による増大したアプタマー標的親和性
実施例２Ａ：抗ＩｇＥアプタマーのＡＲＣ１３３５における２’−デオキシイノシン置換
ＡＲＣ１３３５（配列番号１４）誘導体の結合親和性に対する、プリン残基をイノシンで置換することの影響を、親のＡＲＣ１３３５分子と比較して、２’−デオキシイノシン（ｄＩ）による２’−デオキシプリン残基の系統的な置換のときに調べた。ＡＲＣ１３３５は、ＡＲＣ４４５の１位、２位、７位、１０位、１４位および１７位のヌクレオチド位における２’−デオキシプリン残基の代わりに２’−ＯＭｅ置換を含有するＡＲＣ４４５誘導体である。各２’−デオキシグアノシンを２’−デオキシイノシンで１つずつ置換する１組のアプタマー誘導体を合成し、以前に記載されたドットブロットアッセイおよび結合反応条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、室温で３０分間）を使用して結合について調べて、２’−デオキシイノシン置換が、ヒトＩｇＥについての親和性、従って、効力を改善するかどうかを調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

ＡＲＣ１３３５誘導体のｄＩ系列において、置換は６位〜９位で結合親和性に悪影響を及ぼし（すなわち、Ｋ_Ｄ値を増大させ）、一方で、１６位〜２１位では中程度〜非常に良く許容された（すなわち、同じＫ_Ｄ値または低下したＫ_Ｄ値）。下記の表３から認められ得るように、ｄＩ系列からの結果は多数の構築物（ＡＲＣ１５６２、ＡＲＣ１５６４およびＡＲＣ１５６６）をもたらし、これらは、ＡＲＣ１３３５（親アプタマー）の場合のように両方の２’−ＯＭｅ置換によってもたらされる改善された結合親和性に対してほぼ同一の親和性（ＡＲＣ１５６２およびＡＲＣ１５６４）および改善された親和性（ＡＲＣ１５６６）を有し、また、最初のアプタマーＡＲＣ４４５（配列番号２）に対して非常に改善された親和性を有していた。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表４に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表４に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠けている場合には、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表４に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「Ｉ」はグアノシンに代わるイノシン置換を意味する。

実施例２Ｂ：抗ＩＬ−２３アプタマーのＡＲＣ９７９における２’−デオキシイノシン置換
ＡＲＣ９７９（配列番号１）誘導体の結合親和性に対する、プリン残基をイノシンで１つずつ置換することの影響を、親のＡＲＣ９７９分子と比較して、２’−デオキシイノシン（ｄＩ）による２’−デオキシプリン残基の系統的な置換のときに調べた。ＡＲＣ９７９の各グアノシンが２’−デオキシイノシンで１つずつ置換された１組のアプタマー誘導体、および、各アデノシンが２’−デオキシイノシンで１つずつ置換された１組のアプタマー誘導体を合成し、結合について調べた。以前に記載されたドットブロット結合アッセイを使用して、合成された誘導体アプタマーの相対的な結合親和性を特徴づけ、また、それぞれを同じ結合アッセイにおいて親分子のＡＲＣ９７９と同時に比較した。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識し、以前に記載された緩衝液条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、室温で３０分間）でのドットブロット結合アッセイにおけるタンパク質力価測定を使用して全長ヒトＩＬ−２３に対する直接的な結合について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

ＡＲＣ９７９の場合、２’−デオキシイノシンによる２’−デオキシグアノシンの系統的な置換は結合親和性に悪影響を及ぼさず、それにもかかわらず、結合親和性を顕著には改善しなかった。しかしながら、２’−デオキシイノシンによる２’−デオキシアデノシンの系統的な置換は、下記の表５における計算されたＫ_Ｄ値から認められ得るように、ＡＲＣ９７９の親和性と比較したとき、改善された親和性（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）を有する２つの構築物（ＡＲＣ１６５２およびＡＲＣ１６５４）をもたらした。

別途示されない限り、表５における配列は５’から３’の方向で示される。いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表５に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表５に記載されるアプタマーの核酸配列は、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「Ｉ」はアデノシンに代わるイノシン置換を意味する。

実施例２Ｃ：抗ＩＬ−２３アプタマーのＡＲＣ１３８６における２’−ＯＭｅイノシン置換
ＡＲＣ１３８６（３’逆転したｄＴを有するＡＲＣ９７９）は、２’−ＯＭｅ置換を特定の位置で許容することが以前に示された。ＡＲＣ１３８６における２’−ＯＭｅ残基を２’−ＯＭｅイノシン残基（ｍＩ）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）で系統的に置換して、２’−ＯＭｅイノシン置換をそれぞれの異なる２’−ＯＭｅ残基において有する１組の化学合成された誘導体アプタマーを得た。結合親和性に対する２’−ＯＭｅイノシン置換の影響を、ドットブロット結合アッセイを使用して明らかにした。

前記で記載されたドットブロット結合アッセイを使用して、合成されたアプタマーの相対的な効力を、親分子のＡＲＣ１３８６と比較して特徴づけた。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２ＰＡＴＰで５’末端標識し、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを伴うダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）でのドットブロット結合アッセイにおけるタンパク質力価測定を使用して全長ヒトＩＬ−２３に対する直接的な結合について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

２つの場合において、２’−ＯＭｅイノシンによる２’−ＯＭｅウリジンの１回だけの置換は、親分子のＡＲＣ１３８６と比較して、改善された結合親和性（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）をもたらした。親アプタマーをそれぞれのドットブロット結合アッセイにおいて操作した。２’−ＯＭｅイノシンにより結合親和性がＡＲＣ１３８６に対して改善された構築物の配列および対応する結合親和性が下記の表６に示される。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表６に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表６に記載されるアプタマーの核酸配列は、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表６に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「Ｉ」はイノシン置換を意味する。

実施例３：２’−デオキシジヒドロウリジン置換による増大したアプタマー標的親和性
ＡＲＣ１３８６（３’逆転したｄＴを有するＡＲＣ９７９）誘導体の結合親和性に対する、２’−ＯＭｅウリジン残基を２’−デオキシジヒドロウリジン（ｄｈＵ）で系統的に置換することの影響を、親のＡＲＣ１３８６分子と比較して、調べた。２’−ＯＭｅウリジン残基を２’−デオキシジヒドロウリジン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）で系統的に置換して、ＡＲＣ１３８６における異なる２’−ＯＭｅウリジン位置で置換された２’−デオキシジヒドロウリジンをそれぞれが有する１組の化学合成された誘導体アプタマーを得た。

以前に記載されたドットブロット結合アッセイを使用して、合成された誘導体アプタマーの大部分の相対的な効力を、親分子のＡＲＣ１３８６と比較して特徴づけた。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識し、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを伴うダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）でのドットブロット結合アッセイにおけるタンパク質力価測定を使用して全長ヒトＩＬ−２３に対する直接的な結合について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

２’−デオキシジヒドロウリジン置換により結合親和性がＡＲＣ１３８６に対して改善された構築物の配列および対応する結合親和性が下記の表７に示される。表７において認められるように、２’−ＯＭｅウリジンの２’−デオキシジヒドロウリジンへの１回だけの置換は、親分子のＡＲＣ１３８６と比較したとき、結合親和性を改善した（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表７に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表７に記載されるアプタマーの核酸配列は、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表７に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」、「ｄ」および「ｄｈ」は、２−ＯＭｅ修飾、２’−デオキシ修飾およびジヒドロ２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味する。

実施例４：２’−デオキシ置換による増大したアプタマー標的親和性
１組のＡＲＣ４４５誘導体を、２’−ＯＭｅピリミジンを２’−デオキシ残基で系統的に置換することによって作製した。この２’−デオキシ系列を、前記に記載されたドットブロットアッセイおよび結合反応条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、室温で３０分間）を使用してヒトＩｇＥに対する結合について調べた。２’−デオキシ残基を安定化のための２’−ＯＭｅ残基の代わりに導入することにより、結合親和性が、１つの誘導体では親分子のＡＲＣ４４５に対して改善された。２’−デオキシ置換により結合親和性がＡＲＣ４４５に対して改善された構築物の配列および対応するＫ_Ｄ値が下記の表８に示される。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表８に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表８に記載されるアプタマーの核酸配列は、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味する。

実施例５：ＡＲＣ１３３５における組み合わされた２’−デオキシイノシン置換による増大した結合親和性
ＡＲＣ１３３５に基づく１組の誘導体を、イノシン置換を許容すること（例えば、上記の実施例２Ａを参照のこと）が以前に示されていたＡＲＣ１３３５において１個より多くの位置での２’−デオキシイノシン置換を組み合わせることによって作製した。多重置換されたＡＲＣ１３３５誘導体を、前記に記載されたドットブロットアッセイおよび結合反応条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、室温で３０分間）においてヒトＩｇＥに対する結合親和性について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

下記の表９から認められ得るように、１４位および２０位での２’−デオキシイノシン置換を組み合わせることにより、結合親和性が、ＡＲＣ１３３５（イノシン置換を有しない）、ＡＲＣ１５６６（２０位での１つだけのイノシン置換）およびＡＲＣ１５６０（１４位での１つだけのイノシン置換）に対して改善された。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表８に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表９に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠けている場合には、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表９に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転した２’−デオキシチミジンキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「Ｉ」はイノシン修飾を意味する。

実施例６：ＡＲＣ４４５における組み合わされたホスホロチオエート置換による増大した結合親和性
ＡＲＣ４４５に基づく１組の誘導体を、ホスホロチオエート置換を許容することが以前に明らかにされていたＡＲＣ４４５において１個より多くの位置でのホスホロチオエート置換を組み合わせることによって化学合成した。多重置換されたＡＲＣ４４５誘導体を、前記に記載されたドットブロットアッセイおよび結合反応条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、室温で３０分間）においてヒトＩｇＥに対する結合親和性について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

下記の表９から認められ得るように、いくつかの位置でのホスホロチオエート置換を組み合わせることにより、結合親和性がＡＲＣ４４５およびいくつかのその対応する一置換位置に対して改善された。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表１０に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表１０に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠けている場合には、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表１０に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転した２’−デオキシチミジンキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−ＯＭｅ修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「ｓ」はホスホロチオエート置換を意味する。

実施例７：ＡＲＣ１３３５における組み合わされた２−アミノプリン置換による増大した結合親和性
２−アミノプリン置換をそれぞれの異なるＡまたはＧにおいて有する１組のＡＲＣ１３３５の一置換誘導体を合成した。２−アミノプリン置換の組合せを、２−アミノプリン置換が許容された位置を組み合わせて合成した。２−アミノプリン置換を多数の位置に有するＡＲＣ１３３５誘導体を、前記に記載されたドットブロットアッセイおよび結合反応条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、室温で３０分間）においてヒトＩｇＥに対する結合親和性について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

下記の表１１から認められ得るように、１位、８位および１４位での個々の２−アミノプリン置換はそれぞれが、出発アプタマーＡＲＣ１３３５（２’−アミノプリン置換を有しない）を上回る結合親和性の低下（すなわち、より大きいＫ_Ｄ値）をもたらした。しかしながら、８位および１４位での２’−アミノプリン置換の組合せは、８位および１４位での個々の置換と比較して増大した結合親和性（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）をもたらし、ＡＲＣ１３３５の結合親和性と同一の結合親和性をもたらした。さらに、１位、８位および１４位での２’−アミノプリン置換の組合せは、１位、８位および１４位での個々の置換と比較して結合親和性の増大（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）をもたらし、出発アプタマーＡＲＣ１３３５の結合親和性を上回る著しく改善された結合親和性をもたらした。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表１１に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表１１に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠けている場合には、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表１１に記載される核酸配列は、示された３’キャップ（例えば、３’逆転した２’−デオキシチミジンキャップ（３Ｔ））を有しない。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−Ｏ−メチル修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「ｍＡＰ」は２’−ＯＭｅ−２−アミノプリン置換を意味し、「ｄＡＰ」は２’−デオキシ−２−アミノプリン置換を意味する。

実施例８：組み合わされた２’−デオキシ−５−メチルシチジン置換による増大したアプタマー標的親和性
２’−ＯＭｅシチジンが２’−デオキシ−５−メチルシチジン（５ｍＣ）残基（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）で系統的に置換された一連のＡＲＣ４４５誘導体を設計し、合成した。得られた１組の各アプタマーは５ｍＣ置換をＡＲＣ４４５において異なる２’−ＯＭｅ位置に含んでいた。この系列から得られたデータに基づいて、個々の５ｍＣ置換が結合親和性に対して悪影響をほとんど有しなかった１個より多くの位置において５ｍＣ残基の組合せが置換された第２の１組のＡＲＣ４４５誘導体を設計した。

これらの５ｍＣ系列を、前記に記載されたドットブロットアッセイを使用してヒトＩｇＥに対する結合について調べた。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識し、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを伴うダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含む）におけるタンパク質力価測定を使用してヒトＩｇＥに対する直接的な結合について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

下記の表１２から認められるように、２’−ＯＭｅシチジンを、３位、１１位および２２位において個々の５ｍＣ置換で置換することにより、結合親和性におけるわずかな変化〜無変化がもたらされた。しかしながら、これらの個々の５ｍＣ置換の２つの組合せおよび３つの組合せは結合親和性の改善（すなわち、より低いＫ_Ｄ値）をもたらした。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表１２に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表１２に記載されるアプタマーの核酸配列は、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−ＯＭｅ修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「５ｍ」は２’−デオキシ−５−メチル修飾を意味する。

実施例９：組み合わされた２’−デオキシ−５−メチルシチジン置換および２’−デオキシシチジンによる増大したアプタマー標的親和性
ＡＲＣ４４５の３位、１１位および２２位における２’−デオキシ−５−メチルシチジン（５ｍＣ）置換（上記の実施例８に記載される）の組合せを、ｄＣ置換が十分に許容されることが以前に明らかにされた位置（ＡＲＣ４４５の１２位および２２位、実施例４を参照のこと）において、２’−ＯＭｅシチジン残基に代わる２’−デオキシシチジン残基（ｄＣ）の１つまたは複数の置換と組み合わせた一連のＡＲＣ４４５誘導体を設計し、合成した。

これらの誘導体を、前記に記載されたドットブロットアッセイを使用してヒトＩｇＥに対する結合について調べた。Ｋ_Ｄの決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識し、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを伴うダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含む）におけるタンパク質力価測定を使用してヒトＩｇＥに対する直接的な結合について調べた。Ｋ_Ｄ値を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔの式を近似することによって計算した。

下記の表１３から認められ得るように、ＡＲＣ４４５の３位、１１位および２２位における１つまたは複数の２’−デオキシ−５−メチルシチジン置換の様々な組合せは、ＡＲＣ４４５の１２位または２２位における１つまたは複数の２’−デオキシシチジン置換と組み合わされたとき、結合親和性に悪影響を及ぼさず、結合親和性が中程度に改善された（すなわち、より低いＫ_Ｄ値の）構築物をいくつかもたらした。

いくつかの実施形態において、本発明は、下記の表１３に記載されるような核酸配列を伴うアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、表１３に記載されるアプタマーの核酸配列は、３’キャップ（例えば、逆転したｄＴキャップ（３Ｔ））、ならびに／あるいは、化学的カップリング、および／または、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲート化を容易にするための５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。小文字の「ｍ」および「ｄ」は２−ＯＭｅ修飾および２’−デオキシ修飾をそれぞれ意味し、「５ｍ」は２’−デオキシ−５−メチルシチジン修飾を意味し、「ｄＣ」は２’−デオキシシチジン修飾を意味する。

本発明がこれまで文書による説明および実施例によって記載されているので、当業者は、本発明が様々な実施形態で実施され得ることを認識し、また、上記の説明および実施例が、下記の請求項の限定ではなく、例示のためであることを認識する。

図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの試験管内アプタマー選抜（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）プロセスの概略図である。 図２は、４０ｋＤａの枝分かれＰＥＧの例示である。 図３は、アプタマーの５’末端に結合した４０ｋＤａの枝分かれＰＥＧの例示である。 図４は、標準的なモノＰＥＧ化、多重ＰＥＧ化、および、ＰＥＧ化を介したオリゴマー化を表す様々なＰＥＧ化方法を示す例示である。 図５は、ヒトＩＬ−２３の濃度に対して結合した示されたアプタマーの割合（縦軸）を示すグラフである。

Claims (61)

1. 置換された一本鎖アプタマーを同定する方法であって、
   ａ）一本鎖アプタマー内のヌクレオチド間連結位置においてリン酸基をホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートに置換する工程；
   ｂ）置換された一本鎖アプタマーを標的親和性についてアッセイする工程；および
   ｃ）ホスホロチオエート置換を有しないこと以外は改変された一本鎖アプタマーと同一である出発アプタマーの標的親和性と比較して増大した標的親和性を有する置換された一本鎖アプタマーを同定する工程
   を含む、方法。
2. 前記置換する工程がさらに、ホスホロチオエートを化学合成によってヌクレオチド間連結位置において取り込むことを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記置換する工程が、前記ホスホロチオエート置換を一本鎖アプタマーの３’末端または５’末端における２つのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結において取り込むことを含まない、請求項２に記載の方法。
4. 前記置換する工程が、１つだけのホスホロチオエート置換を一本鎖アプタマーに取り込むことを含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記置換された一本鎖アプタマーが、出発アプタマーの標的結合親和性よりも少なくとも２倍大きい標的結合親和性を含む、請求項４に記載の方法。
6. 請求項５に記載の方法によって同定される置換された一本鎖アプタマー。
7. 前記置換された一本鎖アプタマーにさらなる置換を取り込んで、２回置換された一本鎖アプタマーを得る工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
8. 前記２回置換された一本鎖アプタマーを標的親和性についてアッセイすること、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する前記２回置換された一本鎖アプタマーを同定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記２回置換された一本鎖アプタマーを標的親和性についてアッセイすること、および、前記ホスホロチオエート置換された一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する前記２回置換された一本鎖アプタマーを同定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
10. 請求項９に記載の方法によって同定される２回置換された一本鎖アプタマー。
11. 前記さらなる置換が、第１のホスホロチオエート置換のリン酸基位置とは異なるリン酸基位置におけるさらなるホスホロチオエート置換である、請求項７に記載の方法。
12. 前記さらなる置換が、塩基の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、糖の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドに置換することからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
13. 前記さらなる置換が、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記さらなる置換が、２’−デオキシイノシンまたは２’−ＯＭｅイノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 置換されたアプタマーを同定する方法であって、
    ａ）イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される置換を出発アプタマーに取り込む工程；
    ｂ）置換されたアプタマーを標的親和性についてアッセイする工程；および
    ｃ）置換されたヌクレオチドを有しないこと以外は置換されたアプタマーと同一である出発アプタマーの標的親和性と比較して増大した標的親和性を有する置換されたアプタマーを同定する工程
    を含む、方法。
16. 前記取り込む工程がさらに、前記置換を化学合成によって出発アプタマーに取り込むことを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記同定された置換されたアプタマーが一本鎖である、請求項１６に記載の方法。
18. 第１の置換とは異なるタイプであるさらなる置換を前記置換されたアプタマーに取り込んで、２回置換されたアプタマーを得る工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
19. 前記２回置換されたアプタマーを標的親和性についてアッセイすること、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する前記２回置換されたアプタマーを同定することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記２回置換されたアプタマーを標的に対する親和性についてアッセイすること、および、前記置換されたアプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する前記２回置換されたアプタマーを同定することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記さらなる置換が、塩基の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、糖の位置で改変されたヌクレオチドに置換すること、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドに置換することからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記さらなる置換が、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによるヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択され、かつ、該さらなる置換が第１の置換とは異なる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記さらなる置換が、２−デオキシイノシンまたは２’−ＯＭｅイノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
24. 前記置換されたアプタマーに、前記第１の置換と同じタイプではあるが、異なるヌクレオチド位置に存在するさらなる置換を取り込んで、２回置換されたアプタマーを得ることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
25. 前記２回置換されたアプタマーを標的親和性についてアッセイすること、および、出発した非置換の一本鎖アプタマーおよび／または前記置換されたアプタマーの親和性と同等以上の親和性を有する前記２回置換されたアプタマーを同定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項２４に記載の方法によって同定される２回置換されたアプタマー。
27. 前記取り込む工程が、イノシンにより別のヌクレオチドを置換することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
28. 前記イノシン置換されたアプタマーが、出発した非置換アプタマーの結合親和性よりも少なくとも２倍大きい結合親和性を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記取り込む工程が、２’−デオキシヌクレオチドにより２’−ＯＭｅヌクレオチドを置換することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
30. 前記２’−デオキシ置換されたアプタマーが、出発した非置換アプタマーの結合親和性よりも少なくとも２倍大きい結合親和性を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 第１の置換が、２’−デオキシによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換であり、かつ、前記さらなる置換がイノシンによる置換である、請求項２０に記載の方法。
32. 前記２回置換された一本鎖ホスホロチオエートアプタマーが、出発した非置換アプタマーおよび／または前記置換されたアプタマーよりも少なくとも２倍大きい結合親和性を含む、請求項１２に記載の方法。
33. ホスホロチオエート置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、１個以下のホスホロチオエート骨格置換を含む一本鎖アプタマー。
34. １個以下のさらなるホスホロチオエート置換を含む、請求項３３に記載の一本鎖アプタマー。
35. ２個以下のさらなるホスホロチオエート置換を含む、請求項３４に記載の一本鎖アプタマー。
36. ３個以下のさらなるホスホロチオエート置換を含む、請求項３５記載の一本鎖アプタマー。
37. 塩基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、糖の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換からなる群から選択されるさらなるヌクレオチド置換をさらに含み、かつ、前記置換されたヌクレオチドがリン酸基位置での改変を含むときには、該さらなるヌクレオチド置換はホスホロチオエート置換ではない、請求項３３に記載の一本鎖アプタマー。
38. 前記さらなるヌクレオチド置換が、リン酸基の位置でのホスホロジチオエート置換、イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルヌクレオチドによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換、２’−ＯＭｅヌクレオチドによる２’−デオキシヌクレオチドの置換、および、２−アミノプリンによるプリンの置換からなる群から選択される、請求項３７に記載の一本鎖アプタマー。
39. イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択されるヌクレオチド置換を含み、かつ、ヌクレオチド置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、一本鎖アプタマー。
40. イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される少なくとも２つのヌクレオチド置換を含み、かつ、２回置換された一本鎖アプタマーが、前記少なくとも２つのヌクレオチド置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、請求項３９に記載の一本鎖アプタマー。
41. イノシンによる別のヌクレオチドの置換、２’−デオキシジヒドロウリジンによるウリジンの置換、２’−デオキシ−５−メチルシチジンによるシチジンの置換、２−アミノプリンによるプリンの置換、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される少なくとも３つのヌクレオチド置換を含み、かつ、３回置換された一本鎖アプタマーが、前記少なくとも３つのヌクレオチド置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、請求項３９に記載の一本鎖アプタマー。
42. 前記２回置換された一本鎖アプタマーが、前記ヌクレオチド置換のうちの１つを有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、請求項４０に記載の一本鎖アプタマー。
43. 前記３回置換された一本鎖アプタマーが、前記ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つを有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、請求項４１に記載の一本鎖アプタマー。
44. 前記ヌクレオチド置換が、２’−デオキシヌクレオチドにより２’−ＯＭｅヌクレオチドを置換することである、請求項３９に記載の一本鎖アプタマー。
45. 前記ヌクレオチド置換が、イノシンによりプリンを置換することである、請求項３９に記載の一本鎖アプタマー。
46. ホスホロチオエート改変を有しないこと以外は同じヌクレオチド配列を有する第２のアプタマーの標的結合親和性と比較してアプタマーの標的結合親和性を増大させるために選択されたある位置でのリン酸基骨格のホスホロチオエート改変を有するヌクレオチド配列を含む、標的に特異的に結合するアプタマー。
47. アプタマーを安定化させる方法であって、
    ａ）所定の標的結合親和性を有する出発アプタマーに安定化する改変を導入して、改変されたアプタマーを得る工程、
    ｂ）改変されたアプタマーを標的結合親和性についてアッセイする工程
    を含み、この場合、該結合親和性は、ヌクレオチド置換を取り込ん置換されたアプタマーをもたらす出発アプタマーの結合親和性よりも小さく、該ヌクレオチド置換は、該改変されたアプタマーの標的結合親和性よりも大きい標的結合親和性を有する置換されたアプタマーをもたらす、方法。
48. 前記置換されたアプタマーが、出発アプタマーの標的結合親和性と実質的に同じである標的結合親和性を含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記安定化する改変が、ヌクレアーゼ抵抗性に対するアプタマー抵抗性を増大させる改変である、請求項４７に記載の方法。
50. 前記安定化する改変が、２’−ＯＭｅヌクレオチドにより別のヌクレオチドを置換することを含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記取り込む工程が、２’−ＯＭｅによる別のヌクレオチドの置換を１個より多く導入することを含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記置換する工程が、塩基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、糖の位置で改変されたヌクレオチドによる置換、および、リン酸基の位置で改変されたヌクレオチドによる置換からなる群から選択される置換を含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記置換が、非置換ヌクレオチドを置き換えたホスホロチオエート置換ヌクレオチド、非置換ヌクレオチドを置き換えたホスホロジチオエート置換ヌクレオチド、および、２’−デオキシヌクレオチドによる２’−ＯＭｅヌクレオチドの置換からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
54. 前記置換が、非置換ヌクレオチドを置き換えたホスホロチオエート置換ヌクレオチドである、請求項５３に記載の方法。
55. 置換以外は同一のアプタマーの標的結合親和性よりも大きい標的結合親和性を有する、標的に結合する置換されたアプタマーを同定する方法であって、
    ａ）塩基、糖またはリン酸基の位置で改変された１つのヌクレオチドにより、非置換のヌクレオチドを置換する工程；および
    ｂ）置換されたアプタマーを標的結合親和性についてアッセイする工程
    を含む、方法。
56. 前記置換する工程がさらに、同じ位置で改変された少なくとも２つのヌクレオチドによって、少なくとも２つの非改変ヌクレオチドを置換することを含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記置換する工程がさらに、同じ位置で置換された少なくとも３つのヌクレオチドによって、少なくとも３つの非改変ヌクレオチドを置換することを含む、請求項５６に記載の方法。
58. 前記置換する工程がさらに、異なる位置で改変された少なくとも２つのヌクレオチドによって、少なくとも２つの非改変ヌクレオチドを置換することを含む、請求項５５に記載の方法。
59. 前記置換する工程がさらに、少なくとも３つのヌクレオチドによって少なくとも３つの非改変ヌクレオチドを置換することを含み、ここで、置換されるヌクレオチドのうちの少なくとも２つは異なる位置で改変される、請求項５８に記載の方法。
60. リン酸基、糖または塩基の位置での改変を含む置換ヌクレオチドを有しないこと以外は同じヌクレオチド配列を有する第２のアプタマーの標的結合親和性と比較して、アプタマーの標的結合親和性を増大させるために選択された置換ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む、標的に特異的に結合するアプタマー。
61. 置換ヌクレオチドが、塩基、糖またはリン酸基の位置での化学的改変を含む１個以下のヌクレオチド置換を含む一本鎖アプタマーであって、該置換を有しないこと以外は第１の一本鎖アプタマーと同一である第２の一本鎖アプタマーの標的結合親和性と比較して増大した標的結合親和性で標的に特異的に結合する、一本鎖アプタマー。

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