JP2019528739A - フォン・ビルブラント因子(vwf)標的薬剤およびそれを用いる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(連邦政府支援研究に関する記載)本発明は、米国国立衛生研究所研究費番号1U54HL112307および5K12NS080223-3,220901により政府の支援を受けて達成された。当該政府は本発明において一定の権利を有する。
(配列表)本出願はEFS-Webにより電子出願され、.text形式の電子提出配列表を含む。当該.textファイルは、2017年9月18日作成の“2017-09-18 5667-00413_ST25_Seq_Listing.txt”と題する配列表を含み、当該ファイルのサイズは35,071バイトである。本.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の部分であり、参照によってその全体が本明細書に含まれる。
本発明は全般的に血栓症を予防および治療する組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、フォン・ビルブラント因子(VWF)を標的とする薬剤、並びに血餅形成の予防(抗血栓活性)および形成血餅の治療および/または軽減(血栓溶解活性)におけるその使用に関する。
アプタマーは一本鎖核酸であり、それらの標的との特異的な結合を可能にするそれらの配列を土台とする特異的な二次および三次構造を採る。アプタマーはタンパク質標的と結合しそれらを阻害する。アプタマーは一般的にはSELEXと呼ばれるin vitro選別プロセスによって創出される(SELEX:指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発展、Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)。例えば以下を参照されたい:Ellington AD, Szostak JW.1990.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 346:818-22;Tuerk C, Gold L.1990.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249:505-10。アプタマーは実質的に任意のタンパク質として系統的に単離することができ、広範囲の分子改変を実施して目的とする使用のためにそれらの薬理的動態を最適化させることができる。ペガプタニブナトリウム(黄斑変性の治療のために開発)は使用が承認された最初のアプタマーで、他の化合物は開発中である。例えば以下を参照されたい:Wang P, Yang Y, Hong H, Zhang Y, Cai W, Fang D.2011.Aptamers as therapeutics in cardiovascular diseases.Curr Med Chem 18:4169-74。アプタマーは、普遍的または合理的に設計された解毒剤を用いてアプタマー活性を迅速に無効にし得ることを条件として、有望かつより安全な抗血栓薬クラスを提供する。例えば以下を参照されたい:Rusconi CP, Scardino E, Layzer J, Pitoc GA, Ortel TL, et al.2002, RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa, Nature 419:90-4;WO/2008/066621 A3;およびWO/2008/121354。
しかしながら、当業界では、ヌクレアーゼによる分解に対して安定性が増強された、化学合成を容易にするためにより小さなサイズの、in vivoの循環時間が延長された新規なVWF標的アプタマーが希求されている。
ある特徴では、複数のアプタマーが提供される。アプタマーはポリヌクレオチドを含むことができ、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:1および配列番号:2、または配列番号:3−102のいずれか1つと少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%配列同一性を有する。下記の表1および2を参照されたい。
別の特徴では、本明細書に記載するアプタマーを含むダイマー、トリマーおよびテトラマーもまた開示される。
別の特徴では、本明細書に記載するアプタマーに対する解毒剤が提供される。解毒剤は、配列番号:103−180(表3のヌクレオチド配列)のいずれか1つと少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。また別には、解毒剤は、本明細書記載のアプタマーのいずれか1つの少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25以上のヌクレオチドに対して逆相補性であり、かつ前記ヌクレオチドとハイブリダイズすることができる配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
別の特徴では、対象動物で血餅形成を予防する方法が提供される。前記方法は、当該対象動物に本明細書記載のアプタマー組成物のいずれか1つを、当該対象動物で血餅形成を予防するために治療的に有効な量で投与する工程を含むことができる。
さらに別の特徴では、対象動物で血餅を治療する方法もまた提供される。前記方法は、当該対象動物にVWFを標的とする薬剤を、当該対象動物で血餅を減少させるために治療的に有効な量で投与する工程を含むことができる。
本明細書で開示されるものは、アプタマーおよび解毒剤の組成物とともに、VWF標的薬剤(例えば新規に発見されたVWF標的アプタマー)を用いて対象動物で血餅を予防および治療する方法である。これらの組成物および方法はいくつかの適用で有用であり得る。前記適用には以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):血栓の予防若しくは治療(in vitro、in vivo、ex vivo)、または卒中、脳血管の血栓、深部静脈血栓症(DVT)、肺塞栓症(PE)、心房細動、冠状動脈血栓、心臓内血栓、術後血栓、癌誘発血栓症、癌関連トロンビン発現、感染、および播種性血管内凝固症候群(DIC)に随伴する血栓の予防若しくは治療。
“ポリヌクレオチド”、“ヌクレオチド配列”、“ポリヌクレオチド配列”、“核酸”、および“核酸配列”という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド(前記用語は互換的に用いることができる)、またはその任意のフラグメントを指す。これらの語句はゲノム起原、天然起原または合成起原のDNA若しくはRNAを指すことができる。
例えば図1−3および15−16に提示された普遍的な構造に基づいて、当業者は、アプタマーの全体的構造およびおそらくは機能を維持しながらいくつかの改変を当該配列で実施しできることを容易に認識しよう。例えば、当業者は、第一のステム形成領域ACGおよび第六のステム形成領域CGUをUGCおよびGCAまたはCCGおよびCGG(DTRI-013、配列番号:101)にそれぞれ簡単に切り替え、アプタマーのステム構造をなお維持しよう。付け加えれば、ステム領域内の塩基を変化させるが全体的なピリミジンおよびプリン塩基組成を保存して、ステム領域を同様な融解温度でハイブリダイズさせるステム形成領域の改変を実施できよう。当業者はまた、アプタマーに対して実施される普遍的なアプタマーのステムループ構造を破壊する変更は、おそらくその標的と効率的に結合できないアプタマーを生じるであろうということを理解していよう。
いくつかの実施態様では、アプタマーは、5’から3’に向けて配列番号:1(CGAAC(U/T)GCCC(U/T)C)、1−18(またはその間の任意の範囲)ヌクレオチドから成る可変ヌクレオチド配列またはスペーサー配列、および配列番号:2(GACGCACAGACG)を含むポリヌクレオチドと少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施態様では、アプタマーは、長さが58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17または16ヌクレオチドを超えないことができる。
アプタマーは、非改変形であるか、または少なくとも1つのヌクレオチド塩基改変を含む改変形である、ポリヌクレオチド(RNA、DNA、またはペプチド核酸(PNA))を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ分解からポリヌクレオチドを保護する、および/またはポリヌクレオチドの安定性を増強するためのポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基改変は当業界で周知である。本発明にしたがって用いることができる一般的なヌクレオチド塩基改変には、デオキシリボヌクレオチド、2’-O-メチル塩基、2’-フルオロ塩基、2’アミノ塩基、逆向きデオキシチミジン塩基、5’改変および3’改変が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
典型的な5’改変は、逆向きデオキシチミジン塩基、リンカー配列(例えばC6)の付加、コレステロールの付加、別の部分(例えばPEG)との複合物化を可能にする反応性リンカー配列の付加を含むことができるが、ただしこれらに限定されない。典型的な3’改変は、逆向きデオキシチミジン塩基および逆向き非塩基性残基を含むことができるが、ただしこれらに限定されない。
アプタマーはさらに安定剤を含むことができる。本明細書で用いられるように、“安定剤”は、ポリヌクレオチドの安定性を増強するか、および/またはそのin vivo循環時間を延長し得る任意の物質を指す。典型的な安定剤は当業界で公知であり、ポリエチレングリコール(PEG)、コレステロール、アルブミン、またはエラスチン様ポリペプチドが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“対象動物”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の“非ヒト動物”という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、マウス、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。いくつかの実施態様では、対象動物は人間の患者である。
治療的に有効な量または本明細書で用いられる有効量は、血餅の予防または治療のために対象動物に投与されるとき、(上記に記載した)治療を達成するために十分な組成物の量を意味する。治療的に有効な量は、処方若しくは組成、疾患およびその重篤度、並びに治療される対象動物の年齢、体重、健康状態および応答性にしたがって変動するであろう。
この新しいVWF標的薬剤の使用に基づいて、対象動物で血餅を治療する方法もまた提供される。前記方法は、対象動物で血餅を減少させるために治療的に有効な量で、VWF標的薬剤を当該対象動物に投与する工程を含むことができる。“血餅を治療する”または“血餅を減少させる”ということは、凝塊部位で血流を増加させるために血餅のサイズおよび/または形を減少させることを指す。
血餅の治療を必要とする対象動物は、例えば、卒中、脳血管の血栓、深部静脈血栓症(DVT)、肺塞栓症(PE)、心房細動、冠状動脈血栓、心臓内血栓、術後血栓、癌誘発血栓症、癌関連トロンビン発現、感染、播種性血管内凝固症候群(DIC)、および動脈血栓症(脳動脈、冠状動脈および頭頸部の末梢動脈、内臓動脈、腕および脚の動脈を含む)(ただしこれらに限定されない)に随伴する血餅の治療を必要とし得る。いくつかの実施態様では、血餅の治療を必要とする対象動物は、深部静脈血栓症、卒中、心臓発作、または肺塞栓症を罹患する。
VWFタンパク質は、任意の哺乳動物(人間または家畜化動物(例えばイヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ブタ、マウスまたはラット)を含むが、ただしこれらに限定されない)で見出されるVWFタンパク質のいずれかであり得る。
いくつかの実施態様では、VWF標的薬剤は、VWFタンパク質と結合し、それによってVWFタンパク質の生物学的活性の1つ以上を部分的または完全に遮断、阻害、または中和することができるアプタマーであり得る。適切なアプタマーには、WO/2008/066621 A3(Sullenger et al.)に記載されたものおよびその中に記載されたアプタマーが含まれる(ただしそれらに限定されない)。
VWF標的薬剤はまた小分子であり得る。小分子は、約2500ダルトン、2000ダルトン、1000ダルトン、または500ダルトンより小さい分子量を有する化学分子であり得る。
本発明にしたがって用いることができる解毒剤には、配列特異的解毒剤、例えば本明細書に記載の解毒剤およびWO/2008/066621 A3に記載されたものが含まれ得る。解毒剤にはまた配列非特異的解毒剤(すなわち陽イオンポリマー)、例えばWO/2008/121354に記載のものが含まれ得る。
文脈による特段の規定または指定がないかぎり、“a”、“an”、および“the”という用語は“1つ以上”を意味する。例えば“a protein”または“an RNA”は、“1つ以上のタンパク質”または“1つ以上のRNA”をそれぞれ意味すると解釈されるべきである。
以下の実施例は単なる例証であることが意図され、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲の制限を意味しない。
材料と方法
RNAアプタマーの調製および折り畳み
RNAアプタマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法を用いて自社内で合成した。血小板機能分析(PFA)及びin vivoモデルの前に、RNA系アプタマーを適切な生理学的緩衝液、例えば血小板結合緩衝液(20mM Hepes(pH7.4)、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM KCl)中で“折り畳む”ことができる。アプタマー溶液を95℃で3分間加熱し直ちに氷上に置き、続いて5から10分間室温にさせた。
親和性定数(Kd値)は二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイ(Rusconi et al, Thromb.Haemost.84:841-848, 2000)を用いて決定した。全ての結合試験は結合緩衝液(20mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、2mM CaCl2および0.01%BSA)を用い37℃で実施した。ヒト精製VWF(第VIII因子を含まない)を以下の業者から購入し(Haematologic Technologies Inc.;Essex Junction, VT)、二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイに用いてアプタマーのKdを決定した。簡単に記せば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)および[γ32P]ATP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて、RNAを5’末端で末端標識した(Fitzwater and Polisky, Methods Enzymol.267:275-301, 1996)。末端標識RNAを結合緩衝液Fで希釈し、65℃で5分間熱変性させ、その後37℃で平衡化した。直接結合は、微量の32P-RNAを種々の濃度のVWFタンパク質と結合緩衝液F中で37℃、5分間インキュベートすることによって実施した。ニトロセルロース膜に結合した核酸-タンパク質複合体分画をホスファイメージャー(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて定量した。放射能標識核酸の非特異的結合を差し引いて、特異的結合のみを残した(Wong and Lohman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432, 1993)。
マウスで動脈血栓を誘発するFeCl3化学損傷モデルを述べる。挿管の前に、密閉チャンバーで4から5%のイソフルランを5−7分間吸入させて麻酔を導入した。ガス導入後に、27g1/2”針を用いてアバチン/トリブロモエタノール(1.25%、12.5mg/mL)を効果に応じて100−250mg/kgの間の用量で1回IP注射した。体重に応じて総体積は0.15から0.50ccの範囲であった(典型的には20−25gのマウス)。挿管の実施前に、動物を導入チャンバーにさらに1−2分間戻した。マウスを専用の挿管スタンドに移し、針のない20から22ゲージのカテーテルを用いて挿管した。挿管を確認したら、腹側の頸部の毛を剃って温めた手術台にマウスを移した。背側横臥の状態で直ちにマウスをHarvard Apparatusのげっ歯類用換気装置に連結し、70%窒素:30%酸素混合物を用い、1分間に約90−110呼吸および1回換気量約0.2mLで維持した。イソフルランは約1−3%で維持した。体温はPhysitemp TCAT-2DFで約37℃に維持した。
止血評価のためのマウス伏在静脈出血モデルについて述べる。密閉チャンバーで4から5%のイソフルランを2−3分間吸入させて麻酔を導入した。27g1/2”針を用いてアバチン/トリブロモエタノール(1.25%、12.5mg/mL)を効果に応じて100−250mg/kgの間の用量で1回IP注射した。体重に応じて総体積は0.15から0.50ccの範囲であった(典型的には20−25gのマウス)。挿管の実施前に、動物を導入チャンバーにさらに1−2分間戻した。マウスを専用の挿管スタンドに移し、無針の20から22ゲージのカテーテルを用いて挿管した。挿管を確認したら、頸部腹側および両骨盤肢の内側面の毛を剃って温めた手術台にマウスを移した。背側横臥の状態で直ちにマウスをHarvard Apparatusのげっ歯類用換気装置に連結し、70%窒素:30%酸素混合物を用い、1分間に約90−110呼吸および1回換気量約0.2mLで維持した。イソフルランは約1−3%で維持した。体温はPhysitemp TCAT-2DFおよび直腸プローブで約37℃に維持した。
血小板機能アナライザー、PFA-100(Dade Behring, Deerfield, IL)は、抗凝固全血で血小板機能の定量的測定を提供する(Ortel et al, Thromb.Haemost.84:93-97, 2000)。簡単に記せば、アプタマーを適切な緩衝液(すなわち、150mM NaCl、20mM HEPES(pH7.4)、5mM KCl、1mM MgCl2および1mM CaCl2;または150mM NaCl、20mM HEPES(pH7.4)、2mM CaCl2;またはPBS)で希釈して熱変性させた。アプタマーを新鮮な全血に表示の最終濃度で添加し、RTで3−5分間インキュベートし、続いてコラーゲン/ADP試験カートリッジを用いてPFA-100で分析を実施した。PFA-100の最大閉鎖時間は300秒であった。アプタマーの解毒活性は、全血をアプタマーと混合し、続いて解毒剤を投与し、PFAで測定することによって測定した。
VWF9.14変種
VWF9.14アプタマーを最適化するために、我々は、いくつかのVWF9.14アプタマー切端変種およびいくつかのVWF9.14アプタマー改変変種を作製した。例えば図1−3を参照されたい。VWF9.14アプタマー切端変種は下記の表1に示される。
A=2'OHアデニン;C=2’フルオロシトシン;G=グアニン;U=2’フルオロウラシル
idT=3’末端の逆向きデオキシチミジン(下記の配列の長さおよび配列番号はidTを含まない);NB=結合無し;ND=決定せず
表2:VWF9.14アプタマー切端形の改変型
表の凡例:全ての配列が5’から3’方向である。長さは逆向きデオキシチミジンを含まない。fU=2’フルオロウラシル;fA=2’フルオロアデニン;fC=2’フルオロシトシン;
mA=2’O-メチルアデニン;mC=2’O-メチルシトシン;mG=2’O-メチルグアニン;
mU=2’O-メチルウラシル;fG=2'フルオログアニン;rG=2’リボグアニン;
rA=2’リボアデニン;idT=3’末端の逆向きデオキシチミジン;(C6L)=ヘキシルアミノリンカー;(6GLY)=ヘキサエチレングリコールリンカー(9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングルコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトを用いて取り込まれる);コレステロール=5'末端で取り込まれたコレステロールトリエチレングリコールアミダイト;NB=結合無し;ND=決定されず
全ての配列は5'から3'方向で示される;長さには逆向きデオキシチミジンは含まれない;
mG=2’O-メチルG;mA=2’O-メチルA;mC=2’O-メチルC;mU=2’O-メチルU;
idT=逆向きデオキシチミジン
VWFタンパク質に対するVWF9.14アプタマー変種の結合親和性を決定するために、我々はいくつかの変種を用いて結合アッセイを実施した。結合データは上記の表1−2に要約されている。図1および16-17もまた参照されたい。
図12および13に示すように、我々は、VWF9.14T59について血小板機能アッセイ(PFA)を、解毒剤VWF9.14T59-AO3、-AO10、および-AO11(それぞれAO3、AO10、およびAO11)とともに或いは前記解毒剤無しに実施した。さらにまた、解毒剤VWF9.14T79-AO1(AO43)およびVWF9.14T79-AO2(AO55)とともに或いは前記解毒剤無しに実施したアプタマーVWF9.14T79についてのPFAの結果も示される。解毒剤VWF9.14T82-AO1(AO46)およびVWF9.14T82-AO2(AO58)とともに或いは前記解毒剤無しに実施したアプタマーVWF9.14T82についての結果が示される。解毒剤VWF9.14T84-AO1(AO48)およびVWF9.14T84-AO2(AO60)とともに或いは前記解毒剤無しに実施したアプタマーVWF9.14T84についての結果が示される。これらの結果は、いくつかのVWF9.14アプタマーの抗血栓活性は計画的な解毒剤を用いて復帰させることができることを示す。
VWF9.14アプタマー変種のいくつかをネズミ動脈血栓症モデルおよびネズミ伏在静脈出血モデルで試験した。図4−11を参照されたい。ネズミ動脈血栓症モデルでは、左頸静脈にカニューレを挿管し、右頸動脈を露出させ、フロープローブを配置した。5分後に、表示のベヒクルをマウスにi.v.注射し、10%FeCl3パッチを頸動脈に3分間置いた。続いて頸動脈の血流をプローブを用いて1時間モニターし記録した。ネズミ動脈血栓症モデルでは、FeCl3損傷前のベヒクルの注射(アプタマー無し/陰性コントロール)は、FeCl3パッチ除去から約2分後に血管の閉塞をもたらした(図4参照)。他方、このモデルでFeCl3損傷前に用量0.375 mg/kgのT79vrt7/DTRI-031またはPEG-VWF9.14T79-VRT7/DTRI-031アプタマーを注射することによって、FeCl3パッチ除去から60分間、血管は開存されたままであった(図5および7参照)。これらの結果は、当該アプタマーが強力な抗血栓活性を有することを示す。
ネズミ伏在静脈出血モデルでは、表示の用量でアプタマーを注射する前に、マウスの左頸静脈にカニューレを挿管し、右内側伏在静脈を露出させる。アプタマーを注射して5分後に、伏在静脈を切開して15分間出血を見守った。続いて解毒剤を注射してアプタマーの作用を無効にし、さらに20分間出血を見守った。PEG-VWF9.14T79-VRT7アプタマーの活性は、VWF9.14T79-AO2(AO55)解毒剤の注射によって首尾よく無効にできた(図8参照)。例えば、図8に示すように、VWF9.14T9-AO2(AO55)解毒剤の注射後に凝塊破壊が増加し、アプタマーの活性を無効にできることが示された。
血栓溶解活性について、T79VRT7アプタマーはまたネズミ頸動脈閉塞モデルおよびネズミ頭蓋内出血モデルで試験された。図18−19を参照されたい。
我々は、C57BL/6Jマウス成獣(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)(18−24g)に挿管し、左頸静脈を露出させたネズミ頸動脈閉塞モデルを利用した。次に、我々は、右総頸動脈を露出させ当該動脈を取り囲むようにトランソニックフロープローブ(Transonic Systems Incorporated, Ithaca, NY)を配置した。血流を5分間測定して安定な基準線を得た。続いて、10%塩化第二鉄浸漬ワットマン紙を当該血管に適用することによって血栓症を誘発した。続いて閉塞までの時間を記録した。閉塞から20分後に、食塩水(陰性コントロール)、0.5mg/kgの用量の抗VWFアプタマー(VWF9.14T79VRT7)、10mg/kg用量の組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(rTPA)を静脈内に注射した。ドップラーフロープローブ(Doppler flow probe)を用いて再灌流についてモニターし、灌流が再確立される時間を決定した。60分後に再疎通が生じなければ実験を終了した。続いて、動物をサクリファイスし、脳および総頸動脈を分析のために採集した。
図18に示すように、ネズミ頸動脈閉塞モデルでは、初期頸動脈流のパーセンテージは、rTPA、コントロールまたは灌流無しに対してVWF T79VRT7アプタマーで時間の経過にしたがって強大に増加した。したがって、VWF T79VRT7アプタマーはrTPAと比較して優れた血栓溶解活性を有した。
我々はC57BL/6Jマウス成獣(18−24g)を麻酔し、左頸静脈および右総頸動脈を露出させた。続いて、食塩水(陰性コントロール)、0.5mg/kg用量の抗VWFアプタマー(VWF9.14T79-VRT7)、10mg/kg用量のrTPA、または抗VWFアプタマー(0.5mg/kg)および2.5mg/kg用量の適合する解毒剤オリゴヌクレオチド(VWF9.14T79-AO2(AO55とも呼ばれる))をアプタマーの5分後に注射した。頭蓋内出血を誘発するために、シリコーン被覆6-0ナイロンフィラメントを頸動脈に挿入し、内頸動脈(ICA)終点を穿刺するまでフィラメントを前進させてくも膜下出血(SAH)を惹起させた。梗塞および出血の体積を評価するために、頭蓋内出血誘発から90分後に9.4 Tesla MRI(Bruker Biospin, Billerica, MA)で磁気共鳴画像法(MRI)を実施した。
図19は、ベヒクル、rTPA、抗VWFアプタマー(VWF9.14T79-VRT7)、または抗VWFアプタマー(VWF9.14T79-VRT7)、およびVWF解毒剤(VWF9.14T79-AO2(AO55とも呼ばれる))で処置したマウスのネズミ頭蓋内出血モデルにおける血管創傷に続く1回拍出量を提示するグラフを示す。
虚血性卒中は欧米社会における死亡および障害の主たる原因である1。組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(rTPA)を用いる、承認された血栓溶解性卒中治療はいくつかの重大な要件によって制限される。第一は、rTPA活性を無効にできないことから部分的に生じる出血転換の顕著なリスクである。第二に、rTPAの短い治療ウインドウは90%を超える卒中患者を治療不適格にする2,3。最後に、rTPAは約30%の再疎通を達成するだけであり、再閉塞が一次血栓溶解後に通常的に発生し、早期神経学的改善の低下をもたらす。
フォン・ビルブラント因子(VWF)は、血小板血栓形成の重要な事象に関与する糖タンパク質である。VWFは、糖タンパク質Ibアルファ-IX-V複合体と血小板表面で相互作用し、血小板の血管壁への粘着を誘発する4。これに続いて、糖タンパク質IIb/IIIa(gpIIb/IIIa)は活性化され、フィブリノゲンと結合して血栓形成をもたらす。フォン・ビルブラント病(VWD)はフォン・ビルブラント因子の定性的および定量的減少の両方であり得る。I型VWD(VWF病の主要形)は、歯科的工程後または月経時に軽度の出血を示し、偶発的出血を示さない5。さらにまた、I型VWD患者は、脳血管系および心血管系事象からは防御される6。VWFはしたがって動脈血栓症で有望な標的で、従来の治療を超えることができる。
本実施例で、発明者らは、アプタマー9.14T79vrt7は高せん断ストレス下で血小板粘着を用量依存態様で阻害し、血小板凝集を防ぐことを示す。前記アプタマーはネズミ頸動脈損傷モデルで血栓形成を防ぐ。前記アプタマーはまた、rTPAと比較してネズミおよびイヌの両動脈閉塞モデルで優れた血栓溶解活性を示し、これは、頭蓋内出血を誘発することなくまたは脳へ閉塞凝塊を流出させることなく達成された。最後に、9.14T79vrt7に対抗するように設計した解毒剤オリゴヌクレオチドは、ヒト血液およびネズミ出血モデルの両方で当該アプタマーの抗血小板活性を2分以内に無効にした。
本実施例の試験は、虚血性卒中および他の急性血栓性事象の治療に、9.14T79vrt7アプタマーは新規で潜在的に安全なアプローチであることを示唆する。
アプタマー切端形、改変形および解毒剤オリゴヌクレオチド(AO)の合成
アプタマー切端形は社内で転写または合成した。簡単に記せば、T7 RNAポリメラーゼを用い、RNAアプタマー切端形(T10、T21およびT22)を転写した。アプタマー切端形、改変形および解毒剤は、MerMade 6/12オリゴヌクレオチド合成装置(BioAutomation, Irving, TX)を用いて合成した。RNA二次構造を予測するソフトウェア(M.ZukerによるMfold)を用いて二次構造を予測した。
血小板機能分析(PFA)およびin vivoモデルの前に、RNA系アプタマーを適切な生理学的緩衝液中で“折り畳む”ことができる13。アプタマー溶液を95℃に3分間加熱し、直ちに氷上に3分間置き、続いて約5から10分間で室温にした。
書面のインフォームドコンセントを入手後に、ヒト血液を健康な志願者から静脈穿刺により収集した。採血は、ダラム退役軍人管理局メディカルセンター(Durham Veterans Administration Medical Center)およびデューク大学メディカルセンター(Duke University Medical Center)の両方の所内審査委員会によって承認されたプロトコルにしたがって実施した。
VenafluxTM微小流体力学系(Cellix, Dublin, Ireland)はコラーゲン表面の血小板粘着を測定する。ヒト血液は、ヒルジンチューブに健康な志願者から静脈穿刺によって収集された。アプタマーまたは血小板結合緩衝液のみで処理した全血の300μLを含むアリコットを、コラーゲン被覆微小チャネルに60ダインで3分間流した。続いて、食塩水で3分間チャネルを洗浄し、RBCおよび非結合血小板を洗い流した。Venaflux画像化ソフトウェアおよびイメージプロプラス(Image Pro Plus)を用いて結合血小板を画像化し、被覆された表面面積を計算した。アプタマーを95℃で3分間インキュベートし、氷上に3分間置き、続いて室温で10分間インキュベートした。冷却後、アプタマーを使用まで氷上で維持した。処理血液中で結合血小板によって覆われた全表面積を、陰性コントロール血液の全被覆に対するパーセンテージとして表した。統計的有意は分散分析によって決定した。アプタマーのIC50は調整(fitted)線形回帰曲線を用いて計算した。
T-TAS(Zacrox, Fujimori Kogyo Co.Ltd., Tokyo, Japan)を用いてヒトおよびイヌ全血の両方で血栓形成を査定した15。PLチップ中のヒルジンチューブに血液を収集した(PLチューブは1型コラーゲンで被覆した25のキャピラリーチャネルを含む)。チップを横切る血流を14μL/分の流速で維持した。血小板凝集は、流速を維持するために必要な圧の合計の関数(kPa)として測定した。カメラも使用しコラーゲン被覆チャネルを横切る血小板活性を観察した。
手術を実施したまたは頸動脈流および画像データを分析した研究者らには当該処置グループは知らされなかった。全てのin vivo実験は、デューク大学学内動物管理使用委員会(Duke University Institutional Animal Care and Use Committee)およびオハイオ州立大学学内動物管理使用委員会(Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee)に承認された。さらにまた、前記委員会は、実験動物の管理及び使用についてのNIHガイドラインに忠実である。
ネズミ頸動脈閉塞試験は、業者(Jackson Laboratory)から入手したオスまたはメスのC57BL/6マウス(8週齢)で実施された。血栓症/閉塞はFeCl3に浸漬したワットマンろ紙を用いて達成された。頸動脈閉塞から20分して、処置を開始させた。8週齢のオスまたはメスC57BL/6マウスは業者(Jackson Laboratory)から入手した。動物をケタミン(55mg/kg)およびキシラジン(15mg/kg)で麻酔した。正中腹部切開により動物に挿管し(Harvard Apparatus mouse ventilator, Holliston, MA)、総頸動脈を単離した。ドップラーフロープローブ(Transonic Systems Inc., Ithaca, NY)を用いて頸動脈流の基準線を入手した。10%塩化第二鉄浸漬ワットマンろ紙を血管に3分間置いた。頸動脈閉塞から20分して、処置を開始した。伏在静脈内輸液により(Harvard Apparatus PHD 2000 Infusion Pump, Holliston, MA)、動物をコントロール(血小板結合緩衝液)、VWFアプタマー、TPA、アプタマー/解毒剤、TPA/VWFアプタマー、または灌流無しで処理した。頸動脈流をさらに90分間モニターし再灌流を査定した。心拍数、EKG(ADInstruments PowerLab 4/35 EKGモニタリング系、Sydney, Australia)、および血圧(Kent Scientific CODA非侵襲BP測定系、Torrington, CT)を行程を通してモニターした。当該頸動脈で組織学的分析を実施した。
ネズミ大腿静脈出血モデルを、業者(Jackson Laboratory)から入手したオスまたはメスの8週齢C57BL/6マウスで実施し、解毒剤オリゴヌクレオチドの可逆性16を査定した。両後肢の腹側の毛を除去した。続いて温度およびECGモニター台にマウスを仰向けに置いた。四肢を穏やかに拘束した。左右の後肢の腹側の皮膚を切開し伏在神経血管束の全長を露出させた。前記神経血管束を通常食塩水で覆って乾燥を防いだ。薬剤投与のために、左伏在静脈にカニューレを挿管した。止血を査定するために、右伏在静脈に23G針で穴をあけ、続いて当該血管の遠位部を縦方向に切開することによって、当該血管を切開した。止血が生じるまで血液を穏やかに拭い去った。続いて凝塊を除去して出血を再開させ、再び止血が生じるまで血液を再度拭い去った。各止血発生の後で凝塊破壊を30分間繰り返した。2つのパラメーターを測定した:1)30分間に止血が発生した回数、および2)各止血に要した時間。
イヌ頸動脈閉塞試験をオスおよびメスの成獣ビーグル(7−11kg)で実施した。頸動脈閉塞をFeCl3で誘発し、処置を開始する前に45分間安定化させた。イヌを麻酔して挿管した。右大腿動脈および静脈内にカテーテルを得た。右頸動脈を露出させ、頸動脈流基準線をドップラーフロープローブを用いて得た。50%塩化第二鉄パッチを用いて15分間血栓症を誘発し、凝塊を45分間安定化させた。続いて、イヌにベヒクル、0.9mg/kg TPAまたは0.5mg/kg VWFアプタマーを静脈内輸液した。アプタマーおよびベヒクルはボラスとして投与し、一方、rTPAは、10%ボラスとそれに続く残り薬剤の45分間の輸液による標準的臨床プロトコルによって投与した。頸動脈流を120分間モニターした。血栓症部位から遠位にあるフロープローブで血流移動時間を実験を通してモニターした。頸動脈血管造影は基準開存、血栓閉塞、および再疎通を明瞭に示した。周期的採血によって血小板阻害を査定した(血小板機能アナライザー100)。実験終了時に、各動物の脳および頸動脈を収集し組織学的分析のために包埋した。
値は平均±SDとして表され、統計分析は、多重t検定、カイ二乗分析および適切な場合には二元配置分散分析を用いて実施された。
最適化VWFアプタマー9.14T79はin vitroおよびex vivoでVWFと結合しその活性を阻害する
将来の臨床で扱いやすいVWFアプタマーを作製するために、我々は、2’フルオロ-ピリミジン改変RNAアプタマーVWF9.14に由来する一連のVWFアプタマー誘導体を設計し試験した12,13。実施例1を参照されたい。この試みは先導VWFアプタマー、T59をもたらした。T59は高い親和性結合および阻害活性を保持し、長さが30ヌクレオチドである。次いで、ヌクレアーゼ耐性を改善しさらに当該組成物を最適化するために、我々は、2’O-メチルおよび/または2’フルオロ部分を系統的にT25およびT59切端形で置換した。ほぼ90の切端形を合成しin vitroで試験した。完全に最適化されたアプタマー9.14T79vrt7は35ヌクレオチドであり、60-mer(Kd=18.4 nmol/L、Bmax=51%)と比較して、解離定数(Kd)=11.2nmol/L、Bmax=56%でVWFと結合する(上記表1および2並びに図1−3を参照されたい)。
血小板凝集におけるアプタマーの作用はPFA-100ヒト全血アッセイによりex vivoで測定した。VWFアプタマーは、この系で100nmol/Lを超える用量で血小板凝集を完全に阻害し、ここで血小板血栓形成および閉鎖時間は300秒を超え、これはこのアッセイの上限であった(図21)。したがってVWFアプタマー9.14T79vrt7は、血小板粘着および凝集の両方をex vivoで妨げる。
次いで、ネズミ頸動脈閉塞モデルを用いてアプタマーの血栓溶解活性を評価した。安定な頸動脈閉塞から20分後に、動物にアプタマー9.14T79、食塩水コントロール、またはrTPAを投与した。この実験で用いたrTPAの用量は10mg/kgである(前記用量は0.9mg/kg(判明している最後の発生の3−4.5時間以内に虚血性卒中を示す人間を治療するために用いられる用量)より11倍高い)。その理由は、これが動脈血栓症のネズミモデルで再疎通に有効であると報告された用量だからである17。アプタマーは0.5mg/kgで投与され、図23Aに示されるように、rTPA(p<0.05)および緩衝液コントロール(p<0.01)と比較して有意に高い再疎通を示した(n=8/グループ)。各グループの頸動脈の組織学的分析は、フロープローブによって測定された再疎通の程度とおおざっぱに相関した(図23B、23Cおよび23D)。緩衝液コントロールグループの影響を受けた頸動脈の横断切片の試験は、全ての被検動物で完全な閉塞を示した(n=8)(図23D)。rTPA処理マウスの血管切片は、頸動脈のほぼ完全な血栓症および閉塞を示した(n=8)(図23C)。最後に、VWFアプタマー処理マウスの頸動脈切片の組織検査は、6つのサンプルで完全な開存性を示し、以前に閉塞した血管の2つの切片でただ1つの小さな凝塊の証拠を示した(n=8)(p=0.01)(図23B)。
高せん断下での血小板血栓形成を評価し、さらに大きな動物モデルでアプタマー査定を開始するために、我々は全血栓形成分析系(T-TAS)(Fujimori Kogyo Co., Yokohama, Japan)18でVWFアプタマーを試験した。9.14T79vrt7は、18.75−100nmol/Lの間の用量でイヌ血小板凝集を阻害し、血流圧を維持した(図24A)(n=5/グループ)(緩衝液と比較したときp<0.05)。100nmol/Lの用量で、血小板粘着および凝集の完全な阻害があった(図24B)。各図は1分から5分の最初の10秒を示す。緩衝液コントロールの3から5分で認められる白い霞の領域は水平キャピラリーチャネルに粘着した血小板である。アプタマーのパネルはそのような血小板蓄積を示さず、9.14T79vrt7はin vitroのせん断ストレス下でイヌ血小板機能の強力な阻害剤であることを示している。
イヌ脳血管血栓症モデルを用いて、臨床的に関連する大きな動物でマウスの結果を裏付けた。動脈閉塞を確立させ、さらに治療前に45分間持続させた。動物に、0.5mg/kgの9.14T79vrt7をボラスとして静脈内注射するか、または0.9mg/kgのrTPAを10%注射に続いて残りの90%を45分間かけて輸液するという標準的臨床プロトコルによって投与した。9.14T79vrt7を投与された3匹のイヌの全ての頸動脈が投与の5から15分後に再疎通した(それぞれ図24F、24G)。対照的に、rTPAまたは食塩水コントロールで処理された動物は処理後に再疎通を示さなかった(n=3/グループ)。
9.14T79vrt7の安全性を究明するために、これらのイヌの脳内の出血および凝固を評価した。9.14T79vrt7は頭蓋内出血を誘発せず、頸動脈再疎通もこれら3匹の動物のいずれにおいても脳の血栓閉塞を発生させなかった(図24H−J)。9.14T79vrt7およびrTPAの両グループの脳組織学はコントロール食塩水処理グループと同一である。頸動脈の組織学では当該血管の本質的に完全な再疎通が示されたので、アプタマーグループにおける脳血栓閉塞の欠如は安心をもたらした(図24K)。上段の頸動脈切片は閉塞が発生した血管損傷領域であり、一方、下段の切片は診断のためのカテーテルに隣接する開存部分に由来する。著しく対照的に、rTPAおよび食塩水処理コントロールグループ動物はともに血栓を含み、それら血栓は損傷頸動脈を閉塞し続け、これらのアプローチが血流を再生できないことと一致した(それぞれ図24Lおよび24M)。
必要な場合に9.14T79vrt7活性を無効にするために、我々は解毒剤オリゴヌクレオチド(AO、VWF9.14T79-AO2またはAO55とも呼ばれる)を作製した。最初に試験した解毒剤のいずれも30ヌクレオチドアプタマーT59を無効にできなかった。その理由はおそらく、いったんT59がVWFとしっかりと結合すると、アプタマーの良好な核生成部位に解毒剤が接近できないためであろう。したがって、我々は、5ヌクレオチドウラシル(オリゴUテール)を人工的な核生成部位として当該分子の3’-末端に付加し、このテールとアプタマーの3’末端に相補的な16ヌクレオチド解毒剤を試験した。この解毒剤オリゴヌクレオチド(AO)は、アプタマーの抗血小板活性をin vitroで2分以内に9.14T79vrt7に対して2:1の低い比率で無効にした(図14)(n=2/グループ)。
抗血小板アプタマーを無効にする解毒剤の能力をネズミ大腿静脈出血モデル16で評価した。非処理コントロールマウスは12±3破壊を示し、これは食塩水グループの17±3破壊と同様であった(n=7)(p>0.05)。0.375mg/kgの用量で投与された9.14T79vrt7は凝塊破壊をもたらさず、これは、非処理コントロールおよび食塩水処理動物と比較して大いに有意であった(n=11)(p<0.0001)。9.14T79vrt7の投与に続く解毒剤オリゴヌクレオチドの添加は16±9破壊を示し、これは、アプタマーを投与されなかった動物と同様であった(n=7)。このデータは正常血栓症の%として表された(図25)。解毒剤単独投与は凝塊破壊の増加または低下を生じなかった(データは示されていない)。したがって、解毒剤はVWFのアプタマー媒介阻害に関連するいずれの出血も迅速に無効にできる。
従来、圧倒的多数の虚血性卒中患者には急性処置の選択肢が存在しない。rTPAは出血を生じ、時間的制限があり、さらに無効にできない。我々の研究は、解毒剤によって管理されるVWF阻害剤は強力でなお安全な治療選択肢をこれらの患者に提供できることを示す。9.14T79vrt7は完全長のアプタマー12と比較して改善された結合親和性を示し、モノクローナル抗体7,19の能力と同等である。アプタマー9.14T79vrt7は、ヒト血小板のコラーゲン表面への粘着を高せん断ストレス下(図24)の場合と同様に防いだ(図20−22)。
参考文献
Claims (34)
- アプタマーであって、当該アプタマーが、
配列番号:1および配列番号:2、または配列番号:3−102のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチド、または
5’から3’に向けて、3ヌクレオチドを含む第一のステム形成領域、ヌクレオチド配列AACを含む第一のループ領域、3ヌクレオチドを含む第二のステム形成領域、ヌクレオチド配列CCを含む第二のループ領域、2−8ヌクレオチドから成る第三のステム形成領域、1−12ヌクレオチドから成る第三のループ領域またはスペーサー配列、2−8ヌクレオチドから成り第三のステム形成領域とともにステムを形成することができる第四のステム形成領域、ヌクレオチドCを含む第四のループ領域、3ヌクレオチドを含み第二のステム形成領域とともにステムを形成することができる第五のステム形成領域、ヌクレオチド配列CAGAを含む第五のループ領域、および3ヌクレオチドを含み第一のステム形成領域とともにステムを形成することができる第六のステム形成領域を含むポリヌクレオチドと少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み、
ここで、当該ポリヌクレオチドが非改変形を含むか、または少なくとも1つのヌクレオチド塩基改変を含む改変形を含み、
当該アプタマーが長さにおいて53ヌクレオチドを超えない、前記アプタマー。 - 5’から3’に向けて配列番号:1、1−18ヌクレオチドから成る変動可能ヌクレオチド配列またはスペーサー配列、および配列番号:2を含むポリヌクレオチドと少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 配列番号:3−6のいずれか1つと少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ヒトVWFタンパク質に対する当該アプタマーの解離定数(KD)が100ナノモル(nM)未満である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドの5’末端または3’末端にテールヌクレオチドをさらに含み、当該テールヌクレオチドが当該ポリヌクレオチドの連続する3つ以上のヌクレオチドと対を形成することができず、当該テールヌクレオチド配列が2−12ヌクレオチドから成る、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアプタマー。
- テールヌクレオチド配列がポリヌクレオチドの3’末端に存在し、さらにヌクレオチド配列(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)から成る、請求項5に記載のアプタマー。
- 長さにおいて39ヌクレオチドを超えない、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドがRNAポリヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドが、2’フルオロ改変、2’O-メチル改変、5’改変、および3’改変から成る群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド塩基改変を含む改変形を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドが5’リンカーおよび/または3’リンカーを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドが安定性作用物質をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 安定性作用物質が、ポリエチレングリコール(PEG)、コレステロール、アルブミン、およびエラスチン様ポリペプチドから成る群から選択される、請求項12に記載のアプタマー。
- 安定性作用物質がポリヌクレオチドの5’末端に連結される、請求項12〜13のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドおよび安定性作用物質が共有結合によって連結される、請求項12〜14のいずれか1項に記載のアプタマー。
- ポリヌクレオチドおよび安定性作用物質がタグ系によって連結される、請求項12〜15のいずれか1項に記載のアプタマー。
- タグ系が、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、およびビオチン/ニュートラアビジンから成る群から選択される、請求項12〜16のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 請求項1〜17に記載のアプタマーのいずれか1つを含むダイマー、トリマーまたはテトラマー。
- 配列番号:103−180のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、解毒剤。
- 請求項1〜18に記載のアプタマーのいずれか1つの少なくとも8ヌクレオチドに対して逆相補性であり、かつ前記少なくとも8ヌクレオチドとハイブリダイズすることができる配列を有するポリヌクレオチドを含む解毒剤。
- 医薬担体と、請求項1〜18に記載の組成物または請求項19〜20に記載の解毒剤のいずれか1つとを含む医薬組成物。
- 医薬担体が、20mMのHepes(pH7.4);150mMのNaCl;1mMのCaCl2;1mMのMgCl2;5mMのKClまたは緩衝食塩水を含む、請求項21に記載の医薬組成物。
- 対象動物で血餅形成を予防する方法であって、請求項1〜18、21または22に記載の組成物のいずれか1つを、当該対象動物で血餅形成を予防するために治療的に有効な量で当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
- 対象動物が心房細動を罹患するか、または深部静脈血栓症、卒中、心臓発作、または肺塞栓症を有するリスクがある、請求項23に記載の方法。
- 対象動物で血餅を治療する方法であって、VWFを標的とする薬剤を当該対象動物で血餅を減少させるために治療的に有効な量で当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
- VWF標的薬剤がアプタマーを含む、請求項25に記載の方法。
- VWF標的薬剤が請求項1〜18、20または21に記載の組成物のいずれか1つを含む、請求項26に記載の方法。
- 対象動物が深部静脈血栓症、卒中、心臓発作、または肺塞栓症を罹患する、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 解毒剤を当該アプタマーまたは当該VWF標的薬剤を中和するために治療的に有効な量で当該対象動物に投与する工程をさらに含む、請求項23〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 解毒剤が請求項19−20に記載の解毒剤のいずれか1つを含む、請求項29に記載の方法。
- 対象動物で血餅形成を予防するための医薬の製造における、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 対象動物で血餅を治療するための医薬の製造におけるVWF標的薬剤の使用。
- 当該対象動物が哺乳動物である、請求項23〜32のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 哺乳動物が人間である、請求項33に記載の方法または使用。
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