CN109982707A - 血管性血友病因子（vwf）靶向剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了能够抑制血管性血友病因子(VWF)的活性的适体。还提供了包含这些适体的药物组合物。提供了通过施用所述适体来预防对象中血凝块形成的方法，并且还提供了通过施用VWF靶向剂来治疗血凝块的方法。

Description

血管性血友病因子(VWF)靶向剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求保护于2016年9月16日提交的美国临时专利申请第62/395,642号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是由国立卫生研究院(National Institutes of Health)以奖励号1U54HL112307和5K12NS080223-3,220901的政府支持来进行的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请通过EFS-Web以电子方式提交，并包括以.txt格式电子递交的序列表。.txt文件包含2017年9月18日创建的名为“2017-09-185667-00413_ST25_Seq_Listing.txt”的序列表，大小为35,071字节。在该.txt文件中包含的序列表是说明书的部分，在此通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及用于预防和治疗血栓形成的组合物和方法。更具体地，本发明涉及血管性血友病因子(Von Willebrand Factor)(VWF)靶向剂及其在预防血液凝固(抗血栓形成活性)以及治疗和/或减少形成的血凝块(溶解血栓活性)中的用途。
背景技术
血栓形成是许多心脑血管疾病中的主要潜在问题，并且也是主要的术后并发症。过去25年来，已经开发出抗血栓药物，旨在减少与脑血管和心血管疾病相关的并发症。然而，在减少患者的血栓形成事件的同时，由于缺乏快速且可预测的可逆性，这些药物对出血风险产生了挑战。
适体是单链核酸，其基于其序列采用特定的二级和三级结构，使其能够与其靶标特异性结合。适体可以结合并抑制蛋白质靶标。其通常由称为SELEX(指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment))的体外选择过程产生。参见，例如，Ellington AD,Szostak JW.1990.In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands(与特定配体结合的RNA分子的体外选择)，Nature(自然)346：818-22；Tuerk C，Gold L.1990.Systematic evolution of ligands byexponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase(指数富集的配体系统进化：噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA配体)，Science(科学)249：505-10。能够将适体系统地分离成几乎任何蛋白质，并且可以进行广泛的分子修饰以优化其用于预期用途的药代动力学。开发用于治疗黄斑变性的哌加他尼钠(Pegaptanib sodium)是第一个批准使用的适体，其它化合物正在开发中。参见，例如，Wang P,Yang Y,Hong H,Zhang Y,Cai W,Fang D.2011.Aptamers as therapeutics in cardiovascular diseases(适体作为心血管疾病的治疗).Curr Med Chem(当代医学化学进展)18:4169-74。适体提供了一类有希望的更安全的抗血栓药，主要是适体活性可以用通用或合理设计的解毒剂快速逆转。参见，例如，Rusconi CP,Scardino E,Layzer J,Pitoc GA,Ortel TL等.2002,RNA aptamers asreversible antagonists of coagulation factor IXa(RNA适体作为凝血因子IXa的可逆拮抗剂),Nature(自然)419:90-4；WO/2008/066621 A3；和WO/2008/121354。
血管性血友病因子(VWF)是基于适体的抗血栓形成药的有希望的靶标。VWF是多聚体血浆糖蛋白，与糖蛋白IbIX结合，导致血小板粘附—血小板聚集的第一个非冗余步骤，导致血栓。基本亚单位为260kDa，由内皮和血小板产生。VWF是正常止血栓形成所必需的，并且是因子VIII的载体蛋白。已经证明靶向VWF的适体能抑制血凝块的形成。参见，例如，WO/2008/066621 A3。
然而，本领域需要新的VWF靶向适体，其具有增强的抗核酸酶降解的稳定性、更小的尺寸以促进化学合成以及增加的体内循环时间。
发明内容
本文提供了VWF靶向适体组合物和靶向这样的适体组合物的解毒剂组合物，以及使用VWF靶向剂来预防和治疗血凝块的方法。
一方面，提供了适体。所述适体可以包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或SEQ IDNOs:3-102中的任何一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸。参见下表1和表2。
或者，所述适体可以包含与包含从5’到3’的以下区的多核苷酸具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸：包含或由2个、3个、4个或5个核苷酸组成的第一茎形成区，包含或由核苷酸序列AAC组成的第一环区，包含或由3个、4个或5个核苷酸组成的第二茎形成区，包含或由核苷酸序列CC组成的第二环区，由2个至8个核苷酸组成的第三茎形成区，由1个至12个核苷酸和/或间隔序列组成的第三环区，由2个至8个核苷酸组成并能够与所述第三茎形成区形成茎的第四茎形成区，包含或由核苷酸C组成的第四环区，包含或由3个、4个或5个核苷酸组成并能够与所述第二茎形成区形成茎的第五茎形成区，包含或由核苷酸序列CAGA组成的第五环区，以及包含或由2个、3个、4个或5个核苷酸组成并能够与所述第一茎形成区形成茎的第六茎形成区。
在一些实施方案中，本文所述的适体的长度可以不超过58个、57个、56个、55个、54个、53个、52个、51个、50个、49个、48个、47个、46个、45个、44个、43个、42个、41个、40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个或16个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含未修饰的核苷酸。在另一些实施方案中，所述多核苷酸包含具有至少一个核苷酸碱基修饰的修饰形式。核苷酸碱基修饰包括核苷酸的2’O-甲基或2’氟修饰。
在一些实施方案中，所述适体对vWF的解离结合常数(Kd)小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM或小于2nM。
在另一个方面，还公开了包含本文所述适体的二聚体、三聚体和四聚体。
在另一个方面，提供了本文所述适体的解毒剂。所述解毒剂可包含与SEQ ID NOs:103-180中的任一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸(表3中的核苷酸序列)。或者，解毒剂可以包含多核苷酸，所述多核苷酸具有与本文所述适体中任一种的至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或更多个核苷酸反向互补并能够与之杂交的序列。
在又一个方面，提供了包含本文所述适体或解毒剂中任一种的药物组合物。所述药物组合物可包含药物载体、赋形剂或稀释剂(即，剂)，其在所使用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。
在另一个方面，提供了用于预防对象中血凝块形成的方法。所述方法可包括向对象施用治疗有效量的本文所述的适体组合物中的任一种，以预防所述对象中的血凝块形成。
在又一个方面，还提供了用于治疗对象中的血凝块的方法。所述方法可包括向对象施用治疗有效量的VWF靶向剂以减少所述对象中的血凝块。
附图说明
图1示出了VWF9.14截短物T10(SEQ ID NO:10)、T25(SEQ ID NO:6)、T49(SEQ IDNO:5)、T59(SEQ ID NO:4)和T79(SEQ ID NO:3)的总结。除了预测这些适体的二级结构外，这些适体的长度(nt)、Kd(nM)和Bmax(％)(如通过体外硝化纤维素过滤器结合测定所测定的)也示出在这些二级结构的底部。发现可以将适体截短60个至30个核苷酸，而不会降低其与VWF结合的能力。注意：以红色突出显示的核苷酸表示在每个后续渐进步骤中产生的主要缺失。以黄色突出显示的核苷酸表示碱基替换。VWF适体9.14T79是在3’端具有5个尿嘧啶核苷酸的T59。
图2示出了VWF9.14T59(SEQ ID NO:4)和VWF9.14T79(SEQ ID NO:3)适体的预测的二级结构。T79适体包括T59适体以及3’尿嘧啶尾部以促进解毒剂结合。T59和T79结构上的点分别示出了设计的解毒剂VWF9.14T59-AO11(AO11；SEQ ID NO:113)和VWF9.14T79-AO2(AO55；SEQ ID NO:157)的结合位置。
图3示出了优化的VWF适体T79 VRT7(SEQ ID NO:7)的预测的二级结构。2’-O-甲基修饰的碱基以红色突出显示，2'-氟代修饰的碱基以绿色突出显示；这些适体的长度(nt)、Kd(nM)和Bmax(％)(如通过体外硝化纤维素过滤器结合测定所测定的)示出在这些二级结构的底部。
图4示出了在FeCl3损伤之前注射载剂(无适体/阴性对照)的鼠动脉血栓形成模型实验中的颈动脉血流示踪。基于来自流量探针的测量，在移除FeCl3贴剂后约4分钟至5分钟内血管闭塞。
图5示出了在FeCl3损伤之前以0.375mg/kg(顶部示踪)或0.0375mg/kg(底部示踪)的剂量注射VWF9.14T79-VRT7适体的两个鼠动脉血栓形成模型实验中的颈动脉血流示踪。基于来自流量探针的测量，在移除FeCl3贴剂后，血管保持通畅>60分钟。
图6示出了在FeCl3损伤之前以0.375mg/kg的剂量注射PEG-VWF9.14T79-VRT7适体的鼠动脉血栓形成模型实验中的颈动脉血流示踪。基于来自流量探针的测量，在移除两片7.5％的FeCl3贴剂后，血管保持通畅>60分钟。
图7示出了在FeCl3损伤之前以多个剂量(0.009375mg/kg至0.375mg/kg)注射VWF9.14T79-VRT7适体的鼠动脉血栓形成模型实验中的颈动脉血流百分比的总结。示出了阴性对照以供参考。基于来自流量探针的测量，在移除FeCl3贴剂后60分钟内，低至0.0375mg/kg的剂量足以维持>75％的血流量(与贴剂放置之前的血流量相比)。
图8示出了在鼠隐静脉出血模型中注射盐水或PEG-VWF9.14T79-VRT7(SEQ ID NO:7)适体(剂量0.375mg/kg)后，在注射10倍摩尔比的VWF9.14T79-AO2(AO55；SEQ ID NO:157)解毒剂或无解毒剂(Neg)之前(PRE)和之后(POST)的凝块破坏(clot disruptions)数量的散点图。
图9A示出了在鼠隐静脉出血模型中注射盐水(对照)或VWF9.14T79-VRT7适体(剂量0.375mg/kg；SEQ ID NO:7)后，在注射10倍摩尔比的VWF9.14T79-AO2(DTRI-025；SEQ IDNO:157)解毒剂或无解毒剂(盐水)之前和之后的凝块破坏的散点图。
图9B示出了在鼠隐静脉出血模型中注射盐水(对照)或VWF9.14T79-VRT7适体(剂量0.375mg/kg；SEQ ID NO:7)后，在注射10倍摩尔比的VWF9.14T79-AO2(DTRI-025；SEQ IDNO:157)解毒剂或无解毒剂(盐水)之前和之后的凝块破坏的柱状图。
图10示出了来自组合的动脉血栓形成和隐静脉出血模型的单个研究的颈动脉血流示踪和时间线的实例。图的左侧了采集了血栓形成挑战后评估颈动脉血管通畅性的研究的前半部分。右侧采集了解毒剂施用之前和之后的血管横切、出血和凝块形成。
图11示出了在组合的鼠动脉血栓形成和隐静脉出血模型中注射PEG-VWF9.14T79-VRT7适体(SEQ ID NO:7)、胆固醇-VWF9.14T79-VRT7适体或弹性蛋白样多肽(ELP)-VWF9.14T79-VRT7适体后，在血栓形成隐静脉出血后注射VWF9.14T9-AO2(AO55；SEQ ID NO:157)解毒剂之前(PRE)和之后(POST)的破坏数量。
图12示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T59-AO3、-AO10和-AO11(分别为AO3(SEQ ID NO:105)、AO10(SEQID NO:112)和AO11(SEQ ID NO:113))的情况下，VWF9.14T59(SEQ ID NO:4)的血小板功能测定(PFA)结果。还示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T79-AO1(AO43；SEQ ID NO:145)和VWF9.14T79-AO2(AO55；SEQ ID NO:157)的情况下，适体VWF9.14T79(SEQ ID NO:3)的PFA结果。示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T82-AO1(AO46；SEQ ID NO:148)和VWF9.14T82-AO2(AO58；SEQ ID NO:160)的情况下，适体VWF9.14T82(SEQ ID NO:78)的结果。示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T84-AO1(AO48；SEQ ID NO:150)和VWF9.14T84-AO2(AO60；SEQ ID NO:162)的情况下，适体VWF9.14T84(SEQID NO:80)的结果。
图13示出了在具有和不具有各解毒剂AO61(SEQ ID NO:163)、AO62(SEQ ID NO:164)、AO63(SEQ ID NO:165)、AO64(SEQ ID NO:166)、AO65(SEQ ID NO:167)、AO66(SEQ IDNO:168)和AO67(SEQ ID NO:169))的情况下，VWF9.14T86(SEQ ID NO:82)、VWF9.14T87(SEQID NO:83)、VWF9.14T89(SEQ ID NO:85)、VWF9.14T90(SEQ ID NO:86)、VWF9.14T93(SEQ IDNO:89)、VWF9.14T94(SEQ ID NO:90)和VWF9.14T95(SEQ ID NO:91)的PFA结果。
图14示出了在不具有或具有不同摩尔比的解毒剂DTRI-038(SEQ ID NO:180)的情况下，VWF9.14T79vrt7(DTRI-031；SEQ ID NO:7)的预测的二级结构和PFA数据。
图15示出了T79vrt7/DTRI-031(SEQ ID NO:7)和T59vrt19(SEQ ID NO:4和表2)适体的预测的二级结构以及DTRI-006-DTRI-013适体的序列(分别参见表2和SEQ ID NOs:4、98、99、100和101)。DTRI-008(SEQ ID NO:4)示出没有影响并且与DTRI-006(SEQ ID NO:4)相当。DTRI-009(SEQ ID NO:98)示出与DTRI-006相当的KD但Bmax较低。DTRI-013(SEQ IDNO:101)示出与DTRI-006相当的KD但Bmax较低。
图16示出了DTRI-019(SEQ ID NO:8)适体的预测的二级结构和硝化纤维素过滤器结合测定数据。
图17示出了T79VRT7/DTRI-031(SEQ ID NO:7)适体的硝化纤维素过滤器结合测定数据。
图18示出了表示在用对照、rTPA(重组组织型纤溶酶原激活剂)、抗VWF适体(VWF9.14T79VRT7和胆固醇-VWF9.14T79-VRT7两者)或未灌注处理的小鼠中，在闭塞后多个时间点的初始颈动脉流量百分比的图。如图中所示，与rTPA相比，抗VWF适体(VWF9.14T79VRT7；SEQ ID NO:7)具有更好的溶解血栓活性。
图19示出了表示在用载剂、rTPA、抗VWF适体(VWF9.14T79-VRT7；SEQ ID NO:7)或抗VWF适体(VWF9.14T79-VRT7)和VWF解毒剂(VWF9.14T79-T79-AO2，也称为AO55；SEQ IDNO:157)处理的小鼠中的鼠颅内出血模型中血管损伤后的每搏输出量的图。
图20示出了适体9.14T79vrt7(SEQ ID NO:7)在高剪切下抑制血小板粘附，抑制全血中的血小板聚集并防止体内血栓形成。适体以剂量依赖性方式阻止人血小板粘附。图20A.缓冲液对照表明100％血小板粘附。将适体活性测量为对照的百分比。图20B.在该测定中，56nmol/L表明约50％的血小板粘附，而图20C.900nmol/L表明完全抑制(每组n＝3)。图20D.适体以剂量依赖性方式抑制血小板粘附，其中在56nmol/L至900nmol/L的剂量下显著抑制(p<0.05)(每组n＝3)。图20E.剂量响应曲线的线性回归分析测定适体的logIC50为1.86(72.5nmol/L)。
图21是示出PFA-100结果的图，所述结果表明T79vrt7(SEQ ID NO:7)完全抑制了血小板聚集。100nmol/L至400nmol/L的剂量超过测定的上限，并且与对照相比，25nM表明显著的血小板聚集(每组n＝4)(p<0.01)。
图22是示出鼠颈动脉血栓形成的图，剂量范围0.009375mg/kg至3mg/kg，与阴性对照相比，9.14T79vrt7(SEQ ID NO:7)处理的小鼠表明在剂量低至0.0185mg/kg时，颈动脉通畅(每组n＝3)。为清楚起见，剂量超过0.0375mg/kg未示出，但均表明血管通畅。
图23示出与rTPA相比，适体9.14T79vrt7/DTRI-031(SEQ ID NO:7)在鼠颈动脉闭塞中表现出更好的血栓溶解。图23A.与以10mg/kg剂量的rTPA处理的动物(n＝8)(p<0.05)和生理盐水对照(n＝8)(p<0.01)两者相比，以0.5mg/kg剂量的适体处理的动物(n＝8)表现出更好的血栓溶解。小鼠颈动脉的组织病理学表明，与图23C rTPA动物和图23D盐水对照(每组n＝8)相比，图23B.适体处理的动物血管通畅，没有闭塞性血栓。
图24示出了适体9.14T79vrt7/DTRI-031(SEQ ID NO:7)防止犬全血中总血栓形成分析系统中的血小板粘附和聚集，使犬中的颈动脉闭塞再通，并且表明没有脑出血或栓塞。图24A.与阴性盐水对照相比，用9.14T79vrt7以12.5nmol/L、18.75nmol/L、25nmol/L和100nmo/L的剂量孵育犬全血(每组n＝5)(p<0.05)。图24B.从每分钟的前10秒流过胶原蛋白小管的全血的静止图像。在对照组中看到的混浊斑块是聚集的血小板。9.14T79vrt7剂量为100nmol/L。(图24C至24G)在闭塞45分钟后，与图24F.rTPA或图24G.盐水对照相比，施用9.14T79vrt7导致在测试的3只狗中的每只狗中再通(图24C至24E)(每组n＝3)。与图24I.rTPA或图24J.对照相比，图24H.9.14T79vrt7不引起颅内出血或脑血栓栓塞(每组n＝3)。颈动脉组织学验证了与图24L.rTPA和图24M.对照相比，图24K.9.14T79vrt7处理的狗中闭塞段的再通(每组n＝3)。
图25示出了解毒剂寡核苷酸离体和在鼠股静脉出血模型中逆转9.14T79vrt7/DTRI-031(SEQ ID NO:7)。将所述图表示为未经任何处理的小鼠中正常止血的％。未经处理的对照组(未显示)类似于盐水处理的组(每组n＝7)。与对照和对照及盐水处理的组(p<0.0001)相比，以0.375mg/kg施用的9.14T79表明没有凝块破坏(n＝11)。在适体施用后5分钟添加解毒剂并在2分钟后测量凝块破坏显示出与从未接受适体的动物相似的完全出血逆转(n＝7)。与阴性对照相比，单独施用AO不会导致血栓形成增加(数据未示出)(*＝统计显著性)。
具体实施方式
本公开部分基于本发明人发现的新的优化的可逆VWF靶向适体，其可用于预防(抗血栓形成活性)和治疗(溶解血栓活性)血凝块两者。与先前的VWF靶向适体相比，本发明公开的VWF靶向适体具有增强的抗核酸酶降解稳定性，大小更小以促进化学合成，并显示出体内循环时间的增加。
本文公开了适体和解毒剂的组合物以及使用VWF靶向剂如新发现的VWF靶向适体来预防和治疗对象中的血凝块的方法。这些组合物和方法可用于若干应用，包括但不限于，预防或治疗血栓(体外、体内或离体)，或者预防或治疗与中风相关的血栓、脑血管血栓、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)、心房颤动、冠状动脉血栓、心内血栓、术后血栓、癌症诱导的血栓形成、癌症相关的凝血酶表达、感染以及弥散性血管内凝血(DIC)。
本文提供了适体。如本文所用，术语“适体”是指以高亲和力与靶标分子特异性结合的单链寡核苷酸。通过筛选以高亲和力与靶标结合的组合寡核苷酸文库，可以产生针对靶标分子如VWF的适体(参见，例如，Ellington和Szostak，Nature(自然)1990；346：8 18-22(1990)，Tuerk和Gold，Science(科学)249：505-l 0(1990))。本文公开的适体可使用本领域公知的方法来合成。例如，所公开的适体可以使用多个商业供应商采用的标准寡核苷酸合成技术来合成，所述商业供应商包括综合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT))、西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)、生命技术公司(Life Technologies)或生物合成公司(Bio-Synthesis,Inc)。
适体可包括与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NOS:3-102中的任一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸。适体可包括与SEQ ID NOs:3-6(表1中的核苷酸序列T25、T49、T59或T79)中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，适体包括SEQ ID NO:7(表2中的T79vrt7)、SEQ ID NO:8(表2中的核苷酸序列DTRI-019)或SEQ ID NO:9(表2中的核苷酸序列DTRI-021)。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“多核苷酸序列”、“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(这些术语可互换使用)，或其任何片段。这些短语可以指基因组的、天然或合成来源的DNA或RNA。
关于核苷酸序列，术语“序列同一性”、“百分比同一性”和“％同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个核苷酸序列之间碱基配对的百分比。这样的算法可以以标准化和可再现的方式在待比较的序列中插入间隙，以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。如本领域所理解的，可以测定核苷酸序列的序列同一性。(参见，例如，美国专利第7,396,664号)。(美国)国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)基本局部比对检索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)(BLAST)提供了一套常用且免费使用的序列比较算法，其可从几个来源获得，包括马里兰州贝塞斯达的NCBI(NCBI，Bethesda，Md.)的网站。BLAST软件套件包括多个序列分析程序，包括“blastn”，其用于将已知核苷酸序列与来自多个数据库的其它多核苷酸序列进行比对。还可获得称为“BLAST 2序列”的工具，其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。可以在NCBI网站上以交互方式访问和使用“BLAST 2序列”。
关于核苷酸序列，序列同一性是在整个定义的核苷酸序列的长度上测量的，例如，如通过本文所鉴定的特定序列所定义的。此外，如本文所测量的，序列同一性是基于核苷酸序列中核苷酸碱基的同一性，而不考虑对核苷酸序列的任何另外修饰。例如，本文所述的表中的核苷酸序列可包括对核苷酸序列的修饰，如2’氟、2’O-甲基和反向脱氧胸苷(idT)修饰。在测定序列同一性时不考虑这些修饰。因此，如果碱基，例如，是2’-氟腺嘌呤(或2’O-甲基等)，则为了测定与另一序列的序列同一性，应将其理解为腺嘌呤。同样地，在测定序列同一性时也不考虑对本文所述表中的核苷酸序列的3’idT修饰。
或者，适体可以包含与包含从5’到3’的以下区的多核苷酸具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸：包含或由2个、3个、4个或5个核苷酸组成的第一茎形成区，包含或由核苷酸序列AAC组成的第一环区，包含或由3个、4个或5个核苷酸组成的第二茎形成区，包含或由核苷酸序列CC组成的第二环区，由2个至8个核苷酸组成的第三茎形成区，由1个至12个核苷酸或间隔序列组成的第三环区，由2个至8个核苷酸组成并能够与第三茎形成区形成茎的第四茎形成区，包含或由核苷酸C组成的第四环区，包含或由3个、4个或5个核苷酸组成并能够与第二茎形成区形成茎的第五茎形成区，包含或由核苷酸序列CAGA组成的第五环区，以及包含或由2个、3个、4个或5个核苷酸组成并能够与第一茎形成区形成茎的第六茎形成区。将这样的适体的非限制性实例显示为图1至3和图15至16中的T25、T49、T59、T59 vrt19、T79、T79 vrt7或DTRI-019。
如本文所用的，“间隔序列”可以是不干扰适体的结合活性的任何化学间隔物。例如，间隔序列可包括，但不限于，六乙二醇间隔物(参见例如DTRI-009)、C3间隔物、间隔物9或本领域技术人员已知的任何其它合适的稳定接头，其将促进和保持适体的正确折叠和二级结构。
基于例如图1至3和图15至16中示出的一般适体结构，本领域普通技术人员将容易地认识到可以对序列进行若干修饰，同时保留适体的整体结构和推测的功能。例如，本领域普通技术人员可以简单地将第一茎形成区ACG和第六茎形成区CGU分别转换为UGC和GCA或CCG和CGG(DTRI-013；SEQ ID NO:101)，并且仍保留适体的茎结构。另外，可以对茎区域进行修饰，其改变茎区域内的碱基，但保留整个嘧啶和嘌呤碱基组成，使得茎区域在相似的解链温度下杂交。普通技术人员还将认识到，对适体做出的干扰一般适体茎环结构的改变可能会导致适体不能有效地与其靶标结合。
在一些实施方案中，适体可包含与包含从5’到3’以下序列的多核苷酸具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸：SEQ IDNO:1(CGAAC(U/T)GCCC(U/T)C)、由1个至18个(或其中任何范围)核苷酸或间隔序列组成的可变核苷酸序列以及SEQ ID NO:2(GACGCACAGACG)。
如本文所用的，“可变核苷酸序列”可以是给定长度的任何可能的核苷酸序列。例如，由5个核苷酸组成的“可变核苷酸序列”可包括具有5个核苷酸的45种(或1,025种)可能的核苷酸序列中的任一种。
在一些实施方案中，适体的长度可以不超过58个、57个、56个、55个、54个、53个、52个、51个、50个、49个、48个、47个、46个、45个、44个、43个、42个、41个、40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个或16个核苷酸。
在一些实施方案中，适体对于人VWF蛋白的解离常数(KD)可以小于150纳摩尔、125纳摩尔、100纳摩尔、90纳摩尔、80纳摩尔、70纳摩尔、65纳摩尔、60纳摩尔、55纳摩尔、50纳摩尔、45纳摩尔、40纳摩尔、35纳摩尔、30纳摩尔、25纳摩尔、20纳摩尔、15纳摩尔、10纳摩尔、5纳摩尔、2.5纳摩尔、2纳摩尔、1纳摩尔、0.5纳摩尔或0.1纳摩尔(nM)。适体的KD可以使用本发明人在实施例中使用的方法来测量。例如，可以进行使用双过滤器硝化纤维素过滤器结合测定的与人VWF蛋白的结合研究。
适体可以包含多核苷酸(RNA、DNA或肽核酸(PNA))，所述多核苷酸为未修饰形式或者可以是包括至少一个核苷酸碱基修饰的修饰形式。多核苷酸的核苷酸碱基修饰，例如，保护多核苷酸免受核酸酶降解和/或增加多核苷酸的稳定性是本领域公知的。根据本发明可使用的常见核苷酸碱基修饰包括，但不限于，脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基碱基、2’-氟碱基、2’氨基碱基、反向脱氧胸苷碱基、5’修饰和3’修饰。
在一些实施方案中，适体可包含多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一个选自以下的核苷酸碱基修饰：2’-氟修饰、2’O-甲基修饰、5’修饰和3’修饰。
通常的5’修饰可包括，但不限于，反向脱氧胸苷碱基、接头序列如C6的添加、胆固醇的添加、可与另一部分如PEG缀合的反应性接头序列的添加。通常的3’修饰可包括，但不限于，反向脱氧胸苷碱基和反向无碱基残基。
在一些实施方案中，适体还可以包含在多核苷酸的5’端或3’端的尾核苷酸序列，其不能与多核苷酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个连续核苷酸碱基配对。尾核苷酸序列可以由2个至20个核苷酸或其中的任何范围组成。作为示例性尾核苷酸序列，本发明人将5-核苷酸尿嘧啶(oligo-U尾)添加到适体的3’末端，作为用于解毒剂结合的潜在人工成核位点。因此，在一些实施方案中，尾核苷酸序列可包括核苷酸序列(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)。然而，也可以设想其它核苷酸序列可用作尾核苷酸序列，以使得其不能与适体的多核苷酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个连续核苷酸碱基配对。此外，也将尾核苷酸序列成功地添加到适体的5’端，而不会显著影响适体的活性。
作为另外的5’和/或3’修饰，适体可以包括包含5’接头和/或3’接头的多核苷酸。多核苷酸的常见5’和/或3’接头是本领域已知的，可以包括肽、氨基酸、核酸以及同功能(homofunctional)接头或异功能(heterofunctional)接头。可促进与适体形成共价键的特别有用的缀合试剂可以包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和/或马来酰亚胺或使用点击化学。多核苷酸的通常的5’和/或3’接头可以包括但不限于，氨基C3、C4、C5、C6或C12接头。
适体可以进一步包括稳定剂。如本文所用的，“稳定剂”是指可以增加多核苷酸在体内的稳定性和/或增加其循环时间的任何物质。通常的稳定剂是本领域已知的并且可以包括，但不限于，聚乙二醇、胆固醇(PEG)、白蛋白或弹性蛋白样多肽。
适体与稳定剂可以共价或非共价方式“连接”。此外，适体与稳定剂可以使用本文所述的5’和/或3’接头来连接。适体与稳定剂可以在适体的5’端和/或3’端进行连接。为了以非共价方式连接适体与稳定剂，适体与稳定剂可以通过标签系统进行连接。“标签系统”可包括能够以高亲和力相互结合的任何试剂组。几种标签系统在本领域中是公知的并且包括，但不限于，生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白链菌素、生物素/中性抗生物素蛋白或地高辛配基(DIG)系统。在一些实施方案中，标签系统包含生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生蛋白链菌素。在这样的实施方案中，可以在5’端或3’端对适体进行修饰以包含生物素，同时可以对稳定剂进行修饰以包含抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。或者，可以在5’端或3’端对适体进行修饰以包含抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，同时可以对稳定剂进行修饰以包含生物素。
还提供了包含本文所述的适体中任何一种的二聚体、三聚体和四聚体。“二聚体”是指两个适体分子连接在一起，以便例如增加多核苷酸在体内的稳定性和/或增加其循环时间。“三聚体”是指三个适体分子连接在一起，以便例如增加多核苷酸在体内的稳定性和/或增加其循环时间。“四聚体”是指将四个适体分子连接在一起，以便例如增加多核苷酸在体内的稳定性和/或增加其循环时间。适体分子可以以共价方式、非共价方式或两者的组合连接在一起。适体分子可以在其5’端或3’端进行连接。为了以非共价方式连接适体，适体可以通过标签系统或经由支架系统来连接。
本文还提供了解毒剂并且其包含与SEQ ID NOS:103-180中的任一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸(表3中的核苷酸序列)。或者，解毒剂可以包含多核苷酸，所述多核苷酸具有与本文所述适体中任一个的至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或更多个核苷酸反向互补并能够与之杂交的序列。
提供了包含本文所述的任何适体或解毒剂的药物组合物。药物组合物可包含药物载体、赋形剂或稀释剂(即，剂)，其在所使用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。通常，药剂处于含水pH缓冲溶液中。药物载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子(salt-forming counterions)如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM牌表面活性剂、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM表面活性剂。在一些实施方案中，药物载体可包括缓冲液，其包含约20mM Hepes，pH 7.4；150mMNaCl；1mM CaCl2；1mM MgCl2；5mM KCl。
提供了用于预防对象中血凝块形成的方法。所述方法可包括向对象施用治疗有效量的本文所述的适体组合物中的任一种，以预防对象中的血凝块形成。“预防血凝块形成”可包括降低血凝块的可能性，减小血凝块的大小或减缓血液凝固的进一步发展。
如本文所用的，术语“对象”是指人和非人动物两者。本公开的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物，羊、狗、猫、马、牛、小鼠、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一些实施方案中，对象是人患者。
需要血凝块预防的对象可能需要预防与以下相关的血凝块：例如，但不限于，中风、脑血管血栓、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)、心房颤动、冠状动脉血栓、心内血栓、术后血栓、癌症诱导的血栓形成、癌症相关的凝血酶表达、感染、弥散性血管内凝血(DIC)和动脉血栓形成包括脑动脉、头颈部的冠状动脉和外周动脉、内脏动脉、手臂和腿动脉。在一些实施方案中，需要血凝块预防的对象可能患有心房颤动或处于患有深静脉血栓形成、中风、心脏病发作或肺栓塞的风险中。
如本文所用的，治疗有效量或有效量意指当向对象施用以预防或治疗血凝块时，足以实现治疗(如上所定义的)的组合物的量。治疗有效量将根据制剂或组合物、疾病及其严重程度和待治疗对象的年龄、体重、身体状况和响应性而变化。
除了公开预防对象中血凝块的方法之外，本发明人还证明VWF靶向剂可以以溶解血栓的方式用于减少或“破坏”已经形成的血凝块。在实施例中，本发明人证明，所公开的VWF靶向适体之一，T79vrt7/DTRI-031，在鼠颈动脉闭塞模型中优于重组组织型纤溶酶原激活剂(rTPA)。这些结果令人惊讶地证明VWF靶向剂还可用于治疗形成的血凝块(溶解血栓活性)以及用于预防血凝块形成(抗血栓形成活性)。
基于VWF靶向剂的该新用途，还提供了用于治疗对象中血凝块的方法。所述方法可包括向对象施用治疗有效量的VWF靶向剂以减少对象中的血凝块。“治疗血凝块”或“减少血凝块”是指减小血凝块的大小和/或形状，从而使血流在凝块部位处增加。
需要血凝块治疗的对象可能需要治疗与以下相关的血凝块：例如，但不限于，中风、脑血管血栓、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)、心房颤动、冠状动脉血栓、心内血栓、术后血栓、癌症诱导的血栓形成、癌症相关的凝血酶表达、感染、弥散性血管内凝血(DIC)和动脉血栓形成包括脑动脉、头颈部的冠状动脉和外周动脉、内脏动脉、手臂和腿动脉。在一些实施方案中，需要血凝块治疗的对象患有深静脉血栓形成、中风、心脏病发作或肺栓塞。
如本文所用的，“VWF靶向剂”是能够部分地或完全地阻断、抑制或中和血管性血友病因子(VWF)蛋白的一种或多种生物活性的任何剂，其包括，但不限于，多肽、多核苷酸或小分子。在一些实施方案中，VWF靶向剂可包括能够与VWF蛋白的A1结构域结合并阻断VWF蛋白与gp1bα蛋白的结合的剂。VWF靶向剂可以以直接或间接的方式起作用。例如，VWF靶向剂可以直接与VWF蛋白结合，从而在体外或体内部分地或完全地阻断、抑制或中和VWF蛋白的一种或多种生物活性。VWF靶向剂还可以通过(1)与可以与VWF结合的另一分子相互作用(例如，激活、诱导、阻断或抑制)或(2)调节或影响细胞中VWF蛋白的表达(即，转录或翻译)间接地起作用。
VWF蛋白可以是在任何哺乳动物中发现的VWF蛋白的任一种，所述哺乳动物包括，但不限于，人或驯养动物如狗、猫、马、牛、猪、小鼠或大鼠。
VWF靶向剂可以是多肽包括，但不限于，肽或抗体。如本文所用的，术语“抗体”以本领域中所用的最广泛意义使用，是指基于抗体的多肽亲和剂。例如，抗体可包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或抗体片段如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双抗体、线性抗体、纳米抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体可以是嵌合的、人源化的或完全人的。抗体可以是五类已知的主要免疫球蛋白中的任何一类，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一些实施方案中，VWF靶向剂可以是抗VWF抗体，其能够与VWF蛋白结合，从而部分地或完全地阻断、抑制或中和VWF蛋白的一种或多种生物活性。合适的抗VWF抗体包括，但不限于，caplacizumab、ALX-0681或ALX-0081。
可用本领域公知的技术如噬菌体展示来鉴定可用作VWF靶向剂的肽。
在一些实施方案中，VWF靶向剂可以是适体，其能够与VWF蛋白结合，从而部分地或完全地阻断、抑制或中和VWF蛋白的一种或多种生物活性。合适的VWF适体包括，但不限于，Sullenger等在WO/2008/066621 A3中描述的那些和本文所述的适体。
VWF靶向剂还可以是小分子。小分子可以是分子量低于约2500道尔顿、2000道尔顿、1000道尔顿或500道尔顿的化学分子。
本文所述的预防或治疗血凝块的方法可进一步包括向对象施用治疗有效量的解毒剂以中和适体或VWF靶向剂。“中和”适体或VWF靶向剂是指降低适体或VWF靶向剂的抗血栓形成或溶解血栓活性。
可根据本发明方法使用的解毒剂可包括序列特异性解毒剂如本文所述的解毒剂和WO/2008/066621 A3中描述的那些。解毒剂还可以包括在例如，WO/2008/121354中描述的序列非特异性解毒剂(即，阳离子聚合物)。
本文所述的组合物(即，适体、解毒剂和药物组合物)可通过本领域技术人员已知的任何方式施用，包括但不限于，经口、局部、鼻内、腹膜内、经肠胃外、静脉内、肌内、皮下、鞘内、经皮、鼻咽、病灶内、肿瘤内、皮内或经粘膜吸收。因此，可以将组合物配制成可摄取的、可注射的、局部的或栓剂制剂。向对象施用组合物可以以剂量依赖性方式表现出有益效果。因此，在宽限度内，与施用较小量的组合物相比，施用较大量的组合物预期会获得增加的有益生物效应。此外，还考虑了在低于观察到的毒性水平的剂量下的功效。
应当理解，在任何给定情况下施用的具体剂量将根据所施用的组合物、待治疗或抑制的疾病、对象的状况以及可能改变组合物的活性或对象的响应的其它相关医学因素来进行调整，如本领域技术人员所公知的。例如，特定对象的具体剂量取决于年龄、体重、一般健康状况、饮食、施用时间和方式、排泄速率、组合使用的药物和应用治疗的特定疾病的严重程度。给定患者的剂量可以使用常规考虑来确定，例如，通过本文所述组合物与已知剂的不同活性的惯用比较，如通过适当的常规药理学方案。
对象的最大剂量是不会引起不期望的或不可忍受的副作用的最高剂量。关于个体治疗方案的变量数量很大，并且预计剂量范围相当大。施用途径也将影响剂量要求。预期与不治疗相比，组合物的剂量将预防或治疗血凝块(blot clots)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
可以将本文所述的组合物向对象施用一次或多于一次，以有效地预防或治疗血凝块。合适的剂量范围为大约几百微克有效成分，其中范围为约0.01mg/kg/天至10mg/kg/天，范围优选为约0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。需要施用的有效成分的精确量取决于执业医生的判断，并且可能是每个对象特有的。对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文所述组合物的治疗有效量将尤其取决于施用方案、施用的药物的单位剂量，组合物是否与其它治疗剂组合施用、受体的状态和健康以及特定组合物的治疗活性。
本公开不限于本文所述的构造、组分的排列或方法步骤的具体细节。根据下面的公开内容，本文公开的组合物和方法能够以对于本领域技术人员而言显而易见的多种方式进行制备、实施、使用、进行和/或形成。本文使用的措辞和术语仅用于描述的目的，不应视为对权利要求的范围的限制。在说明书和权利要求书中用来表示多种结构或方法步骤的顺序指示符如第一、第二和第三，并不意味着解释为指示任何特定的结构或步骤，或者这样的结构或步骤的任何特定顺序或配置。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均能够以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在促进本公开，并不意味着对本公开的范围的任何限制。说明书中的任何语言和附图中示出的任何结构都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于所公开主题的实施是必不可少的。术语“包括(including)”、“包含(comprising)”或“具有(having)”及其变型在本文的使用意指包含其后列出的要素及其等同物以及另外的要素。也将叙述为“包括”、“包含”或“具有”某些要素的实施方案考虑为“基本上由”和“由”那些某些要素组成。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。例如，如果将浓度范围表示为1％至50％，则旨在本说明书中明确列举诸如2％至40％，10％至30％或1％至3％等的值。这些仅是特定意图的举例，在所列举的最低值与最高值之间且包括最低值与最高值的所有可能的数值组合，均视为在本公开中明确地说明了。使用词语“约”来描述特定的所述量或量的范围意味着表示非常接近所述量的值包括在该量中，如由于制造公差、形成测量的仪器和人为误差等而可能或自然会考虑的值。除非另有说明，否则所有涉及量的百分比均以重量计。
不承认任何参考文献，包括本说明书中引用的任何非专利或专利文献，构成现有技术。特别地，应理解，除非另有说明，否则本文中对任何文件的引用并不构成承认任何这些文件构成美国或任何其它国家的本领域公知常识的部分。对参考文献的任何讨论均陈述其作者所声称的内容，并且本申请人保留质疑本文引用的任何文献的准确性和相关性的权利。除非另有明确说明，否则本文引用的所有参考文献均通过引用的方式以其整体完全地并入本文。如果在引用的参考文献中发现的任何定义和/或描述之间存在任何差异，则本公开将予以控制。
除非上下文另有说明或指示，否则术语“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”意指“一个或多个”。例如，“一种蛋白质”或“一种RNA”应分别解释为意指“一种或多种蛋白质”或“一种或多种RNA”。
以下实施例仅用于说明，并不意味着对本发明或所附权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1-VWF适体优化
材料和方法
RNA适体制备和折叠
使用常规寡核苷酸合成方法在内部合成RNA适体。在血小板功能分析(PFA)和体内模型之前，可以使基于RNA的适体在适当的生理缓冲液，例如，血小板结合缓冲液(20mMHepes，pH 7.4；150mM NaCl；1mM CaCl2；1mM MgCl2；5mM KCl)中“折叠”。将适体溶液加热至95℃保持3分钟，立即置于冰上3分钟，然后使其在约5分钟至10分钟内达到室温。
适体结合测定
亲和常数(Kd值)使用双过滤器硝化纤维素过滤器结合测定来测定(Rusconi等,Thromb.Haemost.84:841-848(2000))。所有结合研究在结合缓冲液F(20mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2和0.01％BSA)中于37℃进行。人纯化的VWF(不含因子VIII)购自血液技术公司(Haematologic Technologies Inc.)(佛蒙特州埃塞克斯路口(EssexJunction，VT))并用于双过滤器硝化纤维素过滤器结合测定以测定适体的Kd。简言之，RNA在5’端用T4多核苷酸激酶(马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs，Beverly，MA))和[γ32P]ATP(新泽西州皮斯卡塔韦市的阿默舍姆制药生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ))进行末端标记(Fitzwater和Polisky，Methods Enzymol.267：275-301(1996))。将末端标记的RNA在结合缓冲液F中稀释，在65℃热变性5分钟，随后在37℃平衡。通过将示踪的32P-RNA与不同浓度的VWF蛋白在结合缓冲液F中于37℃孵育5分钟来进行直接结合。与硝化纤维素膜结合的核酸-蛋白质复合物部分用磷光成像仪(加利福尼亚州桑尼维尔的分子动力学(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA))来定量。从结合中减去放射性标记的核酸的非特异性结合，使得仅保留特异性结合(Wong和Lohman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432(1993))。
FeCl3诱导的动脉血栓形成
描述了用于诱导小鼠中动脉血栓形成的FeCl3化学损伤模型。在插管前，在密封室中吸入4％至5％异氟烷来诱导麻醉5分钟至7分钟。在气体诱导后，用27g1/2”针头根据效果以100mg/kg至250mg/kg的剂量IP(腹膜内)给予阿佛丁/三溴乙醇的单次注射(1.25％，12.5mg/ml)。总体积范围为0.15cc至0.50cc，取决于重量(通常为20g至25g小鼠)。在尝试插管之前，将动物返回诱导室1分钟至2分钟以上。将小鼠移至特制的插管支架上并用无针20号至22号导管插管。一旦确认插管，就将腹侧颈部剃毛并将小鼠转移至加热的手术台上。在背侧卧位时，将小鼠立即连接到哈佛仪器(Harvard Apparatus)啮齿动物呼吸机上，并在约90次呼吸/分钟至110次呼吸/分钟和～0.2ml的潮气量下用70％氮气：30％氧气混合物维持。将异氟烷维持在～1％至3％。使用Physitemp TCAT-2DF将体温维持在约37℃。
在确保麻醉手术平面后，进行皮肤的颈部中线切口，并直接切开筋膜以暴露右颈总动脉。在暴露并分离右颈总动脉后，通过钝器解剖暴露左颈静脉并放置三根7-0结扎丝线。用显微外科剪刀制作小切口，用单根7-0结扎丝线保持止血，并将PE-10聚乙烯导管或等同物置于静脉中并用剩余的两根7-0结扎丝线固定。一旦用0.9％盐水确认导管通畅，就用哈佛仪器(Harvard Apparatus)PHD2000(或等同物)输注泵以0.5μL/min至3μL/min的速率开始连续速率输注0.9％盐水，并保持直至研究结束。将0.5-PSB通过时间流量探针(transit-time flow probe)(跨音速系统公司(Transonic Systems Inc.)放置在颈动脉周围以测量血流量。在整个研究过程中使用LabChart软件(埃德仪器(ADInstruments))捕获血流量和温度测量值。一旦将正常血流量(1.0mL/min至3.0mL/min)维持至少5分钟，就将抗血栓形成测试药物或对照，通过颈静脉导管用基于盐水的载剂以100μl至200μl的体积施用并在一分钟时间内给予。适体药物剂量范围为0.005mg/kg至1.0mg/kg。
在药物或解毒剂施用后约5分钟，用2.5％至10％FeCl3饱和一两片小片滤纸(1mm×2mm)。然后将这些“贴剂”放置在靠近流量探针的暴露的颈动脉的腹侧+/-背侧。将其留在原位3分钟。在移除贴剂后，用0.9％盐水轻轻冲洗动脉的相应区域。然后连续测量颈动脉血液通过时间直至研究的终点。将所述程序的终点定义为稳定血栓形成后(即～0.0ml/min颈动脉通过时间)不超过60分钟或施用FeCl3贴剂后不超过60分钟。一旦达到终点，就将异氟烷增加至2％至4％。然后将两根环绕的7-0结扎丝线放置在靠近血栓形成的部位的动脉上。移除流量探针并在结扎丝线之间和在远端约5mm至8mm的点处横切动脉。移除动脉切片进行组织病理学检查。然后通过过量的麻醉气体随后用第二种物理方法对动物实施安乐死。
隐静脉出血模型
描述了用于评估小鼠止血的隐静脉出血模型。在密封室中吸入4％至5％异氟烷来诱导麻醉2分钟至3分钟。用27g1/2”针头根据效果以100mg/kg至250mg/kg的剂量腹膜内(IP)给予阿佛丁/三溴乙醇的单次注射(1.25％，12.5mg/ml)。总体积范围为0.15cc至0.50cc，取决于重量(通常为20g至25g小鼠)。然后，在插管之前，将动物返回诱导室1分钟至2分钟以上。然后，将小鼠移至特制的插管支架上并用无针20号至22号导管插管。一旦确认插管，就将腹侧颈部和两个下肢的内侧剃毛并将小鼠转移至加热的手术台上。在背侧卧位时，将小鼠立即连接到哈佛仪器(Harvard Apparatus)啮齿动物呼吸机上，并在约90次呼吸/分钟至110次呼吸/分钟和～0.2ml的潮气量下用70％氮气：30％氧气混合物维持。将异氟烷维持在～1％至3％。使用Physitemp TCAT-2DF和直肠探针将体温维持在约37℃。
在确保麻醉手术平面后，进行皮肤的颈部中线切口。通过钝器解剖完成左颈静脉的手术暴露。一旦分离出颈静脉，就将PE-10聚乙烯导管或等同物置于静脉中并用两个环绕的7-0结扎丝线固定。一旦用0.9％盐水确认导管通畅，就用哈佛仪器(Harvard Apparatus)PHD2000(或等同物)输注泵以0.5μL/min至3μL/min的速率开始连续速率输注0.9％盐水，并保持直至研究结束。在完成导管放置后，切开左侧或右侧下肢内侧的皮肤以暴露一段隐静脉血管束(隐静脉和动脉、内侧隐静脉)。将所述束保持在1滴至2滴0.9％盐水下以防止干燥。
将测试药物或对照通过颈静脉导管用盐水载剂以100μL至200μL的体积IV(静脉内)施用，并在一分钟时间内给予。适体药物剂量范围为0.005mg/kg至1.0mg/kg。在给予测试药物后约5分钟至120分钟，用23g至26g针头横切暴露的隐静脉，然后用微型解剖剪刀在血管的远端部分中进行～1mm至2mm的纵向切口。用锥形迷你棉签涂药器轻轻地将渗出的血吸走，直到止血发生。然后用23g至26g针头移除血管远端部分的凝块以重新开始出血。再次吸走血液，直到再次发生止血。在每次止血发生后重复凝块破坏，在初始损伤后持续总时间为15分钟至30分钟。在整个研究过程中使用LabChart软件(埃德仪器(ADInstruments))采集损伤、凝块破坏、止血和温度测量值。然后在测试药物后通过颈静脉导管以100μL至200μL的体积IV(静脉内)施用相应的解毒剂分子。基于RNA的寡核苷酸解毒剂范围为0.005mg/kg至100mg/kg。在施用解毒剂后约5分钟，再次用23g至26g针头移除血管远端部分上的凝块以重新开始出血。将血液吸走，直到再次发生止血。在每次止血发生后重复凝块破坏，总时间为15分钟至30分钟。一旦达到终点，就通过心脏穿刺收集或从尾静脉中取出～0.5mL血液。然后通过过量的麻醉气体随后用第二种物理方法对动物实施安乐死。
PFA100方案
血小板功能分析仪，PFA-100(伊利诺伊州迪尔菲尔德戴德·贝林(DadeBehring，Deerfield，IL))提供了抗凝血全血中血小板功能的定量测量(Ortel等，Thromb.Haemost.84：93-97(2000))。简言之，将适体在适当的缓冲液(即，150mM NaCl；20mMHEPES pH：7.4；5mM KCl；1mM MgCl2和1mM CaCl2，或150mM NaCl；20mM HEPES pH：7.4；2mMCaCl2；或PBS)中稀释并热变性。将适体以指定的最终浓度添加到新鲜全血中；在RT(室温下)孵育3分钟至5分钟，然后在PFA-100中使用胶原蛋白/ADP测试盒运行。PFA-100的最长封闭时间(closing time)为300秒。通过将全血与适体在缓冲液中混合，然后施用解毒剂并在PFA中测量来测量适体的解毒剂活性。
结果
VWF9.14变体
为了优化VWF9.14适体，我们产生了几种VWF9.14适体截短变体和几种VWF9.14适体修饰变体。参见，例如，图1至3。将VWF9.14适体截短变体列于下表1中。
表1：截短的适体
A＝2’OH腺嘌呤；C＝2’氟胞嘧啶；G＝2’OH鸟嘌呤；U＝2’氟尿嘧啶
idT＝在3’端的反向脱氧胸苷(序列长度和SEQ ID NOs：以下不包括idT)
NB＝未结合；ND＝未测定
将所产生的VWF9.14适体修饰变体列于下表2中。
表2–VWF9.14适体截短物的修饰形式
表格说明：所有序列均为5’至3’方向
长度不包括反向脱氧胸苷
(C6L)＝己基氨基接头；(6GLY)＝六乙二醇接头(使用9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇、1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺并入的)；胆固醇＝在5’端并入的胆固醇三甘醇amidite
NB＝未结合；ND＝未测定
除了创建VWF9.14适体截短变体和VWF9.14适体修饰变体之外，我们还创建了几种靶向这些变体的解毒剂序列，其列于下表3中。
表3：解毒剂序列
所有序列均以5’至3’方向示出。
长度不包括反向脱氧胸苷
mG＝2’O-甲基G；mA＝2’O-甲基A；mC＝2’O-甲基C；mU＝2’O-甲基U；
idT-反向脱氧胸苷
结合研究
为了测定VWF9.14适体变体对VWF蛋白的结合亲和力，我们用几种变体进行结合测定。结合数据总结在上面的表1至2中。还参见图1和图16至17。
VWF9.14适体变体的PFA分析
如图12和13所示，我们在具有和不具有解毒剂VWF9.14T59-AO3、-AO10和-AO11(分别为AO3、AO10和AO11)的情况下，进行了VWF9.14T59的血小板功能测定(PFA)。还示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T79-AO1(AO43)和VWF9.14T79-AO2(AO55)的情况下，适体VWF9.14T79的PFA结果。示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T82-AO1(AO46)和VWF9.14T82-AO2(AO58)的情况下，适体VWF9.14T82的结果。示出了在具有和不具有解毒剂VWF9.14T84-AO1(AO48)和VWF9.14T84-AO2(AO60)的情况下，适体VWF9.14T84的结果。这些结果表明，使用设计的解毒剂可以逆转几种VWF9.14适体的抗血栓形成活性。
VWF9.14适体变体的体内测试
在鼠动脉血栓形成模型和鼠隐静脉出血模型中测试了几种VWF9.14适体变体。参见图4至11。在鼠动脉血栓形成模型中，将左颈静脉插管并将右颈动脉暴露并放置流量探针。5分钟后，将指定的载剂i.v.(静脉内)注射到小鼠中，并将10％FeCl3贴剂放置在颈动脉上3分钟。然后监测颈动脉中的血流量1小时并使用探针记录。在鼠动脉血栓形成模型中，在FeCl3损伤之前注射载剂(没有适体/阴性对照)导致血管在移除FeCl3贴剂后约2分钟闭塞。参见图4。另一方面，在FeCl3损伤之前，以0.375mg/kg的剂量将T79vrt7/DTRI-031或PEG-VWF9.14T79-VRT7/DTRI-031适体注射到该模型中导致血管在移除FeCl3贴剂后60分钟保持通畅。参见图5和图7。这些结果表明适体具有有效的抗血栓形成活性。
在FeCl3损伤之前，还以0.0375mg/kg的剂量将VWF9.14T79-VRT7适体注射到所述模型中，其导致血管在移除FeCl3贴剂后>60分钟保持通畅。参见图5。该结果表明VWF9.14T79-VRT7适体的剂量可以降低并且仍然表现出有效的抗血栓形成活性。剂量范围研究在图7中示出。
在鼠隐静脉出血模型中，在以指定剂量注射适体之前将小鼠的左颈静脉插管并将右内侧隐静脉暴露。注射适体后5分钟，将隐静脉横切，随后出血15分钟，然后注射解毒剂以逆转适体的作用，随后出血另外20分钟。通过注射VWF9.14T79-AO2(AO55)解毒剂可成功逆转PEG-VWF9.14T79-VRT7适体的活性。参见图8。例如，如图8所示，在注射VWF9.14T9-AO2(AO55)解毒剂后，凝块破坏增加，表明适体的活性能够逆转。
此外，我们在组合的鼠动脉血栓形成和隐静脉出血模型中测试了PEG-VWF9.14T79-VRT7适体、胆固醇-VWF9.14T79-VRT7适体、弹性蛋白样多肽(ELP)-VWF9.14T79-VRT7适体与VWF9.14T79-AO2(AO55)解毒剂。在该模型中，将左颈静脉插管并将右颈动脉暴露并在动物中放置跨音速(transonic)流量探针。放置探针后5分钟，以指定剂量注射适体。在另外5分钟后，将两个7.5％FeCl3贴剂置于右颈动脉上3分钟，然后移除。移除后30分钟，将隐静脉暴露并横切，监测出血15分钟。注射解毒剂并观察凝块形成另外15分钟。参见图10至11。在该模型中，在首先证明每种适体的有效抗血栓形成活性后，VWF9.14T79-AO2(AO55)解毒剂仍能成功逆转适体的活性。
实施例2-VWF适体溶解血栓活性
还测试了T79VRT7适体在鼠颈动脉闭塞模型和鼠颅内出血模型中的溶解血栓活性。参见图18至19。
鼠颈动脉闭塞和血栓溶解模型
我们采用鼠颈动脉闭塞模型，其中我们给成年C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，Bar Harbor，ME)(18g至24g)插管并将左颈静脉暴露。接着，我们将右颈总动脉暴露并在动脉周围放置跨音速流量探针(纽约州伊萨卡跨音速系统公司(Transonic Systems Incorporated，Ithaca，NY))。测量血流量5分钟以达到稳定的基线。然后我们通过在血管上施加10％氯化铁浸泡的Whatmann纸来诱导血栓形成。然后记录闭塞时间。闭塞后20分钟，我们以0.5mg/kg的剂量静脉内注射盐水(阴性对照)、抗VWF适体(VWF9.14T79VRT7)，或以10mg/kg的剂量注射重组组织型纤溶酶原激活剂(rTPA)。我们使用多普勒(Doppler)流量探针监测再灌注并测定重建灌注的时间。如果60分钟后没有发生再通，我们就终止实验。然后处死动物并收获脑和颈总动脉进行分析。
如图18所示，在鼠颈动脉闭塞模型中，相对于rTPA、对照或无灌注，使用T79VRT7适体，初始颈动脉流量的百分比随时间增加到更大程度。因此，与rTPA相比，VWF T79VRT7适体具有更好的溶解血栓活性。
鼠颅内出血模型
我们麻醉成年C57BL/6J小鼠(18g至24g)并将左颈静脉和右颈总动脉暴露。然后我们注射盐水(阴性对照)、以0.5mg/kg的剂量的抗VWF适体(VWF9.14T79-VRT7)、以10mg/kg剂量的rTPA或抗VWF适体(0.5mg/kg)与在适体后5分钟以2.5mg/kg的剂量注射匹配的解毒剂寡核苷酸(VWF9.14T79-AO2，也称为AO55)。为了诱导颅内出血，我们将硅树脂涂覆的6-0尼龙丝插入颈动脉并使其前进，直到我们刺穿颈内动脉(ICA)末端，导致蛛网膜下腔出血(SAH)。为了评估梗塞和出血的体积，我们在诱发颅内出血后90分钟在9.4Tesla MRI(马萨诸塞州比勒里卡的布鲁克拜厄斯宾有限公司(Bruker Biospin，Billerica，MA))上进行磁共振成像(MRI)。
图19示出了表示在用载剂、rTPA、抗VWF适体(VWF9.14T79-VRT7)或抗VWF适体(VWF9.14T79-VRT7)与VWF解毒剂(VWF9.14T79-AO2，也称为AO55)处理的小鼠中的鼠颅内出血模型中血管损伤后的每搏输出量的图。
实施例3-用VWF适体进行的另外体内研究
缺血性中风是西方世界死亡和残疾的主要原因。1所批准的使用重组组织型纤溶酶原激活剂(rTPA)的溶解血栓中风治疗受到几个关键因素的限制。首先，出血性转化的显著风险部分是由于无法逆转rTPA活性。其次，rTPA的短治疗窗使超过90％的中风患者不适合接受治疗。2,3最后，rTPA仅实现约30％的再通并且通常在初次血栓溶解后发生再闭塞，导致失去最初的神经改善。
血管性血友病因子因子(VWF)是参与血小板栓塞形成的重要事件的糖蛋白。VWF与血小板表面上的糖蛋白Ibα-IX-V复合物相互作用，诱导血小板粘附到血管壁上。4在该糖蛋白IIb/IIIa(gpIIb/IIIa)被激活并与纤维蛋白原结合后，导致血栓形成。血管性血友病(VWD)可以是血管性血友病因子的定性和定量减少两者。I型VWD是VWF疾病的主要形式，在牙科手术后或月经期间出现轻度出血而不是自发性出血。5此外，VWD I型患者免受脑血管和心血管事件的影响。6因此，VWF代表了动脉血栓形成中的有吸引力的靶标，并且可能优于目前的疗法。
适体是单链寡核苷酸，与其它类别的治疗剂相比具有潜在的优势。其以高亲和力和特异性与其靶标结合。7其可以进行化学修饰以定制其生物利用度，进行大规模化学合成并且与我们的应用最相关，可以快速逆转。8-11
在该实施例中，本发明人证明适体9.14T79vrt7以剂量依赖性方式抑制高剪切应力下的血小板粘附并防止血小板聚集。其防止鼠颈动脉损伤模型中的血栓形成。与rTPA相比，其在鼠和犬两者的动脉闭塞模型中也表现出更好的溶解血栓活性，并且这样做不会引起颅内出血或栓塞凝块脱落到脑中。最后，针对9.14T79vrt7设计的解毒剂寡核苷酸在人血液和鼠出血模型中在2分钟内逆转了适体的抗血小板活性。
该实施例中的研究表明，9.14T79vrt7适体代表了治疗缺血性中风和其它急性血栓形成事件的新颖且潜在更安全的方法。
材料和方法
适体截短物、修饰物和解毒剂寡核苷酸(AO)的合成
适体截短物在内部转录或合成。简言之，将T7 RNA聚合酶用于转录RNA适体截短物T10、T21和T22。使用MerMade 6/12寡核苷酸合成仪(BioAutomation，Irving，TX)合成适体截短物、修饰物和解毒剂。将预测RNA二级结构的软件(M.Zuker的Mfold)用于预测二级结构。
RNA适体制备和折叠
在血小板功能分析(PFA)和体内模型之前，可以将基于RNA的适体在适当的生理缓冲液中“折叠”。13将适体溶液加热至95℃保持3分钟，立即置于冰上3分钟，然后使其在约5分钟至10分钟内达到室温。
人全血研究
经书面知情同意后，通过静脉穿刺从健康志愿者体内采集人血。根据达勒姆退伍军人管理医学中心(Durham Veterans Administration Medical Center)和杜克大学医学中心(Duke University Medical Center)两者的机构审查委员会(Institutional ReviewBoard)批准的方案进行抽血。
血小板粘附分析
VenafluxTM微流体系统(爱尔兰都柏林塞利克斯(Cellix，Dublin，Ireland))测量胶原蛋白表面上的血小板粘附。通过静脉穿刺将人血从健康志愿者中采集到水蛭素管中。将含有300μl单独用适体或血小板结合缓冲液处理的全血的等分试样在60达因下流过胶原蛋白涂覆的微通道3分钟。然后用盐水冲洗通道3分钟以洗去RBC和未结合的血小板。使用Venaflux成像软件和Image Pro Plus对结合的血小板进行成像并计算覆盖的表面积。将适体在95℃孵育3分钟，置于冰上3分钟，然后在室温下孵育10分钟。冷却后，将适体保持在冰上直至使用。将经处理的血液中由结合的血小板覆盖的总表面积表示为阴性对照血液中总覆盖的百分比。通过方差分析测定统计学显著性；使用拟合的线性回归曲线计算适体的IC50。
总血栓形成分析系统(T-TAS)
T-TAS(Zacrox，日本东京藤森高洋有限公司(Zacrox，Fujimori Kogyo Co.Ltd.，Tokyo，Japan))用于评估人和犬两者全血中的血栓形成。15将血液收集在PL芯片中具有水蛭素的管中，所述PL芯片含有25个涂覆有1型胶原蛋白的毛细管通道。将通过芯片的血流维持在14μl/min的速率下。将血小板聚集测量为维持流速所需的压力(kPa)的函数。还使用相机观察通过胶原蛋白涂覆的毛细管通道上的血小板活性。
小鼠体内研究
进行手术或分析颈动脉流量和成像数据的研究人员对治疗组不知情。所有体内实验均由杜克大学动物护理和使用委员会(Duke University Institutional Animal Careand Use Committee)和俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会(The Ohio StateUniversity Institutional Animal Care and Use Committee)批准。此外，这些委员会遵守关于实验室动物护理和使用的NIH指南。
颈动脉闭塞和血栓溶解
在从Jackson实验室获得的雄性和雌性8周龄C57BL/6小鼠上进行鼠颈动脉闭塞研究。使用浸泡在FeCl3中的Whatman滤纸实现血栓形成/闭塞。颈动脉闭塞20分钟后，开始治疗。从Jackson实验室获得雄性和雌性8周龄C57BL/6小鼠。用氯胺酮(55mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉动物。通过中线腹侧切口，对动物进行插管(马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器鼠呼吸机(Harvard Apparatus mouse ventilator，Holliston，MA))并分离颈总动脉。用多普勒流量探针(纽约州伊萨卡跨音速系统公司(Transonic Systems Incorporated，Ithaca，NY))获得基线颈动脉流量。将浸泡在10％氯化铁中的Whatman滤纸置于动脉上3分钟。颈动脉闭塞20分钟后，开始治疗。通过静脉内隐静脉输注(马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器PHD2000输注泵(Harvard Apparatus PHD 2000Infusion Pump，Holliston，MA))，用对照(血小板结合缓冲液)、VWF适体、TPA、适体/解毒剂、TPA/VWF适体或不灌注处理动物。监测颈动脉流量另外90分钟以评估再灌注。在整个过程中监测心率、EKG(澳大利亚悉尼埃德仪器动力实验室4/35EKG监控系统(ADInstruments PowerLab 4/35EKG monitoring system，Sydney，Australia))和血压(康涅狄格州托灵顿肯特科学CODA非侵入式BP测量系统(KentScientific CODA Non-Invasive BP Measurement system,Torrington,CT))。对颈动脉进行组织学分析。
股静脉出血
在从Jackson实验室获得的雄性和雌性8周龄C57BL/6小鼠上进行鼠股静脉出血模型以评估解毒剂寡核苷酸的可逆性。16用异氟烷麻醉动物。移除两个后肢腹侧的毛发。然后将其仰卧放置在温度和ECG监测板上。轻轻地束缚四肢。切开左右腹侧后肢的皮肤，露出一段隐神经血管束；用生理盐水覆盖所述束以防止干燥。将左隐静脉插管以施用药物。为了评估止血，通过用23-G针穿刺右隐静脉，然后在血管的远端部分进行纵向切口来横切右隐静脉。轻轻地吸走血液，直至发生止血。然后移除凝块以重新开始出血并再次吸走血液直至再次发生止血。在每次止血发生后重复凝块破坏，持续30分钟。测量了两个参数：1)在30分钟时间段内发生止血的次数，和2)每次止血所需的时间。
犬颈动脉闭塞和血栓溶解
在雄性和雌性成年小猎犬(7kg至11kg)上进行犬颈动脉闭塞研究。用FeCl3诱导颈动脉闭塞并在开始治疗前稳定45分钟。将狗麻醉并进行插管。获得右股动脉和静脉导管。将右颈动脉暴露，并使用多普勒流量探针获得基线颈动脉流量。用50％氯化铁贴剂诱导血栓形成15分钟，并将凝块稳定45分钟。然后向狗静脉内输注载剂、0.9mg/kg TPA或0.5mg/kgVWF适体。适体和载剂以推注形式施用，而rTPA通过10％推注随后在45分钟内输注剩余的药物的标准临床方案进行施用。监测颈动脉流量120分钟。血栓形成部位远端的流量探针在整个实验中监测血流通过时间。颈动脉血管造影术显示出基线通畅、血栓性闭塞和再通。定期抽血评估血小板抑制(血小板功能分析仪-100)。在实验结束时，收集每只动物的脑和颈动脉并进行包埋以用于组织学分析。
统计分析
值表示为平均值±SD。适当时，使用多重t检验、卡方检验和双因素方差分析(two-way ANOVA)进行统计分析。
结果
优化的VWF适体9.14T79在体外和离体结合并抑制VWF活性
为了创建可适合未来临床的VWF适体，我们设计并测试了一系列衍生自2’-氟-嘧啶修饰的RNA适体VWF9.14的VWF适体衍生物。12,13参见实施例1。这项工作产生了领先的VWF适体，T59，其有30个核苷酸长，保持了高亲和力结合和抑制活性。接着，为了提高核酸酶抗性并优化组合物，我们系统地将2’O-甲基和/或2’氟部分替换成T25和T59适体截短物。合成并在体外测试了近90个截短物。完全优化的适体9.14T79vrt7为35个核苷酸并与VWF结合，其中解离常数(Kd)＝11.2nmol/L，Bmax＝56％，而60-mer的Kd＝18.4nmol/L，Bmax＝51％(见上面的表1和2以及图1至3)。
为了评估适体对血小板粘附的抑制作用，用适体处理人全血样品，所述适体起始为900nmol/L，稀释2倍至14nmol/L，并通过在高剪切应力下测量血小板粘附进行测试。适体以剂量依赖的方式阻止血小板粘附到胶原蛋白表面(图20至22)。在225nmol/L至900nmol/L(图20C和20D)的剂量下实现接近完全抑制血小板粘附，并且在56nmol/L至112nmol/L的剂量下实现中间抑制(图20B和20D)。对数-剂量与响应数据拟合得出计算为1.9的logIC50(72.6nmol/L)(图20E)。
在PFA-100人全血测定中离体测量适体对血小板聚集的影响。当剂量超过100nmol/L时，VWF适体完全抑制该系统中的血小板聚集，其中血小板栓形成和封闭时间超过300秒，代表测定的上限(图21)。因此，VWF适体9.14T79vrt7防止离体血小板粘附和聚集两者。
9.14T79表明，与重组组织型纤溶酶原激活剂(rTPA)相比，鼠颈动脉闭塞模型中的血栓溶解增加
接着使用鼠颈动脉闭塞模型来评估适体溶解血栓活性。在稳定的颈动脉闭塞20分钟后，动物接受适体9.14T79、盐水对照或rTPA。在该实验中使用的rTPA剂量为10mg/kg，相当于0.9mg/kg(用于治疗最近公知的3小时至4.5小时内出现缺血性中风的人的剂量)的11倍，因为据报道，这是在鼠动脉血栓形成模型中有效的再通剂量。17适体剂量为0.5mg/kg，如图23A所示，与rTPA(p<0.05)和缓冲液对照(每组n＝8)(p<0.01)相比，表明再通显著更高。来自每组的颈动脉的组织学分析与通过流量探针测量的再通程度密切相关(图23B、23C和23D)。缓冲液对照组的受影响的颈动脉的横截面的检查表明所有测试的动物完全闭塞(n＝8)(图23D)。来自rTPA处理的小鼠的血管切片示出了几乎完全的血栓形成和颈动脉闭塞(n＝8)(图23C)。最后，VWF适体处理的小鼠的颈动脉切片的组织学表明6个样本完全通畅，并且仅有两个先前闭塞的血管切片出现小凝块的证据(n＝8)(p＝0.01)(图23B)。
9.14T79vrt7表明犬全血的剂量依赖性血小板抑制
为了评估在高剪切力下的血小板血栓形成，并开始在大动物模型中评估适体，我们在总血栓形成分析系统(T-TAS)(日本横滨藤森株式会社(Fujimori Kogyo Co.，Yokohama，Japan))中测试了VWF适体18。9.14T79vrt7抑制犬血小板聚集并在18.75nmol/L至100nmol/L的剂量下维持血流压力(图24A)(每组n＝5)(与缓冲液对照相比p<0.05)。在100nmol/L的剂量下，完全抑制血小板粘附和聚集(图24B)。每张图片代表1分钟到5分钟的前10秒。在缓冲液对照小组中从3分钟到5分钟看到的白雾的区域是粘附到水平毛细管通道上的血小板。适体小组没有显示出这样的血小板积聚，表明9.14T79vrt7是在体外在剪切应力下犬血小板功能的有效抑制剂。
9.14T79vrt7表明犬颈动脉闭塞模型中的再通
使用犬脑血管血栓性疾病模型来证实大的、临床相关动物中的鼠结果。在治疗前建立动脉闭塞并持续45分钟。动物接受以推注方式静脉内注射0.5mg/kg的9.14T79vrt7，或者通过10％注射随后在45分钟内输注剩余90％的标准临床方案来静脉内注射0.9mg/kg的rTPA。在施用后5分钟至15分钟内，接受9.14T79vrt7的所有3只狗的颈动脉均再通(分别为图24F、24G)。相比之下，用rTPA或盐水对照处理的动物在治疗后未显示再通(每组n＝3)。
为了研究9.14T79vrt7的安全性，我们评估了这些狗的脑出血和凝血情况。9.14T79vrt7在3只动物的任何一只中既没有诱导颅内出血，颈动脉再通也没有导致脑血栓栓塞(图24H至24J)。来自9.14T79vrt7和rTPA组的脑组织学均与对照盐水处理的组相同。由于颈动脉组织学表明血管基本完全再通(图24K)，所以适体组中缺乏脑血栓栓塞是令人放心的。顶部颈动脉切片通过其中发生闭塞的血管损伤区域，而底部切片来自与诊断导管相邻的通畅部分。通过鲜明的对比，rTPA和盐水处理的对照组的动物都含有血栓，其继续阻塞受损的颈动脉，与这些方法无法恢复血流相一致(分别为图24L和24M)。
解毒剂寡核苷酸能够在体外和体内快速逆转9.14T79vrt7的抗血小板活性
我们创建了解毒剂寡核苷酸(AO，也称为VWF9.14T79-AO2或AO55)，以在需要时逆转9.14T79vrt7活性。最初测试的解毒剂中没有一个能够逆转30个核苷酸的适体T59，这可能是因为其一旦与VWF紧密结合就无法进入适体上的良好成核位点。因此，我们在分子的3’端添加了5个核苷酸的尿嘧啶(oligo-U尾)作为人工成核位点，并测试了与该尾部和适体的3’端互补的16个核苷酸的解毒剂。解毒剂寡核苷酸(AO)在体外在2分钟内逆转适体的抗血小板活性，其与9.14T79vrt7的比值低至2：1，(图14)(每组n＝2)。
在鼠股静脉出血模型中评估解毒剂逆转抗血小板适体的能力。16未经处理的对照小鼠组显示出12±3次破坏(n＝7)，其与17±3次破坏的盐水组相似(n＝7)(p>0.05)。以0.375mg/kg的剂量施用的9.14T79vrt7导致没有凝块破坏，与未经处理的对照和盐水处理的动物(n＝11)(p<0.0001)相比，其是非常显著的。施用9.14T79vrt7，然后添加解毒剂寡核苷酸，显示出16±9次破坏，这与从未接受过适体的动物相似(n＝7)。该数据表示为正常血栓形成的％(图25)。单独施用解毒剂不会导致凝块破坏增加或减少(数据未显示)。因此，解毒剂可以快速逆转与适体介导的VWF抑制相关的任何出血。
讨论
目前，绝大多数缺血性中风患者没有急性治疗选择。rTPA治疗，导致出血，其有时间限制并且不能逆转。我们的研究表明，解毒剂控制的VWF抑制剂可为这些患者提供强大而安全的治疗选择。与全长适体相比，9.14T79vrt7显示出改善的结合亲和力，12与单克隆抗体的效力相当。7,19适体9.14T79vrt7防止人血小板粘附到胶原蛋白表面(图20至22)以及高剪切应力下粘附(图24)。
在体内，9.14T79vrt7维持动脉通畅并且在低至0.0188mg/kg的剂量维持大于75％的通过时间(图22)。与阴性对照和静脉内rTPA两者相比，9.14T79vrt7在鼠颈动脉闭塞模型中表现出更好的溶解血栓活性(图23)。使用的IV rTPA的剂量是临床使用剂量的10倍，主要是因为这是在小鼠中实现血栓溶解所需的剂量。17药物施用后60分钟，rTPA组达到伤前流量的25％通过时间，而适体处理的组为75％。药物施用后，该效果持续超过100分钟。在5分钟内输注适体，而在45分钟内输注rTPA，这是由于与rTPA相关的出血风险。
乍看之下，靶向内皮和血小板因子的药物分解所形成的动脉血栓的想法并不直观，然而，越来越多的文献支持VWF抑制剂的“解聚”活性。体外研究，高流体剪切应力和不规则血管表面表明，VWF排列成跨越血管腔的粗束和网状物，将血小板结合在一起，导致动脉闭塞。20因此，抗VWF治疗能够对动脉闭塞有影响。我们的观察结果支持该假设，即使在狗的主要动脉中，VWF适体9.14T79vrt7也能够引起闭塞的血管的再通(图24)。
临床上使用的主要类型的肠胃外抗血小板剂是糖蛋白IIb/IIIa(gpIIb/IIIa)抑制剂(阿昔单抗(Abciximab)、依替巴肽(Eptifibatide)和替罗非班(Tirofiban))。这些剂显著改善了急性冠状动脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的结果。21然而，当在急性缺血性中风中进行测试时，其导致颅内出血显著增加而没有改善发病率或死亡率。22因此，我们开发了解毒剂寡核苷酸，其可以在出血的情况下容易地逆转VWF适体活性。在适体与解毒剂的摩尔比低至1：2时，所述解毒剂完全逆转9.14T7vrt79活性(图14)。在静脉出血模型中，体内证实了适体的持久逆转(图9A和9B)。13,16在适体剂量为0.375mg/kg时，未发生凝血；然而，施用10倍摩尔过量的解毒剂寡核苷酸逆转了适体并恢复了正常的止血。通过匹配的解毒剂完全且快速地逆转这样的有效抗血小板剂的能力代表了开发更安全有效的肠胃外抗血小板药物以治疗血栓形成特别是急性缺血性中风向前迈出的重要一步。
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序列表
<110> 杜克大学
俄亥俄州创新基金会
B·萨伦格
S·M·尼姆治
G·A·皮托克
J·雷泽尔
<120> 血管性血友病因子（VWF）靶向剂及其使用方法
<130> 5667-00413
<150> US 62/395,642
<151> 2016-09-12
<160> 180
<170> 专利3.5版
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_特征
<223> 混合的DNA/RNA - 每个U可以为T
<400> 1
cgaacugccc uc 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
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<210> 3
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu uuuuu 35
<210> 4
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu 30
<210> 5
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
acgaacugcc cucgauuauu cgacgcacag acgu 34
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<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
acgaacugcc cucagcuacu uucauguugc ugacgcacag acgu 44
<210> 7
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(8)
<223> 2' O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (9)..(11)
<223> 2' 氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (12)..(19)
<223> 2' O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(22)
<223> 2' 氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(35)
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
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<221> 修饰的_碱基
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 54
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<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<220>
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<220>
<223> 合成的
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<223> 合成的
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<220>
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 28
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 29
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 32
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 35
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<220>
<223> 合成的
<400> 36
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 53
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<211> 41
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<220>
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<400> 54
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<210> 55
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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cccacgaacu gcccucgauc gacgcacaga cgu 33
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<220>
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<400> 72
cccccacgaa cugcccucga ucgacgcaca gacgu 35
<210> 73
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
cacacacgaa cugcccucga ucgacgcaca gacgu 35
<210> 74
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
aaaaacgaac ugcccucgau cgacgcacag acgu 34
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
cccaaaacga acugcccucg aucgacgcac agacgu 36
<210> 76
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu aaa 33
<210> 77
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu acaca 35
<210> 78
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu acccg 35
<210> 79
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu aaaaa 35
<210> 80
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
acgaacugcc cucgaucgac gcacagacgu acacg 35
<210> 81
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
acgaacugcc cucgauuuca uucgacgcac agacgu 36
<210> 82
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
acgaacugcc cucguuucau cgacgcacag acgu 34
<210> 83
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
acgaacugcc cucuuucaug acgcacagac gu 32
<210> 84
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
acgaacugcc cucgauauua uuuucgacgc acagacgu 38
<210> 85
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
acgaacugcc cucguauuau uucgacgcac agacgu 36
<210> 86
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
acgaacugcc cucuauuauu ugacgcacag acgu 34
<210> 87
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
acgaacugcc cucgauauuu cauuuucgac gcacagacgu 40
<210> 88
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
acgaacugcc cucguauuuc auuucgacgc acagacgu 38
<210> 89
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
acgaacugcc cucuauuuca uuugacgcac agacgu 36
<210> 90
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
acgaacugcc cucuuuuuug acgcacagac gu 32
<210> 91
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
acgaacugcc cucuuuuuuu ugacgcacag acgu 34
<210> 92
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
acgaacugcc cucuuuuuuu ugacgcaccc ccgu 34
<210> 93
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
acgaacugcc cucguuucau cgacgcaccc ccgu 34
<210> 94
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
acgaacugcc cucuuucaug acgcaccccc gu 32
<210> 95
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
acgaacugcc cucuauuauu ugacgcaccc ccgu 34
<210> 96
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
acgaacugcc cucuauuuca uuugacgcac ccccgu 36
<210> 97
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
acgaacugcc cucuuuuuug acgcaccccc gu 32
<210> 98
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(14)
<223> 六乙二醇的位点
<400> 98
acgaacugcc cucgacgcac agacgu 26
<210> 99
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
acgaacugcc cucguaagac gcacagacgu 30
<210> 100
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
acgaacugcc cucguaagac gcacagacgu uuuuu 35
<210> 101
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
ccgaacugcc cucgaucgac gcacagacgg 30
<210> 102
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
acgaaaugga aucguaagaa ccacagacgu uuuuu 35
<210> 103
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
ucgagggcag uucgu 15
<210> 104
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
gaucgagggc aguucgu 17
<210> 105
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
gaucgagggc aguu 14
<210> 106
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
ucgaucgagg gcaguu 16
<210> 107
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
gucgaucgag ggcaguu 17
<210> 108
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
gucgaucgag ggca 14
<210> 109
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
ugcgucgauc gagggca 17
<210> 110
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
ugugcgucga ucgaggg 17
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
ucugugcguc gaucgaggg 19
<210> 112
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
ucugugcguc gaucga 16
<210> 113
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
ucugugcguc gauc 14
<210> 114
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
acgucugugc gucgauc 17
<210> 115
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
aaugagggca guucgu 16
<210> 116
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
auaaugaggg caguucgu 18
<210> 117
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
aaugagggca guu 13
<210> 118
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
auaaugaggg caguu 15
<210> 119
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
ucaauaauga gggcaguu 18
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
gucaauaaug agggcaguu 19
<210> 121
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
gucaauaaug agggca 16
<210> 122
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
ugcgucaaua augagggca 19
<210> 123
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 123
gucaauaaug agg 13
<210> 124
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
ugcgucaaua augagg 16
<210> 125
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 125
ucugugcguc aauaa 15
<210> 126
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
acgucugugc gucaauaa 18
<210> 127
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
aaucgagggc aguucgu 17
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
auaaucgagg gcaguucgu 19
<210> 129
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 129
aaucgagggc aguu 14
<210> 130
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
auaaucgagg gcaguu 16
<210> 131
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
ucgaauaauc gagggcaguu 20
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
gucgaauaau cgagggcagu u 21
<210> 133
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
gucgaauaau cgagggca 18
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
ugcgucgaau aaucgagggc a 21
<210> 135
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
gucgaauaau cgagg 15
<210> 136
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
ugcgucgaau aaucgagg 18
<210> 137
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
ucugugcguc gaauaa 16
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 138
acgucugugc gucgaauaa 19
<210> 139
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
gaucgagggc aguucguuau gc 22
<210> 140
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
gaucgagggc aguucguggg 20
<210> 141
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
gaucgagggc aguucguggg gg 22
<210> 142
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
gaucgagggc aguucgugug ug 22
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
gaucgagggc aguucguuuu u 21
<210> 144
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
gaucgagggc aguucguuuu ggg 23
<210> 145
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
aaaaaacguc ugugcgucga uc 22
<210> 146
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
uuuacgucug ugcgucgauc 20
<210> 147
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
uguguacguc ugugcgucga uc 22
<210> 148
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
cggguacguc ugugcgucga uc 22
<210> 149
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
uuuuuacguc ugugcgucga uc 22
<210> 150
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
cguguacguc ugugcgucga uc 22
<210> 151
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
gggcaguucg uuaugc 16
<210> 152
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
gggcaguucg uggg 14
<210> 153
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
gggcaguucg uggggg 16
<210> 154
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
gggcaguucg ugugug 16
<210> 155
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
gggcaguucg uuuuu 15
<210> 156
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
gggcaguucg uuuuggg 17
<210> 157
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 157
aaaaaacguc ugugcg 16
<210> 158
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 158
uuuacgucug ugcg 14
<210> 159
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
uguguacguc ugugcg 16
<210> 160
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
cggguacguc ugugcg 16
<210> 161
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 161
uuuuuacguc ugugcg 16
<210> 162
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 162
cguguacguc ugugcg 16
<210> 163
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
ucugugcguc gaugaaa 17
<210> 164
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 164
ucugugcguc augaaa 16
<210> 165
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 165
ucugugcguc gaaauaaua 19
<210> 166
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
ucugugcguc aaauaaua 18
<210> 167
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
ucugugcguc aaaugaaaua 20
<210> 168
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
ucugugcguc aaaaaa 16
<210> 169
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
ucugugcguc aaaaaaaa 18
<210> 170
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 170
ggggugcguc aaaaaaaa 18
<210> 171
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
ggggugcguc gaugaaa 17
<210> 172
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 172
ggggugcguc augaaa 16
<210> 173
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 173
ggggugcguc aaauaaua 18
<210> 174
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 174
ggggugcguc aaaaaa 16
<210> 175
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 175
aaaaaacguc uguaguu 17
<210> 176
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 176
aaaaaacguc ugguu 15
<210> 177
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 177
aaaaaacguc uguaguucgu 20
<210> 178
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 178
aaaaaacguc ugguucgu 18
<210> 179
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 179
ucugugcguc ga 12
<210> 180
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 180
aaaaaacguc ugugcg 16

Claims (34)

1.适体，其包含：
与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或SEQ ID NOS:3-102中任一个具有至少70％的序列同一性的多核苷酸，或
与从5’到3’包含以下区的多核苷酸具有至少70％的序列同一性的多核苷酸：包含3个核苷酸的第一茎形成区，包含核苷酸序列AAC的第一环区，包含3个核苷酸的第二茎形成区，包含核苷酸序列CC的第二环区，由2个至8个核苷酸组成的第三茎形成区，由1个至12个核苷酸或间隔序列组成的第三环区，由2个至8个核苷酸组成并能够与所述第三茎形成区形成茎的第四茎形成区，包含核苷酸C的第四环区，包含3个核苷酸并能够与所述第二茎形成区形成茎的第五茎形成区，包含核苷酸序列CAGA的第五环区，以及包含3个核苷酸并能够与所述第一茎形成区形成茎的第六茎形成区，
其中所述多核苷酸包含未修饰的形式或包含修饰的形式，所述修饰的形式包含至少一个核苷酸碱基修饰，以及
其中所述适体的长度不超过53个核苷酸。
2.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体包含与从5’到3’包含以下序列的多核苷酸具有至少70％的序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO:1、由1个至18个核苷酸组成的可变核苷酸序列或间隔序列和SEQ ID NO:2。
3.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体包含与SEQ ID NOS:3-6中任一个具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体对人VWF蛋白的解离常数(KD)小于100纳摩尔(nM)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其进一步包含在所述多核苷酸的5’端或3’端的尾核苷酸序列，其不能与所述多核苷酸中的3个或更多个连续核苷酸碱基配对，其中所述尾核苷酸序列由2个至12个核苷酸组成。
6.根据权利要求5所述的适体，其中所述尾核苷酸序列位于所述多核苷酸的3’端并且由核苷酸序列(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)(U/T)组成。
7.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体的长度不超过39个核苷酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸包含RNA多核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸包含修饰的形式，所述修饰的形式包含至少一个选自下组的核苷酸碱基修饰：2’-氟修饰、2’O-甲基修饰、5’修饰和3’修饰。
10.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体包含SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9。
11.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸包含5’接头和/或3’接头。
12.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸进一步包含稳定剂。
13.根据权利要求12所述的适体，其中所述稳定剂选自聚乙二醇(PEG)、胆固醇、白蛋白和弹性蛋白样多肽。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的适体，其中所述稳定剂与所述多核苷酸的5’端连接。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸与所述稳定剂通过共价键连接。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的适体，其中所述多核苷酸与所述稳定剂通过标签系统(tag system)连接。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的适体，其中所述标签系统选自生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白链菌素和生物素/中性抗生物素蛋白。
18.二聚体、三聚体或四聚体，其包含权利要求1至17所述的适体中的任一种。
19.解毒剂，其包含与SEQ ID NOS:103-180中任一个具有至少70％的序列同一性的多核苷酸。
20.解毒剂，其包含具有与权利要求1至18所述的适体中任一种的至少8个核苷酸反向互补并能够与之杂交的序列的多核苷酸。
21.药物组合物，其包含药物载体和权利要求1至18所述的组合物中的任一种或权利要求19至20所述的解毒剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物载体包含20mM Hepes，pH7.4；150mM NaCl；1mM CaCl2；1mM MgCl2；5mM KCl或缓冲盐水。
23.用于预防对象中的血凝块形成的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至18、21或22所述的组合物中的任一种，以预防所述对象中的血凝块形成。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述对象患有心房颤动或处于患有深静脉血栓形成、中风、心脏病发作或肺栓塞的风险中。
25.用于治疗对象中的血凝块的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的VWF靶向剂以减少所述对象中的所述血凝块。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述VWF靶向剂包括适体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述VWF靶向剂包括权利要求1至18、20或21所述的组合物中的任一种。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述对象患有深静脉血栓形成、中风、心脏病发作或肺栓塞。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其进一步包括向所述对象施用治疗有效量的解毒剂以中和所述适体或所述VWF靶向剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述解毒剂包括权利要求19至20所述的解毒剂中的任一种。
31.权利要求1至22中任一项所述的组合物在制备用于预防对象中血凝块形成的药物中的用途。
32.VWF靶向剂在制备用于治疗对象中的血凝块的药物中的用途。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的方法或用途，其中所述对象是哺乳动物。
34.根据权利要求33所述的方法或用途，其中所述哺乳动物是人。
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