CN104145018B - 新型C5a结合性核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合人C5a的核酸分子，其中所述核酸分子包含中央核苷酸区段，其中所述中央核苷酸区段包含核苷酸序列：5’AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:61]，其中n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU，并且G、A、U、C、H、K和R为核糖核苷酸，和dU、dG和dA为2’‑脱氧核糖核苷酸。

Description

新型C5a结合性核酸
本发明涉及能够结合C5a和/或C5的核酸分子、其用于分别制造药剂、诊断剂和检测剂的用途、包含这样的核酸分子的组合物、包含这样的核酸分子的复合物、用于使用这样的核酸分子筛选由C5a和/或C5介导的活性的拮抗剂的方法以及用于检测这样的核酸分子的方法。
人过敏毒素C5a(补体因子5a；SwissProt entry P01031)的一级结构于1978年被测定(Fernandez&Hugli 1978)。其由74个氨基酸组成，这构成了8,200Da的分子量，同时碳水化合物部分占约3,000Da。C5a的碳水化合物部分作为连接于位置64上的天冬酰胺的单个复杂型寡糖单元存在。3个二硫键赋予分子稳定的刚性结构。
尽管来自不同哺乳动物物种的C5a形式的三维结构通常已得到维持，但氨基酸序列在进化过程中不是特别保守。序列比对显示64％的人与小鼠C5a的总体序列同一性。人C5a与来自下列物种的C5a共有下列百分比的相同氨基酸：
●恒河猴(Macaca mulatta)(猕猴)85％
●成束猴(Macaca fascicularis)(食蟹猴)85％
●欧洲牛(Bos taurus)(牛族动物)69％
●野猪(Sus scrofa)(猪)68％
●小家鼠(Mus musculus)(小鼠)64％
●褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)61％
除了有限的序列同源性以外，糖基化也是不同的。虽然人C5a在天冬酰胺64上被糖基化，但鼠同源物根本未被糖基化。更远缘的人蛋白C3a和C4a分别与C5a共有仅35和40％的同一性。
补体系统在上个世纪开始时被发现为热敏感性血清级分，该级分“补充”抗血清介导的细胞和细菌的裂解。作为天然非特异性(先天性)免疫反应的体液组分，其在抗传染原的宿主防御中和在炎症性过程中起着重要作用。补体可通过3个不同途径活化：(i)在抗体将其自身附着于细胞表面或细菌后(称为经典途径)，(ii)直接通过细菌或病毒的糖脂(称为旁路途径)，或(iii)通过细菌上的碳水化合物(称为凝集素途径)。所有这些活化途径在补体组分C3和C5的活化的点上汇合，在该点上开始共同的末端途径，最终终于膜攻击复合物(缩写MAC)的装配。补体系统由超过20种可溶性蛋白组成，其用作蛋白水解酶类或用作结合蛋白，并且构成约10％的脊椎动物血清中的总球蛋白类。此外，补体系统包括多个不同的细胞表面受体，所述受体显示对于补体蛋白的蛋白水解片段的特异性，并且由炎症细胞和调节适应性免疫反应的细胞表达。存在数种抑制补体活化，从而保护宿主细胞免受意外补体攻击的调节蛋白。补体系统可被独立地活化或与适应性免疫反应一起被活化。
补体的功能包括调理作用的过程(即，使细菌对吞噬作用更易感)，通过将孔插入它们的膜中裂解细菌和外来细胞(称为膜攻击复合物)，趋化性活性物质的产生，血管通透性的增强，平滑肌收缩的诱发以及肥大细胞脱粒的促进。与凝血级联类似，在也称为酶促级联的连续酶促步骤中组织补体活化的过程(Sim和Laich,2000)。这些相互作用的详细顺序概述于下文中。
经典途径。该抗体依赖性激活途径补充特定抗体反应。其与旁路途径一样受到精细地控制，但缺乏自发起始能力；即不依赖于抗体的识别功能，和反馈放大机制。在经典途径的激活物中有抗原-抗体复合物、β-淀粉样蛋白、DNA、聚肌苷酸、聚阴离子-聚阳离子复合物如肝素/鱼精蛋白、一些有包膜病毒、尿酸单钠晶体、细菌细胞壁的脂质A、大侧柏酸、蚁毒液多糖、亚细胞膜(例如线粒体)以及细胞-和血浆来源的酶例如纤溶酶、激肽释放酶、激活的Hageman因子、弹性蛋白酶或组织蛋白酶。抗体诱导的经典途径始于C1，其结合连接于细胞表面抗原的抗体(IgM>IgG3>IgG1>>IgG2)的Fc-片段。C1是由分为3个亚单位：C1q、C1r、C1s的22个多肽链组成的识别复合物。C1q是实际的识别部分，其为看起来象一束郁金香的含胶原蛋白样结构域(显示羟脯氨酸和羟赖氨酸残基)的糖蛋白。在通过C1q结合后，C1r被激活成为蛋白酶，其将C1s切割成将C2和C4激活(通过切割)成C2a/b和C4a/b的形式。C2a和C4b组合以产生C4b2a，即C3转化酶(C3激活酶)。C4a仅具有弱过敏毒素活性但无趋化性。C3是所有3个活化途径的中枢。在经典途径中，C4b2a转化酶将C3切割成C3a/b。C3a为过敏毒素。C3b与C4b2a组合形成C4b2a3b复合物(C5转化酶)。C3b还可直接结合细胞，从而使它们对吞噬作用易感(调理作用)。
旁路途径。该途径不需要抗体来活化并且在宿主抗细菌和病毒感染防御中具有极大的重要性，因为与经典途径不同，其被侵入微生物的表面结构例如细菌/病毒糖脂或内毒素直接活化。其它活化物是菊粉、兔红细胞、去唾液酸的人红细胞、眼镜蛇毒因子或硫代磷酸寡核苷酸。6种蛋白C3、因子B、D、H、I和备解素(properdin)一起行使导致激活物结合的C3/C5转化酶的形成的途径的起始、识别和活化的功能。级联始于C3。作为C3的自发切割的结果，总是在循环中发现少量C3b(“C3-慢速运转(tickover)”)，但因随后降解，浓度通常保持极低。然而，当C3b结合细胞表面上的糖时，其可用作旁路途径活化的核心。随后因子B结合C3b。在因子D存在的情况下，结合的因子B被切割成Ba和Bb；Bb包含C3转化酶的活性部位。随后，备解素结合C3bBb以稳定细胞表面上的C3bBb转化酶，从而导致其它C3分子的切割。最后，形成将C5切割成C5a/b的替代C5转化酶C3bBb3b。一旦出现，C5b就起始如上文中描述的膜攻击复合物的装配。通常地，仅革兰阴性细胞可被抗体+补体直接裂解；革兰阳性细胞最具抗性。然而，吞噬作用通过利用C3b(吞噬细胞在其表面上具有C3b受体)的调理作用得到极大增强，并且抗体并非总是需要的。此外，补体可通过直接裂解或通过阻止病毒穿过宿主细胞来中和病毒颗粒。
凝集素途径。最近发现的凝集素或甘露糖结合凝集素(缩写MBL)途径依赖于外来物质(即，细菌表面)的先天识别。该途径与经典途径具有结构和功能相似性。凝集素途径的活化由急性期蛋白MBL起始，所述蛋白识别细菌上的甘露糖、IgA和可能地由受损内皮暴露的结构。MBL与C1q同源并且触发MBL相关丝氨酸蛋白酶(缩写MASP)，所述蛋白酶的3个形式MASP1、MASP2和MASP3已有描述。进一步的凝集素途径的活化实际上与经典途径的活化相同，形成相同的C3和C5转化酶。此外，一些证据表明MASP在一些条件下可直接激活C3。
末端途径。所有3个活化途径汇合于C5转化酶(在经典和凝集素途径中为C4b2a3b，在旁路途径中为C3bBb3b)的形成，所述转化酶将C5切割成C5a/b。C5a具有强有力的过敏毒素活性并且具有趋化性。另一个C5片段C5b通过其疏水性结合部位在靶细胞表面上用作形成裂解性膜攻击复合物(MAC或末端补体复合物，缩写TCC)的锚。MAC从5种前体蛋白：C5b、C6、C7、C8和C9装配而成。终事件是C9寡聚体的形成，该寡聚体将其自身作为跨膜通道插入质膜，从而导致细胞的渗透性裂解。MAC装配受到可溶性血浆因子S蛋白(也称为玻连蛋白)和SP-40,40(也称为簇连蛋白)，以及宿主细胞膜上的CD59和HRF(同源限制性因子)的控制。许多种类的细胞对补体介导的裂解敏感：红细胞、血小板、细菌、具有脂蛋白包膜的病毒和淋巴细胞。
补体系统是起始和扩大炎症的有效机制。这是通过补体组分的片段介导的。过敏毒素是定义最明确的片段，并且是补体系统的丝氨酸蛋白酶的蛋白水解片段：C3a、C4a和C5a。过敏毒素不仅在补体活化过程中产生，而且还从可直接切割C3、C4和C5的其它酶系统的活化产生。这样的酶包括凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、组织和白细胞溶酶体酶以及细菌蛋白酶。过敏毒素对血管壁具有强大的作用，引起平滑肌(例如回肠、支气管、子宫和血管肌肉)的收缩和血管通透性的增加。这些作用显示特殊的快速耐受(tachyphylaxis)(即重复刺激诱导逐渐减弱的反应)并且可被抗组胺药阻断；它们可能通过组胺从肥大细胞和嗜碱性粒细胞的释放间接介导。C5a是C5血浆蛋白α链的74个氨基酸的N末端切割产物。其被受体C5aR(也称为C5R1或CD88)(存在于许多不同细胞类型：最主要地存在于嗜中性粒细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞上的分子)以高亲和力结合。C5a是目前最强的过敏毒素，比C3a更有效约100倍，且比C4a更有效1000倍。该活性以C5a>组胺>乙酰胆碱>C3a>>C4a的顺序减弱。
C5a在刺激嗜中性粒细胞趋化性、粘附、呼吸爆发产生和脱粒上极其有效。C5a还刺激嗜中性粒细胞和内皮细胞提供更多粘附分子；C5a的静脉内注射例如在动物实验中通过触发嗜中性粒细胞至血管壁的附着而迅速导致嗜中性粒细胞减少症。在嗜中性粒细胞C5a受体连接之后，调动膜花生四烯酸，所述膜花生四烯酸被代谢成前列腺素和白三烯，包括LTB4，嗜中性粒细胞和单核细胞的另一种有效化学吸引剂。在单核细胞C5a受体连接后，释放IL-1。因此，C5a在炎症部位的局部释放导致强效的促炎症刺激。事实上，C5a的释放与许多急性或慢性病况直接或间接相关，例如一般免疫复合物相关疾病(Heller等人,1999)；哮喘(Kohl,2001)；脓毒性休克(Huber-Lang等人,2001)；全身性炎症反应综合征(缩写SIRS)；多器官衰竭(缩写MOF)；急性呼吸窘迫综合征(缩写ARDS)；炎性肠病(缩写IBD)(Woodruff等人,2003)；感染；重度烧伤(Piccolo等人,1999)；器官例如心脏(van der Pals等人2010)、脾、膀胱、胰腺、胃、肺、肝、肾、四肢、脑、骨骼肌或肠(Riley等人,2000)的再灌注损伤；银屑病(Bergh等人,1993)；心肌炎；多发性硬化(Muller-Ladner等人,1996)；和类风湿关节炎(缩写RA)(Woodruff等人,2002)。
关于补体系统与疾病之间的关系的许多综述已公开(Kirschfink,1997；Kohl,2001；Makrides,1998；Walport,2001a；Walport,2001b)。
补体造成的细胞损伤作为经典或旁路途径的活化的后果在细胞表面上发生。MAC构成由将近20个蛋白质分子组成并且代表约170万Da的分子量的超分子组织。完全装配的MAC包含C5b、C6、C7和C8各一个分子和数个C9分子。所有这些MAC组分是糖蛋白。当C5被C5转化酶切割并产生C5b时，MAC的自装配开始。C5b和C6形成稳定的可溶性双分子复合物，其结合C7并且诱导其表达亚稳定部位，当新生三分子复合物(C5b-7)存在于靶脂双层上或靠近靶脂双层时，其可通过该部位将其自身插入膜。插入由C5b-7复合物上的在C7结合C5b-6后出现的疏水性区域介导。膜结合C5b-7将MAC装配体提交给膜部位，形成C8的受体。一个C8分子对每一个C5b-7复合物的结合产生具有小于1nm功能性直径的小跨膜通道，所述通道可扰乱靶细菌和红细胞的膜。每一个膜结合C5b-8复合物用作多个C9分子的受体，并且似乎促进C9至细胞膜的碳氢化合物核心的插入。一个C9分子的结合在膜攻击部位起始C9寡聚化的过程。在至少12个分子被整合进入复合物后，形成离散的通道结构。因此终产物由四分子C5b-8复合物(具有约550kDa的分子量)和管状多聚C9(具有约1,100kDa的分子量)组成。MAC的该形式，一旦插入细胞膜，就产生完整的跨膜通道，从而导致细胞的渗透性裂解。形成的跨膜通道视整合入通道结构的C9分子的数目而在尺寸上有所变化。然而多聚-C9的存在对于红血细胞或有核细胞的裂解不是绝对必需的，其对于细菌的杀死可能是必需的。
补体系统主要有益于抗侵入微生物的身体防御。补体级联的早期组分对于病原体的调理作用，随后将它们从身体清除是非常重要的。此外，它们行使免疫系统的几个正常功能，如控制免疫复合物的形成和清除或清除碎片、死亡组织和外来物质。所有3个识别不同分子模式的活化途径帮助控制侵入者，所述分子模式(在健康身体中)确定了大量非自身结构。末端补体途径-其终止于MAC的装配-代表了通过裂解细菌和外来细胞进行的其它线的防御。
当考虑补体缺陷的影响时，功能性补体系统的重要性就变得清楚明了。例如，失去旁路途径蛋白或晚期组分(C3-C9)之一的个体倾向于患上化脓性细菌特别地奈瑟球菌属(Neisseria)种类的严重感染。经典途径组分(例如C1、C2、C4)的缺乏也与增加的(尽管不是强升高的)感染风险相关。补体组分如C1和MBL还具有通过干扰病毒与宿主细胞膜的相互作用，从而阻止进入细胞来中和病毒的能力。
值得注意的是，尽管C5的切割导致C5a以及MAC，但缺乏C5的临床特征与缺乏其它末端组分(例如C6,C7,C8,C9)的临床特征并无显著差异，这表明C5a的不存在对C5缺乏型患者的临床表现无显著贡献。因此，C5a的选择性拮抗有成为最佳杠杆作用的希望，以便补体正常的上下游疾病预防功能保持完整。因此，仅促炎过敏毒素的有害过度产生被阻断。
C5aR-缺陷型小鼠(尽管它们对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染更加易感)在其它方面表现正常的事实，表明C5a功能的阻断无有害作用。
几种靶向C5a或C5或各自的受体的化合物是已知的并且在体内模型中进行了成功地测试。它们中的一些已在临床试验中进行了进一步测试。C5-特异性人源化抗体依库珠单抗被批准用于阵发性睡眠性血红蛋白尿症，并且已在治疗非典型溶血尿毒症(aHUS)、急性抗体介导的肾同种异体移植排斥和冷凝集素疾病中显示功效。其阻止C5的切割并且抑制C5a和C5b的作用。除了相似的研究阶段的C5抗体和抗体片段以外，选择性破坏C5a:C5aR(CD88)相互作用并使C5切割和C5b依赖性MAC形成不受影响的抗体特别吸引人。实例为人源化抗-C5a mAb MEDI-7814，其处于用于炎症障碍和组织损伤的潜在iv治疗的I期临床开发中，和C5a抗体TNX-558，然而自2007年以来没有关于其的报道。用于类风湿性关节炎和中风的针对C5a受体的抗体neutrazumab正在开发之中(Ricklin&Lambris 2007；Wagner&Frank2010)。
PEG化抗C5适体(ARC-1905)处于用于AMD的临床前开发中。CCX168是目前处于用于抗嗜中性粒细胞细胞质自身抗体相关血管炎病的II期临床开发中的小分子C5aR抑制剂(ChemoCentryx Press Release Oct 17,2011)。处于临床开发中的另一种C5aR拮抗剂是用于治疗类风湿关节炎的MP-435。
最近未报导关于小分子/拟肽类C5a受体拮抗剂JPE-1375、JSM-7717的开发(Ricklin&Lambris 2007)。C5a受体CD88的另一种抑制剂环状六肽PMX53在炎症动物模型中是有效的，但在类风湿性关节炎患者的以安慰剂为对照的双盲临床研究中不满足终点。AMD的临床开发也已中断(Wagner&Frank 2010)。已公布PMX53的研究阶段变体PMX205在阿尔茨海默氏痴呆症的鼠模型中具有活性(Fonseca等人2009)。其它临床阶段化合物为C5a受体(C5aR)拮抗剂CCX-168。已于2010年1月开始了针对炎症和自身免疫性疾病的I期试验。
除了如上所述的C5a的作用以外，新的数据使得假定在肿瘤微环境中产生C5a可通过抑制抗肿瘤CD8+T-细胞介导的反应增强肿瘤生长，其中所述抑制似乎与髓源抑制细胞至肿瘤内的募集和它们的定向T细胞的抑制能力的增强相关。Markiewski等人显示肽类C5a受体拮抗剂对C5a受体的阻断在小鼠模型中导致延迟的肿瘤生长(Markiewski等人,2008)。
大多数肽类化合物易于被肽酶降解和修饰，并且另外地显示从身体，优选人体快速的清除率。因此，这些肽类化合物不能被当作药物样分子(通常开发药物以上市的前提条件)。
过去已开发了数种特异性结合人C5a，但不结合其它物种的C5a的Spiegelmer(参见WO2009/040113和WO2010/108657)。
因为对于临床前和临床开发来说，动物模型是必需的，因此本发明要解决的问题是提供与小鼠C5a相互作用的化合物。更具体地，本发明要解决的问题是提供与小鼠C5a和人C5a都相互作用的化合物。
本发明要解决的其它问题是提供用于制造用于人和/或非人疾病的治疗的药剂的化合物，其中疾病的特征在于C5a直接或间接参与这样的疾病的发病机制。
本发明要解决的其它问题是提供用于制造用于疾病的治疗的诊断剂的化合物，其中疾病的特征在于C5a直接或间接参与这样的疾病的发病机制。
本发明要解决的这些和其它问题通过所附独立权利要求的主题得以解决。优选实施方案可采自从属权利要求。
本发明要解决的问题在第一方面、也是第一方面的第一实施方案中通过能够结合人C5a的核酸分子得以解决，其中所述核酸分子包含中央核苷酸区段，其中所述中央核苷酸区段包含如下核苷酸序列：
5’AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:61]，
其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U、C、H、K和R为核糖核苷酸，和
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第2实施方案、也是第一方面的第1实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含选自如下核苷酸序列的核苷酸序列：
a)5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:62],
b)5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:63]，
c)5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:64],
d)5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:65]，
e)5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:66]，
f)5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:67]，和
g)5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:68]，其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U和C为核糖核苷酸，和
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第3实施方案、也是第一方面的第2实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含核苷酸序列：
5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:65]，其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U和C为核糖核苷酸，和
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第4实施方案、也是第一方面的第3实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含选自如下核苷酸序列的核苷酸序列：
a)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:73]，
b)5’AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:74]，
c)5’AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:75]，
d)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:76]，
e)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:77]，
f)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:78]，
g)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:79],
h)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:80]，
i)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:81]，
j)5’AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:82]，
k)5’AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:83]，
l)5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:84],
优选中央核苷酸区段为5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[SEQ IDNO:78]或
5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:84]。
在第一方面的第5实施方案、也是第一方面的第2实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含核苷酸序列：
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:66]，其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U和C为核糖核苷酸，并且
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第6实施方案、也是第一方面的第2实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含核苷酸序列：
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:67]，其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U和C为核糖核苷酸，和
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第7实施方案、也是第一方面的第2实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段包含核苷酸序列：
5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:64]，其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U和C为核糖核苷酸，并且
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第8实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6和7实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段由核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸组成。
在第一方面的第9实施方案、也是第一方面的第1、2、3、5、6和7实施方案的实施方式中，中央核苷酸区段由核糖核苷酸组成。
在第一方面的第10实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、7、8和9实施方案的实施方式中，核酸分子以5’->3’方向包含第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段，其中
第一末端核苷酸区段包含1至5个核苷酸，和
第二末端核苷酸区段包含1至5个核苷酸，
优选地
第一末端核苷酸区段包含3至5个核苷酸，和
第二末端核苷酸区段包含3至5个核苷酸，
更优选地
第一末端核苷酸区段包含3个核苷酸，和
第二末端核苷酸区段包含3个核苷酸。
在第一方面的第11实施方案、也是第一方面的第10实施方案的实施方式中，第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’Z1Z2Z3Z4G 3’并且第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’Z5Z6Z7Z8Z9 3’，
其中
Z1为G或不存在，Z2为S或不存在，Z3为S或不存在，Z4为B或不存在，Z5为C或dC,Z6为V或不存在，Z7为S或不存在，Z8为S或不存在，Z9为C或不存在，并且
G、S、B、C、V为核糖核苷酸，和
dC为2’-脱氧核糖核苷酸,
优选地
a)Z1为G，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
b)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
c)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
d)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
e)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
f)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
g)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
h)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
i)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
j)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
k)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
l)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
m)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
n)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
o)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
p)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
q)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6不存在，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在。
在第一方面的第12实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCCUG 3’并且第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CAGGC 3’或5’dCAGGC 3’，其中
C、A、G和U为核糖核苷酸，和
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第13实施方案、也是第一方面的第12实施方案的实施方式中，第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGGC 3’。
在第一方面的第14实施方案、也是第一方面的第12实施方案的实施方式中，第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CAGGC 3’。
在第一方面的第15实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CCUG 3’或5’CUG 3’或5’UG 3’或5’G 3’，并且
第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGGC 3’，其中
C、A、G和U为核糖核苷酸，和
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第16实施方案、也是第一方面的第15实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CCUG 3’。
在第一方面的第17实施方案、也是第一方面的第15实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CUG 3’。
在第一方面的第18实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，
a)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGC 3’，或
b)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGGC 3’，或
c)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GGCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGCC 3’；其中
C、A、G和U为核糖核苷酸，和
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第19实施方案、也是第一方面的第18实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GGCG 3’并且第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGCC 3’。
在第一方面的第20实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CUG 3’或5’UG 3’或5’CG 3’或5’G 3’，并且
第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGC 3’，
其中
C、A、G和U为核糖核苷酸，并且
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第21实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，
第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCUG 3’，并且
第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAC 3’或5’dCC 3’或5’dCA 3’，其中
C,A,G和U为核糖核苷酸，并且
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第22实施方案、也是第一方面的第10和11实施方案的实施方式中，
a)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAC 3’，或
b)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’UG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCA 3’，或
c)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
d)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
e)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’G 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
f)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCC 3’，或
g)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dC 3’，或
h)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCC 3’；
i)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CGC 3’；其中
C、A、U和G为核糖核苷酸，并且
dC为2’-脱氧核糖核苷酸。
在第一方面的第23实施方案、也是第一方面的第22实施方案的实施方式中，第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’，并且第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’。
在第一方面的第24实施方案、也是第一方面的第1、2、3、5、6、7、9、10、11、12和14实施方案的实施方式中，核酸分子包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:90的核苷酸序列，或包含与包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:90的核苷酸序列的核酸分子具有至少85％的同一性的核酸分子，或包含与包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:90的核苷酸序列的核酸分子同源的核酸分子，其中所述同源性为至少85％。
在第一方面的第25实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23实施方案的实施方式中，核酸分子包含选自SEQ ID NO:14、SEQID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的核苷酸序列，或包含与包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:91和SEQ ID NO:92的核苷酸序列的核酸分子具有至少85％的同一性的核酸分子，或包含与包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的核苷酸序列的核酸分子同源的核酸分子，其中所述同源性为至少85％。
在第一方面的第26实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25实施方案的实施方式中，核酸分子能够结合人C5a和小鼠C5a。
在第一方面的第27实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26实施方案的实施方式中，核酸分子包含至少一个能够结合人C5a和小鼠C5a的结合部分，其中这样的结合部分由L-核苷酸组成。
在第一方面的第28实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27实施方案的实施方式中，核酸分子的核苷酸或形成核酸分子的核苷酸为L-核苷酸。
在第一方面的第29实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28实施方案的实施方式中，核酸分子为L-核酸分子。
在第一方面的第30实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29实施方案的实施方式中，核酸为通过人和/或小鼠C5a介导的活性的拮抗剂。
在第一方面的第31实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30实施方案的实施方式中，核酸分子包含修饰基团，其中包含修饰基团的核酸分子从生物体的排泄率相较于不包含修饰基团的核酸减小。
在第一方面第32实施方案、也是第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30实施方案的实施方式中，核酸分子包含修饰基团，其中包含修饰基团的核酸分子相较于不包含修饰基团的核酸分子在生物体中具有增加的停留时间。
在第一方面的第33实施方案、也是第一方面的第31和32实施方案的实施方式中，修饰基团选自生物可降解的和非生物可降解的修饰，优选修饰基团选自聚乙二醇、线性聚乙二醇、分枝聚乙二醇、羟乙基淀粉、肽、蛋白质、多糖、固醇、聚氧丙烯、聚氧酰胺和聚(2-羟乙基)－L-谷氨酰胺。
在第一方面的第34实施方案、也是第一方面的第33实施方案的实施方式中，修饰基团为聚乙二醇,优选由线性聚乙二醇或分枝聚乙二醇组成，其中聚乙二醇的分子量优选为约20,000至约120,000Da，更优选约30,000至约80,000Da和最优选约40,000Da。
在第一方面的第35实施方案、也是第一方面的第33实施方案的实施方案中，修饰基团为羟乙基淀粉，其中优选羟乙基淀粉的分子量为约50至约1000kDa，更优选约100至约700kDa和最优选200至500kDa。
在第一方面的第36实施方案、也是第一方面的第31、32、33、34和35实施方案的实施方式中，修饰基团通过接头偶联于核酸分子，其中优选地接头是生物可降解接头。
在第一方面的第37实施方案、也是第一方面的第31、32、33、34、35和36实施方案的实施方式中，修饰基团偶联于核酸分子的5’-末端核苷酸和/或核酸分子的3’-末端核苷酸和/或所述核酸分子的5’-末端核苷酸与所述核酸分子的3’-末端核苷酸之间的所述核酸分子的核苷酸。
在第一方面的第38实施方案、也是第一方面的第31、32、33、34、35、36和37实施方案的实施方式中，生物体是动物体或人体，优选人体。
本发明要解决的问题在第二方面、也是第二方面的第一实施方案中通过用于治疗和/或预防疾病的方法的核酸分子得以解决，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案的核酸分子。
在第2方面的第2实施方案、也是第2方面的第1实施方案的实施方式中，疾病与补体活化和C5a介导的发病机制相关，和/或选自自身免疫性疾病、炎性疾病、全身性炎性反应综合征、眼病、缺血/再灌注损伤、迟发性移植物功能、移植排斥、心血管疾病、呼吸性疾病、急性反应、感染性疾病、神经系统疾病、神经变性疾病、纤维变性疾病、血液病、代谢疾病、肿瘤和与由生物材料引起的补体活化相关的临床并发症，优选全身性炎性反应综合征选自脓毒症和外伤或重度烧伤的继发性损伤。
本发明要解决的问题在第3方面、也是第3方面的第1实施方案中通过药物组合物得以解决，所述药物组合物包含根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第一实施方案的核酸分子和任选地其它组分，其中所述其它组分选自药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体和药物活性剂。
在第三方面的第二实施方案、也是第三方面的第一实施方案的实施方案中，药物组合物包含根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和第二方面的第一实施方案的核酸分子以及药学上可接受的载体。
本发明要解决的问题在第4方面、也是第4方面的第1实施方案中通过核酸分子用于制造药剂的用途得以解决，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第一实施方案的核酸分子。
在第4方面的第2实施方案、也是第4方面的第1实施方案的实施方案中，药剂用于人类医学或用于兽医医学。
在第四方面的第3实施方案、也是第四方面的第1和2实施方案的实施方式中，药剂用于治疗和/或预防自身免疫性疾病、炎性疾病、全身性炎性反应综合征、眼病、缺血/再灌注损伤、迟发性移植物功能、移植排斥、心血管疾病、呼吸性疾病、急性反应、感染性疾病、神经系统疾病、神经变性疾病、纤维变性疾病、血液病、代谢疾病、肿瘤和与由生物材料引起的补体活化相关的临床并发症，优选全身性炎性反应综合征选自脓毒症和外伤或重度烧伤的继发性损伤。
本发明要解决的问题在第5方面、也是第5方面的第1实施方案中通过核酸分子用于制造诊断工具的用途得以解决，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子。
本发明要解决的问题在第6方面、也是第6方面的第1实施方案中通过包含核酸分子和C5a的复合物得以解决，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子，其中优选所述复合物是晶体复合物。
本发明要解决的问题在第7方面、也是第7方面的第1实施方案中通过核酸分子用于检测C5a的用途得以解决，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子。
本发明要解决的问题在第8方面、也是第8方面的第1实施方案中通过方法得以解决，所述方法用于筛选由C5a介导的活性的拮抗剂，其包括下列步骤：
-提供由C5a介导的活性的候选拮抗剂，
-提供根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第2方面的第1实施方案的核酸分子，
-提供在由C5a介导的活性的拮抗剂存在的情况下提供信号的测试系统，和
-确定由C5a介导的活性的候选拮抗剂是否是由C5a介导的活性的拮抗剂。
本发明要解决的问题在第9方面、也是第9方面的第一实施方案中通过试剂盒得以解决，所述试剂盒用于检测C5a，其中试剂盒包含根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第2方面的第1实施方案的核酸分子，以及至少说明书或反应容器。
本发明要解决的问题在第10方面、也是第10方面的第1实施方案中通过方法得以解决，所述方法用于检测样品中的根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸，其中所述方法包括步骤：
a)提供捕获探针，其中所述捕获探针与根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第2方面的第1实施方案的核酸分子的第一部分至少部分互补，和检测探针，其中检测探针与根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子的第二部分至少部分互补；或者，可选择地，捕获探针与根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子的第二部分至少部分互补，以及检测探针与根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子的第一部分至少部分互补；
b)将捕获探针和检测探针分别地或组合地添加至样品，所述样品包含根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子或假定包含根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子；
c)使捕获探针和检测探针同时或以任意顺序依次与核酸分子或其部分反应，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子；
d)任选地检测步骤a)中提供的捕获探针是否与核酸分子杂交，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子；和
e)检测步骤c)中形成的由核酸分子与捕获探针和检测探针组成的复合物，所述核酸分子是根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子。
在第10方面的第2实施方案、也是第10方面的第1实施方案的实施方式中，检测探针包括检测工具，和/或其中捕获探针被固定于支持物，优选固体支持物。
在第10方面的第3实施方案、也是第10方面的第1和2实施方案的实施方式中，从反应中除去不为步骤c)中形成的复合物的部分的任何检测探针以便在步骤e)中仅检测是所述复合物的部分的检测探针。
在第10方面的第4实施方案、也是第10方面的第1、2和3实施方案的实施方案中，步骤e)包括步骤：比较当捕获探针与检测探针在根据第一方面的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38实施方案和根据第二方面的第1实施方案的核酸分子或其部分存在的情况下，和在所述核酸分子或其部分不存在的情况下杂交时，通过检测工具产生的信号。
然而不希望受任何理论束缚，本发明人已令人惊讶地发现根据本发明的核酸分子以高亲和力特异性结合小鼠C5a和人C5a，从而抑制C5a对其C5a受体的结合，尽管小鼠C5a和人C5a的序列同源性在同源区域仅为64％并且小鼠C5a具有3个额外的N末端氨基酸。此外，与人C5a相反，小鼠C5a未被糖基化。天冬酰胺64(人C5a中的糖基化位点)在小鼠中被突变成谷氨酸。特别地，皮摩尔范围内的数种单个C5a结合性核酸显示的亲和力不可预见。
此外，本发明人已令人惊讶地发现根据本发明的核酸分子适合于阻断C5a与C5a受体的相互作用。在这个范围内，根据本发明的核酸分子还可被视为C5a受体的拮抗剂和，分别地被视为C5a的作用，具体地C5a对其受体的作用的拮抗剂。针对C5a的拮抗剂是优选在如实施例中描述的体外测定或体内模型中结合C5a(例如根据本发明的核酸分子)和抑制C5a的功能的分子。
在本发明的范围内，根据本发明的核酸是核酸分子。在这个范围内，术语核酸和核酸分子在本文中以同义的方式使用，如果无相反说明的话。此外，这样的核酸优选在本文中也被称为根据本发明的核酸分子，根据本发明的核酸，本发明核酸或本发明核酸分子。
如本文中描述的根据本发明的核酸的特性可在其中单独地或以任意组合地使用所述核酸的本发明的任何方面中实现。
对于可通过使用根据本发明的核酸分子和组合物，优选包含所述核酸分子的药物组合物治疗或预防的各种疾病、病况和障碍，必须认识到这样的疾病、病况和障碍是本文中描述的那些疾病、病况和障碍，包括，特别是本申请的引文部分描述和所示的那些疾病、病况和障碍。在这个范围内，说明书的各个段落和说明书的引文部分形成了本公开内容的完整部分，该部分教导本发明的核酸分子分别用于所述疾病、病况和障碍的预防和治疗的适合性。此外，根据本发明的核酸分子是优选的，如果C5a－C5a受体轴的生理作用与更高水平的血浆C5a相关的话。
如本文中所用，术语C5a是指任何C5a，包括但不限于哺乳动物C5a。优选地，哺乳动物C5a选自人、大鼠、小鼠、猴C5a(参见图11的C5a物种比对)。更优选地，C5a是人C5a。人C5a是具有根据SEQ.ID.No.50的氨基酸序列的碱性蛋白。小鼠C5a是具有根据SEQ.ID.No.52的氨基酸序列的碱性蛋白。
如权利要求和实施例1中更详细地概述的，本发明人可更令人惊讶地鉴定许多不同的能够结合人和小鼠C5a的结合性核酸分子。
如本文中更详细概述的，本发明人已鉴定了许多不同的能够结合人和小鼠C5a的C5a结合性核酸分子，其中可以用核苷酸区段的方式(在本文中也被称为公开的)表征所述核酸分子(参见实施例1)。如实施例8和9中在实验上显示的，本发明人可令人惊讶地在几个系统中显示根据本发明的核酸分子适合用于治疗脓毒症。
结合C5a的本发明的C5a结合性核酸分子的不同类型的每一个包括3个不同的核苷酸的区段：第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段。一般而言，本发明的C5a结合性核酸分子在其5’-末端和3’-末端包含末端核苷酸区段的各一个，即第一末端核苷酸区段或第二末端核苷酸区段(也称为5’-末端核苷酸区段和3’-末端核苷酸区段)。第一末端核苷酸区段和第二末端核苷酸区段可原则上因其碱基互补性而彼此杂交，从而在杂交后，形成双链结构。然而，这样的杂交在生理和/或非生理条件下在分子中不一定实现。C5a结合性核酸分子的3个核苷酸区段-第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段-彼此以5’→3’-方向排列：第一末端核苷酸区段中央核苷酸区段第二末端核苷酸区段。或者，第二末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第一末端核苷酸区段彼此以5’→3’-方向排列。
根据本发明的核酸的中央核苷酸区段的长度优选为34。
根据本发明的核酸的第一末端核苷酸区段的长度为1至5个核苷酸，优选3至5个核苷酸，更优选3个核苷酸。
根据本发明的核酸的第二末端核苷酸区段的长度为1至5个核苷酸，优选3至5个核苷酸，更优选3个核苷酸。
术语‘区段’和‘核苷酸的区段’在本文中以同义的方式使用，如果没有相反指明的话。
不同的C5a结合性核酸分子之间的确定的区段的序列的差异可影响对C5a的结合亲和力。基于本发明的不同C5a结合性核酸分子的结合分析，中央区段和形成中央区段的核苷酸单个地、更优选在其整体上对于对C5a结合核酸分子对C5a的结合是必需的。
在优选实施方案中，根据本发明的核酸分子是单个核酸分子。在其它实施方案中，单个核酸分子以许多单个核酸分子或以许多单个核酸分子种类的形式存在。
本领域技术人员将认识到根据本发明的核酸分子优选由彼此共价连接(优选通过磷酸二酯连接或键)的核苷酸组成。
在本发明的范围内，根据本发明的核酸分子包含两个或更多个区段或其部分，所述区段或其部分原则上可彼此杂交。在这样的杂交后，形成双链结构。本领域技术人员将认识到，这样的杂交可以存在或可以不存在，特别地在体外和/或体内条件下。同样的，在杂交的情况下，这样的杂交不一定在两个区段的整个长度上存在，其中，至少基于碱基配对法则，这样的杂交和从而双链结构的形成在原则上可以发生。如本文中优选使用的，双链结构是核酸分子的部分或通过两个或更多个单独的链或核酸分子的单链的两个空间上分开的区段形成的结构，其中至少一个，优选2个或更多个优选按照沃森-克里克碱基配对法则进行碱基配对的碱基对存在。本领域技术人员还将认识到，其它碱基配对例如Hoogsten碱基配对可存在于这样的双链结构中或可形成这样的双链结构。还将认识到，两个区段杂交的特性优选地表示这样的杂交假定因两个区段的碱基互补性而发生，无论这样的杂交在体内和/或体外实际上是否发生。与本发明相关，这样的区段是第一末端核苷酸区段和第二末端核苷酸区段，所述核苷酸区段，在实施方案中，可如上定义地杂交。
在优选实施方案中，如本文中所用，术语排列意指与本文中公开的核酸分子相关的本文中描述的结构或功能特性或元件的顺序或序列。
本领域技术人员将认识到，根据本发明的核酸能够结合C5a和C5。该结合特征通过这样的事实产生：对于核酸的鉴定，使用存在于C5a和C5中的C5a的部分。因此，根据本发明的核酸适合于C5a或C5或两者的检测。同样地，本领域技术人员将认识到，根据本发明的核酸分子是C5a和C5的拮抗剂。由此，根据本发明的核酸适合用于分别地治疗和预防与C5a或C5或两者相关或由C5a或C5或两者引发的任何疾病。科学原理可来自于确定C5a和C5分别地参与多种疾病和病况或与其相关的现有技术，并将所述技术通过引用并入本文。
已显示本文中公开的本发明的C5a结合性核酸分子识别C5背景中的C5a(参见实施例1)。因此，研究C5至过敏毒素C5a和C5b(其中C5b是膜攻击复合物(MAC)的部分)的切割是否被C5a结合性核酸抑制。MAC是补体级联的终产物：由C5b-9组成的孔。MAC据信插入病原体的细胞质膜并通过诱导细胞质渗漏杀死它们。通过使用补体依赖性绵羊红细胞溶血测试来实现C5切割的测定。本发明的C5a结合性分子不抑制溶血作用(参见实施例6)。本发明的C5a结合性核酸分子不干扰C5切割和MAC形成，因而仅为C5a的选择性拮抗剂。如果用作药剂，这在许多疾病中可以是有利的，因为在病原体防御中有益的MAC的形成在它们存在的情况下未被损坏。
根据本发明的核酸分子还将包含与本文中公开的特定序列基本上同源的核酸。术语基本上同源的应当被理解为例如同源性为至少75％，优选85％，更优选90％，最优选超过95％、96％、97％、98％或99％。
根据本发明的核酸中存在的同源核苷酸的实际百分比将取决于存在于核酸中的核苷酸的总数。百分比变化可基于存在于核酸中的核苷酸的总数。
可如本领域技术人员已知的，测定两个核酸分子之间的同源性。更具体地，序列比较算法可用于基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同源性。测试序列优选是被认为针对不同核酸分子是同源的或待测试其是否是同源的，并且如果是，达到什么程度的序列或核酸分子，其中这样的不同核酸分子也称为参照序列。在实施方案中，参照序列是如本文中描述的核酸分子，优选具有根据SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的任一个的序列的核酸分子。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法(Smith&Waterman,1981)，通过Needleman&Wunsch的同源性比对算法(Needleman&Wunsch,1970)，通过Pearson&Lipman的相似性搜索法(Pearson&Lipman,1988)，通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测观察来进行。
适合用于测定百分比序列同一性的算法的一个实例是用于基本局部比对搜索工具(在下文中称为"BLAST")中的算法，参见，例如，Altschul等人(Altschul等人1990和Altschul等人,1997)。用于进行BLAST分析的软件是可通过国家生物技术信息中心(在下文中称为"NCBI")公共获得的。用于使用可从NCBI获得的软件例如BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸序列)测定序列同一性的缺省参数描述于McGinnis等人(McGinnis等人,2004)中。
根据本发明的核酸还将包括相对于本文中公开的和根据其核苷酸序列确定的核酸具有一定程度的同一性的核酸。更优选地，本发明还包括相对于本文中公开的和根据其核苷酸序列确定的核酸或其部分具有至少75％，优选85％，更优选90％，最优选超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性的那些核酸分子。
术语本发明的核酸或根据本发明的核酸还将包括这样的核酸，所述核酸包含本文中公开的核酸序列或其部分，优选达到所述核酸或所述部分参与结合人C5a的程度。这样的核酸分子在实施方案中为本文中描述的核酸分子之一或其衍生物和/或代谢物，其中这样的衍生物和/或代谢物优选相较于本文中描述的核酸分子为截短的核酸。截短可涉及本文中公开的核酸的任一个或两个末端。截短还可涉及核酸的内部核苷酸序列，即其可分别地涉及5’与3’末端核苷酸之间的核苷酸。此外，截短将包括小至单个核苷酸从本文中公开的核酸的序列的缺失。截短还可涉及超过一个本发明的核酸的区段，其中区段可小至1个核苷酸长。可由本领域技术人员使用常规实验或通过使用或采用本文中描述的方法，优选在本文中实施例部分描述的方法来测定根据本发明的核酸的结合。
根据本发明的核酸分子可以是D-核酸分子或L-核酸分子。优选地，根据本发明的核酸分子为L-核酸分子。更优选，本发明的核酸分子为Spiegelmer。
还在本发明范围内的是，在实施方案中，本文中描述的核酸分子的每一个和任一个根据其核酸序列在其整体上限定于特定指定的核苷酸序列。换句话说，术语“包含”或“含有”在这样的实施方案中应当以包括或由……组成的含义来解释。
也在本发明范围内的是，根据本发明的核酸是更长的核酸的部分，其中该更长的核酸包含几个部分，其中至少一个这样的部分为根据本发明的核酸或其部分。这些更长的核酸的其它部分可以是一个或数个D-核酸或一个或数个L-核酸。可将任意组合与本发明结合使用。这些更长核酸的其它部分单独地或一起地在其整体性上或以特定组合显示与结合、优选与对C5a的结合不同的功能。一个可能的功能是允许与其它分子相互作用，其中这样的其它分子优选与C5a不同，例如用于固定、交联、检测或扩增。在本发明的其它实施方案中，根据本发明的核酸作为单个部分或组合部分包括几个本发明的核酸。这样的包含几个本发明的核酸的核酸也包括在术语更长的核酸内。
如本文中所用，L-核酸为由L-核苷酸组成，优选完全由L-核苷酸组成的核酸或核酸分子。
如本文中所用，D-核酸为由D-核苷酸组成，优选完全由D-核苷酸组成的核酸或核酸分子。
术语核酸和核酸分子在本文中以可互换的方式使用，如果未明确地指出相反的话。
同样的，如果无相反说明的话，任何核苷酸序列在本文中以5’→3’方向显示。
如本文中优选使用的，核苷酸的任何位置是相对于包含这样的核苷酸的序列、区段或子区段的5’末端测定的或提及的。因此，第二核苷酸为分别从序列、区段和子区段的5’末端计数的第二核苷酸。同样地，与其一致地，倒数第二核苷酸为分别从序列、区段和子区段的3’末端计数的第二核苷酸。
不论本发明的核酸分子由D-核苷酸、L-核苷酸组成还是由两者的组合组成(所述组合为由至少一个L-核苷酸和至少一个D-核酸组成的区段的随机组合或确定的序列)，核酸都可由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合组成。
也在本发明范围内的是，核酸分子由核糖核苷酸和2’脱氧核糖核苷酸组成。2′脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸示于图22和23中。为了区分根据本发明的核酸分子的序列中的核糖核苷酸与2’脱氧核糖核苷酸，在本文中使用下列参考码。
根据本发明的核酸分子由2’脱氧核糖核苷酸组成，其中
dG为2’脱氧-鸟苷-5’-单磷酸,
dC为2’脱氧-胞苷-5’-单磷酸,
dA为2’脱氧-腺苷-5’-单磷酸,
dU为2’脱氧-尿苷-5’-单磷酸,
根据本发明的核酸分子由核糖核苷酸组成，其中
G为鸟苷-5’-单磷酸,
C为胞苷5’-单磷酸,
A为腺苷-5’-单磷酸,
U为尿苷-5’单磷酸。
关于核糖核苷酸序列基序的定义，使用针对不明确的核苷酸的IUPAC缩写：
S 强 G或C；
W 弱 A或U；
R 嘌呤 G或A；
Y 嘧啶 C或U；
K 酮类 G或U；
M 亚胺基 A或C；
B 非A C或U或G；
D 非C A或G或U；
H 非G A或C或U；
V 非U A或C或G；
N 全部 A或G或C或U
将本发明的核酸分子设计为L-核酸分子因若干原因是有利的。L-核酸分子是天然存在的核酸的对映体。然而，D-核酸分子在水溶液中，特别地在生物系统或生物样品中因核酸酶的广泛存在而不是特别稳定。天然存在的核酸酶，特别地来自动物细胞的核酸酶不能降解L-核酸。因此，L-核酸分子的生物半衰期在这样的系统包括动物体和人体中显著增加。由于缺乏L-核酸分子的降解能力，在这样的系统包括动物体和人体中，无核酸酶降解产物产生，从而未观察到从其产生的副作用。这个方面使L-核酸分子区别于实际上所有其它用于治疗牵涉C5的存在的疾病和/或障碍的化合物。通过与沃森-克里克碱基配对不同的机制特异性结合靶分子的L-核酸分子，或部分地或完全地由L-核苷酸组成的适体，特别地对于参与适体对靶分子的结合的适体的那些部分，也称为spiegelmer。这样的适体和spiegelmer对于本领域技术人员来说也是已知的，并且除其它以外描述于‘The AptamerHandbook’(eds.Klussmann,2006)中。
也在本发明范围内的是，本发明的核酸分子，不论其以D-核酸、L-核酸还是D,L-核酸存在，或不论其为DNA还是RNA，都可以以单链或双链核酸分子的形式存在。通常地，核酸分子是单链核酸分子，其因其一级序列而显示确定的二级结构，从而也可形成三级结构。然而，核酸分子还可以是双链的，意即彼此互补或部分互补的两条链彼此杂交。
可修饰本发明的核酸分子。这样的修饰可涉及核酸分子的单个核苷酸，并在本领域是公知的。这样的修饰的实例除其它以外由Venkatesan等人(Venkatesan等人，2003)和Kusser(Kusser，2000)进行了描述。这样的修饰可以是所有组成核酸分子的单个核苷酸的一个、数个的2’位置上的H原子、F原子或O-CH3基团和或NH2-基团。根据本发明的核酸分子还可包含至少一个LNA核苷酸。在实施方案中，根据本发明的核酸分子由LNA核苷酸组成。
在实施方案中，根据本发明的核酸分子可以是多部分核酸分子。如本文中所用，多部分核酸分子是由至少两个单独的核酸链组成的核酸分子。这至少两个核酸链形成功能单位，其中在本发明的C5a的情况下，功能单位为靶分子的配体和，优选地，靶分子的拮抗剂。至少两个核酸链可通过切割本发明的核酸分子以产生至少两条链或通过合成一个对应于本发明的全长核酸分子的第一部分的核酸分子和对应于本发明的全长核酸分子的另一部分的另一个核酸分子来从本发明的任意核酸分子产生。取决于形成全长核酸分子的部分的数目，合成对应数目的具有期望核苷酸序列的部分。应认识到切割法和合成法都可被用于产生其中存在超过两个上文例举的链的多部分核酸分子。换句话说，至少两条单独的核酸链通常与彼此互补和杂交的两条链不同，尽管所述至少两个单独的核酸链之间可存在一定程度的互补性以及由这样的互补性可导致所述单独的链的杂交。
最后，也在本发明范围内的是，实现了根据本发明的核酸分子的完全闭合的，即环状的结构，即根据本发明的核酸分子在实施方案中是闭合的，优选地通过共价连接闭合，其中更优选这样的共价连接在本文中公开的本发明的核酸分子或其任何衍生物的核酸序列的5’末端与3’末端之间产生。
测定根据本发明的核酸分子的结合常数的可能性是使用实施例3和4中描述的方法，其确认根据本发明的核酸显示有利的KD值范围的上述发现。为了表达单个核酸分子与靶(在本发明中为C5a)之间的结合强度的适当量度是所谓的KD值，该值本身以及用于其测定的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
优选地，根据本发明的核酸显示的KD值低于1μM。约1μM的KD值被认为是核酸对靶的非特异性结合的特征。如将由本领域技术人员认识到的，一组化合物例如根据本发明的核酸的KD值在一定范围之内。上述约1μM的KD是KD值的优选上限。靶结合核酸的KD的下限可小至约10皮摩或可更高。在本发明范围内，结合C5a的单个核酸KD值优选在该范围内。优选范围可通过选择该范围内的任意第一数值和该范围内的任意第二数值来界定。优选较高的KD值为250nM和100nM，优选较低的KD值为50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。更优选较高的KD值为10nM，更优选较低的KD值为100pM。
除了根据本发明的核酸分子的结合性质以外，根据本发明的核酸分子还抑制各自靶分子(在本情况下为C5a)的功能。C5a的功能-例如先前描述的各自受体的刺激-的抑制通过根据本发明的核酸分子对C5a的结合并形成根据本发明的核酸分子和C5a的复合物来实现。核酸分子与C5a的这样的复合物不能刺激通常被C5a(即不以与本发明的核酸分子的复合物形式存在的C5a)刺激的受体。因此，根据本发明的核酸分子对受体功能的抑制不依赖可被C5a刺激的各自受体，而是因根据本发明的核酸分子阻止C5a对受体的刺激而引起。
测定根据本发明的核酸分子的抑制常数的可能性是实施例5中描述的方法的使用，其确认了上述发现：根据本发明的核酸显示允许在治疗性治疗方案中使用所述核酸的有利的抑制常数。为了表达单个核酸分子对靶(其在本发明中为C5a)与各自受体的相互作用的抑制作用的强度的适当量度为所谓的半最大抑制浓度(缩写IC50)，所述半最大抑制浓度本身以及用于其测定的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
优选地，根据本发明的核酸分子显示的IC50值低于1μM。约1μM的IC50值被认为是通过核酸分子产生的靶功能的非特异性抑制的特征。如将由本领域技术人员认识到的，一组化合物例如根据本发明的核酸分子的IC50值在一定范围之内。上述约1μM的IC50是IC50值的优选上限。靶结合核酸分子的IC50的下限可小至约10皮摩或可更高。在本发明范围内，结合C5a的单个核酸IC50值优选在该范围内。优选范围可通过选择该范围内的任意第一数值和该范围内的任意第二数值来界定。优选较高的IC50值为250nM和100nM，优选较低的IC50值为50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。更优选较高的IC50值为5nM，更优选较低的IC50值为100pM。
根据本发明的核酸分子可具有任意长度，只要它们仍然能够结合靶分子。在本领域应认识到，存在根据本发明的核酸的优选长度。通常地，长度为15至120个核苷酸。本领域技术人员将认识到，15与120之间的任意整数为根据本发明的核酸的可能长度。根据本发明的核酸的长度的更优选范围为约20至100个核苷酸，约20至80个核苷酸，约20至60个核苷酸，约38至44个核苷酸以及约40个核苷酸的长度。
在本发明范围内，本发明的核酸分子包含部分，所述部分优选为高分子量部分和/或优选允许在除其它以外，在动物体优选人体中的停留时间方面修饰核酸分子的特征。这样的修饰的特别优选实施方案为根据本发明的核酸的PEG化和HES化。如本文中所用，PEG代表聚(乙二醇)，HES代表羟乙基淀粉。如本文中优选地使用的，PEG化为根据本发明的核酸分子的修饰，其中这样的修饰由连接于根据本发明的核酸分子的PEG部分组成。如本文中优选地使用的，HES化为根据本发明的核酸分子的修饰，其中这样的修饰由连接于根据本发明的核酸分子的HES部分组成。这些修饰以及使用这样的修饰来修饰核酸分子的方法描述于欧洲专利申请EP 1 306 382中，将其公开内容通过引用整体并入本文。
在PEG为这样的高分子量部分的情况下，分子量优选为约20,000至约120,000Da，更优选约30,000至约80,000Da，最优选约40,000Da。在HES为这样的高分子量部分的情况下，分子量优选为约50kDa至约1000kDa，更优选约100kDa至约700kDa和最优选200kDa至500kDa。HES显示0.1至1.5，更优选地1至1.5的摩尔取代度，并且显示表达为C2/C6比率的约0.1至15，优选约3至10的置换等级。HES修饰的方法例如描述于德国专利申请DE 1 2004006 249.8中，将其公开内容通过引用整体并入本文。
原则上可在其任意位置上对本发明的核酸分子进行修饰。优选地对核酸分子的5’-末端核苷酸、3’-末端核苷酸和/或5’核苷酸与3’核苷酸之间的任意核苷酸进行这样的修饰。
可直接或间接地，优选通过接头间接地将修饰、优选PEG和/或HES的部分连接于本发明的核酸分子。也在本发明范围内的是，根据本发明的核酸分子包含一个或多个修饰，优选一个或多个PEG和/或HES部分。在实施方案中，单个接头分子将超过一个PEG部分或HES部分连接于根据本发明的核酸分子。与本发明相关地使用的接头可本身为线性的或分枝的。该类型的接头对于本领域技术人员来说是已知的，并进一步描述于国际专利申请WO2005/074993和WO2003/035665中。
在优选实施方案中，接头为生物可降解接头。生物可降解接头允许在除其它以外在动物体，优选人体中的停留时间方面因修饰从根据本发明的核酸分子的释放而修饰根据本发明的核酸分子的特征。生物可降解接头的使用可允许更好地控制根据本发明的核酸分子的停留时间。这样的生物可降解接头的优选实施方案为但不限于在国际专利申请WO2006/052790、WO2008/034122、WO2004/092191和WO2005/099768中所描述的生物可降解接头。
在本发明范围内，修饰或修饰基团为生物可降解修饰，其中可直接或间接地，优选通过接头将生物可降解修饰连接于本发明的核酸分子。生物可降解修饰允许在除其它以外在动物体，优选人体中的停留时间方面因修饰从根据本发明的核酸分子的释放或降解修饰根据本发明的核酸分子的特征。生物可降解修饰的使用可允许更好地控制根据本发明的核酸分子的停留时间。这样的生物可降解修饰的优选实施方案为但不限于在国际专利申请WO2002/065963、WO2003/070823、WO2004/113394和WO2000/41647中，优选地在WO2000/41647,第18页，第4至24行中所描述的生物可降解修饰。
除了上述修饰外，可将其它修饰用于修饰根据本发明的核酸分子的特征，其中这样的其它修饰可选自蛋白质、脂质例如胆固醇和糖链例如淀粉酶、葡聚糖等。
不希望受任何理论束缚，通过用高分子量部分例如聚合物，更具体地一个或数个本文中公开的聚合物修饰根据本发明的核酸分子(优选所述聚合物是生理上可接受的)，改变本发明的这样修饰的核酸分子从对其施用了本发明的修饰核酸分子的动物体或人体排出的排泄动力学。更具体地，由于本发明的这样修饰的核酸分子的增加的分子量以及由于本发明的核酸分子未经历代谢(特别地当以L型存在时，即为L-核酸分子时)，从动物体，优选从哺乳动物体，更优选从人体的排泄减少。由于排泄通常通过肾发生，因此本发明人假定这样修饰的核酸分子的肾小球滤过率相较于不具有该类型的高分子量修饰的核酸分子显著减小，这导致修饰的核酸分子在动物体内的停留时间增加。与其相关，特别值得注意的是，尽管存在这样的高分子量修饰，但根据本发明的核酸分子的特异性不以有害方式受到影响。在这个范围内，根据本发明的核酸分子具有除其它以外令人惊讶的特征-所述特征通常不能从药学活性化合物预期-即提供持续释放的药物制剂不是提供根据本发明的核酸分子的持续释放所必需的。相反地，包含高分子量部分的以其修饰形式存在的根据本发明的核酸分子因其修饰而本身可已被用作持续释放制剂，如其已表现为如同从持续释放制剂释放一样。在这个范围内，本文中公开的根据本发明的核酸分子的修饰和这样修饰的根据本发明的核酸分子以及包含所述修饰核酸分子的任何组合物可提供其独特的，优选受控的药代动力学及生物分布。这还包括在动物和人体的循环中的停留时间，以及在这样的动物和人中至组织的分布。这样的修饰进一步描述于专利申请WO2003/035665中。
然而，也在本发明范围内的是，根据本发明的核酸分子不包含任何修饰，特别地无高分子量修饰例如PEG或HES。当根据本发明的核酸分子显示至身体的任何靶器官或组织的优先分布时或当期望在施用后从身体快速清除根据本发明的核酸分子时，这样的实施方案是特别优选地。具有至身体的任何靶器官或组织的优先分布特征的本文中公开的根据本发明的核酸分子会允许在靶组织中建立有效的局部浓度，同时使核酸分子的全身性浓度保持低水平。这会允许低剂量的使用，这不仅从经济的观点来看是有有益的，而且还减少其它组织对核酸分子的不必要暴露，从而减小副作用的潜在风险。除其它以外在使用根据本发明的核酸分子或包含所述核酸分子的药剂的体内成像或特定的治疗剂量要求的情况下可能期望根据本发明的核酸分子在施用后从身体的快速清除。
在本文中也称为根据本发明的核酸的本发明的核酸和/或根据本发明的拮抗剂可用于产生或制造药剂。这样的根据本发明的药剂或药物组合物包含本发明的核酸的至少一种(任选地与其它药物活性化合物一起)，其中本发明的核酸优选本身用作药物活性化合物。这样的药剂在优选实施方案中包含至少药学上可接受的载体。这样的载体可以是例如水、缓冲液、PBS、葡萄糖溶液，优选地5％的葡萄糖盐平衡溶液、淀粉、糖、明胶或任何其它可接受的载体物质。这样的载体对于本领域技术人员来说通常是已知的。本领域技术人员将认识到，本发明的药剂的或与其相关的任何实施方案、用途和方面也适用于本发明的药物组合物并且反之亦然。
利用根据本发明的或根据本发明制备的核酸、药物组合物和药剂治疗和/或预防的适应症、疾病和障碍因C5a直接或间接牵涉于各自的发病机制而引起。
C5a在炎症部位的局部释放导致强效的促炎症刺激。因此，C5a的中和在许多急性或慢性病况例如一般免疫复合物相关疾病(Heller等人,1999)；神经变性和炎症，例如阿尔茨海默病(Bonifati&Kishore,2007)中可以是有益的，其中补体C5a受体拮抗剂PMX205改善了行为参数和减少病理学标志物例如纤维状沉积物和活化的神经胶质(Fonseca等人2009)。牵涉C5a的其它炎性疾病为系统性红斑狼疮(Jacob等人2010a；Jacob等人2010b)、哮喘(Kohl,2001)；外伤的继发性损伤(Yao等人1998)；脓毒性休克(Huber-Lang等人,2001)；全身性炎症反应综合征(SIRS)；多器官衰竭(MOF)；急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；炎性肠病(IBD)(Woodruff等人,2003)；免疫复合物介导的肾病(Wang,2006)，例如系统性红斑狼疮的并发症(Manderson等人,2004)；感染及其后果(例如血管渗漏或骨丢失例如牙周炎继发性骨丢失(Breivik等人2011))；重度烧伤(Piccolo等人,1999)；器官例如心脏、脾、膀胱、胰腺、胃、肺、肝、肾、四肢、脑、骨骼肌或肠的再灌注损伤(Riley等人,2000)(Gueler等人2008；Khan等人2011；van der Pals等人2010；Zheng等人2008)，所述器官的再灌注损伤可导致，除其它以外，迟发性移植物功能(Lewis等人,2008)或器官的纤维化和/或重塑，从而例如在心脏、脑或肺梗塞后导致继发性损伤；银屑病(Bergh等人,1993)；心肌炎；多发性硬化(Muller-Ladner等人,1996)；阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、溶血、血栓栓塞(Hillmern等人2007)和类风湿关节炎(RA)(Woodruff等人,2002)、肾细胞癌的切除和促进骨破坏的破骨细胞的活化，例如导致骨性关节炎或延期愈合。在年龄相关性黄斑变性中，已发现补体C5a的量在玻璃疣中升高，已显示补体C5a导致增加的VEGF表达和促进脉络膜新血管生成，这可导致导致视力受损和丧失(Nozaki等人,2006)。
还已显示补体系统的活化在小鼠模型中增加对发生脑型疟疾的易感性。使用来自利用这些分子免疫的小鼠的血清阻断C5a或C5a受体赋予对脑型疟疾的抗性。因此，阻断C5－C5a轴在预防人的疟疾，尤其脑型疟疾的发生中可以是有益的(Patel等人2008)。
最近已综述了牵涉补体的自身免疫炎性疾病(Chen等人2010)。关于可能的和已进行的补体靶向疗法的专家评议见于Nature Biotechnology(Ricklin&Lambris,2007)。最新资料公布于2011年的Molecular Medicine(Ehrnthaller等人2011)中。
当然，因为根据本发明的C5a结合性核酸与人C5a相互作用或与其结合，所以本领域技术人员将通常理解，根据本发明的C5a结合性核酸可容易地用于治疗、预防和/或诊断本文中描述的人和动物的任何疾病。与此有关地，应认识到根据本发明的核酸分子可用于治疗和预防本文中描述的任何疾病、障碍或病况，不论这样的疾病、障碍和病况深层的作用模式如何。
在下文中，并且不希望受任何理论束缚，提供了将根据本发明的核酸分子与各种疾病、障碍和病况结合使用的合理性，从而使得要求保护的根据本发明的核酸分子的治疗、预防和诊断适用性是合理的。为了避免任何不必要的重复，应当认识到由于C5a－C5受体轴的参与(如与其相关地概述的)，所述轴可通过根据本发明的核酸分子来寻址，以便实现所要求保护的治疗、预防和诊断作用。还应当认识到，可将患者的疾病、障碍和病况的特性和结合其描述的治疗方案的任何细节经历本申请的优选实施方案。
髓源抑制(缩写MDS)细胞最初在早于30年前在癌症患者中被观察到，它们作为抗肿瘤免疫的破坏者的作用仅在现在才被意识到。正常髓样细胞的异质群体被捕获在分化的中间期，MDS细胞在实际上所有癌症患者的血液、淋巴结中以及在肿瘤部位积累。在健康个体中，这些细胞分化成巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞，但肿瘤分泌一系列破坏免疫祖细胞的分化的因子(Ostrand-Rosenberg,2008)。如来自健康小鼠的外周血和脾的分离的MSD细胞所显示的，MDS细胞在它们的表面上表达C5a受体至与它们的成熟对应物粒细胞和单核细胞表达的C5a受体相似的程度-丰富的表达。同样地在荷瘤小鼠中，MDS细胞表达C5a受体，但在肿瘤相关MSD细胞的表面上的表达水平比在外周血和脾中的MSD细胞上的低。原因是C5a受体在肿瘤相关细胞中被内化，如由Markiewski等人显示的，C5a受体拮抗剂可阻断MSD细胞表面上的C5a受体的功能并且导致受损的肿瘤生长(Markiewski等人2008)。C5a还用作天然杀伤细胞(NK细胞)功能的抑制剂，从而提供补体对具有某些免疫疾病的患者的肿瘤监督和NK功能障碍的负面影响的解释(Li等人2012；Min等人2012)。
因此，对于其的治疗和/或预防可使用根据本发明的药剂的疾病和/或障碍和/或病况包括但不限于肿瘤相关疾病和/或障碍和/或病况。
在优选实施方案中，肿瘤或肿块是通过细胞的异常生长形成的肿胀或损伤(称为赘生物)的名称。肿瘤可以是良性肿瘤、恶变前的肿瘤或恶性肿瘤。此外，肿瘤可以是实体瘤，优选癌、肉瘤、aoteoma、纤维肉瘤和软骨瘤(chondrosoma)。
可特别地通过根据本发明的药剂或核酸分子来治疗的肿瘤优选为选自内分泌系统、眼、胃肠道、生殖系统、造血系统(包括混合和胚胎肿瘤)、乳腺、神经系统、呼吸系统、骨骼、皮肤、软组织、尿流出系统的肿瘤的那些肿瘤。
优选地，这些肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌。
在本发明范围内，分别包含根据本发明的核酸的药剂和药物组合物可以以这样的方式用于治疗。
在其它实施方案中，药剂包含用于治疗肿瘤的其它药物活性剂。这样的其它药物活性化合物，除其它以外，为(但不限于其)已知为抗肿瘤活性物质如烷化剂、抗代谢剂、抗血管生成剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞信号转导的抑制剂、激素、抗体、免疫缀合物和融合蛋白的那些药物活性化合物。
其它药物活性化合物，除其它以外，为(但不限于其)已知为博来霉素、胸苷酸合酶抑制剂(例如雷替曲塞和培美曲塞)、酶例如L-天冬酰胺酶，米替福新和阿那格雷,蛋白酶体的抑制剂例如硼替佐米。
此外，根据本发明的药剂可用于治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病。
慢性阻塞性肺疾病(缩写COPD)是特征在于肺部气流的持续性阻断的肺疾病。其为诊断不足的威胁生命的肺疾病，该疾病干扰正常呼吸并且不可完全逆转。COPD包括少数肺病：最常见的是慢性支气管炎和肺气肿。许多患有COPD的人同时患有这两种疾病。肺气肿是对气道顶端的气囊的损伤，这使得身体难以吸入其需要的氧气。在慢性支气管炎过程中，气道被刺激、发红，并且产生许多粘液。气道壁肿胀并且部分阻断气体通过。
嗜中性粒细胞被吸引朝向C5a梯度，在炎症部位上释放超氧化物自由基以杀死病原体和释放β葡萄糖苷酸酶以水解复杂葡萄糖醛酸苷缀合物。然而，如果嗜中性粒细胞被招募至无病原体炎症部位(例如，在梗塞(infaction)、中风或器官移植后的再灌注部位或在自身免疫性疾病、阿尔茨海默病和下文所列的其它疾病的情况下)，则这些有价值的防御机制可损害身体。
进而，过度高的C5a浓度-特别地如果它们不仅局部升高(如它们在脓毒症过程中所表现的)-导致嗜中性粒细胞的全身性活化(导致器官损害)和随后的通过嗜中性粒细胞的细胞表面上的减少的C5a受体表达而耗尽和失活。这使得患者更加容易受到保持其体内的病原体的伤害(Huber-Lang等人2002)。
对于C5a介导的对其受体(CD88)的作用也是抑制性的(如通过使用分化的BAF-3细胞的趋化测定显示的)C5a结合性核酸因而具有阻断上文命名的C5a信号转导后果的潜能，并且可证明在许多牵涉异常C5a信号转导的疾病和病况中作为药剂的部分是有益的。这些病况之一是多种微生物脓毒症。存在大量的收集C5a信号转导在脓毒症中的有害作用的证据的文献(Ward 2010b)。根据本发明的核酸经发现在盲肠结扎穿孔(CLP)研究中改善小鼠的存活和器官功能参数。CLP是已良好确立的多种微生物脓毒症的啮齿类动物模型。最近在野生型和C5缺陷型小鼠中研究了补体C5在通过盲肠结扎穿孔术诱发的脓毒症中的作用(Flierl等人2008)。C5-/-小鼠相较于WT小鼠不具有生存优势，并且当与野生型小鼠相比较时显示400倍的血液传播细菌的增加。这些作用与C5(-/-)小鼠不能装配最终的膜攻击复合物(MAC)相关。本发明人得出，在脓毒症过程中，C5a或其受体(而非C5)的选择性阻断似乎是更有前景的策略，因为C5a阻断仍然允许MAC形成，同时C5a的有害作用被阻止。一致地，已显示C5a受体CD88和C5L2的遗传缺失、CD88的药理学阻断或C5a的药理学中和在盲肠结扎穿孔术(CLP)诱发的脓毒症中是具有保护性的(Czermak等人1999；Rittirsch等人2008)。使用人全血的脑膜炎球菌脓毒症的转变的体外模型确认选择性C5a抑制(与C5切割的阻断相反)阻止潜在有害的白细胞活化而不包括细菌清除(Sprong等人2003)。C5a的抑制通过限制全身性炎症、凝血和其它致病机制在实验性脓毒症中阻止多器官衰竭(Huber-Lang等人2001；Huber-Lang等人2002；Laudes等人2002；Rittirsch等人2008；Ward 2010a)。根据本发明的核酸，尽管结合C5，但不阻断C5切割成C5a和MAC形成所需的C5b。相反地，本发明的核酸占据蛋白C5，这也增加了终端血浆半衰期，并且当C5a被例如C5转化酶释放时选择性阻断C5a的作用。在脓毒症模型中，已显示根据本发明的核酸限制炎症，阻止多器官衰竭和水肿形成，以及改善存活。
脓毒症患者通常因急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)而需要机械通气。ALI/ARDS也可通过肺炎的社区获得性感染或医院获得性感染从肺的直接感染发展而来。存在C5a在ALI/ARDS中的致病作用的大量证据。C5a诱导的组织因子表达促成ALI/ARDS患者的肺泡内血纤蛋白沉积(Kambas等人2008)。实验性ALI在C5-/-小鼠中减弱，肺中C5a的中和或C5aR的沉默抑制炎症反应并阻止血管渗漏(Bosmann&Ward 2012)。
此外，可使用根据本发明的药剂对于其进行治疗和/或预防的其它疾病和/或障碍和/或病况包括但不限于自身免疫性疾病例如类风湿关节炎(缩写RA)、强直性脊椎炎(缩写AS)、系统性红斑狼疮(缩写SLE)、多发性硬化(缩写MS)、银屑病、斑秃、温和冷自体免疫溶血性贫血(缩写AIHA)、非典型溶血性尿毒症、恶性贫血、急性炎性疾病、自身免疫性肾上腺炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(缩写CIDP)、Churg-Strauss综合征、Cogan综合征、CREST综合征、寻常型天疱疮和落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬变、胰腺炎、腹膜炎、牛皮癣关节炎、风湿热、肉瘤样病、综合征、硬皮病、乳糜泻、僵人综合征、高安氏动脉炎、短暂麸质不耐受性、自身免疫性葡萄膜炎、白癜风、多软骨炎、疱疹样皮炎(缩写DH)或杜林氏病、纤维肌痛、古德帕斯丘综合征、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、自身免疫性肝炎、炎性肠病(缩写IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、免疫复合物病、肾小球肾炎、结节性多发性动脉炎、抗磷脂综合征、多腺性自身免疫性综合征、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(缩写ITP)、荨麻疹、自身免疫性不育、幼年型类风湿关节炎、肉瘤样病、自身免疫性心肌病、Lambert-Eaton综合征、硬化性苔癣、莱姆病、格雷夫斯病、白塞病、美尼尔氏病、反应性关节炎(Reiter's综合征)；病毒例如HIV、HBV、HCV、CMV或细胞内寄生物例如利什曼原虫属、立克次体属、衣原体属、考克斯体属、疟原虫属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、利斯特菌属、弓形虫属和锥虫属的感染；外伤继发性损伤；局部炎症、休克、过敏性休克、烧伤、脓毒性休克、失血性休克、全身性炎症反应综合征(缩写SIRS),多器官衰竭(缩写MOF),哮喘和过敏症、血管炎例如颞动脉炎、脉管炎、血管渗漏和动脉粥样硬化；中枢神经系统的急性损伤、心肌炎、皮肌炎、牙龈炎、急性呼吸功能不全、慢性阻塞性肺疾病、中风、心肌梗塞、再灌注损伤、神经认知功能障碍、烧伤、眼的炎性疾病例如葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性(缩写AMD)、糖尿病视网膜病变(缩写DR)、糖尿病黄斑水肿(缩写DME)、眼天疱疮、角结膜炎、Stevens-Johnson综合征和Graves眼病；全身性疾病的局部表现、脉管系统炎症性疾病、中枢神经系统的急性损伤、1型和2型糖尿病、糖尿病的表现、SLE和眼、脑、脉管系统、心脏、肺、肾、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其它器官系统的风湿性疾病,用于冠状动脉旁路搭桥术(缩写CABG)、非体外循环冠状动脉旁路搭桥术(off-pump coronary artery bypass graft)(缩写OPCABG)、微创直接冠状动脉旁路搭桥术(缩写MIDCAB)、经皮腔内冠状动脉成形术(缩写PTCA)、溶栓、器官移植和血管夹手术的预防和/或支持和/或术后治疗；用于移植器官或待移植的器官的器官损伤的预防或用于移植器官例如肝、肾、肠、肺、心脏、皮肤、四肢、角质层、郎罕氏胰岛、骨髓、血管和胰腺的移植排斥的治疗；胎儿排斥。
可如下将可使用核酸对其进行治疗和/或预防的各种疾病和障碍归类：
1.自身免疫性/炎症性疾病
1.1全身性自身免疫性和/或炎性疾病，包括过敏症、脓毒性休克、外伤的继发性损伤、温和冷自身免疫性溶血性贫血(缩写AIHA)、全身性炎症反应综合征(缩写SIRS)、失血性休克、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病的表现、弥散性硬皮病、牙周炎及其相关骨丢失、多软骨炎、多腺性自身免疫性综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(缩写SLE)及其表现、反应性关节炎(也称为Reiter's综合征)。
1.2胃肠道的自身免疫性和/或炎性疾病包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、短暂麸质不耐受性、炎性肠病(缩写IBD)、胰腺炎、胃肠道变应性超敏反应(gastrointestinalallergic hypersensitivity)、坏死性小肠结肠炎。
1.3皮肤的自身免疫性和/或炎性疾病，包括银屑病、荨麻疹、皮肌炎、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、硬斑病/线形硬皮病、白癜风、疱疹样皮炎(缩写DH)或杜林氏病、硬化性苔癣。
1.4脉管系统的自身免疫性和/或炎性疾病，包括血管炎病(优选颞动脉炎)、脉管炎、过敏性紫癜(Henoch purpura)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关脉管炎、血管渗漏、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、Churg-Strauss综合征、高安氏动脉炎、古德帕斯丘综合征(＝抗肾小球基膜病；最影响肾小球和肺)、肾小球肾炎、结节性多发性动脉炎、白塞病
1.5神经系统的自身免疫性和/或炎性疾病，包括多发性硬化(缩写MS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(缩写CIDP)、神经认知功能障碍、僵人综合征、格-巴二氏综合征、重症肌无力、Lambert-Eaton综合征、视神经脊髓炎(Devic综合征)。
1.6骨骼肌自身免疫性和/或炎性疾病，包括类风湿性关节炎、眼、脑、肺、肾、心脏、肝、胃肠道、脾、皮肤、骨、淋巴系统、血液或其它器官的风湿性疾病、强直性脊椎炎(缩写AS)、肉瘤样病、牙周炎和相关骨丢失、风湿性多肌痛、多肌炎、牛皮癣关节炎、风湿热、多软骨炎、纤维肌痛、幼年型类风湿关节炎、莱姆病、反应性关节炎(也称为Reiter's综合征)。
1.7其它自身免疫性和/或炎性疾病，包括Cogan综合征、自身免疫性肾上腺炎、免疫复合物障碍、Ménière's病、局部炎症、斑秃、急性炎性疾病、原发性胆汁性肝硬变、综合征、硬皮病、弥散性硬皮病、CREST综合征、硬斑病/线形硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎(自身免疫性甲状腺破坏)、格雷夫斯病、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肾小球肾炎、腹膜炎、抗磷脂综合征、特发性肺纤维化、肾脏纤维化、肝纤维化、自身免疫性不育、胎儿排斥或流产以及移植物抗宿主病。
2.眼的疾病，包括葡萄膜炎、结膜炎、年龄相关性黄斑变性(缩写AMD),糖尿病视网膜病变(缩写DR)、糖尿病黄斑水肿(缩写DME),视网膜血管闭塞、青光眼、白内障、自身免疫性视网膜和眼内炎性疾病、眼天疱疮、角结膜炎、Stevens-Johnson综合征和Graves眼病。
3.再灌注损伤和移植物排斥，包括中风、心肌梗塞、再灌注损伤、移植后血栓性微血管病或对移植的器官例如肝(Arumugam等人2004)、肾(Arumugam等人2003)、肠、肺、心脏、皮肤、四肢、角质层、郎罕氏胰岛(Tokodai等人2010)、骨髓、血管和胰腺的器官损害、器官或骨髓移植后肾损伤。
4.移植物排斥的预防，所述移植物排斥包括移植的器官例如肝、肾、肠、肺、心脏、皮肤、四肢、角质层、郎罕氏胰岛、骨髓、血管和胰腺的移植物排斥。
5.心血管疾病，包括动脉粥样硬化、心肌炎、心肌梗塞、中风、肺动脉高压(PAH)、腹主动脉瘤、脉管系统的炎症性疾病、血管炎病、优选地颞动脉炎、脉管炎,血管渗漏、糖尿病的表现、惊厥前期,自身免疫性心肌病,静脉宿主病、致心律失常型右心室发育不全/心肌病(arrythmogenic right ventrivular dysplasia/cardiomyopathy),用于冠状动脉旁路搭桥术(缩写CABG)的预防和/或支持和/或术后治疗。
6.代谢功能障碍，包括胰岛素抗性、葡糖耐受不良、脂肪炎症和食物诱导的肥胖症的心血管功能障碍。
7.呼吸性疾病，包括哮喘、急性呼吸功能不全、急性肺损伤、输液相关肺损伤、成人呼吸性窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、呼吸机所致肺损伤、肺炎及其并发症。
8.炎性疾病，包括眼的炎性疾病、自身免疫性葡萄膜炎(Copland等人2010)、结膜炎、春季结膜炎、全身性疾病的局部表现。
9.急性反应，包括外伤和骨折的继发性损伤、休克、烧伤、过敏性休克、失血性休克、多器官衰竭(缩写MOF)、中枢神经系统的急性损伤、中枢神经系统的急性损伤、因活化凝血系统(例如在器官或胰岛移植后)产生过量C5a而引起的急性损伤，
10.疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、吗啡耐受和停药诱发的痛觉过敏。
11.神经性和神经变性障碍，包括神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病和帕金森病(Farkas等人1998)。
12.感染性疾病，包括：
12.1细菌感染，优选脑膜炎、莱姆病、反应性关节炎(也称为Reiter's综合征),泌尿道和肾感染、脓毒症及其并发症例如器官衰竭、心功能障碍、全身性灌注不足、酸中毒、成人呼吸性窘迫综合征、细胞内病原体引起的感染(Klos等人2009),
12.2病毒感染，优选地HIV、HBV、HCV、CMV感染、病毒性脑膜炎
12.3细胞内寄生物、优选地利什曼原虫属、立克次体属、衣原体属、考克斯体属、疟原虫属、尤其地脑型疟疾、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、利斯特菌属、弓形虫属和锥虫属。
13.血液性疾病，包括与凝血和血纤蛋白溶解系统的活化相关的疾病弥漫性血管内凝血(DIC)和/或血栓形成、恶性贫血、温和冷自身免疫性溶血性贫血(缩写AIHA)、抗磷脂综合征及其相关并发症、动脉和静脉血栓形成、妊娠并发症例如复发流产和胎儿死亡、先兆子痫、胎盘功能不全、胎儿生长受限、颈部再塑形和早产、特发性血小板减少性紫癜(缩写ITP)、非典型溶血尿毒症综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和过敏性输血反应。
14.与在过程(包括血液透析、血浆分离置换法(apheresis)、关节炎关节的粘度补充、心肺转流术、人工血管移植和心血管装置的使用)中发生的补体和凝血级联的由生物材料引起的活化相关的临床并发症。
根据本发明的核酸还可以以手术中方式用于避免患者免疫系统的有害作用，更优选用于冠状动脉旁路搭桥术(缩写CABG)、非体外循环冠状动脉旁路搭桥术(缩写OPCABG)、微创直接冠状动脉旁路搭桥术(缩写MIDCAB)、经皮腔内冠状动脉成形术(缩写PTCA)、溶栓、器官移植、脑和脊髓手术、重建外科手术和血管夹手术的预防和/或支持和/或术后治疗，在利用人工通气或通气辅助设备以避免肺呼吸机所致肺损伤或继发性损害例如血管渗漏和/或肺气肿的任何治疗过程中使用，用于移植器官或待移植器官的器官损害的预防，或针对移植器官例如肝、肾、肠、肺、心脏、皮肤、四肢、角质层、郎罕氏胰岛、骨髓、血管和胰腺的移植排斥和再灌注损伤的治疗。
在本发明范围内，可以以这样的方式将分别包含根据本发明的核酸的药剂和药物组合物用于治疗。
在其它实施方案中，药剂包含其它药物活性剂。这样的其它药物活性化合物，除其它以外，为(但不限于其)已知抑制免疫系统的那些药物活性化合物，例如神经钙蛋白抑制剂,环孢菌素A、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、他罗利姆、雷帕霉素、苯丁酸氮芥、来氟米特、吗替麦考酚酯、布喹那、咪唑立宾、沙立度胺或脱氧精胍菌素。其它药物活性化合物在其它实施方案中还可以是减少组胺产量的那些化合物之一，例如敏克静、氯马斯汀、二甲茚定、巴米品、酮替芬、西替利臻、左旋西替利嗪(lovecetirizin)、地氯雷他定(cesloratadin)、氮卓斯汀、咪唑斯汀、左卡巴斯汀、特非那定、非索非那定或依巴斯汀。这样的化合物还可以是但不限于类固醇，优选选自皮质类固醇如泼尼松、甲泼尼龙、氢化可的松、地塞米松、曲安西龙、倍他米松、泡腾剂或布地奈德。此外，这样的化合物可以是一种或数种抗生素例如但不限于氨基糖苷类、β-内酰胺抗生素类、旋转酶抑制剂、糖肽类抗生素、林肯胺、大环内酯抗生素类、硝基咪唑衍生物、多肽抗生素、磺胺、甲氧苄啶和四环素。此外，可将更特异的抗炎或抗血管生成生物制品组合使用：贝伐单抗、雷珠单抗、IL-10、厄利珠单抗(erlizumab)、tolermab、利妥昔单抗、gomiliximab、巴利昔单抗、达珠单抗、HuMax-TAC、维西珠单抗(visilizumab)、HuMaxCD4、克立昔单抗、MAX16H5、TNX 100、托利珠单抗(toralizumab)、阿仑珠单抗、CY1788、加利昔单抗、培克珠单抗、依库珠单抗、PMX-53、ETI 104、FG 3019、柏替木单抗、249417(抗因子IX)阿昔单抗、YM 337、奥马佐单抗、他利珠单抗、芳妥珠单抗、J695(抗IL12)、HuMaxIL-15、美泊利单抗、伊斯利莫、HuDREG、阿那白滞素、Xoma-052、阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、阿非莫单抗、CytoFab、AME 527、伐利昔单抗、贝伐单抗、雷珠单抗、vitaxin、贝利木单抗、MLN 1202、伏洛昔单抗、F200(抗-α5β1)、依法珠单抗、m60.11(抗CD11b)、依那西普、奥那西普、利洛纳塞(rilonacept)、阿巴他塞、那他珠单抗或西利珠单抗(siplizumab)、托珠单抗、乌司奴单抗、ABT-874。最后，其它药物活性剂可以是任何其它趋化因子的活性的调节剂，其可以是趋化因子激动剂或拮抗剂，或趋化因子受体激动剂或拮抗剂，其中趋化因子还可以是趋化脂质。实例是S1P受体调节剂芬戈莫德。或者，或另外地，这样的其它药物活性剂是根据本发明的其它核酸。或者，药剂还包含至少一种结合与C5a不同的靶分子或显示与根据本发明的核酸之一不同的功能的核酸。
一般而言，可将C5a拮抗剂与其它促炎分子或它们的受体的抑制剂组合。其作用可通过与C5a拮抗剂组合而减弱的促炎分子的实例为IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-23、TNF、α4β7、α5β1、BlyS、钙粘蛋白、CCR2、CD11a、CD11b、CD125、CD130、CD16、CD18、CD2、CD20,CD22、CD23、CD25、CD28、CD3、CD30、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45R、CD54、CD62E、CD62L、CD68、CD8、CD80、CD86、CD95、CEP、胃泌素-R、C1、C1-酯酶、C5、因子D、MBL、补体受体1、CRTH2-受体、CTGF、E-和P-选择蛋白、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、因子IX、FGF-20、Fgl-2、GM-CSF、GP IIb/IIIa受体、HMG1、ICAM-1、IgE、胸腺细胞、IFNγ、IFNr、IP-10、MCP-1、M-CSF受体、MIF、MMP9、PDGF-D、SDF-1、TGFβ1、组织因子、酪氨酸激酶受体、VAP-1、VCAM-1、VEGF、VLA1、血管性血友病因子(von Willebrandtfactor)、鞘氨醇1磷酸、神经酰胺-1磷酸盐以及有丝分裂原的抑制剂例如溶血磷脂酸的抑制剂。
最后，其它药物活性剂可以是任何其它趋化因子的活性的调节剂，其可以为趋化因子激动剂或拮抗剂或趋化因子受体激动剂或拮抗剂。或者，或另外地，这样的其它药物活性剂是根据本发明的其它核酸。或者，药剂包含至少一种结合与C5a不同的靶分子或显示与根据本发明的核酸分子之一不同的功能的核酸。
在本发明范围内，药剂原则上可选择地或另外地结合用于预防公开的与药剂用于治疗所述疾病的用途有关的疾病中的任何疾病。因而，各自的标志物即针对各自的疾病的标志物，对于本领域技术人员来说是已知的。优选地，各自的标志物为C5a。
在本发明的药剂的一个实施方案中，将这样的药剂与用于本文中公开的疾病中的任何疾病的其它治疗，特别地会对其使用本发明的药剂的那些治疗组合使用。
"联合治疗"(或"协同治疗(co-therapy)")包括本发明的药剂和至少第二试剂的施用以作为意在从这些治疗剂(即本发明的药剂和所述第二试剂)的协同作用提供有益作用的特异治疗方案的部分。组合的有益作用包括但不限于由治疗剂的组合产生的药代动力学或药效共同作用。通常通过在一段确定的时间(通常数分钟、数小时、数天或数周，取决于选择的组合)内进行这些治疗剂的组合施用。
"联合治疗"可能会，但通常不会期望包括这些治疗剂的两种或更多种的施用以作为偶然地和任意地导致本发明的组合的分开的单一疗法方案的部分。"联合治疗"意欲包括以连续方式施用这些治疗剂，即，其中在不同的时间施用每种治疗剂，以及以大体上同时的方式施用这些治疗剂，或所述治疗剂的至少两种。大体上同时的施用可以例如通过给受试者施用具有固定比率的每一种治疗剂的单个胶囊或多个每个具有一种治疗剂的单个胶囊来实现。
每一种治疗剂的连续或大体上同时施用可通过任何适当的途径来实现，所述途径包括但不限于局部途径、口服途径、静脉内途径、肌内途径和通过粘膜组织的直接吸收。治疗剂可通过相同途径或通过不同途径施用。例如，选择的组合的第一治疗剂可通过注射施用，而组合的其它治疗剂可局部施用。
或者，例如，可局部施用所有治疗剂，或可通过注射施用所有治疗剂。除非另外指出，否则施用治疗剂所按的顺序不是严格地至关重要的。"联合治疗"还可包括与其它生物活性成分进一步组合的上述治疗剂的施用。当联合治疗还包括非药物治疗时，可在任何适当的时间进行非药物治疗，只要可从治疗剂与非药物治疗的组合的共同作用获得有益作用。例如，在适当的情况下，当非药物治疗从治疗剂的施用暂时移除(可能数天或甚至数周)时，仍可获得有益作用。
如上文概述的，根据本发明的药剂原则上可以以本领域技术人员已知的任何形式施用。优选施用途径为全身性施用，更优选通过胃肠外施用，优选通过注射。或者，可局部施用药剂。其它施用途径包括肌内、腹膜内和皮下、口服、鼻内、气管内或经肺，优先考虑侵入性最小然而确保功效的施用途径。
胃肠外施用通常用于皮下、肌内或静脉内注射和输注。此外，用于胃肠外施用的一个方法使用缓释或持续释放系统的植入，这确保了剂量的恒定水平得到维持，这对于本领域技术人员来说是公知的。
此外，本发明的优选药剂可通过适当的鼻内媒介物、吸入剂的局部使用以鼻内形式施用，或使用对于本领域技术人员来说是公知的经皮贴剂的那些形式通过经皮肤途径来施用。为了以透皮递送系统的形式施用，剂量施用当然在给药方案中从始至终是连续的而非间歇性的。其它优选局部用制剂包括乳膏剂、软膏、洗剂、气溶胶喷雾剂和凝胶，其中活性成分的浓度通常会在0.01％至15％w/w或w/v的范围内。
本发明的药剂通常会包含有效量的治疗的活性组分，包括但不限于本发明的核酸分子，其溶解于或分散在药学上可接受的介质中。药学上可接受的介质或载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是公知的。还可将补充活性成分掺入本发明的药剂。
在其它方面，本发明涉及药物组合物。这样的药物组合物包含根据本发明的核酸的至少一种和优选药学上可接受的媒介物。这样的媒介物可以是本领域使用和/或已知的任何媒介物或任何粘合剂。更具体地，这样的粘合剂或媒介物是与本文中公开的药剂的制备相关论述的任何粘合剂或媒介物。在其它实施方案中，药物组合物包含其它药物活性剂。
根据本公开内容，药剂和药物组合物的制备对于本领域技术人员来说将是已知的。通常地，可将这样的组合物制备为血管注射剂(液体溶液或悬浮液)；适合在注射之前溶于或悬浮于液体中的固定形式；片剂或用于口服施用的其它固体；定时释放胶囊；或目前使用的任何其它形式，包括滴眼剂、乳膏、洗剂、软膏、吸入剂等。由外科医生、内科医生或医护人员使用无菌制剂例如基于盐水的洗涤，处理手术区的特定区域也可以是特别有用的。还可通过微工具、微粒或海绵递送组合物。
配制后，将以与剂量配方相容的方式，并且以这样的药理学上有效的量施用药剂。以多种剂型例如上述可注射溶液的类型容易地施用制剂，但也可使用药物释放胶囊等。
在该背景中，待施用的活性成分的量和组合物的体积取决于待治疗的个体或受试者。施用所需的活性化合物的具体量取决于医生的判断并且对于每一个个体是独特的。
通常使用分散活性化合物所需的药剂的最小体积。适当的施用方案也是可变的，但通常是最初施用化合物，监控结果，随后以更长的间隔给予进一步受控的剂量。
例如，对于以片剂或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式进行的口服施用，可将活性药物成分，即根据本发明的核酸分子和/或任何其它药物活性剂，在本文中也称为治疗剂或活性化合物，与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)组合。此外，当期望或必需时，还可将适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物。适当的粘合剂包括淀粉、硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮、天然糖类例如葡萄糖或β-乳糖、玉米增甜剂、天然和合成树胶例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、聚乙二醇、石蜡等。以这些剂型使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、笨甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾合剂等。稀释剂包括例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸。
本发明的药剂还可以以这样的口服剂型如定时和持续释放片剂或胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、悬浮剂、糖浆剂和乳剂进行施用。有利地从脂肪乳剂或悬浮剂配制栓剂。
药物组合物或药剂可被灭菌和/或包含佐剂例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可包含其它治疗上有价值的物质。组合物可按照常规的混合、粒化或包衣法来制备，通常包含约0.1％至75％,优选地约1％至50％的活性成分。
液体，特别地可注射组合物可以例如通过溶解、分散等来制备。将活性化合物溶解在药用纯溶剂(例如水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等)中或与其混合，从而形成可注射溶液或悬浮液。此外，可配制适合在注射之前溶解于液体中的固体形式。
对于固体组合物，赋形剂包括药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。还可使用例如聚亚烷基二醇，例如丙醇作为载体将上文中定义的活性化合物配制为栓剂。在一些实施方案中，有利地从脂肪乳剂或悬浮剂制备栓剂。
还可将本发明的药剂和核酸分子分别地以脂质体递送系统的形式例如小的单层囊泡、大的单层囊泡以及多层囊泡施用。脂质体可从多种磷脂，包括胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。在一些实施方案中，利用药物的水溶液水化脂质组分的薄膜以形成封装药物的脂质层，这对于本领域技术人员来说是公知的。例如，可以以使用本领域已知的方法构建的与亲脂化合物或非免疫原性高分子量化合物的复合物的形式提供本文中描述的本发明的核酸分子。此外，脂质体可在其表面上具有这样的核酸分子，以将细胞毒素剂靶向和运载至内部，从而介导细胞杀伤。核酸缔合的复合物的实例提供于美国专利No.6,011,020中。
本发明的药剂和核酸分子分别地还可与可溶性聚合物如可靶向的药物载体偶联。这样的聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的药剂和核酸分子分别地可偶联至一类用于实现药物的受控释放的生物可降解聚合物，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、多正酯类、缩醛树脂、聚二氢吡喃、聚腈基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或两亲性嵌段共聚物。
必要时，待施用的药物组合物和药剂分别地还可包含少量无毒辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其它物质例如醋酸钠和三乙醇胺油酸酯。
分别地使用本发明的核酸分子和药剂的给药方案按照多个因素来选择，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况；待治疗的病况的严重度；施用途径；患者的肾和肝功能；以及使用的本发明的特定适体或其盐。普通熟练医生或兽医可容易地确定和开出防止、抵御或停止病况的进展所需的药物的有效量。
在本文中公开的疾病的任何疾病的治疗中，根据本发明的核酸的有效血浆水平范围优选在500fM与500μM之间。
本发明的核酸分子和药剂分别地可优选地以单个日剂量、每两天或每三天一次、每周一次、每两周一次、以单个月剂量或每三个月一次来进行施用。
在本发明范围内，本文中描述的药剂组成本文中公开的药物组合物。
在其它方面，本发明涉及用于治疗需要这样的治疗的受试者的方法，其中所述方法包括施用药物活性量的根据本发明的核酸的至少之一。在实施方案中，受试者患有疾病或处于发生这样的疾病的风险中，其中所述疾病为本文中公开的那些疾病的任何疾病，特别地结合根据本发明的核酸的任一种用于制造药剂的用途而公开的那些疾病的任何疾病。
应理解，根据本发明的核酸以及拮抗剂不仅可用作药剂或用于制造药剂，而且还可用于美容目的，特别地在C5a参与局部发炎皮肤病变方面。因此，可使用根据本发明的核酸、药剂和/或药物组合物对其进行治疗或预防的其它病况或疾病为局部发炎皮肤病变。
如本文中优选地使用的，诊断法或诊断试剂或诊断工具适合用于直接或间接地检测C5a，优选如本文中描述的C5a，更优选如本文中描述的与本文中描述的各种障碍和疾病有关的C5a。诊断法适合用于分别地检测和/或随访本文中描述的障碍和疾病的任何一种。这样的检测可通过根据本发明的核酸对C5a的结合来进行。这样的结合可被直接或间接地检测。各自的方法和工具对于本领域技术人员来说是已知的。除其它以外，根据本发明的核酸可包含允许检测根据本发明的核酸，优选结合于C5a的核酸的标记。这样的标记优选选自放射性标记、酶促标记和荧光标记。原则上，针对抗体开发的所有已知测定可用于根据本发明的核酸，其中靶结合抗体被替代成靶结合核酸。在使用未标记靶结合抗体的抗体-测定中，检测优选通过利用第二抗体来进行，所述第二抗体已用放射性标记、酶促标记和荧光标记修饰，并且在其Fc-片段上结合靶结合抗体。在核酸、优选根据本发明的核酸的情况下，利用这样的标记修饰核酸，其中优选地这样的标记选自生物素、Cy-3和Cy-5，并且这样的标记通过针对这样的标记的抗体例如抗-生物素抗体、抗-Cy3抗体或抗-Cy5抗体来检测，或在标记是生物素的情况下，标记通过天然地结合生物素的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白来检测。这样的抗体、链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白继而优选地利用各自的标记例如放射性标记、酶促标记或荧光标记(如第二抗体)来修饰。
在其它实施方案中，通过第二检测工具检测或分析根据本发明的核酸分子，其中所述检测工具为分子信标。分子信标的方法对于本领域技术人员来说是已知的。简而言之，也称为分子信标的核酸探针与待检测的核酸样品反向互补并且由此与待检测的核酸样品的部分杂交。在与核酸样品结合后，分子信标的荧光基团分离，这导致荧光信号的改变，优选强度的改变。该改变与存在的核酸样品的量相关。
应认识到使用根据本发明的核酸进行的C5a的检测特别允许检测本文中定义的C5a。
与C5a的检测相关，优选方法包括下列步骤：
(a)提供将测试其C5a的存在的样品，
(b)提供根据本发明的核酸，
(c)将样品优选地在反应容器中与核酸反应
其中可在步骤(b)之前进行步骤(a)，或可在步骤(a)之前进行步骤(b)。
在优选实施方案中，提供了另外的步骤d)，所述步骤在于检测样品与核酸的反应。优选地，将步骤b)的核酸固定于表面。表面可以是反应容器例如反应管、板的孔的表面，或包含在这样的反应容器中的工具例如珠粒的表面。核酸至表面的固定可通过本领域技术人员已知的任何方式包括但不限于非共价或共价连接来进行。优选地，连接通过表面与核酸之间的共价化学键来建立。然而，也在本发明范围内的是，将核酸间接固定于表面，其中这样的间接固定包括其它组分或一对相互作用伴侣的使用。这样的其它组分优选为与待固定的核酸特异性相互作用的化合物，其也被称为相互作用伴侣，从而介导核酸至表面的连接。相互作用伴侣优选选自核酸、多肽、蛋白质和抗体。优选地，相互作用伴侣为抗体，更优选单克隆抗体。或者，相互作用伴侣为核酸，优选功能性核酸。更优选，这样的功能性核酸选自适体、spiegelmer和与所述核酸至少部分互补的核酸。在其它可选择的实施方案中，核酸至表面的结合由多部分相互作用伴侣介导。这样的多部分相互作用伴侣优选为一对相互作用伴侣或由第一成员和第二成员组成的相互作用伴侣，其中第一成员由核酸包含或连接于所述核酸，并且第二成员连接于表面或被表面包含。多部分相互作用伴侣优选选自包括生物素与抗生物素蛋白、生物素与链霉抗生物素蛋白以及生物素与neutravidin的相互作用伴侣对的组。优选地，相互作用伴侣对的第一成员为生物素。
这样的方法的优选结果为C5a与核酸的固定复合物的形成，其中更优选检测到所述复合物。在实施方案内，从复合物检测到C5a。
顺从该要求的各自检测工具是例如特异于C5a的那部分/那些部分的任何检测工具。特别优选的检测工具为选自核酸、多肽、蛋白质和抗体的检测工具，所述检测工具的产生对于本领域技术人员来说是已知的。
用于检测C5a的方法还包括从已优选地用于进行步骤c)的反应容器除去样品。
方法还在其它实施方案中包括将C5a的相互作用伴侣固定在表面，优选上文中定义的表面上的步骤，其中相互作用伴侣是如本文中定义的，优选如上文中结合各自方法定义的，更优选在它们的各种实施方案中包括核酸、多肽、蛋白质和抗体。在该实施方案中，特别优选的检测工具为根据本发明的核酸，其中这样的核酸可优选地是标记的或非标记的。如果这样的核酸分子被标记，则其可被直接或间接检测。这样的检测还可包括使用第二检测工具，其优选地也选自本文中描述的核酸分子、多肽、蛋白质和不同实施方案中的实施方案。这样的检测工具优选特异于根据本发明的核酸。在更优选实施方案中，第二检测工具为分子信标。核酸或第二检测工具或两者可在优选实施方案中包含检测标记。检测标记优选选自生物素、溴代脱氧尿苷标记、地高辛标记、荧光标记、UV-标记、放射性-标记和螯合剂分子。或者，第二检测工具与检测标记相互作用，所述检测标记优选由核酸包含、包括或连接于所述核酸。特别优选的组合如下：
检测标记是生物素并且第二检测工具为针对生物素的抗体，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具为抗生物素蛋白或具有抗生物素蛋白的分子，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具为链霉抗生物素蛋白或具有链霉抗生物素蛋白的分子，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具为neutravidin或具有neutravidin的分子，或
其中检测标记为溴代脱氧尿苷并且第二检测工具为针对溴代脱氧尿苷的抗体，或其中
检测标记为地高辛并且第二检测工具针对地高辛的抗体，或其中
检测标记是螯合剂，并且第二检测工具为放射性核素，其中优选地所述检测标记连接于核酸。应认识到该类型的组合也适用于其中核酸连接于表面的实施方案。在这样的实施方案中，优选检测标记连接于相互作用伴侣。
最后，也在本发明内的是使用第三检测工具检测第二检测工具，优选第三检测工具为酶，更优选在第二检测工具的检测后显示酶促反应，或第三检测工具为用于检测放射线的工具，更优选由放射性核素发射的放射线。优选地，第三检测工具特异性地检测第二检测工具和/或与其相互作用。
在其中C5a的相互作用伴侣固定在表面上并且优选地将根据本发明的核酸添加至在相互作用伴侣与C5a之间形成的复合物的实施方案中，还可从反应中，更优选从其中进行步骤c)和/或d)的反应容器中除去样品。
在实施方案中，根据本发明的核酸包括荧光部分，并且其中荧光部分的荧光在核酸与C5a和与游离C5a之间的复合物形成后不同。
在其它实施方案中，核酸是根据本发明的核酸的衍生物，其中核酸的衍生物包含至少一个替代腺苷的腺苷的荧光衍生物。在优选实施方案中，腺苷的荧光衍生物为亚乙烯基腺苷。
在其它实施方案中，使用荧光检测由根据本发明的核酸的衍生物和C5a组成的复合物。
在方法的实施方案中，信号在步骤(c)或步骤(d)中产生，优选信号与样品中的C5a浓度相关。
在优选方面，可在96孔板中进行测定，其中如上所述将组分固定在反应容器中，孔用作反应容器。
本发明的核酸还可用作用于药物设计的起始材料。大体上存在两个可能的方法。一个方法是筛选化合物文库，其中这样的化合物文库优选是低分子量化合物文库。在实施方案中，筛选是高通量筛选。优选地，高通量筛选是在基于靶的测定中进行的化合物的快速、高效的试错评价。在最佳情况下通过色度测量进行分析。与其结合使用的文库对于本领域技术人员来说是已知的。
或者，根据本发明的核酸可用于药物的合理设计。优选地，合理的药物设计是药物前导结构(pharmaceutical lead structure)的设计。始于通常通过方法例如X射线晶体学或核磁共振光谱学鉴定的靶的3维结构，使用计算机程序搜索包含许多不同化合物的结构的数据库。利用计算机进行选择，随后可在实验室测试鉴定的化合物。
药物的合理设计可始于根据本发明的任何核酸，并且涉及结构，优选三维结构，所述结构与本发明的核酸的结构相似或与本发明的核酸的结构的结合介导部分相同。在任何情况下，这样的结构仍然显示与本发明的核酸相同或相似的结合特征。在药物的合理设计的其它步骤中或作为替代步骤，利用与核苷酸和核酸不同的化学基团模拟结合神经递质的核酸的那些部分的优选三维结构。通过该模拟，可设计与核酸不同的化合物。这样的化合物优选是小分子或肽。
在筛选化合物文库的情况下，例如通过使用竞争性测定，这对本领域技术人员来说是已知的，可发现适当的C5a类似物、C5a激动剂或C5a拮抗剂。这样的竞争性测定可如下建立。将本发明的核酸，优选地为靶结合性L-核酸的spiegelmer，偶联于固相。为了鉴定C5a类似物，可将标记的C5a添加至测定。潜在类似物可与C5a分子竞争对spiegelmer的结合，这可伴随通过各自标记获得的信号的减弱。激动剂或拮抗剂的筛选可包括本领域技术人员已知的细胞培养测定的使用。
根据本发明的试剂盒可包括至少一种或数种本发明的核酸。此外，试剂盒可包括至少一个或数个阳性或阴性对照。阳性对照可以例如是C5a，特别地本发明的核酸是针对其选择的或本发明的核酸所结合的C5a，优选地其以液体形式存在。阴性对照可以例如是按照与C5a相似的生物物理性质定义的但不被本发明的核酸识别的肽。此外，所述试剂盒还可包括一种或数种缓冲液。可以以干燥或冻干的形式或溶解于液体中的形式将各种成分包含在试剂盒中。试剂盒可包含一种或数种容器，其进而可包含试剂盒的一种或数种成分。在其它实施方案中，试剂盒包括给用户提供关于如何使用试剂盒及其各种成分的信息的说明或说明书。
根据本发明的核酸的药物和生物分析测定对于其在人体和非人体的几种体液、组织和器官中的药代动力学和生物动力学特征谱的估量是非常必要的。为此目的，可使用任何本文中公开的或本领域技术人员已知的检测法。在本发明的其它方面，提供了用于检测根据本发明的核酸的夹心杂交测定。在该检测测定内，使用捕获探针和检测探针。捕获探针与根据本发明的核酸的第一部分互补，并且检测探针与其第二部分互补。捕获和检测探针都可由DNA核苷酸、修饰DNA核苷酸、修饰RNA核苷酸、RNA核苷酸、LNA核苷酸和/或PNA核苷酸形成。
因此，捕获探针包含与根据本发明的核酸的5’-末端互补的序列区段，以及检测探针包含与根据本发明的核酸的3’-末端互补的序列区段。在该情况下，将捕获探针通过其5’-末端固定于表面或基质，其中可在其5’-末端直接固定捕获探针，或通过其5’-末端与表面或基质之间的接头固定捕获探针。然而，原则上可将接头连接于捕获探针的每一个核苷酸。接头可由本领域熟知的亲水性接头形成，或由D-DNA核苷酸、修饰D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、修饰D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、修饰L-RNA核苷酸、修饰L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
或者，捕获探针包含与根据本发明的核酸的3’-末端互补的序列区段，并且检测探针包含与根据本发明的核酸的5’-末端互补的序列区段。在该情况下将捕获探针通过其3’-末端固定于表面或基质，其中可直接在其3’-末端固定或通过其3’-末端与表面或基质之间的接头固定捕获探针。然而，原则上，可将接头连接于与根据本发明的核酸互补的序列区段的每一个核苷酸。接头可由本领域中熟知的亲水性接头或由D-DNA核苷酸、修饰D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、修饰D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、修饰L-RNA核苷酸、修饰L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
可与根据本发明的核酸杂交的捕获和检测探针的核苷酸的数目是可变的，并且可取决于捕获和/或检测探针和/或根据本发明的核酸本身的核苷酸的数目。可与根据本发明的核酸杂交的捕获和检测探针的核苷酸的总数应当是由根据本发明的核酸包含的核苷酸的最大数目。检测和捕获探针的核苷酸的最小数目(2至10个核苷酸)应当允许分别与根据本发明的核酸的5’-末端或3’-末端杂交。为了实现根据本发明的核酸与被分析的样品中存在的其它核酸之间的高特异性和选择性，捕获和检测探针的核苷酸的总数应当是由根据本发明的核酸包含的核苷酸的最大数目。
此外，检测探针优选具有标志物分子或标记，可如本文中先前所述检测所述标志物分子或标记。原则上可将标记或标志物分子连接于检测探针的每一个核苷酸。优选，标记或标志物位于检测探针的5’末端或3’末端，其中可在检测探针内的与根据本发明的核酸互补的核苷酸与标记之间插入接头。接头可由本领域熟知的亲水性接头或由D-DNA核苷酸、修饰D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、修饰D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、修饰L-RNA核苷酸、修饰L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
可如下进行根据本发明的核酸的检测：
根据本发明的核酸以其末端之一与捕获探针杂交并以另一末端与检测探针杂交。随后，通过例如一次或数次洗涤步骤除去未结合的检测探针。可随后测量结合的优选具有标记或标志物分子的检测探针的量，如例如在WO/2008/052774(将其通过引用并入本文)中更详细概述的。
如本文中优选使用的，术语治疗，在优选实施方案中，包括额外地或可选择地预防和/或随防。
如本文中优选地使用的，术语疾病和障碍应当以可互换的方式使用，如果没有相反指明的话。
如本文中所用，术语包括优选地不意欲限定所述术语之后或由其描述的主题。然而，在可选择的实施方案中，术语包括应当理解为意指包含，从而理解为限定所述术语之后或由其描述的主题。
不同的SEQ ID NO：，根据本发明的核酸分子和本文中使用的靶分子C5a的化学性质，其实际序列和内部名称编号概述于下表中。
本发明通过可从其获得其它性质、实施方案和有利方面的附图、实施例和序列表来进一步举例说明，其中
图1显示能够结合人和小鼠C5a的核酸分子的序列的比对，包括KD值和如通过表面等离子体共振测量测定的对人和小鼠C5a的相对结合活性；
图2显示具有单个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的核酸分子NOX-D19001的衍生物，包括KD值和如通过表面等离子体共振测量测定的对人C5a的相对结合活性；
图3显示具有2、3、4、5或6个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的核酸分子NOX-D19001的衍生物，包括KD值和如通过表面等离子体共振测量测定的对人C5a的相对结合活性；
图4+B显示核酸分子NOX-D19001-6xDNA的截短，包括KD值和如通过表面等离子体共振测量测定的对人C5a的相对结合活性；
图5显示具有0、1、2、3或4个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的核酸分子NOX-D20001的衍生物，包括KD值和如通过表面等离子体共振测量测定的对人C5a的相对结合活性；
图6显示通过Biacore测量进行的核酸分子NOX-D19001、NOX-D19001-D09和NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(也称为NOX-D19001-6xDNA)对于人C5a的动力学评价，其中显示了500nM的Spiegelmer NOX-D19001、NOX-D19001-D09(缩写D09)和NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(缩写D09-16-17-30-32-40)的数据；
图7是显示5′-末端40kDa PEG化的C5a结合性Spiegelmer NOX-D19001-5′PEG(也称为NOX-D19)、NOX-D20(也称为NOX-D19001-6xDNA-020-5′40kDa PEG)在趋化性测定中的效能的图示，其中使细胞朝向利用不同量的Spiegelmer在37℃预温育的0.1nM huC5a迁移，
图8显示通过Biacore测量进行的核酸分子NOX-D20(也称为NOX-D19001-6xDNA-020-5′40kDa PEG)对于人C5a、大鼠C5a、小鼠C5a、猴C5a的动力学评价，其中显示了1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和1.95-0nM的Spiegelmer NOX-D20的数据；
图9显示通过Biacore测量进行的核酸分子NOX-D20(也称为NOX-D19001-6xDNA-020-5′40kDa PEG)对于人C5和人desArg-C5a的动力学评价，其中显示了1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和1.95-0nM的Spiegelmer NOX-D20的数据；
图10显示通过Biacore测量进行的核酸分子NOX-D21(也称为NOX-D19001-2dU-1dC-020-5′40kDa PEG)对于人C5a、人C5、人desArg-C5a、小鼠C5a和小鼠desArg-C5a的动力学评价，其中显示了1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和1.95-0nM的Spiegelmer NOX-D21结合人C5a和人C5的数据的数据；
图11显示来自人、恒河猴、小鼠和大鼠的C5a的多肽序列比对；
图12A是显示C5a结合性Spiegelmer NOX-D20在趋化性测定中对于人C5a和小鼠C5a的效能的图示，使细胞朝向利用不同量的Spiegelmer在37℃预温育的0.1nM huC5a或0.3nM mC5a迁移；其中a)将细胞计数针对每一个数据组的最大值标准化，并描述为针对Spiegelmer浓度的百分比计数，b)利用Prism5软件，使用非线性回归(4参数拟合)计算趋化性被抑制50％(IC50)时的Spiegelmer浓度；
图12B是显示C5a结合性Spiegelmer NOX-D21在趋化性测定中对于人C5a的效能的图示，使细胞朝向利用不同量的Spiegelmer在37℃预温育的0.1nM huC5a迁移；其中a)将细胞计数针对每一个数据组的最大值标准化，并描述为针对Spiegelmer浓度的百分比计数，b)利用Prism5软件，使用非线性回归(4参数拟合)计算趋化性被抑制50％(IC50)时的Spiegelmer浓度；
图13是显示C5a结合性Spiegelmer NOX-D19和NOX-D20在(A)趋化性测定和(B)原代人PMN的弹性蛋白酶释放测定中对于人C5a的效能的图示；其中使细胞朝向利用使用不同量的Spiegelmer在37℃预温育的1nM huC5a迁移，并且利用使用不同量的Spiegelmer在37℃预温育的30nM huC5a刺激弹性蛋白酶释放；
图14是显示使用绵羊红细胞溶血测定，利用Spiegelmer(A)NOX-19和NOX-D20以及(B)NOX-D21进行的C5切割抑制的评价的图示。显示了阳性对照(C5C6)和阴性对照(revNOX-D19和revNOX-D21)；
图15是显示多种微生物脓毒症的盲肠结扎穿孔术(CLP)小鼠模型中的存活的图示；在CLP手术后立即开始每日腹膜内注射指定剂量的NOX-D19或媒介物。接受假手术的动物接受无CLP的手术，随后进行媒介物注射；
图16是显示CLP手术前(第-4天)和CLP手术后1天利用指定剂量的NOX-D19处理的小鼠、媒介物处理的小鼠和接受假手术的动物中的(A)血清肌酸酐水平和(B)血液尿素氮(BUN)水平的图示。血清肌酸酐和BUN是肾功能的生物标志物；
图17是显示CLP手术前(第-4天)和CLP手术后1天利用指定剂量的NOX-D19处理的小鼠、媒介物处理的小鼠和接受假手术的动物中的(A)丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平和(B)天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血清水平的图示。血清ALT是肝细胞损害的生物标志物。血清AST是多器官衰竭的生物标志物；
图18是显示多种微生物脓毒症的盲肠结扎穿孔术(CLP)小鼠模型中的存活的图示；在CLP手术后立即开始每日腹膜内注射指定剂量的NOX-D20或媒介物。其中一组在CLP手术后立即接受单次剂的1mg/kgNOX-D20，随后每日注射媒介物。接受假手术的动物接受无CLP的手术，随后进行媒介物注射。
图19是显示CLP手术后1天利用指定剂量的NOX-D20处理的小鼠、媒介物处理的小鼠和接受假手术的动物中的(A)血清肌酸酐水平、(B)血液尿素氮(BUN)和(C)丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平的图示。血清肌酸酐和BUN是肾功能的生物标志物。血清ALT是肝细胞损害的生物标志物；
图20是显示CLP手术后第1天指定剂量的NOX-D20处理对(A)血清乳酸脱氢酶(LDH)(组织损伤的生物标志物)、(B)血管渗漏和(C)PMN至腹膜的浸润的作用的图示。媒介物处理的小鼠和接受假手术的动物显示为对照；
图21是显示缺血/再灌注损伤诱发的急性肾损伤的模型中的存活的图示；在手术前1h静脉内注射指定剂量的NOX-D21，随后每24h腹膜内注射，进行3天；
图22显示组成根据本发明的核酸分子的2‘脱氧核糖核苷酸；
图23显示组成根据本发明的核酸分子的核糖核苷酸；
实施例1:能够结合人和小鼠C5a的核酸分子
鉴定了数种C5a结合性核酸分子及其衍生物：其核苷酸序列描述于图1至5中。C5a结合性核酸分子被表征为
a)适体，即为D-核酸分子，使用直接拉下测定(实施例3)和/或比较性竞争性拉下测定(实施例3)表征的；
b)Spiegelmer，即L-核酸分子，通过表面等离子体共振测量(实施例4)以及通过利用表达人C5a受体的细胞的体外测定(实施例5)表征的。此外，测试Spiegelmer对原代人嗜中性粒细胞的C5a诱导的活化的抑制(实施例6)和在体内对所述活化的抑制(实施例8、9和10)。如实施例2中所述合成Spiegelmer和适体。
这样产生的核酸分子显示略微不同的序列，其中序列可概述或归类为序列家族。
关于核糖核苷酸序列基序的定义，使用了针对不确定的核苷酸的IUPAC缩写：
S 强 G或C；
W 弱 A或U；
R 嘌呤 G或A；
Y 嘧啶 C或U；
K 酮 G或U；
M 亚胺基 A或C；
B 非A C或U或G；
D 非C A或G或U；
H 非G A或C或U；
V 非U A或C或G；
N 全部 A或G或C或U
如果无相反说明，则任何核酸序列或区段的序列分别以5’→3’方向显示。
为了区分2’-脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸，使用下列缩写：
对于2’-脱氧核糖核苷酸：dG、dC、dT、dA和dU(参见图22)。
对于核糖核苷酸：G、C、T、U(参见图23)。
如图1-5中所描述的，C5a结合性核酸分子包含一个界定潜在的C5a结合性基序的中央核苷酸区段，其中图1显示序列家族的不同序列，图2至5显示核酸分子NOX-D19001的衍生物，包括NOX-D20001(也称为NOX-D19001-6x-DNA-020,图4A)和NOX-D21001(也称为NOX-D19001-2dU-1dC-020,图5)。
一般地，C5a结合性核酸分子在5’-末端和3’-末端包含末端核苷酸区段：第一末端核苷酸区段和第二末端核苷酸区段。第一末端核苷酸区段和第二末端核苷酸区段可彼此杂交，其中在杂交后，形成双链结构。然而，在体内和/或体外，这样的杂交不一定在分子中提供。
C5a结合性核酸分子的3个核苷酸区段-第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段-以5’→3’-方向彼此排列：第一末端核苷酸区段-中央核苷酸区段-第二末端核苷酸区段。然而，或者，第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段以5’→3’-方向彼此排列：第二末端核苷酸区段-中央核苷酸区段-第一末端核苷酸区段。
定义的区段的序列在C5a结合性核酸分子之间可以不同，这影响对C5a的结合亲和力。基于不同的C5a结合性核酸分子的结合分析，下文中描述的中央核苷酸区段及其核苷酸序列单个地和更优选在其整体性上是结合人C5a所必需的。
根据本发明的C5a结合性核酸分子(如图1中所示的)由核糖核苷酸组成并且示于图1至5中。C5a结合性核酸分子274-H6-002在比较性竞争性拉下测定(关于方案参见实施例3)中相对于C5a结合性核酸274-D5-002被测试为适体。C5a结合性核酸分子274-H6-002相较于C5a结合性核酸分子274-D5-002显示更弱的结合亲和力。通过等离子体共振测量测试C5a结合性核酸分子274-B5-002、274-D5-002、274-C8-002、274-C8-002-G14(＝NOX-D19001)、274-C5-002和274-G6-002作为Spiegelmer的结合人和小鼠C5a的能力(参见实施例4，图1)。
C5a结合性核酸分子274-C8-002-G14(＝NOX-D19001)显示最好的对于小鼠C5a(KD为0.3nM)和对于人C5a(KD为1.38nM)的结合亲和力(图1)。
C5a结合性核酸分子274-B5-002、274-D5-002、274-C8-002、274-C8-002-G14(＝NOX-D19001)、274-C5-002、274-G6-002和274-H6-002共有序列
5’AUGUGGUGKUGARGGGHUGUKGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:69],
其中G、A、U、C、H、K和R为核糖核苷酸。
C5a结合性核酸分子274-C8-002,274-C8-002-G14(＝NOX-D19001)和274-C5-002显示最好的对C5a的结合亲和力并且包含下列中央区段的序列：
a)274-C8-002:5’AUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:70],
b)274-C8-002-G14:5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:71],
c)274-C5-002:5’AUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:72]，其中d G、A、U和C为核糖核苷酸。
本发明人令人惊讶地显示C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力通过在中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段的序列内用2′-脱氧核糖核苷酸替代核糖核苷酸得以改善。具体地，在C5a结合性核酸分子NOX-D19001中利用2′-脱氧核糖核苷酸替代达到6个核糖核苷酸导致对人C5a的结合亲和力增加3.5的系数。更详细地，本发明人已令人惊讶地发现
a)在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置4、11、12、25或27上利用一个2′-脱氧核糖核苷酸替代一个核糖核苷酸导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图2；Spiegelmer NOX-D19001-D09、NOX-D19001-D16、NOX-D19001-D17、NOX-D19001-D30、NOX-D19001-D32)；
b)在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用一个2′-脱氧核糖核苷酸替代一个核糖核苷酸导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图2；Spiegelmer NOX-D19001-D40)；
c)在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置4/25、4/27或25/27上利用2个2′-脱氧核糖核苷酸替代2个核糖核苷酸导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对生物素化C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-30、NOX-D19001-D09-32、NOX-D19001-D30-32)；
d)替代两个核糖核苷酸，其中在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸以及在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置4、25或27上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-40、NOX-D19001-D30-40、NOX-D19001-D32-40)；
e)替代3个核糖核苷酸，其中在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸以及在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置4/25、4/27或25/27上利用2个2′-脱氧核糖核苷酸替代2个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-30-40、NOX-D19001-D09-32-40、NOX-D19001-D30-32-40)；
f)通过在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置04/25/27上利用3个2′-脱氧核糖核苷酸替代3个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对生物素化C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-30-32)；
g)替代4个核糖核苷酸，其中在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸以及在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置04/25/27上利用3个2′-脱氧核糖核苷酸替代3个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-30-32-40)；
h)替代5个核糖核苷酸，其中在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸以及在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置04/11/25/27或04/12/25/27上利用4个2′-脱氧核糖核苷酸替代4个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-16-30-32-40、NOX-D19001-D09-17-30-32-40)；
i)替代6个核糖核苷酸，其中在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的第二末端核苷酸区段中的位置1上利用1个2′-脱氧核糖核苷酸替代1个核糖核苷酸以及在C5a结合性核酸分子NOX-D19001的中央核苷酸区段中的位置04/11/12/25/27上利用5个2′-脱氧核糖核苷酸替代5个核糖核苷酸，导致相较于C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力增强的对人C5a的结合亲和力(参见图3；Spiegelmer NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40＝NOX-D19-001-6xDNA)。
基于显示在C5a结合性核酸分子的中央核苷酸区段的数个位置上利用2′-脱氧核糖核苷酸替代核糖核苷酸导致增强的对C5a的结合的数据，所有测试的C5a结合性核酸分子的中央区段可以以下列通式来进行概述：
5’AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:61]，
其中
n1为U或dU，n2为G或dG，n3为A或dA，n4为U或dU，n5为U或dU并且
G、A、U、C、H、K和R为核糖核苷酸，和
dU、dG和dA为2’-脱氧核糖核苷酸。
其中
a)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:62](参见274-B5-002)；或
b)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:63](参见274-D5-002)；或
c)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:64](参见274-C8-002)；或
d)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:65](参见NOX-D19001)；或
e)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:66](参见274-C5-002)；或
f)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:67](参见274-G6-002)；或
g)在优选实施方案中，中央核苷酸区段包含序列5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[SEQ ID NO:68](参见274-H6-002)。
C5a结合性核酸分子NOX-D19001-D09,NOX-D19001-D16,NOX-D19001-D17,NOX-D19001-D30,NOX-D19001-D32,NOX-D19001-D09-30,NOX-D19001-D09-32,NOX-D19001-D09-40,NOX-D19001-D30-32,NOX-D19001-D30-40,NOX-D19001-D32-40,NOX-D19001-D09-30-32,NOX-D19001-D09-30-40,NOX-D19001-D09-32-40,NOX-D19001-D30-32-40,NOX-D19001-D09-30-32-40,NOX-D19001-D09-16-30-32-40,NOX-D19001-D09-17-30-32-40,NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(参见图2和3)显示最好的对C5a的结合亲和力，并且包含下列中央核苷酸区段的序列：
a)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:73](参见NOX-D19001-D09,NOX-D19001-D09-40)；或
b)5’AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:74](参见NOX-D19001-D16)；或
c)5’AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:75](参见NOX-D19001-D17)；或
d)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:76](参见NOX-D19001-D30,NOX-D19001-D30-40)；或
e)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:77](参见NOX-D19001-D32,NOX-D19001-D32-40)；或
f)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:78](参见NOX-D19001-D09-30,NOX-D19001-D09-30-40)；或
g)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:79](参见NOX-D19001-D09-32,NOX-D19001-D09-32-40)；
h)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:80](参见NOX-D19001-D30-32,NOX-D19001-D30-32-40)；或
i)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:81](NOX-D19001-D09-30-32,NOX-D19001-D09-30-32-40)；或
j)5’AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:82](参见NOX-D19001-D09-16-30-32-40)；或
k)AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:83](参见NOX-D19001-D09-17-30-32-40)；或
l)5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[SEQ ID NO:84](参见NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40＝NOX-D19001-6xDNA),
其中G、A、U和C为核糖核苷酸，并且dG、dA和dU为2’-脱氧核糖核苷酸。
C5a结合性核酸分子NOX-D19001的结合亲和力通过用2’-脱氧核糖核苷酸替代1至6个核糖核苷酸得到显著增强，如通过表面等离子体共振测量测定的和对于C5a结合性核酸NOX-D19001-D09和NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(也称为NOX-D19001-6xDNA)示例性显示的(图6):
NOX-D19001:1.38nM的KD,
NOX-D19001-D09:709pM的KD,
NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40:361pM的KD。
NOX-D19001-6xDNA包含具有5个2’-脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸的中央核苷酸区段、具有5个核糖核苷酸的第一末端核苷酸区段和具有4个核糖核苷酸和1个2’-脱氧核糖核苷酸的第二末端核苷酸区段。令人惊讶地，本发明人可显示可在不减小亲和力的情况下将第一和第二核末端核苷酸区段截短至4或3个核苷酸。如本文中所示，可将NOX-D19001-6xDNA的第一和第二末端核苷酸区段从5个核苷酸截短至3个核苷酸(参见NOX-D19001-6xDNA-020也称为NOX-D20001)同时保持亲和力(图4A)。
图4显示核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换和截短的成功组合：NOX-D19001-6xDNA和NOX-D19001-6xDNA-020(也称为NOX-D20001)的母分子NOX-D19001(由核糖核苷酸组成并且第一和第二末端核苷酸区段各自具有5个核苷酸)具有1.38nM的结合亲和力(KD)。在6个核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换(导致NOX-D19001-6xDNA)和至具有3个核苷酸的第一及第二末端核苷酸区段的截短(导致NOX-D19001-6xDNA-020,也称为NOX-D20001)后，对人C5a的结合亲和力以超过4的系数增强(NOX-D20001，KD为0.3nM)。第一或第二核苷酸区段至1个核苷酸的截短导致减小的活性，但这样的分子仍然以低于10nM的KD结合C5a(参见图4A,4B)。
2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的成功置换的另一个实例示于图5中。分子NOX-D19001-020是NOX-D19001的截短衍生物，具有11.3nM(参见图5)而非对于NOX-D19001测定的1.38nM(参见图1和2)的KD。两种分子都包含相同的中央核糖核苷酸区段，但NOX-D19001-020包含仅有3个而非5个核糖核苷酸的第一末端区段和仅有3个而非5个核糖核苷酸的第二末端区段。通过在中央核苷酸区段中用2′-脱氧核糖核苷酸置换2或3个核糖核苷酸以及任选地在第二末端核苷酸区段中用2′-脱氧核糖核苷酸置换一个核糖核苷酸，NOX-D19001-020的结合亲和力可以以超过10的系数增强(参见图5，NOX-D19001-2xDNA-020、NOX-D19001-3xDNA-020、NOX-D19001-2dU-1dC-020也称为NOX-D21001、NOX-D19001-3dU-1dC-020)。
总之，C5a结合性核酸分子的第一和第二末端区段包含1、2、3、4或5个核苷酸(图1至图5)，其中区段任选地彼此杂交，其中在杂交后，形成双链结构。该双链结构可由1至5个碱基对组成。然而，这样的杂交不一定在所述分子中给出。
通过分析所有测试的C5a结合性核酸分子的第一末端核苷酸区段和第二末端核苷酸区段，第一末端核苷酸区段的通式为5’Z1Z2Z3Z4G 3’并且第二末端核苷酸区段的通式为5’Z5Z6Z7Z8Z9 3’，
其中
Z1为G或不存在，Z2为S或不存在，Z3为S或不存在，Z4为B或不存在，Z5为C或dC,Z6为V或不存在，Z7为S或不存在，Z8为S或不存在，Z9为C或不存在，并且
G,S,B,C,V为核糖核苷酸，并且dC为2’-脱氧核糖核苷酸，
其中在第一优选实施方案中
a)Z1为G，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
b)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
c)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
d)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
e)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
f)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
g)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
h)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9为C，或
i)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
j)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
k)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8为S，Z9不存在，或
l)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
m)Z1不存在，Z2为S，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
n)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4不存在，Z5为C，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
o)Z1不存在，Z2不存在，Z3不存在，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7为S，Z8不存在，Z9不存在，或
p)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6为V，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在，或
q)Z1不存在，Z2不存在，Z3为S，Z4为B，Z5为C或dC，Z6不存在，Z7不存在，Z8不存在，Z9不存在；
在第二优选实施方案中
a)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCCUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CAGGC，或
b)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCCUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGGC 3’，或
c)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CCUG 3’或5’CUG 3’或5’UG 3’或5’G 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGGC 3’，或
d)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGC 3’，或
e)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGGC 3’，或
f)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GGCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGCC 3’，或
g)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CUG 3’或5’UG 3’或5’CG 3’或5’G3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAGC 3’，或
h)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAC 3’或5’dCC 3’或5’dCA 3’，或
i)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GUG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCAC 3’，或
j)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’UG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCA 3’，或
k)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
l)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
m)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’G 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCGC 3’，或
n)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCC 3’，或
o)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dC 3’，或
p)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’dCC 3’，或
q)所述第一末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’GCG 3’并且所述第二末端核苷酸区段包含核苷酸序列5’CGC 3’。
为了证明它们的功能性，将C5a结合性核酸分子NOX-D19001、NOX-D20001和NOX-D21001合成为在其5’-末端包含氨基的Spiegelmer。将40kDa PEG-部分偶联于所述氨基修饰Spiegelmer，从而导致C5a结合性Spiegelmer NOX-D19、NOX-D20和NOX-D21。Spiegelmer的合成和PEG化描述于实施例2中。
对于C5a结合性核酸分子的功能性可显示增强的结合亲和力的作用。如通过趋化性测定法(实施例5)测定的，完全由核糖核苷酸组成的C5a结合性核酸分子NOX-D19(IC50＝1.9nM)比NOX-D20(包含6个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的NOX-D19的衍生C5a结合性核酸分子(IC50＝0.28nM))更弱地抑制人C5a的功能(图7)。
NOX-D20显示非常高的结合鼠C5a的亲和力，解离常数KD为19pM，然而对于人C5a，测定出299pM的KD(实施例4，图8)。NOX-D20以275pM的抑制常数IC50抑制人C5a的功能，如通过趋化性测定法测定的(实施例5，图7和12A)。由于化学计量的原因，用于小鼠C5a的趋化性测定的灵敏度限于150pM，由于小鼠C5a的刺激浓度为300pM。因此，对于小鼠C5a，测得NOX-D20的IC50为140pM(实施例5，图12A)。
NOX-D20未显示对来自大鼠或恒河猴的C5a的结合，从而显示了极高的靶特异性(图8)。根据人、小鼠、大鼠和恒河猴C5a的多肽序列比对和测定的特异性，人C5a的残基丝氨酸16和缬氨酸28最可能是C5a上的必需的结合残基(图11)。这些残基在人和鼠C5a中是保守的，但在恒河猴和大鼠C5a中是不同的。
NOX-D21包含NOX-D20的主要亲和力增强位点，并且显示如由Biacore测量显示的对人和小鼠C5a的高亲和力(KD(鼠C5a)＝29pM、KD(人C5a)＝815pM、KD(人C5)＝413pM，参见图11)。NOX-D21以476pM的抑制常数IC50抑制人C5a的功能，如通过趋化性测定法(实施例5,图12B)测定的。
在体内，C5a的截短形式通过C末端精氨酸残基的酶促切割产生，称为des-Arg-C5a(也称为C5adesArg)。des-Arg-C5a的生物学功能还不完全清楚，但有证据表明des-Arg-C5a保留白细胞活化功能。因此，研究了NOX-D20是否也结合des-Arg-C5a。NOX-D20显示剂量依赖性的对固定的重组人des-Arg-C5a的结合(图9)。
所述详细的动力学评价显示人des-Arg-C5a被NOX-20以可与对于全长人C5a的亲和力相当的亲和力结合，解离常数分别为316pM和299pM。NOX-D21分别以28pM和854pM的解离常数结合于小鼠和人des-Arg-C5a(图10)。因此即使在C5a至des-Arg-C5a的切割后，C5a结合性核酸分子例如NOX-20和NOX-D21仍然结合它们的靶。
令人惊讶地，NOX-D20和NOX-D21还显示对从人血浆纯化的C5的结合，亲和力分别为164pM和413pM(图9和10)。该现象是不能被预见的。然而，这似乎是说得过去的，因为C5a为当补体被活化时被C5转化酶或被凝血酶或活化的凝血系统的其它成员切掉的C5的部分。此外，从人血浆纯化的C5在天冬酰胺64上具有天然糖基化结构。糖基化以前未曾存在于用于鉴定NOX-D19、NOX-D20、NOX-D21和根据本发明的其它核酸分子的鼠镜像C5a多肽上。
对C5的结合可因预期的大C5蛋白的低清除率和已公开的350-390nM的血浆浓度而影响药代动力学。对C5的结合还可影响药效学。C5被C5a结合性核酸分子例如NOX-20和NOX-D21结合，从而C5a在其释放和可导致受体信号转导之前已被Spiegelmer阻断。
实施例2:适体和Spiegelmer的合成和衍生
小规模合成
利用ABI 394合成仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，使用2’TBDMSRNA亚磷酰胺化学合成法(Damha和Ogilvie,1993)，通过固相合成产生适体(D-RNA核酸)和Spiegelmer(L-RNA核酸)。以D-和L-构型存在的rA(N-Bz)-、rC(Ac)-,rG(N-ibu)-和rU-亚磷酰胺购自ChemGenes,Wilmington,MA。适体和Spiegelmer通过凝胶电泳纯化。
大规模合成+修饰
利用合成仪(Amersham Biosciences；General ElectricHealthcare,Freiburg)，使用2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学合成法(Damha和Ogilvie,1993)，通过固相合成产生Spiegelmer。L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-和L-rU-亚磷酰胺购自ChemGenes,Wilmington,MA。5’-氨基-改性剂购自American InternationalChemicals Inc.(Framingham,MA,USA)。在L-riboG、L-riboC、L-riboA或L-riboU修饰的CPG孔径(Link Technology,Glasgow,UK)上开始未修饰的或5’-氨基-修饰的spiegelmer的合成。为了偶联(15min/循环)，使用乙腈中的0.3M的苄硫基四氮唑(CMS-Chemicals,Abingdon,UK)和乙腈中的3.5个当量的各0.1M的亚磷酰胺溶液。使用氧化-封端循环。用于寡核苷酸合成的其它标准溶剂和试剂购自Biosolve(Valkenswaard,NL)。将Spiegelmer合成为DMT-ON的形式；在脱保护后，使用Source15RPC介质(Amersham)通过制备型RP-HPLC(Wincott等人,1995)纯化其。利用80％的醋酸(除去5’DMT-基团在RT进行30min)。利用80％醋酸除去5’DMT-基团(在RT进行90)。随后，添加2M NaOAc溶液，使用5K再生纤维素膜(Millipore,Bedford,MA)通过切向流过滤技术对Spiegelmer进行脱盐。
Spiegelmer的PEG化
为了延长Spiegelmer的体内血浆停留时间，将spiegelmer在5’-末端共价地偶联于40kDa聚乙二醇(PEG)部分。
为了进行PEG化(关于用于PEG化的方法的技术细节，参见欧洲专利申请EP 1 306382)，将纯化的5’氨基修饰的Spiegelmer溶解于H2O(2.5ml)、DMF(5ml)和缓冲液A(5ml；通过混合柠檬酸·H2O[7g]、硼酸[3.54g]、磷酸[2.26ml]和1M NaOH[343ml]和添加水至1l的终体积制备的；利用1M HCl将pH调整为pH＝8.4)的混合物中。
利用1 M NaOH将Spiegelmer溶液的pH调整至8.4。随后，在37℃每隔30min添加6份0.25当量的40kDa PEG-NHS酯(Jenkem Technology,Allen,TX,USA)，直到达到75至85％的最大产率。在PEG-NHS酯的添加过程中使用1M NaOH使反应混合物的pH保持在8-8.5。
将反应混合物与4ml尿素溶液(8M)和4ml缓冲液B(H2O中的0.1M的三乙铵醋酸酯)混合并加热至95℃，进行15min。随后使用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C：0.1M的乙腈中的三乙铵醋酸酯)，利用Source15RPC介质(Amersham)通过RP-HPLC纯化PEG化的Spiegelmer。过量的PEG洗脱在5％缓冲液C中，PEG化Spiegelmer洗脱在10-15％缓冲液C中。将具有>95％(如通过HPLC估量的)的纯度的产物级分组合并与40ml3M NaOAc混合。通过切向流过滤(5K再生纤维素膜,Millipore,Bedford MA)对PEG化Spiegelmer进行脱盐。
实施例3:适体对于C5a的结合常数的测定(拉下测定)
直接拉下测定
在于37℃进行的下拉测定形式中，C5a结合性核酸的亲和力被测量为适体(D-RNA核酸)对生物素化小鼠D-C5a(SEQ.ID.89)的结合。利用T4多核苷酸激酶(Invitrogen)，使用[γ-32P]-标记的ATP(Hartmann Analytic,Braunschweig,Germany)对适体进行5’-磷酸盐标记。标记适体的比放射活性为200,000-800,000cpm/pmol。在选择缓冲液(20mM Tris-HClpH7.4；150mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；4U/ml RNA酶抑制剂(RNaseOUT,Invitrogen)；0.1％[w/vol]补充有50μg/ml的牛血清白蛋白(Sigma)和10μg/ml非特异性的Spiegelmer(以阻止结合伴侣被使用的塑料器具或固定基质的表面吸附)的Tween-20)中进行测定。在变性和复性后，将适体以0.2-1nM的浓度与不同量的生物素化小鼠D-C5a一起在37℃于选择缓冲液中温育3-4小时以在低浓度下达到平衡。生物素化小鼠D-C5a的浓度范围被设置为640pM至10μM；总反应体积为80-200μl。将生物素化小鼠D-C5a以及适体与生物素化小鼠D-C5a的复合物固定在5μl NeutrAvidin Agarose Plus颗粒(PierceBiotechnology)上，所述颗粒已用选择缓冲液预平衡。将颗粒在37℃于热混合仪中保持悬浮30min。在除去上清液和进行适当洗涤后在闪烁计数器中定量固定的放射性。将结合的百分比针对生物素化小鼠D-C5a的浓度作图，通过使用软件算法(GraphPad Prism)，假定1:1的化学计量来获得解离常数。
竞争性拉下测定
为了比较不同的D-C5a结合性核酸，进行竞争性分级测定。为此目的，将可获得的最精制的(affine)适体进行放射性标记(参见上文)并用作参照。在变性和复性后，在于4μlNeutrAvidin Agarose Plus颗粒(Pierce Biotechnology)上固定和洗涤后，在无竞争的情况下导致约5-10％的对生物素化小鼠D-C5a的结合的条件下，将所述适体与生物素化小鼠D-C5a在37℃下在选择缓冲液中温育。将过量的变性和复性非标记D-RNA适体变体以9pM至400nM的范围内的浓度与标记的参照适体一起添加至平行结合反应中；总反应体积为160-400μl。在3-4小时温育后，固定生物素化小鼠D-C5a以及适体与生物素化小鼠D-C5a的复合物，如上所述分析测定。待测试的适体与参照适体竞争靶结合，从而取决于它们的结合特征而减少结合信号。随后可将经发现在该测定中为最具有活性的适体用作其它适体变体的比较性分析的新参照。
实施例4:Spiegelmer对C5a和相关肽的结合的Biacore测量
将仪器设置至37℃的持续温度(enduring temperature)。使用DESORB法清洁Biacore 2000仪，随后开始新的芯片的每一个实验/固定。在对接维持芯片后，用解吸溶液1(0.5％十二烷基硫酸钠，SDS)、解吸溶液2(50mM甘氨酸，pH9.5)和HBS-EP缓冲液持续预启动(primed)仪器。最后用HBS-EP缓冲液预启动系统。
对于Biacore实验，在无菌水中制备C5a结合性Spiegelmer，所述Spiegelmer具有100μM的浓度。
利用HBS-EP缓冲液预启动CM5芯片，使其平衡直至观察到稳定的基线。从流动池4开始至流动池1固定流动池。使用快速注射(QUICKINJECT)命令以10μl/min的流速注射100μl的0.4M EDC与0.1M NHS的1:1混合物。通过NHS/EDC注射后RU的增加(对于CM5芯片，通常150-500RU)监控流动池的活化。将10mM NaAc pH5.5中0.1-1μg/ml的C5a或10mM NaAcpH5.5中的人C5的溶液转移至小瓶，使用手工注射(MANUALINJECT)命令以10μl/min的流速注射所述溶液。将1000-3000RU固定在芯片上。随后以10μl/min的流速注射70μl的1M盐酸乙醇胺，pH8，以封闭所有流动池。以30μl/min的流速注射30μl再生溶液(1M NaCl)以从芯片表面除去非特异性结合的蛋白质。
通过一系列以2,000-1,000-500-200-125-62.5-31.3-15.6(2x)-7.8-3.9-1.95-0.98-0.48-0.24-0.12-0nM的浓度(从最低浓度开始，于电泳缓冲液中稀释)进行的Spiegelmer注射来评价动力学参数和解离常数。在所有实验中，使用Kinject命令(确定240秒的缔合时间和240秒的解离时间)在37℃以30μl/min的流速进行分析。测定是双参照的，然而FC1用作(封闭的)表面对照(每一个Spiegelmer浓度的合计贡献(bulkcontribution))，一系列无分析物的缓冲液注射测定缓冲液本身的合计贡献。将至少一个Spiegelmer浓度注射2次以在实验过程中监控再生效率和芯片完整性。通过以30μl/min的流速注射60μl1M NaCl来进行再生。每一个再生循环后基线的稳定时间被设置至以30μl/min进行1min。
利用BIAevaluation 3.1.1软件(BIACORE AB,Uppsala,Sweden)，使用改良Langmuir 1:1化学计量拟合算法，利用常数RI和传质评价(使用1x107[RU/M*s]的传质系数kt)进行数据分析和解离常数(KD)的计算。
实施例5:趋化性测定中抑制浓度的测定
表达C5a的人受体的细胞系的产生
通过用编码人C5a受体的质粒(NCBI登录号NM_001736，在pcDNA3.1+中)转染BA/F3小鼠pro B细胞来产生表达C5a的人受体的稳定转染的细胞系。通过用遗传霉素处理来选择表达C5aR的细胞，利用RT-PCR测试其表达，和利用趋化性测定来测试其功能性。
趋化性测定
在实验前一天，将细胞以0.3x106/ml接种在新的培养瓶中。为了进行实验，将细胞离心，于HBH(HBSS,含有1mg/ml牛血清白蛋白和20mM HEPES)中洗涤1次，以1.33x106个细胞/ml进行重悬浮。将75μl的该悬浮液添加至具有5μm孔的96孔Corning Transwell板(Costar Corning,#3388；NY,USA)的上区室。在添加细胞之前，将重组人C5a(SEQ.ID.50)或小鼠C5a(SEQ.ID.54)与不同浓度的Spiegelmer一起在下区室中于235μl HBH中于37℃预温育20至30min。使细胞在37℃迁移3小时。随后，移除插入板(上区室)，将30μl的磷酸缓冲盐溶液中的440μM的刃天青(Sigma,Deisenhofen,Germany)添加至下区室。在于37℃温育2.5小时后，以544nm的激发波长和590nm的发射波长测量荧光。
将荧光值针对本底荧光(孔中无C5a)进行校正，将荧光值针对Spiegelmer浓度作图。使用GraphPad Prism，利用非线性回归(4参数拟合)测定IC50值。或者，将无Spiegelmer(仅C5a)样品的值设置为100％，将具有Spiegelmer的样品的值计算为该值的百分比。将百分比值针对Spiegelmer浓度作图，如上所述测定IC50-值。
人和小鼠C5a半最大有效浓度(EC50)的测定
在BA/F3/huC5aR细胞向不同的人C5a或小鼠C5a浓度迁移3小时后，获得人和小鼠C5a的剂量反应曲线，显示huC5a的半有效浓度(EC50)为0.1nM，mC5a的为0.3nM。关于Spiegelmer对趋化性的抑制的实验，使用0.1nM人C5a和0.3nM小鼠C5a。
实施例6:C5a诱导的原代人嗜中性粒细胞的活化的抑制
人PMN的分离
通过在室温进行不连续梯度离心从全血分离多形核白细胞(PMN)。将血液收集在含枸橼酸葡萄糖的血液收集管(Sarstedt)中。将葡聚糖500(Accurate Chemical)添加至2％w/v的终浓度，将血液/葡聚糖覆在Histopaque(1.077g/ml,Sigma)上。离心后，弃去梯度界面上方的所有液体和细胞。收集沉淀和上方约80％的剩余液体，用Voluven80％v/v(Fresenius Kabi)、PBS16％v/v(Sigma)和ACD4％v/v(Sigma)的混合物以1:1稀释其。将混合物以400rpm离心15分钟。收集上清液，以1,000rpm离心7分钟。将沉淀轻轻地重悬浮，通过裂解除去剩余的红细胞。
C5a-诱导的人PMN的趋化性的抑制
用指定浓度的HBSS+0.01％BSA+25mM HEPES中的NOX-D19或NOX-D20在趋化性板的下区室中预温育人C5a(1nM)。将人嗜中性粒细胞添加至趋化性板的上区室，在37℃和5％CO2进行趋化作用25min。温育后，将上区室与含Accutase的白色发光板匹配合拢，以收获结合于趋化作用网状物的内侧的细胞。添加Glo试剂(Promega)，平衡10min。使用BiotekSynergy 2板读数器测量发光。
C5a诱导的人PMN的弹性蛋白酶释放的抑制
利用TNFα(10ng/ml)和细胞松弛素B(5μg/ml)在37℃,5％CO2预处理人嗜中性粒细胞，进行30分钟。利用已用指定浓度的NOX-D19或NOX-D20预温育的人C5a(30nM)刺激细胞45min。随后通过离心分离细胞，用弹性蛋白酶底物(Calbiochem)在Tris-HCl0.1M pH7.4中在37℃温育25μl的上清液，进行1h，每5分钟以405nm的吸光度获取读数。分析动力学数据以测定每一个样品的vmax。计算每一个样品的相对于对照的平均百分比弹性蛋白酶活性(本底未被扣除)。
结果
NOX-D19和NOX-D20高效地抑制C5a对新鲜分离的人外周血PMN的活化。10nM NOX-D19或NOX-D20足以阻断超过85％的huC5a诱导的人PMN的趋化作用(图13A)。HuC5a诱导的抗微生物弹性蛋白酶的释放被NOX-D19和NOX-D20高效抑制(图13B)。30nM NOX-D19或NOX-D20抑制约50％的C5a诱导的弹性蛋白酶释放。值得注意地，由于化学计量的原因，该测定的灵敏度限于IC50＝15nM，因为30nM huC5a诱导弹性蛋白酶释放。
实施例7:C5a结合性核酸不干扰补体依赖性溶血作用
补体级联的终产物是膜攻击复合物(MAC)，由C5b-9组成的孔。MAC被认为插入病原体的细胞质膜，通过诱发细胞质渗漏杀死它们。
已显示此处提供的C5a结合性核酸(Spiegelmer)识别C5背景中的C5a(参见实施例1，图9和图10)。因此，研究C5至过敏毒素C5a和C5b(MAC的部分)的切割是否被这些Spiegelmer抑制。这通过使用补体依赖性绵羊红细胞溶血测试来实现。
方法
在96孔板(Nunc-ImmunoTM板,MaxiSorp SurfaceTM)中利用在10nM至10,000nM的范围内的PEG化Spiegelmer NOX-D19、NOX-D20和NOX-D21预温育重建的人冻干血清(‘人补体血清’(Sigma Aldrich,Germany)。作为阳性对照，以相同的浓度范围使用抑制C5切割的具有最大2’OMe嘌呤和2′氟嘧啶置换的C5结合性适体C5C6(Biesecker等人1999)(内部合成的)。作为对测定的潜在非特异性Spiegelmer作用的对照，包括了具有NOX-D19和NOX-D21的反向序列的PEG化Spiegelmer，revNOX-D19和revNOX-D21。早先已显示revNOX-D19和revNOX-D21在Biacore和基于细胞的测定中不抑制C5a。在于37℃温育1小时后，将称为溶血系统的利用兔抗绵羊红细胞抗体调理的绵羊红细胞(Institut Virion/Serion GmbH,Germany)添加至预温育的血清补体抑制剂混合物。补体通过经典途径活化，从而导致C5至C5a和C5b的切割。C5b随后与C6-C9缔合以形成裂解性膜攻击复合物(MAC)。30分钟后，在旋转沉降完整细胞后通过色度测量测定因MAC形成而引起的绵羊红细胞溶血。溶血程度越高，405nm处的吸收就越高(在Fluo Star板读数器中测量的)。
结果
适体C5C6以约1μM的IC50抑制绵羊红细胞的补体依赖性溶解(图14A，B)。测试的Spiegelmer即C5和C5a结合性核酸NOX-D19和NOX-D20(图14A)及NOX-D21(图14B)以及非C5-或C5a-结合性Spiegelmer revNOX-D19(图14A)和revNOX-D21(图14B)不抑制溶血作用。
讨论
已显示测试的C5a结合性Spiegelmer不抑制MAC形成，从而仅为C5a的选择性拮抗剂。如果用作药剂，这可以是有利的，因为MAC形成的抑制可削弱身体针对侵入病原体(主要地革兰阴性细菌)的防御机制。
实施例8:C5a结合性核酸NOX-D19在多种微生物脓毒症的鼠盲肠结扎穿孔术模型 中显示功效
在啮齿类动物盲肠结扎穿孔术(CLP)模型中测试NOX-D19的腹膜内注射对多种微生物脓毒症的过程的作用。
方法
动物模型
将10-12周龄雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories,Germany)用于研究。在光异氟烷麻醉下通过手术诱发腹膜炎。在腹腔的左上象限(盲肠的正常位置)内引入切口。暴露盲肠，用缝线在小肠插入的远端围绕盲肠放置紧密结扎(75％被结扎)。利用24规针在盲肠内产生一个刺伤，少量盲肠内容物通过伤口显露出来。将盲肠放回腹腔内，封闭剖腹术部位。皮下提供500μl盐水作为补液。除盲肠的结扎和穿孔外，接受假手术的动物经历相同的过程。最后，将动物放回它们的笼中，自由地接触食物和水。
研究组
测试4个组(对于假手术，n＝6只小鼠，对于CLP手术，n＝10只小鼠/组)：(1)假手术和媒介物(盐水)处理，(2)CLP手术和媒介物处理，(3)CLP手术和低剂量NOX-D19(1mg/kg)处理和(4)CLP手术和高剂量NOX D19(10mg/kg)处理。研究者对于治疗策略是不知情的，并且不知道哪种化合物包含媒介物或真正的处理。施用途径是始于CLP手术，进行6天的每日腹膜内注射(i.p.)。
存活
每一组中随访为7天。每日监控小鼠，使用GraphPad Prism 4软件产生卡普兰一迈耶存活曲线。
抽血
手术前(基线，第-4天)和手术后第1天，在光醚麻醉下利用毛细管从海绵窦获得血液样品，以允许测量急性肾损伤(血清肌酸酐和血液尿素氮，BUN)和急性肝功能衰竭(血清丙氨酸氨基转移酶，血清ALT)的常规血清标志物。血清中的天冬氨酸氨基转移酶(血清AST)的水平被测量为多器官衰竭的标志物。在Olympus分析仪(AU400)上进行临床化学参数的测量。
统计
通过学生氏T检验计算统计显著性。产生了卡普兰一迈耶存活曲线并就显著性进行时序检验。使用GraphPad Prism 4软件。
结果
存活
如所预期的，在经历无CLP的假手术的动物中未发生死亡(图15)。在接受CLP手术和仅用媒介物处理的小鼠中，存活中值为1.5天。CLP手术后NOX-D19的处理改善了存活中值(图15)。利用低剂量NOX-D19(1mg/kg)处理的小鼠显示最长存活中值(5天，相对媒介物p<0.0001)。利用高剂量NOX-D19(10mg/kg)处理的小鼠具有3在的存活中值，这显著长于媒介物处理的小鼠(p＝0.0401)但与低剂量NOX-D19处理并无显著不同(p＝0.4875)。100％的媒介物小鼠在CLP手术后4天内死亡。在分别用低剂量和高剂量NOX-D19处理的小鼠中七天内不会发生100％和90％的死亡率(图15)。
临床化学
肾功能
血清肌酸酐和血液尿素氮(BUN)浓度是肾功能的参数。在研究开始前(第-4天)和CLP手术后第1天评估肾功能。
在第1天，CLP在媒介物处理的小鼠中诱发血清肌酸酐水平的显著升高。低剂量NOX-D19处理(1mg/kg)阻止该升高(图16A)。在利用高剂量NOX-D19(10mg/kg)处理的小鼠中，观察到血清肌酸酐水平的中等但统计上不显著的升高(相对媒介物p＝0.1873)(图16A)。
在媒介物处理的小鼠中，作为比肌酸酐更灵敏的肾功能的参数的BUN(图16B)在CLP手术后第1天显著升高。利用低剂量和高剂量NOX-D19对小鼠的处理显著抑制CLP后BUN的增加(图16B)。
肝功能
肝细胞损伤或坏死亡的最可靠标志物是血清丙氨酸氨基转移酶(血清ALT)。所有组在CLP手术后第1天显示血清ALT的增加。然而，两个NOX-D19处理的脓毒性小鼠的组都显示相较于媒介物处理的小鼠改善的肝功能(图17A)。
多器官衰竭
天冬氨酸氨基转移酶的血清水平(血清AST)(图17B)被测量为多器官衰竭的标志物，因为已显示AST在影响除肝以外的其它器官的疾病(例如心肌梗塞、急性胰腺炎、急性溶血性贫血、重度烧伤、急性肾病、肌骨骼疾病和创伤)中升高。
与ALT类似，所有组在CLP手术后第1天显示AST水平的升高(相对假手术p<0.001)。然而，与肝功能类似，两个NOX-D19处理的脓毒性小鼠的组都显示相较于媒介物处理的小鼠不太显著的AST水平(图17B)。
实施例9:改良C5a-结合性核酸NOX-D20在多种微生物脓毒症的鼠盲肠结扎穿孔术 模型中显示功效
在啮齿类动物盲肠结扎穿孔术(CLP)模型中测试NOX-D20的腹膜内注射对多种微生物脓毒症的过程的作用。
方法
动物模型
如实施例8中所述，通过60-75％的被结扎的盲肠在10-12周龄雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories,Germany)中诱发多种微生物脓毒症。
存活
每一个组随访7天。每日监控小鼠，使用GraphPad Prism 4软件产生卡普兰一迈耶存活曲线。
研究组
测试5个组(对于假手术，n＝5只小鼠，对于CLP手术，n＝10只小鼠/组)：(1)假手术和媒介物(盐水)处理，(2)CLP手术和媒介物处理，(3)CLP手术和每日低剂量NOX-D20(1mg/kg)处理，(4)CLP手术和每日高剂量NOX-D20(3mg/kg)处理以及(5)CLP手术和手术后单次低剂量NOX-D20(1mg/kg)，随后每日媒介物处理。研究者对于处理策略是不知情的，并且不知道哪种化合物包含媒介物或真正的处理。施用途径是腹膜内注射。
临床化学和炎症参数
如实施例8中所述，在手术后第1天在光醚麻醉下利用毛细管从海绵窦获得血液样品。测量急性肾损伤(血清肌酸酐和血液尿素氮，BUN)、急性肝功能衰竭(血清ALT)和内皮损伤(血清乳酸脱氢酶酶，血清LDH)的常规血清标志物。使用3ml PBS进行腹腔灌洗(PL)。测量每一个样品的收集的PL的体积，使用血细胞计数器(Neubauer Zaehlkammer,Gehrden,Germany)评估总的细胞计数。通过基于珠粒的流式细胞术测定(CBA试剂盒，BDBiosciences,Heidelberg,Germany)定量肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和CCL2(＝巨噬细胞化学吸引剂蛋白-1，MCP-1)的血清和PL水平。通过ELISA(R&D Systems,Wiesbaden,Germany)测定CXCL1(＝角质形成细胞化学吸引剂，KC)和CXCL2(＝巨噬细胞炎性蛋白2，MIP-2)的血清和PL浓度。在苏木精和伊红(H&E)染色的细胞离心涂片器(细胞离心涂片器4，Thermo Scientific)上进行PL中的分化细胞计数。
毛细血管渗漏
在CLP手术后立即静脉内注射0.25％w/v伊文斯蓝(200μl)。18小时后，处死小鼠，如上所述进行PL。在620nm利用分光光度计测量血清和PL液中的伊文思蓝染料的浓度。下列公式用于就血红素污染修正光密度：E620(修正的)＝E620(原始)-(E405(原始)x0.014)。血浆渗出被定量为PL液中的衰减对血浆中的衰减的比率。
统计
通过单因素ANOVA和Dunnetts检验计算统计显著性。关于存活，就显著性进行时序检验(long rank test)。使用GraphPad Prism 4软件。
结果
存活
如所预期的，在手术后7天内进行假手术的小鼠中未发生死亡(图18)。在媒介物处理的CLP小鼠中，存活中值为3天。利用1mg/kg NOX-D20对小鼠的每日处理显著地将存活中值延长至7天(相对媒介物p＝0.0043)。至3mg/kg NOX-D20的剂量的增加不具有额外的保护作用，具有6.5天的相似存活中值(相对媒介物p＝0.0092)。值得注意地，CLP手术后1mg/kgNOX-D20的单次注射与每日处理同样有效，显著地将存活中值延长至6.5天(图18)。虽然100％的媒介物处理的小鼠在5天内死亡，但30-40％的NOX-D20处理的小鼠在第7天实验结束时仍然活着(图18)。
器官功能
全身性炎症通常引发多器官衰竭。肌酸酐和BUN的升高的血清水平是减小的肾小球滤过率和肾功能衰竭的参数。CLP手术后1天，媒介物处理的小鼠的两个参数相较于接受假手术的小鼠显著增加。NOX-D20处理高效地阻止了两个标志物的增加，暗示着NOX-D20对肾功能的保护作用(图19A，B)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)是肝细胞损伤和坏死的常用标志物，CLP诱发的脓毒症与升高的ALT血清水平相关。NOX-D20处理的小鼠显示相较于媒介物处理的小鼠显著降低的血清ALT水平，这表明改善的肝功能(图19C)。升高的乳酸脱氢酶(LDH)的血清水平在组织损伤后发生，从而是器官衰竭的一般性标志物。由CLP激发的LDH水平的升高被NOX-D20有效阻断(图20A)。内皮屏障的崩解和水肿形成是脓毒症中的常见致命事件。脓毒症诱发在媒介物处理的小鼠中导致相较于进行假手术的小鼠的至腹腔内的相对血浆蛋白外渗的2倍的增加。NOX-D20处理显著抑制毛细血管渗漏(图20B)。对于所有此处测试的参数，1mg/kg NOX-D20足以显著改善器官功能，这反映在NOX-D20处理的小鼠的改善的存活期上。
炎症
CLP导致促炎细胞因子和趋化因子的强烈的局部和全身性上调。NOX-D20对C5a的阻断在CLP后第1天高效地降低了腹膜和血清中的TNFα、IL-6、CCL2、CXCL1和CXCL2的浓度。这些趋化因子的上调与多形核白细胞(PMN)至腹膜的招募相关。因此，NOX-D20对C5a的抑制抑制了PMN在腹腔中的积累(图20C)。类似地，单核细胞的浸润被NOX-D20阻断。
实施例10:NOX-D21在缺血再灌注诱发的急性肾损伤的模型中的功效
在肾缺血/再灌注损伤(IRI)的啮齿类动物模型中测试NOX-D21对急性肾损伤(AKI)的作用。
方法
动物模型
使用异氟烷通过鼻罩麻醉12-15周龄雄性C57BL/6小鼠(Charles River,Germany)，使小鼠仰卧在加热台上以将体温维持在约32℃。进行正中切口，用微动脉瘤夹夹住右和左肾蒂，进行30min。在除去夹子和缝合皮肤后，让小鼠返回笼中，并进行监控直至完全苏醒。
研究组
测试3个组(n＝10只小鼠/组)：(1)IRI手术和媒介物处理，(2)IRI手术和低剂量NOX-D21(1mg/kg)处理，(3)IRI手术和高剂量NOX-D21(10mg/kg)处理。研究者对于处理策略是不知情的，并且不知道哪种化合物包含媒介物或真正的处理。在第0天在手术前1小时静脉内注射NOX-D21，并且在随后3天(d1-d3)中每天腹膜内注射NOX-D21一次。
存活
每日监控小鼠，进行14天。产生卡普兰一迈耶存活曲线，使用GraphPad Prism 4软件通过时序检验测定显著性。
结果
利用高剂量NOX-D21的处理显著改善存活(图21)。低剂量NOX-D21处理导致明显的但在统计上仍然不显著的存活的改善。在利用媒介物处理的对照组中，仅1只小鼠存活至第14天。NOX-D21处理将存活小鼠的百分比增加至45-55％(图21)。
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说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特性可分开地和以其任意组合地用作以其各种形式实现本发明的材料。

Claims (27)

1.一种能够结合人C5a和小鼠C5a的L-核酸分子，其中所述核酸分子由选自SEQ ID NO：1～6、8～49、55～60和90～92的核苷酸序列及任选地修饰基团构成。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子的核苷酸或形成所述核酸分子的核苷酸为L-核苷酸。
3.权利要求1至2的任一项的核酸分子，其中所述核酸分子为通过人和/或小鼠C5a介导的活性的拮抗剂。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含修饰基团，其中包含修饰基团的核酸分子从生物体的排泄率相较于不包含修饰基团的核酸分子减小。
5.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含修饰基团，其中包含修饰基团的核酸分子相较于不包含修饰基团的核酸分子在生物体中具有增加的停留时间。
6.权利要求4和5的任一项的核酸分子，其中所述修饰基团选自生物可降解的和非生物可降解的修饰。
7.权利要求4和5的任一项的核酸分子，其中所述修饰基团选自：线性聚乙二醇、分枝聚乙二醇、羟乙基淀粉、固醇、聚氧丙烯、聚氧酰胺和聚(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺。
8.权利要求7的核酸分子，
其中所述修饰基团为聚乙二醇，
其中聚乙二醇的分子量为20,000至120,000Da。
9.权利要求8的核酸分子，其中聚乙二醇的分子量为30,000至80,000Da。
10.权利要求8的核酸分子，其中聚乙二醇的分子量为40,000Da。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述核酸分子是SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91或SEQID NO:92的核酸分子。
12.权利要求7的核酸分子，其中所述修饰基团为羟乙基淀粉，其中羟乙基淀粉的分子量为50至1000kDa。
13.权利要求12的核酸分子，其中羟乙基淀粉的分子量为100至700kDa。
14.权利要求12的核酸分子，其中羟乙基淀粉的分子量为200至500kDa。
15.权利要求1的核酸分子，其中所述修饰基团通过接头偶联于核酸分子。
16.权利要求1的核酸分子，其中所述修饰基团偶联于核酸分子的5’-末端核苷酸和/或核酸分子的3’-末端核苷酸。
17.权利要求4至5的任一项的核酸分子，其中所述生物体是动物体或人体。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1至17的任一项中定义的核酸分子和任选地其它组分，其中所述其它组分选自药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体和药物活性剂。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1至17的任一项中定义的核酸分子和药学上可接受的载体。
20.权利要求1至17的任一项的核酸分子用于制造药剂的用途，其中所述药剂用于拮抗C5a。
21.权利要求1至17的任一项的核酸分子用于制造药剂的用途，其中所述药剂用于治疗与C5a相关或由C5a导致的疾病。
22.权利要求21的用途，其中所述药剂用于治疗全身性炎性反应综合征。
23.权利要求22的用途，其中所述全身性炎性反应综合征选自脓毒症和外伤或重度烧伤的继发性损伤。
24.权利要求21的用途，其中所述药剂用于治疗神经退行性疾病。
25.一种复合物，其包含权利要求1至17的任一项的核酸分子和C5a。
26.权利要求1至17的任一项的核酸分子用于制造检测C5a的试剂盒的用途。
27.一种用于检测C5a的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1至17的任一项的核酸分子，以及至少说明书或反应容器。
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