JP6415327B2 - 新規なc5a結合性核酸 - Google Patents
新規なc5a結合性核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6415327B2 JP6415327B2 JP2014551570A JP2014551570A JP6415327B2 JP 6415327 B2 JP6415327 B2 JP 6415327B2 JP 2014551570 A JP2014551570 A JP 2014551570A JP 2014551570 A JP2014551570 A JP 2014551570A JP 6415327 B2 JP6415327 B2 JP 6415327B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- nox
- seq
- nucleotides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Description
・ Macaca mulatta(アカゲザル) 85%
・ Macaca fascicularis(カニクイザル) 85%
・ Bos taurus(ウシ) 69%
・ Sus scrofa(ブタ) 68%
・ Mus musculus(マウス) 64%
・ Rattus norvegicus(ラット) 61%
5’AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号61]のヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、U、C、H、KおよびRは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
a)5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号62]、
b)5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号63]、
c)5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号64]、
d)5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号65]、
e)5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号66]、
f)5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号67]、および
g)5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号68]
の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号65]のヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
a)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号73]、
b)5’AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号74]、
c)5’AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号75]、
d)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[配列番号76]、
e)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[配列番号77]、
f)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[配列番号78]、
g)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[配列番号79]、
h)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号80]、
i)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号81]、
j)5’AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号82]、
k)5’AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号83]、
l)5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号84]
の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記中心ストレッチのヌクレオチドが、
5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[配列番号78]または
5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号84]
である。
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号66]のヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号67]のヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号64]のヌクレオチド配列を含み、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつ
dU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドは、1〜5個のヌクレオチドを含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドは、1〜5個のヌクレオチドを含み、
好ましくは、
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドは、3〜5個のヌクレオチドを含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドは、3〜5個のヌクレオチドを含み、
より好ましくは、
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドは、3個のヌクレオチドを含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドは、3個のヌクレオチドを含む。
Z1は、Gまたは不在であり、Z2は、Sまたは不在であり、Z3は、Sまたは不在であり、Z4は、Bまたは不在であり、Z5は、CまたはdCであり、Z6は、Vまたは不在であり、Z7は、Sまたは不在であり、Z8は、Sまたは不在であり、Z9は、Cまたは不在であり、かつ
G、S、B、C、Vは、リボヌクレオチドであり、かつ
dCは、2’−デオキシリボヌクレオチドであり、
好ましくは、
a)Z1は、Gであり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
b)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
c)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
d)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
e)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
f)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
g)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
h)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
i)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
j)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
k)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
l)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
m)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
n)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、Cであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
o)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
p)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
q)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、不在であり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在である。
C、A、GおよびUは、リボヌクレオチドであり、かつ
dCは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CCUG3’または5’CUG3’または5’UG3’または5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGGC3’のヌクレオチド配列を含み、
C、A、GおよびUは、リボヌクレオチドであり、かつ
dCは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
a)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
b)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
c)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GGCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGCC3’のヌクレオチド配列を含み、
C、A、GおよびUは、リボヌクレオチドであり、かつ
dCは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GGCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGCC3’のヌクレオチド配列を含む。
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CUG3’または5’UG3’または5’CG3’または5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGC3’のヌクレオチド配列を含み、
C、A、GおよびUが、リボヌクレオチドであり、かつ
dCが、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAC3’または5’dCC3’または5’dCA3’のヌクレオチド配列を含み、
C、A、GおよびUが、リボヌクレオチドであり、かつ
dCが、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
a)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
b)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’UG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCA3’のヌクレオチド配列を含むか、または
c)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
d)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
e)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
f)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
g)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
h)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
i)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CGC3’のヌクレオチド配列を含み、
C、A、GおよびUは、リボヌクレオチドであり、かつ
dCは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含む。
− C5aにより媒介される活性の候補アンタゴニストを準備するステップと、
− 第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による核酸分子を準備するステップと、
− C5aにより媒介される活性のアンタゴニストの存在下でシグナルを発生する試験系を準備するステップと、
− C5aにより媒介される活性の候補アンタゴニストが、C5aにより媒介される活性のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含む。
a)捕捉プローブおよび検出プローブを準備するステップであって、前記捕捉プローブは、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による核酸分子の第1の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブは、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による核酸分子の第2の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すか、あるいは、前記捕捉プローブは、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による核酸分子の第2の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブは、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による核酸分子の第1の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すステップと、
b)前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを別々にまたは組み合わせて、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による前記核酸分子を含有する試料または第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による前記核酸分子を含有すると推定される試料に添加するステップと、
c)前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを、第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による前記核酸分子またはその部分と同時にまたは任意の順番で順次に反応させるステップと、
d)任意選択的に、前記捕捉プローブがステップa)で準備された第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による前記核酸分子とハイブリダイズするか否かを検出するステップと、
e)第1の態様の第1の、第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第11の、第12の、第13の、第14の、第15の、第16の、第17の、第18の、第19の、第20の、第21の、第22の、第23の、第24の、第25の、第26の、第27の、第28の、第29の、第30の、第31の、第32の、第33の、第34の、第35の、第36の、第37の、および第38の実施形態による、ならびに第2の態様の第1の実施形態による前記核酸分子ならびに前記捕捉プローブおよび前記検出プローブからなる、ステップc)で形成された複合体を検出するステップと
を含む。
dGは、2’デオキシ−グアノシン−5’−モノホスフェートであり、
dCは、2’デオキシ−シチジン−5’−モノホスフェートであり、
dAは、2’デオキシ−アデノシン−5’−モノホスフェートであり、
dUは、2’デオキシ−ウリジン5’−モノホスフェートである。
Gは、グアノシン−5’−モノホスフェートであり、
Cは、シチジン5’−モノホスフェートであり、
Aは、アデノシン−5’−モノホスフェートであり、
Uは、ウリジン−5’−モノホスフェートである。
S 強 GまたはC、
W 弱 AまたはU、
R プリン GまたはA、
Y ピリミジン CまたはU、
K ケト GまたはU、
M イミノ AまたはC、
B Aでない CまたはUまたはG、
D Cでない AまたはGまたはU、
H Gでない AまたはCまたはU、
V Uでない AまたはCまたはG、
N 全て AまたはGまたはCまたはU。
1.1. アレルギー、敗血症性ショック、外傷の二次的損傷、温式および冷式の自己免疫性溶血性貧血(略語:AIHA)、全身性炎症反応症候群(略語:SIRS)、出血性ショック、糖尿病1型、糖尿病2型、糖尿病所見、びまん性強皮症、歯周炎およびそれに関連する骨喪失、多発性軟骨炎、多腺性自己免疫性症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(略語:SLE)およびその所見、反応性の関節炎(ライター症候群としても知られている)が含まれる、全身性の自己免疫性および/または炎症性の疾患
12.1 細菌感染、好ましくは、髄膜炎、ライム病、反応性の関節炎(ライター症候群としても知られている)、尿路および腎臓の感染、敗血症、および臓器不全、心機能不全、全身性低灌流、アシドーシス、成人呼吸促迫症候群等のその合併症、細胞内病原体による感染(Klosら、2009)、
12.2 ウイルス感染、好ましくは、HIV、HBV、HCV、CMV、ウイルス性髄膜炎、
12.3 細胞内寄生生物、好ましくは、リーシュマニア、リケッチア、クラミジア、コクシエラ、マラリア原虫、とりわけ脳性マラリア、ブルセラ、マイコバクテリア、リステリア、トキソプラズマおよびトリパノソーマ。
脳および脊髄の手術、再建手術ならびに血管クランプ手術;血管漏出および/または肺気腫等の人工呼吸器により誘発される肺損傷または二次的損傷を避けるための、人工呼吸または人工呼吸補助による任意の治療の間移植された臓器もしくは移植しようとする臓器の臓器損傷の予防のため、または肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管および膵臓等の移植された臓器についての移植片拒絶および再灌流傷害の治療における使用のためが含まれる。
(a)C5aの存在について試験しようとする試料を提供するステップと、
(b)本発明による核酸を提供するステップと、
(c)試料を核酸と、好ましくは反応槽中で反応させるステップと
を含み、
ステップ(a)をステップ(b)の前に実施してもよく、または(b)をステップ(a)の前に実施してもよい。
検出標識がビオチンであり、第2の検出手段がビオチンに対して作られた抗体であるか、または
検出標識がビオチンであり、第2の検出手段がアビジンもしくはアビジン担持分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第2の検出手段がストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン担持分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第2の検出手段がニュートラアビジンもしくはニュートラアビジン担持分子であるか、または
検出標識がブロモ−デオキシウリジンであり、第2の検出手段がブロモ−デオキシウリジンに対して作られた抗体であるか、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、第2の検出手段がジゴキシゲニンに対して作られた抗体であるか、または
検出標識がキレート剤であり、第2の検出手段が放射性核種であり、前記検出標識が核酸につながっていることが好ましい。また、この種類の組合せは、核酸が表面につながっている実施形態にも適用可能であることを認識されたい。そのような実施形態では、検出標識が相互作用のパートナーにつながっていることが好ましい。
いくつかのC5a結合性核酸分子およびそれらの誘導体を同定し、それらのヌクレオチド配列を図1〜図5に示す。C5a結合性核酸分子を、
a)直接的なプルダウンアッセイ(実施例3)および/または比較競合的なプルダウンアッセイ(comparative competition pull−down assay)を使用して、アプタマー、すなわちD−核酸分子として、
b)表面プラズモン共鳴測定により(実施例4)、およびヒトC5a受容体を発現する細胞によるin vitroアッセイにより(実施例5)、スピーゲルマー、すなわちL−核酸分子として特徴付けた。さらに、スピーゲルマーを、C5aにより誘発される初代ヒト好中球の活性化の阻害に関して(実施例6)およびin vivoで(実施例8、9および10)で試験した。スピーゲルマーおよびアプタマーを実施例2に記載するように合成した。
S 強い GまたはC;
W 弱い AまたはU;
R プリン GまたはA;
Y ピリミジン CまたはU;
K ケト GまたはU;
M イミノ AまたはC;
B Aでない CまたはUまたはG;
D Cでない AまたはGまたはU;
H Gでない AまたはCまたはU;
V Uでない AまたはCまたはG;
N 全て AまたはGまたはCまたはU
2’−デオキシリボヌクレオチドに関して:dG、dC、dTdAおよびdU(図22を参照されたい)。
リボヌクレオチドに関して:G、C、T、U(図23を参照されたい)。
5’AUGUGGUGKUGARGGGHUGUKGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号69]を共有し、
G、A、U、C、H、KおよびRは、リボヌクレオチドである。
a)274−C8−002:5’AUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号70]、
b)274−C8−002−G14:5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号71]、
c)274−C5−002:5’AUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号72]を含み、
dG、A、UおよびCは、リボヌクレオチドである。
a)C5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチド中の4、11、12、25または27位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたらされた(図2を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09、NOX−D19001−D16、NOX−D19001−D17、NOX−D19001−D30、NOX−D19001−D32);
b)C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたらされた(図2を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D40);
c)C5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチド中の4/25、4/27または25/27位において2個の2’−デオキシリボヌクレオチドで2個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してビオチン化C5aに対する結合親和性の向上がもたらされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−30、NOX−D19001−D09−32、NOX−D19001−D30−32);
d)2個のリボヌクレオチドを置換することであって、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、およびC5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチドの4、25または27位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−40、NOX−D19001−D30−40、NOX−D19001−D32−40);
e)3個のリボヌクレオチドを置換することであって、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、およびC5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチドの4/25、4/27、25/27位において2個の2’−デオキシリボヌクレオチドで2個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−30−40、NOX−D19001−D09−32−40、NOX−D19001−D30−32−40);
f)C5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチド中の04/25/27位において3個の2’−デオキシリボヌクレオチドで3個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してビオチン化C5aに対する結合親和性の向上がもたらされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−30−32);
g)4個のリボヌクレオチドを置換することであって、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、およびC5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチドの04/25/27位において3個の2’−デオキシリボヌクレオチドで3個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−30−32−40);
h)5個のリボヌクレオチドを置換することであって、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、およびC5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチドの04/11/25/27または04/12/25/27位において4個の2’−デオキシリボヌクレオチドで4個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−16−30−32−40、NOX−D19001−D09−17−30−32−40);
i)6個のリボヌクレオチドを置換することであって、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の第2の末端ストレッチのヌクレオチド中の1位において1個の2’−デオキシリボヌクレオチドで1個のリボヌクレオチドを置換することにより、およびC5a結合性核酸分子NOX−D19001の中心ストレッチのヌクレオチドの04/11/12/25/27位において5個の2’−デオキシリボヌクレオチドで5個のリボヌクレオチドを置換することにより、C5a結合性核酸分子NOX−D19001の結合親和性と比較してヒトC5aに対する結合親和性の向上がもたされた(図3を参照されたい;スピーゲルマーNOX−D19001−D09−16−17−30−32−40=NOX−D19−001−6xDNA)。
5’AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号61]に要約することができ、
n1は、UまたはdUであり、n2は、GまたはdGであり、n3は、AまたはdAであり、n4は、UまたはdUであり、n5は、UまたはdUであり、かつ
G、A、U、C、H、K
およびRは、リボヌクレオチドであり、かつdU、dGおよびdAは、2’−デオキシリボヌクレオチドであり、
a)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’[配列番号62](274−B5−002を参照されたい);
の配列を含み、または
b)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号63](274−D5−002を参照されたい)
の配列を含み、または
c)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号64](274−C8−002を参照されたい)
の配列を含み、または
d)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号65](NOX−D19001を参照されたい)
の配列を含み、または
e)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号66](274−C5−002を参照されたい)
の配列を含み、または
f)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号67](274−G6−002を参照されたい)
の配列を含み、または
g)好ましい実施形態では、中心ストレッチのヌクレオチドは、
5’AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA3’[配列番号68](274−H6−002を参照されたい)
の配列を含む。
a)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号73](NOX−D19001−D09、NOX−D19001−D09−40を参照されたい);または
b)5’AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号74](NOX−D19001−D16参照);または
c)5’AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3’[配列番号75](NOX−D19001−D17参照);または
d)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[配列番号76](NOX−D19001−D30、NOX−D19001−D30−40を参照されたい);または
e)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[配列番号77](NOX−D19001−D32、NOX−D19001−D32−40を参照されたい);または
f)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3’[配列番号78](NOX−D19001−D09−30、NOX−D19001−D09−30−40を参照されたい);または
g)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3’[配列番号79](NOX−D19001−D09−32、NOX−D19001−D09−32−40を参照されたい);
h)5’AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号80](NOX−D19001−D30−32、NOX−D19001−D30−32−40を参照されたい);または
i)5’AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号81](NOX−D19001−D09−30−32、NOX−D19001−D09−30−32−40);または
j)5’AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号82](NOX−D19001−D09−16−30−32−40を参照されたい);または
k)AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号83](NOX−D19001−D09−17−30−32−40を参照されたい);または
l)5’AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3’[配列番号84](NOX−D19001−D09−16−17−30−32−40=NOX−D19001−6xDNAを参照されたい)、
G、A、UおよびCは、リボヌクレオチドであり、かつdG、dAおよびdUは、2’−デオキシリボヌクレオチドである。
NOX−D19001:1.38nMのKD、
NOX−D19001−D09:709pMのKD、
NOX−D19001−D09−16−17−30−32−40:361pMのKD。
Z1は、Gまたは不在であり、Z2は、Sまたは不在であり、Z3は、Sまたは不在であり、Z4は、Bまたは不在であり、Z5は、CまたはdCであり、Z6は、Vまたは不在であり、Z7は、Sまたは不在であり、Z8は、Sまたは不在であり、Z9は、Cまたは不在であり、かつ
G、S、B、C、Vは、リボヌクレオチドであり、かつdCは2’−デオキシリボヌクレオチドであり、
第1の好ましい実施形態では、
a)Z1は、Gであり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
b)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
c)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
d)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
e)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
f)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
g)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
h)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、Cであるか、または
i)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
j)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
k)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、Sであり、Z9は、不在であるか、または
l)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
m)Z1は、不在であり、Z2は、Sであり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
n)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、不在であり、Z5は、Cであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
o)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、不在であり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、Sであり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
p)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、Vであり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であるか、または
q)Z1は、不在であり、Z2は、不在であり、Z3は、Sであり、Z4は、Bであり、Z5は、CもしくはdCであり、Z6は、不在であり、Z7は、不在であり、Z8は、不在であり、Z9は、不在であり、
第2の好ましい実施形態では、
a)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CAGGC’のヌクレオチド配列を含むか、または
b)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
c)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CCUG3’もしくは5’CUG3’もしくは5’UG3’もしくは5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
d)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
e)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
f)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GGCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGCC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
g)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CUG3’もしくは5’UG3’もしくは5’CG3’もしくは5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
h)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAC3’もしくは5’dCC3’もしくは5’dCA3’のヌクレオチド配列を含むか、または
i)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GUG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCAC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
j)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’UG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCA3’のヌクレオチド配列を含むか、または
k)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
l)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
m)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’G3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCGC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
n)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
o)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
p)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’dCC3’のヌクレオチド配列を含むか、または
q)前記第1の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’GCG3’のヌクレオチド配列を含み、かつ
前記第2の末端ストレッチのヌクレオチドが、5’CGC3’のヌクレオチド配列を含む。
小規模な合成
アプタマー(D−RNA核酸)およびスピーゲルマー(L−RNA核酸)を、ABI394合成機(Applied Biosystems、Foster City、CA、米国)を用いて、2’TBDMS RNAホスホラミダイト化学(DamhaおよびOgilvie、1993)を使用する固相合成によって生成した。D−およびL−立体配置のrA(N−Bz)−、rC(Ac)−、rG(N−ibu)−およびrU−ホスホラミダイトをChemGenes、Wilmington、MAから購入した。アプタマーおよびスピーゲルマーを、ゲル電気泳動によって精製した。
スピーゲルマーを、AktaPilot100合成機(Amersham Biosciences;General Electric Healthcare、Freiburg)を用いて、2’TBDMS RNAホスホラミダイト化学(DamhaおよびOgilvie、1993)を使用する固相合成によって生成した。L−rA(N−Bz)−、L−rC(Ac)−、L−rG(N−ibu)−およびL−rU−ホスホラミダイトを、ChemGenes、Wilmington、MAから購入した。5’−アミノ改変体を、American International Chemicals Inc.(Framingham、MA、米国)から購入した。未改変または5’−アミノ改変のスピーゲルマーの合成を、L−riboG、L−riboC、L−riboAまたはL−riboU改変CPGポアサイズ1000Å(Link Technology、Glasgow、英国)上で開始した。カップリング(1サイクル当たり15分)のために、アセトニトリル中の0.3Mベンジルチオテトラゾール(CMS−Chemicals、Abingdon、英国)、およびアセトニトリル中の3.5当量のそれぞれの0.1Mホスホラミダイト溶液を使用した。酸化−キャッピングのサイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準的な溶媒および試薬は、Biosolve(Valkenswaard、オランダ)から購入した。スピーゲルマーをDMT−ONで合成した。脱保護の後、スピーゲルマーを調製用RP−HPLC(Wincottら、1995)によって、Source15RPC媒体(Amersham)を使用して精製した。5’DMT基を、80%酢酸を用いて除去した(室温にて30分)。それに続いて、2M NaOAc水溶液を添加し、スピーゲルマーを、接線フローろ過によって、5K再生セルロースメンブラン(Millipore、Bedford、MA)を使用して脱塩した。
in vivoにおけるスピーゲルマーの血漿滞留時間を延長させるために、スピーゲルマーを、5’末端において40kDaのポリエチレングリコール(PEG)部分に共有結合によって結合させた。
PEG化するために(PEG化のための方法の技術的な詳細については、欧州特許出願第EP1 306 382号を参照されたい)、精製した5’−アミノ改変スピーゲルマーを、H2O(2.5ml)、DMF(5ml)および緩衝液A(5ml;クエン酸H2O[7g]、ホウ酸[3.54g]、リン酸[2.26ml]および1M NaOH[343ml]を混合し、水を添加して1lの最終容積となすことによって調製し;1M HClを用いてpH=8.4に加減した)の混合液中に溶解させた。
直接的なプルダウンアッセイ
C5a結合性核酸の親和性を、ビオチン化マウスD−C5a(配列番号89)に対するアプタマー(D−RNA核酸)の結合として、プルダウンアッセイのフォーマットにおいて37°Cで測定した。アプタマーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Invitrogen)によって、[γ−32P]−標識ATP(Hartmann Analytic、Braunschweig、ドイツ)を使用して5’−リン酸標識した。標識されたアプタマーの特異的な放射活性は、200,000〜800,000cpm/ピコモルであった。アッセイを、選択緩衝液(20mM Tris−HCl、pH 7.4;150mM NaCl;5mM KCl;1mM MgCl2;1mM CaCl2;4U/ml RNase阻害剤(RNaseOUT、Invitrogen);結合パートナーが、使用するプラスチック製品または固定化マトリックスの表面に吸着するのを予防するために、50μg/mlのウシ血清アルブミン(Sigma)および10μg/mlの非特異的スピーゲルマーを補充した0.1%[w/vol]ツイーン20)中で実施した。低い濃度において平衡に達するために、アプタマーを、変性および再生の後に、0.2〜1nMの濃度で、選択緩衝液中、ビオチン化マウスD−C5aの変化させた量と一緒に37°Cで3〜4時間インキュベートした。ビオチン化マウスD−C5aの濃度範囲は、640pM〜10μMに設定し;全反応容積は80〜200μlであった。選択緩衝液を用いてあらかじめ平衡化してある5μlのNeutrAvidin Agarose Plus粒子(Pierce Biotechnology)上に、ビオチン化マウスD−C5a、およびアプタマーとビオチン化マウスD−C5aとの複合体を固定化した。粒子を、サーモミキサー中で、懸濁液中に37°Cで30分間保った。上清を取り除き適切に洗浄した後、固定化した放射活性をシンチレーションカウンター中で定量化した。結合のパーセントを、ビオチン化マウスD−C5aの濃度に対してプロットし、解離定数を、1:1の化学量論を推測し、ソフトウエアアルゴリズム(GraphPad Prism)を使用することによって得た。
異なるD−C5a結合性核酸を比較するために、競合的なランク付けアッセイを実施した。この目的では、利用可能な最もアフィンなアプタマーを放射標識し(上記を参照されたい)、参照として用いた。それを、変性および再生の後、選択緩衝液中で、ビオチン化マウスD−C5aと共に37°Cで、競合がない場合には4μlのNeutrAvidin Agarose Plus粒子(Pierce Biotechnology)上への固定化および洗浄の後に約5〜10%のビオチン化マウスD−C5aへの結合をもたらす条件下でインキュベートした。過剰量の変性および再生した非標識D−RNAアプタマー変異体を、9pM〜400nMの範囲の濃度で、標識参照アプタマーと共に平行結合反応に添加し;全反応容積は160〜400μlであった。3〜4時間のインキュベーション後にビオチン化マウスD−C5a、およびアプタマーとビオチン化との複合体を固定化し、アッセイを上記に記載したように解析した。試験しようとするアプタマーは、参照アプタマーと競合して標的に結合し、したがって、それらの結合の特徴に依存して、結合のシグナルが減少した。次いで、このアッセイにおいて最も活性であることが見出されたアプタマーを、さらなるアプタマー変異体の競合解析のための新しい参照として用いることができた。
装置を37°Cの不変温度に設定した。DESORB法を使用してBiacore2000装置を洗浄した後、新しいチップについて各実験/固定化を開始した。メンテナンスチップのドッキング後、装置に脱着溶液1(0.5%のドデシル硫酸ナトリウム、SDS)、脱着溶液2(50mMのグリシン、pH9.5)およびHBS−EP緩衝液を連続してプライミングした。最後に、系にHBS−EP緩衝液をプライミングした。
C5aのためのヒト受容体を発現する細胞株の生成
ヒトC5a受容体をコードするプラスミド(NCBI寄託NM_001736、pcDNA3.1+)でBA/F3マウスプロB細胞をトランスフェクトすることにより、C5aのためのヒト受容体を発現する安定的なトランスフェクト細胞株を生成した。C5aRを発現する細胞をゲネチシン処理により選択し、RT−PCRにより発現に関して試験し、走化性アッセイにより機能性に関して試験した。
実験前日、細胞を0.3×106個/mlで新しいフラスコ中に播種する。実験のために、細胞を遠心分離し、HBH(HBSS、1mg/mlのウシ血清アルブミンおよび20mMのHEPESを含有する)中で1回洗浄し、1.33×106個の細胞/mlで再懸濁させた。この懸濁液75μlを、5μmの細孔を有する96ウエルのCorning Transwellプレート(Costar Corning、#3388;NY,USA)の上側のコンパートメントに添加した。下側のコンパートメントでは、組み換えヒトC5a(配列番号50)またはマウスC5a(配列番号54)を、細胞の添加前に、20〜30分間にわたって37°Cにおいて、235μlのHBH中において様々な濃度でスピーゲルマーと一緒にプレインキュベートした。細胞を37°Cで3時間遊走させた。その後、挿入プレート(上側のコンパートメント)を除去し、リン酸塩緩衝食塩水中の440μMのレサズリン(Sigma、Deisenhofen、ドイツ)30μlを下側のコンパートメントに添加した。2.5時間にわたる37°Cでのインキュベーション後、蛍光を、544nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。
様々なヒトC5aまたはマウスC5a濃度の方向へのBA/F3/C5aR細胞の3時間の遊走後、ヒトおよびマウスのC5aについての用量応答曲線を得たが、これは、huC5aについては0.1nMの半量有効濃度(EC50)を示し、mC5aについては0.3nMの半量有効濃度(EC50)を示した。スピーゲルマーによる走化性の阻害に関する実験のために、0.1nMのヒトC5aおよび0.3nMのマウスC5aを使用した。
ヒトPMNの単離
室温での不連続勾配遠心分離により、多形核白血球(PMN)を全血液から単離した。クエン酸デキストロース含有採血管(Sarstedt)中に血液を収集した。デキストラン500(Accurate Chemical)を2重量/体積%の最終濃度まで添加し、血液/デキストランをHistopaque(1.077g/ml、Sigma)上に積層した。遠心分離後、勾配界面上の全ての液体および細胞を破棄した。ペレットおよび上記の残存する液体の約80%超を回収し、ボルベン80体積/体積%(Fresenius Kabi)、PBS16体積/体積%(Sigma)およびACD4体積/体積%(Sigma)の混合物で1:1に希釈した。混合物を400rpmで15分にわたり遠心分離した。上清を収集し、1,000rpmで7分にわたり遠心分離した。ペレットを徐々に再懸濁させ、残存する赤血球を溶解により除去した。
走化性プレートの下方チャンバー中において、HBSS+0.01%BSA+25mM HEPES中の示した濃度のNOX−D19またはNOX−D20と共にヒトC5a(1nM)をプレインキュベートした。走化性プレートの上方チャンバーにヒト好中球を添加し、37°Cおよび5%CO2で25分を超えて走化性を実施した。インキュベーション後に、Accutaseを含有する白色発光プレートに上方チャンバーを取り付け、走化性メッシュの裏面に結合した細胞を回収した。Glo試薬(Promega)を添加し、10分にわたり平衡化した。Biotek Synergy 2プレートリーダーを使用して発光を測定した。
37°C、5%CO2で30分にわたり、TNFα(10ng/ml)およびサイトカラシンB(5μg/ml)によりヒト好中球を予備刺激した。示した濃度でNOX−D19またはNOX−D20と共にプレインキュベートしたヒトC5a(30nM)により、細胞を45分にわたり刺激した。次いで、遠心分離により細胞を分離し、25μlの上清を、Tris−Hcl0.1M pH7.4中のエラスターゼ基質(Calbiochem)と共に37°Cで1時間にわたりインキュベートし、5分毎に405nmの吸光度で読み取りを行なった。動態データを解析し、各試料についてのvmaxを決定した。各試料について、対照に対するエラスターゼ活性の平均パーセントを算出した(バックグラウンドを減じていない)。
NOX−D19およびNOX−D20は、新鮮単離したヒト末梢血PMNのC5aによる活性化を効果的に阻害する。10nMのNOX−D19またはNOX−D20は、huC5aにより誘発されるヒトPMNの走化性の85%超を遮断するのに十分であった(図13A)。huC5aにより誘発される抗菌性エラスターゼの放出は、NOX−D19およびNOX−D20により効果的に阻害された(図13B)。30nMのNOX−D19またはNOX−D20は、C5aにより誘発されるエラスターゼ放出の約50%を抑制した。注目すべきことに、化学量論的理由のために、このアッセイの感度は、エラスターゼ放出が30nMのhuC5aにより誘発されるIC50=15nMに制限される。
補体カスケードの最終生成物は、膜侵襲複合体(MAC)であるC5b−9からなる細孔である。MACは病原体の細胞膜中に挿入され、細胞質漏出の誘発により病原体を死滅させると考えられる。
元に戻したヒト凍結乾燥血清(「ヒト補体血清」(Sigma Aldrich、ドイツ)を、96ウエルプレート(Nunc−Immuno(商標)プレート、MaxiSorp Surface(商標))中において10nM〜10,000nMの範囲のPEG化スピーゲルマーNOX−D19、NOX−D20およびNOX−D21と共にプレインキュベートした。陽性対照として、C5切断を阻害する、最大の2’OMeプリンおよび2’フルオロピリミジン置換を有するC5結合性アプタマーC5C6(Bieseckerら、1999)(インハウスで合成した)を同じ濃度範囲で使用した。アッセイでの潜在的に非特異的なスピーゲルマー効果についての対照として、NOX−D19およびNOX−D21の逆配列である逆NOX−D19および逆NOX−D21を有するPEG化スピーゲルマーを含めた。逆NOX−D19および逆NOX−D21は、Biacoreおよび細胞に基づくアッセイにおいてC5aを阻害しないことがすでに明らかであった。37°Cでの1時間のインキュベーション後、溶血系(Institut Virion/Serion GmbH、ドイツ)として知られている、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体でオプソニン化したヒツジ赤血球を、プレインキュベートした血清補体阻害剤混合物に添加する。C5のC5aおよびC5bへの切断をもたらす古典経路を介して補体を活性化した。次いで、C5bはC6−C9と会合して溶解性の膜侵襲複合体(MAC)を形成する。無傷細胞の沈降から30分後に、比色測定により、MAC形成に起因するヒツジ赤血球溶血を測定した。溶血の程度が高くなるほど、(Fluo Starプレートリーダー中で測定した)405nmでの吸収が高くなる。
アプタマーC5C6は、およそ1μMのIC50でヒツジ赤血球の補体依存性溶血を阻害した(図14A、図14B)。試験したスピーゲルマー、すなわちC5およびC5a結合性核酸NOX−D19およびNOX−D20(図14A)およびNOX−D21(図14B)ならびにC5またはC5a非結合性スピーゲルマーである逆NOX−D19(図14A)および逆NOX−D21(図14B)は溶血を阻害しなかった。
試験したC5a結合性スピーゲルマーはMAC形成を阻害しないことが明らかとなり、したがって、試験したC5a結合性スピーゲルマーはC5aのみの選択的アンタゴニストである。医薬品として使用される場合、このことは有利であることができ、なぜならば、MAC形成の阻害は、侵入する病原体、主にグラム陰性細菌に対する身体の防御機構を損なう可能性があるからである。
複数菌による敗血症の経過におけるNOX−D19の腹腔内注射の効果を、齧歯動物の盲腸結紮穿刺(CLP)モデルで試験した。
動物モデル
10〜12週齢の雄C57BL/6マウス(Charles River Laboratories、ドイツ)を本研究に使用した。軽いイソフルラン(isofluran)麻酔下で、腹膜炎を外科的に誘発させた。腹膜腔の左上腹部(盲腸の正常な位置)を切開した。盲腸を露出させ、盲腸の周囲に結紮糸をきつく巻き、小腸の挿入より遠位で縫合した(75%を結紮した)。24ゲージ針によって盲腸に1つの穿刺創を形成し、少量の盲腸内容物を穿刺創から押し出した。盲腸を腹膜腔中に戻し、開腹部位を塞いだ。500μlの生理食塩水を補液として皮下注射した。盲腸の結紮および穿刺を除いて、偽動物に同じ手順を施した。最後に、動物を、食料および水に自由にアクセスできるケージに戻した。
以下の4つの群(偽手術に関してn=6のマウスおよびCLP手術に関して群当たりn=10のマウス)を試験した:(1)ビヒクル(生理食塩水)処理を伴う偽手術、(2)ビヒクル処理を伴うCLP手術、(3)低用量のNOX−D19(1mg/kg)処理を伴うCLP手術、および(4)高用量のNOX D19(10mg/kg)処理を伴うCLP手術。研究者らは処理戦略を把握しておらず、どの化合物がビヒクルまたは本物(verum)を含有するか分からなかった。投与ルートは、CLP手術時から始まり6日にわたって毎日、腹腔内であった。
経過観察は各群において7日であった。マウスを毎日モニタリングし、GraphPad Prism4ソフトウエアを使用してカプランマイヤー生存曲線を生成した。
手術前(ベースライン、−4日)および手術後1日目に、毛細管により海綿静脈洞から軽いエーテル麻酔下で血液試料を得て、急性腎傷害(血清クレアチニンおよび血液尿素窒素、BUN)および急性肝不全(血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、血清ALT)の通常の血清マーカーを測定した。多臓器不全のマーカーとして、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(血清AST)の血清中のレベルを測定した。臨床化学パラメータの測定をOlympus分析器(AU400)上で実施した。
スチューデントのT検定により統計的有意性を算出した。生存期間に関して、カプランマイヤー曲線を生成し、有意性に関するログランク検定を実施した。GraphPad Prism4ソフトウエアを使用した。
生存期間
予想したように、CLPを伴わない偽手術を施した動物は死亡しなかった(図15)。CLP手術したマウスおよびビヒクルのみで処理したマウスでは、生存期間中央値は1.5日であり、CLP手術後のNOX−D19処理により生存期間中央値が改善された(図15)。低用量のNOX−D19(1mg/kg)で処理したマウスは、最長の生存期間中央値を示した(5日、ビヒクルに対してp<0.0001)。高用量のNOX−D19(10mg/kg)で処理したマウスは、ビヒクル処理マウス(p=0.0401)に比べて有意に長いが低用量のNOX−D19処理(p=0.4875)と有意差がない3日の生存期間中央値を有した。100%のビヒクルマウスがCLP手術後4日以内に死亡した。低用量のNOX−D19および高用量のNOX−D19それぞれで処理したマウスでは、7日までに死亡率は100%および90%になっていなかった(図15)。
腎機能
血清クレアチニンおよび血液尿素窒素(BUN)濃度は腎機能に関するパラメータである。研究の開始前(−4日)およびCLP手術後1日目に腎機能を評価した。1日までに、CLPは、ビヒクル処理マウスにおける血清クレアチニンレベルの有意な増加を誘発した。低用量のNOX−D19処理(1mg/kg)により、この増加が予防された(図16A)。高用量のNOX−D19(10mg/kg)で処理されたマウスでは、血清クレアチニンレベルの中程度ではあるが統計的に有意ではない増加を観察した(ビヒクルに対してp=0.1873)(図16A)。
肝臓細胞の損傷または壊死の最も確実なマーカーは、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(血清ALT)である。全ての群が、CLP手術後1日目に血清ALTの増加を示した。しかし、NOX−D19処理した敗血症マウスの両方の群は、ビヒクル処理したマウスと比べて肝機能の改善を実証した(図17A)。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの血清レベル(血清AST)(図17B)を多臓器不全のマーカーとして測定した。なぜならば、ASTは、心筋梗塞、急性膵炎、急性溶血性貧血、重度の熱傷、急性腎臓疾患、筋骨格系疾患および外傷等の、肝臓以外の臓器に影響を及ぼす疾患で上昇することが明らかになっているからである。ALTと同様に、全ての群は、CLP手術後1日目にASTレベルの上昇を示した(偽に対してp<0.001)。しかし、肝機能と同様に、NOX−D19処理した敗血症マウスの両方の群は、ビヒクル処理したマウスと比べてあまりはっきりとしないASTレベルを実証した(図17B)。
複数菌による敗血症の経過におけるNOX−D20の腹腔内注射の効果を、齧歯動物の盲腸結紮穿刺(CLP)モデルで試験した。
動物モデル
実施例8に記載したように、複数菌による敗血症を、盲腸の60〜75%が結紮されている10〜12週齢の雄C57BL/6マウス(Charles River Laboratories、ドイツ)に誘発させた。
経過観察は各群において7日であった。マウスを毎日モニタリングし、GraphPad Prism4ソフトウエアを使用してカプランマイヤー生存曲線を生成した。
以下の5つの群(偽手術に関してn=6のマウスおよびCLP手術に関して群当たりn=10のマウス)を試験した:(1)ビヒクル(生理食塩水)処理を伴う偽手術、(2)ビヒクル処理を伴うCLP手術、(3)毎日の低用量のNOX−D20(1mg/kg)処理を伴うCLP手術、(4)毎日の高用量のNOX−D20(3mg/kg)処理を伴うCLP手術、および(5)手術後に単回の低用量のNOX−D20(1mg/kg)、続いて毎日のビヒクル処理を伴うCLP手術。研究者らは処理戦略を把握しておらず、どの化合物がビヒクルまたは本物を含有するか分からなかった。投与ルートは腹腔内であった。
手術後1日目に、毛細管により海綿静脈洞から軽いエーテル麻酔下で実施例8に記載したように血液試料を得た。急性腎傷害(血清クレアチニンおよび血液尿素窒素、BUN)、急性肝不全(血清ALT)および内皮損傷(血清乳酸脱水素酵素、血清LDH)の通常の血清マーカーを測定した。3mlのPBSを使用して腹腔洗浄(PL)を実施した。各試料においてPLの収集量を測定し、血球計(Neubauer Zaehlkammer、Gehrden、ドイツ)を使用して全細胞数を評価した。腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)、インターロイキン−6(IL−6)およびCCL2(=マクロファージ走化タンパク質−1、MCP−1)の血清レベルおよびPLレベルをビーズベースのフローサイトメトリーアッセイ(CBAキット、BD Biosciences、Heidelberg、ドイツ)により定量化した。CXCL1(=ケラチノサイト化学誘因物質、KC)およびCXCL2(=マクロファージ炎症性タンパク質2、MIP−2)の血清濃度およびPL濃度を、ELISA(R&D Systems、Wiesbaden、ドイツ)により測定した。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色サイトスピン(サイトスピン4、Thermo Scientific)上で、PLにおける差分細胞計数を実施した。
CLP手術直後に、0.25重量/体積%のエバンスブルー(200μl)を静脈注射した。18時間後にマウスを屠殺し、上記に記載したようにPLを実施した。血清流体およびPL流体におけるエバンスブルー染料の濃度を620nmで分光光学的に測定した。ヘム色素の混入のために、以下の式を使用して光学濃度を補正した:E620(補正)=(E620(未加工)−(E405(未加工)×0.014)。PL流体中における消光と血漿中における消光との比率として血漿滲出を定量化した。
一元ANOVAおよびDunnetts検定により統計的有意性を算出した。生存期間に関して、有意性に関するログランク検定を実施した。GraphPad Prism4ソフトウエアを使用した。
生存期間
予想したように、偽手術したマウスは手術後7日以内に死亡しなかった(図18)。ビヒクル処理したCLPマウスでは、生存期間中央値は3日であった。1mg/kgのNOX−D20で毎日処理したマウスでは、生存期間中央値が7日に有意に延びた(ビヒクルに対してp=0.0043)。NOX−D20の投与量を3mg/kgに増加させても、さらなる保護効果はなく、生存期間中央値は同様に6.5日であった(ビヒクルに対して0.0092)。特に、CLP手術後の1mg/kgのNOX−D20の単回注射は毎日の処理と同じように効果的であり、生存期間中央値が6.5日に有意に延びた(図18)。ビヒクル処理したマウスの100%が5日以内に死亡するが、NOX−D20で処理したマウスの30〜40%は7日目において実験の終了時に依然として生存した(図18)。
全身性炎症は多臓器不全を起こすことが多い。クレアチニンおよびBUNの血清レベルの増加は、糸球体ろ過率の低下および腎不全に関するパラメータである。両方のパラメータは、偽マウスと比べて、CLP手術後1日に、ビヒクル処理したマウスにおいて有意に増加した。NOX−D20処理により両方のマーカーの増加が効果的に防止され、このことは腎機能に関するNOX−D20の保護効果を示唆した(図19A、図19B)。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)は肝臓細胞の損傷および壊死の一般的なマーカーであり、CLPにより誘発された敗血症は、ALTの血清レベルの増加と関連した。NOX−D20処理したマウスは、ビヒクル処理したマウスと比べて血清ALTの有意な低下を実証し、このことは肝機能の改善を示唆した(図19C)。乳酸脱水素酵素(LDH)の血清レベルの上昇は組織傷害後に起こり、したがって臓器不全の一般的なマーカーである。CLPによって引き起こされるLDHレベルの上昇は、NOX−D20により効果的に遮断された(図20A)。内皮バリアの崩壊および浮腫形成は、敗血症で通常の致命的事象である。偽手術したマウスと比べて、ビヒクル処理において、敗血症の誘発により、関連する血漿タンパク質の腹膜腔中への溢出が2倍に増加した。NOX−D20処理により毛細血管漏出が有意に阻害された(図20B)。本明細書で試験した全てのパラメータに関して、1mg/kgのNOX−D20は、臓器機能を有意に改善するのに十分であり、このことは、NOX−D20処理したマウスの生存期間の改善に反映される。
CLPにより、炎症促進性のサイトカインおよびケモカインの強局在のおよび全身の上方制御がもたらされた。NOX−D20によるC5aの遮断より、CLP後1日目において、腹膜および血清中のTNFα、IL−6、CCL2、CXCL1およびCXCL2の濃度が効果的に低下した。これらのケモカインの上方制御は、多形核白血球(PMN)の腹膜への動員と関係する。したがって、NOX−D20によるC5a−阻害によって、腹膜腔中でのPMNの蓄積が阻害された(図20C)。同様に、NOX−D20によって単球の浸潤が遮断された。
腎虚血/再灌流損傷(IRI)の齧歯動物モデルにおいて、急性腎傷害(AKI)についてのNOX−D21の効果を試験した。
動物モデル
鼻マスクによってインフルランを使用し、12〜15週齢の雄C57BL/6マウス(Charles River、ドイツ)に麻酔をかけ、暖房テーブル上に仰向けに寝かせて体温を約32°Cに維持した。正中線切開を実施し、30分にわたりマイクロ動脈瘤クリップで右および左の腎茎を挟んだ。クリップの除去および皮膚の縫合後にマウスをケージに戻し、完全に目が覚めるまでモニタリングした。
以下の3つの群(群当たりn=10のマウス)を試験した:(1)ビヒクル処理を伴うIRI手術、(2)低用量のNOX−D21(1mg/kg)処理を伴うIRI手術、(3)高用量のNOX−D21(10mg/kg)処理を伴うIRI手術。研究者らは処理戦略を把握しておらず、どの化合物がビヒクルまたは本物を含有するか分からなかった。NOX−D21を0日目において手術前に1時間点滴し、次の3日の間(1日目〜3日目)、NOX−D21を1日に1回、腹腔内に投与した。
14日にわたり毎日マウスをモニタリングした。カプランマイヤー生存曲線を生成し、GraphPad Prism4ソフトウエアを使用してログランク検定により有意性を決定した。
高NOX−D21での処理によって、生存期間が有意に改善された(図21)。低用量のNOX−D21処理では、生存期間はまだ統計的に有意に改善されないことは明らかだった。ビヒクルのみで処理した対照群では、1匹のマウスが14日まで生存した。NOX−D21処理により、生存しているマウスの割合が45〜55%に増加した(図21)。
Claims (19)
- ヒトC5aに結合することができるL−核酸分子であって、前記L−核酸分子が、配列番号4、配列番号8〜49、配列番号55〜60、配列番号90〜92、配列番号1〜3、配列番号5および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるL−核酸分子。
- ヒトC5aおよびマウスC5aに結合することができるL−核酸分子であって、前記L−核酸分子が、配列番号4、配列番号8〜49、配列番号55〜60、配列番号90〜92、配列番号1〜3、配列番号5および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるL−核酸分子に対する少なくとも90%の同一性を有するL−核酸分子。
- 前記L−核酸分子がヒトC5aおよびマウスC5aに結合することができる、請求項1に記載のL−核酸分子。
- 前記核酸が、ヒトおよび/またはマウスのC5aにより媒介される活性のアンタゴニストである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のL−核酸分子。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のL−核酸分子においてさらに修飾基を含むL−核酸分子であって、前記修飾基は、生分解性修飾および非生分解性修飾を含む群から選択される、L−核酸分子。
- 前記修飾基は、ポリエチレングリコール、直鎖ポリエチレングリコール、分岐ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミデートおよびポリ(2−ヒドロキシエチル)−L−グルタミンを含む群から選択される、請求項5に記載のL−核酸分子。
- 疾患を治療および/または予防するための方法において使用するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のL−核酸分子。
- 前記疾患は、補体活性化およびC5a媒介性発症機構に関連があり、かつ/または、自己免疫性疾患、炎症性疾患、全身性炎症反応症候群、眼疾患、虚血/再灌流傷害、臓器移植後臓器機能障害、移植片拒絶、心血管疾患、呼吸器疾患、急性反応、感染性疾患、神経性疾患、神経変性疾患、線維性疾患、血液疾患、代謝性疾患、腫瘍、および生体材料による補体活性化に関連する臨床的合併症を含む群から選択される、請求項7に記載の使用のためのL−核酸分子。
- 前記全身性炎症反応症候群は、敗血症および外傷または重度の熱傷の二次的損傷を含む群から選択される、請求項8に記載の使用のためのL−核酸分子。
- 請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子および場合によりさらなる構成要素を含む医薬組成物であって、さらなる構成要素は、薬学的に許容できる賦形剤、薬学的に許容できる担体および薬学的に活性な薬剤を含む群から選択される医薬組成物。
- 医薬品を製造するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のL−核酸分子の使用。
- 診断手段を製造するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のL−核酸分子の使用。
- 前記医薬品が、自己免疫性疾患、炎症性疾患、全身性炎症反応症候群、眼疾患、虚血/再灌流傷害、臓器移植後臓器機能障害、移植片拒絶、心血管疾患、呼吸器疾患、急性反応、感染性疾患、神経性疾患、神経変性疾患、線維性疾患、血液疾患、代謝性疾患、腫瘍、および生体材料による補体活性化に関連する臨床的合併症の治療および/または予防のためのものである、請求項11に記載の使用。
- 前記全身性炎症反応症候群は、敗血症および外傷または重度の熱傷の二次的損傷を含む群から選択される、請求項13に記載の使用。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のL−核酸分子ならびにC5aを含む複合体。
- C5aを検出するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のL−核酸分子のin vitroにおける使用。
- C5aにより媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングするための方法であって、
C5aにより媒介される活性の候補アンタゴニストを提供するステップと、
請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子を提供するステップと、
C5aにより媒介される活性のアンタゴニストの存在下でシグナルを発生する試験系を提供するステップと
C5aにより媒介される活性の候補アンタゴニストが、C5aにより媒介される活性のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載のL−核酸分子と、少なくとも指示書または反応槽とを含む、C5aの検出のためのキット。
- 試料中の、請求項1〜9のいずれか1項で定義された核酸を検出するための方法であって、
a)捕捉プローブおよび検出プローブを準備するステップであって、前記捕捉プローブは、請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子の第1の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブは、請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子の第2の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すか、あるいは、前記捕捉プローブは、請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子の第2の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブは、請求項1〜9のいずれか1項で定義されたL−核酸分子の第1の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すステップと、
b)前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを別々にまたは組み合わせて、請求項1〜9のいずれか1項で定義された前記L−核酸分子を含有する試料または請求項1〜9のいずれか1項で定義された前記L−核酸分子を含有すると推定される試料に添加するステップと、
c)前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを、請求項1〜9のいずれか1項で定義された前記L−核酸分子またはその部分と同時にまたは任意の順番で順次に反応させるステップと、
d)請求項1〜9のいずれか1項で定義された前記L−核酸分子ならびに前記捕捉プローブおよび前記検出プローブからなる、ステップc)で形成された複合体を検出するステップと
を含む方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EPPCT/EP2012/000089 | 2012-01-10 | ||
EP12000106 | 2012-01-10 | ||
EP12000106.0 | 2012-01-10 | ||
PCT/EP2012/000089 WO2012095303A1 (en) | 2011-01-10 | 2012-01-10 | Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same |
EP12006960.4 | 2012-10-08 | ||
EP12006960 | 2012-10-08 | ||
PCT/EP2013/000056 WO2013104540A1 (en) | 2012-01-10 | 2013-01-10 | New c5a binding nucleic acids |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015509705A JP2015509705A (ja) | 2015-04-02 |
JP2015509705A5 JP2015509705A5 (ja) | 2016-03-03 |
JP6415327B2 true JP6415327B2 (ja) | 2018-10-31 |
Family
ID=48781063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014551570A Active JP6415327B2 (ja) | 2012-01-10 | 2013-01-10 | 新規なc5a結合性核酸 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9518265B2 (ja) |
EP (1) | EP2802660B1 (ja) |
JP (1) | JP6415327B2 (ja) |
KR (1) | KR102034203B1 (ja) |
CN (1) | CN104145018B (ja) |
AU (2) | AU2013209131A1 (ja) |
BR (1) | BR112014016877B1 (ja) |
CA (1) | CA2860806C (ja) |
DK (1) | DK2802660T3 (ja) |
ES (1) | ES2786007T3 (ja) |
HK (1) | HK1198371A1 (ja) |
IL (1) | IL233516B (ja) |
IN (1) | IN2014DN05665A (ja) |
MX (1) | MX362061B (ja) |
PL (1) | PL2802660T3 (ja) |
PT (1) | PT2802660T (ja) |
RU (1) | RU2645261C2 (ja) |
SG (2) | SG11201403771SA (ja) |
WO (1) | WO2013104540A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015066027A2 (en) | 2013-10-28 | 2015-05-07 | Dots Devices, Inc. | Allergen detection |
US10238700B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-03-26 | Genelux Corporation | Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity |
EP3793427A1 (en) | 2018-05-17 | 2021-03-24 | The Procter & Gamble Company | Systems and methods for hair coverage analysis |
US11172873B2 (en) | 2018-05-17 | 2021-11-16 | The Procter & Gamble Company | Systems and methods for hair analysis |
EP3586865A1 (en) * | 2018-06-21 | 2020-01-01 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Complement anaphylatoxin binders and their use in treatment of a subject having an ocular wound and/or fibrosis |
WO2020005326A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | The Procter & Gamble Company | Aptamers for personal care applications |
AU2019378732A1 (en) * | 2018-11-12 | 2021-05-27 | Aptarion Biotech Ag | CXCL8 binding nucleic acids |
MX2021012433A (es) | 2019-04-16 | 2021-11-17 | Procter & Gamble | Aptameros para aplicaciones para el control de olor. |
US12039732B2 (en) | 2021-04-14 | 2024-07-16 | The Procter & Gamble Company | Digital imaging and learning systems and methods for analyzing pixel data of a scalp region of a users scalp to generate one or more user-specific scalp classifications |
CN113150106B (zh) * | 2021-04-26 | 2022-08-16 | 华中农业大学 | 来源于补体成分C5a的抗菌肽及其应用 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6395888B1 (en) * | 1996-02-01 | 2002-05-28 | Gilead Sciences, Inc. | High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins |
US6011020A (en) | 1990-06-11 | 2000-01-04 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligand complexes |
US6140490A (en) | 1996-02-01 | 2000-10-31 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins |
US6395029B1 (en) | 1999-01-19 | 2002-05-28 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Sustained delivery of polyionic bioactive agents |
US6652886B2 (en) | 2001-02-16 | 2003-11-25 | Expression Genetics | Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents |
US7629456B2 (en) | 2001-10-26 | 2009-12-08 | Noxxon Pharma Ag | Modified L-nucleic acid |
EP1306382A1 (de) | 2001-10-26 | 2003-05-02 | Noxxon Pharma AG | Modifizierte L-Nukleinsäure |
EP1585817B1 (en) | 2002-02-20 | 2009-09-02 | The General Hospital Corporation | Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor |
US7595304B2 (en) | 2003-04-13 | 2009-09-29 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Polymeric oligonucleotide prodrugs |
GB0314472D0 (en) | 2003-06-20 | 2003-07-23 | Warwick Effect Polymers Ltd | Polymer |
US20070116710A1 (en) | 2004-02-03 | 2007-05-24 | Leonard Bell | Methods of treating hemolytic anemia |
CN1917905B (zh) | 2004-02-09 | 2012-01-04 | 诺松制药股份公司 | 从多糖和多核苷酸生产缀合物的方法 |
US7803931B2 (en) * | 2004-02-12 | 2010-09-28 | Archemix Corp. | Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders |
ES2429442T3 (es) * | 2004-02-12 | 2013-11-14 | Archemix Llc | Aptámeros terapéuticos útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con complemento |
CA2824093C (en) | 2004-03-23 | 2016-10-25 | Complex Biosystems Gmbh | Polymeric prodrug with a self-immolative linker |
CA2585664C (en) | 2004-11-05 | 2014-05-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Biodegradable linkers for molecular therapies |
BRPI0606647A2 (pt) * | 2005-01-17 | 2009-07-14 | Jerini Ag | antagonistas do receptor de c5a |
NZ571791A (en) | 2006-03-08 | 2012-03-30 | Archemix Llc | Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders |
CN101534643A (zh) | 2006-09-15 | 2009-09-16 | 安佐制药股份有限公司 | 用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体 |
EP2061901A2 (en) | 2006-10-31 | 2009-05-27 | Noxxon Pharma AG | Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule |
EP2562256A3 (en) | 2007-09-24 | 2013-06-19 | Noxxon Pharma AG | C5a binding nucleic acids |
JP4642940B2 (ja) | 2009-03-11 | 2011-03-02 | オリンパスメディカルシステムズ株式会社 | 画像処理システム、その外部装置およびその画像処理方法 |
WO2010108657A2 (en) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Noxxon Pharma Ag | C5a binding nucleic acids and the use thereof |
EP2561079A1 (en) | 2010-04-21 | 2013-02-27 | Noxxon Pharma AG | Lipid binding nucleic acids |
JP2014504865A (ja) * | 2011-01-10 | 2014-02-27 | ノクソン ファーマ エージー | 標的分子との結合親和性を有する核酸分子およびその生成方法 |
AU2012325233A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-04-24 | Noxxon Pharma Ag | Glucagon binding nucleic acids |
CN104136612A (zh) | 2012-01-10 | 2014-11-05 | 诺松制药股份公司 | 特异性结合cgrp的核酸 |
-
2013
- 2013-01-10 AU AU2013209131A patent/AU2013209131A1/en not_active Abandoned
- 2013-01-10 DK DK13700617.7T patent/DK2802660T3/da active
- 2013-01-10 IN IN5665DEN2014 patent/IN2014DN05665A/en unknown
- 2013-01-10 MX MX2014008454A patent/MX362061B/es active IP Right Grant
- 2013-01-10 JP JP2014551570A patent/JP6415327B2/ja active Active
- 2013-01-10 EP EP13700617.7A patent/EP2802660B1/en active Active
- 2013-01-10 PL PL13700617T patent/PL2802660T3/pl unknown
- 2013-01-10 PT PT137006177T patent/PT2802660T/pt unknown
- 2013-01-10 SG SG11201403771SA patent/SG11201403771SA/en unknown
- 2013-01-10 SG SG10201605594UA patent/SG10201605594UA/en unknown
- 2013-01-10 US US14/371,006 patent/US9518265B2/en active Active
- 2013-01-10 RU RU2014132708A patent/RU2645261C2/ru active
- 2013-01-10 ES ES13700617T patent/ES2786007T3/es active Active
- 2013-01-10 WO PCT/EP2013/000056 patent/WO2013104540A1/en active Application Filing
- 2013-01-10 CN CN201380009020.9A patent/CN104145018B/zh active Active
- 2013-01-10 CA CA2860806A patent/CA2860806C/en active Active
- 2013-01-10 BR BR112014016877-6A patent/BR112014016877B1/pt active IP Right Grant
- 2013-01-10 KR KR1020147022321A patent/KR102034203B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-07-03 IL IL233516A patent/IL233516B/en active IP Right Grant
- 2014-11-24 HK HK14111874.2A patent/HK1198371A1/xx unknown
-
2016
- 2016-12-12 US US15/376,338 patent/US10590424B2/en active Active
-
2018
- 2018-11-30 AU AU2018271388A patent/AU2018271388B2/en active Active
-
2020
- 2020-03-15 US US16/819,102 patent/US11492625B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6415327B2 (ja) | 新規なc5a結合性核酸 | |
JP5798320B2 (ja) | C5aに結合する核酸 | |
JP5798549B2 (ja) | ヘプシジン結合核酸 | |
JP2021181490A (ja) | 免疫細胞へオリゴヌクレオチドを送達する方法 | |
AU2010284329B2 (en) | Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics | |
CA2620582A1 (en) | Methods of altering an immune response induced by cpg oligodeoxynucleotides | |
US20120065254A1 (en) | C5A binding nucleic acids and the use thereof | |
AU2014238740B2 (en) | Aptamer to IL-17 and use thereof | |
EP2167662A2 (en) | Pharmaceutical compounds comprising abasic oligonucleotides | |
US20210230599A1 (en) | Stem-loop compositions and methods for inhibiting interleukin-8 | |
AU2016204713B2 (en) | Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160112 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160112 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161013 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161220 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170307 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170413 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170901 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171106 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180301 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180316 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180614 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180904 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181002 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6415327 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |