BR112021007724A2 - ácidos nucleicos de ligação à cxcl8 - Google Patents

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Dirk Zboralski
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Abstract

ÁCIDOS NUCLEICOS DE LIGAÇÃO À CXCL8. A presente invenção está relacionada a uma molécula de ácido L-nucleico capaz de se ligar à CXCL8 de humano, em que a molécula de ácido L-nucleico compreende um trecho central de nucleotídeos, em que o trecho central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5 GG A AGU ACGUGGA AAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG-3 [SEQ. ID. NO: 27], em que XU é U ou ausente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ÁCIDOS NUCLEICOS DE LIGAÇÃO À CXCL8”.
[001] A presente invenção está relacionada a uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar à CXCL8, a molécula de ácido nuclei- co para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, a molécula de ácido nucleico para uso em um método para detectar CXCL8, a molécula de ácido nucleico para a fabricação de um meio de detecção ou um biossensor, uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ácido nucleico, o uso da molécula de ácido nucleico para a fabricação de um medicamento, o uso da molé- cula de ácido nucleico para a fabricação de um meio de diagnóstico, um meio de diagnóstico ou um biossensor, uso da molécula de ácido nucleico para a detecção de CXCL8, um kit compreendendo a molécu- la de ácido nucleico, um método para a detecção de CXCL8 usando a molécula de ácido nucleico, um complexo compreendendo a molécula de ácido nucleico, um método para o rastreamento de um antagonista de uma atividade mediada por CXCL8 usando a molécula de ácido nu- cleico e um método para a detecção da molécula de ácido nucleico.
[002] CXCL8 (UniProtKB/Swiss-Prot P10145, IL8_HUMAN; SEQ ID NO: 2), também conhecido como interleucina 8 (abr. IL-8), proteína ativadora de neutrófilos 1 (abr. NAP-1), fator quimiotático neutrófilo de- rivado de monócitos (abr. MDNCF), ou proteína quimiotática de granu- lócitos 1 (abr. GCP-1), é uma pequena proteína básica que pertence a uma subfamília de quimiocinas CXC com propriedades pró- inflamatórias e pró-angiogênicas caracterizadas por um motivo de glu- tamato-leucina-arginina (abr . ELR) no terminal N. Quimiocinas CXCL1 ELR-positivas (também conhecidas como proteína alfa regulada pelo crescimento, Gro-alfa, atividade estimuladora de crescimento do mela- noma, MGSA ou NAP-3), CXCL2 (também conhecida como Gro-beta ou proteína inflamatória 2-alfa de macrófago, MIP2-alfa), CXCL3 (tam-
bém conhecida como Gro-gamma ou MIP2-beta), CXCL5 (também conhecida como proteína 78 ativadora de neutrófilos derivada do epité- lio, ENA-78 ou pequena citocina B5 induzível), CXCL6 (também co- nhecida como quimiocina alfa 3, CKA-3, proteína quimiotática de gra- nulócitos 2, GCP-2 ou citocina B6 pequena induzível), CXCL7 (tam- bém conhecida como proteína básica de plaquetas, PBP, fator de crescimento derivado de leucócitos, LDGF, fator de crescimento deri- vado de macrófago, MDGF, ou pequena citocina B7 induzível) e CXCL8 são agonistas do receptor CXCR2 (também conhecido como IL8RB, IL8R tipo 2, CD182, CDw128b ou receptor GRO/MGSA). CXCL6, CXCL7 e CXCL8 são agonistas do receptor CXCR1 (também conhecido como IL8RA, IL8R tipo 1, CD181 ou CDw128a). CXCL8 li- ga-se aos receptores CXCR1 e CXCR2 com afinidades semelhantes de cerca de 4 nM. A ligação de CXCL8 a CXCR1/2 desencadeia vias de sinalização dependentes de Gαi e, por exemplo, induz a migração de neutrófilos, desgranulação e explosão oxidativa. A sensibilidade do receptor pode ser regulada por fosforilação, recrutamento de beta- arrestina e internalização do receptor (Ha, Theranostics 2017). CXCL7 tem a maior homologia com CXCL8 com 33 aminoácidos idênticos. CXCL8 de primatas não humanos (macaca mulata, macaco cinomol- go) compartilham 95 % de identidade (73 de 77 aminoácidos idênticos) com CXCL8 humana. Não há ortólogo de CXCL8 em camundongos e ratos.
[003] CXCL8 é secretada por diferentes tipos de células, incluin- do monócitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais e epiteliais em resposta a, por exemplo, moléculas de padrão molecular associa- do a patógenos (abr. PAMP) (por exemplo, LPS), mediadores pró- inflamatórios (por exemplo, IL-1, IL-6 e TNF-a), hipóxia, espécies reati- vas de oxigênio ou fatores de estresse ambiental (por exemplo, fuma- ça de cigarro) (Ha, Theranostics 2017). CXCL8 atua como uma citoci-
na quimiotática e ativadora para neutrófilos e monócitos e desempe- nha um papel fisiológico importante em defesa do hospedeiro.
[004] CXCL8 é usada como um biomarcador para diagnóstico, estado de doença, prognóstico e eficácia terapêutica em doenças in- fecciosas com níveis elevados de CXCL8 descritos em infecções virais (por exemplo, vírus sincicial respiratório, vírus do herpes simples, vírus da hepatite B e C, citomegalovírus humano), infecção bacteriana (por exemplo, Stretptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis) e infecção fúngica (por exemplo, Candida albicans e Aspergillus fumi- gatus). Na infecção por vírus sincicial respiratório pediátrico (abr. RSV), os níveis plasmáticos de CXCL8 se correlacionam com a gravi- dade da doença. Assim, a CXCL8 pode servir como um biomarcador para avaliar a gravidade da infecção por RSV e orientar o manejo clí- nico. A combinação com outros biomarcadores imunológicos, nomea- damente contagens de linfócitos e níveis plasmáticos de CCL5, au- menta a precisão (Brand, Pediatr Res 2013). Outros exemplos para o uso de CXCL8 como biomarcador em doenças infecciosas são sepse neonatal (Zhou, PLoS One 2015), meningite bacteriana (Yao, Int J Clin Exp Med 2015), pneumonia (Morris, Thorax 2009) e neurossífilis (Wang, Sci Rep 2016). CXCL8 também pode ser usado como um bio- marcador em doenças inflamatórias, incluindo prostatite crônica, pielo- nefrite aguda, fibrose cística e várias doenças autoimunes (Shahzad, Int Arch Med 2010). Em pacientes com câncer, os níveis de CXCL8 se correlacionam com a carga do tumor e pior resultado (Sanmamed, Clin Cancer Res 2014). Por exemplo, CXCL8 se correlaciona com menor sobrevida no câncer de mama (Fang, Anticancer Res 2017) e câncer pancreático (Chen, World J Gastroenterol 2012) e sarcoma pediátrico (Highfill, Sci Transl Med 2014). No melanoma, os níveis basais eleva- dos de CXCL8 se correlacionam com a não responsividade ao trata- mento de combinação de anti-CTLA 4/quimioterapia e piores resulta-
dos dos pacientes (Jamal, J Immunoter Cancer 2017).
[005] CXCL8 e seus receptores estão implicados na patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo doenças inflamatórias do sistema respiratório (por exemplo, distúrbio pulmonar obstrutivo crôni- co, síndrome da angústia respiratória aguda, asma, fibrose cística, fi- brose pulmonar), doenças inflamatórias da pele (por exemplo, derma- toses neutrofílicas, psoríase, penfigoide bolhoso), doenças autoimunes (por exemplo, doenças inflamatórias intestinais, colite ulcerativa, escle- rose múltipla, artrite reumatoide), doenças neurológicas inflamatórias (por exemplo, doença de neuro-sweet, doença de Alzheimer), doenças isquêmicas (por exemplo, acidente vascular cerebral, infarto do mio- cárdio, isquemia cerebral e infarto) e outras doenças inflamatórias (por exemplo, aterosclerose) (Ha, Theranostics 2017; Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014). O potencial de inibição de CXCL8 para o trata- mento de tais doenças inflamatórias é suportado por modelos de do- enças animais. Por exemplo, em coelhos, a administração de anticor- po anti-CXCL8 melhorou a dermatite induzida por LPS, pleurisia indu- zida por LPS, artrite induzida por LPS/IL-1, glomerulonefrite do tipo IC, lesão pulmonar aguda e lesão de reperfusão pulmonar (Bao, Int Immunofarmacol 2010; Harada, J Leukoc Biol 1994). O bloqueio de CXCR1/2 reduziu a lesão cerebral isquêmica em um modelo de rato (Garau, Cytokine 2005).
[006] CXCL8 está implicada no desenvolvimento, progressão e resistência ao tratamento de cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário e melanoma, e promove o cresci- mento do tumor e metástase (Brat, Neuro Oncol 2005; Ha, Theranos- tics 2017; Koch, Science 1992; Li, Angiogenesis 2005; Liu, Cytokine Growth Factor Rev 2016; Xu, Oncol Res 2000). Os mecanismos de promoção do câncer por CXCL8 incluem a estimulação da angiogêne-
se, autorrenovação de células tronco cancerosas, transição epitelial para mesenquimal, e a geração de um microambiente tumoral imunos- supressor (Ginestier, J Clin Invest 2010; Visvader, Nat Rev Cancer 2008; David, Vaccines 2016). O potencial de inibição de CXCL8 para o tratamento de câncer humano é apoiado por modelos de doenças animais. Por exemplo, o nocaute de CXCL8 reduz o crescimento de células cancerígenas de ovário resistentes à quimioterapia (Merritt, J Natl Cancer Inst 2008). A inibição de CXCL8 aumenta as respostas antiangiogênicas induzidas por docetaxel em modelos de câncer de ovário e de próstata (Campbell, Pharmaceuticals 2013). A superex- pressão de CXCL8 em tumores insuficientes em homólogo de fosfa- tase e tensina (PTEN) aumenta a viabilidade das células cancerosas e contribui para o desenvolvimento de tumores resistentes ao tratamento (Campbell, Pharmaceuticals 2013; Maxwell, Eur Urol 2013; Maxwell, Oncotarget 2014). A inibição da sinalização CXCL8 sensibiliza as célu- las cancerosas deficientes em PTEN, bem como as células cancero- sas mutantes em p53, a agentes danificadores de DNA, antimetabóli- tos ou estratégias de segmentação do receptor de andrógeno (Camp- bell, Pharmaceuticals 2013). O bloqueio de CXCR2 aumentou a eficá- cia do inibidor do ponto de checagem imunológico anti-PD-1 em mode- los de camundongo de rabdomiossarcoma e adenocarcinoma ductal pancreático (Highfill, Sci Transl Med 2014; Steele, Cancer Cell 2016).
[007] Vários compostos direcionados a CXCL8 ou um ou ambos os respectivos receptores CXCR1 e CXCR2 são conhecidos e foram testados com sucesso em modelos in vivo. Alguns deles foram poste- riormente testados em ensaios clínicos. Antagonistas de CXCR1 e/ou CXCR2, ou seja, reparixina, ladarixina, danirixina, navarixina, SX-682 e AZD-5069 são testados em ensaios clínicos para transplante de ilho- tas pancreáticas, transplante de órgãos, diabetes tipo 1, DPOC, asma, bronquiectasia, psoríase, penfigoide bolhoso e câncer. O antagonista de XCR1/2 reparixina é ainda testado clinicamente em pacientes com câncer de mama triplo-negativo metastático. O antagonista de CXCR2 AZD-5069 é testado em combinação com durvalumabe anti-PD-L1 ou quimioterapias em cânceres sólidos.
[008] Embora compartilhem os receptores CXCR1 e CXCR2, quimiocinas ELR-positivas têm padrões de expressão distintos, distri- buição in vivo (propriedades de ligação à matriz extracelular) e meca- nismos de interação com os receptores (Feniger-Barish, Cytokine 1999; Sawant, Sci Rep 2016). As respectivas funções fisiológicas dos diferentes membros da família de quimiocinas ELR-positivas são mal compreendidas. Assim, a inibição seletiva da CXCL8 promotora da doença será potencialmente mais eficaz no tratamento da doença e reduzirá o risco de efeitos colaterais em comparação com o bloqueio amplo do bloqueio de CXCR1/CXCR2. Por exemplo, CXCL8, mas não CXCL1, é necessário para a manutenção de células tronco cancerosas (Liotti F et al., Stem Cells 2017; 35:135-146). Na infecção, as quimioci- nas têm atividades sobrepostas. Consequentemente, uma ampla inibi- ção de quimiocinas ELR-positivas (por exemplo, inibição simultânea de CXCL8 e CXCL1) pode estar associada a um risco aumentado de in- fecção (Yung SC e Murphy PM; frontiers in Immunology, setembro de 2012, vol. 3, Art. 276). Os ligantes CXCR1/2 compartilham um motivo de ELR N-terminal comum que pode servir como um epitopo de liga- ção (descrito na patente Norte-americana 9.783.605). A presença des- ta característica estrutural compartilhada em ligantes CXCR1/2 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 e CXCL8 é um de- safio ao tentar identificar um composto que se ligará seletivamente e inibirá CXCL8 sem interferir com outras quimiocinas ELR-positivas.
[009] Os anticorpos que se ligam a CXCL8, mas não às quimioci- nas CXCL1 ELR-positivas (também conhecida como proteína alfa re- gulada pelo crescimento, GRO-alfa) e CXCL2 (também conhecida co-
mo proteína beta regulada pelo crescimento, GRO-beta) foram identifi- cados (Skov, J Immunol 2008). Os anticorpos monoclonais específicos para CXCL8 até agora não mostraram eficácia em ensaios clínicos que podem estar associados às propriedades farmacológicas desta classe de substâncias, incluindo perfil farmacocinético, biodistribuição e eliminação. Por exemplo, altas taxas de produção de quimiocinas podem resultar em uma rápida saturação de anticorpos terapêuticos e eficácia insuficiente com longos intervalos de dosagem usados rotineiramente. Além disso, os anticorpos podem potencialmente não interferir na ligação das quimiocinas aos glicosaminoglicanos, resul- tando em uma falta de destruição do gradiente de quimiocinas e inibi- ção insuficiente da migração e extravasamento de leucócitos. Os áci- dos nucleicos se ligam preferivelmente aos sítios de ligação de glico- saminoglicanos de proteínas (Obertur, Nat Commun 2015). Assim, ou- tras classes de substâncias, como os ácidos nucleicos, podem ser su- periores para o direcionamento terapêutico de CXCL8.
[0010] Os ácidos nucleicos são sensíveis à degradação por enzi- mas (nucleases) presentes nos fluidos corporais. Esta falta de bioes- tabilidade dificulta a fabricação de medicamentos à base de ácido nu- cleico para o tratamento de um ser humano, bem como a fabricação de agentes de diagnóstico à base de ácido nucleico para a identifica- ção e/ou tratamento de uma doença. As modificações químicas podem aumentar a estabilidade dos ácidos nucleicos, mas podem ser insufici- entes para fornecer estabilidade suficiente para o uso de um medica- mento. Por exemplo, um ácido nucleico com pirimidinas modificadas com 2’-fluoro mostrou uma meia-vida plasmática comparável a um ácido nucleico totalmente de DNA e modificações 2’-O-metila foram necessárias para atingir meias-vidas longas (Kratschmer, Nucleic Acid Ther 2017 ). Macugen, o primeiro aptâmero aprovado para uso tera- pêutico, é estabilizado por uma combinação de 2’-fluoro-pirimidinas, 2’-
O-metil-purinas e um tamponamento em 3’. Além disso, as modifica- ções químicas podem vir com um risco aumentado de efeitos colate- rais quando usadas para a fabricação de um medicamento. Em con- traste, os ácidos nucleicos de configuração L não natural são altamen- te bioestáveis e se mostraram seguros, bem tolerados e eficazes em ensaios clínicos (Ludwig, Leukemia 2017; Menne, Nefrol Dial Trans- plant 2016).
[0011] Aptâmeros de RNA de 2’-fluoro pirimidina de ligação à CXCL8 foram descritos anteriormente (Sung, Biomaterials 2014). No entanto, em ensaios funcionais, a alta afinidade de ligação de um dos aptâmeros descritos, aptâmero 8A-35, não se traduziu em funcionali- dade melhorada com a inibição da migração de neutrófilos induzida por CXCL8 com IC50 > 125 nM. A análise semiquantitativa sugeriu nenhuma ou baixa ligação de um aptâmero precursor às quimiocinas CXCL1 ELR-positivas (também conhecidas como GRO-alfa) e CXCL2 (também conhecidas como GRO-beta).
[0012] O problema subjacente à presente invenção é fornecer uma molécula de ácido nucleico, de preferência um ácido L-nucleico, que interage especificamente com CXCL8, de preferência não interage es- pecificamente com outras quimiocinas ELR-positivas, e mais preferi- velmente deos não com quimiocinas ELR-positivas que ligam-se aos receptores CXCR1 e/ou CXCR2.
[0013] Outro problema subjacente à presente invenção é fornecer uma molécula de ácido nucleico, de preferência uma molécula de áci- do L-nucleico, que se liga a CXCL8 com alta afinidade, permitindo as- sim inibir efetivamente a quimiotaxia estimulada por CXCL8, de prefe- rência com uma constante inibidora na faixa nanomolar de um único dígito, mais preferivelmente na faixa picomolar.
[0014] Um outro problema subjacente à presente invenção é for- necer uma molécula de ácido nucleico, de preferência uma molécula de ácido L-nucleico, para a fabricação de um medicamento para o tra- tamento de doenças humanas e/ou não humanas, em que a doença é caracterizada por CXCL8 ser direta ou indiretamente envolvido no me- canismo patogenético de tal doença, de preferência pelo menos na medida em que antagonizar ou inibir CXCL8 resulta em um efeito tera- pêutico.
[0015] Um outro problema subjacente à presente invenção é for- necer uma molécula de ácido nucleico, de preferência uma molécula de ácido L-nucleico, para a fabricação de um agente de diagnóstico para a identificação, diagnóstico e/ou tratamento de uma doença, em que a doença é caracterizada por CXCL8 estando direta ou indireta- mente envolvido no mecanismo patogenético dessa doença.
[0016] Este e outros problemas subjacentes à presente invenção são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes anexas. As Modalidades preferidas podem ser tiradas das reivindicações de- pendentes.
[0017] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um primeiro aspecto por uma molécula de ácido L-nucleico capaz de se ligar à CXCL8 humana, em que a molé- cula de ácido L-nucleico compreende um trecho central de nucleotí- deos, em que o trecho central de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG-3’ [SEQ. ID. NO: 27], em que XU é U ou ausente.
[0018] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um segundo aspecto por uma molécula de ácido L-nucleico do primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.
[0019] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto por uma molécula de áci- do L-nucleico do primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, para uso em um método para detectar CXCL8.
[0020] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um quarto aspecto por uma molécula de áci- do L-nucleico do primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, para a fabricação de um meio de detecção ou um biossensor.
[0021] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um quinto aspecto por uma composição far- macêutica que compreende uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma e, opcionalmente, um outro constituinte, em que o outro consti- tuinte é selecionado a partir de o grupo compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável, um transportador farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo.
[0022] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um sexto aspecto pelo uso de uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qual- quer Modalidade da mesma, para a fabricação de um medicamento.
[0023] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um sétimo aspecto pelo uso de uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qual- quer Modalidade da mesma, para a fabricação de um diagnóstico, meio de diagnóstico ou um biossensor.
[0024] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um oitavo aspecto pelo uso de uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qual- quer Modalidade do mesmo, para a detecção de CXCL8, de preferên- cia CXCL8 humana.
[0025] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um nono aspecto por um kit para a detecção de CXCL8, em que o kit compreende uma molécula de ácido L- nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modali- dade da mesma, e pelo menos uma instrução folheto ou um vaso de reação.
[0026] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um décimo aspecto por um método para a detecção de CXCL8 usando o ácido L-nucleico conforme definido de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo, em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer uma amostra com concentração desconhecida de CXCL8; b) colocar a amostra ou uma diluição da mesma em contato com um meio de diagnóstico, meio de diagnóstico ou biossensor con- forme definido no sétimo aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo; c) medir o sinal com um meio de diagnóstico ou biossensor conforme definido no sétimo aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo; d) opcionalmente, comparar o sinal com uma referência; opcionalmente, a concentração de CXCL8 em uma amostra com con- centração de CXCL8 desconhecida é determinada por comparação com sinais obtidos de pelo menos uma amostra com concentração de CXCL8 conhecida, de preferência a pelo menos uma amostra com uma concentração de CXCL8 conhecida está sujeita às etapas b) a c) .
[0027] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um décimo primeiro aspecto por um complexo compreendendo uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma e CXCL8,
em que preferivelmente o complexo é um complexo cristalino.
[0028] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um décimo segundo aspecto por um método para o rastreamento de um antagonista de uma atividade mediada por CXCL8 compreendendo as seguintes etapas: - fornecer um antagonista candidato da atividade mediada por CXCL8, - fornecer uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, - fornecer um sistema de teste que fornece um sinal na pre- sença de um antagonista da atividade mediada por CXCL8, e - determinar se o antagonista candidato da atividade media- da por CXCL8 é um antagonista da atividade mediada por CXCL8.
[0029] Mais especificamente, o problema subjacente à presente invenção é resolvido em um 13º aspecto por um método para a detec- ção de uma molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer uma sonda de captura, em que a sonda de cap- tura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, inclu- indo qualquer Modalidade da mesma, e uma sonda de detecção, em que a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, ou, alter- nativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente comple- mentar a uma segunda parte da molécula de ácido L-nucleico de acor- do com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo, e a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo; b) adicionar a sonda de captura, e a sonda de detecção se- paradamente ou combinadas a uma amostra contendo a molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma, ou presumivelmente conter a molécula de áci- do L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade da mesma; c) permitir que a sonda de captura, e a sonda de detecção reajam simultaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com a molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, in- cluindo qualquer Modalidade do mesmo; d) detectar opcionalmente se a sonda de captura é ou não hibridizada com a molécula de ácido L-nucleico de acordo com o pri- meiro aspecto, incluindo qualquer Modalidade do mesmo, fornecida na etapa a); e e) detectar o complexo formado na etapa c) que consiste na molécula de ácido L-nucleico de acordo com o primeiro aspecto, inclu- indo qualquer Modalidade da mesma, e a sonda de captura, e a sonda de detecção.
[0030] A presente invenção também é mais especificamente tam- bém resolvida pelas seguintes Modalidades 1 a 103, em que a Modali- dade 1 corresponde ao primeiro aspecto, a Modalidade 47 correspon- de ao segundo aspecto, a Modalidade 49 corresponde ao terceiro as- pecto, a Modalidade 50 corresponde ao quarto aspecto, Modalidade 51 corresponde ao quinto aspecto, Modalidade 53 corresponde ao sexto aspecto, Modalidade 56 corresponde ao sétimo aspecto, Modali- dade 79 corresponde ao oitavo aspecto, Modalidade 96 corresponde ao nono aspecto, Modalidade 97 corresponde ao décimo aspecto, Mo- dalidade 98 corresponde ao décimo primeiro aspecto, a Modalidade 99 corresponde ao décimo segundo aspecto, e a Modalidade 100 corres-
ponde ao 13º aspecto: Modalidade 1: Uma molécula de ácido L-nucleico capaz de se ligar à CXCL8 humana, em que a molécula de ácido L-nucleico compreende um trecho central de nucleotídeos, em que o trecho central de nucleo- tídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG-3’ [SEQ.
ID.
NO: 27], em que XU é U ou ausente.
Modalidade 2: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 1, em que o trecho central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 28], 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 29], e 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 30]. Modalidade 3: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 2, em que o trecho central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 30] ou 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 28], de preferência 5’ GGAAGUACGUGGAAAG- CCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ.
ID.
NO: 30]. Modalidade 4: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 3, em que a molécula de ácido L-nucleico compreen- de na direção 5’ -> 3’ um primeiro trecho terminal de nucleotídeos, o trecho central de nucleotídeos e um segundo trecho terminal de nucle- otídeos, em que o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende três a seis nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende três a seis nucleotídeos, em que preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende cin- co a seis nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende cinco a seis nucleotídeos, em que mais preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende cin- co nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende cinco nucleotídeos.
Modalidade 5: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 4, em que o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ Z1Z2Z3Z4Z5C 3’, e o segundo trecho ter- minal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos 5’ GZ6Z7Z8Z9Z10 3’, em que Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é K ou ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M ou ausente, Z9 é S ou ausente, e Z10 é C ou ausente; em que preferivelmente a) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou b) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 está ausente; ou c) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou d) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é
S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou e) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou f) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou g) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou h) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 está ausente; ou i) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou j) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou k) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou l) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou m) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 está ausente; ou n) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 está ausente; ou o) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, e Z10 está ausente; ou p) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 está ausente, e Z10 está ausente.
Modalidade 6: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 4 a 5, em que a) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; b) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAGC 3’; ou c) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAGC 3’; d) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’; e) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ UGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCA 3’; f) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCC 3’; g) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGC 3’; h) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGUC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GACC 3’;
i) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ UGGC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCCA 3’; j) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GAC 3’, e o segundo trecho ter- minal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUC 3’; em que preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GU- CAGC 3’ ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’; em que mais preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’ ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’. Modalidade 7: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 6, em que a molécula de ácido L-nucleico compreen- de 40 a 45 nucleotídeos, de preferência 42 a 45 nucleotídeos, mais preferivelmente 42 nucleotídeos.
Modalidade 8: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 7, em que a molécula de ácido L-nucleico consiste em ribonucleotídeos.
Modalidade 9: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 8, em que a molécula de ácido L-nucleico compreen- de uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ.
ID.
NOs: 14 a 26 e 39 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico compreende uma molécula de ácido L-nucleico tendo uma identidade de pelo menos 75 % com a molécula de ácido L-nucleico compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ.
ID.
NOs: 14 a 26 e 39 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico com- preende uma molécula de ácido L-nucleico que é homóloga à molécu- la de ácido L-nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ.
ID.
NOs: 14 a 26 e 39 a 44, em que a homologia é de pelo menos 75 %. Modalidade 10: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 9, em que a molécula de ácido L-nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ.
ID.
NO: 16, SEQ.
ID.
NO: 17, SEQ.
ID.
NO: 25, SEQ.
ID.
NO: 26, SEQ.
ID.
NO: 39, SEQ.
ID.
NO: 40, SEQ.
ID.
NO: 20 e SEQ.
ID.
NOs: 41 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico compreende uma molécula de ácido L-nucleico tendo uma identidade de pelo menos 75 % com a molécula de ácido L- nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ.
ID.
NO: 16, SEQ.
ID.
NO: 17, SEQ.
ID.
NO: 25, SEQ.
ID.
NO: 26, SEQ.
ID.
NO: 39, SEQ.
ID.
NO: 40, SEQ.
ID.
NO: 20 e SEQ.
ID.
NOs: 41 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico com- preende uma molécula de ácido L-nucleico que é homóloga à molécu- la de ácido L-nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ.
ID.
NO: 16, SEQ.
ID.
NO: 17, SEQ.
ID.
NO: 25, SEQ.
ID.
NO: 26, SEQ.
ID.
NO: 39, SEQ.
ID.
NO: 40, SEQ.
ID.
NO: 20 e SEQ.
ID.
NOs 41 a 44, em que a homologia é de pelo menos 75 %. Modalidade 11: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 10, em que a molécula de ácido L-nucleico é capaz de se ligar à CXCL8, em que preferivelmente CXCL8 é CXCL8 huma- na, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cão, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho-da-índia.
Modalidade 12: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 11, em que a molécula de ácido L-nucleico é capaba- le de ligação específica a CXCL8, de preferência CXCL8 humana, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cão, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho-da-índia, mais preferi- velmente CXCL8 humana.
Modalidade 13: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 12, em que a molécula de ácido L-nucleico não se liga a ou é incapaz de se ligar a quimiocinas CXC ELR-positivas dife- rentes de CXCL8, em que quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8 são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7. Modalidade 14: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 13, em que a molécula de ácido L-nucleico não se liga a ou é incapaz de se ligar a quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 humana, em que as quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferen-
tes de CXCL8 humana são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1 humana, CXCL2 humana, CXCL3 humana, CXCL5 humana, CXCL6 humana e CXCL7 humana.
Modalidade 15: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 14, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para CXCL8 humana, expressa como KD, de 10 nM ou menos, de preferência de 1 nM ou menos, e mais preferivel- mente de 100 pM ou menos e mais preferivelmente de 30 pM ou me- nos.
Modalidade 16: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 15, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para CXCL8 humana, expressa como IC50, de 10 nM ou menos, de preferência de 1 nM ou menos, mais preferivelmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos.
Modalidade 17: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 16, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, expressas como KD, de 100 nM ou mais, de preferência de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais.
Modalidade 18: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 17, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, expressas como IC50, de 100 nM ou mais, de preferência de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais.
Modalidade 19: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 18, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para CXCL8 humana, expressa como KD, de 10 nM ou menos, de preferência de 1 nM ou menos, e mais preferivel- mente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou me- nos, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de li-
gação para quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, ex- pressas como KD, de 100 nM ou mais, de preferência de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais, e/ou a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para CXCL8 humana, expressa como IC50, de 10 nM ou menos, de prefe- rência de 1 nM ou menos, mais preferivelmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para quimiocinas CXC ELR-positivas diferente de CXCL8, expressa como IC50, de 100 nM ou mais, preferivelmente de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais.
Modalidade 20: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 15 a 19, em que a afinidade de ligação é determinada à temperatura ambiente, de preferência a 25 °C.
Modalidade 21: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 15 a 19, em que a afinidade de ligação é determinada a 37 °C.
Modalidade 22: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 21, em que a molécula de ácido L-nucleico é um an- tagonista de uma atividade mediada por CXCL8, de preferência CXCL8 humana, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cão, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho-da- índia, mais preferivelmente CXCL8 humana.
Modalidade 23: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 22, em que a molécula de ácido L-nucleico não é um antagonista de quimioci- nas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 humana ou é incapaz de antagonizar uma atividade mediada por quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, em que as quimiocinas CXC ELR- positivas diferentes de CXCL8 são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7. Modalidade 24: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 23, em que a molécula de ácido L-nucleico não é um antagonista de quimioci- nas CXC humanas ELR-positivas diferente de CXCL8 humana ou é incapaz de antagonizar uma atividade mediada por quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferente de CXCL8 humana, em que as qui- miocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 humana são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1 humana, CXCL2 humana, CXCL3 humana, CXCL5 humana, CXCL6 humana e CXCL7 humana.
Modalidade 25: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 22 a 24, em que a atividade antagonista da molécula de ácido L-nucleico para uma atividade mediada por CXCR1 e/ou CXCR2 humano, expressa como IC50, é de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, mais preferivelmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos.
Modalidade 26: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 22 a 25, em que a atividade antagonista da molécula de ácido L-nucleico para uma atividade mediada por CXCL8 humana é determinada a 37 °C.
Modalidade 27: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 26, em que a molécula de ácido L-nucleico compre- ende um grupo de modificação.
Modalidade 28: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 27, em que o grupo de modificação é acoplado ao nucleotídeo do terminal 5’ e/ou ao nucleotídeo do terminal 3’ da molécula de ácido L-nucleico e/ou a um nucleotídeo da molécula de ácido L-nucleico entre o nucleo- tídeo do terminal 5’ da molécula de ácido L-nucleico, e o nucleotídeo do terminal 3’ da molécula de ácido L-nucleico.
Modalidade 29: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 e 28, em que o grupo de modificação é acoplado à molécula de ácido L-nucleico por meio de um ligante.
Modalidade 30: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 29, em que o ligante é um ligante hidrofílico, de preferência o ligante hidrofílico compreende uma ou mais unidades de etileno glicol, mais preferivel- mente o ligante hidrofílico compreende trietileno glicol, hexaetileno gli- col ou polietileno glicol.
Modalidade 31: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 29, em que o ligante é um ligante biodegradável.
Modalidade 32: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 a 31, em que a taxa de excreção da molécula de áci- do L-nucleico que compreende o grupo de modificação de um orga- nismo é diminuída em comparação com a taxa de excreção de um ácido L-nucleico que não compreende o grupo de modificação.
Modalidade 33: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 a 31, em que a molécula de ácido L-nucleico compre- endendo o grupo de modificação tem um tempo de retenção aumenta- do em um organismo em comparação com o tempo de retenção em um organismo de um L-nucleico molécula de ácido que não compre- ende o grupo de modificação.
Modalidade 34: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 32 a 33, em que o organismo é um corpo humano ou animal, de preferência um corpo humano.
Modalidade 35: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 e 34, em que o grupo de modificação é selecionado a partir do grupo que compreende uma modificação biodegradável e uma modificação não biodegradável, de preferência o grupo de modifi- cação é selecionado a partir do grupo que compreende polietileno gli- col, polietileno glicol linear, polietileno glicol ramificado, hidroxietilami-
do, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um esterol, polioxi- propileno, polioxamidato e poli (2-hidroxietil)–L-glutamina.
Modalidade 36: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 35, em que o grupo de modificação é um polietileno glicol, de preferência um polietileno glicol linear ou um polietileno glicol ramificado, em que de preferência o peso molecular do polietileno glicol é de cerca de 20.000 a cerca de 120.000 Da, mais preferivelmente de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da.
Modalidade 37: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 36, em que o peso molecular do polietileno glicol é de cerca de 20.000 a cerca de 120.000 Da, preferivelmente de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da.
Modalidade 38: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 35 em que o grupo de modificação é hidroxietilamido, em que preferivelmente o peso molecular do hidroxietilamido é de cerca de 50 a cerca de 1000 kDa, mais preferivelmente de cerca de 100 a cerca de 700 kDa e mais preferivelmente de 200 a 500 kDa.
Modalidade 39: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 a 31, em que o grupo de modificação é para a imobili- zação da molécula de ácido L-nucleico.
Modalidade 40: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 39, em que a imobilização compreende a ligação covalente da molécula de ácido L-nucleico a uma superfície, em que preferivelmente a superfície é uma superfície de um vaso de reação, uma superfície de um disposi- tivo em um vaso de reação ou uma superfície de um biossensor.
Modalidade 41: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 39, em que a imobilização compreende a ligação não covalente da molécula de ácido L-nucleico a uma superfície, em que preferivelmente a super- fície é uma superfície de um vaso de reação, uma superfície de um dispositivo em um vaso de reação ou uma superfície de um biossen-
sor.
Modalidade 42: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 39 a 41, em que o grupo de modificação é selecionado a partir do grupo que compreende carboxila, hidroxila, fosfatidila, éster sulfônico, amina, tiol, epóxido, alcina, cicloalcina deformada, maleimi- da, azida, hidrazida, em que, de preferência, a cicloalcina deformada é selecionada do grupo que compreende dibenzociclo-octila (DBCO), biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) e azadibenzociclo-octila (ADIBO). Modalidade 43: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 42, em que o grupo de modificação é uma cicloalcina deformada, de preferên- cia dibenzociclo-octila (DBCO). Modalidade 44: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 41, em que o grupo de modificação é biotina, bromo-desoxiuridina, digoxige- nina ou um oligonucleotídeo, de preferência o grupo de modificação é biotina.
Modalidade 45: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 27 a 31, em que o grupo de modificação permite a detec- ção da molécula de ácido L-nucleico, de preferência o grupo de modi- ficação é um marcador.
Modalidade 46: A molécula de ácido L-nucleico da Modalidade 45, em que o marcador é selecionado a partir do grupo que compreende bioti- na, bromo-desoxiuridina, digoxigenina, um oligonucleotídeo, um mar- cador fluorescente, um marcador de eletroquimoluminescência, um marcador radioativo, um marcador enzimático, um rótulo de UV, ouro coloidal, uma nanopartícula e um rótulo de molécula quelante.
Modalidade 47: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 46, para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.
Modalidade 48: A molécula de ácido L-nucleico para uso da Modali- dade 47, em que a doença está associada a um mecanismo patogêni-
co mediado por CXCL8 e/ou é selecionada a partir do grupo que com- preende uma doença inflamatória e câncer, em que, de preferência, a doença inflamatória é uma doença inflamatória do sistema respiratório, uma doença inflamatória da pele, uma doença autoimune, uma doença neurológica inflamatória, uma doença isquêmica, aterosclerose, rejei- ção ao transplante de ilhotas pancreáticas, rejeição ao transplante de órgão, função retardada de órgão, lesão da medula espinhal ou cistite.
Modalidade 49: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 47, para uso em um método para detectar CXCL8. Modalidade 50: A molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 47, para a fabricação de um meio de detecção ou um biossensor.
Modalidade 51: Uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e, opcionalmente, um outro constituinte, em que o outro constituinte é selecionado a partir do grupo que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, um transportador farmaceuti- camente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo.
Modalidade 52: A composição farmacêutica da Modalidade 51, em que a composição farmacêutica compreende uma molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Modalidade 53: Uso de uma molécula de ácido L-nucleico de qual- quer uma das Modalidades 1 a 50, para a fabricação de um medica- mento.
Modalidade 54: Uso da Modalidade 53, em que o medicamento é pa- ra uso na medicina humana ou para uso na medicina veterinária.
Modalidade 55: Uso da Modalidade 54, em que o medicamento é pa- ra o tratamento e/ou prevenção de uma doença que está associada a um mecanismo patogênico mediado por CXCL8 e/ou é selecionado a partir do grupo que compreende uma doença inflamatória e câncer, em que preferivelmente inflamatório doença é uma doença inflamatória do sistema respiratório, uma doença inflamatória da pele, uma doença autoimune, uma doença neurológica inflamatória, uma doença isquê- mica, aterosclerose, rejeição ao transplante de ilhotas pancreáticas, rejeição ao transplante de órgão, função retardada de órgão, lesão da medula espinhal ou cistite.
Modalidade 56: Uso de uma molécula de ácido L-nucleico de qual- quer uma das Modalidades 1 a 50, para a fabricação de um diagnósti- co, um meio de diagnóstico ou um biossensor.
Modalidade 57: Uso da Modalidade 56, em que o diagnóstico ou o meio de diagnóstico tem uma superfície em um recipiente de reação ou uma superfície em um dispositivo em um recipiente de reação.
Modalidade 58: Uso da Modalidade 56, em que o biossensor tem uma superfície.
Modalidade 59: Uso de qualquer uma das Modalidades 56 a 58, em que o diagnóstico, o meio de diagnóstico ou o biossensor é adequado para detectar, direta ou indiretamente, CXCL8, de preferência CXCL8 humana.
Modalidade 60: Uso de qualquer uma das Modalidades 56 a 57, em que CXCL8 é detectada por ligação direta, em um ensaio de ligação em sanduíche ou em um ensaio de ligação competitiva.
Modalidade 61: Uso da Modalidade 60, em que a ligação direta com- preende um método de detecção que usa apenas a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e não usa ou não envolve o uso de uma segunda molécula diferente do ácido L-nucleico molécula de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 que interage com CXCL8. Modalidade 62: Uso da Modalidade 60, em que o ensaio em sanduí- che é um ensaio de hibridização em sanduíche no qual a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 é imobiliza- da na superfície e um complexo da molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e CXCL8 é detectada por um meio de detecção que se liga a (um) epitopo (s) de CXCL8 que são diferentes daquele (s) ligado (s) pela molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 Modalidade 63: Uso da Modalidade 60, em que o ensaio em sanduí- che é um ensaio de hibridização em sanduíche em que um meio que se liga a (um) epitopo (s) de CXCL8 que são diferentes daquele (s) ligado (s) pela molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Mo- dalidades 1 a 50 é imobilizada na superfície, e o complexo de tais meios e CXCL8 é detectada pela molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50. Modalidade 64: Uso da Modalidade 60, em que no ensaio de ligação competitiva a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Mo- dalidades 1 a 50 é imobilizada em uma superfície, e a ligação da mo- lécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 a CXCL8 é competido por sondas oligonucleotídicas pelo menos parci- almente complementares à molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou por CXCL8, de preferência a comple- mentaridade é complementaridade de base, mais preferivelmente com base no emparelhamento de bases de Watson-Crick.
Modalidade 65: Uso da Modalidade 60, em que no ensaio de ligação competitiva a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Mo- dalidades 1 a 50 não é imobilizada em uma superfície, e a ligação da molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 a CXCL8 é competida por sondas oligonucleotídicas complementares à molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou por CXCL8, em que preferivelmente as sondas oligonucleotídi- cas complementares à molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou CXCL8 são imobilizados em uma superfí- cie, de preferência a complementaridade é complementaridade de ba- ses, mais preferivelmente com base no emparelhamento de bases de Watson-Crick.
Modalidade 66: Uso de qualquer uma das Modalidades 62 a 65, em que para imobilização na superfície, a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 39 a 44 é usada.
Modalidade 67: Uso de qualquer uma das Modalidades 57 a 66, em que a superfície, de preferência a superfície do biossensor, é selecio- nada a partir do grupo que consiste em ouro, prata, titânio, zircônio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, tungstênio, molibdênio, platina, alumínio, ferro, aço, cobre, níquel, silício, germânio, fosfeto de índio, arseneto de gálio e um óxido, nitreto ou liga ou mistura dos mesmos, óxido de índio-estanho, carbono vítreo, safira, silicato vitrificado e bo- rato vitrificado.
Modalidade 68: Uso de qualquer uma das Modalidades 57 a 67, em que a superfície, de preferência a superfície do biossensor, é modifi- cada por polilisina, um aminossilano, um epoxissilano, uma nitrocelu- lose, um carboxidextrano, uma nanomembrana de carbono, um óxido de grafeno, uma superfície de carbono, como negro de carbono, uma fibra de carbono, uma placa de carbono, um pano de carbono, um car- vão ativado, um carbono vítreo, carvão, um carvão ativado, um pó de grafite, uma fibra de grafite, um nanotubo de carbono, um fulereno, um carboxila grupo, um grupo azida, um grupo tiol, um grupo hidróxi, um epóxido, maleimida, uma alcina, uma alcina deformada ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 69: Uso da Modalidade 68, em que para a imobilização de uma molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalida- des 39 a 44, a superfície é funcionalizada por uma amina primária, grupo tiol, azida, alcina, alqueno, tetrazina, tetrazol ou cicloalcina de-
formada, em que, de preferência, a cicloalcina deformada é seleciona- da a partir do grupo que compreende dibenzociclo-octila (DBCO), bici- clo[6.1.0]non-4-ina (BCN) ou azadibenzociclo-octila (ADIBO). Modalidade 70: Uso da Modalidade 69, em que para a imobilização de uma molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalida- des 42 a 43, a cicloadição de azida-alcina promovida por cepa é usa- da.
Modalidade 71: Uso de qualquer uma das Modalidades 56 a 70, em que a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 44 a 46 é usada para detecção.
Modalidade 72: Uso de qualquer uma das Modalidades 56 a 71, em que um sistema de detecção do biossensor é baseado em leitura ópti- ca, mudança de massa, índice refratário, carga, tensão superficial e microscopia de força atômica.
Modalidade 73: Uso da Modalidade 72, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na leitura óptica é fluorescência, absor- ção ou luminescência.
Modalidade 74: Uso da Modalidade 72, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na mudança de massa é a microbalança de cristal de quartzo ou sistemas microeletromecânicos.
Modalidade 75: Uso da Modalidade 72, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base no índice refratário é a ressonância de plasmon de superfície, um ressonador de anel ou elipsometria.
Modalidade 76: Uso da Modalidade 72, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na carga é a impedância eletroquímica, voltametria, amperometria, potenciometria, condutividade ou um tran- sistor de efeito de campo.
Modalidade 77: Uso da Modalidade 72, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na tensão de superfície é um biossensor em cantilever.
Modalidade 78: Uso de qualquer uma das Modalidades 56 a 59, em que CXCL8 é detectada por uma configuração de ensaio homogêneo.
Modalidade 79: Uso de uma molécula de ácido L-nucleico de qual- quer uma das Modalidades 1 a 50, para a detecção de CXCL8, de pre- ferência CXCL8 humana.
Modalidade 80: Uso da Modalidade 79, em que CXCL8 é detectada em uma configuração de ensaio de ligação em sanduíche, uma confi- guração de ensaio homogêneo ou uma configuração de ensaio com- petitivo.
Modalidade 81: Uso da Modalidade 80, em que a configuração do en- saio de ligação em sanduíche, a configuração do ensaio homogêneo ou a configuração do ensaio competitivo é adequada para detectar, direta ou indiretamente, CXCL8. Modalidade 82: Uso de qualquer uma das Modalidades 78 a 81, em que a molécula de ácido L-nucleico é covalentemente imobilizada em uma superfície de um vaso de reação de um diagnóstico, na superfície de um dispositivo em um vaso de reação de um diagnóstico ou em uma superfície de um biossensor.
Modalidade 83: Uso da Modalidade 82, em que para imobilização a molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 39 a 44 é usada.
Modalidade 84: Uso de qualquer uma das Modalidades 82 a 83, em que a superfície, de preferência a superfície do biossensor, é selecio- nada do grupo que consiste em ouro, prata, titânio, zircônio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, tungstênio, molibdênio, platina, alumínio, ferro, aço, cobre, níquel, silício, germânio, fosfeto de índio, arseneto de gálio e um óxido, um nitreto ou uma liga ou suas misturas, óxido de índio-estanho, carbono vítreo, safira, um silicato vitrificado e um borato vitrificado.
Modalidade 85: Uso de qualquer uma das Modalidades 82 a 84, em que a superfície, de preferência a superfície do biossensor, é modifi- cada por polilisina, um aminossilano, um epoxissilano, uma nitrocelu- lose, um carboxidextrano, uma nanomembrana de carbono, óxido de grafeno, uma superfície de carbono, como negro de carbono, fibra de carbono, uma placa de carbono, um pano de carbono, um carvão ati- vado, um carbono vítreo, um carvão, um carvão ativado, um pó de gra- fite, uma fibra de grafite, um nanotubo de carbono, um fulereno, um grupo carboxila, um grupo azida, um grupo tiol, um grupo hidróxi, um epóxido, maleimida, uma alcina, uma alcina deformada ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 86: Uso da Modalidade 85, em que para a imobilização de uma molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalida- des 38 a 44, a superfície é funcionalizada por uma amina primária ati- vada, grupo tiol, azida ou cicloalcina deformada, em que preferivel- mente cicloalcina deformada é selecionada do grupo que compreende dibenzociclo-octila (DBCO), biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) ou azadi- benzociclo-octila (ADIBO). Modalidade 87: Uso da Modalidade 86, em que para a imobilização de uma molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Modalida- des 42 a 43, a cicloadição de azida-alcina promovida por cepa é usa- da.
Modalidade 88: Uso de qualquer uma das Modalidades 82 a 87, em que um sistema de detecção do biossensor é baseado em leitura ópti- ca, mudança de massa, índice refratário, carga, tensão superficial e microscopia de força atômica.
Modalidade 89: Uso da Modalidade 88, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na leitura óptica é fluorescência, absor- ção ou luminescência.
Modalidade 90: Uso da Modalidade 85, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na mudança de massa é um sistema de microbalança de cristal de quartzo ou um sistema microeletromecâni- co.
Modalidade 91: Uso da Modalidade 88, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base no índice refratário é a ressonância de plasmon de superfície, um ressonador de anel ou elipsometria.
Modalidade 92: Uso da Modalidade 88, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na carga é a impedância eletroquímica, voltametria, amperometria, potenciometria, condutividade ou um tran- sistor de efeito de campo.
Modalidade 93: Uso da Modalidade 88, em que o sistema de detec- ção do biossensor com base na tensão de superfície é um biossensor em cantilever.
Modalidade 94: Uso de qualquer uma das Modalidades 79 a 81, em que a molécula de ácido L-nucleico compreende um grupo de modifi- cação que permite a detecção da molécula de ácido L-nucleico, de preferência o grupo de modificação é um marcador.
Modalidade 95: Uso da Modalidade 94, em que o marcador é selecio- nado a partir do grupo que compreende biotina, bromo-desoxiuridina, digoxigenina, um oligonucleotídeo, um marcador fluorescente, um marcador de eletroquimoluminescência, um marcador radioativo, um marcador enzimático, um marcador UV, ouro coloidal, uma nanopartí- cula e um rótulo de molécula quelante.
Modalidade 96: Um kit para a detecção de CXCL8, em que o kit com- preende uma molécula de ácido L-nucleico de qualquer uma das Mo- dalidades 1 a 50 e pelo menos um folheto de instruções ou um recipi- ente de reação.
Modalidade 97: Um método para a detecção de CXCL8 usando o áci- do L-nucleico conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer uma amostra com concentração desconhecida de CXCL8; b) colocar a amostra ou uma diluição da mesma em contato com um meio de diagnóstico, meio de diagnóstico ou biossensor, con- forme definido em qualquer uma das Modalidades 56-78; c) medir o sinal com um meio de diagnóstico, meio de diag- nóstico ou biossensor, conforme definido em qualquer uma das Moda- lidades 56-78; d) opcionalmente, comparar o sinal com uma referência; e) opcionalmente, a concentração de CXCL8 em uma amostra com concentração de CXCL8 desconhecida é determinada por comparação com sinais obtidos de pelo menos uma amostra com concentração de CXCL8 conhecida, de preferência a pelo menos uma amostra com concentração de CXCL8 conhecida está sujeita às eta- pas b) a c). Modalidade 98: Um complexo que compreende uma molécula de áci- do L-nucleico de qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e CXCL8, em que preferivelmente o complexo é um complexo cristalino.
Modalidade 99: Método para o rastreamento de um antagonista de uma atividade mediada por CXCL8, que compreende as seguintes etapas: - fornecer um antagonista candidato da atividade mediada por CXCL8, - fornecer uma molécula de ácido L-nucleico, conforme defi- nido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50, - fornecer um sistema de teste que fornece um sinal na pre- sença de um antagonista da atividade mediada por CXCL8, e - determinar se o antagonista candidato da atividade media- da por CXCL8 é um antagonista da atividade mediada por CXCL8. Modalidade 100: Um método para a detecção de um ácido L-nucleico conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer uma sonda de captura, em que a sonda de cap- tura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 e uma sonda de detecção, em que a sonda de de- tecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50, ou, alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da mo- lécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50, e a sonda de detecção é pelo menos parcialmen- te complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L- nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50; b) adicionar a sonda de captura, e a sonda de detecção se- paradamente ou combinadas a uma amostra contendo a molécula de ácido L-nucleico conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou presumivelmente conter a molécula de ácido L-nucleico con- forme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50; c) permitir que a sonda de captura, e a sonda de detecção reajam simultaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com a molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou parte da mesma; d) detectar opcionalmente se a sonda de captura é ou não hibridizada com a molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 fornecidas na etapa a); e e) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo na molécula de ácido L-nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50, e a sonda de captura, e a sonda de detecção.
Modalidade 101: O método da Modalidade 100, em que a sonda de detecção compreende um meio de detecção e/ou em que a sonda de captura é imobilizada em um suporte, de preferência um suporte sóli- do. Modalidade 102: O método da Modalidade 100 ou 101, em que qual- quer sonda de detecção que não faz parte do complexo formado na etapa c) é removida da reação de modo que na etapa e) apenas uma sonda de detecção que faz parte do complexo é detectada. Modalidade 103: O método de qualquer uma das Modalidades 100 a 102, em que a etapa e) compreende a etapa de comparar o sinal ge- rado pelos meios de detecção quando a sonda de captura, e a sonda de detecção são hibridizadas na presença da molécula de ácido L- nucleico conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50 ou parte das mesmas, e na ausência da referida molécula de ácido L- nucleico, conforme definido em qualquer uma das Modalidades 1 a 50.
[0031] Embora não desejando ser limitados por qualquer teoria, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que a molécu- la de ácido L-nucleico bioestável de acordo com a presente invenção se liga especificamente e com alta afinidade a CXCL8 humana, inibin- do assim efetivamente a ligação de CXCL8 aos seus receptores. Sur- preendentemente, os inventores identificaram uma molécula de ácido nucleico que se liga especificamente e inibe CXCL8, mas não se liga e inibe, respectivamente, quimiocinas relacionadas CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7, embora essas proteínas comparti- lhem características estruturais com CXCL8 como o motivo de ELR. A afinidade mostrada na faixa picomolar, e a alta seletividade do nuclei- co de ligação à CXCL8 não puderam ser previstas.
[0032] Em particular, os presentes inventores descobriram surpre- endentemente que a molécula de ácido nucleico de acordo com a pre- sente invenção é adequada para bloquear a interação de CXCL8 com seus receptores e inibe a quimiotaxia induzida por CXCL8 com uma constante inibidora na faixa picomolar. Na medida em que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também pode ser vista como um antagonista dos efeitos de CXCL8, em particular os efeitos de CXCL8 em seus receptores CXCR1 e/ou CXCR2. Como preferivelmente usado neste documento, um antagonista de CXCL8 é uma molécula que se liga a CXCL8 - tal como as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção- e inibe a função de CXCL8, de preferência em um ensaio in vitro conforme descrito nos Exemplos ou em um modelo in vivo.
[0033] Está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é um ácido nucleico. Na medida em que os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui de maneira sinônima, se não houver indicação em contrário. Além disso, esse (s) ácido (s) nucleico (s) é/são de preferên- cia também aqui referido (s) como a (s) molécula (s) de ácido nucleico de acordo com a (presente) invenção, o (s) ácido (s) nucleico (s) de acordo com a presente invenção, o (s) ácido (s) nucleico (s) inventivo (s) ou a (s) molécula (s) de ácido nucleico da invenção.
[0034] As características dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento, podem ser realizadas em qualquer aspecto da presente invenção, incluindo qual- quer Modalidade da mesma, onde o ácido nucleico é usado, sozinho ou em qualquer combinação. Deve ser reconhecido que qualquer Mo- dalidade de um aspecto da presente invenção é também uma Modali- dade de cada um e qualquer outro aspecto da presente invenção. Mais especificamente, qualquer Modalidade do primeiro aspecto da presen- te invenção é também uma Modalidade de cada um dos segundo, ter- ceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo pri- meiro, décimo segundo e 13º aspecto.
[0035] Quanto às várias doenças, condições e distúrbios que po- dem ser tratados ou prevenidos usando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e composições, de preferência composições farmacêuticas compreendendo as mesmas, deve-se re- conhecer que tais doenças, condições e distúrbios são preferivelmente aqueles que são descritos neste documento, incluindo e em particular aqueles descritos e apresentados na parte introdutória do presente pedido. Na medida em que as respectivas passagens do relatório des- critivo, e a parte introdutória do relatório descritivo formam uma parte integrante da presente descrição ensinando a adequação da molécula de ácido nucleico da presente invenção para a prevenção e tratamen- to, respectivamente, para as referidas doenças, condições e distúrbios. Além disso, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é preferida se o efeito fisiológico do eixo de receptor CXCL8 - CXCR1 e receptor CXCL8 - CXCR2 estiver relacionado a níveis plas- máticos mais elevados de CXCL8.
[0036] Como usado de preferência aqui, o termo CXCL8 refere-se a qualquer CXCL8 incluindo, mas não se limitando a, CXCL8 de mamí- fero. De preferência, a CXCL8 de mamífero é selecionado a partir do grupo que compreende CXCL8 humano, de macaco, coelho, porco, cão, ovelha, peixe-zebra e porquinho-da-índia. Mais preferivelmente, a CXCL8 é CXCL8 humana, preferivelmente possuindo a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No 2.
[0037] Conforme descrito em mais detalhes nas reivindicações e no exemplo 1, os presentes inventores podem, surpreendentemente, identificar uma série de diferentes moléculas de ácido nucleico que podem se ligar à CXCL8 humana.
[0038] Conforme descrito em mais detalhes neste documento, os presentes inventores identificaram uma série de diferentes moléculas de ácido nucleico CXCL8 capazes de se ligar à CXCL8 humana, pelo que as moléculas de ácido nucleico podem ser caracterizadas em ter- mos de trechos de nucleotídeos que também são referidos aqui como descritos (veja, Exemplo 1).
[0039] Cada um dos diferentes tipos de molécula de ácido nucleico de ligação à CXCL8 da invenção que se liga a CXCL8 compreende três trechos diferentes de nucleotídeos: um primeiro trecho terminal de nucleotídeos, um trecho central de nucleotídeos e um segundo trecho terminal de nucleotídeos. Em geral, uma molécula de ácido nucleico de ligação à CXCL8 da presente invenção compreende em sua extre- midade 5’ e na extremidade 3’ cada um dos trechos terminais de nu- cleotídeos, ou seja, o primeiro trecho terminal de nucleotídeos e/ou um segundo trecho terminal de nucleotídeos (também referido como tre- cho 5’-terminal de nucleotídeos e trecho 3’-terminal de nucleotídeos, respectivamente). O primeiro trecho terminal de nucleotídeos, e o se- gundo trecho terminal de nucleotídeos podem, em princípio, devido à sua complementaridade de bases, hibridizar entre si, pelo que após a hibridização uma estrutura de fita dupla é formada. No entanto, essa hibridação não é necessariamente realizada na molécula em condi- ções fisiológicas e/ou não fisiológicas. Os três trechos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico de ligação de CXCL8 - o primeiro tre- cho terminal de nucleotídeos, o trecho central de nucleotídeos, e o se- gundo trecho terminal de nucleotídeos - são arranjados uns aos outros na direção 5’  3’: o primeiro trecho terminal de nucleotídeos - o tre- cho central dos nucleotídeos - o segundo trecho terminal dos nucleotí- deos. Alternativamente, o segundo trecho terminal de nucleotídeos, o trecho central de nucleotídeos, e o primeiro trecho terminal de nucleo- tídeos são arranjados entre si na direção 5’  3’.
[0040] O comprimento da extensão central de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é de preferência 32 ou 33 nucleotídeos.
[0041] O comprimento do primeiro trecho terminal de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é entre três e seis nucleotídeos, preferivelmente entre cinco e seis nucleotídeos, mais preferivelmente cinco nucleotídeos.
[0042] O comprimento do segundo trecho terminal de nucleotídeos do nucleotídeo de acordo com a presente invenção é entre três e seis nucleotídeos, preferivelmente entre cinco e seis nucleotídeos, mais preferivelmente cinco nucleotídeos.
[0043] Os termos ‘trecho’ e ‘trecho de nucleotídeos’ são usados aqui de maneira sinônima, se não for indicado o contrário.
[0044] As diferenças nas sequências dos trechos definidos entre as diferentes moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8 podem influenciar a afinidade de ligação à CXCL8. Com base na análise de ligação das diferentes moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8 da presente invenção, o trecho central e os nucleotídeos que as formam são individualmente e mais preferivelmente em sua totali- dade essenciais para a ligação da molécula de ácido nucleico de liga- ção à CXCL8 a CXCL8.
[0045] Em uma Modalidade preferida, a molécula de ácido nuclei- co de acordo com a presente invenção é uma única molécula de ácido nucleico. Em uma outra Modalidade, a única molécula de ácido nuclei- co está presente como uma multidão da única molécula de ácido nu- cleico ou como uma multidão das espécies de molécula de ácido nu- cleico única.
[0046] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção consiste preferi- velmente em nucleotídeos que estão covalentemente ligados uns aos outros, preferivelmente através de ligações ou ligações fosfodiéster.
[0047] Está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende dois ou mais trechos ou parte (s) dos mesmos que podem, em princípio, hibridizar uns com os outros. Após tal hibridação, uma estrutura de fita dupla é formada. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que tal hibridação pode ou não ocorrer, particularmente em condições in vitro e/ou in vivo. Além disso, no caso de hibridização, tal hibridação não ocorre necessariamente ao longo de todo o comprimento dos dois tre- chos onde, pelo menos com base nas regras de emparelhamento de bases, tal hibridação e, portanto, a formação de uma estrutura de fita dupla pode, em princípio, ocorrer. Como preferivelmente usado neste documento, uma estrutura de fita dupla é uma parte de uma molécula de ácido nucleico ou uma estrutura formada por duas ou mais fitas se- paradas ou dois trechos separados espacialmente de uma fita simples de uma molécula de ácido nucleico, em que pelo menos um, de prefe- rência dois ou existem mais pares de bases que são emparelhamento de bases de preferência de acordo com as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Será também reconhecido por alguém ver- sado na técnica que outro emparelhamento de bases, como o empare- lhamento de bases de Hoogsten, pode existir ou pode formar tal estru- tura de fita dupla. Deve-se também reconhecer que a característica de que dois trechos hibridizam de preferência indica que tal hibridização é assumida como ocorrendo devido à complementaridade de base dos dois trechos, independentemente de tal hibridização realmente ocorrer in vivo e/ou in vitro. Em conexão com a presente invenção, tais trechos são o primeiro trecho terminal de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos que, em uma Modalidade, podem hibridizar como definido acima.
[0048] Em uma Modalidade preferida, o termo arranjo quando usado neste documento, significa a ordem ou sequência de caracterís- ticas ou elementos estruturais ou funcionais descritos neste documen- to em conexão com a (s) molécula (s) de ácidos nucleicos aqui descri- ta (s).
[0049] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também deve compreender ácidos nucleicos que são essen- cialmente homólogos às sequências particulares aqui descritas. O termo substancialmente homólogo deve ser entendido como a homo- logia é de pelo menos 75 %, preferivelmente 85 %, mais preferivel- mente 90 % e mais preferivelmente mais que 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %.
[0050] A porcentagem real de nucleotídeos homólogos presentes na molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção de- penderá do número total de nucleotídeos presentes na molécula de ácido nucleico. A modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes na molécula de ácido nucleico.
[0051] A homologia entre duas moléculas de ácido nucleico pode ser determinada como conhecido pelo especialista na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequência pode ser usado para calcular a homologia de sequência percentual para a (s) sequência (s) de teste em relação à sequência de referência, com ba- se nos parâmetros de programa designados. A sequência de teste é de preferência a sequência ou molécula de ácido nucleico que se diz ser homóloga ou a ser testada se é homóloga e, em caso afirmativo, em que medida, a uma molécula de ácido nucleico diferente, pelo que essa molécula de ácido nucleico diferente também é referida como a sequência de referência. Em uma Modalidade, a sequência de refe- rência é uma molécula de ácido nucleico conforme descrito neste do- cumento, de preferência uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de acordo com qualquer um das SEQ. ID. NOs: 14 a 26 e 39 a 44, de preferência SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 25 e SEQ. ID. NO: 26, SEQ. ID. NO: 39, SEQ. ID. NO: 40, SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NOs: 41 a 44. O alinhamento ideal de sequên- cias para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algorit- mo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman,
1981) pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) pelo método de busca por simi- laridade de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), por imple- mentações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual.
[0052] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para deter- minar a porcentagem de identidade de sequência é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básica (doravante “BLAST”), veja, por exemplo, Altschul et al (Altschul et al. 1990 e Al- tschul et al, 1997). O software para realizar análises por BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (doravante denominado “NCBI”). Os parâmetros padrão usados na determinação da identidade de sequência usando o softwa- re disponível no NCBI, por exemplo, BLASTN (para sequências de nu- cleotídeos) e BLASTP (para sequências de aminoácidos) são descritos em McGinnis et al (McGinnis et al., 2004).
[0053] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também deve compreender uma molécula de ácido nucleico que tem um certo grau de identidade em relação aos ácidos nucleicos descritos e descritos aqui e definidos por sua sequência de nucleotí- deos. Mais preferivelmente, a presente invenção também compreende uma molécula de ácido nucleico que tem uma identidade de pelo me- nos 75 %, preferivelmente 85 %, mais preferivelmente 90 % e mais preferivelmente mais de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em relação a uma molécula de ácido nucleico descrita e descrita aqui e definida por sua sequência de nucleotídeos ou uma parte dela.
[0054] O termo ácido nucleico inventivo ou molécula de ácido nu- cleico de acordo com a presente invenção deve também compreender uma molécula de ácido nucleico compreendendo as sequências de ácidos nucleicos descritas ou descritas aqui ou parte das mesmas, de preferência na medida em que a molécula de ácido nucleico ou as re- feridas partes estão envolvidas na ligação à CXCL8 humana. Tal ácido nucleico é, em uma Modalidade, uma das moléculas de ácido nucleico descritas ou descritas aqui, ou um derivado e/ou um metabólito do mesmo, em que tal derivado e/ou metabólito é de preferência uma mo- lécula de ácido nucleico truncada em comparação com as moléculas de ácido nucleico descritas ou descritas aqui. O truncamento pode es- tar relacionado a uma ou ambas as extremidades das moléculas de ácido nucleico conforme descrito ou descrito aqui. Além disso, o trun- camento pode estar relacionado à sequência interna de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico, isto é, pode estar relacionado ao (s) nucleotídeo (s) entre os nucleotídeos 5’ e 3’ terminais, respectivamen- te. Além disso, o truncamento deve compreender a deleção de apenas um único nucleotídeo da sequência dos ácidos nucleicos aqui descri- tos. O truncamento também pode estar relacionado a mais de um tre- cho do (s) ácido (s) nucleico (s) descrito (s) ou descrito (s) neste do- cumento, em que o trecho pode ter apenas um nucleotídeo de com- primento. A ligação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser determinada por aqueles versados na técnica usando experiências de rotina ou usando ou adotando um mé- todo como aqui descrito, de preferência como aqui descrito na parte do exemplo.
[0055] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser uma molécula de ácido D-nucleico ou uma molécu- la de ácido L-nucleico. De preferência, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido L-nucleico.
[0056] Também está dentro da presente invenção que, em uma Modalidade, cada uma das moléculas de ácido nucleico aqui descritas em sua totalidade em termos de sua (s) sequência (s) de ácido nuclei- co é limitada à (s) sequência (s) de nucleotídeos indicada (s) em parti- cular. Em outras palavras, os termos “compreendendo” ou “compreen- de (r)” devem ser interpretados em tal Modalidade no significado de conter ou consistir em.
[0057] Também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção faz parte de uma molécula de ácido nucleico mais longa em que este ácido nuclei- co mais longo compreende várias partes em que pelo menos uma dessas partes é um ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção, ou um parte dele. A (s) outra (s) parte (s) de tal molécula de ácido nucleico mais longa pode ser uma ou várias moléculas de ácido D- nucleico ou uma ou várias moléculas de ácido L-nucleico. Qualquer combinação pode ser usada em conexão com a presente invenção. Esta (s) outra (s) parte (s) da molécula de ácido nucleico mais longa, sozinhas ou em conjunto, na sua totalidade ou em uma combinação particular, podem exibir uma função que é diferente da ligação, de pre- ferência da ligação à CXCL8. Uma função possível é permitir a intera- ção com outras moléculas, pelo que tais outras moléculas são preferi- velmente diferentes de CXCL8, tal como, por exemplo, para imobiliza- ção, reticulação, detecção ou amplificação. Em uma outra Modalidade da presente invenção, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção compreende, como porções individuais ou combinadas, vá- rias das moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Essa mo- lécula de ácido nucleico compreendendo vários dos ácidos nucleicos da presente invenção também é abrangida pelo termo ácido nucleico mais longo.
[0058] Um ácido L-nucleico como aqui utilizado é um ácido nuclei- co ou molécula de ácido nucleico consistindo em L-nucleotídeos, de preferência consistindo completamente em L-nucleotídeos.
[0059] Um ácido D-nucleico, tal como aqui utilizado, é ácido nu- cleico ou molécula de ácido nucleico consistindo em D-nucleotídeos, de preferência consistindo completamente em D-nucleotídeos.
[0060] Os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui de uma maneira intercambiável, se não for explicitamente indicado o contrário.
[0061] Além disso, se não for indicado o contrário, qualquer se- quência de nucleotídeos é aqui apresentada na direção 5’  3’.
[0062] Como preferivelmente usado aqui, qualquer posição de um nucleotídeo é determinada ou referida em relação à extremidade 5’ de uma sequência, um trecho ou um subtrecho contendo tal nucleotídeo. Por conseguinte, um segundo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 5’ da sequência, trecho e subtrecho, respectivamente. Além disso, de acordo com o mesmo, um penúltimo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 3’ de uma sequência, trecho e subtrecho, respectivamente.
[0063] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em ribonucleotídeos, em que G é guanosina-5’-monofosfato, C é citidina 5’-monofosfato, A é adenosina-5’-monofosfato, U é uridina-5’ monofosfato.
[0064] Para a definição de motivos de sequência de ribonucleotí- deos, as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos são usadas: S forte G ou C; W fraco A ou U (T); R purina G ou A; Y pirimidina C ou U (T); K ceto G ou U (T); M imino A ou C;
B não A C ou U (T) ou G; D não C A ou G ou U (T); H não G A ou C ou U (T); V não U A ou C ou G; N todos A ou G ou C ou U (T)
[0065] Projetar a molécula de ácido nucleico da invenção como uma molécula de ácido L-nucleico é vantajoso por várias razões. As moléculas de ácido L-nucleico são enantiômeros de moléculas de áci- do nucleico de ocorrência natural. As moléculas de ácido D-nucleico, no entanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e particular- mente em sistemas biológicos ou amostras biológicas devido à pre- sença generalizada de nucleases. Nucleases de ocorrência natural, particularmente nucleases de células animais não são capazes de de- gradar ácidos L-nucleicos. Por causa disso, a meia-vida biológica de uma molécula de ácido L-nucleico é significativamente aumentada em tal sistema, incluindo o corpo animal e humano. Devido à falta de de- gradabilidade das moléculas de ácido L-nucleico, nenhum produto de degradação de nuclease é gerado e, portanto, nenhum efeito colateral resultante é observado em tal sistema, incluindo o corpo animal e hu- mano. Este aspecto distingue as moléculas de ácido L-nucleico de to- dos os outros compostos que são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios envolvendo a presença de CXCL8. Uma molécula de ácido L-nucleico que se liga especificamente a uma molécula alvo através de um mecanismo diferente do emparelhamento de bases de Watson Crick, ou um aptâmero que consiste parcial ou totalmente em L- nucleotídeos, particularmente com aquelas partes do aptâmero sendo envolvidas na ligação do aptâmero para a molécula alvo, também é chamado de spiegelmer. Aptâmeros e spiegelmers como tais são co- nhecidos por uma pessoa versada na técnica e são, entre outros, des- critos em “The Aptamer Handbook” (eds. Klussmann, 2006).
[0066] Também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico da invenção, independentemente de estar presente como uma molécula de ácido D-nucleico, molécula de ácido L ou D- nucleico, molécula de ácido L-nucleico, pode estar presente como uma molécula de ácido nucleico de fita simples ou dupla molécula de ácido. Normalmente, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico de fita simples que exibe uma estrutura secundária definida devido à sua sequência primária e pode, portanto, também formar uma estrutura terciária. A molécula de ácido nucleico, no entanto, também pode ser de fita dupla no sentido de que duas fitas que são comple- mentares ou parcialmente complementares uma à outra são hibridiza- das uma com a outra.
[0067] A molécula de ácido nucleico da invenção pode ser modifi- cada. Tal modificação pode estar relacionada ao único nucleotídeo da molécula de ácido nucleico e é bem conhecida na técnica. Exemplos de tais modificações são descritos por, entre outros, Venkatesan et al. (Venkatesan et al., 2003) e Kusser (Kusser, 2000). Tal modificação pode ser um átomo de H, um átomo de F ou grupo O-CH3 ou grupo NH2 na posição 2’ de um, vários de todos os nucleotídeos individuais dos quais consiste a molécula de ácido nucleico. Além disso, a molé- cula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode com- preender pelo menos um nucleotídeo de LNA. Em uma Modalidade, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção con- siste em nucleotídeos de LNA.
[0068] Em uma Modalidade, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser uma molécula de ácido nu- cleico multipartida. Uma molécula de ácido nucleico multipartida, como aqui utilizada, é uma molécula de ácido nucleico que consiste em pelo menos duas fitas de ácido nucleico separadas. Estas pelo menos duas fitas de ácido nucleico formam uma unidade funcional em que a unida-
de funcional é um ligante para uma molécula alvo e, de preferência, um antagonista para a molécula alvo, no presente caso de CXCL8. As pelo menos duas fitas de ácido nucleico podem ser derivadas de qual- quer uma das moléculas de ácido nucleico da invenção clivando uma molécula de ácido nucleico da invenção para gerar pelo menos duas fitas ou sintetizando uma molécula de ácido nucleico correspondente a uma primeira parte da molécula de ácido nucleico de tamanho natural da invenção e outra molécula de ácido nucleico correspondendo a ou- tra parte da molécula de ácido nucleico de tamanho natural da inven- ção. Dependendo do número de partes que formam as moléculas de ácido nucleico de tamanho natural, o número correspondente de par- tes com a sequência de nucleotídeos necessária será sintetizado. De- ve-se reconhecer que tanto a abordagem de clivagem quanto a abor- dagem de síntese podem ser aplicadas para gerar uma sequência de nucleotídeos multipartida molécula de ácido onde há mais de duas fi- tas, conforme exemplificado acima. Em outras palavras, as pelo me- nos duas fitas de ácido nucleico separadas são tipicamente diferentes de duas fitas sendo complementares e hibridizando uma com a outra, embora um certo grau de complementaridade entre as referidas pelo menos duas fitas de ácido nucleico separadas possa existir e pelo qual tal complementaridade pode resultar no hibridização das referidas ca- deias separadas.
[0069] Finalmente, está também dentro da presente invenção que uma estrutura totalmente fechada, isto é, circular para a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é realizada, isto é, que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é fechada em uma Modalidade, de preferência através de um ligação covalente, pelo que mais preferivelmente tal ligação covalente é feita entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ da sequência de ácido nu- cleico da molécula de ácido nucleico da invenção como aqui descrita ou qualquer derivado desta.
[0070] Uma possibilidade para determinar as constantes de liga- ção de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente in- venção é a utilização dos métodos descritos nos exemplos 3 e 4, que confirmam a descoberta acima de que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção exibe uma faixa de valores de KD fa- vorável. Uma medida apropriada para expressar a intensidade da liga- ção entre a molécula de ácido nucleico individual, e o alvo que é no presente caso CXCL8 é o chamado valor de KD que, como tal, também o método para sua determinação é conhecido por aquele versado na técnica.
[0071] De preferência, o valor de KD mostrado pelos ácidos nuclei- cos de acordo com a presente invenção é inferior um 1 µM. Diz-se que um valor de KD de cerca de 1 µM é característico de uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo. Como será reconhecido por aqueles versados na técnica, o valor de KD de um grupo de com- postos, tal como a molécula de ácido nucleico de acordo com a pre- sente invenção, está dentro de uma certa faixa. A KD acima menciona- do de cerca de 1 µM é um limite superior preferido para o valor de KD. O limite inferior para a KD de ácidos nucleicos de ligação ao alvo pode ser tão pequeno quanto cerca de 10 picomolar ou pode ser mais alto. Está dentro da presente invenção que os valores de KD de ácidos nu- cleicos individuais que se ligam a CXCL8 estão preferivelmente dentro desta faixa. Os intervalos preferidos podem ser definidos escolhendo qualquer primeiro número dentro deste intervalo e qualquer segundo número dentro deste intervalo. Os valores de KD superiores preferidos são 250 nM, 100 nM e 20 nM, os valores de KD inferiores preferidos são 10 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior e 30 pM ou inferior. O valor de KD superior mais preferido é 20 nM, o valor de KD inferior mais preferido é 30 pM ou inferior.
[0072] Além das propriedades de ligação da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, a molécula de ácido nu- cleico de acordo com a presente invenção inibe a função da respectiva molécula alvo que é no presente caso CXCL8. A inibição da função de CXCL8 - por exemplo, a estimulação dos respectivos receptores con- forme descrito anteriormente - é alcançada por uma ligação da molé- cula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção a CXCL8 e formando um complexo de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e CXCL8. Tal complexo de uma molécula de ácido nucleico e CXCL8 não pode estimular os receptores que nor- malmente são estimulados por CXCL8, ou seja. CXCL8 que não está presente em um complexo com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Consequentemente, a inibição da função do receptor por uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é independente do respectivo receptor que pode ser estimulado por CXCL8, mas resulta da prevenção a estimulação do receptor por CXCL8 por uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[0073] Uma possibilidade de determinar a constante inibidora da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é o uso dos métodos descritos no exemplo 5 que confirma a descoberta acima de que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção exibe uma constante inibidora favorável que permite que uti- lização dos referidos ácidos nucleicos num esquema de tratamento terapêutico. Uma medida apropriada para expressar a intensidade do efeito inibidor da molécula de ácido nucleico individual na interação do alvo que é no presente caso CXCL8, e o respectivo receptor, é a cha- mada metade da concentração inibidora máxima (abr. IC50) o qual, como tal, também o método para a sua determinação é conhecido da pessoa versada na técnica.
[0074] De preferência, o valor de IC50 mostrado por uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é inferior um 1 µM. Diz-se que um valor de IC50 de cerca de 1 µM é característico de uma inibição não específica de funções alvo por uma molécula de áci- do nucleico. Como será reconhecido pelos versados na técnica, o va- lor de IC50 de um grupo de compostos, tais como as moléculas de áci- do nucleico de acordo com a presente invenção, está dentro de uma certa faixa. A IC50 acima mencionada de cerca de 1 µM é um limite su- perior preferido para o valor de IC50. O limite inferior para a IC50 de uma molécula de ácido nucleico de ligação ao alvo pode ser tão pe- queno quanto cerca de 10 picomolar ou pode ser maior. Está dentro da presente invenção que os valores de IC50 de ácidos nucleicos indi- viduais que se ligam a CXCL8 estão preferivelmente dentro desta fai- xa. Os intervalos preferidos podem ser definidos escolhendo qualquer primeiro número dentro deste intervalo e qualquer segundo número dentro deste intervalo. Os valores de IC50 superiores preferidos são 250 nM e 100 nM e 20 nM, os valores de IC50 inferiores preferidos são 10 nM ou abaixo, 1 nM ou abaixo, 500 pM ou abaixo e 260 pM ou abaixo. O valor de IC50 superior mais preferido é 20 nM, o valor de IC50 inferior mais preferido é 260 pM ou inferior.
[0075] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ter qualquer comprimento, desde que ainda sejam ca- pazes de se ligar à molécula alvo. Será reconhecido na arte que exis- tem comprimentos preferidos da molécula de ácido nucleico de acordo com as presentes invenções. Normalmente, o comprimento é entre 15 e 120 nucleotídeos. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que qualquer número inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possí- vel para a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente in- venção. Intervalos mais preferidos para o comprimento da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção são comprimentos de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 38 a 45 nucleotídeos e cerca de 40 a 45 nucleotídeos.
[0076] Está dentro da presente invenção que uma molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma fração que pre- ferivelmente é uma porção de alto peso molecular e/ou que preferivel- mente permite modificar as características da molécula de ácido nu- cleico em termos de, entre outros, tempo de residência no corpo ani- mal, de preferência o corpo humano. Uma Modalidade particularmente preferida de tal modificação é a PEGuilação e HESilação de uma mo- lécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Quando aqui usado, PEG significa poli (etileno glicol) e HES para hidroxietila- mido. A PEGuilação como preferivelmente usada aqui é a modificação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção em que tal modificação consiste em uma porção de PEG que está ligada a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. HESilação, quando preferivelmente aqui usada, é a modifi- cação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em que tal modificação consiste em uma porção HES que está ligada a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presen- te invenção. Estas modificações, bem como o processo de modifica- ção de uma molécula de ácido nucleico usando tais modificações, são descritas nos pedidos de patente EP 1 306 382 e WO2018099600A1, cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade por referência.
[0077] No caso de o PEG ser essa porção de peso molecular ele- vado, o peso molecular é preferivelmente cerca de 20.000 a cerca de
120.000 Da, mais preferivelmente de cerca de 30.000 a cerca de
80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da. Em outra Mo- dalidade preferida, o PEG é um PEG conforme descrito no pedido de patente internacional WO03076490. No caso de HES ser essa porção de alto peso molecular, o peso molecular é preferivelmente de cerca de 50 KDa a cerca de 1000 KDa, mais preferivelmente de cerca de 100 KDa a cerca de 700 KDa e mais preferivelmente de 200 KDa a 500 KDa. HES exibe uma substituição molar de 0,1 a 1,5, mais preferi- velmente de 1 a 1,5 e exibe um grau de substituição expresso como a relação C2/C6 de aproximadamente 0,1 a 15, de preferência de apro- ximadamente 3 a 10. O processo de modificação de HES é, por exem- plo, descrito no pedido de patente Alemã DE 1 2004 006 249,8, cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade por referência.
[0078] A modificação pode, em princípio, ser feita na molécula de ácido nucleico da presente invenção em qualquer posição da mesma. De preferência, tal modificação é feita no nucleotídeo do terminal 5’, no nucleotídeo do terminal 3’ e/ou em qualquer nucleotídeo entre o nucle- otídeo 5’ e o nucleotídeo 3’ da molécula de ácido nucleico.
[0079] A modificação e, de preferência, a porção PEG e/ou HES pode ser ligada à molécula de ácido nucleico da presente invenção, direta ou indiretamente, de preferência indiretamente através de um ligante. Também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais modificações, de preferência um ou mais porção PEG e/ou HES. Em uma Modalidade, a molécula de ligante individual liga mais de uma porção PEG ou porção HES a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante usado em conexão com a presente invenção pode ser linear ou ramificado. Este tipo de ligan- tes é conhecido por aqueles versados na técnica e são adicionalmente descritos nos pedidos de patente internacional WO2005/074993 e WO2003/035665.
[0080] Em uma Modalidade preferida, o ligante é um ligante bio- degradável. O ligante biodegradável permite modificar as característi- cas da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em termos de, entre outros, tempo de residência em um corpo animal, de preferência em um corpo humano, devido à liberação da modifica- ção da molécula de ácido nucleico de acordo com à presente inven- ção. A utilização de um ligante biodegradável pode permitir um melhor controle do tempo de residência da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma Modalidade preferida de tal li- gante biodegradável é um ligante biodegradável como descrito em, mas não limitado a, pedidos de patentes internacionais WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191 e WO2005/099768.
[0081] Está dentro da presente invenção que o grupo de modifica- ção ou modificação é uma modificação biodegradável, em que a modi- ficação biodegradável pode ser ligada à molécula de ácido nucleico da presente invenção direta ou indiretamente, de preferência através de um ligante. A modificação biodegradável permite modificar as caracte- rísticas da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente in- venção em termos de, entre outros, tempo de residência em um corpo animal, de preferência em um corpo humano, devido à liberação ou degradação da modificação da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O uso de uma modificação biodegradável pode permitir um melhor controle do tempo de residência da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma Modalida- de preferida de tal modificação biodegradável é biodegradável confor- me descrito em, mas não restrito a, pedidos de patente internacional WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 e WO2000/41647, de preferência em WO2000/41647, página 18, linha 4 a 24 .
[0082] Em outra Modalidade preferida, o ligante tem a seguinte estrutura:
[0083] Um respectivo ligante é, por exemplo, descrito em WO 2015/062743. Como evidente a partir da estrutura acima, o ligante liga duas porções PEG separadas a um grupo OH de uma porção fosfato de um nucleotídeo para a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.
[0084] Além das modificações, conforme descrito acima, outras modificações podem ser usadas para modificar as características da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, pelo que tais outras modificações podem ser selecionadas a partir do grupo de proteínas, lipídios, como colesterol e cadeias de açúcar, como ami- lase, dextrano, etc.
[0085] Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, modificando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção com uma porção de alto peso molecular, tal como um polímero e mais par- ticularmente um ou vários dos polímeros aqui descritos, que são de preferência fisiologicamente aceitáveis, a excreção a cinética da molé- cula de ácido nucleico assim modificada da invenção de um corpo animal ou humano ao qual a molécula de ácido nucleico modificada da invenção é administrada é alterada. Mais particularmente, devido ao aumento do peso molecular da molécula de ácido nucleico modificada da invenção e devido à molécula de ácido nucleico da invenção não ser sujeita a metabolismo particularmente quando na forma L, isto é, ser uma molécula de ácido L-nucleico, excreção de um corpo animal, de preferência de um corpo de mamífero e mais preferivelmente de um corpo humano é diminuída. Como a excreção ocorre tipicamente atra- vés dos rins, os presentes inventores assumem que a taxa de filtração glomerular da molécula de ácido nucleico assim modificada é significa- tivamente reduzida em comparação com uma molécula de ácido nu- cleico que não tem este tipo de modificação de alto peso molecular que resulta em um aumento na residência tempo da molécula de ácido nucleico modificada no corpo do animal. Em conexão com isso, é par- ticularmente notável que, apesar de tal modificação de alto peso mole- cular, a especificidade da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção não é afetada de maneira prejudicial. Na medida em que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção tem, entre outras, a característica surpreendente - que normal- mente não pode ser esperada de um composto farmaceuticamente ativo - que uma formulação farmacêutica proporcionando uma libera- ção prolongada não é necessariamente necessária para fornecer uma liberação prolongada da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Em vez disso, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção na sua forma modificada compreen- dendo uma porção de alto peso molecular, como tal, já pode ser usada como uma formulação de liberação prolongada, uma vez que atua, de- vido à sua modificação, já como se tivesse sido liberada de uma for- mulação de liberação prolongada. Na medida em que, a (s) modifica- ção (ões) da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento, e a molécula de ácido nucleico assim modificada de acordo com a presente invenção e qual- quer composição compreendendo a mesma, podem fornecer uma far- macocinética e biodistribuição distinta, de preferência controlada. Isso também inclui o tempo de residência na circulação do corpo animal e humano, e a distribuição aos tecidos desses animais e humanos. Es- sas modificações são ainda descritas no pedido de patente WO2003/035665.
[0086] No entanto, também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção não compreende qualquer modificação e, particularmente, nenhuma modi- ficação de alto peso molecular, como PEG ou HES. Tal Modalidade é particularmente preferida quando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção mostra distribuição preferencial a qualquer órgão ou tecido alvo no corpo ou quando uma eliminação rá- pida da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção do corpo após a administração é desejada. Uma molécula de áci- do nucleico de acordo com a presente invenção, conforme descrito neste documento, com um perfil de distribuição preferencial a qualquer órgão ou tecido alvo no corpo permite o estabelecimento de concen- trações locais eficazes no tecido alvo, enquanto mantém baixa a con- centração sistêmica da molécula de ácido nucleico. Isso permite o uso de baixas doses, o que não é apenas benéfico do ponto de vista eco- nômico, mas também reduz a exposição desnecessária de outros teci- dos à molécula de ácido nucleico, reduzindo assim o risco potencial de efeitos colaterais. A eliminação rápida da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção do corpo após a administração pode ser desejada, entre outros, no caso de imagem in vivo ou requisi- tos de dosagem terapêutica específicos usando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou medicamentos com- preendendo a mesma.
[0087] O ácido nucleico inventivo, que também é referido aqui co- mo o ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a (presente) invenção, e/ou os anta- gonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a geração ou fabricação de um medicamento. Tal medicamento ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém pelo menos um dos ácidos nucleicos da invenção, opcionalmente jun- tamente com outros compostos farmaceuticamente ativos, em que o ácido nucleico da invenção preferivelmente atua como o próprio com- posto farmaceuticamente ativo. Esses medicamentos compreendem em Modalidades preferidas, pelo menos, um transportador farmaceuti- camente aceitável. Tal transportador pode ser, por exemplo, água, tampão, PBS, solução de glicose, de preferência uma solução balan- ceada de sal de glicose a 5 %, amido, açúcar, gelatina ou qualquer outra substância transportadora aceitável. Esses transportadores são geralmente conhecidos das pessoas versadas na técnica. Será reco- nhecido pelo versado na técnica que quaisquer Modalidades, uso e aspectos de ou relacionados ao medicamento da presente invenção também são aplicáveis à composição farmacêutica da presente inven- ção e à molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso no tratamento e/ou prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doen- ça, conforme descrito ou descrito neste documento, e vice-versa.
[0088] A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/ou prevenção dos quais os ácidos nucleicos, as composições farmacêuti- cas e os medicamentos de acordo com ou preparados de acordo com a presente invenção resultam do envolvimento, direto ou indireto, de CXCL8 no respectivo mecanismo patogenético.
[0089] CXCL8 (UniProtKB/Swiss-Prot P10145, IL8_HUMAN; SEQ ID NO: 2), também conhecida como interleucina 8 (IL-8), proteína ati- vadora de neutrófilos 1 (NAP-1), fator quimiotático neutrófilo derivado de monócitos (MDNCF), ou proteína quimiotática de granulócitos 1 (GCP-1), é uma pequena proteína básica que pertence a uma subfa- mília de quimiocinas CXC com propriedades pró-inflamatórias e pró- angiogênicas caracterizadas por um motivo de glutamato-leucina- arginina (ELR) no terminal N . Quimiocinas CXCL1 ELR-positivas (também conhecidas como proteína alfa regulada pelo crescimento, Gro-alfa, atividade estimuladora de crescimento do melanoma, MGSA ou NAP-3), CXCL2 (também conhecida como Gro-beta ou proteína inflamatória 2-alfa de macrófago, MIP2-alfa), CXCL3 (também conhe- cido como Gro-gamma ou MIP2-beta), CXCL5 (também conhecido como proteína ativadora de neutrófilos derivada do epitélio 78, ENA-78 ou pequena citocina B5 induzível), CXCL6 (também conhecido como quimiocina alfa 3, CKA-3, proteína quimiotática de granulócitos 2, GCP-2 ou pequena citocina B6 induzível), CXCL7 (também conhecida como proteína básica de plaquetas, PBP, fator de crescimento deriva- do de leucócitos, LDGF, fator de crescimento derivado de macrófago, MDGF, ou pequena citocina B7 induzível) e CXCL8 são agonistas do receptor CXCR2 (também conhecido como IL8RB, IL8R tipo 2, CD182, CDw128b ou receptor GRO/MGSA). CXCL6, CXCL7 e CXCL8 são agonistas do receptor CXCR1 (também conhecido como IL8RA, IL8R tipo 1, CD181 ou CDw128a). CXCL8 liga-se aos receptores CXCR1 e CXCR2 com afinidades semelhantes de cerca de 4 nM. A ligação de CXCL8 a CXCR1/2 desencadeia vias de sinalização dependentes de Gαi e, por exemplo, induz a migração de neutrófilos, desgranulação e explosão oxidativa. A sensibilidade do receptor pode ser regulada por fosforilação, recrutamento de beta-arrestina e internalização do recep- tor (Ha, Theranostics 2017). CXCL7 tem a maior homologia com CXCL8 com 33 aminoácidos idênticos. CXCL8 de primatas não huma- nos (macaca mulata, macaco cinomolgo) compartilham 95 % de iden- tidade (73 de 77 aminoácidos idênticos) com CXCL8 humana. Não há ortólogo de CXCL8 em camundongos e ratos.
[0090] Obviamente, porque a molécula de ácido nucleico de liga- ção à CXCL8 de acordo com a presente invenção interage com ou se liga a CXCL8 humana, uma pessoa versada geralmente entenderá que a molécula de ácido nucleico de ligação à CXCL8 de acordo com a presente invenção pode ser facilmente usada para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doença de humanos e ani- mais como aqui descrito. Em conexão com isso, deve ser reconhecido que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção podem ser usadas para o tratamento e/ou prevenção de qualquer uma das doenças, distúrbios ou condições descritas neste documento, independentemente do modo de ação subjacente a tal doença, distúr- bio e condição.
[0091] A seguir, e sem desejar ser limitado por qualquer teoria, o racional para o uso das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em conexão com as várias doenças, distúrbios e condições é fornecido, tornando assim a reivindicada aplicabilidade terapêutica, preventiva e diagnóstica das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção plausível. A fim de evitar qualquer repetição desnecessária, deve ser reconhecido que, devido ao envol- vimento do eixo do receptor CXCL8 - CXCL8, conforme delineado em conexão com o mesmo, o referido eixo pode ser endereçado pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, de modo que o reivindicado efeito terapêutico, preventivo e diagnóstico seja alcançado. Além disso, deve ser reconhecido que as particulari- dades das doenças, distúrbios e condições dos pacientes e qualquer detalhe do regime de tratamento descrito em conexão com o mesmo, podem estar sujeitos a Modalidades preferidas do presente pedido.
[0092] CXCL8 e seus receptores estão implicados ou envolvidos na fisiopatologia de várias doenças inflamatórias, e o potencial de ini- bição de CXCL8 para o tratamento de tais doenças inflamatórias é apoiado por modelos de doenças em animais. Doença e/ou distúrbios inflamatórios e/ou condições de doença para o tratamento e/ou pre- venção das quais o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado incluem, mas não estão limitados a: Doenças inflamatórias do sistema respiratório a. Doença pulmonar obstrutiva crônica b. Síndrome da insuficiência respiratória aguda c.
Asma e inflamação alérgica d.
Bronquite, bronquiolite, bronquiolite obliterante, bron- quiectasia e.
Doenças pulmonares intersticiais, incluindo fibrose pul- monar f.
Fibrose cística g.
Transplante de pulmão h.
Lesões pulmonares causadas por insultos físicos, por ex. fumaça de cigarro, reexpansão após callaps, hiperoxia i.
Lesões pulmonares causadas por infecção bacteriana, viral ou fúngica (pneumonia) Doenças inflamatórias da pele a.
Dermatoses neutrofílicas b.
Psoríase c.
Penfigoide bolhoso d.
Epidermólise bolhosa e.
Hidradenite supurativa f.
Neurodermatite g.
Excema Doenças autoimunes a.
Doenças inflamatórias intestinais b.
Colite ulcerativa c.
Esclerose múltipla d.
Artrite reumatoide e.
Diabetes tipo 1 f.
Espondilite anquilosante Doenças neurológicas a.
Doença de neuro-sweet b.
Doença de Alzheimer Lesões de isquemia-reperfusão a. Acidente vascular cerebral b. Infarto do miocárdio c. Isquemia cerebral e infarto Outras doenças inflamatórias a. Aterosclerose b. Rejeição ao transplante de ilhotas pancreáticas c. Rejeição ao transplante de órgão e/ou função retardada d. Lesão da medula espinal e. Cistite (revisado por Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014 e Ha, Theranos- tics 2017).
[0093] A CXCL8 é superexpressa em cânceres humanos e os mo- delos experimentais de câncer suportam o potencial de inibição da CXCL8 para o tratamento do câncer. Consequentemente, doenças e/ou distúrbios e/ou condições de doença para o tratamento e/ou pre- venção das quais o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado incluem, mas não estão limitados a a. câncer de pulmão b. câncer de cólon c. câncer colorretal d. câncer de próstata, incluindo câncer de próstata refratá- rio a hormônios e. câncer de pâncreas f. câncer de fígado g. câncer de mama h. cancro do ovário i. câncer de tireoide j. melanoma k. glioblastoma l. osteossarcoma m. câncer de esôfago n. cânceres hematológicos (leucemias e linfomas) o. tumores insuficientes em PTEN p. tumores com mutação P53 q. tumores com mutação Kras r. Cânceres resistentes ao tratamento, incluindo cânceres resistentes ao tratamento com agentes quimioterápicos, agentes anti- angiogênicos, inibidores da tirosina cinase e inibidores do ponto de checagem imunológico.
[0094] Em uma outra Modalidade, o medicamento compreende um outro agente farmaceuticamente ativo para o tratamento de câncer e/ou tumores. Esses outros compostos farmaceuticamente ativos são, entre outros, mas não limitados a eles, aqueles conhecidos por subs- tâncias ativas antineoplásicas como agentes alquilantes, antimetabóli- tos, agentes antiangiogênicos, agentes inibidores de mitose, inibidores de topoisomerase, inibidores da transdução de sinal celular, hormô- nios, anticorpos, conjugados imunológicos e proteínas de fusão.
[0095] Outros compostos farmaceuticamente ativos para o trata- mento de câncer e/ou tumores são agentes imunoterapêuticos. Esses outros compostos farmaceuticamente ativos são, entre outros, mas não se limitando a eles, inibidores de ponto de checagem, vacinas contra o câncer, agentes imunoestimulantes, terapias celulares contra o câncer.
[0096] Outros compostos farmaceuticamente ativos são, entre ou- tros, mas não se limitando a eles, aqueles conhecidos por Bleomicina, inibidores da timidilatsintase como Raltitrexede e Pemetrexede, enzi- mas como L-asparaginase, Miltefosina e ANAgrelid, inibidores do pro- teassoma como Bortezomibe.
[0097] Está dentro da presente invenção que o medicamento, e a composição farmacêutica, respectivamente, contendo um ácido nu-
cleico de acordo com os presentes inventores podem ser usados para o tratamento dessa forma.
[0098] Em uma outra Modalidade, o medicamento compreende um outro agente farmaceuticamente ativo para o tratamento de doenças inflamatórias. Esses outros compostos farmaceuticamente ativos são, entre outros, mas não se limitando a eles, aqueles conhecidos por su- primir o sistema imunológico, como fármacos anti-inflamatórias não esteroidais, corticosteroides, inibidores de calcineurina, ciclosporina A, metotrexato, azatioprina, tacrolimo, rapamicina, clorambucila, lefluno- mida, micofenolato de mofetila, brequinar, mizoribina, talidomida, de- soxiespergualina, dapson, hidroxicloroquina, sulfassalazina, anti- histamínicos ou produtos biológicos antiinflamatórios como anticorpo anti-fator de necrose tumoral adalimumabe, anticorpo anti-CD20 deple- tor de células B rituximabe, anticorpo anti-IL6R tocilizumabe, anticorpo anti-IgE omalizumabe e imunoglobulinas intravenosas.
[0099] Finalmente, o outro agente farmaceuticamente ativo pode ser um modulador da atividade de qualquer outra quimiocina que pode ser um agonista ou antagonista de quimiocina ou um agonista ou an- tagonista do receptor de quimiocina. Alternativamente, ou adicional- mente, esse outro agente farmaceuticamente ativo é uma outra molé- cula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Alternati- vamente, o medicamento compreende pelo menos mais um ácido nu- cleico que se liga a uma molécula alvo diferente de CXCL8 ou exibe uma função que é diferente daquela dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.
[00100] Está dentro da presente invenção que o medicamento é alternativamente ou adicionalmente usado, em princípio, para a pre- venção de qualquer uma das doenças descritas em conexão com o uso do medicamento para o tratamento das ditas doenças. Portanto, os respectivos marcadores, isto é, para as respectivas doenças, são conhecidos dos versados na técnica. De preferência, o respectivo marcador é CXCL8.
[00101] Em uma Modalidade do medicamento da presente inven- ção, tal medicamento é para uso em combinação com outros trata- mentos para qualquer uma das doenças aqui descritas, particularmen- te aquelas para as quais o medicamento da presente invenção é para ser usado.
[00102] “Terapia de combinação” (ou “coterapia”) inclui a adminis- tração de um medicamento da invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico destinado a fornecer o efeito benéfico da coação desses agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção, e o referido segundo agente. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não está limitado a, coa- ção farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração desses agentes terapêuticos em combinação normalmente é realizada ao longo de um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas, depen- dendo da combinação selecionada).
[00103] “Terapia de combinação” pode, mas geralmente não se destina a abranger a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separados que acidentalmente e arbitrariamente resultam nas combinações da pre- sente invenção. “Terapia de combinação” se destina a abranger a ad- ministração desses agentes terapêuticos de uma maneira sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado em um momen- to diferente, bem como a administração desses agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de maneira substanci- almente simultânea. A administração substancialmente simultânea po- de ser realizada, por exemplo, pela administração a um indivíduo de uma única cápsula com uma proporção fixa de cada agente terapêuti-
co ou em múltiplas cápsulas únicas para cada um dos agentes tera- pêuticos.
[00104] A administração sequencial ou substancialmente simultâ- nea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas não se limitando a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares e absorção direta através dos tecidos da membrana mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser ad- ministrado por injeção, enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.
[00105] Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuti- cos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes tera- pêuticos podem ser administrados por injeção. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é estritamente crítica, a menos que indicado de outra forma. “Terapia de combinação” também pode abranger a administração dos agentes terapêuticos como des- crito acima em combinação adicional com outros ingredientes biologi- camente ativos. Quando a terapia de combinação compreende ainda um tratamento sem fármaco, o tratamento sem fármaco pode ser con- duzido em qualquer momento adequado, desde que um efeito benéfi- co da coação da combinação dos agentes terapêuticos e do tratamen- to sem fármaco seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é alcançado quando o tratamento sem fármaco é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.
[00106] Conforme descrito em termos gerais acima, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser administrado, em princí- pio, em qualquer forma conhecida por aqueles versados na técnica. Uma via de administração preferida é a administração sistémica, mais preferivelmente por administração parentérica, preferivelmente por in- jeção. Alternativamente, o medicamento pode ser administrado local- mente. Outras vias de administração compreendem a via de adminis- tração intramuscular, intraperitoneal e subcutânea, per orum, intrana- sal, intratraqueal ou pulmonar, sendo dada preferência à via de admi- nistração que é menos invasiva, ao mesmo tempo que assegura a efi- cácia.
[00107] A administração parenteral é geralmente usada para inje- ções e infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Além disso, uma abordagem para administração parenteral emprega a im- plantação de sistemas de liberação lenta ou de liberação prolongada, que garantem que um nível constante de dosagem seja mantido, que são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[00108] Além disso, os medicamentos preferidos da presente in- venção podem ser administrados na forma intranasal por meio do uso tópico de veículos intranasais adequados, inalantes ou por vias trans- dérmicas, usando as formas de adesivos transdérmicos bem conheci- dos dos versados na técnica. Para ser administrada na forma de um sistema de distribuição transdérmica, a administração da dosagem se- rá, com certeza, contínua em vez de intermitente ao longo do regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, unguentos, loções, sprays de aerossol e géis, em que a concentração do ingrediente ativo normalmente varia de 0,01 % a 15 %, p/p ou p/v.
[00109] O medicamento da presente invenção geralmente compre- enderá uma quantidade eficaz do (s) componente (s) ativo (s) da tera- pia, incluindo, mas não se limitando a, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, dissolvida ou dispersa em um meio farmaceuti- camente aceitável. Os meios ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotô-
nicos e de retardamento da absorção, e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incor- porados no medicamento da presente invenção.
[00110] Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacio- nada a uma composição farmacêutica. Tal composição farmacêutica compreende pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e, de preferência, um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser qualquer veículo ou qualquer aglutinan- te usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente, tal agluti- nante ou veículo é qualquer aglutinante ou veículo conforme discutido em conexão com a fabricação do medicamento descrito neste docu- mento. Em uma outra Modalidade, a composição farmacêutica com- preende um outro agente farmaceuticamente ativo.
[00111] A preparação de um medicamento e de uma composição farmacêutica será conhecida dos versados na técnica à luz da presen- te descrição. Normalmente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sóli- das adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da inje- ção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; co- mo cápsulas de liberação de tempo; ou em qualquer outra forma atu- almente usada, incluindo colírios, cremes, loções, unguentos, inalan- tes, e similares. O uso de formulações estéreis, como lavagens à base de solução salina, por cirurgiões, médicos ou profissionais de saúde para tratar uma área particular no campo operacional também pode ser particularmente útil. As composições também podem ser distribuí- das por meio de microdispositivo, micropartícula ou esponja.
[00112] Após a formulação, um medicamento ou uma composição farmacêutica será administrado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que seja farmacologi-
camente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetá- veis descritas acima, mas cápsulas de liberação de fármacos, e simila- res também podem ser empregadas.
[00113] Nesse contexto, a quantidade de princípio ativo, e o volume da composição a ser administrado dependem do indivíduo ou paciente a ser tratado. As quantidades específicas de composto ativo necessá- rias para administração dependem do julgamento do médico e são pe- culiares a cada indivíduo.
[00114] Um volume mínimo de um medicamento ou composição farmacêutica necessário para dispersar os compostos ativos é tipica- mente utilizado. Os regimes adequados para administração também são variáveis, mas seriam tipificados pela administração inicial do composto e monitoramento dos resultados e, em seguida, administra- ção de doses controladas adicionais em intervalos adicionais.
[00115] Por exemplo, para administração oral na forma de um com- primido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina), o compo- nente ativo da fármaco, isto é, uma molécula de ácido nucleico da pre- sente invenção e/ou qualquer outro agente farmaceuticamente ativo, também referido aqui como agente (s) terapêutico (s) ou composto (s) ativo (s) pode (m) ser combinado (s) com um transportador inerte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como etanol, glicerol, água, e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, ligan- tes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes adequa- dos também podem ser incorporados na mistura. Ligantes adequados incluem amido, silicato de magnésio e alumínio, pasta de amido, gela- tina, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolido- na, açúcares naturais, como glicose ou betalactose, adoçantes de mi- lho, gomas naturais e sintéticas, como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras, e similares. Lubrificantes usados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de só- dio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, clo- reto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicol, e similares. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, ágar, bentonita, amidos de goma xantana, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio ou misturas eferves- centes, e similares. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, dex- trose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina.
[00116] O medicamento ou a composição farmacêutica da invenção também podem ser administrados em formas de dosagem oral como comprimidos ou cápsulas de liberação cronometrada e de liberação prolongada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaro- pes e emulsões. Os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões gordurosas.
[00117] A composição farmacêutica ou medicamento pode ser este- rilizado e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, esta- bilizantes, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, eles tam- bém podem conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação ou revestimento e contêm tipicamente cerca de 0,1 % a 75 %, preferivelmente cerca de 1 % a 50 %, do ingrediente ativo.
[00118] Composições líquidas, particularmente injetáveis podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O com- posto ativo é dissolvido em ou misturado com um solvente farmaceuti- camente puro, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e similares, para assim formar a solução ou suspensão injetável. Além disso, podem ser formuladas formas sólidas adequadas para dissolução em líquido antes da injeção.
[00119] Para composições sólidas, os excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sa- carina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de mag- nésio, e similares. O composto ativo definido acima também pode ser formulado como supositórios, usando, por exemplo, polialquileno gli- cóis, por exemplo, propileno glicol, como transportador. Em algumas modalidades, os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões gordurosas.
[00120] O medicamento, composição farmacêutica e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção também podem ser administrados na forma de sistemas de distribuição de lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unila- melares e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser forma- dos a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, uma pelí- cula de componentes lipídicos é hidratada com uma solução aquosa de fármaco para formar uma camada lipídica que encapsula o fárma- co, o que é bem conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico aqui descritas podem ser fornecidas como um complexo com um composto lipofílico ou não imunogênico, composto de alto peso molecular construído usando métodos conheci- dos na técnica. Além disso, os lipossomas podem conter tais molécu- las de ácido nucleico em sua superfície para direcionar e transportar agentes citotóxicos internamente para mediar a morte celular. Um exemplo de complexos associados a ácido nucleico é fornecido na Pa- tente U.S. No. 6.011.020.
[00121] O medicamento, composição farmacêutica e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção também podem ser acoplados a polímeros solúveis como transportadores de fármacos direcionáveis. Esses polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copo-
límero de pirano, poli-hidroxipropil-metacrilamida-fenol, poli- hidroxietilaspanamidafenol ou polietilenooxidopolilisina substituído com resíduos de palmitoíla. Além disso, os medicamentos e as moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para al- cançar a liberação controlada de um retardamento, por exemplo, ácido polilático, poliepsilon capro lactona, ácido poli-hidroxibutírico, polior- toésteres, poliacetais, polidi-hidropiranos, policianoacrilatos e copolí- meros em bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogeis.
[00122] Se desejado, a composição farmacêutica, e o medicamen- to, respectivamente, a serem administrados também podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH e outras substâncias, como por exemplo, acetato de sódio e oleato de trietanolamina.
[00123] O regime de dosagem utilizando a molécula de ácido nu- cleico, medicamento ou composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a rotina de adminis- tração; a função renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular ou sal do mesmo empregado. Um médico ou veterinário normalmente versado pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz do medicamento necessária para prevenir, contrariar ou interromper o progresso da doença.
[00124] Os níveis plasmáticos eficazes do ácido nucleico de acordo com a presente invenção variam preferivelmente de 500 fM a 500 µM no tratamento de qualquer uma das doenças aqui descritas.
[00125] A molécula de ácido nucleico, medicamento e composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção podem ser ad-
ministrados preferivelmente em uma única dose diária, a cada segun- do ou terceiro dia, semanalmente, a cada segunda semana, em uma única dose mensal ou a cada três meses.
[00126] Está dentro da presente invenção que o medicamento co- mo aqui descrito constitui a composição farmacêutica aqui descrita.
[00127] Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacio- nada a um método para o tratamento de um indivíduo que necessita desse tratamento, em que o método compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos uma das mo- léculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma doença ou está em risco de de- senvolver tal doença, em que a doença é qualquer uma das aqui des- critas, particularmente qualquer uma das doenças descritas em cone- xão com o uso de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.
[00128] Deve ser entendido que o ácido nucleico, bem como os an- tagonistas de acordo com a presente invenção, podem ser usados não apenas como um medicamento ou para a fabricação de um medica- mento, mas também para fins cosméticos, particularmente no que diz respeito ao envolvimento de CXCL8 em lesões cutâneas regionais in- flamadas. Portanto, uma outra condição ou doença para o tratamento ou prevenção da qual o ácido nucleico, o medicamento e/ou a compo- sição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser usados, são as lesões cutâneas regionais inflamadas.
[00129] Claro, porque uma molécula de ácido nucleico de ligação à CXCL8 de acordo com a presente invenção interage com ou se liga à CXCL8 de humano, uma pessoa versada geralmente compreenderá que a molécula de ácido nucleico de ligação à CXCL8 de acordo com a presente invenção pode ser facilmente usada para a detecção de CXCL8 e para a fabricação de um diagnóstico ou de um biossensor.
[00130] Como preferivelmente utilizado neste documento, um diag- nóstico ou agente diagnóstico ou meio diagnóstico ou um biosenor é adequado para detectar, direta ou indiretamente, CXCL8, preferivel- mente CXCL8 como descrito neste documento e mais preferivelmente CXCL8 como descrito neste documento em relação aos vários distúr- bios e doenças aqui descritos. O diagnóstico ou biossensor é adequa- do para, porém, não se limita à detecção e/ou acompanhamento de qualquer um dos distúrbios e doenças, respectivamente, aqui descri- tos. Tal detecção é possível através da ligação do ácido nucleico de acordo com a presente invenção à CXCL8. Tal ligação pode ser detec- tada direta ou indiretamente, em que a molécula de ácido nucleico po- de compreender um grupo de modificação ou pode não compreender um grupo de modificação. Em uma Modalidade preferida, o grupo de modificação permite a imobilização do ácido nucleico. Em outra Moda- lidade preferida, o grupo de modificação é um rótulo. Os respectivos métodos e meios são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00131] Em uma modalidade, o ácido nucleico inventivo é imobiliza- do à superfície de um vaso de reação do diagnóstico, à superfície de um dispositivo contido em um vaso de reação do diagnóstico ou à su- perfície do biossensor, por qualquer meio conhecido pelos versados na técnica incluindo ligações não covalentes ou covalentes.
[00132] Em uma Modalidade preferida, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é imobilizado por ligação covalente a uma superfície. Portanto, está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende um grupo de mo- dificação que permite a imobilização da molécula de ácido nucleico em superfícies. Tais grupos de modificações para ligação covalente inclu- em, porém, não estão limitados a (ativada) carboxila, hidroxila, fosfati- dila, éster sulfônico, amina, tiol, epóxido, alcina, cicloalcina deformada (por exemplo, dibenzociclo-octila, DBCO; biciclo[6,1,0]non-4-ino, BCN;
ou azadibenzociclo-octina, ADIBO), maleimida, azida, hidrazida.
[00133] Tais ligações covalentes podem ser formadas, por exemplo, por grupos carboxila ativados (por exemplo, ativação de EDC/NHS) reagindo com aminas primárias, por maleimida reagindo com grupos tiol, por cicloadição de azida alcina catalisada por cobre (química click), por química click livre de cobre incluindo porém, não se limitan- do a cicloadição de alcina deformada de azida livre de cobre, cicloadi- ção de alceno azida [3+2], alceno tetrazina de demanda inversa Diels- Alder e reação fotoclick de alceno tetrazol, ou por acoplamento direto de sondas tioladas em superfícies de ouro. Está dentro da Modalidade que tais métodos não estão restritos a uma geometria particular e que um grupo reativo pode estar localizado na superfície ou nos ácidos nu- cleicos.
[00134] Em uma Modalidade preferida, ácidos nucleicos inventivos são acoplados a superfícies funcionalizadas com azida de biossenso- res por cicloadição de azida-alcina promovida por deformação (quími- ca click). Para isso, a superfície é funcionalizada com azida, e o oligo- nucleotídeo é funcionalizado com uma alcina deformada, por exemplo, dibenzociclo-octila, DBCO; biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) e azadiben- zociclo-octina (ADIBO), preferivelmente em uma extremidade 5' ou 3’. Alternativamente, a geometria inversa pode ser usada, isto é, usando uma superfície biossensora funcionalizada com alcina deformada e ácidos nucleicos modificados com azida.
[00135] Em outra modalidade, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é imobilizado por ligação não covalente. Portanto, está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende um grupo de modificação que permite a imobilização da molécula de ácido nucleico em superfícies, pelo que a ligação é reversível. Esses grupos de modificação para ligação não covalente incluem, porém, não são limitados a biotina (ligação à avidi-
na, estreptavidina ou neutravidina), bromo-desoxiuridina (ligação a um anticorpo anti-bromo-desoxiruridina), digoxigenina (ligação a um anti- corpo anti-digoxigenina) e oligonulceotídeos (ligação a oligonucleotí- deo complementar). As extremidades 3’ desbloqueadas de oligonucle- otídeos podem servir como iniciadores para polimerases ou como aceptores para outro ácido nucleico em uma reação de ligase. Está dentro da Modalidade que tais métodos não são restritos a uma geo- metria particular e que um grupo reativo pode estar localizado em qualquer superfície ou ácidos nucleicos.
[00136] Está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico da presente invenção não é imobilizada, porém, é usada em solução e compreende um grupo de modificação que preferivelmente permite a detecção da molécula de ácido nucleico, aqui referida como marcador. Esses marcadores incluem, porém, não são limitados à bio- tina (ligação à avidina, estreptavidina ou neutravidina), bromo- desoxiuridina (ligação a um anticorpo anti-bromo-desoxiruridina), digo- xigenina (ligação a um anticorpo anti-digoxigenina), oligonulceotídeos (ligação ao oligonucleotídeo complementar), marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, Cy-3, Cy-5), um marcador de eletroquimio- luminescência, marcadores radioativos, marcadores enzimáticos, mar- cadores UV, ouro coloidal, nanopartículas e marcadores de moléculas quelantes.
[00137] Em uma outra Modalidade, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção contém um não nucleosídeo, preferivelmente um ligante hidrofílico, tal como uma unidade única ou etileno glicol de re- petição, por exemplo, trietileno glicol (TEG), hexaetileno glicol (HEG) ou mesmo polietileno glicol (PEG), que podem se juntar ao ácido nu- cleico e ao grupo de modificação.
[00138] Em relação à detecção de CXCL8, os métodos preferidos são a ligação direta de CXCL8, um ensaio de ligação em sanduíche,
um ensaio de ligação competitivo ou uma configuração de fluxo lateral.
[00139] Em uma modalidade, CXCL8 é detectada por ligação direta de um ácido nucleico imobilizado para CXCL8. A ligação direta de acordo com a presente invenção é um método que usa apenas um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, porém, não uma segunda molécula que interage com CXCL8.
[00140] Um formato de um ensaio de ligação em sanduíche é a formação de um complexo imobilizado de CXCL8 e uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção compreendendo um grupo de modificação para imobilização, em que o complexo é imobilizado na superfície do vaso de reação do diagnóstico, na superfície de um dis- positivo contido em um vaso de reação do diagnóstico ou à superfície do biossensor, pelo que, preferivelmente, o referido complexo é detec- tado. Está dentro de uma Modalidade que CXCL8 é detectada a partir do complexo. Um respectivo meio de detecção que segue este requisi- to é, por exemplo, qualquer meio de detecção que seja específico para essa/aquelas parte(s) (epitopos) de CXCL8 não detectada pela molé- cula de ácido nucleico da invenção e é selecionado a partir do grupo que compreende ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e anticor- pos, cuja geração é conhecida pelos versados na técnica. As metodo- logias de tais ensaios de ligação em sanduíche são conhecidas pelos versados na técnica.
[00141] Está dentro da Modalidade de um ensaio de ligação em sanduíche que uma geometria inversa pode ser usada, onde o meio de detecção descrito acima é imobilizado na superfície do vaso de re- ação do diagnóstico, na superfície de um dispositivo contido em um vaso de reação do diagnóstico ou à superfície do biossensor para for- mar um complexo com CXCL8 fornecido em uma amostra, e o com- plexo é detectado por uma molécula de ácido nucleico da invenção. É nesta modalidade, que a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção compreende um marcador ou é não marcada. A detecção da molécula de ácido nucleico não marcada pode envolver o uso de um segundo meio de detecção que é, preferivelmente, também seleciona- do a partir do grupo que compreende ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e Modalidades nas várias Modalidades aqui descritas. Esses meios de detecção são preferivelmente específicos para o ácido nu- cleico de acordo com a presente invenção.
[00142] Finalmente, está também dentro da presente invenção que o segundo meio de detecção é detectado usando um terceiro meio de detecção, preferivelmente o terceiro meio de detecção está ligado a uma enzima, mais preferivelmente mostrando uma reação enzimática após a detecção do segundo meio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para detectar radiação, mais preferivelmente ra- diação emitida por um radionuclídeo. Preferivelmente, o terceiro meio de detecção detecta e/ou interage especificamente com o segundo meio de detecção.
[00143] Em uma outra modalidade, a ligação das moléculas de áci- do nucleico de acordo com a invenção à CXCL8 é detectada em en- saios competitivos. Aqui, as sondas oligonucleotídicas imobilizadas complementares a partes das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção competem com a formação de complexo entre o ácido nucleico da invenção e CXCL8, pelo que, em tal modalidade, a molé- cula de ácido nucleico não é imobilizada em uma superfície. Alternati- vamente, a CXCL8 imobilizada compete com a formação de complexo entre o ácido nucleico da invenção, e a CXCL8, pelo que, em tal mo- dalidade, a molécula de ácido nucleico não é imobilizada em uma su- perfície. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é imobilizada em uma superfície, e a ligação de CXCL8 à molécula de ácido nucleico imobilizada de acordo com a invenção é competida por sondas oligonucleotídicas complementares a partes das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção. As metodologias de tais ensaios são conhecidas pro pessoas versa- das na técnica.
[00144] Em relação à detecção de CXCL8, uma outra Modalidade preferida é o uso das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção para a fabricação de um biossensor. Por definição, um bios- sensor é um dispositivo analítico usado para a detecção de um anali- sado, como CXCL8, que combina um componente biológico, tal como o ácido nucleico de acordo com a presente invenção com um detector físico-químico. O transdutor ou elemento detector, que transforma um sinal em outro, atua de forma físico-química: ótica, piezoelétrica, ele- troquímica, eletroquimioluminescência etc., resultante da interação da CXCL8 com o elemento biológico. O biossensor pode compreender pelo menos um elemento biológico imobilizado covalentemente em uma superfície do biossensor. O pelo menos um elemento biológico imobilizado covalentemente em uma superfície de biossensor é um ácido nucleico de acordo com a invenção compreendendo um grupo de modificação para imobilização, um meio com ligação específica pa- ra esse/aqueles epitopos de CXCL8 que não estão ligados pelos áci- dos nucleicos inventivos, uma sonda de oligonucleotídeo complemen- tar aos ácidos nucleicos inventivos, ou CXCL8. Se o ácido nucleico da presente invenção não estiver imobilizado na superfície do biossensor, o ácido nucleico da presente invenção compreende um grupo de modi- ficação que é um marcador ou não compreende um grupo de modifi- cação.
[00145] A superfície do biossensor ou a superfície do diagnóstico pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em ouro, prata, titânio, zircônio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, tungstênio, moli- bdênio, platina, alumínio, ferro, aço, cobre, níquel, silício, germânio, fosfeto de índio, arseneto de gálio e óxidos, nitretos ou ligas ou mistu-
ras dos materiais acima mencionados, óxido de índio-estanho, carbo- no vítreo, safira e vidros de silicato ou borato.
[00146] Estas superfícies podem ainda ser modificadas por polilisi- na, aminossilano, epoxissilano, nitrocelulose, carboxidextrano, nano- membranas de carbono, óxido de grafeno, amino grafeno, superfícies de carbono, como negro de fumo, fibra de carbono, placas de carbono, tecido de carbono, carvão ativado, carvão vítreo, carvão ativado, car- vão, pó de grafite, fibras de grafite, nanotubos de carbono, fulerenos, grupos carboxila, grupos azida, grupos tiol, grupos hidroxila, epóxido, maleimida, alcinas, alcinas deformadas ou combinações dos mesmos.
[00147] Em uma Modalidade preferida, uma molécula de ácido nu- cleico de acordo com a invenção que compreende um grupo de modi- ficação para imobilização é imobilizada na superfície do biossensor para a detecção direta de CXCL8 ou para a detecção de CXCL8 em um formato de ensaio em sanduíche ou um formato de ensaio compe- titivo. Em outra Modalidade preferida, um meio de detecção específico para esse/aqueles epitopos de CXCL8 não detectados pelo ácido nu- cleico inventivo (descrito acima), uma sonda de oligonucleotídeo com- plementar aos ácidos nucleicos inventivos ou CXCL8 é imobilizada na superfície do biossensor, e os ácidos nucleicos marcados de acordo com a invenção (descrito acima) são usados para detecção em forma- to de ensaio em sanduíche ou um formato de ensaio competitivo.
[00148] Os sistemas de detecção em meios de diagnóstico e bios- sensores podem ser baseados, por exemplo, na leitura ótica (fluores- cência, absorção e luminescência), mudança de massa (por exemplo, microbalança de cristal de quartzo, sistemas microeletromecânicos), índice refratário (ressonância de plasmônio superficial, ressonadores de anel, elipsometria), carga (impedância eletroquímica, voltametria, amperometria, potenciometria ou condutividade, transistores de efeito de campo), estresse de superfície (biossensores cantilever) e micros-
copia de força atômica.
[00149] Em uma outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é usada em sanduíche ou ensaios de fluxo lateral competitivo. As metodologias de tais ensaios de fluxo lateral são conhecidas por pessoas versadas na técnica.
[00150] Em uma outra modalidade, a ligação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção à CXCL8 é detectada em ensaios homogêneos por sondas de ácido nucleico complementares a partes da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, pelo que em tal Modalidade a molécula de ácido nucleico não é imobilizada para uma superfície. Aqui, a hibridização resulta em mudanças no si- nal de fluorescência de dois grupos fluorofóricos ligados aos ácidos nucleicos, preferivelmente uma mudança na intensidade, e a hibridiza- ção compete com a formação de complexo entre o ácido nucleico da invenção e CXCL8. Os dois grupos fluorofóricos estão ambos ligados à sonda de ácido nucleico (farol molecular) ou um está ligado à sonda, e o outro está ligado ao ácido nucleico da invenção. Em uma outra modalidade, um ou dois grupos fluorofóricos estão ligados ao ácido nucleico da invenção, e a formação do complexo com CXCL8 resulta em mudanças do sinal de fluorescência, preferivelmente uma mudan- ça na intensidade. As metodologias de tais ensaios são conhecidas por pessoas versadas na técnica.
[00151] A molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ainda ser usada como material de partida para o projeto de fár- macos. Basicamente, existem duas abordagens possíveis. Uma abor- dagem é o rastreio de bibliotecas de compostos, ao passo que tais bi- bliotecas de compostos são preferivelmente bibliotecas de compostos de baixo peso molecular. Em uma modalidade, o rastreamento é um rastreamento de alto rendimento. Preferivelmente, o rastreamento de alto rendimento é a avaliação rápida e eficiente de tentativa e erro de compostos em um ensaio com base no alvo. Na melhor das hipóteses, as análises são realizadas por uma medição colorimétrica. Bibliotecas como usadas em conexão com as mesmas são conhecidas por aque- les versados na técnica.
[00152] Alternativamente, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser usada para a concepção racional de fármacos. Preferivelmente, o projeto racional de fármacos é o proje- to de uma estrutura farmacêutica principal. Partindo da estrutura tridi- mensional do alvo, que é tipicamente identificada por métodos como cristalografia de raios X ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear, programas de computador são usados para pesquisar bancos de dados contendo estruturas de muitos compostos químicos diferen- tes. A seleção é feita por computador, os compostos identificados po- dem ser posteriormente testados em laboratório.
[00153] O projeto racional de fármacos pode começar a partir de qualquer um dentre uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferivelmente uma es- trutura tridimensional, que é semelhante à estrutura dos ácidos nuclei- cos da invenção ou idêntica às partes mediadoras de ligação da estru- tura do ácido nucleico da invenção. Em qualquer caso, essa estrutura ainda mostra a mesma ou uma característica de ligação semelhante ao ácido nucleico da invenção. Em uma etapa adicional ou como uma etapa alternativa no projeto racional de fármacos, a estrutura preferi- velmente tridimensional daquelas partes do ácido nucleico que se liga ao neurotransmissor é imitada por grupos químicos que são diferentes dos nucleotídeos e ácidos nucleicos. Por este mimetismo, pode ser concebido um composto diferente do ácido nucleico de acordo com a invenção. Esse composto é preferivelmente uma molécula pequena ou um peptídeo.
[00154] No caso de rastreamento de bibliotecas de compostos, tal como usando um ensaio competitivo que é conhecido por aqueles ver- sados na técnica, análogos de CXCL8, agonistas de CXCL8 ou anta- gonistas de CXCL8 apropriados podem ser encontrados. Esses ensai- os competitivos podem ser configurados como segue. O ácido nucleico da invenção, preferivelmente um Spiegelmer que é um ácido L- nucleico de ligação ao alvo, é acoplado a uma fase sólida. Para identi- ficar análogos de CXCL8, CXCL8 marcada pode ser adicionada ao ensaio. Um análogo potencial iria competir com as moléculas CXCL8 que se ligam ao Spiegelmer, o que iria junto com uma diminuição no sinal obtido pelo respectivo marcador. O rastreamento de agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de um ensaio de cultura de células como conhecido pelos versados na técnica.
[00155] O kit de acordo com a presente invenção pode compreen- der pelo menos uma ou várias das moléculas de ácido nucleico da in- venção. Além disso, o kit pode compreender pelo menos um ou vários controles positivos ou negativos. Um controle positivo pode, por exem- plo, ser CXCL8, particularmente aquele contra o qual o ácido nucleico da invenção é selecionado ou ao qual se liga, preferivelmente, na for- ma líquida. Um controle negativo pode, por exemplo, ser um peptídeo que é definido em termos de propriedades biofísicas semelhantes a CXCL8, porém, que não é reconhecido pelos ácidos nucleicos da in- venção. Além disso, o referido kit pode compreender um ou vários tampões. Os vários ingredientes podem estar contidos no kit na forma seca ou liofilizada ou dissolvidos em um líquido. O kit pode compreen- der um ou vários recipientes que, por sua vez, podem conter um ou vários ingredientes do kit. Em uma outra modalidade, o kit compreende uma instrução ou folheto de instruções que fornece ao usuário infor- mações sobre como usar o kit e seus vários ingredientes.
[00156] A determinação farmacêutica e bioanalítica de uma molécu- la de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é fundamental para a avaliação do seu perfil farmacocinético e biodinâmico em vários humores, tecidos e órgãos do corpo humano e não humano. Para tal, qualquer um dos métodos de detecção descritos neste documento ou conhecidos por alguém versado na técnica podem ser usados. Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ensaio de hibridi- zação em sanduíche para a detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Dentro do ensaio de detecção, são utilizadas uma sonda de captura e uma sonda de detecção. A sonda de captura é complementar à primeira parte, e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Tanto a sonda de captura quanto a de detecção podem ser formadas por nu- cleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modificados, nucleotídeos de RNA modificados, nucleotídeos de RNA, nucleotídeos de LNA e/ou nucleotídeos de PNA.
[00157] Assim, a sonda de captura compreende um trecho de se- quência complementar à extremidade 5' da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, e a sonda de detecção compre- ende um trecho de sequência complementar à extremidade 3’ da mo- lécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada em uma superfície ou matriz por meio de sua extremidade 5', pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente em sua extremidade 5' ou por meio de um li- gante entre sua extremidade 5' e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio, o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo da sonda de captura. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos dos ver- sado na técnica ou por nucleotídeos D-DNA, nucleotídeos D-DNA mo- dificados, nucleotídeos D-RNA, nucleotídeos D-RNA modificados, nu- cleotídeos D-LNA, nucleotídeos PNA, nucleotídeos L-RNA, nucleotí- deos L-DNA, nucleotídeos L-RNA modificados, nucleotídeos L-DNA modificados e/ou nucleotídeos L-LNA.
[00158] Alternativamente, a sonda de captura compreende um tre- cho de sequência complementar à extremidade 3' da molécula de áci- do nucleico de acordo com a presente invenção, e a sonda de detec- ção compreende um trecho de sequência complementar à extremida- de 5' da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente inven- ção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada em uma superfície ou matriz por meio de sua extremidade 3', pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente em sua extremidade 3’ ou por meio de um ligante entre sua extremidade 3' e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio, o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo do trecho de sequência que é complementar ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante pode ser formado por ligantes hi- drofílicos dos versados na técnica ou por nucleotídeos D-DNA, nucleo- tídeos D-DNA modificados, nucleotídeos D-RNA, nucleotídeos D-RNA modificados, nucleotídeos D-LNA, nucleotídeos PNA, nucleotídeos L- RNA, nucleotídeos L-DNA, nucleotídeos L-RNA modificados, nucleotí- deos L-DNA modificados e/ou nucleotídeos L-LNA.
[00159] O número de nucleotídeos da sonda de captura e de detec- ção que pode hibridizar com a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é variável e pode ser dependente do número de nucleotídeos da sonda de captura e/ou de detecção e/ou do ácido nucleico de acordo com à própria presente invenção. O número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção que podem hibri- dizar com o ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve ser máximo do número de nucleotídeos que são compreendidos pelo ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O número mínimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos) da sonda de detecção e de cap- tura deve permitir a hibridização para a extremidade 5’ ou extremidade 3’, respectivamente, do ácido nucleico de acordo com a presente in- venção. A fim de realizar alta especificidade e seletividade entre o áci-
do nucleico de acordo com a presente invenção e outros ácidos nu- cleicos que ocorrem em amostras que são analisadas, o número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção deve ser ou no máximo o número de nucleotídeos que são compreendidos por uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[00160] Além disso, a sonda de detecção preferivelmente transporta uma molécula marcadora ou rótulo que pode ser detectado como des- crito anteriormente neste documento. O rótulo ou molécula marcadora podem, em princípio, ser ligados a cada nucleotídeo da sonda de de- tecção. Preferivelmente, o rótulo ou marcador está localizado na ex- tremidade 5’ ou 3’ da sonda de detecção, pelo que entre os nucleotí- deos dentro da sonda de detecção que são complementares à molécu- la de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, e o rótulo, um ligante pode ser inserido. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos dos versados na técnica ou por nucleotídeos D-DNA, nu- cleotídeos D-DNA modificados, nucleotídeos D-RNA, nucleotídeos D- RNA modificados, nucleotídeos D-LNA, nucleotídeos PNA, nucleotí- deos L-RNA, nucleotídeos L-DNA, nucleotídeos L-RNA modificados, nucleotídeos L-DNA modificados e/ou nucleotídeos L-LNA.
[00161] A detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser realizada da seguinte forma:
[00162] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção hibridiza com uma das suas extremidades para a sonda de captura e com a outra extremidade para a sonda de detecção. Posteri- ormente, a sonda de detecção não ligada é removida por, por exem- plo, uma ou várias etapas de lavagem. A quantidade de sonda de de- tecção ligada que preferivelmente transporta um rótulo ou molécula marcadora, pode ser medida subsequentemente como, por exemplo, descrito em mais detalhes em WO/2008/052774 que é aqui incorpora- do por referência.
[00163] Quando aqui usado preferivelmente, o termo tratamento compreende em uma Modalidade preferida, adicional ou alternativa- mente, prevenção e/ou acompanhamento.
[00164] Como preferivelmente usado neste documento, os termos doença e distúrbio devem ser usados de maneira alternável, se não houver indicação em contrário.
[00165] Quando aqui usado, o termo compreende não se destina, preferivelmente, a limitar o assunto seguido ou descrito por tal termo. No entanto, em uma Modalidade alternativa, o termo compreende de- ve ser entendido no significado de conter e, assim, limitar o assunto seguido ou descrito por tal termo.
[00166] As várias SEQ. ID. Nos:, a natureza química das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e as moléculas alvo CXCL8 quando aqui usadas, a sequência real das mesmas, e o número de referência interno estão resumidos na tabela a seguir.
TABELA 1 SEQ.
ID. NO:
Nome Sequência (N-terminal ---> C-terminal)
1 D-amino ácidos D-CXCL8 AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS-biotina (C-bio)(da mesma forma referido como “D-CXCL8 biotinilado”) 2 L-amino ácidos CXCL8 da mesma forma referida como “L-CXCL8”) AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS
SEQ ID NO: Nome Sequência (5’---> 3’) 3 D-RNA 315-H9-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCGGUCAGC 4 D-RNA 315-F11-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCGGUGAGC 5 D-RNA 315-F8-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAGC 6 D-RNA 315-F8-002 CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG
90/115 7 D-RNA 315-F8-003 UGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCA 8 D-RNA 315-F8-004 GACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUC 9 D-RNA 315-F8-005 GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC 10 D-RNA 315-F8-006 GGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCC 11 D-RNA 315-F8-007 GCACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUGC 12 D-RNA 315-F8-008 GGUCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGACC 13 D-RNA 315-F8-009 UGGCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGCCA 14 L-RNA 315-H9-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCGGUCAGC 15 L-RNA 315-F11-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCGGUGAGC 16 L-RNA 315-F8-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAGC 17 L-RNA 315-F8-002 CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG 18 L-RNA 315-F8-003 UGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCA 19 L-RNA 315-F8-004 GACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUC 20 L-RNA 315-F8-005 GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC 21 L-RNA 315-F8-006 GGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCC 22 L-RNA 315-F8-007 GCACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUGC 23 L-RNA 315-F8-008 GGUCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGACC 24 L-RNA 315-F8-009 UGGCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGCCA 25 L-RNA 315-F8-002-PEG, 315-F8-002-5’-PEG PEG-Ligante-CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG; Ligante = amino-hexila 26 L-RNA 315-F8-002-Amino, 315-F8-002-5’-Amino NH2-Ligante-CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG; 27 GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG em que XU é U ou ausente 28 GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 29 GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 30 GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG
31 reverso 315-F8-002-Amino NH2-Ligante-GACUGGCCCUGUGUGAAAGCCGAAAGGUGCAUGAAGGCAGUC
SEQ ID NO: Nome Sequência (N-terminal ---> C-terminal) 32 L-amino ácidos CXCL1 ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN
33 L-amino ácidos CXCL2 APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVIATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN 34 L-amino ácidos CXCL3 ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEVIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN
35 L-amino ácidos CXCL5 AGPAAAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCSKVEVVASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN 36 L-amino ácidos CXCL6 GPVSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSKVEVVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN
37 L-amino ácidos CXCL7 SSTKGQTKRNLAKGKEESLDSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD
91/115 38 L-amino ácidos CCL5 SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
SEQ. ID.
NO: Nome Sequência (5’---> 3’) 39 L-RNA 315-F8-002-3’-PEG CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG-Ligante-PEG; Ligante = amino-hexila 40 L-RNA 315-F8-002-3’-Amino CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG-Ligante-Amino; Ligante = amino-hexila
41 L-RNA 315-F8-005-5’-PEG PEG-Ligante-GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC; Ligante = amino-hexila 42 L-RNA 315-F8-005-5’-Amino NH2-Ligante-GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC; Ligante = amino-hexila 43 L-RNA 315-F8-005-3’-PEG GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC-Ligante-PEG; Ligante = amino-hexila 44 L-RNA 315-F8-005-3’-Amino GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC-Ligante-Amino; Ligante = amino-hexila 45 D-RNA 8A-35 5'-GGGGGCUUAUCAUUCCAUUUAGUGUUAUGAUAACC-3’ (Sung, Biomaterials 2014) C = 2’Fluoro-C; U = 2’Flúor-U
PEG = 40kD-polietileno glicol em forma de Y
[00167] As características da presente invenção descritas no relató- rio descritivo, nas reivindicações, na listagem de sequências e/ou nos desenhos podem ser ambas separadamente e em qualquer combina- ção destes materiais para realizar a invenção em várias formas.
[00168] A presente invenção é ainda ilustrada pelas figuras, exem- plos, e a listagem de sequência a partir da qual outras características, Modalidades e vantagens podem ser tomadas, em que
[00169] A Fig. 1 mostra um alinhamento de sequências de molécu- las de ácido nucleico capazes de se ligar à CXCL8 de humano, inclu- indo o valor de KD determinado por ensaio de ligação pull-down de competição;
[00170] A Fig. 2 mostra derivados truncados da molécula de ácido nucleico 315-F8-001 incluindo o valor de KD, e a atividade de ligação relativa à CXCL8 de humano conforme determinado por ensaio de li- gação pull-down de competição e/ou por medição de ressonância de plasmônio superficial;
[00171] A Fig. 3 mostra a avaliação cinética por ensaio de ligação pull-down de competição das moléculas de ácido nucleico 315-F8-001 e 315-F8-002 a D-CXCL8;
[00172] A Fig. 4 mostra a ligação da molécula de ácido nucleico 315-F8-002 a CXCL8 a (A) 25 °C e (B) 37 °C, conforme determinado pela medição de ressonância de plasmônio superficial. A constante de associação ka, e a constante de dissociação kd são fornecidas;
[00173] A Fig. 5 mostra a ligação da molécula de ácido nucleico 315-F8-002-PEG a CXCL8 a (A) 25 °C e (B) 37 °C, conforme determi- nado pela medição de ressonância de plasmônio superficial. A cons- tante de associação ka, e a constante de dissociação kd são forneci- das;
[00174] A Fig. 6 mostra a seletividade da ligação de 315-F8-002 para CXCL8, conforme determinado por um por um ensaio de ligação competitivo usando medição de ressonância de plasmônio superficial;
[00175] A Fig. 7 mostra a inibição da quimiotaxia induzida por CXCL8 de células que expressam CXCR2 pela molécula de ácido nu- cleico 315-F8-002-PEG;
[00176] A Fig. 8 é um diagrama de barras que mostra a quantifica- ção de CXCL8 pela molécula de ácido nucleico 315-F8-002 (Fig. 8A), e a quantificação de CCL5 pela molécula de ácido nucleico 315-F8- 002 (Fig. 8B); e
[00177] A Fig. 9 é um diagrama de barras que mostra a ligação do L-aptâmero 315-F8-002 (Fig. 9A) e do aptâmero 8A-35 (Fig. 9B) a CXCL8 e CXCL1 solúveis em diferentes concentrações. Exemplo 1: Ácidos Nucleicos Capazes de se ligarem à CXCL8 de humano
[00178] Vários ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 e seus deriva- dos foram identificados, cujas sequências de nucleotídeos são apre- sentadas nas Figuras 1 a 2. Os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 foram testados como D-aptâmeros (ácidos D-nucleicos) e L-aptâmeros (ácidos L-nucleicos ), em que os ácidos D-nucleicos e os ácidos L- nucleicos foram sintetizados conforme descrito no Exemplo 2.
[00179] Os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 foram caracteriza- dos a) como D-aptâmeros por ensaios de ligação pull-down a D- CXCL8 biotinilado (SEQ ID NO: 1) como mostrado no Exemplo 3; e b) como L-aptâmeros por medição de ressonância de plas- mônio superficial (SPR) (Exemplo 4), e por um ensaio in vitro com cé- lulas que expressam o receptor CXCR2 humano, em que para ambos os métodos L-CXCL8 (SEQ ID NO: 2) foi usado (Exemplo 5).
[00180] Os ácidos nucleicos assim gerados exibem sequências li- geiramente diferentes, pelo que as sequências podem ser resumidas ou agrupadas como uma família de sequências.
[00181] Para a definição de motivos de sequência de nucleotídeos, as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos são usadas: S forte G ou C; W fraco A ou U (T); R purina G ou A; Y pirimidina C ou U (T); K ceto G ou U (T); M imino A ou C; B não A C ou U (T) ou G; D não C A ou G ou U (T); H não A ou C ou U (T); V não U A ou C ou G; N todos A ou G ou C ou U (T)
[00182] Se não for indicado o contrário, qualquer sequência de áci- do nucleico ou sequência de trechos, respectivamente, é indicada na direção 5'  3’.
[00183] Conforme representado nas Figuras 1 a 2, os ácidos nu- cleicos de ligação à CXCL8 compreendem um trecho central de nucle- otídeos que definem um motivo de ligação à CXCL8 potencial, em que a Figura 1 mostra as diferentes sequências da família de sequências, e a Figura 2 mostra derivados truncados do ácido nucleico de CXCL8 315-F8- 001 incluindo ácido nucleico de CXCL8 315-F8-002-PEG.
[00184] Em geral, as moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8 compreendem os trechos terminais de extremidade 5' e de ex- tremidade 3’ de nucleotídeos: o primeiro trecho terminal de nucleotí- deos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos. O primeiro trecho terminal de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos podem hibridizar entre si, pelo que, após a hibridização, uma estrutura de fita dupla é formada. No entanto, essa hibridização não é necessa- riamente dada na molécula in vivo e in vitro.
[00185] Os três trechos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8 - o primeiro trecho terminal de nucleotí- deos, o trecho central de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos - são arranjados entre si na direção 5'  3’: o primeiro trecho terminal de nucleotídeos - o trecho central de nucleotídeos - o segundo trecho terminal de nucleotídeos. No entanto, alternativamen- te, o primeiro trecho terminal de nucleotídeos, o trecho central de nu- cleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos são arranja- dos um ao outro na direção 5'  3’: o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos - o trecho central de nucleotídeos - o primeiro trecho termi- nal de nucleotídeos.
[00186] As sequências dos trechos definidos podem ser diferentes entre as moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8 que influen- ciam a afinidade de ligação à CXCL8. Com base na análise de ligação das diferentes moléculas de ácido nucleico de ligação à CXCL8, o tre- cho central de nucleotídeos e suas sequências de nucleotídeos con- forme descrito a seguir são individualmente e mais preferivelmente em sua totalidade essenciais para a ligação à CXCL8.
[00187] Os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 consistem em ri- bonucleotídeos (como mostrado nas Figuras 1 a 2).
[00188] Como mostrado na Figura 1, a sequência do trecho central de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315-H9-001, 315-F11-001 e 315-F8-001 é ligeiramente diferente: 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ (315-H9- 001), 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3’ (315-F11- 001), 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ (315-F8- 001).
[00189] O trecho central de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 de acordo com a presente invenção compreende 32 - 33 nt e pode ser resumido na sequência de consenso: 5 ’GGAA- GUACGUGGAAAGCCRA (XU) RAGUGUGUCCCG 3’, em que XU é U ou ausente.
[00190] Os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 com a melhor afi- nidade de ligação à CXCL8, o que significa que os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 com a maior afinidade de ligação à CXCL8 ou a constante de dissociação mais baixa Kd para CXCL8, compreendem um trecho central de nucleotídeos com uma sequência de 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ (315-F8-001) e 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ (315-H9- 001), em que um trecho central de nucleotídeos com uma sequência de 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ (315-F8-001) leva à melhor afinidade de ligação de um ácido nucleico de CXCL8 para CXCL8.
[00191] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, o primeiro trecho termi- nal de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos de ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 compreendem seis nucleotídeos, cinco nucleotídeos, quatro nucleotídeos ou três nucleotídeos em que os trechos hibridizam opcionalmente entre si, em que após a hibridiza- ção uma estrutura de fita dupla é formada. Essa estrutura de fita dupla pode consistir em seis, cinco, quatro ou três pares de bases. No entan- to, essa hibridização não é necessariamente dada na molécula.
[00192] Como mostrado na Figura 1, o primeiro, e o segundo tre- chos de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315- H9-001, 315-F11-001 e 315-F8-001 compreendem seis nucleotídeos, respectivamente: a) Ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315-H9-001 e 315-F8-001 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GU- CAGC 3’; b) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F11-001 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos com- preende uma sequência de nucleotídeos de 5 'GUGAGC 3’.
[00193] Como mostrado na Figura 2, o primeiro, e o segundo tre- chos de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 com- preendem cinco, quatro ou três nucleotídeos, respectivamente: a) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- endem uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; b) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-005 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos com- preende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’; c) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-003 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ UGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCA 3’; d) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-006 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCC 3’; e) ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-007 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre-
ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGC 3’; f) ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-008 – o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGUC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GACC 3’; g) ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-009 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ UGGC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCCA 3’; h) ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-004 – o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreen- de uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUC 3’.
[00194] O primeiro trecho terminal de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos de todas as moléculas de ácido nu- cleico de ligação à CXCL8 testadas podem ser resumidos na seguinte fórmula genérica para o primeiro trecho terminal de nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos: a fórmula genérica para o primeiro trecho terminal de nucleotídeos é 5’ Z1Z2Z3Z4Z5C 3’, e a fórmula genérica para o segundo trecho terminal de nucleotídeos é 5’ GZ6Z7Z8Z9 Z10 3’, em que Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é K ou ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M ou ausente, Z9 é S ou ausente, e Z10 é C ou ausente, pelo qual em uma primeira Modalidade preferida q) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou r) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou s) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou t) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou u) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou v) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou w) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou x) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou y) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou z) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou aa) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou bb) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é au- sente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou cc) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou dd) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou ee) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou ff) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente.
[00195] Os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 com a melhor afi- nidade de ligação à CXCL8, o que significa que os ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 com a maior afinidade de ligação à CXCL8 ou a constante de dissociação mais baixa Kd para CXCL8, compreendem os seguintes primeiro e segundo trechos terminais de nucleotídeos: a) Ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315-H9-001 e 315-F8-001 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GU- CAGC 3’; b) Ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; c) ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-005 - o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos com- preende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3'.
[00196] Os valores de Kd dos ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315-F8-001, 315-H9-001 e 315-F11-001 (compreendendo trechos ter- minais com seis nucleotídeos) foram medidos na faixa de 1,5 - 12,5 nM, conforme determinado em um ensaio de ligação pull-down de competição (Figuras 1 a 3). Em um formato de ensaio pull-down direto, ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-001 mostrou um valor de Kd de 0,8 nM. Usando a medição de ressonância de plasmônio super- ficial, um método mais sensível para determinar valores de Kd, o Kd para ácido nucleico de ligação à CXCL8 315- F8-001, era 0,22 nM a 25 °C e 0,68 nM a 37 °C (Figura 2).
[00197] Foi surpreendentemente descoberto que o truncamento do primeiro trecho terminal de seis para cinco nucleotídeos, e o trunca- mento do segundo trecho terminal de seis para cinco nucleotídeos não teve efeito negativo na afinidade de ligação à CXCL8. A afinidade de ligação do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 conforme medido pelo ensaio pull-down de competição (Kd de 1,1 nM; Figuras 2 e 3) e por medição de ressonância de plasmônio superficial (Kd de 0,22 nM a 25 °C e de 0,75 nM a 37 °C; Figuras 2 e 4) está na faixa de afinidade de ligação conforme determinado para o ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-001 (veja, valores de Kd para 315-F8-001 supra).
[00198] As tentativas de truncar e/ou mutar ainda mais os trechos terminais do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 resulta- ram em ácidos nucleicos de ligação à CXCL8 315-F8-003, 315-F8- 004, 315 F8 005, 315-F8-006, 315-F8-007, 315-F8-008 e 315-F8-009 com afinidades de ligação inferiores (315-F8-003, 315-F8-004, 315-F8- 006, 315-F8-007, 315-F8-008, e 315-F8-009) ou semelhantes (315-F8- 005) para CXCL8 (Figura 2).
[00199] Para a variante 5'-40 kDa-PEGuilada do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002, o ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002-PEG (também referido como AON-S08) uma Kd de 0,2 nM a 25 °C e 0,8 nM a 37 °C foi determinada por medição de ressonância de plasmônio superficial (Figuras 2 e 5).
[00200] CXCL8 é uma das várias quimiocinas CXC humanas ELR- positivas. Ao lado de CXCL8, as quimiocinas CXC humanas ELR- positivas CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 se ligam ao receptor de CXCL8 CXCR2, em que as quimiocinas CXC humanas ELR-positivas CXCL6 e CXCL7 também se ligam ao receptor de CXCL8 CXCR8. Para mostrar a especificidade e seletividade das ca- racterísticas de ligação do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8- 002, a afinidade de ligação de ácido nucleico de ligação à CXCL8 315- F8-002 às quimiocinas CXC humanas ELR-positivas CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 foi testada por SPR em um ensaio de ligação competitivo (Exemplo 4). O ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 não mostrou ligação a qualquer outra quimiocina CXC humana ELR-positiva CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6,
CXCL7 (Figura 6).
[00201] O ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002-PEG ini- biu a quimiotaxia induzida por CXCL8 de células BA/F3 que expres- sam CXCR2 com uma constante inibitória média IC50 de 0,26 nM (Fi- gura 7, Exemplo 5).
[00202] Um biossensor com ácido nucleico de ligação à CXCL8 imobilizada 315-F8-002 foi usado para detectar e quantificar CXCL8. O limite de detecção (valor médio da linha de base + desvio padrão 3x dos valores da linha de base) foi < 98 pM de CXCL8, e o limite inferior de quantificação (valor médio da linha de base + desvio padrão 10x dos valores da linha de base) também foi < 98 pM de CXCL8 (Figura 8A, Exemplo 6). A fim de mostrar a especificidade do ácido nucleico de ligação à CXCL8 imobilizada 315-F8-002, uma quimiocina diferente (CCL5) foi usada como analisado. Nenhuma ligação de CCL5 foi me- dida em concentrações de até 12,5 nM (Figura 8B, Exemplo 6). Exemplo 2: Síntese de D- e L- Aptâmeros Síntese em fase sólida em pequena escala
[00203] D-aptâmeros (ácidos D-nucleicos) e L-aptâmeros (ácidos L- nucleicos) foram produzidos por síntese de fase sólida com um sinteti- zador ABI 394 (Applied Biosistems, Foster City, CA, USA) usando química de 2’TBDMS RNA fosforamidita (Damha e Ogilvie, 1993). L- rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-, D-rA(N-Bz)-, D-rC(Ac)-, D- rG(N-ibu)-, D-rU- fosforamiditas foram adquiridos em ChemGenes, Wilmington, MA. Os D- e L-aptâmeros foram purificados por eletrofore- se em gel. Síntese em fase sólida em larga escala
[00204] Os L-aptâmeros foram produzidos por síntese de fase sóli- da com um sintetizador ÄktaPilot100 (Amersham Biosciences; General Electric Healtcare, Freiburg) usando 2'TBDMS RNA e química de DNA fosforamidita (Damha and Ogilvie, 1993). L-rA (N-Bz)-, L-rC (Ac)-, L-rG
(N-ibu)- e L-rU- foram adquiridos de ChemGenes, Wilmington, MA. O modificador 5'-amino foi adquirido da American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA). A síntese do L-aptâmero não modificado ou modificado com 5'-amino foi iniciada em L-riboA, L-riboC, L-riboG ou L-riboU, tamanho de poro de CPG modificado 1000 A (Link Techno- logi, Glasgow, UK. Para acoplamento de RNA fosforamiditas (15 min por ciclo), benziltiotetrazol 0,3 M (CMS-Chemicals, Abingdon, UK) em acetonitrila e 2 equivalentes da respectiva solução de fosforamidita 0,2 M em acetonitrila foram usados. Um ciclo de tamponamento contra oxidação foi usado. Outros solventes e reagentes padrão para a sínte- se de oligonucleotídeos foram adquiridos de Biosolve (Valquenswaard, NL). O L-aptâmero foi sintetizado DMT-ON; após a desprotecção, foi purificado via RP-HPLC preparativa (Wincott et al., 1995) usando meio Sourcel5RPC (Amersham). O grupo 5'DMT foi removido com 80 % de ácido acético (30 min à RT). No caso de L-aptâmeros 5'aminomodificados, o grupo 5'MMT foi removido com 80 % de ácido acético (90 min à RT). Posteriormente, foi adicionada solução aquosa de NaOAc 2 M, e o L-aptâmero foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada de 5 K (Mil- lipore, Bedford, MA). PEGilação de L-aptâmeros
[00205] Para prolongar o tempo de residência do L-aptâmero no plasma in vivo, o L-aptâmero foi covalentemente acoplado a uma por- ção de polietileno glicol (PEG) de 40 kDa na extremidade 5’. Para PE- Gilação (para detalhes técnicos do método de PEGilação, veja o pedi- do de patente Europeia EP 1 306 382), o L-aptâmero modificado com 5' amino purificado foi dissolvido em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml) e tampão A (5 ml; preparado pela mistura de ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml] e NaOH 1 M [343 ml] e adição de água a um volume final de 1 l; pH = 8,4 foi ajusta-
do com HCl 1 M).
[00206] O pH da solução de L-aptâmero foi levado a 8,4 com NaOH 1 M. Em seguida, 40 kDa de PEG-NHS éster (Jenkem Technology, Allen, TX, USA) foi adicionado a 37 °C a cada 30 min em seis porções de 0,25 equivalente até um rendimento máximo de 75 a 85 % ser al- cançado. O pH da mistura de reação foi mantido a 8 - 8,5 com NaOH 1 M durante a adição do PEG-NHS éster.
[00207] A mistura de reação foi misturada com 4 mL de solução de ureia (8 M) e 4 mL de tampão B (acetato de trietilamônio 0,1 M em H2O) e aquecida a 95 °C durante 15 min. O L-aptâmero PEGilado foi, então, purificado por RP-HPLC com meio Source 15RPC (Amersham), usando um gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato de trietilamônio 0,1 M em acetonitrila). O excesso de PEG eluiu em 5 % de tampão C, L-aptâmero PEGilado em 10-15 % de tampão C. As fra- ções do produto com uma pureza de >95 % (conforme avaliado por HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 ml de NaOAc 3 M. O L-aptâmero PEGilado foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA). Exemplo 3: Ensaios de Ligação Pull-Down Ensaio pull-down direto para determinação de constantes de ligação de D-aptâmeros
[00208] Os ensaios pull-down diretos são usados para determinar a afinidade de D-aptâmeros para D-CXCL8 (C-bio) (SEQ ID NO: 1). Para este propósito, D-aptâmeros são radioativamente marcados pelo T4 polinucleotídeo cinase (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) usando [- 32P]-ATP (Hartmann Analitic, Braunschweig, Germany). A radioativi- dade específica dos D-aptâmeros marcados era 110.000 – 300.000 cpm/pmol. D-aptâmeros marcados são incubados a uma concentração de 0,2 nM em tampão de seleção (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, Tween 20 0,1 %, 100 µg/ml de albumina sérica bovina livre de ácido graxo essencial, 200 µg/ml de RNA de levedura) juntamente com quantidades variáveis de D-CXCL8 (C-bio) variando de 0,0192 a 300 nM por 1,5 - 2 horas a 37 °C. Os complexos D-CXCL8 (C-bio)/D-aptâmero são imobilizados em contas de NAag+ (Neutravidin agarose plus from Pierce Biotechnology, Rock- ford, USA) pré-equilibrados em tampão de seleção. Após a separação do sobrenadante, e a lavagem apropriada, a radioatividade ligada à conta é medida em um contador de cintilação (LS6500; Beckman Coulter, Fullerton, USA). A quantidade de D-aptâmero, rotulado imobi- lizado (% de entrada) é representada graficamente contra a concen- tração de D-CXCL8 (C-bio) e as constantes de dissociação Kd são ob- tidas usando algoritmos de software (GRAFIT; Eritacus Software; Sur- rey UK) assumindo uma estequiometria 1:1.
[00209] Para os aptâmeros de ligação à CXCL8 315-H9-001 e 315- F8-001, valores de Kd de 1,7 nM e 0,8 nM foram determinados por en- saio pull-down direto, respectivamente. Ensaio pull-down de competição para classificação e determinação de constantes de ligação de D-aptâmeros
[00210] Os ensaios pull-down de competição são usados para comparar as afinidades de D-aptâmeros de ligação a D-CXCL8(C-bio) diferentes. Para este propósito, um D-D-aptâmeroe referência é mar- cado radioativamente (como descrito acima) e incubado a 37 °C com D-CXCL8(C-bio) em tampão de seleção em condições que resultam em um sinal de ligação não saturado após imobilização em NAag+ e lavagem (por exemplo, D-CXCL8(C-bio) 3 nM, D-aptâmero marcado 0,15 nM). A adição de uma quantidade em excesso de um D-aptâmero não marcado que compete com o D-aptâmero marcado pela ligação a D-CXCL8(C-bio) resulta em uma diminuição na quantidade de radioa- tividade ligada à conta após imobilização e lavagem. O grau de redu- ção do sinal depende da quantidade e afinidade do D-aptâmero não marcado. Os ensaios pull-down de competição são usados para expe- rimentos de classificação e para determinar constantes de dissociação (Kd) de D-aptâmeros selecionados. As constantes de dissociação Kd são determinadas plotando a fração (em %) de um D-aptâmero mar- cado ligado a D-CXCL8(C-bio) contra a concentração do D-aptâmero competitivo não marcado. As análises de dados foram realizadas com GRAFIT.
[00211] Os resultados dos ensaios de ligação pull-down são especi- ficados no Exemplo 1 e mostrados nas Figuras 1, 2 e 3, em que como D-aptâmero marcado, o ácido nucleico de CXCL8 315-F8-001 foi usa- do. Exemplo 4: Ensaios de Ligação de Ressonância de Plasmônio Superficial (SPR)
[00212] As medições de ressonância de plasmônio superficial foram realizadas em um instrumento Biacore 2000 (GE Healtcare) ajustado para uma temperatura constante de 25 °C ou 37 °C. As proteínas fo- ram imobilizadas em chips sensores CM4 (GE Healtcare) por acopla- mento de amina. A superfície do chip sensor foi ativada por injeção de uma mistura 1:1 de 0,4 M de EDC (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida; GE) e 0,1 M de NHS (N- hidroxissuccinimida; GE). A resposta máxima observada para o peptí- deo ou proteína imobilizada covalentemente foi de cerca de 500 RU. As células de fluxo foram bloqueadas com cloridrato de etanolamina 1 M (GE, BR-1000-50). O peptídeo ou proteína não covalentemente li- gado também é removido por este procedimento. Uma célula de fluxo com superfície não tratada de dextrano e uma célula de fluxo com su- perfície bloqueada por etanolamina serviram como controles. Antes da medição, o chip sensor foi preparado duas vezes com tampão fluente fisiológico desgaseificado (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM e CaCl2 1 mM) e passou por pelo menos três ciclos de injeção e regeneração (NaCl 5 M).
[00213] As afinidades de ligação dos L-aptâmeros foram medidas por injeção de uma série de concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95, 0,98, 0,49, 0,24, 0,12, 0,06 nM e regis- tro da fase de associação e dissociação do evento de ligação. As cur- vas de ligação resultantes foram ajustadas a um modelo de ligação estequiométrico Langmuir 1:1 para determinar as constantes de taxa cinética de ligação (constantes de associação ka; constante de disso- ciação kd) que são usadas para calcular a constante de dissociação (Kd = kd/ka). A análise dos dados foi feita com o software BIAevalua- tion 3.1.1 (BIACORE AB, Uppsala, Sweden) com um valor de índice de refração constante (RI) e um coeficiente de transporte de massa inicial kt de 1 x 10e7 (RU∙M-1s-1).
[00214] A seletividade da ligação de L-aptâmero foi avaliada por ensaios de ligação competitivos. Para este propósito, quimiocinas hu- manas CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 e CXCL8 (adquiridas de RnD Systems, PeproTech or ProSpecTech) foram inje- tadas individualmente a 40 nM junto com o L-aptâmero e ácido nuclei- co de ligação à CXCL8 315-F8-002 (0,25 nM) para competir pela liga- ção do L-aptâmero à CXCL8 imobilizada. Como um controle, quimioci- nas foram injetadas na ausência do L-aptâmero para monitorar a liga- ção à matriz de dextrano do chip sensor ou/e CXCL8 imobilizada. A ligação de 315-F8-002 à CXCL8 imobilizada foi registrada em um pon- to de relatório predefinido 240 s após o final da injeção. As quimiocinas selecionadas foram imobilizadas e as afinidades de ligação do L-D- aptâmeroo do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 foram determinadas conforme descrito acima.
[00215] Os resultados dos ensaios de ligação a SPR são especifi- cados no Exemplo 1 e mostrados nas Figuras 2, 4, 5 e 6. Exemplo 5: Farmacologia In Vitro - Ensaio de Quimiotaxia
[00216] A linhagem celular pro-B de camundongo BA/F3 foi trans- fectada de forma estável usando um plasmídeo que codifica para o CXCR2 humano. Para ensaios de quimiotaxia, CXCL8 recombinante (0,5 nM) foi pré-incubada com o L-aptâmero do ácido nucleico de liga- ção à CXCL8 315-F8-002-PEG nas concentrações indicadas em tam- pão HBH (solução salina balanceada de Hanks (HBSS) + 1 mg/ml de BSA + HEPES 20 mM) nos compartimentos inferiores de uma placa Corning Transwell de 96 cavidades com poros de 5 μm (Costar Cor- ning, NY) a 37 °C por 20 - 30 minutos. Células CXCR2+ em tampão HBH foram adicionadas aos compartimentos superiores e puderam migrar a 37 °C por 3 horas. Após a remoção dos compartimentos su- periores, 50 μM de resazurina (Sigma-Aldrich) em PBS foram adicio- nados aos compartimentos inferiores e incubados a 37 °C por 2,5 ho- ras. A fluorescência foi medida em 590 nm (comprimento de onda de excitação 544 nm). Os valores de fluorescência corrigidos e normali- zados antecedentes foram plotados graficamente contra a concentra- ção de L-aptâmero. Os valores de IC50 da constante inibitória (concen- trações de L-aptâmero necessárias para metade da inibição máxima) foram determinados com regressão não linear (ajuste de 4 parâme- tros) usando o software Prism 5 (GrafPad Software, San Diego, CA).
[00217] Os resultados dos ensaios de quimiotaxia são especifica- dos no Exemplo 1 e mostrados na Figura 7. Exemplo 6: Biossensor de CXCL8
[00218] Chips sensores SPR revestidos com nanomembrana de carbo terminada em azida foram preparados, e o L-aptâmero de liga- ção à CXCL8 315-F8-002-DBCO (uma variante modificada por DBCO de 315-F8-002-Amino) foi imobilizado de uma solução de 20 µM em NaCl 2 M em uma célula de fluxo de um sistema Biacore comercial (a cerca de 1000 RU). Como referência, o L-aptâmero não funcional (DBCO-modificado reverso 315-F8-002-Amino), foi imobilizado em uma quantidade semelhante em outra célula de fluxo. As superfícies foram passivadas por imobilização de polietileno glicol terminado em metóxi linear modificado por DBCO (MW: 5kDa). A injeção de uma sé- rie de concentrações do analisado CXCL8 que foi reforçado a um tam- pão de amostra padrão (Universal Transport Medium from Copan) com a adição de 0,1 % (p/v) de Tween20 mostrou um aumento dependente da dose do sinal. A temperatura da medição foi de 25 °C, o fluxo foi de 30 µL/min, e o tampão fluente foi o tampão de medição (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl2 1 mM, 0,1 % (c/v) Tween20). O analisado foi permitido associar por 10 min seguido por um tempo de dissociação em tampão de medição de 2,5 min. O sinal no final da fase de dissociação foi referenciado por subtração do sinal na célula de fluxo de referência.
[00219] Os resultados do biossensor de CXCL8 são especificados no Exemplo 1 e mostrados na Figura 8. Exemplo 7: Ensaio de Ligação a SPR para Comparação de Liga- ção a Quimiocinas Solúveis
[00220] A atividade inibitória de um aptâmero depende de sua ca- pacidade de se ligar ao seu alvo em solução. Aqui, um ensaio de liga- ção a SPR competitivo foi usado para determinar a ligação do L- aptâmero do ácido nucleico de ligação à CXCL8 315-F8-002 de acordo com a presente invenção, e o aptâmero 8A-35 publicado anteriormente (Sung, Biomaterials 2014) às CXCL8 e CXCL1 solúveis . Para este propósito, as medições de SPR foram realizadas conforme descrito no Exemplo 4 com CXCL8 sendo imobilizada em um chip sensor C1 (GE Healtcare) por acoplamento de amina. A ligação de 315-F8-002 (3 nM) ou 8A-35 (1,6 nM) à CXCL8 imobilizada resultou em uma resposta de ligação de aproximadamente 20 unidades de resposta. Nos ensaios de ligação a 8A-35, os chips sensores foram regenerados usando solução de CaCl2 1M. Para avaliar a ligação de ambos os aptâmeros ao seu alvo em solução, CXCL8 solúvel foi injetada concomitantemente na concentração equimolar (relação de 1:1) ou em excesso de 5 vezes (relação de 1:5) para competir com a ligação do aptâmero à CXCL8 imobilizada. A ligação à CXCL1 solúvel foi usada como um controle. Todas as medições foram realizadas a 37 °C. As respostas de ligação à CXCL8 imobilizada foram registradas 240 s após a injeção.
[00221] A ligação de 315-F8-002 à CXCL8 imobilizada foi comple- tamente bloqueada (> 90 %) por uma concentração equimolar de CXCL8 solúvel (Figura 9A). Em contraste, a ligação de 8A 35 foi ape- nas parcialmente bloqueada por CXCL8 solúvel em equimolar (apro- ximadamente 30 %) e em concentração de excesso de 5 vezes (apro- ximadamente 45 %) (Figura 9B). Isso mostra que 315-F8-002 tem uma afinidade de ligação mais alta para CXCL8 solúvel em comparação com 8A-35. Uma afinidade de ligação reduzida à CXCL8 solúvel (com- parado a CXCL8 imobilizada na superfície) pode explicar a fraca ativi- dade inibitória de 8A-358 observada em um ensaio de migração de neutrófilos induzida por CXCL8 (Sung, Biomaterials 2014).
[00222] CXCL1 solúvel foi usada como um controle, pois 315-F8- 002 mostrou não ter reatividade cruzada com outras quimiocinas ELR- positivas (Figura 6). De acordo, a ligação de 315-F8-002 não foi blo- queada por CXCL1 solúvel (Figura 9A). Surpreendentemente, a liga- ção de 8A-358 foi bloqueada por CXCL1 solúvel com eficácia seme- lhante à de CXCL8 solúvel (aproximadamente 25 % em equimolar e aproximadamente 35 % em concentração de excesso de 5 vezes) (Fi- gura 9B). Isso mostra que 8A-35, em contraste com 315-F8-002, não se liga seletivamente e inibe prospectivamente CXCL8 em solução. Referências
[00223] Os dados bibliográficos completos dos documentos citados neste documento, cuja descrição é incorporada por referência, são, se não for indicado o contrário, como segue.
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[00224] O projeto que deu origem a este pedido recebeu financia- mento do programa de pesquisa e inovação European Union’s Horizon 2020 sob acordo de subvenção No 634415.

Claims (103)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido L-nucleico capaz de se ligar à CXCL8 de humano, caracterizada pelo fato de que compreende um trecho central de nucleotídeos, em que o trecho central de nucleotídeos com- preende uma sequência de nucleotídeos de 5’-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG-3’ [SEQ. ID. NO: 27], em que XU é U ou ausente.
2. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que o trecho central de nucleotí- deos compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de d) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 28], e) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 29], e f) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 30].
3. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizada pelo fato de que o trecho central de nucleotí- deos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 30] ou 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 28], preferivelmente 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ. ID. NO: 30].
4. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compre- ende na direção 5'  3’ um primeiro trecho terminal de nucleotídeos, o trecho central de nucleotídeos e um segundo trecho terminal de nucle-
otídeos, em que o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende três a seis nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende três a seis nucleotídeos, em que preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende cin- co a seis nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende cinco a seis nucleotídeos, em que mais preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende cin- co nucleotídeos, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende cinco nucleotídeos.
5. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 4, caracterizada pelo fato de que o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ Z1Z2Z3Z4Z5C 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compre- ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GZ6Z7Z8Z9Z10 3’, em que Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é K ou ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M ou ausente, Z9 é S ou ausente, e Z10 é C ou ausente; em que preferivelmente gg) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou hh) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou ii) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou jj) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou kk) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou ll) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou mm) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é C; ou nn) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou oo) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou pp) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou qq) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou rr) Z1 é ausente, Z2 é S, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é au- sente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou ss) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou tt) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é S, e Z10 é ausente; ou uu) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é K, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é ausente, Z9 é ausente, e Z10 é ausente; ou vv) Z1 é ausente, Z2 é ausente, Z3 é ausente, Z4 é S, Z5 é D, Z6 é H, Z7 é S, Z8 é M, Z9 é ausente, e Z10 é ausente.
6. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que: a) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se-
quência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; b) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho termi- nal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAGC 3’; ou c) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho termi- nal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAGC 3’; d) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’; e) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ UGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCA 3’; f) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCC 3’; g) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GCAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGC 3’; h) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GGUC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de
5’ GACC 3’; i) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ UGGC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCCA 3’; j) o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma se- quência de nucleotídeos de 5’ GAC 3’, e o segundo trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUC 3’; em que preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’; ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAGC 3’ ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’; em que mais preferivelmente o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAG 3’ ou o primeiro trecho terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUGAC 3’, e o segundo trecho terminal de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GUCAC 3’.
7. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compre- ende 40 a 45 nucleotídeos, preferivelmente 42 a 45 nucleotídeos, mais preferivelmente 42 nucleotídeos.
8. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, a molécula de ácido L-nucleico caracte- rizada pelo fato de que consiste em ribonucleotídeos.
9. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, a molécula de ácido L-nucleico caracte- rizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NOs: 14 a 26 e 39 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico compreende uma molécula de ácido L- nucleico tendo uma identidade de pelo menos 75 % com a molécula de ácido L-nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NOs: 14 a 26 e 39 a 44, ou a molécula de ácido L-nucleico compreende uma molécula de ácido L- nucleico que é homóloga à molécula de ácido L-nucleico compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NOs: 14 a 26 e 39 a 44, em que a homologia é de pelo menos 75 %.
10. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 9, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 25, SEQ. ID. NO: 26, SEQ. ID. NO: 39, SEQ. ID. NO: 40, SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NOs: 41 a 44, ou a mo- lécula de ácido L-nucleico compreende uma molécula de ácido L-
nucleico tendo uma identidade de pelo menos 75 % com a molécula de ácido L-nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 25, SEQ. ID. NO: 26, SEQ. ID. NO: 39, SEQ. ID. NO: 40, SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NOs: 41 a 44, ou a molécula de ácido L- nucleico compreende uma molécula de ácido L-nucleico que é homó- loga à molécula de ácido L-nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 25, SEQ. ID. NO: 26, SEQ. ID. NO: 39, SEQ. ID. NO: 40, SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NOs 41 a 44, em que a homologia é de pelo menos 75 %.
11. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é capaz de se ligar à CXCL8, em que preferivelmente CXCL8 é CXCL8 de hu- mano, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cachorro, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho-da-índia.
12. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é capaz de ligação específica à CXCL8, preferivelmente CXCL8 de humano, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cachorro, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho-da-índia, mais preferivelmente CXCL8 de humano.
13. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que não se liga a ou é incapaz de se ligar a quimiocinas CXC ELR-positivas dife- rentes de CXCL8, em que as quimiocinas CXC ELR-positivas diferen- tes de CXCL8 são preferivelmente selecionadas a partir do grupo que consiste em CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7.
14. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizada pelo fato de que não se liga a ou é incapaz de se ligar a quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 de humano, em que as quimiocinas CXC humanas ELR- positivas diferentes de CXCL8 de humano são preferivelmente seleci- onadas a partir do grupo que consiste em CXCL1 de humano, CXCL2 de humano, CXCL3 de humano, CXCL5 de humano, CXCL6 de hu- mano e CXCL7 de humano.
15. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade de ligação à CXCL8 de humano, expressa como KD, de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, e mais preferi- velmente de 100 pM ou menos e mais preferivelmente de 30 pM ou menos.
16. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade de ligação à CXCL8 de humano, expressa como IC50, de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, mais preferi- velmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos.
17. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade de ligação a quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, expressa como KD, de 100 nM ou mais, preferivelmente de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais.
18. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade de ligação a quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, expressa como IC50, de 100 nM ou mais, preferivelmente de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais.
19. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade de ligação à CXCL8 de humano, expressa como KD, de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, e mais preferi- velmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos, em que a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para quimiocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, ex- pressa como KD, de 100 nM ou mais, preferivelmente de 500 nM ou mais, e mais preferivelmente de 1000 nM ou mais, e/ou a molécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de liga- ção à CXCL8 de humano, expressa como IC50, de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, mais preferivelmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos, em que a mo- lécula de ácido L-nucleico tem uma afinidade de ligação para quimio- cinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, expressa como IC50, de 100 nM ou mais, preferivelmente de 500 nM ou mais, e mais prefe- rivelmente de 1000 nM ou mais.
20. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizada pelo fato de que a afini- dade de ligação é determinada à temperatura ambiente, preferivelmen- te a 25 °C.
21. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizada pelo fato de que a afini- dade de ligação é determinada a 37 °C.
22. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que é um antagonista de uma atividade mediada por CXCL8, preferivelmente CXCL8 de humano, CXCL8 de macaco, CXCL8 de coelho, CXCL8 de porco, CXCL8 de cachorro, CXCL8 de ovelha ou CXCL8 de porquinho- da-índia, mais preferivelmente CXCL8 de humano.
23. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi-
cação 22, caracterizada pelo fato de que não é um antagonista de quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 de humano ou é incapaz de antagonizar uma atividade mediada por qui- miocinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8, em que as quimio- cinas CXC ELR-positivas diferentes de CXCL8 são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7.
24. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 23, caracterizada pelo fato de que não é um antagonista de quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 de humano ou é incapaz de antagonizar uma atividade mediada por qui- miocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 de huma- no, em que as quimiocinas CXC humanas ELR-positivas diferentes de CXCL8 de humano são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em CXCL1 de humano, CXCL2 de humano, CXCL3 de hu- mano, CXCL5 de humano, CXCL6 de humano e CXCL7 de humano.
25. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada pelo fato de que a ativi- dade antagonista da molécula de ácido L-nucleico a uma atividade mediada por CXCR1 e/ou CXCR2 de humano, expressa como IC50, é de 10 nM ou menos, preferivelmente de 1 nM ou menos, mais preferi- velmente de 100 pM ou menos, e mais preferivelmente de 30 pM ou menos.
26. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que a ativi- dade antagonista da molécula de ácido L-nucleico a uma atividade mediada por CXCL8 de humano é determinada a 37 °C.
27. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que com- preende um grupo de modificação.
28. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 27, caracterizada pelo fato de que o grupo de modificação é acoplado ao nucleotídeo 5'- terminal e/ou ao nucleotídeo 3’-terminal da molécula de ácido L-nucleico e/ou a um nucleotídeo da molécula de ácido L-nucleico entre o nucleotídeo 5'-terminal da molécula de ácido L-nucleico, e o nucleotídeo 3’-terminal da molécula de ácido L- nucleico.
29. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 28, caracterizada pelo fato de que o gru- po de modificação é acoplado à molécula de ácido L-nucleico por meio de um ligante.
30. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 29, caracterizada pelo fato de que o ligante é um ligante hidrofí- lico, preferivelmente o ligante hidrofílico compreende uma ou mais uni- dades de etileno glicol, mais preferivelmente o ligante hidrofílico com- preende trietileno glicol, hexaetileno glicol ou polietileno glicol.
31. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 29, caracterizada pelo fato de que o ligante é um ligante biode- gradável.
32. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que a taxa de excreção da molécula de ácido L-nucleico que compreende o grupo de modificação de um organismo é diminuída em comparação com a taxa de excreção de um ácido L-nucleico que não compreende o grupo de modificação.
33. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que que compreende o grupo de modificação tendo um tempo de retenção au- mentado em um organismo em comparação com o tempo de retenção em um organismo de uma molécula de ácido L-nucleico não compre-
endendo o grupo de modificação.
34. Molécula de ácido L-nucleico, de a reivindicação 32 ou 33, caracterizada pelo fato de que o organismo é um corpo humano ou animal, preferivelmente um corpo humano.
35. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 34, caracterizada pelo fato de que o gru- po de modificação é selecionado a partir do grupo que compreende uma modificação biodegradável e uma modificação não biodegradável, preferivelmente o grupo de modificação é selecionado a partir do gru- po que compreende polietileno glicol, polietileno glicol linear, polietile- no glicol ramificado, hidroxietilamido, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um esterol, polioxipropileno, polioxamidato e poli (2- hidroxietil)–L-glutamina.
36. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 35, caracterizada pelo fato de que o grupo de modificação é um polietileno glicol, preferivelmente um polietileno glicol linear ou um po- lietileno glicol ramificado, em que preferivelmente o peso molecular do polietileno glicol é de cerca de 20.000 a cerca de 120.000 Da, mais preferivelmente de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais pre- ferivelmente cerca de 40.000 Da.
37. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 36, caracterizada pelo fato de que o peso molecular do polietile- no glicol é de cerca de 20.000 a cerca de 120.000 Da, preferivelmente de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da.
38. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 35, caracterizada pelo fato de que o grupo de modificação é hi- droxietilamido, em que preferivelmente o peso molecular do hidroxieti- lamido é de cerca de 50 a cerca de 1000 kDa, mais preferivelmente de cerca de 100 a cerca de 700 kDa e mais preferivelmente de 200 a 500 kDa.
39. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que o gru- po de modificação é para a imobilização da molécula de ácido L- nucleico.
40. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizada pelo fato de que a imobilização compreende a ligação covalente da molécula de ácido L-nucleico a uma superfície, em que preferivelmente a superfície é uma superfície de um vaso de reação, uma superfície de um dispositivo em um vaso de reação ou uma superfície de um biossensor.
41. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizada pelo fato de que a imobilização compreende a ligação não covalente da molécula de ácido L-nucleico a uma superfí- cie, em que preferivelmente a superfície é uma superfície de um vaso de reação, uma superfície de um dispositivo em um vaso de reação ou uma superfície de um biossensor.
42. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizada pelo fato de que o gru- po de modificação é selecionado a partir do grupo que compreende carboxila, hidroxila, fosfatidila, éster sulfônico, amina, tiol, epóxido, al- cina, cicloalcina deformada, maleimida, azida, hidrazida, em que prefe- rivelmente a cicloalcina deformada é selecionada a partir do grupo que compreende dibenzociclo-octila (DBCO), biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) e azadibenzociclo-octila (ADIBO).
43. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que o grupo de modificação é um cicloalcina deformada, preferivelmente dibenzociclo-octila (DBCO).
44. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 41, caracterizada pelo fato de que o grupo de modificação é bio-
tina, bromo-desoxiuridina, digoxigenina ou um oligonucleotídeo, prefe- rivelmente o grupo de modificação é biotina.
45. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que o gru- po de modificação permite a detecção da molécula de ácido L- nucleico, preferivelmente o grupo de modificação é um rótulo.
46. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que o rótulo é selecionado a partir do grupo que compreende biotina, bromo-desoxiuridina, digoxigenina, um oligonucleotídeo, um rótulo fluorescente, um rótulo de eletroquimo- luminescência, um rótulo radioativo, um rótulo enzimático, um rótulo UV, ouro coloidal, uma nanopartícula e um rótulo de molécula quelan- te.
47. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.
48. Molécula de ácido L-nucleico para uso, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que a doença está asso- ciada a um mecanismo patogênico mediado por CXCL8 e/ou é seleci- onada a partir do grupo que compreende uma doença inflamatória e câncer, em que, preferivelmente, a doença inflamatória é uma doença inflamatória do sistema respiratório, uma doença inflamatória da pele, uma doença autoimune, uma doença neurológica inflamatória, uma doença isquêmica, aterosclerose, rejeição ao transplante de ilhotas pancreáticas, rejeição ao transplante de órgão, função retardada de órgão, lesão da medula espinhal ou cistite.
49. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método para detectar CXCL8.
50. Molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um meio de detecção ou um biossensor.
51. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e, opcionalmente, um ou- tro constituinte, em que o outro constituinte é selecionado a partir do grupo que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, um transportador farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceu- ticamente ativo.
52. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 51, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e um transportador farmaceu- ticamente aceitável.
53. Uso de uma molécula de ácido L-nucleico, como defini- da em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento.
54. Uso, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para uso em medicina humana ou para uso em medicina veterinária.
55. Uso, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que está associada a um mecanismo patogênico me- diado por CXCL8 e/ou é selecionada a partir do grupo que compreen- de uma doença inflamatória e câncer, em que preferivelmente a doen- ça inflamatória é uma doença inflamatória do sistema respiratório, uma doença inflamatória da pele, uma doença autoimune, uma doença neurológica inflamatória, uma doença isquêmica, aterosclerose, rejei- ção ao transplante de ilhotas pancreáticas, rejeição ao transplante de órgão, função retardada de órgão, lesão da medula espinhal ou cistite.
56. Uso de uma molécula de ácido L-nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um diagnóstico, um meio diagnóstico ou um biossensor.
57. Uso, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico ou meio diagnóstico tem uma superfície em um vaso de reação ou uma superfície em um dispositivo em um vaso de reação.
58. Uso, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o biossensor tem uma superfície.
59. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico, o meio diagnós- tico ou o biossensor é adequado para detectar, direta ou indiretamen- te, CXCL8, preferivelmente CXCL8 de humano.
60. Uso, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracteri- zado pelo fato de que CXCL8 é detectada por ligação direta, em um ensaio de ligação em sanduíche ou em um ensaio de ligação competi- tivo.
61. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a ligação direta compreende um método de detecção que usa apenas a molécula de ácido L-nucleico, como definida em e qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e não usa ou não envolve o uso de uma segunda molécula diferente da molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 que interage com CXCL8.
62. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o ensaio em sanduíche é um ensaio de hibridização em sanduíche no qual a molécula de ácido L-nucleico, como definida em de qualquer uma das reivindicações 1 a 50 é imobilizada na super- fície e um complexo da molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e CXCL8 é detectada por um meio de detecção que se liga a (um) epitopo(s) de CXCL8 que é(são) diferente(s) daquele(s) ligado(s) pela molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50.
63. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o ensaio em sanduíche é um ensaio de hibridização em sanduíche em que um meio que se liga a (um) epitopo(s) de CXCL8 que é(são) diferente(s) daquele(s) ligado(s) pela molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 é imobilizado à superfície, e o complexo de tais meios e CXCL8 é detectada pela molécula de ácido L-nucleico, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 50.
64. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que no ensaio de ligação competitivo, a molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 é imobilizada em uma superfície, e a ligação da molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 a CXCL8 é competida por sondas oligonucleotídicas complementares à molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 50 ou por CXCL8, preferivelmente a complementari- dade é complementaridade de base, mais preferivelmente com base no pareamento de base de Watson-Crick.
65. Uso, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que no ensaio de ligação competitivo, a molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 não é imobilizada em uma superfície, e a ligação da molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, a CXCL8 é competida por sondas oligonucleotídicas complementares à molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 ou por CXCL8, em que, preferivelmente, as son-
das oligonucleotídicas complementares à molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 ou CXCL8 são imobilizadas em uma superfície, preferivelmente a com- plementaridade é complementaridade de bases, mais preferivelmente com base no pareamento de base de Watson-Crick.
66. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo fato de que para imobilização à superfície, a molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 44 é usada.
67. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 66, caracterizado pelo fato de que a superfície, preferivelmente a superfície do biossensor, é selecionada a partir do grupo que consiste em ouro, prata, titânio, zircônio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, tungstênio, molibdênio, platina, alumínio, ferro, aço, cobre, níquel, silí- cio, germânio, fosfeto de índio, arseneto de gálio e um óxido, nitreto ou liga ou mistura dos mesmos, óxido de índio-estanho, carbono vítreo, safira, vidro de silicato e vidro de borato.
68. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 67, caracterizado pelo fato de que a superfície, preferivelmente a superfície do biossensor, é modificada por polilisina, um aminossilano, um epoxissilano, uma nitrocelulose, um carboxidextrano, uma nano- membrana de carbono, um óxido de grafeno, uma superfície de carbo- no como o negro de fumo, uma fibra de carbono, uma placa de carbo- no, um tecido de carbono, um carvão ativado, um carbono vítreo, car- vão, um carvão ativado, um pó de grafite, uma fibra de grafite, um na- notubo de carbono, um fulereno, um grupo carboxila, um grupo azida, um grupo tiol, um grupo hidróxi, um epóxido, maleimida, uma alcina, uma alcina deformada ou qualquer combinação dos mesmos.
69. Uso, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que para a imobilização de uma molécula de ácido L-
nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 44, a superfície é funcionalizada por uma amina primária, grupo tiol, azida, alcina, alceno, tetrazina, tetrazol ou cicloalcina deformada, em que preferivelmente a cicloalcina deformada é selecionada a partir do gru- po que compreende dibenzociclo-octila (DBCO), biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) ou azadibenzociclo-octila (ADIBO).
70. Uso, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que para a imobilização de uma molécula de ácido L- nucleico, como definida na reivindicação 42 ou 43, a cicloadição de azida-alcina promovida por deformação é usada.
71. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 70, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 44 a 46 é usada para detecção.
72. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 71, caracterizado pelo fato de que um sistema de detecção do biossensor é com base na leitura ótica, mudança de massa, índice re- fratário, carga, tensão superficial e microscopia de força atômica.
73. Uso, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na leitura ótica é fluorescência, absorção ou luminescência.
74. Uso, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na mudança de massa é a microbalança de cristal de quartzo ou sistemas microeletromecânicos.
75. Uso, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base no índice refratário é a ressonância de plasmônio superficial, um resso- nador de anel ou elipsometria.
76. Uso, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na carga é a impedância eletroquímica, voltametria, amperometria, poten- ciometria, condutividade ou um transistor de efeito de campo.
77. Uso, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na tensão superficial é um biossensor cantilever.
78. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que CXCL8 é detectada por uma configuração de ensaio homogêneo.
79. Uso de uma molécula de ácido L-nucleico, como defini- da em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que é para a detecção de CXCL8, preferivelmente CXCL8 de hu- mano.
80. Uso, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que CXCL8 é detectada em uma configuração de ensaio de ligação em sanduíche, uma configuração de ensaio homogêneo ou uma configuração de ensaio competitivo.
81. Uso, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a configuração do ensaio de ligação em sanduíche, a configuração do ensaio homogêneo ou a configuração do ensaio com- petitivo é adequada para detectar, direta ou indiretamente, CXCL8.
82. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 81, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido L-nucleico é covalentemente imobilizada em uma superfície de um vaso de rea- ção de um diagnóstico, na superfície de um dispositivo em um vaso de reação de um diagnóstico ou em uma superfície de um biossensor.
83. Uso, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que para a imobilização, a molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a 44 é usada.
84. Uso, de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracte-
rizado pelo fato de que a superfície, preferivelmente a superfície do biossensor, é selecionada a partir do grupo que consiste em ouro, pra- ta, titânio, zircônio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, tungstênio, molibdênio, platina, alumínio, ferro, aço, cobre, níquel, silício, germâ- nio, fosfeto de índio, arseneto de gálio e um óxido, um nitreto ou uma liga ou suas misturas, óxido de índio-estanho, carbono vítreo, safira, um vidro de silicato e um vidro de borato.
85. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizado pelo fato de que a superfície, preferivelmente a superfície do biossensor, é modificada por polilisina, um aminossilano, um epoxissilano, uma nitrocelulose, um carboxidextrano, uma nano- membrana de carbono, óxido de grafeno, uma superfície de carbono, como negro de fumo, fibra de carbono, uma placa de carbono, um te- cido de carbono, um carvão ativado, um carbono vítreo, um carvão ve- getal, um carvão ativado, um pó de grafite, uma fibra de grafite, um nanotubo de carbono, um fulereno, um grupo carboxila, um grupo azi- da, um grupo tiol, um grupo hidróxi, um epóxido, maleimida, uma alci- na, uma alcina deformada ou qualquer combinação dos mesmos.
86. Uso, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que para a imobilização de uma molécula de ácido L- nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 38 a 44, a superfície é funcionalizada por uma amina primária ativada, grupo tiol, azida ou cicloalcina deformada, em que preferivelmente cicloalcina deformada é selecionada a partir de grupo compreendendo dibenzoci- clo-octila (DBCO), biciclo[6.1.0]non-4-ina (BCN) ou azadibenzociclo- octila (ADIBO).
87. Uso, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que para a imobilização de uma molécula de ácido L- nucleico, como definida na reivindicação 42 ou 43, a cicloadição de azida-alcina deformada é usada.
88. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 87, caracterizado pelo fato de que um sistema de detecção do biossensor é com base na leitura ótica, mudança de massa, índice re- fratário, carga, tensão superficial e microscopia de força atômica.
89. Uso, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na leitura ótica é fluorescência, absorção ou luminescência.
90. Uso, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na mudança de massa é um sistema de microbalança de cristal de quar- tzo ou um sistema microeletromecânico.
91. Uso, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base no índice refratário é a ressonância de plasmônio superficial, um resso- nador de anel ou elipsometria.
92. Uso, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na carga é a impedância eletroquímica, voltametria, amperometria, poten- ciometria, condutividade ou um transistor de efeito de campo.
93. Uso, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção do biossensor com base na tensão superficial é um biossensor cantilever.
94. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 81, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido L-nucleico compreende um grupo de modificação que permite a detecção da mo- lécula de ácido L-nucleico, preferivelmente o grupo de modificação é um rótulo.
95. Uso, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o marcador é selecionado a partir do grupo que com- preende biotina, bromo-desoxiuridina, digoxigenina, um oligonucleotí-
deo, um rótulo fluorescente, um rótulo de eletroquimoluminescência, um rótulo radioativo, um rótulo enzimático, um rótulo UV, ouro coloidal, uma nanopartícula e um rótulo de molécula quelante.
96. Kit para a detecção de CXCL8, caracterizado pelo fato de que o kit compreende uma molécula de ácido L-nucleico, como de- finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e pelo menos um folheto de instruções ou um vaso de reação.
97. Método para a detecção de CXCL8 usando o ácido L- nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o método compreen- de as etapas de: f) fornecer uma amostra com concentração desconhecida de CXCL8; g) colocar a amostra ou uma diluição da mesma em contato com um diagnóstico, meio diagnóstico ou biossensor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 56 a 78; h) medir o sinal com um diagnóstico, meio diagnóstico ou biossensor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 56 a 78; i) opcionalmente, comparar o sinal com uma referência; j) opcionalmente, a concentração de CXCL8 em uma amostra com concentração de CXCL8 desconhecida é determinada por comparação com sinais obtidos de pelo menos uma amostra com concentração de CXCL8 conhecida, preferivelmente a pelo menos uma amostra com uma concentração de CXCL8 conhecida está sujeita às etapas b) a c).
98. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 e CXCL8, em que, preferivelmente, o com- plexo é um complexo cristalino.
99. Método para o rastreamento de um antagonista de uma atividade mediada por CXCL8, caracterizado pelo fato de que compre- ende as seguintes etapas:
- fornecer um antagonista candidato da atividade mediada por CXCL8, - fornecer uma molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, - fornecer um sistema de teste que fornece um sinal na presença de um antagonista da atividade mediada por CXCL8, e - determinar se o antagonista candidato da atividade mediada por CXCL8 é um antagonista da atividade mediada por CXCL8.
100. Método para a detecção de um ácido L-nucleico, con- forme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o método compreende as eta- pas de: f) fornecer uma sonda de captura, em que a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 50 e uma sonda de detecção, em que a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, ou, alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 50, e a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50; g) adicionar a sonda de captura, e a sonda de detecção separadamen- te ou combinada a uma amostra contendo a molécula de ácido L- nucleico, conforme definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 50 ou presumivelmente conter a molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50; h) permitir que a sonda de captura, e a sonda de detecção reajam si- multaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com a molé-
cula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 50 ou parte dela; i) detectar opcionalmente se a sonda de captura é ou não hibridizada com a molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 fornecidas na etapa a); e j) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo na molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 50, e na sonda de captura, e na sonda de detecção.
101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zado pelo fato de que a sonda de detecção compreende um meio de detecção e/ou em que a sonda de captura é imobilizada em um supor- te, preferivelmente um suporte sólido.
102. Método, de acordo com a reivindicação 100 ou 101, caracterizado pelo fato de que qualquer sonda de detecção que não faz parte do complexo formado na etapa c) é removida da reação de modo que na etapa e) apenas uma sonda de detecção que faz parte do complexo seja detectada.
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 100 a 102, caracterizado pelo fato de que a etapa e) compreende a etapa de comparar o sinal gerado pelos meios de detecção quando a sonda de captura, e a sonda de detecção são hibridizadas na presen- ça da molécula de ácido L-nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50 ou parte das mesmas, e na ausência da re- ferida molécula de ácido L-nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 50.
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