JP2015506174A - Ｃｇｒｐに特異的に結合する核酸 - Google Patents

Ｃｇｒｐに特異的に結合する核酸 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＧＲＰに結合することができる核酸分子に関し、核酸分子はヌクレオチドの中心ストレッチを含み、ヌクレオチドの中心ストレッチは５’ＨＷｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｙｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ｒｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＲｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１３’［配列番号９９］のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｍ、Ｂ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｃはリボヌクレオチドであり、ｎ１はＲまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＫまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＮまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＮまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＲまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＢまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。

Description

本発明は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（略語：ＣＧＲＰ）に結合することができる核酸分子、薬剤、診断薬および検出薬をそれぞれ製造するための核酸分子の使用、前記核酸分子を含む組成物、前記核酸分子を含む複合体、前記核酸分子を使用して、ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングする方法、ならびに前記核酸分子を検出する方法に関する。
アルファＣＧＲＰは、カルシトニン遺伝子転写物の選択的スプライシングにより生成される３７アミノ酸の神経ペプチドである（Ａｍａｒａ，Ｊｏｎａｓら、１９８２）。ＣＧＲＰは、抹消神経系および中枢神経系で主に発現される（ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍ，Ｈａｎｉｓｃｈら、１９９７）。ＣＧＲＰに関して様々な機能が説明されているが、最も知られているインビボでのＣＧＲＰの作用は、硬膜の血管拡張および痛覚の伝達である（ＥｄｖｉｎｓｓｏｎおよびＨｏ、２０１０）。ヒトＣＧＲＰの構造は、１Ｈ−ＮＭＲによって部分的に決定されていた。ペプチドは、明確に定義されたアルファヘリックス（残基８および１８）をもたらす、定義されたアミノ末端ジスルフィド結合ループ（残基２〜７）を含む。ペプチドのＣ末端部分は、明瞭に定義された構造を有さない（Ｂｒｅｅｚｅ，Ｈａｒｖｅｙら、１９９１）。
ベータＣＧＲＰは、アルファＣＧＲＰに対する相同性が高いペプチドである（ヒトアルファおよびベータＣＧＲＰは、３７個のアミノ酸中で３個だけ異なる、すなわち９５％同一のアミノ酸である）が、別々の遺伝子により転写される。両方のペプチドは別々の解剖学的部位で発現されるが、類似の生物学的作用を示す（ＥｄｖｉｎｓｓｏｎおよびＨｏ、２０１０）。ヒトアルファＣＧＲＰに対する配列相同性を示す他のペプチドは、ヒトアミリン（３７個中で１５個＝ヒトアルファＣＧＲＰに対して４１％同一のアミノ酸）、カルシトニン（３７個中で７個＝１９％同一）、アドレノメデュリン（３７個中で７個＝１９％同一）およびインテルメジン（３７個中で７個＝１９％同一）である（図８Ａを参照）。
ＣＧＲＰの細胞受容体は、Ｇタンパク質連結受容体であるカルシトニン様受容体（略語：ＣＬＲ）のヘテロ二量体であり、受容体活性調節タンパク質１（略語：ＲＡＭＰ１）と呼ばれる小さな膜貫通タンパク質である。２つの他のＲＡＭＰ、すなわちＲＡＭＰ２およびＲＡＭＰ３はクローン化されており、ＣＬＲと共にヘテロ二量体を形成することができ、ペプチドのカルシトニンファミリーの他のメンバーに対する選択性を決定することができる。例えば、ＣＬＲおよびＲＡＭＰ２は、アドレノメデュリンの選択的受容体を形成する（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ，Ｆｒａｓｅｒら、１９９８）。ＣＬＲとＲＡＭＰ１とが共にＣＧＲＰ用の結合ポケットを形成すること、および臨床的に有効なＣＧＲＰ受容体アンタゴニストがこの結合溝を遮断することが、構造データから確認された（ＲａｄｄａｎｔおよびＲｕｓｓｏ、２０１１）。受容体に結合しているＣＧＲＰにより、細胞内のｃＡＭＰレベル増大がもたらされる。
ＣＧＲＰに関して様々な機能が説明されているが、最も知られているインビボでのＣＧＲＰの作用は、硬膜の血管拡張および痛覚の伝達である（ＥｄｖｉｎｓｓｏｎおよびＨｏ、２０１０）。実際、ＣＧＲＰは、痛覚神経線維のマーカーとして広く使用されている。
西洋諸国では、成人人口の約１０％が片頭痛を患っており、女性における罹患率はより高い。片頭痛は、吐き気もしくは嘔吐、または光恐怖症もしくは音恐怖症を伴う激しい再発性頭痛で特徴付けられる衰弱性疾患である。患者の約１５％では、頭痛は神経症状、通常は視覚から始まる。この種の片頭痛は、前兆を伴う片頭痛として定義される（Ｇｏａｄｓｂｙ、２００３）。
現在の治療の選択肢には、標準的な鎮痛薬（アセチルサリチル酸、パラセタモール、イブプロフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤などの、主に非ステロイド性抗炎症薬（略語：ＮＳＡＩＤ））と、２つのクラスの片頭痛に特有の鎮痛薬、すなわち血管収縮性の麦角アルカロイド誘導体（例えばジヒドロエルゴタミン）およびトリプタン、５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体アゴニスト（例えばスマトリプタン）とが含まれる。これらの薬物は多くの患者にとって非常に効果的であるが、全ての片頭痛患者が現在利用可能な薬によって十分に治療され得るわけではなく、新規の治療の選択肢の必要性が強調されている（ＭｏｎｔｅｉｔｈおよびＧｏａｄｓｂｙ、２０１１）。
いくつかの証拠から、片頭痛の病理学におけるＣＧＲＰの中心的役割が示唆される。脳血管の血管拡張は、片頭痛における頭痛の発生にとって重要な機構であると考えられる。ＣＧＲＰは強力な血管拡張物質として知られており、三叉神経節の刺激により、三叉神経の終末からのＣＧＲＰの放出、続いて血管平滑筋上にあるＣＧＲＰ受容体により仲介される血管拡張が生じることが示された（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ，Ｋａｔｓａｒａｖａら、２００１）。さらに、血漿ＣＧＲＰレベルは、片頭痛発作中の患者において上昇した（Ｇｏａｄｓｂｙ，Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎら、１９９０；Ｇａｌｌａｉ，Ｓａｒｃｈｉｅｌｌｉら、１９９５；Ｊｕｈａｓｚ，Ｚｓｏｍｂｏｋら、２００３）が、他の研究ではこの事実を確認することができなかった（Ｔｖｅｄｓｋｏｖ，Ｌｉｐｋａら、２００５）。小児片頭痛では、ＣＧＲＰの頭部外（ｅｘｔｒａｃｅｐｈａｌｉｃａｌ）の源が示唆されている（Ｔｆｅｌｔ−ＨａｎｓｅｎおよびＡｓｈｉｎａ、２０１０）。驚くべきことに、ＣＧＲＰの注入により、片頭痛患者において片頭痛様頭痛が誘導されるが健常者においては誘導されず、片頭痛患者にＣＧＲＰに対する感受性の増大が示唆される（Ｌａｓｓｅｎ，Ｈａｄｅｒｓｌｅｖら、２００２）。さらに、ＣＧＲＰは、群発性頭痛、発作性片側頭痛、外傷後頭痛および透析頭痛などの片頭痛と異なる頭痛に関与するという証拠がある（Ｆｒｅｓｅ，Ｓｃｈｉｌｇｅｎら、２００５；Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ，Ｍａｓｓａｎｔｉら、２００６；Ｔｆｅｌｔ−ＨａｎｓｅｎおよびＬｅ、２００９；Ｓｕｍｍ，Ａｎｄｒｅｏｕら、２０１０）。例えば、血漿ＣＧＲＰレベルは、鎮痛治療後に正常化される群発性頭痛の発作中に上昇する（ＧｏａｄｓｂｙおよびＥｄｖｉｎｓｓｏｎ、１９９４；Ｔｆｅｌｔ−ＨａｎｓｅｎおよびＬｅ、２００９）。
片頭痛の病態生理学の一因となる血管拡張以外の機構にＣＧＲＰが関与するという証拠が増加している。神経性炎症は、感覚神経の活性化に起因する無菌タイプの炎症であり、血管拡張、血漿タンパク質の溢出、常在する肥満細胞からの炎症性メディエーターの放出により特徴付けられる。三叉神経の終末からのＣＧＲＰの血管周囲への放出により、硬膜に常在する肥満細胞およびサテライトグリア細胞が刺激されることによって、そのような炎症事象が引き起こされ得る（ＯｔｔｏｓｓｏｎおよびＥｄｖｉｎｓｓｏｎ、１９９７；ＲａｄｄａｎｔおよびＲｕｓｓｏ、２０１１）。さらに、ＣＧＲＰは、片頭痛関連の光恐怖症および音恐怖症中に観測された、感覚入力に対する感受性の増大をもたらす痛覚のシナプス伝達に直接影響を与える可能性がある（Ｈｏ，Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎら、２０１０）。
片頭痛におけるＣＧＲＰの重要性は、ジヒドロエルゴタミンまたはスマトリプタンなどの抗片頭痛薬の投与によりＣＧＲＰレベルを低下させることができるという観測によって強調される（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ，Ｋａｔｓａｒａｖａら、２００１；Ｓｔｅｐｉｅｎ，Ｊａｇｕｓｔｙｎら、２００３）。ペプチドフラグメントＣＧＲＰ（８〜３７）は、受容体を遮断することによりＣＧＲＰの機能に拮抗する。ＣＧＲＰ（８〜３７）は、様々な片頭痛および疼痛のモデルにうまく使用されたが、低い生物学的安定性に起因して、その使用が制限される。いくつかの非ペプチド小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストが開発されている。オルセゲパント（ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ）、静脈内配合ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、片頭痛の急性発作の治療に有効であった（Ｏｌｅｓｅｎ，Ｄｉｅｎｅｒら、２００４）。これらの有望な結果にも関わらず、その開発は、おそらく経口有効性の欠如に起因して中止された。オルセゲパントの後続の経口投与可能な化合物であるＢＩ−４４３７０ ＴＡは、急性片頭痛の第２相試験で用量依存効果を最近示した（Ｄｉｅｎｅｒ，Ｂａｒｂａｎｔｉら、２０１１）。テルカゲパント（ＭＫ−０９７４）は、片頭痛の潜在的治療のために開発された経口投与可能なＣＧＲＰ受容体アンタゴニストである。それは急性片頭痛の第３相臨床試験で効能を示した（Ｈｏ，Ｆｅｒｒａｒｉら、２００８；Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓｈａｐｉｒｏら、２００９）が、その開発は、おそらく予防臨床試験からの肝臓毒性の徴候により最近中止された（ＲａｄｄａｎｔおよびＲｕｓｓｏ、２０１１）。第２相臨床試験での片頭痛の潜在的な経口カプセル治療のために、ＢＭＳ−９２７７１１が最近開発されている。抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体は、神経性血管拡張を効果的に阻害した（Ｔａｎ，Ｂｒｏｗｎら、１９９５；Ｚｅｌｌｅｒ，Ｐｏｕｌｓｅｎら、２００８）。ＣＧＲＰを標的とする２種のモノクローナル抗体が最近開発されている。両方の抗体は現在、片頭痛の潜在的治療のための第１相臨床試験にある。しかし、それらの潜在的免疫原性のために、これらと他の抗体は、片頭痛の長期治療にとって実行可能な選択肢ではない可能性がある。
基本的に、ＣＧＲＰレベル／活性を下げることによる治療介入の試みにより、ＣＧＲＰ拮抗作用の概念を片頭痛の潜在的治療として支持する多くの結果が得られているが、十分な効力プロファイルまたは十分な安全プロファイルを有する化合物はもたらされていない。
発明者らは、ラットＣＧＲＰと、より低い親和性でヒトＣＧＲＰと結合するスピーゲルマーをすでに説明した（Ｖａｔｅｒ，Ｊａｒｏｓｃｈら、２００３）。動物モデルでは、このスピーゲルマーは、ＣＧＲＰにより誘導される血管拡張を効果的に抑制し（Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ，Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００７；Ｊｕｈｌ，Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎら、２００７）、電気刺激後の硬膜動脈血流の増加を予防し（Ｄｅｎｅｋａｓ，Ｔｒｏｌｔｚｓｃｈら、２００６）、侵害的熱に対するストレイン関連過敏症（ｓｔｒａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を消失させた（Ｍｏｇｉｌ，Ｍｉｅｒｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）。
アミリンまたは島アミロイドポリペプチド（略語：ＩＡＰＰ）は、ヒトにおけるα−ＣＧＲＰに対して４１％同一のアミノ酸残基を示す３７アミノ酸ペプチドホルモンである。アミリンは、ランゲルハンス島のβ細胞からインシュリンと共に分泌される。アミリンは、胃内容排出の速度を落とし、消化分泌液を抑制し、その結果として食物摂取量を低下させることにより、血糖値の制御に寄与する。さらに、アミリンは、明らかに中枢神経系との相互作用により、満腹感および喉の渇きの感覚を引き起こす（Ｆｉｅｌｄ，Ｃｈａｕｄｈｒｉら、２０１０）。これに基づいて、ラットでは、アミリンの注入により食物摂取量の低下が生じる（Ｌｕｔｚ，Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら、１９９４；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｆｌｏｏｄら、１９９４）。この食欲減退効果により、アミリンの抑制は食物摂取量および肥満の増加をもたらす可能性がある（Ｌｕｔｚ、２００６）。結果として、ＣＧＰＲ結合スピーゲルマーのアミリンとの交差反応は、片頭痛の潜在的治療にとって重大な障害である。
本発明の根底にある問題は、アミリン、好ましくはヒトアミリンと相互作用することなく、ヒトＣＧＲＰ、好ましくはヒトアルファＣＧＲＰに特異的に結合し、ＣＧＲＰ、好ましくはヒトアルファＣＧＲＰにより媒介される活性に拮抗する手段を提供することであり、この手段は、片頭痛、急性および慢性の疼痛またはモルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性などの疾患および状態の予防および／または治療に適している。
本発明の根底にあるこれらおよび他の問題は、添付した独立請求項の内容によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から得ることができる。
本発明の根底にある問題は、第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様において、ＣＧＲＰに結合することができる核酸分子であって、核酸分子がヌクレオチドの中心ストレッチを含み、ヌクレオチドの中心ストレッチが
５’ＨＷｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｙｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ｒｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＲｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号９９］
のヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｍ、Ｂ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｃはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＲまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＫまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＮまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＮまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＲまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＢまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである
核酸分子によって解決される。
第１の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
５’ＣＵｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｂｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ａｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１００］
のヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｂ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＶはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＤまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第１および第２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０１］
のヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、ＨおよびＲはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＲまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＲまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０２］
のヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＧまたはｄＧであり、ｎ８はＵまたはｄＴであり、ｎ９はＣまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＡまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
Figure 2015506174
Figure 2015506174
 の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａはリボヌクレオチドであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
Figure 2015506174
 のヌクレオチド配列を含む。
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、２’−リボヌクレオチドからなる。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態では、核酸分子は、５’→３’の方向でヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含み、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは４〜７ヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは４〜７ヌクレオチドを含み、
好ましくは、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５〜７ヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５〜７ヌクレオチドを含む。
第１の態様の第９の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態では、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５ヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５ヌクレオチドを含む。
第１の態様の第９および第１０の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＳＺ４ＷＺ５ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１Ｚ１２ ３’のヌクレオチド配列を含み、
式中、Ｓ、Ｗ、Ｖ、ＢおよびＫはリボヌクレオチドであり、
Ｚ１はＳまたは不在であり、Ｚ２はＶまたは不在であり、Ｚ３はＢまたは不在であり、Ｚ４はＶまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＹまたはｄＣであり、Ｚ７はＷまたはｄＡであり、Ｚ８はＢまたはｄＣであり、Ｚ９はＳまたはｄＧであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧまたは不在であり、Ｚ１１はＢまたは不在であり、Ｚ１２はＫまたは不在であり、
ｄＧ、ｄＣおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第１１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態では、
ａ）Ｚ１はＳであり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２はＫであり、
ｂ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２はＫであり、
ｃ）Ｚ１はＳであり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｄ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｅ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｆ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｇ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｈ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３は不在であり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｉ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０は不在であり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、または
ｊ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３は不在であり、Ｚ１０は不在であり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在である。
第１の態様の第９、第１１および第１２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態では、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＡＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣＵ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＵＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＵＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含む。
第１の態様の第９、第１０、第１１および第１２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態では、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＺ４ＵＺ５ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
式中、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵはリボヌクレオチドであり、
Ｚ４はＧまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＣまたはｄＣであり、Ｚ７はＡまたはｄＡであり、Ｚ８はＣまたはｄＣであり、Ｚ９はＧまたはｄＧであり、Ｚ１０はＧまたはｄＧであり、
ｄＣ、ｄＧおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第１の態様の第９、第１０、第１１、第１２および第１４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態では、
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣｄＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｃ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｄ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ｄＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｅ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣｄＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｆ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡｄＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｇ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣｄＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｈ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含む。
第１の態様の第９、第１０、第１１、第１２および第１４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態では、
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＣＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｃ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含む。
第１の態様の第９、第１１および第１２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態では、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＵＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＡＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＵＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含む。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６および第１７の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１８の実施形態では、核酸分子は、配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列、または
配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも８５％の同一性を有する核酸分子、または配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と相同であり、相同性は少なくとも８５％である核酸分子を含む。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、および第１７の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１９の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも８５％の同一性を有する核酸分子、または配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と相同であり、相同性は少なくとも８５％である核酸分子を含む。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２０の実施形態では、核酸分子のヌクレオチドまたは核酸分子を形成するヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドである。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８および第１９の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２１の実施形態では、核酸分子はＬ−核酸分子である。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０および第２１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２２の実施形態では、核酸分子は、ＣＧＲＰに結合することができる少なくとも１つの結合部分を含み、そのような結合部分はＬ−ヌクレオチドからなる。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１および第２２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２３の実施形態では、核酸は、ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストである。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２および第２３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２４の実施形態では、核酸分子は修飾基を含み、修飾基を含む核酸分子の生物からの排出速度は、修飾基を含まない核酸と比較して低下する。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２および第２３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２５の実施形態では、核酸分子は修飾基を含み、修飾基を含む核酸分子の生物における保持時間は、修飾基を含まない核酸分子と比較して増大する。
第１の態様の第２４および第２５の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２６の実施形態では、修飾基は生分解性および非生分解性修飾を含む群から選択され、好ましくは修飾基はポリエチレングリコール、直鎖ポリエチレングリコール、分岐ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミデートおよびポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンを含む群から選択される。
第１の態様の第２６の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２７の実施形態では、修飾基はポリエチレングリコールであり、好ましくは直鎖ポリエチレングリコールまたは分岐ポリエチレングリコールからなり、ポリエチレングリコールの分子量は好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
第１の態様の第２６の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２８の実施形態では、修飾基はヒドロキシエチルデンプンであり、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの分子量は約５０〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである。
第１の態様の第２４、第２５、第２６、第２７および第２８の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２９の実施形態では、修飾基はリンカーを介して核酸分子と結合し、好ましくはリンカーは生分解性リンカーである。
第１の態様の第２４、第２５、第２６、第２７および第２８の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第３０の実施形態では、修飾基は核酸分子の５’末端ヌクレオチドおよび／もしくは３’末端ヌクレオチドと、ならびに／または核酸分子の５’末端ヌクレオチドと核酸分子の３’末端ヌクレオチドとの間にある核酸分子のヌクレオチドと結合している。
第１の態様の第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９および第３０の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第３１の実施形態では、生物は動物またヒトの身体、好ましくはヒトの身体である。
本発明の根底にある問題は、第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様において、疾患の治療および／または予防方法で使用するための、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子によって解決される。
第２の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第２の実施形態では、疾患は、片頭痛、異なる形態の頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性、骨関節症、血管形成、自己免疫疾患、腫瘍増殖および炎症性疾患を含む群から選択され、好ましくは急性疼痛および慢性疼痛は炎症および／または神経障害に由来する。
本発明の根底にある問題は、第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様において、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子、ならびに任意選択でさらなる構成要素を含む医薬組成物であって、さらなる構成要素が、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される担体および薬学的活性作用物質を含む群から選択される医薬組成物によって解決される。
第３の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第３の態様の第２の実施形態では、医薬組成物は、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子、ならびに薬学的に許容される担体を含む。
本発明の根底にある問題は、第４の態様の第１の実施形態でもある第４の態様において、薬剤を製造するための、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態に対する核酸分子の使用によって解決される。
第４の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第４の態様の第２の実施形態では、薬剤は、ヒト医学で使用するためまたは獣医学で使用するための薬剤である。
第４の態様の第１および第２の実施形態の実施形態でもある第４の態様の第３の実施形態では、薬剤は、片頭痛、異なる形態の頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性、骨関節症、血管形成、自己免疫疾患、腫瘍増殖および炎症性疾患の治療用および／または予防用であり、好ましくは急性疼痛および慢性疼痛は炎症および／または神経障害に由来する。
本発明の根底にある問題は、第５の態様の第１の実施形態でもある第５の態様において、診断手段を製造するための、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の使用によって解決される。
本発明の根底にある問題は、第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様において、好ましくは結晶複合体である、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子およびＣＧＲＰを含む複合体によって解決される。
本発明の根底にある問題は、第７の態様の第１の実施形態でもある第７の態様において、ＣＧＲＰを検出するための、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の使用によって解決される。
本発明の根底にある問題は、第８の態様の第１の実施形態でもある第８の態様において、ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
ＣＧＲＰにより媒介される活性の候補アンタゴニストを準備するステップと、
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態の核酸分子を提供するステップと、
ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストの存在下でシグナルをもたらす試験系を提供するステップと、
ＣＧＲＰにより媒介される活性の候補アンタゴニストがＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含む方法によって解決される。
本発明の根底にある問題は、第９の態様の第１の実施形態でもある第９の態様において、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子と、少なくとも使用説明リーフレットまたは反応容器を含む、ＣＧＲＰを検出するためのキットによって解決される。
本発明の根底にある問題は、第１０の態様の第１の実施形態でもある第１０の態様において、試料中の第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態の核酸分子を検出する方法であって、
ａ）捕捉プローブおよび検出プローブを準備するステップと、ここで、捕捉プローブは第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的であり、検出プローブは第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的であり、あるいは、捕捉プローブは第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的であり、検出プローブは第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的であり、
ｂ）捕捉プローブおよび検出プローブを別々にまたは組み合わせて、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子を含有する、または含有すると推定される試料に添加するステップと、
ｃ）捕捉プローブおよび検出プローブを、第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子またはその部分と同時にまたは任意の順番で順次に反応させるステップと、
ｄ）任意選択で、捕捉プローブがステップａ）で準備された第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子とハイブリダイズするか否かを検出するステップと、
ｅ）第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態による核酸分子ならびに捕捉プローブおよび検出プローブからなる、ステップｃ）で形成された複合体を検出するステップと
を含む方法によって解決される。
第１０の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第１０の態様の第２の実施形態では、検出プローブは検出手段を含み、かつ／または捕捉プローブを支持体、好ましくは固体支持体に固定化する。
第１０の態様の第１および第２の実施形態の実施形態でもある第１０の態様の第３の実施形態では、ステップｃ）で形成された複合体の一部でないいかなる検出プローブも反応から除去され、その結果ステップｅ）で複合体の一部である検出プローブだけが検出される。
第１０の態様の第１、第２および第３の実施形態の実施形態でもある第１０の態様の第４の実施形態では、ステップｅ）は、捕捉プローブおよび検出プローブは請求項１から３２のいずれか１項に記載の核酸分子またはその部分の存在下でハイブリダイズするとき、検出手段によって生じたシグナルと、前記核酸分子またはその部分の不在下でハイブリダイズするとき、検出手段によって生じたシグナルとを比較するステップを含む。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、および第３１の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第２の実施形態でもある、第１の態様の第３２の実施形態では、ＣＧＲＰは、ヒトＣＧＲＰ、マウスＣＧＲＰ、ラットＣＧＲＰまたはアカゲザル（ｍａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来のＣＧＲＰであり、好ましくは、ＣＧＲＰはヒトＣＧＲＰである。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、および第３２の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１および第２の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第３の実施形態でもある、第１の態様の第３３の実施形態では、ＣＧＲＰはα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰであり、好ましくはヒトα−ＣＧＲＰ、ヒトα−ＣＧＲＰまたはラットα−ＣＧＲＰである。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、第３２の、および第３３の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１、第２および第３の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第４の実施形態でもある、第１の態様の第３４の実施形態では、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有する。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、第３２の、第３３のおよび第３４の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第５の実施形態でもある、第１の態様の第３５の実施形態では、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有する。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、第３２の、第３３の、第３４のおよび第３５の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第６の実施形態でもある、第１の態様の第３６の実施形態では、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、第３２の、第３３の、第３４の、第３５のおよび第３６の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第７の実施形態でもある、第１の態様の第３７の実施形態では、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
第１の態様の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、第１１の、第１２の、第１３の、第１４の、第１５の、第１６の、第１７の、第１８の、第１９の、第２０の、第２１の、第２２の、第２３の、第２４の、第２５の、第２６の、第２７の、第２８の、第２９の、第３０の、第３１の、第３２の、第３３の、第３４の、第３５の、第３６のおよび第３７の実施形態の実施形態でもあり、第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の実施形態でもある第２の態様の第８の実施形態でもある、第１の態様の第３８の実施形態では、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有し、
および／または
核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
どんな理論にも拘泥するものではないが、本発明者らは、驚くべきことに、本発明による核酸分子がＣＧＲＰに特異的におよび高親和性で結合し、それにより、アミリンと交差反応することなくＣＧＲＰ受容体へのＣＧＲＰの結合が阻害されることを発見した。したがって、本発明による核酸分子は、片頭痛および他の疾患を含む疼痛関連疾患などのＣＧＲＰ関連の障害および疾患の治療に使用される可能性がある。さらに、本発明者らは、本発明による核酸分子がＣＧＲＰとＣＧＲＰ受容体との相互作用を遮断するのに適していることを発見した。その限りにおいて、本発明による核酸分子はＣＧＲＰのアンタゴニストであり、および／またはＣＧＲＰ−ＣＧＲＰ受容体系のアンタゴニストである。
ＣＧＲＰに対するアンタゴニストは、ＣＧＲＰに結合し、実施例５に記載されているインビトロアッセイにおいてＣＧＲＰによりＣＧＲＰ受容体へと仲介される活性に拮抗する分子（本発明による核酸分子など）である。本発明によるＣＧＲＰにより媒介される活性の一種は、実施例５に記載されているヒト神経芽細胞腫細胞におけるｃＡＭＰ産生の誘導である。
本発明による核酸分子または組成物、好ましくは本発明による核酸分子を含む医薬組成物を使用することにより治療または予防することができる様々な疾患、状態および障害に関して、そのような疾患、状態および障害は、特に、本出願の導入部に記載されているおよび導入部で説明されているものを含め、本明細書に記載されているものであることを認める必要がある。その限りにおいて、本明細書の各節および本明細書の導入部は、前記疾患、状態および障害それぞれの予防および治療への本発明の核酸分子の適合性を教示する本開示の不可欠な部分を形成する。
本明細書においてＣＧＲＰという用語は、それだけに限らないが哺乳動物ＣＧＲＰを含む任意のＣＧＲＰに関する。好ましくは、哺乳動物ＣＧＲＰは、ヒトＣＧＲＰ、サルＣＧＲＰ、ラットＣＧＲＰ、マウスＣＧＲＰ、ブタＣＧＲＰ、ヒツジＣＧＲＰ、イヌＣＧＲＰを含む群から選択される。より好ましくは、ＣＧＲＰはヒトＣＧＲＰである。本明細書においてＣＧＲＰという用語は、αＣＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰに関する。好ましくは、α−ＣＧＲＰは、ヒトα−ＣＧＲＰ、サルα−ＣＧＲＰ、ラットα−ＣＧＲＰ、マウスα−ＣＧＲＰ、ブタα−ＣＧＲＰ、ヒツジα−ＣＧＲＰ、イヌα−ＣＧＲＰを含む群から選択される。より好ましくは、α−ＣＧＲＰはヒトα−ＣＧＲＰである。
配列アラインメント（図８Ｂを参照）は、以下のもの由来のα−ＣＧＲＰと同一のヒトα−ＣＧＲＰのアミノ酸の以下の割合を実証する。
・ Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル） １００％
・ Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット） ８９％
・ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス） ８９％
・ Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ） ８６％
・ Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ） ８９％
・ Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ） ９２％
本明細書においてＣＧＲＰ受容体という用語は、シグナル伝達事象を誘導することによりＣＧＲＰシグナルを細胞中に伝える任意の細胞表面タンパク質に関する。ＣＧＲＰ受容体は、それだけに限らないが哺乳動物ＣＧＲＰ受容体を含む。好ましくは、哺乳動物ＣＧＲＰ受容体は、ヒトＣＧＲＰ受容体、サルＣＧＲＰ受容体、ラットＣＧＲＰ受容体、マウスＣＧＲＰ受容体、ブタＣＧＲＰ受容体、ヒツジＣＧＲＰ受容体、イヌＣＧＲＰ受容体を含む群から選択される。より好ましくは、ＣＧＲＰ受容体はヒトＣＧＲＰ受容体である。
さらに、ＣＧＲＰ−ＣＧＲＰ受容体軸の生理学的作用がＣＧＲＰのより高い血漿中レベルに関連する場合には、本発明による核分子が好ましい。
ＣＧＲＰとアミリンとの間の高い配列相同性（図９のアラインメントを参照）の結果として、すでに同定されているＣＧＲＰ結合スピーゲルマー（ＷＯ２００３／０４３７２を参照）は、アミリンとの交差反応を示した（実施例７、図１０）。したがって、本発明は、次の驚くべき知見に基づく。すなわち、高親和性でヒトＣＧＲＰと結合し、それにより、ＣＧＲＰの作用、特にＣＧＲＰの受容体に対するＣＧＲＰの作用を阻害およびアンタゴナイズする核酸分子を生成することができるという知見、およびこの核酸分子はヒトアミリンに対する交差反応を示さず、ヒトＣＧＲＰへの結合に関して高度に特異的であるという知見である。
本発明による核酸が核酸分子であることは本発明の範囲内である。その限りにおいて、核酸および核酸分子という用語は、そうでないことを示さない場合は同意語のように本明細書で使用される。さらに、そのような（１つまたは複数の）核酸は本明細書において、好ましくは、本発明による（１つまたは複数の）核酸分子、本発明による（１つまたは複数の）核酸、本発明の（１つまたは複数の）核酸、または本発明の（１つまたは複数の）核酸分子とも称される。
本明細書に記載されている、本発明による核酸の特徴は、核酸が単独でまたは任意の組合せで使用される本発明の任意の態様において実現することができる。
本明細書でより詳細に述べるように、本発明者らは、ＣＧＲＰに特異的に結合するいくつかの異なるＣＧＲＰ結合核酸分子であり、本明細書において開示されているようにも称されるヌクレオチドのストレッチの観点から特徴付けることができる核酸分子を同定した（実施例１を参照）。
本発明のＣＧＲＰ結合核酸分子はヌクレオチドの３つの異なるストレッチ、すなわちヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含む。一般に、本発明のＣＧＲＰ結合核酸分子は、５’末端および３’末端において、ヌクレオチドの末端ストレッチ、すなわちヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチ（また、ヌクレオチドの５’末端ストレッチおよびヌクレオチドの３’末端ストレッチとも称される）をそれぞれ含む。ヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、原則としてはそれらの塩基相補性に起因して、互いにハイブリダイズすることができ、ハイブリダイゼーション時に二本鎖構造が形成される。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、生理学的条件および／または非生理学的条件下において分子内で必ずしも実現されるものではない。本発明のＣＧＲＰ結合核酸分子のヌクレオチドの３つのストレッチであるヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’→３’の方向で、すなわちヌクレオチドの第１の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第２の末端ストレッチで互いに配列されている。あるいは、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの末端の第１のストレッチが５’→３’の方向で互いに配列されている。
本発明による核酸のヌクレオチドの中心ストレッチの長さは、好ましくは４０である。
本発明による核酸のヌクレオチドの第１の末端ストレッチの長さは４〜７ヌクレオチドであり、好ましくは５〜７ヌクレオチドであり、より好ましくは５ヌクレオチドである。
本発明による核酸のヌクレオチドの第２の末端ストレッチの長さは４〜７ヌクレオチドであり、好ましくは５〜７ヌクレオチドであり、より好ましくは５ヌクレオチドである。
本発明の様々なＣＧＲＰ結合核酸分子の間で定義されたボックスまたはストレッチの配列における差異は、ＣＧＲＰに対する結合親和性に影響を与える。本発明の様々なＣＧＲＰ結合核酸分子の結合分析に基づいて、中心ストレッチおよびそれを形成するヌクレオチドは個々に、より好ましくはそれらの全体でＣＧＲＰへのＣＧＲＰ結合核酸分子の結合に不可欠である。
「ストレッチ」および「ヌクレオチドのストレッチ」という用語は、そうでないことを示さない限り同意語のように本明細書で使用される。
好ましい実施形態では、本発明による核酸は単一核酸分子である。さらなる実施形態では、単一核酸分子は、多数の単一核酸分子として、または多数の単一核酸分子種として存在する。
本発明に従った核酸分子は、好ましくはホスホジエステル連結または結合を介して、互いに共有結合的に連結されているヌクレオチドから好ましくはなることが当業者により認められるであろう。
２つ以上のストレッチまたはその（１つまたは複数の）部分を含む、本発明による核酸が、原理上、互いにハイブリダイズすることができることは、本発明の範囲内である。そのようなハイブリダイゼーション後に二本鎖構造が形成される。特にインビトロおよび／またはインビボの条件下で、そのようなハイブリダイゼーションが起こることもあり、または起こらないこともあることが当業者によって認められるであろう。また、そのようなハイブリダイゼーションの場合、必ずしも、ハイブリダイゼーションが、少なくとも塩基対形成の規則に基づいてそのようなハイブリダイゼーション、したがって二本鎖構造の形成が原理上起こり得る２つのストレッチの長さ全体にわたって起こるとは限らない。好ましくは本明細書において、二本鎖構造とは、核酸分子の２つ以上の別々の鎖または一本鎖の２つの空間的に分離したストレッチによって形成される核酸分子の一部分または構造であり、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成の規則に従って塩基対を形成している少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の塩基対が存在する。フーグスティーン塩基対形成などの他の塩基対形成がそのような二本鎖構造中に存在し、またはそれを形成する可能性があることも当業者によって認められるであろう。２つのストレッチがハイブリダイズするという特徴が、好ましくは、そのようなハイブリダイゼーションがインビボおよび／またはインビトロで実際に起こるかどうかに関わらず、そのようなハイブリダイゼーションが２つのストレッチの塩基相補性に起因して起こると推定されることを示唆することも認められるはずである。本発明に関連して、そのようなストレッチは、上記で定義したように、実施形態においてハイブリダイズすることができるヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２のストレッチである。
好ましい実施形態では、本明細書において配置という用語は、本明細書で開示されている本発明の（１つまたは複数の）核酸に関連して本明細書に記載されている構造的または機能的特徴または要素の順番または順序を意味する。
本発明による核酸がＣＧＲＰと結合することができることが当業者によって認められるであろう。どんな理論にも拘泥するものではないが、ＣＧＲＰ結合は、本発明の核酸分子の三次元構造的特性または要素の組み合わせから生じていると考えられ、その特性または要素は、そのような特性または要素を形成するヌクレオチドの一次配列の配向および折り畳みパターンによって生じており、好ましくは、そのような特性または要素は、ＣＧＲＰ結合核酸分子のヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチである。本発明の核酸分子のＣＧＲＰへの結合を仲介するために、そのような要素または特性が形成しなければならない三次元構造に応じて変動の程度が様々であり得る種々の異なる個々の配列によって、個々の特性または要素が形成され得ることは明らかである。特許請求に係る核酸の全体的な結合の特徴は、最終的に特許請求に係る核酸とその標的、すなわちＣＧＲＰの相互作用をもたらす種々の要素および特性それぞれの相互影響から生じる。さらに、どんな理論にも拘泥するものではないが、ＣＧＲＰ結合核酸に特徴的なヌクレオチドの中心ストレッチは、特許請求に係る核酸分子とＣＧＲＰとの結合を仲介するために重要である。したがって、本発明による核酸は、ＣＧＲＰとの相互作用に適している。また、本発明による核酸が、ＣＧＲＰに対するアンタゴニストであることも当業者によって認められるであろう。このため、本発明による核酸は、ＣＧＲＰに関連しまたはそれによって引き起こされる任意の疾患または状態の治療および予防それぞれに適している。そのような疾患および状態は、ＣＧＲＰが前記疾患および状態それぞれに関与しまたはそれに関連することを明らかにし、本発明による核酸の治療目的での使用について科学的論拠をもたらす、参照により本明細書に組み込まれる従来技術から得ることができる。
本発明による核酸分子は、本明細書で開示されている特定のヌクレオチド配列と本質的に相同である核酸分子も含むものとする。実質的に相同という用語は、例えば相同性が少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものであるように理解されるものとする。
本発明による核酸分子中に存在する相同ヌクレオチドの実際の割合は、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に依存するだろう。修飾の割合を、核酸分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づいて算出することができる。
当業者に知られているように、２つの核酸分子間の相同性を決定することができる。より具体的には、配列比較アルゴリズムを使用して、指定されたプログラムパラメータに基づいて基準配列に対する（１つまたは複数の）試験配列のパーセント配列相同性を計算することができる。試験配列は、好ましくは、異なる核酸分子と相同であるといわれている、または相同であるかどうか、相同である場合はどの程度であるかを試験すべきである配列または核酸分子であり、そのような異なる核酸分子は基準配列とも称される。一実施形態では、基準配列は、本明細書に記載の核酸分子、好ましくは配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号８８、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８のいずれか１つによる配列を有する核酸分子である。比較に最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、１９８８）の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装系（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、または視覚的検査によって行うことができる。
パーセント配列同一性の決定に適したアルゴリズムの一例は、基本的な局所アラインメント検索ツールで使用されるアルゴリズム（以下「ＢＬＡＳＴ」）であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以後「ＮＣＢＩ」）を通じて公的に利用可能である。ＮＣＢＩから利用可能であるソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を使用して配列同一性を決定する際に使用される初期設定パラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）に記載されている。
本発明による核酸分子は、本明細書で開示されている本発明の（１つまたは複数の）核酸分子に対する同一性を特定の程度で有し、その／それらのヌクレオチド配列によって定義される核酸分子も含むものとする。より好ましくは、本発明は、そのヌクレオチド配列またはその一部によって定義される本発明の核酸分子に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える同一性を有する核酸分子も含む。
本発明の核酸または本発明による核酸分子という用語は、本明細書で開示されている核酸配列またはその一部を、例えば本発明による核酸の代謝物または誘導体などを、好ましくは核酸分子または前記一部がＣＧＲＰとの結合に関与するまたはＣＧＲＰと結合することができる程度まで含む核酸分子も含むものとする。例えば切断により、そのような核酸分子を本明細書で開示されているものから誘導することができる。切断は、本明細書で開示されている本発明の核酸分子の末端の一方または両方に関連し得る。また、切断は、ヌクレオチドの内部配列にも関連し得、すなわち、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドそれぞれの間にある（１つまたは複数の）ヌクレオチドの内の１つまたはいくつかに関連し得る。さらに、切断は、本明細書で開示されている本発明の核酸分子の配列からのわずか１つだけのヌクレオチドの欠失を含むものとする。切断は、本発明の核酸分子のヌクレオチドの複数のストレッチにも関連し得、ヌクレオチドのストレッチはわずか１ヌクレオチドの長さでもよい。本発明による核酸分子の結合は、日常的な実験を使用して、または本明細書に記載の、好ましくは実施例の部において本明細書に記載の方法を使用もしくは採用することによって、当業者により決定することができる。
本発明による核酸分子は、Ｄ−核酸分子でもよく、またはＬ−核酸分子でもよい。好ましくは、本発明による核酸分子はＬ−核酸分子であり、より好ましくは、本発明による核酸分子はスピーゲルマーである。
一実施形態において、その（１つまたは複数の）核酸配列の観点から本明細書に記載の核酸分子その全体のうちのそれぞれおよびいずれかが、特定の（１つまたは複数の）示されたヌクレオチド配列に限定されることも、本発明の範囲内である。言い換えると、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」という用語は、そのような実施形態において、含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）またはからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）の意味に解釈されるものとする。
本発明による核酸が長い核酸の一部であり、この長い核酸がいくつかの部分を含み、少なくとも１つのそのような部分が本発明による核酸またはその部分であることも、本発明の範囲内である。これらの長い核酸の（１つまたは複数の）他の部分は、１つもしくはいくつかの（１つもしくは複数の）Ｄ−核酸でもよく、または（１つもしくは複数の）Ｌ−核酸でもよい。本発明に関連して任意の組合せを使用することができる。この長い核酸のこれらの（１つまたは複数の）他の部分は、結合、好ましくはＣＧＲＰとの結合とは異なる機能を示し得る。１つのあり得る機能は、例えば固定化、架橋、検出または増幅などのために、他の分子との相互作用を可能にすることであり、そのような他の分子は、好ましくはＣＧＲＰと異なる。本発明のさらなる実施形態では、本発明による核酸は、個々のまたは組み合わせた部分として、本発明の核酸のいくつかを含む。本発明の核酸のいくつかを含むそのような核酸も、長い核酸という用語によって包含される。
本明細書においてＬ−核酸とは、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸または核酸分子である。
本明細書においてＤ−核酸とは、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸または核酸分子である。
核酸および核酸分子という用語は、そうでないと明白に示さない場合は互換的に本明細書で使用される。
また、そうでないことを示さない場合は、任意のヌクレオチド配列は、本明細書において５’→３’の方向で記載されている。
好ましくは本明細書において、ヌクレオチドの任意の位置は、そのようなヌクレオチドを含む配列、ストレッチまたはサブストレッチの５’末端に対して決定または言及される。したがって、２番目のヌクレオチドは、配列、ストレッチおよびサブストレッチそれぞれの５’末端からカウントして２番目のヌクレオチドである。また、それによれば、最後から２番目のヌクレオチドは、配列、ストレッチおよびサブストレッチそれぞれの３’末端からカウントして２番目のヌクレオチドである。
本発明の核酸分子が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドまたは例えばランダムな組合せもしくは少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなるストレッチの規定された配列である両方の組合せからなるかどうかに関係なく、核酸は、（１つまたは複数の）デオキシリボヌクレオチド、（１つまたは複数の）リボヌクレオチドまたはその組合せからなっていてもよい。
リボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの両方からなる核酸分子も本発明の範囲内である。２’デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを図１１Ａ〜Ｂおよび１２に示す。本発明による核酸分子の配列においてリボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドを区別するために、本明細書において以下の参照コードを使用する。
本発明による核酸分子は主に２’デオキシリボヌクレオチドからなり、ｄＧは２’デオキシ−グアノシン−５’−モノホスフェートであり、ｄＣは２’デオキシ−シチジン−５’−モノホスフェートであり、ｄＡは２’デオキシ−アデノシン−５’−モノホスフェートであり、ｄＴは２’デオキシ−チミジン−５’−モノホスフェートであり、およびｄＵは２’デオキシ−ウリジン−５’−モノホスフェートである。
本発明による核酸分子は主にリボヌクレオチドからなり、Ｇはグアノシン−５’−モノホスフェートであり、Ｃはシチジン５’−モノホスフェートであり、Ａはアデノシン−５’−モノホスフェートであり、Ｕはウリジン−５’モノホスフェートである。
Ｌ−核酸分子として本発明の核酸分子を設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸分子は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。しかし、Ｄ−核酸分子は、ヌクレアーゼが広範に存在するために、水溶液中、特に生物系または生物試料中であまり安定でない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞由来のヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。このため、Ｌ−核酸分子の生物学的半減期は、動物およびヒトの身体を含めたそのような系の中で著しく増大する。Ｌ−核酸分子の分解性を欠くため、ヌクレアーゼ分解生成物は発生せず、したがってそれから生じる副作用は、動物およびヒトの身体を含めたそのようの系の中で観察されない。この側面は、ＣＧＲＰの存在が関与しているもしくはＣＧＲＰが媒介する疾患および／または障害の治療で使用される事実上全ての他の化合物からＬ−核酸分子を区別する。ワトソンクリック塩基対形成と異なる機構を通じて標的分子と特異的に結合するＬ−核酸分子、または部分的にもしくは完全にＬ−ヌクレオチドからなるアプタマー、特にアプタマーと標的分子の結合に関与しているアプタマーの部分は、スピーゲルマーとも呼ばれる。アプタマーおよびスピーゲルマーそれ自体は当業者に知られており、とりわけ「Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ編、２００６）」に記載されている。
本発明の核酸分子が、それがＤ−核酸、Ｌ−核酸もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうか、またはそれがＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうかに関わらず、一本鎖または二本鎖核酸として存在し得ることも、本発明の範囲内である。典型的には、本発明の核酸分子は、一次配列に起因して規定された二次構造を示し、したがって三次構造をも形成できる一本鎖核酸分子である。しかし、本発明の核酸分子は、互いに相補的または部分的に相補的な２つの鎖が互いにハイブリダイズするという意味で二本鎖でもよい。
本発明の核酸分子を修飾することができる。そのような修飾は、核酸分子の単一のヌクレオチドに関連し得、当技術分野で周知である。そのような修飾の例は、とりわけ、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋｉｍら、２００３）およびＫｕｓｓｅｒ（Ｋｕｓｓｅｒ、２０００）に記載されている。そのような修飾は、核酸分子を構成する個々のヌクレオチドの内の１つ、いくつか、または全ての２’位におけるＨ原子、Ｆ原子またはＯ−ＣＨ３基もしくはＮＨ２−基であり得る。また、本発明による核酸分子は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、本発明による核酸分子はＬＮＡヌクレオチドからなる。
一実施形態では、本発明による核酸分子は多分割核酸分子でもよい。本明細書において多分割核酸分子とは、少なくとも２つの別々の核酸鎖からなる核酸分子である。これら少なくとも２つの核酸鎖は機能的単位を形成し、その機能的単位は標的分子に対するリガンドであり、好ましくは、ＣＧＲＰの場合では標的分子に対するアンタゴニストである。少なくとも２つの核酸鎖は、本発明の核酸分子を切断して少なくとも２つの鎖を得るか、または本発明の完全長の核酸分子の第１の部分に対応する１つの核酸分子および本発明の完全長の核酸分子の別の部分に対応する別の核酸分子を合成することにより、本発明の核酸分子のいずれかから得ることができる。完全長の核酸分子を形成する部分の数に応じて、必要なヌクレオチド配列を有する同数の部分が合成される。切断手法と合成手法を両方適用して、上記で例示した、鎖が２つより多い多分割核酸分子を得ることができることが認められるはずである。言い換えると、少なくとも２つの別々の核酸鎖は、典型的には、互いに相補的でありハイブリダイズする２つの鎖と異なるが、前記少なくとも２つの別々の核酸鎖の間にある程度の相補性が存在することがあり、そのような相補性の結果、前記別々の鎖のハイブリダイゼーションが生じることがある。
最後に、本発明による核酸分子の完全に閉鎖した、すなわち環状の構造が実現され、すなわち、本発明による核酸分子が一実施形態において、好ましくは共有結合により閉鎖し、より好ましくはそのような共有結合が本明細書で開示されている核酸配列またはその任意の誘導体の５’末端と３’末端の間でなされることも、本発明の範囲内である。
本発明による核酸分子の結合定数を決定できる可能性は、本明細書において実施例４に記載の方法の使用にあり、これにより、本発明による核酸が有望なＫＤ値の範囲を示すという上記の知見が確認される。個々の核酸分子と、この場合ＣＧＲＰである標的との結合の強度を表すのに適した尺度はいわゆるＫＤ値であり、それ自体、同様にその決定の方法も当業者に知られている。
好ましくは、本発明による核酸によって示されるＫＤ値は１μＭ以下である。約１μＭのＫＤ値は、核酸と標的の非特異的な結合に特徴的であるといわれている。当業者によって認められるように、本発明による核酸分子の種々の実施形態などの一群の化合物のＫＤ値は特定の範囲内にある。上記で述べた約１μＭのＫＤは、ＫＤ値について好ましい上限である。本発明による核酸分子の一つなどの標的結合核酸のＫＤの下限はわずか約１０ピコモルでもよく、またはより高くてもよい。ＣＧＲＰと結合する個々の本発明による核酸分子のＫＤ値が好ましくはこの範囲内であることは、本発明の範囲内である。この範囲内での任意の第１の数およびこの範囲内での任意の第２の数を選択することによって、好ましいＫＤ値の範囲を規定することができる。好ましい上位のＫＤ値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下位のＫＤ値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好ましい上位のＫＤ値は１０ｎＭであり、より好ましい下位のＫＤ値は１００ｐＭである。
好ましくは、ＣＧＲＰはヒトアルファＣＧＲＰであり、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性を有する。
本発明による核酸分子に関して実施例７に示すように、表面プラズモン共鳴測定によってヒトアミリンに対する結合を検出することができなかった。好ましくは、本発明による核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
本発明による核酸分子の結合特性に加えて、本発明による核酸分子は、この場合ＣＧＲＰである各標的分子の機能を阻害する。ＣＧＲＰの機能の阻害（例えば既に記載した各受容体の刺激）は、本発明による核酸分子のＣＧＲＰへの結合により、および本発明による核酸分子とＣＧＲＰとの複合体の形成により実現される。核酸分子とＣＧＲＰとのそのような複合体は、通常はＣＧＲＰによって、すなわち本発明の核酸分子との複合体中に存在しないＣＧＲＰによって刺激される受容体を刺激することができない。したがって、本発明の核酸分子による受容体機能の阻害は、ＣＧＲＰによって刺激され得る各受容体から独立しているが、本発明の核酸分子による、ＣＧＲＰによる受容体の刺激の予防から生じる。
本発明による核酸分子の阻害定数を決定できる可能性は、実施例５に記載の方法の使用にあり、これにより、本発明による核酸分子が、治療的処置スキームにおける前記核酸分子の使用を可能にする有望な阻害定数を示すという上記の知見が確認される。この場合ＣＧＲＰである標的と各受容体との相互作用に関する個々の核酸分子の阻害作用の強度を表すのに適した尺度は、いわゆる５０％阻害濃度（略語：ＩＣ５０）であり、それ自体、同様にその決定方法も当業者に知られている。
好ましくは、本発明による核酸分子によって示されるＩＣ５０値は１μＭ未満である。約１μＭのＩＣ５０値は、標的機能の非特異的な阻害、好ましくは、本発明の核酸分子による、標的による標的受容体の活性化の阻害に特徴的であるといわれている。当業者によって認められるように、本発明による核酸分子の様々な実施形態などの一群の化合物のＩＣ５０値は特定の範囲内にある。上記で述べた約１μＭのＩＣ５０は、ＩＣ５０値についての好ましい上限である。標的結合核酸分子のＩＣ５０についての下限はわずか約１０ピコモルでもよく、またはより高くてもよい。ＣＧＲＰと結合する個々の核酸のＩＣ５０値が好ましくはこの範囲内であることは、本発明の範囲内である。この範囲内での任意の第１の数およびこの範囲内での任意の第２の数を選択することによって、好ましい範囲を規定することができる。好ましい上位のＩＣ５０値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下位のＩＣ５０値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好ましい上位のＩＣ５０値は５ｎＭであり、より好ましい下位のＩＣ５０値は１００ｐＭである。
好ましい実施形態では、ＣＧＲＰはヒトアルファＣＧＲＰであり、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性を有する。
本発明による核酸分子に関して実施例７に示すように、ヒトアミリンに関して１０００ｎＭを超えるＩＣ５０およびラットアミリンに関して１００ｎＭを超えるＩＣ５０を測定した。好ましい実施形態では、本発明の分子による核酸は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
好ましくは、核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有し、および／または核酸分子は、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、核酸分子は、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する。
本発明による核酸分子は、それが依然としてＣＧＲＰの場合での標的分子と結合することができるという条件で、どんな長さを有していてもよい。本発明による核酸について好ましい長さがあることが当技術分野において認められるであろう。典型的には、その長さは１５〜１２０ヌクレオチドである。１５〜１２０の間の任意の整数が、本発明による核酸についてあり得る長さであることが当業者によって認められるであろう。本発明による核酸の長さについてより好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５２ヌクレオチドおよび約４８〜５４ヌクレオチドである。
核酸分子が、好ましくは高分子量部分であり、かつ／または好ましくは核酸の特徴を、とりわけ、動物の身体、好ましくはヒトの身体における滞留時間の観点から修飾することを可能にする部分を含むことは、本発明の範囲内である。そのような修飾の特に好ましい実施形態は、本発明による核酸分子のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書において、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を表し、ＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを表す。好ましくは本明細書においてＰＥＧ化は本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾は本発明による核酸と結合したＰＥＧ部分からなる。好ましくは本明細書においてＨＥＳ化は本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾は本発明による核酸と結合したＨＥＳ部分からなる。これら修飾、ならびにそのような修飾を使用して核酸を修飾する方法は欧州特許出願ＥＰ１３０６３８２に記載され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＰＥＧがそのような高分子量部分である場合、分子量は好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。ＨＥＳがそのような高分子量部分である場合、分子量は好ましくは約５０〜約１０００ｋＤａであり、より好ましくは約１００〜約７００ｋＤａであり、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである。ＨＥＳは、０．１〜１．５の、より好ましくは１〜１．５のモル置換を示し、約０．１〜１５の、好ましくは約３〜１０のＣ２／Ｃ６比として表される置換グレードを示す。ＨＥＳ修飾の方法は、例えば独国特許出願ＤＥ１２００４００６２４９．８に記載され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
修飾は、原理上、本発明の核酸分子に対してその任意の位置で行うことができる。好ましくは、そのような修飾は、核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間にある任意のヌクレオチドに対して行われる。
修飾ならびに好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を、直接または間接的に、好ましくはリンカーを介して間接的に本発明の核酸分子と結合させることができる。本発明による核酸分子が１つまたは複数の修飾、好ましくは１つまたは複数のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも、本発明の範囲内である。一実施形態では、個々のリンカー分子は複数のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を本発明による核酸分子と結合させる。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自体直鎖でもよく、または分岐していてもよい。この種のリンカーは当業者に知られており、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３およびＷＯ２００３／０３５６６５にさらに記載されている。
好ましい実施形態では、リンカーは生分解性リンカーである。生分解性リンカーは、本発明による核酸からの修飾の放出により、本発明による核酸の特徴を、とりわけ、動物の身体、好ましくはヒトの身体における滞留時間の観点から修飾することを可能にする。生分解性リンカーを使用すると、本発明による核酸の滞留時間の良好な調節を可能にすることができる。そのような生分解性リンカーの好ましい実施形態は、それだけに限らないが、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０、ＷＯ２００８／０３４１２２、ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８に記載されている生分解性リンカーである。
修飾または修飾基が生分解性修飾であり、その生分解性修飾を、直接または好ましくはリンカーを介して間接的に本発明の核酸分子と結合させることができることは、本発明の範囲内である。生分解性修飾は、本発明による核酸からの修飾の放出または分解により、本発明による核酸の特徴を、とりわけ、動物の身体、好ましくはヒトの身体における滞留時間の観点から修飾することを可能にする。生分解性修飾を使用すると、本発明による核酸の滞留時間の良好な調節を可能にすることができる。そのような生分解性修飾の好ましい実施形態は、それだけに制限されないが、国際特許出願ＷＯ２００２／０６５９６３、ＷＯ２００３／０７０８２３、ＷＯ２００４／１１３３９４およびＷＯ２０００／４１６４７に、好ましくはＷＯ２０００／４１６４７、１８ページ、４〜２４行目に記載されているように生分解性である。
上記に記載の修飾のほかに、他の修飾を使用して、本発明による核酸の特徴を修飾することができ、そのような他の修飾は、タンパク質、コレステロールなどの脂質およびアミラーゼ、デキストランなどの糖鎖などの群から選択することができる。
どんな理論にも拘泥するものではないが、好ましくは生理的に許容されるポリマー、より詳細には本明細書で開示されているポリマーの１つまたはいくつかなどの高分子量部分で本発明による核酸分子を修飾することにより、そのような修飾された本発明の核酸分子の、本発明の修飾核酸分子が投与される動物またはヒトの身体からの排出動態が変化する。より詳細には、そのような修飾された本発明の核酸分子の分子量が増大し、特にＬ型のときに、すなわちＬ−核酸分子であるときに本発明の核酸分子が代謝に曝されないため、動物の身体、好ましくは哺乳動物の身体、より好ましくはヒトの身体からの排出が低下する。典型的には排出が腎臓を介して行われるので、こうして修飾された核酸分子の糸球体ろ過量がこの種の高分子量修飾を有さない核酸分子と比較して著しく低減され、その結果、動物の身体における修飾核酸分子の滞留時間が増大することが想定される。それに関連して、そのような高分子量修飾にも関わらず、本発明による核酸分子の特異性が、有害な方法で影響を受けないことは特に注目に値する。その限りにおいて、本発明による核酸分子は、とりわけ、持続性放出をもたらす医薬製剤が本発明による核酸分子の持続性放出をもたらすことが必ずしも必要でないような、薬学的活性化合物から通常は予想できない驚くべき特徴を有する。むしろ、高分子量部分を含む修飾された形態の本発明による核酸分子は、その修飾のために、すでに持続性放出製剤から放出されたかのように働くので、それ自体すでに持続性放出製剤として使用することができる。その限りにおいて、本明細書で開示されている本発明による核酸分子の（１つまたは複数の）修飾およびこうして修飾された本発明による核酸分子ならびにそれらを含む任意の組成物は、独特の、好ましくは調節された薬物動態および生体内分布をもたらすことができる。これには、動物およびヒトの身体の循環ならびにそのような動物およびヒトの組織への分布における滞留時間も含まれる。そのような修飾は、特許出願ＷＯ２００３／０３５６６５にさらに記載されている。
しかし、本発明による核酸が、修飾、特にＰＥＧ化またはＨＥＳ化などの高分子量修飾を含まないことも、本発明の範囲内である。そのような実施形態は、本発明による核酸が体内の任意の標的臓器もしくは組織に対して優先的な分布を示すとき、または身体への投与後の身体からの本発明による核酸の迅速なクリアランスが所望されるときに特に好ましい。体内の任意の標的臓器または標的組織に対して優先的な分布プロファイルを有する、本明細書で開示されている本発明による核酸分子により、核酸分子の全身濃度を低く維持しつつ、標的組織における有効な局所濃度の確立が可能となる。これにより低用量の使用が可能となり、それは経済的な視点から有益であるだけでなく、核酸作用物質に対する他の組織の不要な曝露も低減し、それによって副作用の潜在的なリスクが低減する。投与後の身体からの本発明による核酸分子の迅速なクリアランスは、とりわけ、本発明による核酸分子またはそれを含む薬剤を使用したインビボ画像化または特定の治療的投与の必要のある場合に所望されることがある。
本発明による核酸分子および／または本発明によるアンタゴニストは、薬剤または医薬組成物の生成または製造に使用することができる。本発明によるそのような薬剤または医薬組成物は、任意選択で少なくとも１つのさらなる薬学的活性化合物と一緒に、本発明による核酸分子の少なくとも１つを含有し、本発明による核酸分子は、好ましくは、薬学的活性化合物それ自体として働く。そのような薬剤は、好ましい実施形態では、少なくとも薬学的に許容される担体を含む。そのような担体は、例えば、水、緩衝液、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース、塩平衡溶液、クエン酸塩、デンプン、糖、ゼラチンまたは任意の他の許容される担体物質でよい。そのような担体は、当業者に一般に知られている。本発明の薬剤のまたはそれに関連する任意の実施形態、使用および態様が、本発明の医薬組成物にも適用可能であり、逆もまた同じであることが当業者によって認められるであろう。
本発明によるまたは本発明に従って調製された核酸分子、医薬組成物および薬剤による治療および／または予防の適応症、疾患および障害は、それぞれの病原性機構においてＣＧＲＰが直接または間接的に関与することから生じる。
片頭痛および他の頭痛の発現に関連するまたは関与する経路におけるＣＧＲＰの関与に基づいて、本発明の核酸分子、核酸分子の内の１つまたはいくつかを含有する本発明の医薬組成物および核酸分子の内の１つまたはいくつかを含有する本発明に薬剤が前記疾患、障害および疾患状態の治療および／または予防において有用であることは明らかである。
本発明の核酸分子、核酸分子の内の１つまたはいくつかを含有する本発明の医薬組成物および核酸分子の内の１つまたはいくつかを含有する本発明の薬剤の使用は、上記に記載した片頭痛および他の頭痛の発現における潜在的な治療的介入に制限されない。さらに、それらは、ＣＧＲＰの病態生理学的関与が説明されている疾患および／または障害および／または疾患状態に適用可能である。したがって、そのような疾患および／または障害および／または疾患状態には、それだけに限らないが、片頭痛、異なる形態の頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性、骨関節症、血管形成、腫瘍成長、自己免疫疾患およびまたは炎症性疾患が含まれ、好ましくは、急性疼痛および慢性疼痛は炎症および／または神経障害に由来する。
言うまでもなく、本発明によるＣＧＲＰ結合核酸分子がＣＧＲＰと相互作用し、またはＣＧＲＰに結合することから、本発明によるＣＧＲＰ結合核酸分子を、ヒトおよび動物の本明細書に記載されている任意の疾患の治療、予防および／または診断に容易に使用することができることを当業者は一般に理解するだろう。それに関連して、一実施形態では、本発明による核酸分子が、本明細書に記載されている疾患、障害および状態の根底にある作用の機序に関係なく、そのような疾患、障害または状態のいずれかの治療および予防に使用することができることが認められるはずである。
いかなる不必要な繰り返しも避けるために、それに関連して概略されているＣＧＲＰ−ＣＧＲＰ受容体軸の関与により、特許請求に係る治療、予防および診断効果が実現するように本発明による核酸分子によって前記軸に対処することができることが認められるはずである。さらに、患者の疾患、障害および状態の特殊性およびそれに関連して記載されている治療レジメンのいかなる詳細も本出願の好ましい実施形態の対象であり得ることが認められるはずである。
急性および慢性の疼痛。ＣＧＲＰは、侵害受容性の神経線維により高度に発現される。ＣＧＲＰが急性および慢性の疼痛の発生および永続化に関与する証拠が蓄積されている。炎症は、急性および慢性の痛覚の潜在的トリガーであり得る。慢性膵炎では疼痛が最も治りにくい症状である。それは、後根神経節におけるＣＧＲＰの上方制御を順次誘導する膵臓におけるＮＧＦの発現の増大により進行する（Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｈｅら、２００５；Ｗｉｃｋ，Ｈｏｇｅら、２００６；Ｌｉｕ，Ｓｈｅｎｏｙら、２０１１）。ＣＧＲＰ（８〜３７）の髄腔内投与により、この機構に拮抗することができ、痛覚過敏を低下させることができる（Ｌｉｕ，Ｓｈｅｎｏｙら、２０１１）。関節炎の動物モデルでは、髄腔内のＣＧＲＰ（８〜３７）およびオルセゲパントはニューロン活動を著しく阻害し、後肢の侵害反射の閾値を増大させた（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、２００６；Ａｄｗａｎｉｋａｒ，Ｊｉら、２００７）。ＣＧＲＰ欠乏マウスでは、関節炎の実験的誘導後に痛覚過敏を実証することに失敗した（ＺｈａｎｇおよびＭｃＤｏｕｇａｌｌ、２００６）。さらに、自発性疼痛に伴う関節炎の顎関節の髄液中において、ＣＧＲＰが高レベルで発見されている（Ｋｏｐｐ、２００１）。深部組織炎症のモデルでは、静脈内ＣＧＲＰ（８〜３７）により血漿の溢出が遮断され、頭部および後肢の両方の機械的アロディニアが消滅した（Ａｍｂａｌａｖａｎａｒ，Ｍｏｒｉｔａｎｉら、２００６）。
神経障害性疼痛に関するモデルでは、ＣＧＲＰの高度発現が観測される（Ｚｈｅｎｇ，Ｗａｎｇら、２００８；Ｎｉｔｚａｎ−Ｌｕｑｕｅｓ，Ｄｅｖｏｒら、２０１１）。ＣＧＲＰ（８〜３７）は、脊髄ヘミセクションまたは骨髄神経切断により誘発される機械的なおよび熱的なアロディニアの消滅に効果的である（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃｈａｓｔａｉｎら、２０００；ＬｅｅおよびＫｉｍ、２００７）。同様に、ＣＧＲＰ（８〜３７）およびオルセゲパントにより、部分的な坐骨神経の結紮後の温熱性痛覚過敏が効果的に弱められた（ＭａおよびＱｕｉｒｉｏｎ、２００６）。糖尿病の神経障害性疼痛に関するモデルでは、静脈内ＣＧＲＰ（８〜３７）により、ＳＴＺにより誘導される糖尿病を患うマウスにおいて痛覚過敏活性が著しく弱められた（ＧａｂｒａおよびＳｉｒｏｉｓ、２００４）。さらに、ＣＧＲＰは、帯状ヘルペスによって引き起こされる神経損傷の結果であると考えられる後ヘルペス性神経痛に関与することができる（Ｈｏｕ，Ｂａｒｒら、２０１１）。
腰痛は仙腸関節で起こることが知られている。ヒト組織の組織学的研究により、ＣＧＲＰが仙骨および腸骨の軟骨の上層に存在することが明らかになった（Ｓｚａｄｅｋ，Ｈｏｏｇｌａｎｄら、２０１０）。一致するように、ラットにおけるアジュバントによる誘導される腰痛中での後根神経節中においてＣＧＲＰ発現が増大した（Ｌｅｅ，Ｋｉｍら、２００９）。
癌性疼痛におけるＣＧＲＰの関与の証拠が、ＣＧＲＰ陽性線維およびＣＧＲＰ放出を伴う腫瘍の神経支配の増大が痛覚過敏と関連することを明らかにしている研究によりもたらされている（Ｗａｃｎｉｋ，Ｂａｋｅｒら、２００５；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈｏｆ，Ｓｔｏｓｓｅｒら、２００９）。ＣＧＲＰ（８〜３７）の腫瘍内注入により、腫瘍が関連する痛覚過敏が部分的に遮断される（Ｗａｃｎｉｋ，Ｂａｋｅｒら、２００５）。
疼痛は過敏性腸症候群の特徴的な症状である。慢性結腸過敏症に関する非炎症性のモデルでは、ＣＧＲＰ受容体の遮断により結腸過敏症が低減した。このことは、過敏性腸症候群における腹痛の潜在的治療としてのＣＧＲＰ拮抗作用を示唆する（Ｂｏｕｒｄｕ，Ｄａｐｏｉｇｎｙら、２００５）。
片頭痛、異なる形態の頭痛、急性および慢性の疼痛における治療的介入の場合では、本発明のまたは本発明に従って調製された核酸分子、医薬組成物および薬剤を、ＮＳＡＩＤ、麦角アルカロイド誘導体（例えばジヒドロエルゴタミン）およびトリプタン、５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体アゴニスト（例えばスマトリプタン）などの確立した鎮痛剤（ａｎａｇｅｔｉｃｓ）との併用療法で使用することができる。
モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性。モルヒネをベースとする薬物に長時間にわたって曝されると鎮痛効力が徐々に減少し、その臨床用途が制限される。ＣＧＲＰは、モルヒネをベースとする鎮痛剤に対するこの耐性の仲介に関与すると示唆されている。ラットでは、慢性の髄腔内モルヒネ治療により、その抗侵害受容性効果に対する耐性がもたらされ、脊髄後角におけるＣＧＲＰの上方制御が誘導される。同様に、この神経末端から放出されたＣＧＲＰは、モルヒネにより誘導される鎮痛に対する耐性の発生の一因となる。動物モデルでは、オルセゲパントまたはＣＧＲＰ（８〜３７）による髄腔内治療により、これらの下流効果が遮断され、それによって、慢性的に使用されるモルヒネの鎮痛特性が維持される。したがって、ＣＧＲＰアンタゴニストを、アヘン剤をベースとする治療における補助剤として潜在的に使用することができる（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍａら、２０００；Ｗａｎｇ，Ｍａら、２００９）。
骨関節症。痛みを伴う骨関節症（略語：ＯＡ）を患う患者からの股関節は、対照と比較して３倍高いＣＧＲＰ陽性神経密度を有し、関節リウマチおよびＯＡの患者からの滑膜組織の組織学は、ＯＡにおける著しく高いＣＧＲＰ−陽性神経線維密度を明らかにした（Ｓａｘｌｅｒ，Ｌｏｅｒら、２００７；Ｄｉｒｍｅｉｅｒ，Ｃａｐｅｌｌｉｎｏら、２００８）。一致するように、関節を刺激するＣＧＲＰ−陽性線維の割合がＯＡの動物モデルでは著しく増大した（Ｆｅｒｒｅｉｒａ−Ｇｏｍｅｓ，Ａｄａｅｓら、２０１０）。一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１アンタゴニストの鎮痛効果は、ＯＡモデルにおけるＣＧＲＰの低下した脊髄レベルと関連した（Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ，Ｈａｎら、２０１０）。侵害受容におけるＣＧＲＰの役割に加えて、ＣＧＲＰは、骨代謝に直接関与することもできる。ＣＧＲＰシグナル伝達は、骨芽細胞の増殖および分化を刺激することにより、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成および骨吸収の抑制により、骨量を維持する（Ｈａｎ，Ｚｈａｎｇら、２０１０；Ｗａｎｇ，Ｓｈｉら、２０１０）。
腫瘍の血管形成および増殖。ＣＧＲＰ欠乏マウスでは、移植肺癌細胞の腫瘍の増殖および腫瘍関連の血管形成が著しく低下する。野生型マウスでは、ＣＧＲＰ（８〜３７）または除神経は癌細胞の増殖を抑制した。これらの結果は、ＣＧＲＰが腫瘍関連の血管形成および腫瘍の増殖を促進することを示す。血管形成のＣＧＲＰ依存性増大に関する下流の分子がＶＥＧＦであるという徴候がある（Ｔｏｄａ，Ｓｕｚｕｋｉら、２００８）。ヒトでは、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌および甲状腺癌を含む特定の癌からの血漿および腫瘍の両方においてＣＧＲＰの高度の発現が確認されている。前立腺癌では、血清ＣＧＲＰは高悪性度の／高段階の疾患と関連した。ＲＡＭＰ１ｍＲＮＡ発現が、良性の褐色細胞腫および悪性の褐色細胞腫、コーン腺腫および膵臓癌において検出されている（Ｈａｙ，Ｗａｌｋｅｒら、２０１１）。
虚血により誘導される血管形成。虚血により、代償機構としての血管形成が誘導される。ラットの後肢（ｈｉｎｄ ｌｉｍｐ）の虚血組織においてＣＧＲＰレベルが増大し、ＣＧＲＰのアデノウイルス過剰発現により虚血後肢における毛細管密度が増加した（Ｚｈｅｎｇ，Ｌｉら、２０１０）。ＣＧＲＰ欠乏マウスは、実験的な後肢の虚血後に血流回復の低下および毛細管密度の減少を示した。ミニ浸透圧ポンプによるＣＧＲＰ（８〜３７）の皮下注入により血管形成が遅延した（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｉｔｏら、２０１１）。
炎症。ＣＧＲＰが炎症プロセスに直接影響を及ぼすという証拠がある。ＣＧＲＰは、関節炎の動物モデルでは上方制御されている（Ｎｏｈｒ，Ｓｃｈａｆｅｒら、１９９９；Ｃｈｅｎ，Ｗｉｌｌｃｏｃｋｓｏｎら、２００８）。多発性硬化症のモデルでは、ＣＧＲＰが病原性Ｔ細胞応答を促進することが明らかになった（Ｍｉｋａｍｉ，Ｗａｔａｎａｂｅら、２０１２）。２型糖尿病の動物モデルではＣＧＲＰレベルの増大も観測された（Ｇｒａｍ，Ｈａｎｓｅｎら、２００５；Ｔａｎａｋａ，Ｓｈｉｍａｙａら、２０１１）。乾癬のマウスモデルでは、ＣＧＲＰ（８〜３７）によるＣＧＲＰの除神経または阻害により、ＣＤ４＋細胞数および表皮肥厚の著しい減少がもたらされた（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｂｅｌｋａｄｉら、２０１１）。さらに、ヒト皮膚微小血管内皮細胞によるケモカイン産生をＣＧＲＰが阻害すること（Ｈｕａｎｇ，Ｓｔｏｈｌら、２０１１）、およびアトピー性皮膚炎の患者由来のＴ細胞によるケモカイン産生をＣＧＲＰが調節したこと（Ａｎｔｕｎｅｚ，Ｔｏｒｒｅｓら、２００９）を明らかにしている研究により、皮膚炎症におけるＣＧＲＰの役割が示唆される。
不安。ＣＧＲＰの注入により、ラットにおいて、ＣＧＲＰ拮抗作用が不安の軽減に臨床上有用な方針であり得ることを示唆する不安様応答が引き起こされる。
神経変性疾患。最近の研究により、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）の発病に不可欠であるアンドロゲン受容体の変異がＣＧＲＰ発現の増大と関連すること、およびＣＧＲＰ発現の抑制により臨床症状が軽減されることが明らかになった（Ｍｉｎａｍｉｙａｍａ，Ｋａｔｓｕｎｏら、２０１２）。
嚢胞性繊維症（Ｘｉｅ，Ｆｉｓｈｅｒら、２０１１）、肥満細胞症（Ｍａｉｎｔｚ，Ｗａｒｄｅｌｍａｎｎら、２０１１）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）（Ｚｈａｎｇ，Ｇｏｎｇら、２０１２）、非びらん性胃食道逆流症（Ｘｕ，Ｌｉら、２０１２）を含む様々な他の疾患においてＣＧＲＰの病因的役割が示唆されている。
さらなる実施形態では、薬剤は、さらなる薬学的活性作用物質を含む。そのようなさらなる薬学的活性化合物は、とりわけ、それだけに限定されないが、片頭痛、急性および慢性の疼痛の治療および／または予防用の化合物であり、化合物は、トリプタン、ＮＳＡＩＤ、オピオイド、Ｎ型電位開口型カルシウムチャネル遮断剤（ジコノチド）、抗うつ剤および抗てんかん剤を含む群から選択される。本発明による核酸分子によって本発明に従って対処され得る様々な適応症を仮定すれば、前記さらなる（１つまたは複数の）薬学的活性作用物質は、原理上、そのような疾患の治療および／または予防に適しているいずれか１つであり得ることが当業者に理解されるだろう。本発明による核酸分子は、特に薬剤として存在するまたは使用される場合、好ましくは、トリプタン、ＮＳＡＩＤ、オピオイド、Ｎ型電位開口型カルシウムチャネル遮断剤（ジコノチド）、抗うつ剤および抗てんかん剤であり、またはそれらと併用される。
あるいは、またはさらに、本発明による薬剤が、原理上、前記疾患の治療のための薬剤の使用に関連して開示されている疾患のいずれかの予防に使用されることは、本発明の範囲内である。したがって、すなわちそれぞれの疾患に対するそれぞれのマーカーが当業者に知られている。好ましくは、それぞれのマーカーはＣＧＲＰである。
本発明の薬剤の一実施形態では、そのような薬剤は、本明細書で開示されている疾患、特に本発明の薬剤が使用される疾患のいずれかに対する他の治療と組み合わせて使用するための薬剤である。
「併用療法」（または「共同療法」）は、特定の治療レジメンの一部としての本発明の薬剤および少なくとも第２の作用物質またはさらなる薬学的活性作用物質の投与を含み、その治療レジメンは、これらの治療作用物質、すなわち本発明の核酸分子および前記第２の作用物質またはさらなる作用物質の共同作用から有益な効果をもたらすことを意図している。併用の有益な効果には、それだけに限らないが、治療作用物質の併用から生じる薬物動態的なまたは薬力学的な共同作用が含まれる。組合せにおけるこれらの治療作用物質の投与は、典型的には、規定された期間にわたって（選択された組合せに応じて通常は数分、数時間、数日または数週間）実施される。
「併用療法」は、別々の単独療法レジメンの一部としてのこれら２つ以上の治療作用物質の投与を包含することを意図し得るが、一般には意図していない。「併用療法」は、順次の、すなわち各治療作用物質が異なる時期に投与される形でのこれらの治療作用物質の投与、ならびに実質的に同時のこれらの治療作用物質、または少なくとも２つの治療作用物質の投与を含むことを意図している。実質的に同時の投与は、例えば、対象に、固定された比率の各治療作用物質を有する単一のカプセルを投与し、または治療作用物質それぞれについて単一のカプセルを複数投与することによって行なうことができ、まるで複数の単一カプセルが同時に投与されたように治療効果が得られるように、複数の単一カプセルが同時にまたは適時に投与される。
治療作用物質それぞれの順次または実質的に同時の投与は、それだけに限らないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋内経路、および粘膜組織を介する直接吸収を含めた任意の適当な経路により実施することができる。治療作用物質は、同じ経路により投与することもでき、または異なる経路により投与することもできる。例えば、組合せの第１の治療作用物質を注射により投与することができ、一方で、その組合せの他の治療作用物質を局所投与することができる。
あるいは、例えば、全ての治療作用物質を局所投与することができ、または全ての治療作用物質を注射により投与することができる。「併用療法」は、他の生物学的なまたは薬学的な活性成分とのさらなる組み合わせでの、上記に記載した治療作用物質の投与を含むこともできる。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、非薬物治療は、治療作用物質と非薬物治療の組合せの共同作用からの有益な効果が実現される限り、任意の適切な時期に行うことができる。例えば、適当な場合には、非薬物治療が治療作用物質の投与からおそらく数日または数週間でも時間的に隔てられているときでも有益な効果が依然として実現される。
上記の一般用語で概略を述べたように、原理上、当業者に知られている任意の形態で、本発明による薬剤を投与することができる。好ましい投与経路は全身投与であり、より好ましくは非経口投与により、好ましくは注射による。あるいは、薬剤を局所に投与することができる。他の投与経路は、筋内、腹腔内および皮下、経口、鼻内、気管内または肺を含み、効率を確保しつつ侵襲性が最も小さい投与経路が優先される。
皮下、筋内または静脈内注射および注入に非経口投与が一般に使用される。さらに、非経口投与の１つの手法は、確実に一定レベルの投与量が維持されるようにし、当業者に周知である緩徐放出または持続性放出系の埋め込みを使用する。
さらに、適切な鼻内用媒体、吸入剤の局所使用を介する鼻内の形態で、または当業者に周知の経皮的皮膚パッチの形態を使用する経皮経路を介して、本発明の好ましい薬剤を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するために、その投与は、好ましくは、投与レジメン全体にわたって断続的ではなく連続的となる。他の好ましい局所製剤には、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾルスプレー剤およびゲル剤が含まれる。
本発明の方法に対して有利に反応することができる対象には、医学のおよび獣医学の対象が含まれ、一般に、ヒトおよびヒトの患者が含まれる。本発明の方法および手段が有用である他の対象の中には、ネコ、イヌ、大型動物、ニワトリなどの鳥類などがある。
本発明の薬剤は、一般に、それだけに限らないが、薬学的に許容される媒質中に溶解または分散した本発明の核酸分子を含めた、治療に有効な量の（１つまたは複数の）活性構成成分を含む。薬学的に許容される媒質または担体には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質についてのそのような媒質および作用剤の使用は当技術分野で周知である。本発明の薬剤中に補充的な活性成分を取り込むこともできる。
さらなる態様では、本発明は医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、本発明による核酸分子の少なくとも１つおよび好ましくは薬学的に許容される結合剤を含む。そのような結合剤は、当技術分野で使用され、かつ／または知られている任意の結合剤でよい。より詳細には、そのような結合剤は、本明細書で開示されている薬剤の製造に関連して論じられる任意の結合剤であるが、それに制限されない。さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物はさらなる薬学的活性作用物質を含む。
本発明の薬剤および医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に知られている。典型的には、そのような組成物は、液体の溶液もしくは懸濁液の注射剤として；注射前に液体で溶液もしくは懸濁液にするのに適した固体形態；経口投与用の錠剤もしくは他の固体として；徐放型カプセルとして；または点眼剤、クリーム剤、ローション剤、膏薬、吸入剤などを含めた現在使用されている任意の他の形態で調製することができる。手術現場において特定の領域を取り扱う外科医、内科医または医療従事者による、食塩水に基づく洗浄などの滅菌製剤の使用も特に有用であり得る。微小デバイス、微小粒子またはスポンジを介して本発明の組成物を送達することもできる。
処方時に、本発明の薬剤を、投与製剤に適合する手段で、および薬理学的に有効であるような量で投与することができる。製剤は、上記に記載されている注射剤のタイプなどの様々な投与形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
本発明の薬剤は、徐放および持続性放出錠剤またはカプセル、丸剤、粉末、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップおよびエマルションのような経口剤形で投与することもできる。坐剤は、脂肪性のエマルションまたは懸濁液から調製すると有利である。
本発明の医薬組成物または薬剤は、滅菌することができ、かつ／または保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を制御するための塩および／もしくは緩衝剤などのアジュバントを含有してよい。さらに、それらは他の治療的価値のある物質を含有してもよい。組成物は、従来の混合、造粒、または被覆方法に従って調製され、典型的には、約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％の活性成分を含む。
液体の、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製することができる。活性化合物を、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの薬学的に純粋な溶媒中に溶解し、またはそれと混合することによって、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体で溶解するのに適した固体形態を製剤することができる。
本発明の薬剤および核酸分子はそれぞれ、小型単層小胞、大型単層小胞や多層小胞などのリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、種々のリン脂質から形成することができ、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有している。いくつかの実施形態では、脂質構成成分の薄膜が薬物の水溶液で水和されて薬物を被包する脂質層を形成するが、これは当業者に周知である。例えば、当技術分野で知られている方法を使用して構築された親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として、核酸分子を提供することができる。さらに、リポソームは、その表面上に細胞傷害作用物質を標的化するためのそのような核酸分子と、内部に細胞死滅を仲介するための毒性試薬を有し得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に示されている。
本発明の薬剤および核酸分子はそれぞれ、標的化可能な薬物担体である可溶性ポリマーと結合していてもよい。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンが含まれ得る。さらに、本発明の薬剤および核酸分子はそれぞれ、薬物の制御放出を実現するのに有用なあるクラスの生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合していてもよい。
所望の場合、投与する医薬組成物および薬剤はそれぞれ、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤や、例えば酢酸ナトリウムやオレイン酸トリエタノールアミンなどの他の物質などの非毒性補助物質を少量含有してもよい。
本発明の核酸分子および薬剤をそれぞれ利用する投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用する特定のアプタマーまたはその塩を含めた種々のファクターに従って選択される。通常の技能を有する医師または獣医なら、状態の進行を予防し、それに対抗し、またはそれを停止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定し処方することができる。
本明細書で開示されている疾患のいずれかの治療において、本発明による核酸分子の有効な血漿レベルは、好ましくは５００ｆＭ〜２００μＭであり、好ましくは１ｎＭ〜２０μＭ、より好ましくは５ｎＭ〜２０μＭであり、最も好ましくは５０ｎＭ〜２０μＭである。
本発明の核酸分子および薬剤はそれぞれ、好ましくは、毎日１回の投与で、２日もしくは３日に１回、毎週、２週間に１回、毎月１回の投与でまたは３ヶ月に１回投与することができる。
本明細書に記載されている本発明の薬剤が、本明細書に開示されている医薬組成物、好ましくは本発明の医薬組成物を構成することは、本発明の範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、そのような治療を必要とする対象の治療方法に関し、その方法は、薬学的活性量の本発明による核酸分子の投与を含む。一実施形態では、対象は疾患を患いまたはそのような疾患を発症するリスクがあり、疾患は、本明細書で開示されているもののいずれか、特に薬剤を製造するための本発明による核酸分子のいずれかの使用に関連して開示されている疾患のいずれかである。
好ましくは本明細書において診断用物質または診断薬または診断手段は、ＣＧＲＰ、好ましくは本明細書に記載のＣＧＲＰ、より好ましくは本明細書に記載の種々の障害および疾患に関連して本明細書に記載されているＣＧＲＰを直接または間接的に検出するのに適している。診断用物質は、本明細書に記載の障害および疾患それぞれのうちいずれかの検出および／または経過観察に適している。そのような検出は、本発明による核酸とＣＧＲＰの結合により可能である。そのような結合を直接または間接的に検出することができ得る。そのそれぞれの方法および手段は当業者に知られている。とりわけ、本発明による核酸分子は、本発明による核酸分子、好ましくはＣＧＲＰと結合している核酸分子の検出を可能にする標識を含んでよい。そのような標識は、好ましくは、放射性、酵素および蛍光標識を含む群から選択される。原理上、抗体について開発された全ての既知のアッセイを本発明による核酸分子に採用させることができ、標的結合抗体は本発明の標的結合核酸分子によって置き換えられる。標識のない標的結合抗体を使用する抗体アッセイでは、好ましくは、検出は、放射性、酵素および蛍光標識で修飾され、そのＦｃ断片で標的結合抗体と結合する二次抗体によって行われる。核酸、好ましくは本発明による核酸分子の場合、核酸はそのような標識で修飾され、好ましくは、そのような標識はビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５を含む群から選択され、そのような標識はそのような標識に対する抗体、例えば抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体もしくは抗Ｃｙ５抗体によって検出され、または標識がビオチンである場合、その標識は、天然にビオチンと結合するストレプトアビジンまたはアビジンによって検出される。そのような抗体、ストレプトアビジンまたはアビジンが、好ましくは、それぞれの標識、（例えば二次抗体のような）放射性、酵素および蛍光標識で修飾され、その検出を可能にするシグナルを伝達する。
さらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、第２の検出手段によって検出または分析され、前記第２の検出手段は分子ビーコンである。分子ビーコンの方法は当業者に知られており、Ｍａｉｒａｌらによって報告されている（Ｍａｉｒａｌら、２００８）。
本発明による核酸分子を使用したＣＧＲＰの検出により、本明細書で定義されるＣＧＲＰの検出が特に可能となることが認められるであろう。
ＣＧＲＰの検出に関連して本発明の好ましい方法は、
（ａ）ＣＧＲＰの存在について試験する試料を提供するステップと、
（ｂ）本発明による核酸分子を提供するステップと、
（ｃ）好ましくは反応容器中で試料を核酸と反応させるステップと
を含み、ステップ（ｂ）の前にステップ（ａ）を行うことができ、または、ステップ（ａ）の前にステップ（ｂ）を行うことができる。
好ましい実施形態では、さらなるステップｄ）が提供され、これは、試料と核酸分子との反応の検出からなる。好ましくは、ステップｂ）の核酸分子は表面に固定化される。その表面は、反応チューブ、プレートのウェルなどの反応容器の表面でもよく、または例えばビーズなどそのような反応容器に入っているデバイスの表面でもよい。表面への核酸分子の固定化は、それだけに限らないが、非共有結合または共有結合による連結を含めた、当業者に知られている任意の手段によって行うことができる。好ましくは、表面と核酸分子との共有化学結合を介して連結が確立される。しかし、本発明の核酸分子が表面に間接的に固定化されることも本発明の範囲内であり、そのような間接的固定化はさらなる構成成分または一対の相互作用パートナーの使用を伴う。そのようなさらなる構成成分は、好ましくは、相互作用パートナーとも称される固定化する核酸と特異的に相互作用し、したがって核酸分子と表面の結合を仲介する化合物である。相互作用パートナーは、好ましくは、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から選択される。好ましくは、相互作用パートナーは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用パートナーは核酸、好ましくは機能的核酸である。より好ましくは、そのような機能的核酸は、アプタマー、スピーゲルマーおよび核酸と少なくとも部分的に相補的である核酸を含む群から選択される。さらなる代替の実施形態では、核酸と表面の結合は、多分割相互作用パートナーによって仲介される。そのような多分割相互作用パートナーは、好ましくは、一対の相互作用パートナー、または核酸分子に含まれもしくはそれに結合した第１のメンバーおよび表面に結合しもしくはそれに含まれる第２のメンバーからなる相互作用パートナーである。多分割相互作用パートナーは、好ましくは、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ならびにビオチンおよびニュートラアビジンを含む相互作用パートナーの対の群から選択される。好ましくは、相互作用パートナーの対の第１のメンバーはビオチンである。
そのような方法の好ましい結果は、ＣＧＲＰと本発明の核酸分子との固定化された複合体の形成であり、より好ましくは前記複合体が検出される。複合体からＣＧＲＰ部分が検出されることは、実施形態の範囲内である。
この要求に従っているそれぞれの検出手段は、例えばＣＧＲＰ／ＣＧＲＰの（１つまたは複数の）一部に特異的な任意の検出手段である。特に好ましい検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から選択される検出手段であり、これらの生成は当業者に知られている。
本発明によるＣＧＲＰの検出方法は、一実施形態において、好ましくはステップｃ）を行うのに使用されている反応容器から試料を除去することも含む。
本発明の方法は、さらなる実施形態では、表面、好ましくは上記で定義した表面上にＣＧＲＰの相互作用パートナーを固定化するステップも含み、相互作用パートナーは、本明細書、好ましくはそのそれぞれの方法に関連して上記と同様に定義され、より好ましくはその種々の実施形態において核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む。この実施形態では、特に好ましい検出手段は本発明による核酸分子であり、そのような核酸は好ましくは標識されていてよく、または標識されていなくてもよい。そのような核酸分子が標識されている場合、核酸分子は直接または間接的に検出することができ得る。そのような検出は、第２の検出手段の使用を伴うこともあり、この手段は、好ましくは核酸、ポリペプチドおよびタンパク質を含む群からやはり選択される。そのような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸分子に特異的である。より好ましい実施形態では、第２の検出手段は分子ビーコンである。核酸分子または第２の検出手段またはそれらの両方が、好ましい実施形態において検出標識を含んでもよい。検出標識は、好ましくは、ビオチン、ブロモデオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射標識およびキレーター分子を含む群から選択される。あるいは、第２の検出手段は、好ましくは核酸分子に含有される、核酸分子に含まれる、または核酸分子に結合している検出標識と相互作用する。特に好ましい組合せは以下の通りである：
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がビオチンに対する抗体であり、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がアビジンもしくはアビジン保有分子であり、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン保有分子であり、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がニュートラアビジンもしくはニュートラアビジン保有分子であり、または
検出標識がブロモデオキシウリジンであり、第２の検出手段がブロモデオキシウリジンに対する抗体であり、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、第２の検出手段がジゴキシゲニンに対する抗体であり、または
検出標識がキレーターであり、第２の検出手段が放射性核種であり、前記検出標識は核酸分子に結合していることが好ましい。この種類の組合せが、核酸が表面に結合している実施形態にも適用可能であることが認められるはずである。そのような実施形態では、検出標識が、相互作用パートナーに結合していることが好ましい。
最後に、第３の検出手段を使用して第２の検出手段が検出されることも本発明の範囲内であり、好ましくは、第３の検出手段は、酵素、より好ましくは第２の検出手段の検出において酵素反応を示す酵素であり、または、第３の検出手段は、放射線、より好ましくは、放射性核種により放射される放射線を検出するための手段である。好ましくは、第３の検出手段は、第２の検出手段を特異的に検出し、かつ／またはそれと相互作用している。
また、ＣＧＲＰの相互作用パートナーが表面上に固定化され、本発明による核酸分子が好ましくは相互作用パートナーとＣＧＲＰの間で形成された複合体に付加される実施形態では、反応から、より好ましくはステップｃ）および／またはｄ）が行われる反応容器から試料を除去することができる。
一実施形態では、本発明による核酸分子は蛍光部分を含み、蛍光部分の蛍光は、核酸とＣＧＲＰとにより形成された複合体と、遊離ＣＧＲＰとの間で異なる。
さらなる実施形態では、核酸分子は、本発明による核酸分子の誘導体であり、核酸の誘導体は、アデノシンを置換するアデノシンの少なくとも１つの蛍光誘導体を含む。好ましい実施形態では、アデノシンの蛍光誘導体はエテノアデノシンである。
さらなる実施形態では、本発明による核酸分子の誘導体およびＣＧＲＰからなる複合体は、蛍光を使用して検出される。
その方法の実施形態では、ステップｃ）またはステップｄ）でシグナルが生じ、好ましくは、シグナルは試料中のＣＧＲＰの濃度と相関する。
好ましい態様では、本発明の方法の一部であるアッセイを、構成成分が上記に記載の反応容器中に固定化され、ウェルが反応容器として働く９６ウェルプレート中で実施することができる。
薬物発見の出発物質として、本発明の核酸分子をさらに使用することができる。基本的に、２つの手法が考えられる。１つの手法は化合物ライブラリーのスクリーニングであり、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは低分子量化合物ライブラリーである。一実施形態では、スクリーニングはハイスループットスクリーニングである。好ましくは、ハイスループットスクリーニングは、標的に基づくアッセイにおける化合物の迅速で効率のよい、試行錯誤による評価である。最も良い場合、分析は比色測定に基づいて行われる。それに関連して使用されるライブラリーは当業者に知られている。
化合物ライブラリーのスクリーニングの場合では、当業者に知られている競合アッセイなどを使用することによって、適当なＣＧＲＰ類似体、ＣＧＲＰアゴニストまたはＣＧＲＰアンタゴニストを同定することができる。そのような競合アッセイを以下のように設定することができる。本発明の核酸分子、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるスピーゲルマーを固相と結合させる。ＣＧＲＰ類似体を同定するために、標識ＣＧＲＰをアッセイに加えることができる。潜在的な類似体はスピーゲルマーと結合するＣＧＲＰ分子と競合し、このことは、それぞれの標識によって得られるシグナルの低下と同時に起こる。アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に知られている細胞培養アッセイの使用を伴うことがある。
本発明によるキットは、好ましくはＣＧＲＰの検出のため、核酸分子の少なくとも１つまたはいくつかを含んでよい。さらに、キットは、少なくとも１つまたはいくつかの陽性または陰性対照を含んでよい。陽性対照は、例えばＣＧＲＰ、特に本発明の核酸分子が選択または結合するＣＧＲＰでよく、好ましくは、液体形態で存在する。陰性対照は、例えば、ＣＧＲＰと類似する生物物理学的特性の観点から定義されるが、本発明の核酸分子によって認識されないペプチドでよい。さらに、前記キットは、１つまたはいくつかの緩衝液を含んでよい。種々の成分は、乾燥もしくは凍結乾燥形態でキット中に入っていてもよく、または液体中に溶解していてもよい。キットは、１つまたはいくつかの容器を含んでもよく、その容器は１つまたはいくつかのキットの成分を含有してもよい。さらなる実施形態では、キットは、キットおよびその種々の成分の使用法についての情報を使用者に提供する使用説明または使用説明リーフレットを含む。
本発明による核酸分子の薬学的なおよび生物分析的な測定は、ヒトまたは非ヒトの身体のいくつかの体液、組織および臓器における核酸分子の薬物動態および生物力学プロファイルの評価の基本である。そのような目的で、本明細書で開示されまたは当業者に知られている検出方法のいずれかを使用することができる。本発明のさらなる態様では、本発明による核酸分子を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが提供される。検出アッセイでは、捕捉プローブおよび検出プローブが使用される。捕捉プローブは第１の部分と相補的であり、本発明による核酸分子の第２の部分に対する検出プローブ。捕捉プローブは表面またはマトリックスに固定化される。検出プローブは、好ましくは、本明細書においてすでに記載されているように検出できるマーカー分子または標識を保有する。
本発明による核酸分子の検出は、以下の通りに実施することができる：本発明による核酸分子を、その末端の１つで捕捉プローブと、その他の末端で検出プローブとハイブリダイズさせる。その後、非結合検出プローブを例えば１つまたはいくつかの洗浄ステップにより除去する。続いて、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２００８／０５２７７４でより詳細な概略が述べられているように、好ましくは標識またはマーカー分子を保有する結合検出プローブの量を測定することができる。
好ましくは本明細書において、治療という用語は、好ましい実施形態ではそれに加えてまたはその代わりに予防および／または経過観察を含む。
好ましくは本明細書において、疾患および障害という用語は、そうでないと示さない場合は互換的に使用されるものとする。
本明細書において、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、好ましくは、そのような用語の前にあるまたはそれによって述べられる内容を限定することを意図していない。
種々の配列番号、本発明による核酸分子の化学的性質、および、その実際の配列ならびに内部参照番号が以下の表にまとめられている。
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それからさらなる特徴、実施形態および利点を得ることができる図面、実施例および配列表によって、本発明をさらに説明する。
本発明のＣＧＲＰ結合核酸分子の配列のアラインメントおよび競合的結合アッセイにおけるヒトアルファＣＧＲＰに対する相対活性を示す。 異なる第１のおよび第２の末端ストレッチを有するＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体を示す。 表面プラズモン共鳴測定により決定したＫＤ値およびヒトアルファＣＧＲＰに対する相対結合活性を含む、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体を示す。 固定化されたヒトアルファＣＧＲＰに対するＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１のＢｉａｃｏｒｅ測定による動態評価を示す図であり、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８、３．９、１．９５および０ｎＭのスピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１に関するデータを応答単位として示す。 固定化されたヒトアルファＣＧＲＰに対するＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４のＢｉａｃｏｒｅ測定による動態評価を示す図であり、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８、３．９、１．９５および０ｎＭのスピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４に関するデータを応答単位として示す。 固定化されたヒトアルファＣＧＲＰに対するＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／４４のＢｉａｃｏｒｅ測定による動態評価を示す図であり、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８、３．９、１．９５および０ｎＭのスピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／４４に関するデータを応答単位として示す。 ＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２１２−Ｇ１−００１（黒ひし形）および２２６−Ｆ２−００１（黒丸）による、ヒトアルファＣＧＲＰにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害を示す図であり、ａ）ウェル当たりのｃＡＭＰの生成量を各データセットの最大値に正規化し、スピーゲルマー濃度に対する百分率活性として示し、ｂ）Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアによる非線形回帰（４パラメータフィット）を使用して、ｃＡＭＰ産生が５０％阻害されるスピーゲルマー濃度（ＩＣ５０）を算出し、ｃ）２１２−Ｇ１−００１および２２６−Ｆ２−００１に関して決定したＩＣ５０値はそれぞれ８．７ｎＭおよび３．５ｎＭであった。 ＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧ（黒丸）およびＮＯＸ−Ｌ４１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも称される、黒四角）による、ヒトＣＧＲＰにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害を示す図であり、ａ）ウェル当たりのｃＡＭＰの生成量を各データセットの最大値に正規化し、スピーゲルマー濃度に対する百分率活性として示し、ｂ）Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアによる非線形回帰（４パラメータフィット）を使用して、ｃＡＭＰ産生が５０％阻害されるスピーゲルマー濃度（ＩＣ５０）を算出し、ｃ）２２６−Ｆ２−００１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｌ４１に関して決定したＩＣ５０値はそれぞれ３．８ｎＭおよび０．３９ｎＭであった。 ヒトアルファＣＧＲＰ、ヒトベータＣＧＲＰ、ヒトアミリン、ヒトカルシトニン、ヒトアドレノメデュリンおよびヒトインテルメジンのアミノ酸配列アラインメントを示す。 ヒト、アカゲザル、ラット、マウス、イノシシ、ヒツジおよびイヌ由来のアルファＣＧＲＰのアミノ酸配列アラインメントを示す。 ヒトおよびラットのＣＧＲＰならびにヒトおよびラットのアミリンのアミノ酸配列アラインメントを示し、ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーＮＯＸ−Ｌ４１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも称される）および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１に関して、ＩＣ５０値をヒトＣＧＲＰ受容体によるインビトロアッセイで決定し、解離定数ＫＤを動的Ｂｉａｃｏｒｅ測定に決定した。 ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーＮＯＸ−Ｌ４１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも称される、黒四角）およびアミリン結合対照スピーゲルマー（黒三角）による、ヒトアミリンにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害を示す図であり、ウェル当たりのｃＡＭＰの生成量を各データセットの最大値に正規化し、スピーゲルマー濃度に対する百分率活性として示した。 本発明による核酸分子を構成する２’デオキシリボヌクレオチドを示す。 本発明による核酸分子を構成するリボヌクレオチドを示す。 固定化されたヒトＣＧＲＰに対するＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２０および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８のＢｉａｃｏｒｅ測定による動態評価を示す図であり、５００−２５０−１２５−６２．５−３１．３−１５．６−７．８（２ｘ）−３．９−１．９５−０．９８−０．４８−０ｎＭのスピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２０および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８に関するデータを応答単位として示す。
［実施例１：ＣＧＲＰに特異的に結合することができる核酸分子］
いくつかのＣＧＲＰ結合核酸分子およびそれらの誘導体を同定し、それらのヌクレオチド配列を図１〜図３に示す。ＣＧＲＰ結合核酸分子のヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性およびヒトアルファＣＧＲＰとＣＧＲＰ受容体との相互作用に関するそれらの拮抗作用を、
ａ）比較競合的プルダウンアッセイ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）（実施例３）を使用してアプタマー、即ちＤ−核酸分子として、
ｂ）表面プラズモン共鳴測定（実施例４）により、およびヒトＣＧＲＰ受容体を発現する細胞によるインビトロアッセイ（実施例５）により、スピーゲルマー、即ちＬ−核酸として特徴付けた。
スピーゲルマーおよびアプタマーを実施例２に記載されるように合成した。
このように作製した核酸分子はわずかに異なる配列を示し、配列を配列ファミリーとして集約するまたは分類することができる。
リボヌクレオチド配列モチーフの定義のために、曖昧なヌクレオチドに関してＩＵＰＡＣ略称を以下のように使用する。
Ｓ 強 ＧまたはＣ、
Ｗ 弱 ＡまたはＵ、
Ｒ プリン ＧまたはＡ、
Ｙ ピリミジン ＣまたはＵ、
Ｋ ケト ＧまたはＵ、
Ｍ イミノ ＡまたはＣ、
Ｂ Ａでない ＣまたはＵまたはＧ、
Ｄ Ｃでない ＡまたはＧまたはＵ、
Ｈ Ｇでない ＡまたはＣまたはＵ、
Ｖ Ｕでない ＡまたはＣまたはＧ、
Ｎ 全て ＡまたはＧまたはＣまたはＵ。
２’−デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとを区別するために、以下の略語を使用する。
２’−デオキシリボヌクレオチドに関して：ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡおよびｄＵ（図１１Ａおよび１１Ｂを参照）。
リボヌクレオチドに関して：Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ（図１２を参照）。
反対に示されない場合、任意の核酸配列またはストレッチおよびボックスの配列は、それぞれ５’→３’の方向で示す。
図１〜３に示すように、ＣＧＲＰ結合核酸分子は、潜在的ＣＧＲＰ結合モチーフを定義するヌクレオチドの１つの中心ストレッチを含み、図１（図１Ａおよび１Ｂ）は配列ファミリーの様々な配列を示し、図２〜３は核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体を示す。
一般に、ＣＧＲＰ結合核酸分子は、それらの５’末端および３’末端において、ヌクレオチドの末端ストレッチである、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含む。ヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは互いにハイブリダイズでき、ハイブリダイゼーション後に二本鎖構造が形成される。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは、インビボ および／またはインビトロの分子内に必ずしも与えられるわけではない。
ＣＧＲＰ結合核酸分子のヌクレオチドの３つのストレッチであるヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’→３’の方向で、即ちヌクレオチドの第１の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第２の末端ストレッチで互いに配列されている。しかし、あるいは、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’→３’の方向で、即ちヌクレオチドの第２の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第１の末端ストレッチで互いに配列されている。
定義されたストレッチの配列は、ＣＧＲＰ、好ましくはヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性に影響を与えるＣＧＲＰ結合核酸分子の間で異なっていてもよい。異なるＣＧＲＰ結合核酸分子の結合分析に基づいて、以下に記載するようにヌクレオチドの中心ストレッチおよびそのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくはその全体がＣＧＲＰ、好ましくはヒトアルファＣＧＲＰとの結合に不可欠である。
図１Ａおよび１Ｂに示す本発明によるＣＧＲＰ結合核酸分子は、リボヌクレオチドからなる。ＣＧＲＰ結合核酸分子２１２−Ｇ１−００１は、ヒトアルファＣＧＲＰに関する５．１２ｎＭのＫＤの結合親和性を有する（プラズモン共鳴測定による決定、実施例４を参照）。ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１、２１２−Ｆ１−００１、２２４−Ｂ２−００１、２２４−Ｅ１−００１、２２６−Ａ２−００２、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｇ２−００２、２２６−Ｇ１−００２、２２６−Ｃ２−００２、２２６−Ｅ１−００２、２２６−Ｆ１−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｇ２−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｄ１−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ｂ３−００１、２３１−Ａ２−００１、２３１−Ｅ２−００１および２３１−Ｈ２−００１を、ヒトアルファＣＧＲＰに結合するそれらの能力に関して、ＣＧＲＰ結合核酸２１２−Ｇ１−００１に対する比較競合的プルダウンアッセイで試験した（実施例３、図１Ａおよび１Ｂを参照）。
ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ａ２−００１および２３１−Ｅ２−００１は、２１２−Ｇ１−００１よりも良好な結合親和性を示した。ＣＧＲＰ結合核酸分子２１２−Ｆ１−００１、２２４−Ｂ２−００１、２２４−Ｅ１−００１および２２６−Ｆ１−００１は、２１２−Ｇ１−００１と同様の結合親和性を示した。ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ａ２−００２、２２６−Ｇ２−００２、２２６−Ｃ２−００２、２２６−Ｅ１−００２、２３１−Ｇ２−００１、２３１−Ｄ１−００１、２３１−Ｂ３−００１および２３１−Ｈ２−００１は、２１２−Ｇ１−００１よりも弱い結合親和性を示した（図１Ａおよび１Ｂを参照）。
ＣＧＲＰ結合核酸分子２１２−Ｇ１−００１、２２６−Ｆ２−００１、２１２−Ｆ１−００１、２２４−Ｂ２−００１、２２４−Ｅ１−００１、２２６−Ａ２−００２、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｇ２−００２、２２６−Ｃ２−００２、２２６−Ｅ１−００２、２２６−Ｆ１−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｇ２−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｄ１−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ｂ３−００１、２３１−Ａ２−００１、２３１−Ｅ２−００１および２３１−Ｈ２−００１はリボヌクレオチドからなり、配列
５’ＨＷＲＵＹＧＧＡＫＡＣＵＭＭＢＹＮＹＮＲＶＫＫＲＧＡＤＡＵＡＲＲＵＹＣＣＢＵＣＣ ３’［配列番号９５］
を共有する。
ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１、２１２−Ｆ１−００１、２２４−Ｂ２−００１、２２４−Ｅ１−００１、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｆ１−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ａ２−００１および２３１−Ｅ２−００１は、ヒトアルファＣＧＲＰに対して２１２−Ｇ１−００１と同様のまたは２１２−Ｇ１−００１よりも良好の結合親和性を示し、配列
５’ＣＵＧＵＹＧＧＡＧＡＣＵＭＭＵＢＤＹＨＲＶＫＫＡＧＡＤＡＵＡＧＧＵＹＣＣＣＵＣＣ ３’［配列番号９６］
を共有する。
ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ａ２−００１および２３１−Ｅ２−００１は、ヒトアルファＣＧＲＰに対する最大の結合親和性を示し、配列
５’ＣＵＧＵＣＧＧＡＧＡＣＵＡＣＵＣＲＹＨＧＲＧＵＡＧＡＡＡＵＡＧＧＵＣＣＣＣＵＣＣ ３’［配列番号９７］
を共有し、配列
５’ＣＵＧＵＣＧＧＡＧＡＣＵＡＣＵＣＧＵＣＧＡＧＵＡＧＡＡＡＵＡＧＧＵＣＣＣＣＵＣＣ ３’［配列番号９８］
がその好ましい実施形態である。
本発明者らは、驚くべきことに、ヌクレオチドの中心ストレッチならびにヌクレオチドの第１のおよび第２の末端ストレッチの配列内において２’−デオキシリボヌクレオチドによりリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性が向上することを発見した。特に、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１中において２’−デオキシリボヌクレオチドにより２つ以下のリボヌクレオチドを置き換えることにより、プラズモン共鳴測定により決定したヒトアルファＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（プロトコルに関して実施例４を参照）。より詳細には、本発明者らは、驚くべきことに以下のことを発見した。
ａ）ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヌクレオチドの中心ストレッチ中の３、４、９、１１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２５、２８、２９、３２、３４、３６、３７、３９および４０位において、１つの２’−デオキシリボヌクレオチドにより１つのリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較してヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄを参照；スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３０、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４５、２２６−Ｆ２−００１−ｄＵ−２０および２２６−Ｆ２−００１−ｄＵ−２８）；
ｂ）ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヌクレオチドの第１の末端ストレッチ中の３または５位において、１つの２’−デオキシリボヌクレオチドにより１つのリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較してヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（図３Ａを参照；スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０３および２２６−Ｆ２−０１１−Ｄ０５）；
ｃ）ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヌクレオチドの第２の末端ストレッチ中の任意の位置において、１つの２’−デオキシリボヌクレオチドにより１つのリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較してヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（図３Ａおよび３Ｃを参照；スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ５０）；
ｄ）ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヌクレオチドの中心ストレッチ中の３６および３９位、または３６および１５位、または３６および２３位において、２つの２’−デオキシリボヌクレオチドにより２つのリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較してヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（図３Ａ、３Ｃおよび３Ｄを参照；スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／４４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ−２０および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８）；
ｅ）ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１のヌクレオチドの中心ストレッチ中の３６、３９および１５位、または３６、３９および２３位において、３つの２’−デオキシリボヌクレオチドにより３つのリボヌクレオチドを置き換えることにより、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較してヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の向上がもたらされた（図３Ｄを参照；スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４−ｄＵ２０、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４−ｄＵ２８）。
ＣＧＲＰ結合核酸分子のヌクレオチドの中心ストレッチのいくつかの位置における２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置き換えによって、ヒトアルファＣＧＲＰに対する結合の向上がもたらされることを示すデータに基づいて、試験した全てのＣＧＲＰ結合核酸分子の中心ストレッチを以下の一般式
５’ＨＷｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｙｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ｒｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＲｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号９９］
式中、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｍ、Ｂ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｃはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＲまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＫまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＮまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＮまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＲまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＢまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである
に集約することができる。
一般式
５’ＣＵｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｂｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ａｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１００］
は、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１、およびヒトアルファＣＧＲＰに対して２１２−Ｇ１−００１と同様のまたは２１２−Ｇ１−００１よりも良好の結合親和性を示した、２２６−Ｆ２−００１の誘導体２１２−Ｆ１−００１、２２４−Ｂ２−００１、２２４−Ｅ１−００１、２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｆ１−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ａ２−００および２３１−Ｅ２−００１の中心ストレッチの配列を集約し、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｂ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＶはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＤまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
一般式
５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０１］
は、ＣＧＲＰに関する結合親和性が最大であるＣＧＲＰ結合核酸分子（スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１およびその誘導体、ならびにスピーゲルマー２２６−Ａ３−００１、２２６−Ｃ３−００１、２３１−Ａ１−００１、２３１−Ｃ１−００１、２３１−Ｃ２−００１、２３１−Ｆ１−００１、２３１−Ｅ１−００１、２３１−Ａ２−００１および２３１−Ｅ２−００１）の中心ストレッチの配列を集約し、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、ＨおよびＲはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＲまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＲまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
ＣＧＲＰ結合核酸２２６−Ｆ２−００１、およびヌクレオチドの中心ストレッチのいつかの位置における２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置き換えに起因して、２２６−Ｆ２−００１と比較してＣＧＲＰに対する結合の向上を示す２２６−Ｆ２−００１の誘導体のヌクレオチドの中心ストレッチを以下の一般式：
５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０２］
に集約することができ、
式中、Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａはリボヌクレオチドであり、
ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＧまたはｄＧであり、ｎ８はＵまたはｄＴであり、ｎ９はＣまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＡまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである
好ましい実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは配列
Figure 2015506174
Figure 2015506174
 を含み、より好ましい実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは配列
Figure 2015506174
 を含む。
本発明のＣＧＲＰ結合核酸分子の第１のおよび第２の末端ストレッチは、４つ、５つ、６つ、または７つのヌクレオチドを含み（図１〜３）、ストレッチは任意選択で互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション時に二本鎖構造が形成される。この二本鎖構造は１〜７つの塩基対からなり得る。しかし、このようなハイブリダイゼーションはインビボおよびインビトロで分子内に必ずしも与えられるわけではない。
試験した全てのＣＧＲＰ結合核酸分子のヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチの分析から、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチの一般式は５’Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＳＺ４ＷＺ５ ３’であり、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチの一般式は５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１Ｚ１２ ３’であり、
式中、
Ｚ１はＳまたは不在であり、Ｚ２はＶまたは不在であり、Ｚ３はＢまたは不在であり、Ｚ４はＶまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＹまたはｄＣであり、Ｚ７はＷまたはｄＡであり、Ｚ８はＢまたはｄＣであり、Ｚ９はＳまたはｄＧであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧまたは不在であり、Ｚ１１はＢまたは不在であり、Ｚ１２はＫまたは不在であり、
Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ｂ、ＹおよびＫはリボヌクレオチドであり、
ｄＧ、ｄＣおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドであり、
好ましい実施形態では、
ａ）Ｚ１はＳであり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２はＫであり、
ｂ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２はＫであり、
ｃ）Ｚ１はＳであり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｄ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｅ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１はＢであり、Ｚ１２は不在であり、
ｆ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２はＶであり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｇ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｈ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３は不在であり、Ｚ１０はＳまたはｄＧであり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｉ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３はＢであり、Ｚ１０は不在であり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在であり、
ｊ）Ｚ１は不在であり、Ｚ２は不在であり、Ｚ３は不在であり、Ｚ１０は不在であり、Ｚ１１は不在であり、Ｚ１２は不在である。
リボヌクレオチドからなる第１のおよび第２の末端ストレッチを含むＣＧＲＰ結合核酸分子は、第１のおよび第２の末端ストレッチの以下の組み合わせ：
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＡＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣＵ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｃ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＵＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｄ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＵＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｅ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｆ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｇ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｈ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＣＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｉ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＣＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｊ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｋ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＵＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｌ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＧＣＡＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＵＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含む
を含む。
リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドからなる第１のおよび第２の末端ストレッチを含むＣＧＲＰ結合核酸分子は、第１のおよび第２の末端ストレッチの以下の組み合わせを含み、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＺ４ＵＺ５ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵはリボヌクレオチドであり、
Ｚ４はＧまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＣまたはｄＣであり、Ｚ７はＡまたはｄＡであり、Ｚ８はＣまたはｄＣであり、Ｚ９はＧまたはｄＧであり、Ｚ１０はＧまたはｄＧであり、
ｄＣ、ｄＧおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドであり、
好ましい実施形態では、
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣｄＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｃ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｄ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ｄＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｅ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣｄＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｆ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡｄＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｇ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣｄＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
ｈ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは５’ＣＡＣＧｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含む。
ＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２１２−Ｇ１−００１、２２６−Ｆ２−００１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８のヒトアルファＣＧＲＰに対する、ＫＤとして表される結合親和性をプラズモン共鳴測定により決定した（実施例４、図４、５、６および１３）：
２１２−Ｇ１−００１：５．１２ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１：２．６２ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１：０．５５ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４：０．５２ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４：０．２ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８：０．０７ｎＭのＫＤ
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−ｄＵ２８：０．２１ｎＭのＫＤ
ＣＧＲＰ結合分子２１２−Ｇ１−００１および２２６−Ｆ２−００１は、ヌクレオチドの同一の中心ストレッチを共有する（図１Ａを参照）。親和性決定（上記参照）により示されるように、４ヌクレオチド（２１２−Ｇ１−００１を参照）の代わりに５ヌクレオチド（２２６−Ｆ２−００１を参照）を有する第１のおよび第２の末端ストレッチにより、ヒトＣＣＲＰに対する結合親和性の著しい改善がもたらされた。
さらに、上記および図４、５および６に示すように、ＣＧＲＰ結合分子２２６−Ｆ２−００１中における（１つまたは複数の）２’−デオキシリボヌクレオチドによる１つ（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４を参照）または２つ（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４を参照）のリボヌクレオチドの置き換えにより、ヒトアルファＣＣＲＰに対する結合親和性の著しい改善がもたらされた。
一般に、スピーゲルマーは、それをインビボで使用するためにＰＥＧ部分で修飾される。５’末端にアミノ基を含むスピーゲルマーとして、ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１を合成した。前記アミノ修飾スピーゲルマーに４０ｋＤａのＰＥＧ部分を連結して、ＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧおよび２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−４０ｋＤａ−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｌ４１とも称される）を得た。スピーゲルマーの合成およびＰＥＧ化は実施例２に記載されている。ＣＧＲＰ結合核酸分子２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１のＰＥＧ修飾は、スピーゲルマーの結合および機能に影響を及ぼさなかった（以下を参照）。
ＣＧＰＲ結合分子２１２−Ｇ１−００１、２２６−Ｆ２−００１、２２６−Ｆ２−００１−５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧおよび２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｌ４１とも称される）は、以下のＩＣ５０により、インビトロでヒトＣＧＲＰの受容体に対するヒトＣＧＲＰの機能と拮抗することができる（実施例５、図７Ａおよび７Ｂ）：
２１２−Ｇ１−００１：８．７ｎＭのＩＣ５０
２２６−Ｆ２−００１：３．５ｎＭのＩＣ５０
２２６−Ｆ２−００１−５’４０ｋＤａＰＥＧ：３．８ｎＭのＩＣ５０
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧ：０．３９ｎＭのＩＣ５０
親和性決定（上記参照）と一致して、４ヌクレオチド（２１２−Ｇ１−００１を参照）の代わりに５ヌクレオチド（２２６−Ｆ２−００１を参照）を有する第１のおよび第２の末端ストレッチにより、ヒトアルファＣＣＲＰの機能の著しく強力な阻害がもたらされた（図７Ａ）。
さらに、上記および図７Ｂに示すように、２’−デオキシリボヌクレオチドによる１つのリボヌクレオチドの置き換え（２２６−Ｆ２−００１−５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｌ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも称される）により、ヒトアルファＣＣＲＰの機能の著しく強力な阻害がもたらされた（図７Ｂを参照）。
［実施例２：アプタマーおよびスピーゲルマーの合成および誘導体化］
＜小規模合成＞
標準的な環外アミン保護基を有する２’ＴＢＤＭＳ−ＲＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）を使用して、ＡＢＩ−３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた固相合成によって、アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ修飾Ｄ−ＲＮＡ核酸）およびスピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ核酸またはＬ−ＤＮＡ修飾Ｌ−ＲＮＡ核酸）を生成した。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分に関しては、Ｄ−立体配置およびＬ−立体配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−ホスホラミダイト、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイトおよびｒＵ−ホスホラミダイトを使用したが、ＤＮＡ部分に関しては、Ｄ−立体配置およびＬ−立体配置のｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、ｄＴおよびｄＵを適用した。全てのホスホラミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。合成および脱保護後に、アプタマーおよびスピーゲルマーをゲル電気泳動によって精製した。
＜大規模合成および修飾＞
標準環外アミン保護基を有する２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）を使用して、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を用いた固相合成によって、スピーゲルマーを生成した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＵ−ホスホラミダイト、Ｌ−ｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｄＧ（Ｎ−ｉＢｕ）−ホスホラミダイトおよびＬ−ｄＴ−ホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。５’−アミノ−修飾剤は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。非修飾スピーゲルマーまたは５’−アミノ−修飾スピーゲルマーの合成を、Ｌ−リボＡ、Ｌ−リボＣ、Ｌ−リボＧ、Ｌ−リボＵ、Ｌ−２’デオキシＡ、Ｌ−２’デオキシＣ、Ｌ−２’デオキシＧまたはＬ−２’デオキシＴ修飾ＣＰＧ孔径１０００Å（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）で開始した。ＲＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイトのカップリング（１サイクル当たり１５分）について、アセトニトリル中の０．３Ｍのベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）、およびアセトニトリル中のそれぞれの０．２Ｍのホスホラミダイト溶液２当量を使用した。酸素−キャッピングサイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準的な溶媒および試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）から購入した。スピーゲルマーをＤＭＴ−ＯＮ合成し、脱保護後、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５）によって精製した。５’ＤＭＴ−基を、８０％酢酸（室温で３０分）で除去した。５’アミノ修飾スピーゲルマーの場合、５’ＭＭＴ−基を８０％酢酸（室温で９０分）で除去した。続いて、水性２ＭのＮａＯＡｃ溶液を加え、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用した接線流濾過によってスピーゲルマーを脱塩した。
＜スピーゲルマーのＰＥＧ化＞
インビボでのスピーゲルマーの血漿残留時間を延長するために、４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分をスピーゲルマーの５’末端で共有結合した。
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化のための方法の技術的詳細については、欧州特許出願第１３０６３８２号を参照）のために、精製５’−アミノ修飾スピーゲルマーを、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）、および緩衝液Ａ（５ｍｌ、クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］、および１ＭのＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、１ｌの最終容量まで水を加えることにより調製した。ｐＨ＝８．４は１ＭのＨＣｌで調整した）の混合物に溶解させた。
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨで８．４にした。次いで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、３７℃で３０分ごとに０．２５当量を６回に分けて、７５〜８５％の最大収率に達するまで加えた。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを加える間、１ＭのＮａＯＨで８〜８．５に保った。
反応混合物を４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）、および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中に０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート）と混ぜ、９５℃まで１５分間加熱した。次いでＰＥＧ化スピーゲルマーを、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ、緩衝液Ｃ：アセトニトリル中に０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート）を使用して、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。過剰なＰＥＧは５％緩衝液Ｃで、ＰＥＧ化スピーゲルマーは１０〜１５％の緩衝液Ｃで溶出した。９５％超の純度（ＨＰＬＣにより評価した場合）を有する生成物画分を合わせ、３ＭのＮａＯＡＣ４０ｍｌと混合した。接線流濾過（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）によってＰＥＧ化スピーゲルマーを脱塩した。
［実施例３：競合的プルダウン結合アッセイによるＤ−アルファＣＧＲＰ結合アプタマーの順位付け］
異なる試験アプタマーのセットの比較順位付けのために、プルダウン結合アッセイを使用した。この目的のために、標識していないアプタマーは、ビオチン化Ｄ−ＣＧＲＰへの結合に関して、標識した基準アプタマーと競合し、そのため試験アプタマーのＤ−ＣＧＲＰに対する親和性に従って結合シグナルを減少させた。基準アプタマーを、［γ−３２Ｐ］−標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（インビトロｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって５’−末端で４０００００〜８０００００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比放射能に放射性標識した。２〜４時間にわたって、３６０μｌの選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％［ｗ／ｖｏｌ］のＴｗｅｅｎ−２０、１０μｇ／ｍｌのＨＳＡ、１０μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ）中で、１０〜２０ｎＭである一定量のビオチン化Ｄ−ＣＧＲＰと一緒に１５０ｐＭの放射性標識した基準アプタマーを用いて、３７℃で結合反応を実施した。これらの条件により、ニュートラアビジンアガロースまたはストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（共にＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）における固定化および洗浄後に、ビオチン化Ｄ−ＣＧＲＰに対する基準アプタマーの約５〜１０％の結合がもたらされた。競合させるために、標識していない試験アプタマーを、一定量の標識した基準アプタマーと一緒に、５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭで結合反応に添加した。結合の競合、固定化、適切な洗浄、およびシンチレーションカウンターによる、固定化された放射能の定量後に、試験中に最大の活性が見られたアプタマーを次いで、さらなるアプタマー多様体の比較分析のための新しい基準として機能させた。結果を図１Ａ〜Ｂに示す。
［実施例４：ＣＧＲＰおよび関連ペプチドに結合するスピーゲルマーのＢｉａｃｏｒｅ測定］
＜Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの設定＞
ヒトＣＧＲＰおよび関連ペプチドを、０．４ＭのＥＤＣ（Ｈ２Ｏ中の１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）と０．１ＭのＮＨＳ（Ｈ２Ｏ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド；ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）との１：１混合物を使用して、カルボキシメチル化（略語：ＣＭ）デキストラン被覆センサーチップ上に、アミンカップリング手順により固定化した。同じセンサーチップ上の基準フローセルをビオチンで遮断した。
＜一般的な動態評価＞
ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーを、１００μＭの保存濃度（２６０ｎｍでの吸収の測定による定量化）まで水で希釈し、水浴またはサーモミキサー中で３０秒間９５℃まで加熱し、氷上で即座に冷却して、均一に溶解した溶液を確保した。
ランニング緩衝液で希釈した１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８、３．９、１．９５および０ｎＭの濃度での、または５００−２５０−１２５−６２．５−３１．３−１５．６−７．８（２ｘ）−３．９−１．９５−０．９８−０．４８−０ｎＭの濃度での一連のスピーゲルマー注入によって、動態パラメータおよび解離定数を評価した。全ての実験において、３０μｌ／分の流量で２４０〜３６０秒の結合時間および２４０〜３６０秒の解離時間を定量するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを使用して、３７℃で分析を実施した。このアッセイは２重を基準とし、一方でＦＣ１は（遮断された）表面対照（各スピーゲルマー濃度のバルク寄与）として機能し、検体を有さない連続した緩衝液注入により緩衝液自体のバルク寄与を決定した。データ分析および解離定数ＫＤの算出を、改良したＬａｎｇｍｕｉｒ１：１化学量論的適合アルゴリズムを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行った。
データ分析および解離定数ＫＤの算出を、定数ＲＩと１×１０７［ＲＵ／Ｍ＊秒］の質量輸送係数ｋｔによる質量輸送評価とにより、改良したＬａｎｇｍｕｉｒ１：１化学量論的適合アルゴリズムを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行なった。結果を図３Ａ〜Ｄ、４〜６、９および１３に示す。
［実施例５：ヒト神経芽細胞腫細胞における、アルファＣＧＲＰにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害］
ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーの生物学的効力を以下のように分析した。
ＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞（ＡＣＣ２０３、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を平底の９６−ウェルプレートに５×１０４個の細胞／ウェルで播種し、１０％熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ）、５０単位／ｍｌのペニリシンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した１００μｌのＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌのグルコース、インビトロｇｅｎ）中において３７℃および５％ＣＯ２にて４８時間培養した。
刺激溶液（１ｎＭのヒトまたはラットのＬ−アルファＣＧＲＰ（Ｂａｃｈｅｍ）＋漸増濃度のスピーゲルマー）を、Ｖ底の０．２ｍｌロープロファイル９６−ウェルプレートを使用して、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で三重反復試験として調製し、全体で６０分にわたり３７℃でインキュベートした。ブランク値（Ｌ−アルファＣＧＲＰなし、スピーゲルマーなし）および対照値（１ｎＭのＬ−アルファＣＧＲＰ、スピーゲルマーなし）を三重反復試験として含めた。刺激の２０分前に、１ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ；ＨＢＳＳ／ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳで希釈したＤＭＳＯ中での５０ｍＭストック）を細胞および刺激溶液に添加した。
刺激するために細胞培養培地を細胞から除去し、１００μｌの予めインキュベートした刺激溶液で置換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分刺激した。刺激溶液の除去後、５０μｌ／ウェルのアッセイ／溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ Ｓｙｓｔｅｍキット）を３７℃で３０分添加することにより、細胞を溶解した。
その後、ウェル当たりのｃＡＭＰの産生量を、製造業者の指示書に従って、Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。簡単に言うと、６ｎｍｏｌ〜０．６ｐｍｏｌのｃＡＭＰ／ウェルの範囲のアッセイ／溶解緩衝液で標準曲線を作成する。アッセイ／溶解緩衝液で希釈した細胞溶解物および標準曲線を、ヤギ抗ウサギＩｇＧで予め被覆したマイクロプレートに添加する。ｃＡＭＰアルカリ性ホスファターゼ共役体および抗ｃＡＭＰ抗体を試料に添加し、室温で６０分インキュベートする。その後、プレートを洗浄し、化学発光基質を添加する。３０分後、化学発光をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡプレート読取り機ユニット（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定する。ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡシステムは、競合的イムノアッセイフォーマットである。したがって、光信号強度は、試料または標準調製物中におけるｃＡＭＰレベルと反比例する。このアッセイシステムを使用して、本明細書中に記載されている実施例１および７の範囲内のスピーゲルマーを試験した。結果を図７および８に示す。産生されたｃＡＭＰの量を対照の百分率として示す。対照と比較してｃＡＭＰ産生の５０％阻害に必要なスピーゲルマーの濃度が阻害定数ＩＣ５０を規定する。結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。
［実施例６：アミリンにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害］
ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーのヒトまたはラットのアミリンに対する交差反応性を以下のように分析した。
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（ＡＣＣ１１５、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を平底の９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に５×１０４個の細胞／ウェルで播種し、１０％熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ）、５０単位／ｍｌのペニリシンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した１００μｌのＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌのグルコース、インビトロｇｅｎ）中において３７℃および５％ＣＯ２にて２４時間培養した。
刺激溶液（３ｎＭのヒトまたはラットのＬ−アミリン（Ｂａｃｈｅｍ）＋漸増濃度のスピーゲルマー）を、Ｖ底の０．２ｍｌロープロファイル９６−ウェルプレートを使用して、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で三重反復試験として調製し、全体で６０分にわたり３７℃でインキュベートした。ブランク値（Ｌ−アミリンなし、スピーゲルマーなし）および対照値（１ｎＭのＬ−アミリン、スピーゲルマーなし）を三重反復試験として含めた。刺激の２０分前に、１ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ；ＨＢＳＳ／ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳで希釈したＤＭＳＯ中での５０ｍＭストック）を細胞および刺激溶液に添加した。
刺激するために細胞培養培地を細胞から除去し、１００μｌの予めインキュベートした刺激溶液で置換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分刺激した。刺激溶液の除去後、５０μｌ／ウェルの溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ Ｓｙｓｔｅｍキット）を３７℃で３０分添加することにより、細胞を溶解した。
その後、上記で簡単に記載されているように、ウェル当たりのｃＡＭＰの産生量を、製造業者の指示書に従ってＴｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。
このアッセイシステムを使用して、本明細書中に記載されている実施例７の範囲内のスピーゲルマーを試験した。結果を図１０に示す。産生されたｃＡＭＰの量を対照の百分率として示す。対照と比較してｃＡＭＰ産生の５０％阻害に必要なスピーゲルマーの濃度が阻害定数ＩＣ５０を規定する。
［実施例７：ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーＮＯＸ−Ｌ４１のＣＧＲＰとアミリンとの識別］
図９は、４つのＣ−末端アミド化ペプチドであるヒトアルファＣＧＲＰ、ラットアルファＣＧＲＰ、ヒトアミリンおよびラットアミリンのアラインメントを示す。４つ全てのペプチドは、保存されているＣｙｓ２−Ｃｙｓ７ジスルフィド架橋を有する。
スピーゲルマーＮＯＸ−Ｌ４１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも称される）およびそのペグ化されていない形態２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１は、それらの密接に関連したペプチドを識別し、ヒトまたはラットのアルファＣＧＲＰに選択的に結合する。ＮＯＸ−Ｌ４１は０．３９ｎＭのＩＣ５０で、ヒトアルファＣＧＲＰにより誘導されるｃＡＭＰ産生を阻害する（図９）。対照的に、ヒトアミリンによる細胞活性化は、１μＭ以下の濃度でＮＯＸ−Ｌ４１によって阻害されない（図１０）。アミリン結合スピーゲルマー（配列：５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ− ＧＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＧＣＧＧＵＣＣＵ ＡＵＵＡＣＧＣＣＧＡＵＡＧＧＧＵＧＡＧＧＧＧＡ、［配列番号１３５］）は、ヒトアミリンにより誘導されるｃＡＭＰ産生を阻害する（図１０）。一致するように、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１がヒトアミリンに結合しないことを、動的Ｂｉａｃｏｒｅ測定により検出した（図９）。２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１のヒトＣＧＲＰに対する親和性（ＫＤ）は０．５５ｎＭであった（図９）。したがって、ＮＯＸ−Ｌ４１は、１０００を超える係数でヒトアルファＣＧＲＰとヒトアミリンとを識別する。ラットアルファＣＧＲＰとヒトアミリンとの識別は、７５を超える識別係数に対応するそれぞれ３．６ｎＭおよび２８３ｎＭのＩＣ５０ではあまりはっきりしない（図９）。
阻害濃度および親和性の関係から、アミノ酸残基がスピーゲルマー結合に関与し得ることを大まかに推定することができる。
ラットアミリンは測定可能なＩＣ５０を有するＮＯＸ−Ｌ４１により阻害されるが、ヒトアミリンの阻害を検出できなかった（図９および１０）。ラットアミリンとヒトアミリンとで異なるのはアミノ酸残基のみ、すなわちアミノ酸残基１８および２９である。ヒトアミリンからの各変化はＲ１８ＨおよびＰ２９Ｓである。したがって、Ｒ１８もしくはＰ２９のいずれかまたは両方が、最小の結合エピトープの部分である。Ｐ２９の場合には、ペプチドの主鎖においてプロリンにより誘導される湾曲が隣接する保存残基の適切な認識に必要であるかもしれない。文献から、核酸アプタマーは好ましくはアルギニンを標的とすることが知られている。さらに、アプタマーによって結合する標的分子のエピトープは通常、全体の親和性に寄与する多数の弱い接触を有する複数のアミノ酸を含む。したがって、この場合にはまた、Ｒ１８は、ＣＧＲＰと比較してラットアミリンへの弱い結合を説明する結合事象に寄与する隣接残基によるスピーゲルマー結合において中心的役割を果たす。
［参考文献］
その開示が参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に列挙した文献の完全な書誌データは、そうでないことを示さない場合は以下の通りである。
Figure 2015506174
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Figure 2015506174
Figure 2015506174
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明細書、特許請求の範囲および／または図面において開示されている本発明の特徴は、その様々な形態において、別個で、および任意の組み合わせの両方で、本発明を実現化するための材料とすることができる。

Claims (54)

  1. ＣＧＲＰに結合する能力を有する核酸分子であって、前記核酸分子がヌクレオチドの中心ストレッチを含み、前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    ５’ＨＷｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｙｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ｒｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＲｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号９９］
    のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｍ、Ｂ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｃはリボヌクレオチドであり、
    ｎ１はＲまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＫまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＮまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＮまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＲまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＢまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
    ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである、核酸分子。
  2. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    ５’ＣＵｎ１ｎ２ＹＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＭｎ５ｎ６Ｂｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｋｎ１２Ａｎ１３ＡＤｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１００］
    のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｂ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＲおよびＶはリボヌクレオチドであり、
    ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＭまたはｄＣであり、ｎ６はＢまたはｄＵであり、ｎ７はＤまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＲまたはｄＧであり、ｎ１１はＶまたはｄＡであり、ｎ１２はＫまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＹまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
    ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    ５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０１］
    のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｇ、Ａ、ＨおよびＲはリボヌクレオチドであり、
    ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＲまたはｄＧであり、ｎ８はＹまたはｄＴであり、ｎ９はＨまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＲまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
    ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    ５’ＣＵｎ１ｎ２ＣＧＧＡｎ３Ａｎ４ＵＡｎ５ｎ６Ｃｎ７ｎ８ｎ９ｎ１０ｎ１１Ｇｎ１２Ａｎ１３ＡＡｎ１４ｎ１５ＡＧｎ１６Ｕｎ１７Ｃｎ１８ｎ１９Ｕｎ２０ｎ２１ ３’［配列番号１０２］
    のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａはリボヌクレオチドであり、
    ｎ１はＧまたはｄＧであり、ｎ２はＵまたはｄＴであり、ｎ３はＧまたはｄＧであり、ｎ４はＣまたはｄＣであり、ｎ５はＣまたはｄＣであり、ｎ６はＵまたはｄＵであり、ｎ７はＧまたはｄＧであり、ｎ８はＵまたはｄＴであり、ｎ９はＣまたはｄＣであり、ｎ１０はＧまたはｄＧであり、ｎ１１はＡまたはｄＡであり、ｎ１２はＵまたはｄＴまたはｄＵであり、ｎ１３はＧまたはｄＧであり、ｎ１４はＡまたはｄＡであり、ｎ１５はＵまたはｄＴであり、ｎ１６はＧまたはｄＧであり、ｎ１７はＣまたはｄＣであり、ｎ１８はＣまたはｄＣであり、ｎ１９はＣまたはｄＣであり、ｎ２０はＣまたはｄＣであり、ｎ２１はＣまたはｄＣであり、
    ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
  5. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    Figure 2015506174
    Figure 2015506174
     の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａはリボヌクレオチドであり、
    ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡおよびｄＵは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  6. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが
    Figure 2015506174
     のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
  7. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチがリボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  8. 前記ヌクレオチドの中心ストレッチが２’−リボヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  9. 前記核酸分子が、５’→３’の方向でヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、前記ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含み、
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが４〜７ヌクレオチドを含み、
    前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが４〜７ヌクレオチドを含み、
    好ましくは、
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５〜７ヌクレオチドを含み、
    前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５〜７ヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
  10. 前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５ヌクレオチドを含み、
    前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５ヌクレオチドを含む、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＳＺ４ＷＺ５ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１Ｚ１２ ３’のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｓ、Ｗ、Ｖ、ＢおよびＫはリボヌクレオチドであり、
    Ｚ１はＳまたは不在であり、Ｚ２はＶまたは不在であり、Ｚ３はＢまたは不在であり、Ｚ４はＶまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＹまたはｄＣであり、Ｚ７はＷまたはｄＡであり、Ｚ８はＢまたはｄＣであり、Ｚ９はＳまたはｄＧであり、Ｚ１０はＳまたはｄＧまたは不在であり、Ｚ１１はＢまたは不在であり、Ｚ１２はＫまたは不在であり、
    ｄＧ、ｄＣおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項９または１０に記載の核酸分子。
  12. ａ）Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＶであり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１がＢであり、Ｚ１２がＫであり、
    ｂ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２がＶであり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１がＢであり、Ｚ１２がＫであり、
    ｃ）Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＶであり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１がＢであり、Ｚ１２が不在であり、
    ｄ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２がＶであり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１がＢであり、Ｚ１２が不在であり、
    ｅ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２が不在であり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１がＢであり、Ｚ１２が不在であり、
    ｆ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２がＶであり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１が不在であり、Ｚ１２が不在であり、
    ｇ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２が不在であり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１が不在であり、Ｚ１２が不在であり、
    ｈ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２が不在であり、Ｚ３が不在であり、Ｚ１０がＳまたはｄＧであり、Ｚ１１が不在であり、Ｚ１２が不在であり、
    ｉ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２が不在であり、Ｚ３がＢであり、Ｚ１０が不在であり、Ｚ１１が不在であり、Ｚ１２が不在であり、または
    ｊ）Ｚ１が不在であり、Ｚ２が不在であり、Ｚ３が不在であり、Ｚ１０が不在であり、Ｚ１１が不在であり、Ｚ１２が不在である、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＡＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧＣＵ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＵＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＣＣＡＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＵＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含む、請求項９、１１および１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  14. 前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＺ４ＵＺ５ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０ ３’のヌクレオチド配列を含み、
    式中、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵはリボヌクレオチドであり、
    Ｚ４はＧまたはｄＧであり、Ｚ５はＧまたはｄＧであり、Ｚ６はＣまたはｄＣであり、Ｚ７はＡまたはｄＡであり、Ｚ８はＣまたはｄＣであり、Ｚ９はＧまたはｄＧであり、Ｚ１０はＧまたはｄＧであり、
    ｄＣ、ｄＧおよびｄＡは２’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  15. ａ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｂ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣｄＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｃ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｄ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ｄＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｅ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣｄＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｆ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡｄＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｇ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣｄＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｈ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧｄＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、
    好ましくは、前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＧ ３’のヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１２および１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  16. ａ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｂ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＧＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＣＣ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    ｃ）前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＣＣＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＧＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１２および１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
  17. 前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＣＧＵＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＵＡＣＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、または
    前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’ＧＣＡＧ ３’のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＵＧＣ ３’のヌクレオチド配列を含む、請求項９、１１および１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  18. 前記核酸分子が、配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも８５％の同一性を有する核酸分子、または配列番号２、配列番号７、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と相同であり、相同性は少なくとも８５％である核酸分子を含む、請求項１〜４および８〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
  19. 前記核酸分子が、配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも８５％の同一性を有する核酸分子、または配列番号３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５４、配列番号１２４および配列番号０７８の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子と相同であり、相同性は少なくとも８５％である核酸分子を含む、請求項１〜７および９〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
  20. 前記核酸分子の前記ヌクレオチドまたは前記核酸分子を形成する前記ヌクレオチドがＬ−ヌクレオチドである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
  21. 前記核酸分子がＬ−核酸分子である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
  22. 前記核酸分子が、ＣＧＲＰに結合することができる少なくとも１つの結合部分を含み、そのような結合部分がＬ−ヌクレオチドからなる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  23. 前記核酸が、ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  24. 前記核酸分子が修飾基を含み、前記修飾基を含む前記核酸分子の生物からの排出速度が、前記修飾基を含まない核酸と比較して低下する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
  25. 前記核酸分子が修飾基を含み、前記修飾基を含む前記核酸分子の生物における保持時間が、前記修飾基を含まない核酸分子と比較して増大する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
  26. 前記修飾基が、生分解性および非生分解性修飾を含む群から選択され、好ましくは前記修飾基が、ポリエチレングリコール、直鎖ポリエチレングリコール、分岐ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミデートおよびポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンを含む群から選択される、請求項２４または２５に記載の核酸分子。
  27. 前記修飾基がポリエチレングリコールであり、好ましくは直鎖ポリエチレングリコールまたは分岐ポリエチレングリコールからなり、前記ポリエチレングリコールの分子量が好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである、請求項２６に記載の核酸分子。
  28. 前記修飾基がヒドロキシエチルデンプンであり、好ましくは前記ヒドロキシエチルデンプンの分子量が約５０〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである、請求項２６に記載の核酸分子。
  29. 前記修飾基がリンカーを介して前記核酸分子と結合し、好ましくは前記リンカーが生分解性リンカーである、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子。
  30. 前記修飾基が前記核酸分子の５’末端ヌクレオチドおよび／もしくは３’末端ヌクレオチド、ならびに／または前記核酸分子の５’末端ヌクレオチドと前記核酸分子の３’末端ヌクレオチドとの間にある前記核酸分子のヌクレオチドと結合している、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子。
  31. 生物が動物またはヒトの身体、好ましくはヒトの身体である、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
  32. 疾患の治療および／または予防方法で使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  33. 前記疾患が、片頭痛、異なる形態の頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性、骨関節症、血管形成、自己免疫疾患、腫瘍成長および炎症性疾患を含む群から選択され、好ましくは前記急性疼痛および慢性疼痛が炎症および／または神経障害に由来する、請求項３２に記載の核酸分子。
  34. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子、および任意選択でさらなる構成要素を含む医薬組成物であって、さらなる構成要素が、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される担体および薬学的活性作用物質を含む群から選択される医薬組成物。
  35. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子および薬学的に許容される担体を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 薬剤を製造するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
  37. 薬剤が、ヒト医学で使用するためまたは獣医学で使用するための薬剤である、請求項３６に記載の使用。
  38. 診断手段を製造するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
  39. 前記薬剤が、片頭痛、異なる形態の頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、モルヒネをベースとする鎮痛に対する耐性、骨関節症、血管形成、自己免疫疾患、腫瘍成長および炎症性疾患の治療用および／または予防用であり、好ましくは前記急性疼痛および慢性疼痛が炎症および／または神経障害に由来する、請求項３６に記載の使用。
  40. 好ましくは結晶複合体である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子およびＣＧＲＰを含む複合体。
  41. ＣＧＲＰを検出するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
  42. ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
    ＣＧＲＰにより媒介される活性の候補アンタゴニストを提供するステップと、
    請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子を提供するステップと、
    ＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストの存在下でシグナルをもたらす試験系を提供するステップと、
    ＣＧＲＰにより媒介される活性の候補アンタゴニストがＣＧＲＰにより媒介される活性のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと
    を含む方法。
  43. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子と、少なくとも使用説明リーフレットまたは反応容器とを含む、ＣＧＲＰを検出するためのキット。
  44. 試料中の請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸を検出する方法であって、
    ａ）捕捉プローブおよび検出プローブを準備するステップと、ここで、前記捕捉プローブが請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記検出プローブが請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的であり、あるいは、前記捕捉プローブが請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的であり、かつ前記検出プローブが請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子の前記第１の部分と少なくとも部分的に相補的であり、
    ｂ）前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを別々にまたは組み合わせて、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子を含有する試料または請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子を含有すると推定される試料に添加するステップと、
    ｃ）前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子またはその部分と同時にまたは任意の順番で順次に反応させるステップと、
    ｄ）任意選択で、前記捕捉プローブが、ステップａ）で準備された請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズするか否かを検出するステップと、
    ｅ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子ならびに捕捉プローブおよび検出プローブからなる、ステップｃ）で形成された複合体を検出するステップと
    を含む方法。
  45. 検出プローブが検出手段を含み、かつ／または捕捉プローブを支持体、好ましくは固体支持体に固定化する、請求項４４に記載の方法。
  46. ステップｃ）で形成された複合体の一部でないいかなる検出プローブも反応から除去され、その結果ステップｅ）で複合体の一部である検出プローブだけが検出される、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. ステップｅ）が、捕捉プローブおよび検出プローブが請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子またはその部分の存在下でハイブリダイズするとき、検出手段によって生じたシグナルと、前記核酸分子またはその部分の不在下でハイブリダイズするとき、検出手段によって生じたシグナルとを比較するステップを含む、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＣＧＲＰが、ヒトＣＧＲＰ、マウスＣＧＲＰ、ラットＣＧＲＰまたはアカゲザル由来のＣＧＲＰであり、好ましくはＣＧＲＰがヒトＣＧＲＰである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  49. 前記ＣＧＲＰがα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰであり、好ましくはヒトα−ＣＧＲＰ、ヒトα−ＣＧＲＰまたはラットα−ＣＧＲＰである、請求項１〜３２および４８のいずれか１項に記載の核酸分子。
  50. 前記核酸分子が、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有する、請求項１〜３２、４８および４９のいずれか１項に記載の核酸分子。
  51. 前記核酸分子が、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有する、請求項１〜３２および４８〜５０のいずれか１項に記載の核酸分子。
  52. 前記核酸分子が、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する、請求項１〜３２および４８〜５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  53. 前記核酸分子が、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する、請求項１〜３２および４８〜５２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  54. 前記核酸分子が、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＫＤとして表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、前記核酸分子が、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＫＤとして表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有し、
    および／または
    前記核酸分子が、１０ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、より好ましくは１００ｐＭ以下の、ＩＣ５０として表されるヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性を有し、前記核酸分子が、１００ｎＭ以上の、好ましくは５００ｎＭ以上の、より好ましくは１０００ｎＭ以上の、ＩＣ５０として表されるヒトアミリンに対する結合親和性を有する、請求項１〜３２および４８〜５３のいずれか１項に記載の核酸分子。
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