JP5308813B2 - グレリン結合核酸 - Google Patents
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Description
M.Kojima,H.Hosoda,Y.Date,M.Nakazato,H.Matsu,K.Kangawa,"Ghrelin is a growth−hormone−releasing acylated peptide from stomach",Nature 402:656−60,1999 M.Tsch p,D.L.Smiley,M.L.Heiman,"Ghrelin induces adiposity in rodents",Nature 407:908−13、2000 A.M.Wren et al.,"Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans",Jounal of Clinical Endocrinology Metabolism 86:5992−6,2001 M.Nakazato et al.,"A role for ghrelin in the central regulation of feeding",Nature 409:194−8,2001 N.Nagaya et al.,Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2001 May;280(5):R1483−7;Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers Volante M,et al.,J Clin Endocrinol Metab.2002 Mar;87(3):1300−8.Expression of ghrelin and of the GH secretagogue receptor by pancreatic islet cells and related endocrine tumors Jeffery PL,et al.,J Endocrinol.2002 Mar;172(3):R7−11 Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines Egido EM,et al.,Eur J Endocrinol.2002 Feb;146(2):241−4 Inhibitory effect of ghrelin on insulin and pancreatic somatostatin secretion Broglio F,et al.,J Clin Endocrinol Metab.2001 Oct;86(10)5083−6,Ghrelin, a natural GH secretagogue produced by the stomach,induces hyperglycemia and reduces insulin secretion in humans Bednarek MA,et al.,J Med Chem.2000 Oct;43:4370−6 Structure−function studies on the new growth hormone−releasing peptide,ghrelin:minimal sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a.
こうして、核酸は、
第一のストレッチBoxAおよび
第二のストレッチBoxB
を含み、
ここで、
第一のストレッチBoxAは約25個の連続ヌクレオチドを含み、
第二のストレッチBoxBは約6〜8個の連続ヌクレオチドを含み、
ここで、
第一のストレッチBoxAのヌクレオチドの3’末端ストレッチは、第二のストレッチBoxBとハイブリダイズし、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そしてそのような第一の二本鎖構造はバルジを含む。
ここで、第三のストレッチBoxC1は少なくとも1個のヌクレオチドを含み、そして
第四のストレッチBoxC2は少なくとも1個のヌクレオチドを含み、そして
ここで、第三のストレッチBoxC1は、その3’末端によって第二のストレッチBox
Bの5’末端に連結されており、そして第四のストレッチBoxC2は、その5’末端によって第一のストレッチBoxAの3’末端に連結されている。
5’CA(X)n3’
[式中、Xは、好ましくはA,G,T,C,UおよびIを含んでなる群から選ばれるいずれかのヌクレオチドであり、そしてnは、0,1,2,3および4からなる群から選ばれるいずれかの整数である]
の配列を含む。
5’CA(X)n3’
[式中、n=4]
からなる。
のストレッチBoxEは少なくとも1個のヌクレオチドを含む。
X1=GまたはA;
X2=AまたはU;
X3=GまたはA;
X4=AまたはCまたはU;および
X5=GまたはA]
、好ましくは
る。
− 候補グレリンアンタゴニストおよび/または候補グレリンアゴニストを提供し、
− 第一の態様による核酸を提供し、
− グレリンアンタゴニストおよび/またはグレリンアゴニストの存在においてシグナルを提供する試験系を提供し、そして
− 候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか、そして/または候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアンタゴニストまたはグレリンアゴニストのスクリーニングのための方法によって第7の態様において解決される。
− 相、好ましくは固定相に固定化されたグレリンを提供し、
− 第一の態様による核酸、好ましくは標識されている第一の態様による核酸を提供し、
− 候補グレリンアゴニストおよび/または候補グレリンアンタゴニストを添加し、そして
− 候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか、そして/または候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアゴニストおよび/またはグレリンアンタゴニストのスクリーニングのための方法によって第8の態様において解決される。
し、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そのような第一の二本鎖構造はバルジを含む。二本鎖構造は、第一のストレッチBoxAの5個の3’末端連続ヌクレオチドおよび第二のストレッチBoxBの若干の6〜8個の連続ヌクレオチドによって形成される。バルジは、第一のストレッチBoxAの5個の3’末端連続ヌクレオチドと塩基対合しない1個位の少ないおよび3個位の多いヌクレオチドによって形成される。したがって、バルジは、好ましくは第二のストレッチBoxBによって提供される、1,2または3個の非塩基対合ヌクレオチドからなってもよい。このバルジのサイズに鑑みて、第二のストレッチBoxBは6〜8個の連続ヌクレオチドを含んでもよい。より好ましくは、バルジは、好ましくは6個の連続ヌクレオチドを含んでなる第二のストレッチBoxBによって、第二のストレッチBoxBの5’末端から見られる第二のストレッチBoxB内の非塩基対合第三ヌクレオチドによって創成される。
5’CA(X)n3’
[式中、Xは、好ましくはA,G,T,C,UおよびIを含んでなる群から選ばれるいずれかのヌクレオチドである]
の配列を有する第五ストレッチにおいて特に効果的であることがわかった。
、このより長い核酸は、少なくとも一部分は、本発明による核酸またはその一部である数部分を含む。これらのより長い核酸の他の部分は、D−核酸でもL−核酸であってもよい。いずれの組み合わせ物が本発明に関して使用されてもよい。これらのより長い核酸の他の部分は、結合、好ましくはグレリンへの結合とは異なる機能を示すことができる。1つの可能性のある機能は、他の分子と相互作用させることであり、そのような他の分子は、例えば、固定化、架橋、検出または増幅のためのように、好ましくはグレリンとは異なる。
n,L.S.et al.(1995)Chem Biol,2,683−95;Kawasaki,A.M.et al.(1993)J Med Chem、36,831−41;Lesnik,E.A.et al.(1993)Biochemistry,32,7832−8;Miller,L.E.et al.(1993)J Physiol,469,213−43において記述されている。そのような修飾は、核酸がなりたっている個々のヌクレオチドの2’位におけるH原子、F原子またはO−CH3基またはNH2基であってもよい。また、本発明による核酸は少なくとも1個のLNAヌクレオチドを含んでもよい。1つの実施態様では、本発明による核酸はLNAヌクレオチドからなる。
る核酸について可能な長さであることは当業者によって認識できる。本発明による核酸の長さのより好適な範囲は、約20〜100ヌクレオチド、約20〜80ヌクレオチド、約20〜60ヌクレオチド、約20〜50ヌクレオチドおよび約30〜50ヌクレオチドの長さである。
く。そのような薬物は好適な実施態様では少なくとも1種の製薬学的に許容できる担体を含む。そのような担体は、例えば、水、バッファー、PBS、グルコース溶液、好ましくは5%グルコース塩均衡溶液、澱粉、糖、ゼラチンまたはいずれか他の許容できる担体物質であってもよい。そのような担体は一般に当業者には既知である。
SPIEGELMER NOX−B11 inhibits neurostimulatory and orexigenic effects of peripheral ghrelin in rats.Gut.2005 Jun 30,Epub ahead of print)は、抗グレリンSpiegelmer NOX−B11の投与において末梢グレリンにより誘発された短期間の食物摂取の用量依存性減退を報告している。より具体的には、PBSおよび3nmolグレリンによるポジティブ対照群(媒質/グレリン群)処置では、媒質/媒質群(1.13±0.59g/kg−BW,p<0.0002)に較べて腹腔内注射後初めの半時間内に食物摂取が有意に増加した(4.94±0.63g/kg−BW)(Kobeltら、前出の図2A)。Spiegelmer NOX−B11(=SOT−C=B11trc)の30nmolによる前処置は食物摂取に及ぼすグレリンの促進効果を阻止した(0.58±0.58g/kg−BW,p<0.0001)(Kobeltら、前出の図2A)。これに対して、ランダム配列からなる対照Spiegelmerの投与は、そのような抑制効果を有せず、食物摂取におけるグレリン誘導の促進は元のままであった(4.77±0.66g/kg−BW;p>0.864)(Kobeltら、前出の図2A)。
既知の標準技術を用いて実施されてもよい。そのようなアッセイがまた、次に概説されるようなグレリン、好ましくは生物活性グレリンの検出のために使用できることは理解されるにちがいない。
(a)生物活性グレリンの存在について試験されるべきサンプルを提供し、
(b)本発明による核酸を提供し、
(c)好ましくは反応容器中で、サンプルを核酸と反応させること、
を含み、この場合、段階(a)は段階(b)の前に実施されてもよく、または段階(b)は段階(a)の前に実施されてもよい。
であるすべての検出手段である。好ましくは、そのような検出手段は、かくしてグレリンのC末端に結合するか、あるいは少なくとも、N末端およびn−オクタノイル側鎖によって形成されるドメインに結合することはない。特に好適な検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選ばれる検出手段であり、これらの生成は当業者には既知である。
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がビオチンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がアビジンまたはアビジン保持分子であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がストレプトアビジンまたはストレプトアビジン担持分子であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がノイトラビジンまたはノイトラビジン担持分子であるか、あるいは
検出標識がブロモ−デオキシウリジンであり、そして第二の検出手段がブロモ−デオキシウリジンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がジゴキシゲニンであり、そして第二の検出手段がジゴキシゲニンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がキレーターであり、そして第二の検出手段が放射性核種であり、
これらの場合、該検出標識は核酸に連結されていることが好ましい。この種の組み合わせがまた核酸が表面に付着される実施態様にも応用できることが理解されるべきである。そのような実施態様では、検出標識が相互作用パートナーに連結されることが好ましい。
グは高処理スクリーニングである。好ましくは、高処理スクリーニングは、標的に基づくアッセイにおける化合物の迅速、効率的、試行錯誤評価である。最良の場合には、分析は比色(colormatic)測定によって実施される。これに関連して使用されるライブラリーは当業者には既知である。
施態様では、用語「含む」は、含有するという意味において理解されるべきであり、かくして、そのような用語によって追跡または記述される主題を限定するとして理解されるべきである。
明確に別に指示されない限り、これらの実施例をとおして使用されるグレリンは、そのオクタノイル化形態におけるグレリンであった。
異なる位置において変異を示す15クローン(図1)が、実施例2に記述される「競合アッセイ」を用いる37℃での格付け実験のために選ばれた。参考として、放射能標識アプタマーSOT−C(B11trc)が使用された。数種の候補がSOT−C(B11trc)よりも強くD−グレリンに結合し、より低いKDまたは「競合アッセイ」では分別できない活性コンホメーションのより高い量を示した。クローンMS−P2−G2、MS−P2−D2、MS−P2−A2、MS−P2−H3は対照クローンSOT−C(B11trc)よりも良好な結合を有するように見え、クローンMS−P2−E1、MS−P2−B1、MS−P2−F1、MS−P2−C3、MS−P2−C2,MS−P2−A4およびMS−P2−B2はさらに良好な結合を示した。SOT−C(B11trc)に較べて類似の結合結果は、クローンMS−P2−E3、MS−P2−A3、MS−P2−H2およびMS−P2−D1について決定できた(図2;評価は図1参照)。したがって、最良クローンが、平衡アッセイにおいてアプタマーとして、そして37℃における細胞培養アッセイにおいてSpiegelmerとしてそれらの活性について試験された(プロトコルは実施例2参照)。結果は図1において総括されている。クローンMS−P2−D2、MS−P2−F1、MS−P2−C2、MS−P2−A4およびMS−P2−B2は、平衡アッセイにおいて37℃で22〜34nMのKD(約60%活性分子)と測定され、そして3,0〜8,0nMのIC50値が37℃の細胞培養実験において検出できた。これに較べて、SOT−C(B11trc)のIC50は37℃で20nMと検出され、そしてKDは37℃で100nM(47%活性分子)と決定された(特許出願WO2004/013274A2に記述されるように、室温におけるSOT−CのIC50は約5nMである)。結果は、SpiegelmerMS−P2−F1、MS−P2−C2およびMS−P2−D2の生物学的活性は、37℃においてSOT−C(B11trc)よりも約5倍も良好であり得ることを示している。連続的な先端切り取り実験では、クローンMS−P2−F1(4,0nMのIC50)が選択された(二次構造予想、図12参照)。
2.1 「平衡結合アッセイ」の使用による放射能標識アプタマーの格付け
本明細書で開示され、そしてより具体的には図1において列挙されるほとんどのクローンが、「平衡結合アッセイ」の使用によって、ビオチン化ヒト・D−グレリンに対するそれらの結合挙動に関して放射能標識アプタマー(D−RNA)として格付けされた。
成分 [最終]
オリゴヌクレオチド 5μM
T4 Forward反応バッファー(Invitrogen) 1x
T4 ポリヌクレオチドキナーゼ(Invitrogen) 10U/10μl反応容量[γ−32P]−ATP 1μl/10μl反応容量
既知のグレリン結合配列SOT−C(B11trc;特許出願WO2004/013274A2参照)に対してクローンを比較するために、SOT−Cが、本明細書で記述される標準プロトコル(実施例4)を用いてアプタマー(D−RNA)として合成された。アプタマー配列は本明細書で記述される標準プロトコルを用いてγ−P32−ATPにより5’末端において放射能標識された。
グレリン結合Spiegelmerの機能的特性決定が、ヒト(L−)グレリンとヒト
成長ホルモン分泌促進物質受容体(GHS−R)との相互作用を追跡する細胞アッセイ系において実施された。受容体−リガンド相互作用からもたらされる細胞内カルシウム放出は、蛍光カルシウム指示薬の手段によって可視化される。
ビオチン化ヒトD−グレリンに結合するアプタマーの特性決定が、前記BIAcore2000装置(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)を用いるSPR即時速度分析によって決定された。C末端ビオチン化ペプチドの100RU(フローセル2)および300RU(フローセル3)が、Streptavidin共役センサーチッ
プ(BIAcore AB,Freiburg,Germany)に固定化され、そして0,1μM〜1μMの濃度範囲におけるサンプルが、会合時間360(s)および解離時間360(s)を定めるKinject指令を用いて注入された。フローセル1はバッファーおよびデキストラン基質対照(Biacore SA−Chip surface)として使用され、フローセル4には、非特異的D−ペプチドが固定化されてアプタマーの非特異的結合を決定した。反応は37℃で実施された。BIAevaluation3.0 ソフトウエア(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)によるデータ解析では、本研究者らはLangmuir1:1化学量論的フィッティング・アルゴリズムを使用した。
3.1 SOT−D−000の切り取り
3.1.1 予め選ばれたSOT−D−000の末端切り取り
図3に示されたグレリン結合Spiegelmerは、特許出願WO2004/013274A2において既に示されるように予め得られた。二次構造の予測(最小自由エネルギーコンホメーション[Hofacker et al.,1994,Monatsh.Chem 125:167−188])では、5’−および3’末端の間の標準的分子内塩基対合が全Spiegelmerについて明白になる(図4−7;図3において下線を付した塩基)。Spiegelmerにおけるそのような構造的要素の存在は、活性のある三次元構造の正確な折り畳みのためには極めて重要であろうが、経済的なSpiegelmerの合成のためには、分子は可能な限り短くあるべきである。SpiegelmerSOT−D−000(別名、プライマー結合部位を含まないSOT−R04−DR14−F7の先端切り取り物)は、それが、最長の末端らせんを形成する可能性を有する最短の選ばれたSpiegelmerであるので、末端切り取りのための基本として選ばれた。
図3における選ばれたグレリン結合物(binder)の整列を考慮する場合、強度に可変性の領域は、5’末端における末端らせんに直接隣接するすべての整列された分子において存在すると思われる。グレリン結合物のさらなる先端切り取りについてのこの明白な可変性を精査するために、最小の完全活性SOT−D変異体SOT−D−100およびー108がさらなる切り取りのための基礎として使用された。内部のSOT−D−100変異体の場合は、それぞれの塩基が単純に除かれたが、SOT−D−108変異体では、それらが、合成中に柔軟性の親水性スペーサーによって置換された。次に、SOT−D−100およびその誘導体SOT−D−101および−102ならびにSOT−D−108誘導体SOT−Dー109、SOT−D−110およびー111が、実施例2における記述のように細胞培養において試験された(図9)。図8に示されるように、3個ではないが2個の内部ヌクレオチドの欠失は、活性喪失なしに可能であった(SOT−D−101;−102)。これに対して、スペーサーによって置換された場合(SOT−D−109、−110、−111)には、3個のヌクレオチドが除くことができた。スペーサーの最適位置はSOT−D−109において実現される(図10)。
次のように、先導配列として選ばれたグレリン結合配列MS−P2−F1(図1および図12)はSOT−Eと呼ばれる。
3’末端における5個のヌクレオチドは分子の他の部分にはハイブリダイズされないと思われる。反対に、5’末端では、ヌクレオチドは部分的に対合できる。驚くべきことに、3’末端は結合の低下なしには切り取りすることができない(SpiegelmerSOT−E−012)が、一方SOT−E−014(5’末端における6個のヌクレオチドの切り取り)は完全なグレリン・アンタゴニスト性能を維持した(図13)。
図1における選ばれたグレリン結合物MS−P2−E3、MS−P2−G2、MS−P2−D2、MS−P2−A3、MS−P2−E1、MS−P2−B1、MS−P2−C3、MS−P2−C2、MS−P2−H2、MS−P2−A4、およびSOT−E(配列ファミリーI)の整列を考慮する場合、可変性の領域は、末端において、かつ、らせんに直接隣接するすべての整列された分子において存在すると思われる(SOT−EにおけるG36−C43)。SpiegelmerSOT−Eの二次構造予測は、4個のヌクレオチドのループを示す(A38−U41;図12)。グレリン結合物のさらなる切り取りのためにこの明白な可変性を探査するために、最初に、SpiegelmerSOT−Eのそれぞれの塩基が、合成中に柔軟性の親水性スペーサーによって置換された。8個のヌクレオチド(G36−C43;SOT−E−008)ではない6個(U37−A42;SOT−E−011)の欠失が、活性の喪失なしに可能であった。5’末端における切り取り(G1−A6)の結果および柔軟性の親水性スペーサーによる6個のヌクレオチド(U37−A42)の置換の組み合わせは、56−ヌクレオチドSpiegelmerSOT−E(図12)として細胞培養において同一のIC50を示す44−ヌクレオチドのSpiegelmerSOT−E−019(図14)をもたらす。
配列MS−P2−A2、MS−P2−H3、MS−P2−D1(図1)によって表される配列ファミリーIIは配列ファミリーI(SOT−Eを含む)に対して類似性を担持する。これらの配列相同性は図1におけるboxA(UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC)として強調される。配列ファミリーIIでは、boxAは、むしろ3’末端に置かれるが、配列ファミリーIでは、boxAは5’末端に接近している。SpiegelmerSOT−Eのインビトロの選択および二次構造予測のこの結果により、boxAが5’末端に置かれるSOT−E−019の変異体が計画された。その目的のために、SOT−E−019の本来の5’末端および3’末端が、柔軟性の親水性スペーサーと連結され、そしてループが除去されて、新しい5’末端および3’末端を生成した(SOT−E−021;図15および21)。驚くべきことに、SOT−E−021では、活性の喪失は観察できなかった。SOT−E−019およびSOT−E−021(SOT−E−33(図16および21)およびSOT−E−25(図17および21))に基づくさらなる切り取り物は、グレリン・アンタゴニスト機能の低下なしには可能ではなかった(図13)。
SpiegelmerSOT−Eが、SOT−Cに比較して表面プラズモン共鳴(実施例2)によって測定され、6倍良好なKDが決定できた(図18)。同じ改良された結合性(5倍良好)が、D−109に較べてSpiegelmerSOT−Eを用いる細胞培養実験(実施例2)において検出することができた(図19)。動物体内での滞留時間を改良するために、SpiegelmerSOT−E−19が、40kDa−PEG部分によってその5’末端において修飾された(SOT−E19−5’−PEG)。SOT−E19−5’−PEGは、細胞培養実験においてSOT−Eに較べて類似の結果を示し(図19)、さらに、インビボ活性を例証した(実施例5;図22)。
グレリン、特に本明細書で定義されるオクタン酸側鎖を有するグレリンを結合させるすべての分子は、第一に、グレリン結合のために必須である25個のヌクレオチド(「BoxA」)のモチーフの存在を特徴とする。「BoxA」内の25個のヌクレオチドのあるものは他の塩基と相互に交換可能であると思われる(図20A)。
化学的固相合成
小規模合成
アプタマーは、2’TBDMS RNAホスホルアミダイト化学を使用してABI 394シンセサイザー(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)による固相合成によって製造された(M.J.Damha,K.K.Ogivie,Methods in Molecular Biology,Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs,ed.S.Agrawal,p.81−114,Humana Press Inc.1993)。D−rA(N−Bz)−、D−rC(Ac)−、D−rG(N−ibu)−、D−rU−およびヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトは、ChemGenes,Wilmington,MAから購入された。アプタマーはゲル電気泳動によって精製された。
修飾SpiegelmerSOT−E−19は、2’TBDMS RNAホスホルアミダイト化学を使用して ktaPilot100シンセサイザー(Amersham Bioscience;General Electric Healthcare,Freiburg)による固相合成によって製造された(M.J.Damha,K.K.Ogilvie,Methods in Molecular Biology,Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs,ed.S.Agrawal,p.81−114,Humana Press Inc.1993)。L−rA(N−Bz)−、L−rC(Ac)−、L−rG(N−ibu)−、L−rU−およびヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトは、ChemGenes,Wilmington,MAから購入された。合成は、L−riboC修飾されたCPG孔径1000(Link Technology,Glasgow,UK)において開始された。カップリング(1サイクルについて15分)では、アセトニトリル中0.3Mベンジルチオテトラゾール(CMS−Chemicals,Abingdon,UK)、およびアセトニトリル中それぞれ0.1Mホスホルアミダイト溶液の3.5当量が使用された。Spiegelmerの5’末端におけるアミノ基は、アミノヘキシルホスホルアミダイト(ChemGenes)をカップリングすることによって連結された。酸化−キャッピング(capping)サイクルが使用された。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準溶媒および試薬はBiosolve(Valkenswaard,NL)から購入された。SpiegelmerはDMT−ON合成された;脱保護の後、それは、Source15RPC媒質(Amersham)を用いて調製用RP−HPLC(Wincott et al 1995 Nucleic Acids Res.23:2677)により精製された。5’DMT−基は80%酢酸を用いて除去された(RTで30分)。続いて、2MNaOAc水溶液が添加され、そしてSpiegelmerが、5K再生セルロース膜(Millipore,Bedford,MA)を用いる接線流動濾過によって脱塩された。
インビボの腎臓クリアランスを低下させるために、SpiegelmerSOT−E−19は5’末端において40kDaポリエチレングリコール(PEG)部分に共有結合された。そのような増加された分子質量をもつSpiegelmerを用いることは、血漿における保持を有意に延長させ、そのために、より長い有効性が達成できた。
外因性グレリンの投与は、ラットにおける成長ホルモン(GH)の放出を惹起することが知られている。グレリン結合Spiegelmerの前以ての投与は、GHのグレリン誘導放出を抑制する。
実施例3に記述されたように、抗グレリンSpiegelmerSOT−E−19は、L−ヌクレオチド、および6個のヌクレオチドを置換するために元の分子SOT−Eに組み入れられた内部リンカーからなる。6個のヌクレオチドからの4個はSpiegelmerSOT−Eにおいてループを形成し、残りの2ヌクレオチド(6ヌクレオチドからの)は互いにハイブリダイズできる(SOT−E、参照図23、第一列、ハイブリダイズされるヌクレオチドは下線を付される)。
グレリンに対するSpiegelmerSOT−E−19の結合の特徴は、さらに、実施例2に記述された方法に基づいて、競合アッセイにおいて分析された。これらのアッセイにおいて、Spiegelmerは、細胞の刺激前の刺激溶液においてグレリンペプチド(オクタノイル−およびデスオクタノイル−グレリン)の種々の組み合わせ物とともにインキュベートされた。
=huグレリン)が図24(左から右へ数えられるバー)において総括される:いずれのオクタノイル−グレリン(ヒト・グレリン=huグレリン)も含まないか、または300nMの最終濃度においてデスオクタノイル−グレリンを含む場合は、細胞の刺激は検出できない(バー1および2)が、一方、13nMの濃度におけるオクタノイル−グレリン(ヒト・グレリン=huグレリン)は既にカルシウム放出を媒介するために十分であり(バー3);300nMデスオクタノイル−グレリン(バー4)のさらなる添加は細胞刺激を妨げず、これは、生物学的に不活性なデスオクタノイル−グレリンが受容体アンタゴニストではないことを示している。3nMオクタノイル−グレリン(ヒト・グレリン=huグレリン)によって媒介されるカルシウム放出はSOT−E−19の10倍過剰量によって抑制でき(バー5)、オクタノイル−グレリン(ヒト・グレリン=huグレリン)を超える100倍過剰量(300nM)でのデスオクタノイル−グレリンの存在でさえ抑制に対して競合しない(バー6)。これに対して、300nMオクタノイル−グレリンおよび30nMSpiegelmerのアッセイ濃度はカルシウム放出の増加を示し(バー7)、アッセイ条件下で、オクタノイル−グレリン(ヒト・グレリン=huグレリン)による刺激増進が達成できるという証拠を与える。この実験は、SOT−E−19がオクタノイル形態とデスオクタノイル形態におけるグレリン間を特異的に識別することを例証する。
グレリン結合SpiegelmerNOX−B11は、オクタノイル化されたヒトおよびラットのグレリンの非放射能定量のために、酵素免疫アッセイ(EIA)のアッセイ形式に類似する形式で使用することができる。
このアッセイでは、標準、対照および未知の処理血漿が、グレリン結合Spiegelmer、例えば、そのN末端においてオクタノイル−グレリンを認識するSpiegelmerNOX−B11によりコートされた96穴ミクロタイター・プレートにおいてインキュベートされる。インキュベーションおよび洗浄後、ウェルが、抗グレリン抗体(第一の抗体)またはグレリンのC末端においてグレリンに結合する核酸により処理される。この抗体または核酸は標識されても、されなくてもよいが、核酸は好ましくは標識される。(第一の)抗体が標識されない場合、(第一の)抗グレリン抗体を除去するインキュベーションおよび数回の洗浄段階後、第二の抗体(抗体は第一の抗体のFcフラグメントに対向され、そして標識されている)が添加される。第二の抗体の標識は、酵素セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)であってもよい。第二の抗体とともにウェルをインキュベートし、未結合フラクションを除去した後、ウェルはHRP基質テトラメチルベンジジン(TMB)とともにインキュベートされる。次いで、酸性停止液が添加され、そして基質の酵素的ターンオーバーの度合が450nmにおける吸光度測定によって決定される。測定された吸光度はサンプル中に存在するオクタノイル−グレリンの濃度に直接比例している。1セットのグレリン標準が使用されて、グレリン濃度に対する吸光度の標準曲線がプロットされ、これから未知のグレリンが計算できる。
最初に、ストレプトアビジンでコートされた96穴プレート(Reacti−Bind
Streptavidin Coated High Bind Capacity Black 96−well Plates,Perbio Science,Bonn,Germany)が、0.1%Tweenを含むPBS−Dulbecco(Mg2+およびCa2+を含む、Biochrom AG,Berlin,Germany)により3回洗浄された。各ウェルは、室温で1時間、100μlの50μMビオチン化SpiegelmerNOX−B11(PBSに溶解;配列番号:72)とともにインキュベートされた。ビオチン化SpiegelmerNOX−B11の固定化の後、未結合のSpiegelmerが1回の洗浄段階(100μl PBS)によって除去された。これは図26Aに図示される。
原則として、実験データは、SpiegelmerNOX−B11が濃度依存方式でオクタノイル−グレリンを固定化するために使用でき、したがって、EIA型検出アッセイにおいて試薬としての潜在力を有することを例証する。
Claims (6)
- ヒト・グレリンに結合できるL−核酸であって、
第一のストレッチBoxAは
UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC
の配列を含み、
第二のストレッチBoxBは5’GUGAGG3’の配列を含み、
第三のストレッチBoxC1は2または3個の連続ヌクレオチドを含み、
第四のストレッチBoxC2は2または3個の連続ヌクレオチドを含み、
第五のストレッチBoxDは
5’CA(X)n3’
[配列中、XはA,G,T,C,UおよびIからなる群より選ばれるいずれかのヌクレオチドであり、そしてnは、0,1,2,3および4からなる群より選ばれるいずれかの整数である。]
の配列を含み
第六のストレッチBoxEは1〜4の連続ヌクレオチドを含み、
スペーサーは親水性の非核酸スペーサーであり、かつ、
GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG-spacer-CGGUGAGGCAGCAC (SOT-E-19) (配列番号39)、
CGGUGAGGCAGCAC-spacer-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG (SOT-E-21) (配列番号40)、
CGGUGAGGCAGC-spacer-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG (SOT-E-25) (配列番号41) および
GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG-spacer-CGGUGAGGCAGC (SOT-E-33) (配列番号42)
(上記配列中、spacerは親水性の非核酸スペーサーである)
からなる群より選択される、L−核酸。 - L−核酸が
GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG-spacer-CGGUGAGGCAGCAC (SOT-E-19) (配列番号39)
である、請求項1に記載のL−核酸。 - spacerが、少なくとも1個のエチレングリコール部分を含み、かつ、344Daの分子量を有する、請求項1又は2に記載のL−核酸。
- L−核酸が修飾体(modification)を含んでなる、請求項1〜3のいずれかに記載のL−核酸。
- 修飾体が直鎖または分枝状PEGからなるPEG部分であり、ここで、PEG部分の分子量が40kDである、請求項4に記載のL−核酸。
- L−核酸が
5'-PEG-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG-spacer-CGGUGAGGCAGCAC (SOT-E-19-5'-PEG) (配列番号51)である、請求項1〜5のいずれかに記載のL−核酸。
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