DE19808591C2 - Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay - Google Patents

Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay

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Description

Die Erfindung betrifft einen standardisierten durchflußzytometrischen Vollblu­ tassay zur Quantifizierung der Fibrinogenrezeptorblockade durch Fibrinogen­ rezeptorantagonisten.
Der Assay findet Anwendung in klinischen Disziplinen, die sich mit dem The­ rapiemonitoring bei der Behandlung von Patienten mit Fibrinogenrezeptoran­ tagonisten (z. B. Kardiologie, Angiologie, Neurologie) befassen, und in nicht- klinischen Disziplinen, die die Entwicklung und Erprobung neuer Substanzen dieser Präparateklasse in vitro und im Tiermodell zum Ziel haben.
Der Fibrinogenrezeptor (Glykoproteinkomplex IIb/IIIa) wird ausschließlich auf Blutplättchen (Thrombozyten) exprimiert und vermittelt über Bindung von Fi­ brinogen am aktivierten Rezeptorkomplex die Aggregation von Thrombozyten nach Aktivierung durch physiologische Stimuli. Damit kommt der Wechsel­ wirkung von Fibrinogen und seinem Rezeptor auf Thrombozyten eine ent­ scheidende Bedeutung zu - unter physiologischen Bedingungen beider Bil­ dung von Thrombozytenaggregaten zum Verschluß von Gefäßverletzungen und bei der Erhaltung der Gefäßintegrität.
Unter pathologischen Bedingungen (wie z. B. degenerative atherosklerotische Gefäßerkrankungen, Diabetes mellitus, Autoimmunerkrankungen, Tumorer­ krankungen u. a.) führt die gesteigerte Thrombozytenaktivierung zu einer ver­ stärkten Bildung von plättchenreichen Aggregaten und damit zum thromboti­ schen Verschluß von Gefäßen.
Aus diesem Grund entsteht mit der Entwicklung von Inhibitoren der Fibrino­ genbindung am Fibrinogenrezeptor eine neue und sehr interessante Klasse von antithrombozytären Medikamenten. Bereits im klinischen Einsatz ist ein blockierender Antikörper (murin-human chimerer Klon c7E3 Fab; abciximab; ReoPro®), der entsprechend den Ergebnissen aus der Phase III-Studie EPIC (1) als zusätzliche Medikation neben Heparin und Acetylsalicylsäure (ASS) bei Patienten mit akutem Herzinfarkt und instabiler Angina pectoris in ver­ schiedenen Ländern zugelassen ist. Auf den Ergebnissen der drei Studien­ arme beruht die z. Zt. empfohlene Anwendung des Medikamentes mit Bolus und anschließender zwölfstündiger Infusion. Weitere peptidische und nicht­ peptidische Fibrinogenrezeptorantagonisten (Eptifibatide [2], Lamifiban [3]) sind in verschiedenen Phasen ihrer klinischen Erprobung für die intravenöse und orale Anwendung.
Der Einsatz der Fibrinogenrezeptorantagonisten erfolgt in Kombination mit anderen antithrombotischen Medikamenten wie ASS und Heparin. Daher stellt das selektive und quantitative Monitoring jedes Medikamentes allein und in der Kombination eine entscheidende Voraussetzung zur Beurteilung der Effektivität und für die Entwicklung von individuellen Dosierungsempfehlun­ gen dar. Eine funktionell wirksame Inhibierung der Thrombozytenaggregation tritt erst bei einer Blockade von mehr als 75% der Fibrinogerezeptoren auf und erreicht ihr Maximum bei ca. 85% Blockade (4). Für die individuelle Do­ sisanpassung bei der akuten intravenösen Gabe und auch bei der chroni­ schen Anwendung oraler Substanzen ist daher die Quantifizierung im Bereich unterhalb der Blockade von 75% der Rezeptoren von entscheidender Bedeu­ tung.
Für das Monitoring der Fibrinogenrezeptorantagonisten wurden bisher folgen­ de Methoden publiziert: a) Blutungszeit (5), b) Aggregometrie (6), c) Throm­ belastografie (7), d) Platelet Function Analyzer-100 (PFA-100) (8), e) plättchen-induzierte Thrombingenerierungszeit (9), f) Kompetition mit radio­ aktiv-markierten Antikörpern (10) und Antikörperfragmenten (11), g) induzier­ te Aggregation fibrinogenbeschichteter Plastekügelchen (4) und h) durchfluß­ zytometrische Kompetitionsassays mit dem fluoreszenzmarkierten Medika­ ment (12) bzw. i) einem fluoreszenzmarkierten Antikörper (13) oder fluores­ zenzmarkiertem Fibrinogen (14).
Die Nachteile der bisher publizierten Methoden liegen in der mangelnden Se­ lektivität für den Nachweis der Wirkung der Fibrinogenrezeptorantagonisten bei der Kombinationstherapie mehrerer antithrombotischer Medikamente (a, b, c, d, e), in der ungenügenden Quantifizierbarkeit der Rezeptorblockade (a, b, c, d, e, g), in der Verwendung hochspezialisierter Geräte und Instrumente (c, d, e, f), in der Anwendung radioaktiver Substanzen (f) und in der fehlen­ den Verfügbarkeit fluoreszenzmarkierter Derivate der therapeutisch zugelas­ senen Fibrinogenrezeptorblocker (h) sowie in der ungenügenden Standardi­ sierung, Gerätekalibierung, Qualitätskontrolle und Beachtung der akti­ vierungsabhängig steigenden Rezeptorexpressionsdichte (h, i).
Die Ursachen der Nachteile liegen in folgendem.
Die Methoden a)-e) (Blutungszeit, Aggregometrie, Thrombelastografie, PFA- 100-Messung und plättchen-induzierte Thrombingenerierung) können eine angeborene oder erworbene Unterfunktion der Thrombozyten (z. B. infolge antithrombotischer Therapie) nachweisen, ermöglichen aber methodisch be­ dingt nicht die selektive Bestimmung der jeweiligen Einzelwirkung bei einer antithrombotischen Kombinationstherapie. Der Einsatz der Fibrinogenrezep­ torantagonisten erfolgt entsprechend dem aktuellen Wissenstand aber in Kombination mit ASS und Heparin.
Darüberhinaus ist keine exakte Quantifizierung der Rezeptorblockade durch Fibrinogenrezeptorantagonisten mit den Methoden a)-e) und g) möglich, da eine niedrige Rezeptorbesetzung bis ca. 75% funktionell noch nicht bedeut­ sam ist und damit nicht erfaßt werden kann. Für die individuelle Dosisanpas­ sung ist aber gerade die Quantifizierung dieses subtherapeutischen Berei­ ches wichtig.
Eine Reihe von Methoden erfordert technische Geräte und Labormöglichkei­ ten, die hochspezialisiert, nur für wenige Fragestellungen einsetzbar sind und daher nur für wenige Labors infrage kommen. Thrombelastografie (c) und PFA-100-Gerät (d) wurden als Screeningmethoden für die Thrombozy­ tenfunktion entwickelt und sind ausschließlich für diese Fragestellung einsetz­ bar. Die Anwendung von radioaktiv markierten Antikörpern (f) erfordert bau- und gerätetechnische sowie strahlenschutzrechtliche Voraussetzungen, die bei neuen Routineassays heute vermieden werden sollten.
Der vorgestellte durchflußzytometrische Assay mit einem fluoreszenten Deri­ vat des Medikamentes als Kompetitor (h) ist hochselektiv für den getesteten Fibrinogenrezeptorantagonisten. Insbesondere für nichtpeptidische Fibrino­ genrezeptorantagonisten ist aber dieses Testprinzip in vielen Fällen synthe­ tisch nicht leicht zu lösen, da die Kopplung des Fluorophors am meist sehr kleinen Inhibitor zu keiner Beeinflussung seiner Bindungseigenschaften füh­ ren darf.
In dem als Abstract publizierten Assay von I. Besson und M. C. McGregor (i) wird die Kompetition von Fibrinogenrezeptorantagonisten mit fluoreszenzmar­ kierten Antikörpern vorgestellt. Hierin fehlen aber die für einen allgemein ein­ setzbaren Routinetest notwendige Standardisierung, Gerätekalibrierung und Minimierung der unspezifischen Bindung. Darüberhinaus konnte die Arbeits­ gruppe von B. S. Coller (11) nachweisen, daß der Einsatz von intakten IgG- Antikörpern aufgrund der zwei Bindungsvalenzen im Gegensatz zum mono­ valenten Fab-Fragment nur 50% der tatsächlich vorhandenen Antigene de­ tektiert. In keinem der publizierten Tests wird die aktivierungsabhängig stei­ gende Expressionsdichte des GpIIb/IIIa-Rezeptors berücksichtigt.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung eines standardisierten, se­ lektiven und quantitativen Assays zur Bestimmung der Rezeptorblockade durch Fibrinogenrezeptorantagonisten auf unstimulierten und stimulierten Thrombozyten.
Ein durchflußzytometrischer Assay auf dem Prinzip der Kompetition eines fluoreszenten Substrates mit einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenre­ zeptorantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor ermöglicht die quantitative und selektive Analyse der Fibrinogenrezeptorblockade und wird in Verbindung mit der Minimierung der unspezifischen Hintergrundfluores­ zenz, der Stimulation in vitro mit einem starken Agonisten, mit der Kalibrie­ rung und Standardisierung der Gerätefluoreszenz sowie der Option zur Um­ rechnung der gemessenen Fluoreszenzsignale in die Anzahl besetzter Fibri­ nogenrezeptoren zu einem standardisierten Routinetest.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen dargestellt.
Prinzip
Das Prinzip des Assays besteht in der Kompetition therapeutisch eingesetzter Fibrinogenrezeptorantagonisten (z. B. monoklonale Antikörper wie c7E3 [Reo- Pro®], lineare oder zyklische RGD-Peptide wie Eptifibatide [Integrilin®] oder nicht-peptidische Fibrinogenrezeptorantagonisten wie Lamifiban) mit einem fluoreszenzmarkierten Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörper (z. B. Fab der Klone P2, LYP18 oder c7E3), einem fluoreszenzmarkierten linearen oder zyklischen RGD-Peptid oder einem nicht-peptidischen Fibrinogenrezep­ torantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor der Thrombozyten.
Ansatz
Vor Beginn der Therapie mit dem Fibrinogenrezeptorantagonisten wird eine schonende Blutentnahme beim Patienten (geringe venöse Stauung, kurze und weitlumige Kanüle) durchgeführt. Das Vollblut wird durch Verdünnen in Pufferlösung (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] oder Hank's Balanced Salt Solution [HBSS]; pH 7,4), die humanes Immunglobulin [1 mg/­ ml] zur Verminderung der unspezifischen Antikörperbindung enthält, auf eine Zahl von 10.000 Thrombozyten/µl eingestellt.
Eine definierte Zahl von Thrombozyten wird unstimuliert mit einer sättigenden Konzentration des fluoreszenzmarkierten Substrates inkubiert und so der ma­ ximale Fluoreszenzwert der unstimulierten Probe ermittelt (entspricht 0% Re­ zeptorblockade). Im Parallelansatz wird die gleiche Absolutzahl von Thrombo­ zyten mit einem starken, proteaseresistenten Agonisten maximal stimuliert (z. B. TRAP-6 mit N-terminaler Substitution von Serin durch Isoserin) (15). Der Fluoreszenzwert nach anschließender Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem Substrat in sättigender Konzentration entspricht 0% Rezeptorblockade bei maximal stimulierten Thrombozyten. In einem dritten Ansatz erfolgt wiederum bei gleicher Absolutzahl der Thrombozyten die in vitro-Btockierung aller bloc­ kierbaren GpIIb/IIIa-Rezeptoren mit dem therapeutisch eingesetzten Fibrino­ genrezeptorantagonisten. Die Endkonzentration wird im Ansatz so gewählt, daß sie dem Doppelten der Medikamentenkonzentration im Vollblut ent­ spricht, die nach Bolusgabe der maximal zur Therapie zugelassenen Medikamentendosis erreicht werden kann.
Die Identifizierung der Thrombozyten folgt in allen drei Ansätzen dem glei­ chen Prinzip. Verwendet wird ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Anti­ körper in sättigender Konzentration, der eine räumlich weit von der Fibrino­ genbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors erkennt und mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff als das Substrat konjugiert ist. Es sollten zwei Fluoreszenzfarbstoffe ausgewählt werden, deren Emissionsbereiche sich nicht wesentlich überlappen (z. B. Fluoreszeinisothiocyanat [FITC] mit Phycoerythrin-Cyan5 [PE-Cy5] oder Phycoerythrin [PE] mit PE-Cy5, so daß keine Kompensationsprobleme auftreten. Für die Markierung des Substrates erscheint FITC besonders geeignet, da aufgrund seines niedrigen Molekular­ gewichtes die Gefahr einer sterischen Behinderung am GpIIb/IIIa-Rezeptor gering ist.
Unter laufender Therapie mit einem Fibrinogenrezeptorantagonisten kann nun nach Inkubation der unstimulierten bzw. stimulierten Patiententhrombo­ zyten mit dem fluoreszenzmarkierten Substrat aus der gemessenen Fluores­ zenzintensität auf den jeweiligen Prozentsatz therapeutisch blockierter bzw. bei maximal stimulierten Thrombozyten blockierbarer Fibrinogenrezeptoren geschlossen werden.
Kalibrierung der Fluoreszenzsignale in die Anzahl geblockter Fibrinogenre­ zeptoren durch den therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptorantagoni­ sten
Die gemessenen arbiträren Fluoreszenzinensitäten können nicht direkt zur Berechnung der Zahl geblockter Rezeptoren verwendet werden. Die Absolut­ werte der Fluoreszenzintensitäten sind vom Durchflußzytometer, der Verstär­ kereinstellung des Gerätes und vom fluoreszenten Substrat abhängig. Erst die Kalibrierung der gemessenen Fluoreszenzsignale in die Anzahl blockierter Fibrinogenrezeptoren erlaubt nicht nur einen Vergleich der prozentualen Re­ zeptorbesetzung, sondern auch einen vom Durchflußzytometer und fluores­ zenzmarkierten Substrat unabhängigen Vergleich der absoluten Rezeptor­ zahlen zwischen verschiedenen Labors.
Bei Verwendung von murinen fluoreszenzmarkierten Fab-Fragmenten von IgG-Antikörpern als kompetitives Substrat erfolgt die Inkubation einer sätti­ genden Konzentration dieser Antikörperfragmente mit einem Set von 5 Po­ pulationen von Plastekügelchen (Beads), die durch ihre unterschiedlichen Bindungskapazitäten für monoklonale Antikörper charakterisiert sind (z. B. Quantum Simply Cellular Microbead Kit®, Sigma, Deisenhofen). Werden fluo­ reszenzmarkierte Substrate verwendet, die keine murinen monoklonalen An­ tikörper sind, muß die Kalibrierung bei bekanntem Fluoreszenzmolekül-Pro­ teinmolekül-Verhältnis (F/P-Ratio) über ein Set von mehreren Plastekügel­ chen durchgeführt werden. Diese Beadpopulationen sind mit demselben Fluoreszenzfarbstoff wie das Substrat markiert und leuchten mit unterschied­ licher, definierter Fluoreszenzstärke (Quantum Fluorescence Kit for MESF units of FITC®, Sigma, Deisenhofen).
Gerätekalibrierung und Standardisierung
Bei quantitativen Messungen mit dem Durchflußzytometer muß mittels fluo­ reszenzmarkierter Plastekügelchen die Leistungstärke des Lasers täglich kontrolliert werden. Hierfür wird das Fluoreszenzsignal dieser Beads unter denselben Geräteeinstellungen wie bei Thrombozytenmessungen analysiert. Durch Setzen eines Markers über der Beadpopulation wird deren mittlere Fluoreszenzintensität bestimmt und durch Nachstellen der Verstärkerspan­ nung konstant gehalten.
Bei Durchflußzytometern, die in der Online-Software die Möglichkeit eines Autosetup haben (z. B. Coulter EPICS®XL mit System 2-Software), wird diese zur automatischen Nachkorrektur aktiviert. Hierfür wird in dem Protokoll zur Messung der Beads ein sehr schmaler Marker über der mittleren Fluo­ reszenzintensität der Beads gesetzt. Liegt die mittlere Fluoreszenzintensität der Beads bei Folgemessungen außerhalb dieses Markers, paßt die Software die Verstärkerspannung automatisch an und optimiert so bedienerunabhän­ gig die Geräteeinstellung.
Die Erfindung wird an Beispielen erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein. - Die nachfolgende Vorschrift wurde für die Quantifizierung der Fibrinogenre­ zeptorblockade durch das Medikament ReoPro® (murin-human chimerer Klon c7E3 Fab; abciximab) optimiert.
Ansatz
Als kompetitives fluoreszenzmarkiertes Substrat wurden FITC-markierte Fab- Fragmente des Klons c7E3 verwendet. Die FITC-Kopplung erfolgte mit einem kommerziellen Fluoreszenzmarkierungs-Kit (Sigma, Deisenhofen). Die Identi­ fizierung der Thrombozyten im Vollblut erfolgt mit dem PE-Cy5-markierten Anti­ körperklon SZ21 (Coulter-Immunotech Diagnostics, Hamburg), der mit dem c7E3-Klon nicht um die Bindungsstelle am Fibrinogenrezeptor kompetitiert (13).
Das Vollblut des Patienten wird mit einem isoosmolaren Puffer (HBSS, pH 7,4, mit 1 mg/ml humanes Immunglobulin G) auf 10.000 Thrombozyten/µl ver­ dünnt. 20 µl des verdünnten Vollblutes werden mit 5 µl des FITC-markierten Fab-Fragmentes c7E3 (Proteinkonzentration 0,3 mg/ml) zur Bestimmung der maximalen Fluoreszenz ohne Blockade des Fibrinogenrezeptors durch Reo- Pro® für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und dann für weitere 5 min bei RT mit 10 µl PE-Cy5-markiertem Antikörper SZ21 zur Thrombozytenidentifizie­ rung inkubiert. Die maximale Stimulation erfolgt im parallelen Ansatz mit einer Aktivatorkonzentration von 500 µM iso-TRAP-6 für 30 min bei RT: Nach Auf­ füllen mit 2 ml Pufferlösung werden 10.000 Thrombozyten am Durchflußzyto­ meter mit einer Flußrate von 500-1000 Partikeln pro Sekunde gemessen. Die Identifizierung der Thrombozyten erfolgt über ihre hohe Fluoreszenzintensität für PE-Cy5 und ihre Größe, die als Vorwärtsstreulicht gemessen wird. Diese Population wird mit einer Region markiert und in einer nächsten Darstellung mit Vorwärts- gegen Seitstreulicht entsprechend den bekannten Streulicht­ eigenschaften für Thrombozyten überprüft. Nach Setzen einer Region um die erneut als Thrombozyten verifizierte Population und Ausschluß von Zellfrag­ menten, Aggregaten, Erythrozyten und Leukozyten wird nun die mittlere Fluo­ reszenzintensität in einer dritten Darstellung für die FITC-Fluoreszenz ermit­ telt (entspricht 0% Blockade).
Parallel erfolgt ein Ansatz mit 20 µl verdünntem Vollblut und ReoPro® (End­ konzentration 5 µg/ml) für 10 min bei RT. Anschließend wird zunächst mit 5 µl markiertem c7E3-Fab-FITC für 10 min und schließlich mit 10 µl SZ21-PE-Cy5 für 5 min bei RT inkubiert. Nach Auffüllen mit 2 ml Puffer erfolgt die Messung.
Die so ermittelte mittlere Fluoreszenzintensität für die FITC-Fluoreszenz ent­ spricht dem Wert "100% Blockade".
Kalibrierung der Fluoreszenzsignale in die Anzahl geblockter Fibrinogenre­ zeptoren durch den therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptorantagoni­ sten
Die Umrechnung der gemessenen Fluoreszenzwerte wird mit dem Quantum Fluorescence Kit for MESF units of FITC® (Sigma, Deisenhofen) entspre­ chend den Herstellerangaben durchgeführt. Fünf verschiedene Beadpopula­ tionen sind mit einer bekannten Anzahl von FITC-Molekülen gekoppelt. Dem­ entsprechend kann einer bekannten Zahl von FITC-Molekülen eine Fluores­ zenzintensität zugeordnet werden. Die mit den fünf Beadpopulationen erstell­ te Eichgerade dient zur Umrechnung der gemessenen Fluoreszenzintensität der Thrombozyten in die Anzahl gebundener FITC-Moleküle. Unter Verwen­ dung der spektrophotometrisch bestimmten F/P-Ratio unserer c7E3-Fab- Fragmente (Lot 12/97: 4,2) kann aus der Anzahl gebundener FITC-Moleküle auf die am Thrombozyten gebundenen fluoreszenten Fab-Fragmente ge­ schlossen werden. Vollblut und Beadsuspension werden unter identischen Geräteeinstellungen gemessen.
Gerätekalibrierung und Standardisierung
Für die Standardisierung und Überwachung der Geräteeinstellung werden fluoreszente Beads (z. B. Flow-Set Fluorospheres®, Coulter-Immunotech Dia­ gnostics, Hamburg), in einem separaten Protokoll mit sehr schmalen Mar­ kern für ihr mittleres Vorwärtsstreulichtsignal und die Fluoreszenzsignale bei 525 nm (FITC) sowie < 650 nm (PE-Cy5) analysiert. Die Nachkorrektur für Abweichnungen von den gespeicherten Markereinstellungen im Meßprotokoll erfolgt automatisch unter Nutzung der Auto-Setup-Funktion der System 2- Software des Durchflußzytometers EPICS XL der Fa. Coulter.
Der Assay weist merkliche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Metho­ den auf. Insbesondere ist er für klinisch und experimentell tätige Mediziner, Laborchemiker und Naturwissenschaftler angrenzender biologischer Gebiete interessant. Für die klinische Anwendung des ersten zugelassenen Fibrino­ genrezeptorantagonisten (ReoPro®) existiert z. Zt. nur eine auf dem Körper­ gewicht basierende Dosisempfehlung für die Bolusgabe und anschließende zwölfstündige Infusion entsprechend dem Ergebnis einer multizentrischen Studie. Eine individuelle Dosisadaptierung, die durch das Erreichen einer vor­ gegebenen prozentualen Blockierung der Fibrinogenrezeptoren des Patien­ ten gesteuert wird, würde die klinische Effektivität und Sicherheit des Medika­ mentes weiter verbessern. Der vorliegende Assay bietet die methodische Grundlage für die Datenerhebung und den Vergleich der Meßergebnisse zwi­ schen verschiedenen Labors. Für die genannte Problemstellung ist bislang kein Assay verfügbar, der den komplexen Anforderungen gerecht wird.
Neben der Anwendung im klinischen Umfeld kann der Assay auch für die Te­ stung der Wirkung neuer Fibrinogenrezeptorantagonisten in vitro und im Tier­ modell genutzt werden. Die Kenntnisse über Dosis-Wirkungsbeziehungen bereits charakterisierter Rezeptorinhibitoren sind mit neuen Substanzen ver­ gleichbar.
Literatur
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2. Tcheng, J. E., Impact of eptifibatide on early ischemic events in acute ische­ mic coronary syndromes: a review of the IMPACT II trial. Integrilin to Minimi­ ze Platelet Aggregation and Coronary Thrombosis. Am J Cardiol 80 (1997) 21B-28B
3. Theroux, P., Kouz, S., Roy, L., Knudtson, M. L., Doitati, J. G., Marquis, J. F., Nasmith, J., Fung, A. Y., Boudreault, J. R., Delage, F., Dupuis, R., Kells, C., Bokslag, M., Steiner, B., Rapold, H. J. Platelet membrane receptor glycopro­ tein IIb/IIIa antagonism in unstable angina. The Canadian Lamifiban Study. Circulation 94 (1996) 899-905
4. Coller, B. S., Lang, D., Scudder, L. E. Rapid and simple platelet function assay to assess glycoprotein IIb/IIIa receptor blockade. Circulation 95 (1997) 860-67
5. Channing-Rodgers, R. P., Levin, J. A critical reappraisal of the bleeding time. Semin Thromb Haemost 16 (1990) 1-20
6. Mascelli, M. A., Lance, E., Mack, S., Weisman, H., Schaible, T., Jordan, R. Rapid assessment of platelet inhibition using a modified whole blood aggre­ gometer (Aggrestat) in PTCA patients receiving ReoPro. J Am Coll Cardiol 27 (1996) 361
7. Greilich, P. E., Alving, B. M., O'Neill, K. L., Chang, A. S., Reid, T. J. Modified thromboelastography: a rapid, simple method for monitoring c7E3 Fab in he­ parinized patients. Blood 86 (1995) 545
8. Kundu, S., Heilmann, E., Sio, R., Garcia, C., Ostgaard, R. Characterization of the platelet function analyzer, PFA-100TM
. Thromb Haemost 73 (1995) 1061
9. Breddin, H. K., Brreddin, H., Kirchmaier, C. M., Keppler, S. Methods to monitor the effects of the glycoprotein IIb/IIIa inhibitors and their interaction with other antithrombotic agents. Thromb Haemost 73 (1995) 1446
10. Coller, B. S., Scudder, L. E., Beer, J., Gold, H. K., Folts, J. D., Cavagnaro, J., Jordan, R., Wagner, C., Iuliucci, J., Knight, D., Ghrayed, J., Smith, C., Weisman, H., Berger, H. Monoclonal antibodies to platelet gpIIb/IIIa as anti­ thrombotic agents. Ann N Y Acad Sci 614 (1991) 193-213
11. Wagner, C. L., Mascelli, M. A., Neblock, D. S., Weisman, H. F., Coller, B. S., Jordan, R. E: Analysis of gpIIb/IIIa receptor number by quantification of 7E3 binding to human platelets. Blood 88 (1996) 907-914
12. Anderson, D. R., Zayed, E., Embree, J., Theroux, P., Steiner, B. Flow cy­ tometry as a quantitative measure of the antiplatelet activity of a glycoprotein IIB/IIIA inhibitor. Blood 86 (1995) 893a
13. Besson, I., McGregor, M. C. Effect of antagonists on gpIIb/IIIa receptor occupancy: Use of a whole blood flow cytometry assay. Thromb Haemost Suppl (1997) 664
14. Faraday, N., Goldschmidt-Clermont, P., Dise, K., Bray, P. F. Quanatitation of soluble fibrinogen binding to platelets by fluorescence-activated flow cyto­ metry. J Lab Clin Med 123 (1994) 728-740
15. Coller, B. S., Springer, K. T., Scudder, L. E., Kutok, J. L., Ceruso, M., Prest­ wich, G. D. Substituting isoserine for serine in the thrombin receptor activating peptide SFLLRN confers resistance to aminopeptidase M-induced cleavage and inactivation. J Biol Chem 268 (1993) 20741-20743

Claims (16)

1. Assay-kit für die Verwendung in der Durchflußzytometrie zur Analyse der Fibrinogenrezepterblockade durch therapeutisch eingesetzte Fibrinogenrezeptor­ antagonisten, bestehend aus
  • a) einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptorantagonisten wie monoklonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklonaler Anti­ körper oder lineare oder zyklische. Peptide oder nicht-peptidische Reptorantagonisten oder Aptamere und
  • b) einem kompetitiven fluoreszenzmarkierten Fibrinogenrezeptoranta­ gonisten wie monoklonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklo­ naler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-pep­ tidische Reptorantagonisten oder Aptamere.
2. Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenrezeptorblockade auf Throm­ bozyten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kompetition eines fluores­ zenten Substrates mit einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenre­ zeptorantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor die quantita­ tive und selektive Analyse der Fibrinogenrezeptorblockade dergestalt er­ möglicht, daß
  • a) als kompetitives fluoreszenzmarkiertes Substrat monoklonale Anti­ körper oder Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-peptidische Rezeptorantagonisten oder Aptamere verwendet werden, die in an sich bekannter Weise mit einem kommerziellen Fluoreszenzmarkierungskit mit einem in der Durchflußzytometrie üblichen Fluoreszenzfarbstoff wie Fluorescein­ isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), energy coupled dye (ECD), PerCP®, Phycoerythrin-Cyan 5 (PE-Cy5) oder Allophycocyanin (APC) markiert sind,
  • b) als therapeutisch eingesetzter Fibrinogenrezeptorantagonist mono­ klonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-peptidische Reptor­ antagonisten oder Aptamere eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) dem Patienten Blut entnommen wird,
  • b) das Vollblut auf eine Zahl von 10.000 Thrombozyten/µl eingestellt wird,
  • c) ein Teil des verdünnten Vollblutes unstimuliert mit einer sättigenden Konzentration des fluoreszenzmarkierten Substrates inkubiert wird und nachfolgend der Fluoreszenzwert der unstimulierten Probe er­ mittelt wird,
  • d) ein anderer Teil des verdünnten Vollblutes, der die gleiche Anzahl von Thrombozyten enthält, mit einem starken, proteaseresisten Ago­ nisten stimuliert wird und der Fluoreszenzwert nach anschließender Inkubation mit einer sättigenden Konzentration des fluoreszenzmar­ kierten Substrates gemessen wird,
  • e) ein dritter Teil des verdünnten Vollblutes, der die gleiche Anzahl von Thrombozyten enthält, in vitro mit dem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptörantagonisten versetzt wird,
  • f) die Thrombozyten in den drei Volumina nach gleicher Methodik iden­ tifiziert werden,
  • g) aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten die therapeutisch blockierten bzw. blockierbaren Fibrinogenrezeptoren rechnerisch be­ stimmt werden,
  • h) nachdem die gemessene Fluoreszenzintensität der Thrombozyten in die Anzahl gebundener Fluoreszenzmoleküle umgerechnet wird, was nach Kalibrierung des Gerätes mit fünf verschieden fluoreszenten Beadpopulationen gelingt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Einstellen auf 10.000 Thrombozyten/µl durch Verdünnen mit Pufferlösung wie phoshatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder mit Hanks Balanced Salts (HBSS) bei pH 7,4 mit einem Gehalt von 1 mg/ml humanem Im­ munglobulin G erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der maximale Fluoreszwert der unstimulierten Probe den Nullwert der Rezeptorblocka­ de darstellt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulie­ rung der Thrombozyten mit einem proteaseresistenten starken Agonisten wie TRAP-6 mit N-terminaler Substitution von Serin durch Isoserin er­ folgt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der maximale Fluoreszwert der stimulierten Probe den Nullwert der Rezeptorblockade bei maximal stimulierten Thrombozyten darstellt.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem the­ rapeutisch eingesetzten Fibrinogerezeptorantagonisten die Fibrinogenre­ zeptoren blockiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 3 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß der the­ rapeutisch eingesetzte Fibrinogerezeptorantagonist in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß seine Endkonzentration dem Doppelten der zur Therapie zugelassenen Medikamentendosis entspricht.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifi­ zierung der Thrombozyten dergestalt erfolgt, daß der jeweiligen verdünn­ ten Vollblutprobe ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Antikörper in sättigender Konzentration zugesetzt wird, der eine räumlich weit von der Fibrinogenbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors er­ kennt und mit einem anderen Fluoreszfarbstoff als das kompetitve Sub­ strat markiert ist.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem the­ rapeutisch eingesetzten Fibrinogerezeptorantagonisten die Fibrinogenre­ zeptoren blockiert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 3 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß der the­ rapeutisch eingesetzte Fibrinogerezeptorantagonist in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß seine Endkonzentration dem Doppelter der zur Therapie zugelassenen Medikamentendosis entspricht.
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifi­ zierung der Thrombozyten dergestalt erfolgt, daß der jeweiligen verdünn­ ten Vollblutprobe ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Antikörper in sättigender Konzentration zugesetzt wird, der eine räumlich weit von der Fibrinogenbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors er­ kennt und mit einem anderen Fluoreszfarbstoff als das kompetitve Sub­ strat markiert ist.
14. Verfahren nach Anspruch 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als monoklonale Antikörper die Klone SZ21 oder gleichwertige andere einge­ setzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Fluoreszenzfarbstoffe dergestalt ausgewählt werden, daß sie sich in ihren Emissionsbereichen nicht wesentlich überlappen.
16. Verfahren nach Anspruch 3, 10 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzfarbstoffpaare FITC mit PE-Cy5 oder FITC mit PerCP oder PE mit PE-Cy5 oder PE mit PerCP verwendet werden.
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