DE3688637T2 - Löslicher Interleukin-2-Rezeptor als Anzeiger eines bösartigen Tumors und Verfahren zu dessen Nachweis. - Google Patents
Löslicher Interleukin-2-Rezeptor als Anzeiger eines bösartigen Tumors und Verfahren zu dessen Nachweis.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf einen löslichen Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R) und ein Verfahren zu seinem Nachweis bzw. zur Bestimmung seines Gehalts. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Entdeckung des löslichen IL-2R in der menschlichen Körperflüssigkeit als ein Ergebnis eines bösartigen Tumors.
- Der Ligand Interleukin-2 (IL-2) und sein Rezeptor (IL-2R) sind, für sich genommen, gut bekannte Gebilde. Interleukin-2 oder T-Zellen-Wachstumsfaktor, wie es manchmal genannt wird, ist ein Lymphokin, hergestellt und abgesondert von lectin- oder antigenaktivierten T-Zellen. Die biologischen Aktivitäten des IL-2, über die berichtet wurde, schließen die Stimulation eines langfristigen in vitro-Wachstums aktivierter T- Zellklone, die Induktion zytotoxischer T-Zellreaktivität und ähnliches ein. Es wird vermutet, daß IL-2 seine biologischen Wirkungen durch Wechselwirken mit speziellen Rezeptoren mit hoher Affinität (IL-2R) auf der Oberfläche der aktivierten T- Zellen ausübt.
- Ein Verfahren unter Anwendung eines quantitativen "Sandwich"-ELISA mit monoklonalen Antikörpern zur Messung des löslichen IL-2R wurde von Rubin et al entwickelt und in der Federation Proceedings [Band 44, Nr.4, 5. April 1985, 5.946 Nr. 3131] veröffentlicht.
- Im Gegensatz zu Hormon-vermittelten Systemen ist die zelluläre Aktivierung eine Voraussetzung für die Induktion sowohl des Liganden (IL-2) als auch seines Rezeptors (IL-2R), wobei der letzere in einer zeitabhängigen und heterogenen Weise schnell an der Zelloberfläche exprimiert wird (Centrall, et al, Science, 244 : 1312-1316, 1984).
- Wenn bestimmte menschliche Zellen stimuliert oder anderweitig aktiviert werden, produzieren und exprimieren sie auf ihren Zelloberflächen neu synthetisierte Moleküle und sie setzen diese Moleküle auch in löslicher Form frei. Somit kann der Nachweis dieser Moleküle, die nicht von ruhenden oder nicht-aktivierten Zellen exprimiert werden, als Indikator oder "Fußabdruck" zellulärer Aktivierung dienen. Wie hierin nachstehend detaillierter beschrieben werden wird, wurde entdeckt, daß bei bestimmten bösartigen Tumorerkrankungen, besonders bei bösartigen lymphoretikulären Tumoren IL-2R in löslicher Form hergestellt wird und in der Körperflüssigkeit zirkuliert.
- Bis 1985 war die Messung der IL-2-Rezeptoren (IL-2R) auf die Beurteilung des zellassoziierten IL-2R mittels einer Vielfalt immunologischer Techniken, die verschiedene monoklonale Antikörper gegen den menschlichen IL-2R einbezogen, beschränkt. Über die Beobachtung einer löslichen oder freigesetzten Form dieses Moleküls wurde bisher nichts berichtet. Deshalb wurde dieses lösliche Molekül niemals in einer Körperflüssigkeit gemessen. Deshalb ist die Entdeckung eines löslichen IL-2R-Moleküls in Menschen mit bestimmten Leiden eine neue Entdeckung.
- Bezüglich des zellassoziierten IL-2R wurde die quantitative Messung des IL-2R durch Bindung des monoklonalen Antikörpers, gefolgt von einer zellulären Analyse mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortiervorrichtung (Zellsorter) (FACS) oder einer ähnlichen Maschine (Kosten ungefähr $ 80.000 -200.000) verwirklicht. Solch eine Analyse liefert Informationen über die Zahl der den Rezeptor exprimierenden Zellen, und die Menge an gebundenem Antikörper, liefert aber keine quantitative Abschätzung der Zahl an Rezeptoren. Letzteres kann mit einem Nachweis erreicht werden, der radioaktiv markiertes Monoklonales mit bekannter spezifischer Aktivität verwendet. Solche Tests sind jedoch langwierig und erfordern Radionuklide, was Sicherheits- und Entsorgungsprobleme aufwirft.
- Im Gegensatz dazu ist das erfindungsgemäße "Enzyme- Linked-Immunosorbent Assay"-Nachweisverfahren (ELISA) für den IL-2R, wie es hier detaillierter beschrieben wird, quantitativ, schnell, empfindlich, billig und verwendet anstelle der Radioaktivität Enzym, um den IL-2R nachzuweisen. Die notwendigen Reagenzien könnten in ein ziemlich kleines Gehäuse oder eine Ausstattung gepackt werden und würden eine "Gebrauchsfähigkeitsdauer" von ungefähr einem Jahr aufweisen. Das Instrument, das notwendig ist, um den Nachweis bzw. die Gehaltsbestimmung zu "lesen", kann ein einfaches Spektrophotometer, das in praktisch jedem klinischen Hospitallabor verfügbar ist, sein. Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Verfahren, wurde dieser Festphasen-Immunnachweis auch mit monoklonalen Antikörpern (7G7/B6), die mit alkalischer Phosphatase konjugiert waren, direkt durchgeführt, anstelle des mit dem FITC konjugierten 7G7/B6 und des mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-Anti-FITC.
- Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Überwachung, zum Nachweis oder zum Screenen solch bösartiger Zustände im Menschen zur Verfügung zu stellen, in denen dem Spiegel an löslichem IR-2R in der Körperflüssigkeit einen indikativen Index wiedergibt.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Ausstattung zur Verfügung zu stellen, die verschiedene Bestandteile des vorliegenden Sandwich-ELISA zum Nachweis bzw. der Gehaltsbestimmung des löslichen IL-2R, insbesondere im menschlichen Plasma oder Serum, enthält.
- Andere Aufgaben und Vorteile werden in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung deutlich werden.
- Diese und andere Aufgaben, Merkmale und viele der mit der Erfindung einhergehenden Vorteile werden durch das Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher werden, wobei:
- Fig. 1 zeigt schematisch verschiedene Schritte des ELISA für löslichen menschlichen IL-2R;
- Fig. 2 zeigt Serum-IL-2R-Spiegel in normalen Patienten und in Patienten mit verschiedenen bösartigen Tumorerkrankungen.
- Fig. 3 zeigt die Empfindlichkeit des ELISA für den Nachweis von zellulärem und Überstands-IL-2R. Eine IL-2 abhängige T-Zell-Linie wurde mit IL-2 stimuliert und der Kultur-Überstand ( ) und die mittels eines Detergens solubilisierten Zellen ( ) mittels ELISA analysiert. Die Extinktion bei 405 nm bezog sich auf die Anzahl an Zellen, aus denen sich der Zellextrakt und der Überstand ableiteten.
- Fig. 4 zeigt aktivierende Stimuli und die Kinetik der zellulären (A) und Überstands (B)-IL-2R-Erzeugung. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden in vitro mit Medium (O), PHA ( ), OKT3 ( ), Tetanus-Toxoid ( ) oder allogenen Zellen ( ) über verschiedene Zeiträume hinweg gezüchtet, und der Überstands- und zelluläre IL-2R ermittelt. Die Ergebnisse stellen die Einheiten an IL-2R pro 106 gezüchteter PBMC dar;
- Fig. 5 zeigt, daß die Herstellung des löslichen IL-2R eine de novo-Proteinsynthese erfordert, aber keine Zellproliferation. Periphere mononukleäre Blutzellen wurden mit PHA ohne weitere Behandlung ( ) oder gefolgt von einer Bestrahlung mit 3000 R ( ) oder in Gegenwart von 25 g/ml Cycloheximid ( ) stimuliert. Sowohl zellulärer (A), als auch Überstands-IL-2R (B) wurde ermittelt. Die Ergebnisse stellen die Einheiten an IL-2R pro pro 10&sup6; gezüchteter PBMC dar;
- Fig. 6 zeigt die Abschätzung des Molekulargewichtes des löslichen IL-2R mittels Sephadex® G-20 Gelfiltration. Konzentrierte überstehende Flüssigkeit aus einer IL-2 abhängigen T-Zell-Linie wurde durch eine kalibrierte Sephadex® G-200 Kolonne gesiebt und die Menge an IL-2 in den Fraktionen durch ELISA ermittelt; und
- Fig. 7 zeigt die Bestimmung des Molekulargwichts des löslichen IL-2 durch NaDodSO&sub4;-PAGE. Überstands-IL-2 aus HUT 102B2 wurde zuerst durch eine normale Maus-IgG2a-Sepharose® 4B-Kolonne und dann über eine monoklonale Anti-IL-2(7G7/B6)- 4B-Kolonne geleitet. Die 7G7/B6-Kolonne wurde ausgiebig mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und dann mit 10 ml 0,2 M Glycin-HCl eluiert. Das eluierte Protein wurde gefriergetrocknet, in 300 ul destilliertem Wasser resuspendiert, und 25 ul davon auf einem 12,5%-igen NaDodSO&sub4;- Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen analysiert, gefolgt von einer Silberbeizung. (Molekulargewichtsmarkierungssubstanzen: Ovalbumin-- 43.000; Carbonatanhydratase-30.000.)
- Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch ein billiges, schnelles, empfindliches und quantitatives Nachweisverfahren zur Ermittlung der Anwesenheit des löslichen IL-2-Rezeptors in einer Probe gelöst, das einen monoklonalen Antikörper umfaßt, der eine spezielle Bindungsaffinität für ein Epitop des Rezeptors aufweist, wobei besagtes Epitop sich von der IL-2-Bindungsstelle und von einer Heteroantikörper- Bindungsstelle des Rezeptors unterscheidet.
- Obwohl alle Materialien und Verfahren, die ähnlich oder gleich den nachstehend beschriebenen Materialien und Methoden sind, beim Testen oder in der erfindungsgemäßen Praxis verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Materialien und Verfahren beschrieben.
- Ausgangsmaterial der normalen Zellen und Zell-Linien: Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden mittels auf diesem Gebiet der Technik wohlbekannter Standardverfahren aus normalem, heparinisiertem venösem Blut hergestellt. IL-2 abhängige Zell-Linien wurden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt und aufbewahrt. Die HTLV positive T-Zell-Linie HUT 102B2 ist gut charakterisiert (Poeisz et al, Nature 294, 268- 271, 1981) und wurde von Dr. N. Goldman, NIH, Bethesda, MD, zur Verfügung gestellt. Die T-Zell-Linien MOLT-4, CEM, und JURKAT (Uchivama, et al, J. Immunol. 126, 1393-1397, 1981 und Robb et al, J. Exp. Med. 160, 1126-1146, 1984), wie auch die mittels des menschliche Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierten B-lymphoblastoiden -Linien wurden von Dr. R. Quinones, NIH, Bethesda, MD, zur Verfügung gestellt. Die Prae- B-Zell-Linien NALM-1 und NALL-1 (Korsmever et al, J. Clin. Invest. 71, 301-313, 1983) und die B-Zell-Linien NU-DHL1 und SU-DHL6 (Winter, et al, Blood 63, 140-146, 1984) wurden von Dr. S. Korsemeyer von NIH, Bethesda, MD, erhalten. Ein zweiter monoklonaler Antikörper gegen den IL-2R, Anti-Tac genannt, wie von Uchivama et al s. vorstehend, beschrieben, wurde von Dr. T. Waldmann, NIH, Bethesda, MD, erhalten.
- Kultur-Stimulantien: Phytohaemagglutinin (PHA/GIBCO) wurde in einer Endverdünnung von 1/200 (v/v) verwendet, gereinigtes OKT-3 mit 10 ng/ml, Tetanus-Toxoid (Massachusetts Dept. of Public Health) in einer Endkonzentration von 6 Lf- Einheiten/ml, und Pokeweed Mitogen (PWM/Gibco) in einer Endverdünnung von 1/100 (v/v).
- Zellen und Zellkulturen: PHA-aktivierte Lymphoblasten aus normalen Individuen wurden in einer Massenkultur durch die Zugabe von 10 ml peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) mit 1·10&sup6; Zellen/ml, die in Medium 1640, das 5% hitzeinaktiviertes (56ºC, 30 Minuten) fetales Kälberserum (FCS) (Gibco) enthielt, suspendiert waren, zu Gewebekulturflaschen (Costar #3275, Cambridge, MA) mit PHA (Gibco) in einer Endverdünnung von 1/200 (v/v) hergestellt, und für 72 Stunden in einer angefeuchteten 5%igen CO-Luftatmosphäre bei 37ºC inkubiert. Mit Concanavalin A (Con A) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) stimulierte PBMC wurden in identischer Weise mit 10 ug/ml von Con A hergestellt. Lymphoblastoide B-Zell-Linien stammten aus normalen, mit dem B95-8-Stamm des Epstein-Barr- Virus transformierten PBMC. Die HTLV-1 positive T-Zell-Leukämielinie, HUT 102B2 wurde in vitro durch Serienpassage durch ein mit Antibiotika supplementiertes RPMI 1640, das 10% FCS und hinzugefügtes Gentamycin (50 ug/ml, Schering Corp. Kennelworth, NJ) enthielt, aufbewahrt. Eine IL-2 abhängige T-Zell-Linie wurde aus 72 Stunden-PHA-Lymphoblasten durch Resuspendieren der Zellen bei 1·10&sup6; Zellen/ml in mit Antibiotika supplementiertem 1640-Medium mit 5% FCS und 10% (v/v) lectinfreiem IL-2 (Cellular Products, Buffalo, NY) und Rekultivierung für zwei Passagen von jeweils 3-5 Tagen, hergestellt. Die Ansprechbarkeit solcher Zellen auf IL-2 und die Inhibierung der durch IL-2 induzierten Vermehrung durch 7G7/B6 oder Anti- Tac wurde durch Inkubation von 50·10³ Zellen in 200 ul Medium in vierfacher Ausfertigung in den Löchern von 96-Loch- Mikrotiterplatten (Costar #3596) für 72 Stunden, mit oder ohne zugegebenem IL-2 und äquivalenten Konzentrationen an 7G7/B6 oder Anti-Tac getestet. Die Kulturen wurden mit 1 uCi aus ³H- Thymidin (New England Nuclear, Boston, MA, 20 Ci/mmol) die letzten 4 Stunden der Kultivierung pulsmarkiert. Die Beurteilung der proliferativen und der zytotoxischen Antworten der gemischten Leucozytkulturen (MLC) in An- oder Abwesenheit von 7G7/B6 wurde, wie von Uchivama, et al, J. Immunol. 126 : 1398, 1981 beschrieben, durchgeführt. Zusätzlich wurden unbehandelte allostimulierte Zellen mit 7G7/B6 oder Anti-Tac beschichtet und unter Verwendung von Sephadex® G-200 Anti-Maus Fab-Kolonnen, wie von Uchivama, et al (s. vorstehend) beschrieben, in positive und negative Populationen getrennt. Diese getrennten Zellen wurden dann auf eine zytotoxische Effektorwirkung, wie von Uchivama, et al, (s. vorstehend), beschrieben, getestet. T-Zellen und Nicht-T-Zellen wurden mittels AET-behandeltem Schafserythrozyten-Rosettentest, wie von Tosato, et al NEJM 301 : 1133, 1979 beschrieben, getrennt.
- Stimulierte Kulturen: Kulturen, die mit PHA oder OKT-3 stimuliert wurden, enthielten 5·10&sup5; Zellen in 2 ml RPMI 1640 mit 10% hitze-inaktiviertem, fetalem Kälberserum (FCS), ergänzt mit Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 ug/ml. Mit PWM stimulierte Kulturen enthielten 2·10&sup6; Zellen in 2 ml des gleichen Mediums. Mit Tetanus-Toxoid oder allogenen Zellen stimulierte Kulturen enthielten 3·10&sup6;, beziehungsweise 2·10&sup6; Zellen/Kultur in 2 ml des gleichen Mediums, das 10% menschliches Pool-Plasma enthielt. Allogene Kulturen bestanden aus 1·10&sup6; Responder-PBMC und 1·10&sup6; bestrahlten (3000R) Stimulator-PBMC. Dreifach-Replikatkulturen wurden in 24- Lochplatten (Costar, Cambridge, MA) eingebracht und bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO&sub2; und Luft inkubiert. Die Kulturen wurden zu verschiedenen Zeiten geerntet, die Replikate in einen Pool eingebracht und zentrifugiert (400·G·10min), um die Zellen und die überstehende Flüssigkeit zu trennen. Die Proteinase- Inhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid (2 mM) und Tosylamid- 2-phenylethylchlormethylketon (150 ug/ml) wurden den überstehenden Flüssigkeiten hinzugefügt. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 25 mM Tris-gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 1% Triton X-100 und Proteinase- Inhibitoren enthielt, lysiert. Überstehende Flüssigkeit und Zellextrakte wurden bis zum Gebrauch bei -20ºC aufbewahrt.
- Monoklonale Antikörper: Herstellung des monoklonalen Antikörpers 7G7/B6. BalbC/J-Mäuse (Jackson Labs. Bar Harbor, ME) wurde intraperitoneal und subkutan mit 20·10&sup6; A/Hong Kong- Influenzavirus stimulierten PBMC zweimal, im Abstand von 30 Tagen geimpft, gefolgt von einer intravenösen Injektion mit 14·10&sup6; Zellen einen Monat später. Eine Woche nach der dritten Injektion wurden Immun-Milzzellen mit SP2/0-Zellen gemäß dem Verfahren von Ozat, et al, J. Immunol. 124 : 533, 1980 verschmolzen. Überstehende Flüssigkeiten der Hybridomkultur, gescreent durch Komplement vermittelte Zellyse, die Antikörper herstellten, die an durch Phytohaemagglutinin (PHA) stimulierte Lymphoblasten, aber nicht an B-lymphoblastoide Zellen des Spenders der influenza-stimulierten PBMC banden, wurden ausgewählt und in Mikrotiterlöchern auf einer Feeder- Schicht aus Rattenfibroblasten bei 0,3 Zellen/Loch geklont. Ein schnellwachsender Klon, der große Mengen eines IgG2a- Antikörpers herstellte, wurde ausgewählt und als 7G7/B6 bezeichnet. Das Hybridom, das diesen monoklonalen Antikörper herstellte (7G7/B6), wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter Zugangs-Nr. HB 8784 deponiert. Ein monoklonaler Anti-HLA-A und -B Framework-Antikörper der IgG2a-Unterklasse wurde von den Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, gekauft. Teilweise gereinigtes 7G7/B6 wurde aus Ascites mittels Chromatographie auf Sepharose 4 gebundenem Staphylococcus-Protein A (Pharmacia Chemicals, Piscataway, NJ) hergestellt, wie von Ev, et al, Immunochem. 15 : 429, 1978, beschrieben. Kaninchen-Anti-Mensch- Heteroantikörper werden unter Verwendung von gereinigtem IL-2R als Immunogen nach Standardverfahren hergestellt (Leonard, et al, Nature, 311 : 626-631, 1984).
- Zytofluorimetrische Analysen des Bindungsmusters des 7B7/B6 für sowohl die ruhenden als auch die aktivierten PBMC wurden durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung eines mit Fluoresceinisothiocyanats (FITC) konjugierten F(ab')2-Fragmentes eines Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörpers (N.L. Cappell Labs, Cochranville, PA) gemäß Routineverfahren ausgeführt.
- Die kompetitive Bindung des 7G7/B6 oder Anti-Tac an aktivierte Zellen wurde unter Verwendung biotinylierter Formen des monoklonalen Antikörpers, wie von Titus, et al, J. Immunol. Methods, 50 : 193, 1982 beschrieben, ermittelt. PHA- aktivierte PBMC wurden zuerst bei 4ºC mit unmarkiertem 7G7/B6 oder Anti-Tac bei einer bekannten Sättigungsdosis inkubiert, mit kaltem Medium gewaschen und mit der biotinylierten Form entweder des selben oder eines anderen monoklonalen Antikörpers für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden mit kaltem Medium gewaschen und mit 25 ul einer 1/40- Verdünnung eines FITC-modifizierten Avidin (Sigma) für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, zweimal gewaschen und auf dem FACS analysiert.
- Die Fähigkeit des IL-2, die Bindung der Antikörper gegenüber den aktivierten Zellen zu blockieren, wurde durch Inkubierung von 1·106 PHA-aktivierten PBMC für 1 Stunde bei 4ºC in einem Endvolumen von 100 ul von verschiedenen Konzentrationen des immunoaffinitäts-gereinigten IL-2 (Robb, et al, Proc, National Academy of Sciences, USA, 80 : 5990, 1983) bewertet. Subsättigende Dosen von biotinylierten Antikörpern wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, gefolgt vom zweimaligen Waschen in kaltem Medium, wie vorstehend mit FITC-Avidin angefärbt, und auf dem FACS analysiert.
- ¹²&sup5;I-Zelloberflächenmarkierung: Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) wurde mit 25 mM Tris (BRL) in Dulbecco's PBS (Gibco) bei einem pH-Wert von 7,4, zu dem 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 150 ug/ml L-1-Tosylamid-2- phenylethylchlor-methylketon (Sigma) hinzugefügt wurden, hergestellt. Der Lyse-Puffer bestand aus TBS mit 1% Triton®X-100 (RPI Elk Grove, IL). Ungefähr einhundert Millionen PHA-aktivierte PBMC- oder HUT 102B2-Zellen wurden gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert und die Oberfläche mit 10 ul ¹²&sup5;I (Na-Salz, 100 mCi/ml, Amersham, Arlington Hts., IL) mittels einer durch Lactoperoxidase (Sigma) katalysierten Iodierungsreaktion, wie von Ledbetter et al, J. Exp. Med. 153 : 310, 1981, beschrieben, radioaktiv markiert. Markierte Zellen wurden bei einer Konzentration von 10·10&sup6; Zellen/ml mit Lyse-Puffer solubilisiert und der Überstand wurde nach der Zentrifugierung erhalten. 1 ml aliquote Teile des Überstands wurden mit 2 ug 7G7/B6 oder Anti-HLA für 2 Stunden bei 4ºC inkubiert, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation bei 4ºC mit gewaschenem 10%igen Staphylococcus aureus (Cowan, Stamm 1, ATCC 12598, Rockville, MD). Die Suspensionen wurden zentrifugiert und die Immunpräzipitate fünfmal gewaschen und dann für 2 Minuten in 25 u 62,5 mM Tris-HCl mit 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 10% Glycerin, 5% Beta- Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau (alle von Sigma) zum Sieden erhitzt. Nach dem Pelletieren der Staphylococci wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und auf einem 12,5% SDS- Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, gefolgt von einer audiographischen Analyse mittels Standardverfahren.
- Ungefähr hundert Millionen HUT 102B2-Zellen wurden einmal in methioninfreiem RPMI 1640 (NIH Medium-Einheit), das 2% dialysiertes FCS enthielt, gewaschen und in dem selben Medium auf 10·10&sup6; Zellen/ml für 1 Stunde bei 37ºC resuspendiert. Die Zellen wurden pelletiert, in dem selben Medium auf 1·10&sup6; Zellen/ml resuspendiert und mit 250 uCi/ml ³&sup5;S-Methionin (1315 Ci/mmol, Amersham) für 30 Minuten gepulst. Die Zellen wurden pelletiert und auf 2·10&sup6; Zellen/ml in RPMI 1640, das überschüssiges (500fach) unmarkiertes Methionin (Gibco) enthielt, verdünnt. Die Inkubation der Kulturen wurde fortgesetzt und in Intervallen von 1, 2, 4, 8 und 22 Stunden wurden aliquote Teile mit 2·10&sup7; Zellen entfernt und in einem 10fachen Volumen an PBS (4ºC), das 50 ug/ml Cycloheximid (Sigma) enthielt, verdünnt. Jedes Aliquot wurde pelletiert und in der gleichen Weise lysiert wie die Zellen, die einer radioaktiven Markierung der Oberfläche unterzogen wurden. Vor der Immunpräzipitation mit 7G7/B6 oder Anti-Tac wurden die Proben zuerst mit Anti-HLA vorgereinigt. Anti-HLA-, 7G7/B6- und Anti-Tac-Immunpräzipitate wurden wie vorstehend auf SDS- Polyacrylamidgelen analysiert.
- Kreuz-Klärungs-Studien: Sequentielle Immunpräzipitationen wurden sowohl auf beiden Oberflächen als auch von biosynthetisch markierten HUT 102B2-Zellen durchgeführt. Aliquote Teile wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und zuerst mit Anti-HLA oder 7G7/B6 oder Anti-Tac immunpräzipitiert. Die überstehenden Flüssigkeiten dieser Immunpräzipitate wurden entfernt und dann entweder mit der gleichen oder einem dazu alternativen monoklonalen Antikörper (Mab) immunpräzipitiert. Eine optimale Dosierung an Mab wurde in diesen Studien für die Praeabsorption und die nachfolgende Immunpräzipitation verwendet, um die Identifizierung jedes verbleibenden Proteins, das vom Mab präzipitiert werden könnte, sicherzustellen. Für die sequentiellen Immunpräzipations-Studien der biosynthetisch markierten Zellen wurden Experimente sowohl zu einem frühen (< 30 Minuten) als auch einem späten (> 8 Stunden) Zeitpunkt in einer Puls-Studie durchgeführt.
- Für den ELISA zum Nachweis von löslichem IL-2R wurden alternierende Reihen der inneren 60 Löcher der Immulon-1-96- Loch-Flachbodenmikrotiterplatte (Dynatech) über Nacht mit 150 ul gereinigtem Anti-Tac bei 1 ul/ml in Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 oder Carbonatpuffer alleine, als eine Hintergrundskontrolle, beschichtet. Es sollte hier bemerkt werden, daß ein Heteroantikörper, wie Kaninchen-Anti-IL2- Rezeptorantikörper auch anstelle des Anti-Tac verwendet werden kann. Tatsächlich liefert die Verwendung von Heteroantikörper einen umfassenderen und wünschenswerteren Nachweis. Nach dem Waschen wurden 100 ul von verschieden verdünnten Proben zu den beschichteten und den Kontroll-Löchern gegeben, für 2 Stunden inkubiert, gewaschen und 100 ul eines 1/4.000 verdünnten FITC- konjugierten 7G7/B6-Antikörpers in phosphatgepufferter Salzlösung, die 1% FCS enthielt, zu allen Löchern hinzugefügt. Nach zwei Stunden zusätzlicher Inkubation wurden die Platten gewaschen und 100 ul einer 1/1.000 Verdünnung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-Anti-Tac wurde hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen, 100 ul p-Nitrophenylphosphat (Sigma/l mg/ml) hinzugefügt, und die Extinktion der Löcher bei 405 nm unter Verwendung eines Titertek-ELISA-Lesegeräts (Flow-Laboratories) nach 30 Minuten ermittelt. Der ELISA für das IgM wurde wie von Yarchoan, et al (J. Immunol. 127, 1958-1964, 1981) beschrieben, durchgeführt. Die Spezifität des ELISA für lösliches IL-2R wurde durch Beschichten der Platten mit Puffer alleine, Anti-IgM, und einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper ermittelt. Diese Löcher erhielten dann den Überstand vom 12ten Tag der PWM-aktivierten PBMC, gefolgt entweder von FITC-konjugiertem Anti-IgM (Yarchoan, et al. Immunol. 132, 2696 - 22699, 1984) oder alternativ dazu von FITC-konjugiertem 7G7/B6 (Rubin et al, Hybridoma, 1985) und schließlich Kaninchen-Anti-FITC, wie vorstehend beschrieben.
- Verfahren: Die Löcher einer Polyvinyl-Mikrotiterplatte mit 96 Löchern (Cooke) wurden über Nacht mit 150 ul einer Lösung des monoklonalen Antikörpers 7G7/B6, der in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 mit 1 ug/ml suspendiert war oder mit 150 ul eines Carbonatpuffers alleine, beschichtet. Die Löcher der Platte wurden gewaschen und 100 ul von verschiedenen Konzentrationen an mit Detergens löslichgemachten Zellextrakten oder zellfreier Kulturüberstände von den gleichen Zellen wurden zu den beschichteten und unbeschichteten (Kontroll-Löcher) in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt. In diesem Experiment wurden tonsilläre mononukleäre Zellen für 72 Stunden in vitro mit Phytohaemagglutinin aktiviert. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit Puffer gewaschen. (Die verwendeten Puffer und Verdünnungsmittel sind die gleichen, wie diejenigen, die für den Sandwich-ELISA angewendet wurden). Jedes Loch erhielt dann 20.510 cpm an tritium-markiertem Anti-Tac, hergestellt wie beschrieben von Leonard, et al (Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 6957-6961, 1983) in einem Volumen von 100 ul. Nach einer zusätzlichen zweistündigen Inkubation wurden die Platten gewaschen, getrocknet und einzelne Bohrungen wurden aus der Platte ausgeschnitten. Die Bohrungen wurden in Szintillationsfläschchen zusammen mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit (Ultrafluor) eingebracht und die in den Bohrungen gebundene Radioaktivität durch Flüssigkeits- Szintillationsspektroskopie ermittelt. In allen Fällen betrug die Menge an Radioaktivität in den Löchern, die mit dem Carbonatpuffer alleine beschichtet waren, weniger als 160 cpm.
- Molekulargewichtsbestimmung: Eine Sephadex G-200 Gelfiltration wurde unter Verwendung des konzentrierten (10·) Überstands einer IL-2-abhängigen Zell-Linie durchgeführt. Nach der Molekularsieb-Auftrennung wurden die einzelnen Fraktionen (2,5 ml) gefriergetrocknet, in 100 ul destilliertem Wasser resuspendiert und dem ELISA-Nachweistest unterzogen, um den IL-2R-Gehalt zu bestimmen. Kontroll- und 7G7/B6- Immunaffinitätskolonnen wurden durch Kopplung von entweder normalem Maus-IgG2a oder gereinigtem 7G7/B6 an mit Cyanbromid aktivierter Sepharose 4B (Phramacia) hergestellt. 600 ml Überstand von HUT 102B2-Kulturen wurden konzentriert und zuerst über eine 4B-Kolonne mit normaler Maus-IgG2a-Sepharose geleitet, gefolgt von einem Durchleiten über eine 4B-Kolonne mit 7G7/B6-Sepharose. Das an die letztere Kolonne gebundene Material wurde mit einem kleinen Volumen an 0,2 M Glycin-HCl mit einem pH-Wert von 2,5 eluiert, gegen PBS dialysiert, gefriergetrocknet und in 300 ul destilliertem Wasser resuspendiert. 25 ul dieses konzentrierten Materials wurde mittels einer Natrium-Dodecylsul fat-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (Na-Dod-SO&sub4;PAGE) analysiert.
- Wie in Fig. 3 gezeigt, weisen die Ergebnisse darauf hin, daß der IL-2R in den zellassozierten und zellfreien überstehenden Flüssigkeiten aus einer IL-2 abhängigen menschlichen T-Zell-Linie, die mit IL-2 bei einer Zellkonzentration von 1·10&sup5; Zellen/ml stimuliert und vier Tage später, als die Zellkonzentration 1·10&sup6; Zellen/ml betrug, geerntet worden war, meßbar war. Verschiedene Verdünnungen an überstehender Kulturflüssigkeit oder eines Detergenszellextrakts wurden mittels ELISA analysiert und die Extinktion bei 405 nm gegen die Zahl an Zellen, woraus sich die überstehende Flüssigkeit und der Zellextrakt ableiteten, aufgetragen. Wie in Fig. 3 gezeigt, konnten sowohl der IL-2R in der überstehenden Flüssigkeit als auch der mit der Zelle assoziierte IL-2R gegenüber einem Hintergrundspiegel von so niedrigen Zellzahlen wie 6x10&sup4; beziehungsweise 3·10&sup4;/ml ermittelt werden. Um sicherzustellen, daß das überstehende Material tatsächlich eine lösliche Form des IL-2R war, wurde die überstehende Flüssigkeit durch ein 0,22 Mikrometer Millipore-Filter geleitet und auch für 1 Stunde bei 100.000· G ultrazentrifugiert. Keines der Verfahren verminderte die Menge an ermitteltem IL-2R in der überstehenden Flüssigkeit. Um die Spezifität des Elisa für den löslichen IL-2R festzustellen, wurde überstehende Kulturflüssigkeit von PBMC, die für 12 Tage mit PWM aktiviert worden waren, auf IL-2R und IgM hin analysiert. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, daß die Extinktion in unbeschichteten Löchern, die Probe und entweder FITC-Anti-IgM oder FITC-7G7/B6 (zweiter Antikörper) plus mit alkalischer Phosphatase konjungiertem Anti-FITC erhielten (dritter Antikörper), sehr gering war. Löcher, die mit Heteroantikörper beschichtet waren und die dann Probe und FITC-7G7/B (aber keinen FITC-Anti-IgM), gefolgt von einem dritten Antikörper, erhielten, waren stark positiv. Löcher, die mit Anti-IgM beschichtet waren, und die Probe, FITC-Anti- IgM (aber keinen FITC-7G7/B6) und dritten Antikörper erhielten, waren ebenfalls stark positiv. Diejenigen Löcher, die mit Anti-IgM beschichtet waren, und die mit Probe, FITC- 7G7/B6 und einem dritten Antikörper behandelt wurden oder diejenigen Löcher, die mit Heteroantikörper beschichtet waren, und die Probe, FITC-Anti-IgM und dritten Antikörper erhielten, wiesen eine mit den unbeschichteten Löchern vergleichbare Extinktion auf. Diese Ergebnisse bestätigen, daß dieses Nachweisverfahren spezifisch für das durch 7G7/B6 und Heteroantikörper gebundene Molekül ist.
- Wie in Fig. 4 A&B gezeigt, werden Überstands- und zellassoziierte IL-2R in denjenigen Kulturen, die mit PHA oder OKT3 stimuliert wurden, früh und mit rascher Anreicherung gebildet, während die Zunahme in Kulturen, die mit Tetanus- Toxoid und allogenen Zellen stimuliert wurden, eher langsam verlief. Zusätzlich war die Menge an als Antwort auf die Antigenaktivierung erzeugtem zellulären und löslichen IL-2R zu den getesteten Zeitpunkten etwas geringer als diejenige des als Antwort auf die PHA- und OKT3-Stimulierung produzierte. Tabelle 1 Legende Tabelle 1 Beschichtungsantikörper Probe Zweiter Antikörper Dritter Antikörper Extinktion Keiner Anti-Tac
- Spezifität eines ELISA für den löslichen IL-2R. Überstehende Flüssigkeiten wurden aus PWM-stimulierten PBMC nach 12 Kulturtagen erhalten. Löcher, die entweder alleine mit Puffer, Anti-Tac oder Anti-IgM beschichtet waren, erhielten überstehende PWM-Flüssigkeit, gefolgt entweder von FITC 7G7/B6 oder FITC-Anti-IgM, in der gezeigten Kombination. Alle Löcher erhielten dann mit alkalische Phosphatase konjugierten Anti- FITC-Antikörper. P-Nitrophenylphosphat-Substrat wurde hinzugefügt und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
- Kulturen, die alleine mit Medium stimuliert wurden, erzeugten im Grunde keine meßbaren IL-2R-Spiegel. Zellulärer IL-2R in Kulturen, die mit PHA und OKT3 stimuliert wurden, nahm von den Höchstwerten am Kulturtag 7 an ab, während der IL-2R in der überstehenden Flüsstgkeit weiter zunahm. Um festzustellen, ob der lösliche IL-2R das Ergebnis eines Zelltodes und der nachfolgenden Freisetzung des zellassozierten IL-2R war, wurden PBMC-Kulturen, die 24 Stunden mit PHA stimuliert worden waren und die 500 Einheiten pro 106 Zellen an zellassoziertem IL-2R besaßen, gewaschen, entweder mit SHAM behandelt oder wiederholt gefroren und aufgetaut und zurück zur Kultur gegeben, mit dem gleichen Überstand in dem sie gezüchtet worden waren. Die Daten in Tabelle 2 zeigen, daß es keine zusätzliche Anreicherung an löslichem IL-2R in der überstehenden Flüssigkeit aus den abgetöteten Zellen gab, während die sham-behandelten Zellen löslichen IL-2R in der überstehenden Flüssigkeit produzierten.
- Da die Expression des zellassoziierten IL-2R, wie gezeigt wurde (Uchivama, et al, s. vorstehend), eine de novo- Proteinsynthese erfordert, aber keine Zellproliferation, wurde die Wirkung einer Bestrahlung und des Polypeptidsynthese- Inhibitors Cycloheximid auf den Überstands-IL-2R untersucht. Fig. 5 A&B zeigen, daß die Bestrahlung mit 3000 R die Erzeugung des Überstands-IL-2R oder des zellassoziierten IL-2R nicht hemmte, während das Cycloheximid (25 ug/ml) die Erzeugung von beiden Formen des IL-2R vollständig hemmte. Tabelle 2 Behandlung Spiegel des Überstands-IL-2R am Tag Keine Einfrieren/Auftauen
- Löslicher IL-2R wird in vitro nicht aus abgetöteten IL-2R- positiven Zellen freigesetzt. Normale PBMC wurden mit PHA für 24 Stunden aktiviert und die Menge an löslichem und zellulärem IL-2R mittels Elisa ermittelt. Diese aktivierten Zellen wurden dann drei Zyklen aus Einfrieren und Auftauen unterzogen oder sham-behandelt und in die gleichen IL-2 und IL-2R enthaltenden Medien für die zusätzliche Zeit einer in-vitro-Züchtung zurückgegeben. Der Spiegel des Überstands-IL-2R wurde mittels ELISA ermittelt. Die Ergebnisse stellen die Einheiten an IL-2R pro 10&sup6; kultivierter PBMC dar.
- Weil mit HTLV I infizierte T-Zell-Linien den Zelloberflächen-IL-2R konstitutiv exprimieren (Robb et al, J. Exp. Med. 160, 1126-1146, 1984), wurden die Zellen und überstehenden Flüssigkeiten verschiedener menschlicher Tumorzell-Linien auf IL-2R hin untersucht. Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß die HTLV I-positive T-Zell-Linie HUT 102B2 hohe Spiegel an zellassoziiertem IL-2R hervorbringt und auch große Mengen an IL-2R in die überstehende Flüssigkeit freisetzt im Vergleich zu den IL-2R-Spiegeln, die von einer IL-2 abhängigen Zell-Linie hervorgebracht und freigesetzt werden. HTLV I-negative T-Zell-Linien, wie MOLT 4, JURKAT und CEM bringen keinen zellulären IL-2R hervor, noch setzen sie löslichen IL-2R frei. Die Prae-B-Zell-Linien NALM-1 und NALL- 1, und die B-Zell-Linien NU-DHLI und SU-DHL6 brachten keinen IL-2R hervor und setzten auch keinen IL-2R in die überstehenden Kulturflüssigkeiten frei. Im Gegensatz dazu brachten alle drei EBV-induzierten B-Zell-Linien niedrige Spiegel an zellulärem IL-2R hervor und eine dieser Linien setzte meßbare Mengen IL-2R in die überstehenden Kulturflüssigkeit frei.
- Der lösliche IL-2R aus einer IL-2 abhängigen T-Zell- Linie, analysiert mittels einer Sephadex®G-20 Gelfiltration (Fig. 6), scheint von relativ einheitlicher Größe mit einem Molekulargewicht, das etwas kleiner als das des Albumins ist, zu sein. Um das Molekulargewicht des löslichen IL-2R besser zu definieren, wurde immunoaffinitäts-gereinigter, löslicher IL-2R aus HUT-102B2-Zellen mittels NaDodSO4 PAGE analysiert. Fig. 7 zeigt, daß der lösliche IL-2R als eine einzelne breite Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von Mr = 40.000 migrierte. Tabelle 3 Zell-Linie Zelltyp Zellulärer IL-2R Überstands-IL-2R IL-2-abhängige Linie T-Zelle Prae-B-Zelle B-Zelle
- Analyse von verschiedener Zell-Linien auf die Anwesenheit von zellulärem und Überstands-IL-2R. In vitro kultivierte Zell- Linien wurden auf den Spiegel an zellulären und Überstands-IL- 2R-Rezeptoren mittels ELISA analysiert. Ergebnisse stellen die Einheiten an IL-2R pro 10&sup6; Kulturzellen dar.
- Der Begriff "Sandwich"-ELISA oder "Sandwich"- Nachweisverfahren, wie er hier verwendet wird, bedeutet daß mindestens zwei Antikörper oder reaktive Fragmente davon, die verschiedene Bindungsstellen auf dem IL-2R aufweisen, verwendet werden, so als würde der Rezeptor zwischen den beiden Antikörpern in Form eines Sandwich eingeschlossen.
- Diese Antikörper könnten entweder beide monoklonal oder einer davon monoklonal und der andere ein Heteroantikörper (polyklonal) sein, oder beide könnten Heteroantikörper sein.
- Wie in Fig. 1 gezeigt wird, wird Kaninchen-Anti-Mensch- IL2-Rezeptor-Antikörper bis zu einer gewünschten Konzentration (1 bis 1.200) in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 verdünnt und 150 ul davon werden zu den Löchern alternierender Reihen der inneren 60 Löcher von 96-Loch- Immulon-1-Mikrotiter-Flachbodenplatten (Dynatech) gegeben. Die alternierenden Löcher der Platte erhalten Carbonatpuffer alleine. Nach einer Inkubation über Nacht oder länger bei 4ºC werden die Löcher mit Puffer gewaschen (Phosphat-gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 0,05% Tween und Natriumazid enthält) und verschiedene Verdünnungen der zu analysierenden Probe werden in die beschichteten und unbeschichteten Löcher eingebracht. Das Verdünnungsmittel besteht aus phosphatgepufferter Salzlösung, die Tween, Azid und 1% fetales Kälberserum oder eine anderes Proteinmaterial (Verdünnungsmittel) enthält. Eine Referenz-Präparation an löslichem IL-2-Rezeptor wird ebenfalls zu den beschichteten und unbeschichteten Löchern hinzugefügt. Es folgt eine 2- Stunden-Inkubation bei Raumtemperatur, anschließend werden die Platten mit Puffer gewaschen (PBS mit Tween und Azid, wie vorstehend), 100 ul einer 1 : 1.000-Verdünnung von mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiertem monoklonalen Antikörper (7G7/B6) wird hinzugefügt und die Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Auf diese Inkubation folgend werden die Platten gewaschen und 100 -l eines auf 1 : 1.000 mit Verdünnungsmittel verdünnten, mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-Anti-FITC hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation werden die Platten gewaschen und 100 ul einer Lösung aus p-Nitrophenylphosphatsubstrat (PNPP, Sigma, 1 mg/ml) in Diethanolaminpuffer mit einem pH-Wert von 9,8 zu den Löchern hinzugefügt. Die Umwandlung des Substrates (PNPP), um (PNP) zu produzieren, wird durch die Extinktion bei 405 nm in den experimentellen (beschichtet) und Kontroll- Löchern (unbeschichtet) bestimmt, wobei letztere von der der experimentellen Löcher abgezogen werden. Das spezifische Produkt, das in den experimentellen Löchern hergestellt wird, wird dann auf das bezogen, das in den Standardlöchern hergestellt wird, und die Menge an IL-2R, die in einer unbekannten Probe vorhanden ist, wird aus den gemessenen Werten ermittelt, die für verschiedene bekannte IL-2R-Spiegel erhalten wurden.
- Es sollte bemerkt werden, daß die bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens in einem indirekten oder "verstärkten" Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) besteht. Natürlich können vielfältige Veränderungen des vorliegenden Verfahrens durch den Praktiker, in Übereinstimmung mit der hier herausgearbeiteten Beschreibung, entwickelt werden.
- Einige Alternativen zu dem Verfahren schließen ein:
- (a) Die löslichen Moleküle (IL-2R) sind entweder unter Verwendung von Verfahren zur Festphasen-Gehaltsbestimmung, Verfahren zur Flüssigphasen-Gehaltsbestimmung oder Verfahren zur Semifestphasen-Gehaltsbestimmung (Antikörper oder Ligand in einem Gel) meßbar. Das Verfahren braucht nicht nur auf Festphasensysteme beschränkt zu sein, wie es für den normalen Fachmann, an den sich diese Erfindung wendet, offensichtlich sein sollte.
- (b) Im Falle von Festphasen-Gehaltsbestimmungen, kann der lösliche IL-2-Rezeptor für die Analyse mittels Materialien eingefangen werden, die entweder nichtspezifisch oder spezifisch an den Rezeptor binden. Um die Spezifität des Nachweises sicherzustellen, müssen erstere den Rezeptor jedoch durch spezifische Mittel, z. B. Antikörper, IL-2 oder andere spezifische Liganden ermitteln. Solche Antikörper schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Heteroantiseren (ganz verschiedener Arten), die an den Rezeptor binden, monoklonale heterologe und homologe Antikörper (aus Hybridom oder anderweitig gewonnen), und spezifischen Liganden (IL-2). In den Fällen, wo der Rezeptor unter Verwendung von Materialien eingefangen wird, die spezifisch für den Rezeptor sind und die heterologe und homologe Antiseren, monoklonale Antikörper (aus Hybridom oder anderweitig gewonnen) und spezifischen Ligand (IL-2), der an den Rezeptor bindet, einschließen, kann ein nichtspezifisches Mittel zum Nachweis des Rezeptors angewendet werden, wie Heteroantiseren, die Antikörper gegen den menschlichen IL-2R enthalten, als auch bestimmte Liganden, die an verschiedene Epitope des Moleküls, die für das Molekül nicht spezifisch sind, z. B. Zuckerresten und ähnliches, gebunden werden.
- (c) Wenn das Einfangen für die Analyse auf einer festen Oberfläche erfolgt, kann die feste Oberfläche aus polymeren Verbindungen, Glas- oder keramischen Materialien, anorganischen Matrizen, Agarose, magnetischen Körnern und anderen in der Technik gut bekannten Absorptionsmitteln bestehen.
- (d) Die spezifischen oder nicht-spezifischen Materialien, die an den Rezeptor binden, könnten mit verschiedenen Enzymen "markiert" werden (alkalische Phosphatase, Glukoseoxidase, Peroxidase und ähnliches), Radioisotopen (¹²&sup5;I, ³H, ¹&sup4;C und ähnliches) oder anderen Materialien, um einen Nachweis der Bindung zu gestatten. Zusätzlich können "Kompetitions"-Nachweise durchgeführt werden, in denen die Bindung markierter Liganden an den Rezeptor durch die Bindung von "kalten" oder nicht-markierten Liganden behindert wird. Es sollte bemerkt werden, daß zusätzlich zu den "indirekten oder erweiterten" Gehaltsbestimmungen ein direkt an den Rezeptor bindender Ligand ebenfalls für den Nachweis des Rezeptors verwendet werden kann. Ferner könnte eine Vielzahl an Schichten aus Reagentien zur "Verstärkung" des Nachweisverfahrens verwendet werden.
- (e) Es sollte betont werden, daß die Puffer, die Inkubationszeiten, das Substrat, das Enzym und ähnliches, das hier erwähnt wurde, nur beispielhaft sind. Natürlich kann jede der beschriebenen Inkubationszeiten und Puffer, die dazu verwendet werden, das Antisera oder den Liganden an die feste Oberfläche zu binden, können die Puffer, die für das Waschen, Verdünnen oder das Solubilisieren des Substrates verwendeten werden, und die zur Bestimmung der Umwandlung des Substrates in Produkt angewandte Wellenlänge in geeigneter Weise verändert werden. Jedes geeignete Substrat, das ein Produkt erzeugt, das mit einer Wellenlänge gemessen werden kann, die sich von der des Substrates unterscheidet, kann ebenfalls verwendet werden.
- (f) Ein anderes Verfahren, um den Rezeptor nachzuweisen, wäre es, die Bindung eines spezifischen Liganden an den Rezeptor zu gestatten und dann das Vorhandensein des Liganden mittels Antikörper gegen den Liganden entweder durch ein indirektes oder durch eine direktes Verfahren nachzuweisen.
- (g) Wenn eine Analyse in der flüssigen Phase durchgeführt wird, kann jedes geeignete Lösungsmittel verwendet werden. In der flüssigen Phase könnte die Gehaltsbestimmung als ein Standard-Kompetitions- Radioimmuniassay durchgeführt werden, der radioaktiv markierten IL-2-Rezeptor, Antikörper gegen den IL-2-Rezeptor (7G7/B6 oder andere Antikörper), einen an den Anti-Rezeptor- Antikörper, aber nicht an den IL-2-Rezeptor bindenden Liganden und nicht-radioaktiv-markierten IL-2-Rezeptor einschließt. Zusätzlich zur Verwendung von mit Radioisotopen markiertem IL- 2R, könnte der Rezeptor mit Enzym oder anderen Materialien markiert werden, um seinen Nachweis zu gestatten. Andere Gehaltsbestimmungen in der flüssigen Phase könnten "markiertes" IL-2, um den Rezeptor sowohl in der flüssigen Phase nachzuweisen als auch Aussalz- oder andere Verfahren, um den Rezeptor-Ligandkomplex auszufällen, einschließen.
- (h) Zusätzlich zu den festgestellten Veränderungen der Extinktion während der enzymatischen Umwandlung des Substrates zum Produkt, kann diese Gehaltsbestimmung auch unter Verwendung radioisotopischer Mittel durchgeführt werden, zum Beispiel wie in Tablle 4 gezeigt. Wie zu erkennen ist, können lösliche IL-2-Rezeptoren durch die Bindung von ³H-markierten monoklonalen Antikörpern gemessen werden. Die Daten zeigen auch, daß IL-2R entweder in den Zellextrakten oder in den überstehenden Kulturflüssigkeiten nachgewiesen werden kann. Zusätzlich dazu kann auch die Umwandlung eines radioisotopen Substrates in ein nichtradioisotopes Produkt verwendet werden. Der nicht-radioaktive ELISA, wie vorstehend beschrieben, ist jedoch das bevorzugte Verfahren. Tabelle 4: Ein Festphasen-Radioisotopverfahren zur Messung des löslichen IL-2-Rezeptors Quelle des löslichen IL-2R Einheiten des IL-2R/ml# CPM des gebundenen, tritiierten Anti-IL-2R Zellen mit Detergens solubilisiert Überstehende Kulturflüssigkeit
- * Die Werte stellen das geometrische Mittel der Impulszahl pro Minute dar.
- x/% 1 Mittlere Standardabweichung des tritierten, an die Platten gebundenen Anti-Tac.
- # Die Konzentration des löslichen iL-2R in diesen Präperationen in Einheiten/ml wurde durch Sandwich-Elisa bestimmt.
- Die hier vorgeführte Demonstration, das die Freisetzung oder das Hervorbringen des IL-2R mit einer Immunaktivierung verbunden ist, macht es nun möglich, den zellassoziierten und den löslichen IL-2R in verschiedenen Körperflüssigkeiten als empfindlichen Test auf veränderte Zustände der Immunaktivierung, wie sie zum Beispiel bei der rheumatischen Arthritis und der systemischen lupus erythematosis-Krankheit vorkommen, zu überwachen. Der ELISA-Test der vorliegenden Erfindung kann wertvoll sein, um vorauszusagen, wann Krankheitsverschlechterungen im Entstehen begriffen sind und/oder zur Überwachung einer immunsuppressiven Therapie. In ähnlicher Weise würde die Bestimmung des IL-2R im Serum von Individuen, die verpflanzte Nieren, Lebern und ähnliches abstoßen, die Überwachung der Transplantatabstoßung und Titrieren der immunsuppresiven Therapie erlauben.
- Die Demonstration der angestiegenen Serumspiegel des IL-2R in Zusammenhang mit bestimmten bösartigen Tumoren, wie in Fig. 2 gezeigt, bestätigt, daß eine Analyse der Zellen und des Serums von bestimmten Patienten mit solch einer Krebserkrankung ein nützliches diagnostisches Mittel für den Nachweis und/oder die Überwachung einer beginnenden oder verbliebenen Tumorlast ist.
- Es sollte bemerkt werden, das die vorliegende empfindliche Gehaltsbestimmung für den IL-2R auch die Überwachung der Dosierung des an Menschen verabreichten IL-2R ermöglicht, gerade so wie die Serumspiegel von Pharmazeutika überwacht werden.
- Da der vorliegende Test auf löslichen IL-2R von Hybridomen abgeleitete monoklonale Antikörpern erfordert, die in großer Anzahl hergestellt werden können, stellt die Quantität an benötigten Reagentien nicht länger ein Problem dar. Mäuse (jede von ihnen kostet angenähert $10), denen Hybridomzellen injiziert wurden, würden genug Reagens für die Durchführung von grob 50.000 Tests erzeugen, wodurch es ganz offenkundig ziemlich billig wird. Die Durchführung dieses Tests als ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) erfordert keine Radioisotope und die Reagentien sind über eine Zeitdauer von einem Jahr stabil, was deutliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind.
Claims (14)
1. In vitro-Verfahren zum Nachweis eines bösartigen
Tumors, der löslichen Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R) erzeugt,
umfassend den Nachweis des Vorhandenseins von löslichem IL-2R
in einer Körperflüssigkeit.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der bösartige
Tumor einer des lymphoretikulären Systems ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin
der Nachweis des Vorhandenseins von löslichem interleukin-2-
Rezeptor in der Körperflüssigkeit die Bestimmung der
Reaktivität der Körperflüssigkeit mittels einer Vielzahl an
Liganden umfaßt, wobei jeder Ligand Bindungsaffinität für eine
spezielle Stelle auf dem Rezeptor aufweist und diese Stelle
für jeden Liganden unterschiedlich ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei mindestens zwei
Liganden verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei mindestens einer
der Liganden ein monoklonaler Antikörper oder ein reaktives
Fragment davon ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der monoklonale
Antikörper von einem Hybridom aus der American Type Culture
Collection Zugangs-Nr. HB8784 abgeleitet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die beiden
Liganden monoklonale Antikörper oder reaktive Fragmente davon
sind.
8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die beiden
Liganden Heteroantikörper oder reaktive Fragmente davon sind.
9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein zweiter Ligand
ein Heteroantikörper oder reaktives Fragment davon ist.
10. Verfahren-nach Anspruch 4, wobei einer der Liganden
Interleukin-2 oder ein reaktives Fragment davon ist.
11. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein zweiter Ligand
ein Antikörper ist.
12. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reaktivität
enzymatisch, radioisotopisch, spektralphotometrisch,
immunologisch, fluoreszenzphotometrisch oder durch eine
Kombination davon ermittelt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Reaktivität
durch einen Vergleichsnachweis unter Verwendung
radiomarkierter und nicht-markierter Liganden ermittelt wird.
14. Ausstattung für den in vitro-Nachweis eines
bösartigen Tumors, umfassend
einen ersten Behälter, der einen Liganden enthält, der
an den Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R) bindet, wobei der Ligand
aus einem monoklonalen Antikörper besteht, abgeleitet aus
einem Hybridom aus der American Type Culture Collection
Zugangs-Nr. HB 8784,
einen zweiten Behälter, der einen davon verschiedenen
Liganden enthält, der auch an den Interleukin-2-Rezeptor
bindet, wobei der verschiedene Ligand durch ein Verfahren
ermittelt werden kann, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
enzymatischen, radioisotopischen, spektralphotometrischen,
immunologischen, fluoreszenzphotometrischen Verfahren und
einer Kombination davon,
und Anweisungen zur Durchführung des Nachweises.
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