KR0172123B1 - 재조합 단백질 수용체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 단백질 수용체

제1도는 사람 IL-2R

쇄 cDNA의 구조도이다.

제2도는 유추된 사람 IL-2R

및 IL-2R

쇄 전구체 구조물의 수치료(hydropathy) 플롯 분석도이다.

제3a도는 상이한 세포 유형에서 사람 IL-2R

쇄의 mRNA 발현을 나타낸다.

제3b도는 사람 PBLs에서 IL-2R

및 IL-2R

mRNA의 발현을 나타낸다.

제4a도는 사람 IL-2R

및/또는 IL-2R

cDNA형질감염체의 세포 표면 염색 양상에 의한 사람 IL-2R

및/또는 IL-2R

쇄의 발현을 나타낸다.

제4b도는 클로닝된 cDNAs를 발현하는 형질 감염체에 대한¹²⁵I-IL-2 결합의 스케차드(Scatchard) 플롯 분석에 의한

쇄 및

쇄의 발현을 나타낸다.

제5도는 IL-2R-양성 형질전환체의 친화성 교차결합 연구결과를 나타낸다.

제6도는 재구성된 수용체를 통한 IL-2의 내재화를 나타낸다.

제7도는 마우스 IL-2 수용체

쇄 cDNA 클론의 제한 효소 분해 지도이다.

제8도는 쥐 IL-2R

의 구조 유전자를 나타낸다.

제9도는 앵커 마이너스 cDNA 함유 발현 벡터의 작제도이다.

제10도는 천연

및 가용성

에 대한 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

제11도는 가용성

의 존재를 스크리닝하기 위한 샌드위치 ELISA Immulon-I 미세역가판의 도식도이다.

제12도는 가용성

의 분자량 측정을 위한 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)의 분석도이다.

제13도는

쇄의 분비 형태의 IL-2 결합능을 측정하기 위한 경쟁적 샌드위치 ELISA 분석결과이다.

본 발명은 인터루킨-2에 대한 수용체 (특히, 수용체의

-쇄),

-쇄 또는 이의 일부를 암호화하는 cDNA,

-쇄를 암호화하는 cDNA 삽입체를 함유하는 벡터, 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 및

-쇄를 생성하는 숙주의 배양물에 관한 것이다.

세포대 세포 전달(communication)에 수반되는 가용성 매개체 종류인 사이토킨(Cytokine)이 면역계의 조절에 필수적이라는 많은 증거가 있다. 사이토킨은 특정한 세포 표면 수용체(들)과 상호작용하여 표적세포의 증식, 분화 및 활성화를 유도한다고 공지되어 있다. 이미 T 세포 성장 인자(참조문헌: 1)로 정의된 인터루킨-2(IL-2)는 T-림프구 (T 세포)의 항원-특이적 클론 증식에 중요한 역활을 하는 것으로 공지된 가장 특징적인 사이토킨중의 하나이다(참조문헌: 2), IL-2는 또한 미성숙된 흉선세포(참조문헌 : 3), B 림프구(B 세포)(참조문헌: 4), 대식세포(참조문헌 5), 천연 킬러 세포(NK 세포)(참조문헌: 6), 및 림포카인-활성화된 킬러세포(LAK 세포)(참조문헌: 7)와 같은 면역계의 다른 세포에도 작용하는 것으로 보인다. IL-2의 이러한 다작용성은 선택적(adoptive) 면역치료법(참조문헌: 8)과 같은 면역치료법에서 제제로 사용할 수 있다는 가능성을 보였다(참조문헌: 8). 최근들어, IL-2는 핍지신경교와 같은 신경세포상에서도 작용하는 것으로 나타났으며(참조문헌: 9), 이는 중추 신경계에서 사이토킨이 수반될 수 있음을 제시한다. 기초 면역학 및 임상 면역학에서의 IL-2 시스템에 대한 광대한 연구에도 불구하고, IL-2 매개된 시그날 도입을 뒷받침하는 분자기작에 대한 정보는 한정되어 있다(참조문헌: 10).

IL-2 수용체 (IL 2R)는 3가지 형태(IL-2에 대한 결합능력에 따라 고친화성 형태, 중간친화성 형태 및 저친화성 형태, 각각 해리 상수(Kds)가 10^-11M, 10^-9M 및 10^-8M)로 존재한다고 알려져 있다(참조문헌: 11, 12,). IL-2R

(Tac 항원, p55)의 특징 분석에 따라 (참조문헌: 13),

쇄가 단독으로는 저친화성 형태를 구성하고, 림프구의 또다른 특정한 성분(들)과 결합되지 않으면 그자체로는 IL-2의 내재화 및 시그날 도입에 작용하지 않는다는 것이 확실해졌다(참조문헌: 14, 15). 그후, 림프막 성분이 새로운 수용체쇄 (

쇄로 칭함, 또는 p70-75)인 것으로 확인되었다(참조문헌: 12, 16, 17). 사실, 실험적 증거는 IL-2R

쇄가 그 자체로서 중간 친화성 형태를 구성한다고 제시하였다(참조문헌: 12). 또한, IL-2R

쇄는 IL-2R

쇄와 결합하여 고친화성 형태의 수용체가 된다(참조문헌: 12, 16, 17). 야생형 및 돌연변이된 IL-2R

쇄 cDNA를 사용한 발현연구는, IL-2R

쇄가 아닌 IL-2R

쇄가 세포내 시그날 도입 과정을 이끄는데 원인이 되는 영역(들)을 갖는다는 생각을 지시하고 있다(참조문헌: 18). 따라서, IL-2

쇄의 구조 및 작용을 설명할 수 있을 정도로 IL-2

쇄의 양을 수득할 필요가 있으며, 이것이 고친화성 IL-2R의 분자 기초 및 IL-2 반응 세포에 작용하는 시그날 도입의 기작에 대한 추가의 관찰에 필수적인 단계이다. 본 발명자는 하기에서 상기 cDNA의 적합한 벡터로의 삽입 및 적합한 숙주에서 이의 발현으로 IR-2R

쇄 또는 이의 일부에 상응하는 단백질을 다량 생성할 수 있는 IL-2

쇄 또는 이의 일부를 암호화하는 cDNA를 기술한다.

따라서 본 발명의 하나의 양상에 따라, 본 발명자는 IL-2R

쇄 또는 이의 일부를 암호화하는 재조합 cDNA를 제공한다.

사람 IL-2R

, 또는 이의 축퇴 변이체 또는 이의 일부를 암호화하는 본 발명의 cDNA는 하기식을 갖는다:

쥐 IL-2R

, 또는 이의 축퇴 변이체 또는 이의 일부를 암호화하는 본 발명의 또다른 cDNA는 하기식을 갖는다 :

본 발명에 특별히 중요한 DNAs는 IL 2-R

의 일부, 예를들어 세포의 부분 또는 이의 일부, 또는 세포내 부분 또는 이의 일부를 암호화하는 DNAs를 포함한다.

특히, IL2-R

의 세포의 부분 및 이의 일부를 포함한 IL2-R

의 가용성 부분을 암호화하는 DNA가 중요하다.

따라서, 본 발명은 또한 이의 범위내에 상술한 cDNAs의 일부를 암호화하는 cDNA, 예를 들어 hIL-2R

쇄의 완전한 서열의 일부, [예: 아미노산(a,a) (제1도 참조) 1에서 도는 근처 (예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)에서 시작하고 a,a, 214에서 또는 근처 (예: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220)에게 종결되는 세포의 부분, 또는 이의 세포의 부분의 아-부분 도는 이의 축퇴 변이체; 또는 수용체 쇄의 세포내 부분에 상응하는 부분, 예를 들어, a, a, 219에서 또는 근처(예: 230, 231, 232, 234, 235, 236, 267, 238, 239, 240, 241, 242)에서 시작하여 a, a, 525까지 또는 근처(예: 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 및 525)에서 종결되는 부분 또는 이의 아-부분 또는 이의 축퇴 변이체] 뿐만아니라 쥐 IL-2Rβ쇄의 완전한 서열의 일부를 암호화하는 cDNA(제8도 참조) [예:아미노산 1에서 또는 근처(예:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10)에서 시작하여 아미노산 210에서 또는 근처(예: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220)에서 종결되는 세포의 부분 또는 세포의 아-부분 또는 이의 축퇴 변이체; 또는 수용체 쇄의 세포내 부분에 상응하는 부분, 예를 들어, 아미노산 235에서 또는 근처(예: 225, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242)에서 시작하여 a,a, 513에서 또는 근처(예: 505, 506, 508, 509, 510, 512 및 513)에서 종결되는 부분 또는 이의 아-부분 또는 이의 축퇴 변이체]를 포함한다.

본 명세서에 기술된 특정한 IL-2R

쇄 또는 이의 일부에 대해, 개체마다 발생하는 천연적 대립형질 변이체가 존재할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이들 변이체는 전체서열중 하나 이상의 아미노산 차이에 의하거나 서열 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해 나타날 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 IL-2R

쇄 또는 이의 일부는 IR-2Rβ쇄 또는이의 일부의 중요 특성은 변화시키지 않으면서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 첨가시키기 위해 유전자 공학 기술(예: 포인트 돌연변이)에 의해 변형시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 이의 범위내에 본 명세서에 기술된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있고 IL-2R

쇄 또는 이의 일부, 특히 가용성 IL-2R

의 활성을 실질적으로 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.

본 발명의 추가의 양상에서, 본 발명자는 사람 IL-2R

(hIL2-R

)의 수용성 부분을 암호화하는 재조합 DNA 분자, 예를 들어 전체 hIL2-R

의 아미노산 약 1내지 약 210을 함유하는 아미노산 서열을 제공한다. 이러한 DNA 분자는, 예를 들어 잔기 1 내지 210이 천연 IL-2R

쇄의 아미노산에 상응하는 212개 아미노산 잔기를 갖는 가용성 사람 인터루킨 2 수용체

-쇄 유도체를 암호화한다.

예를들어 하기에 기술된 하나의 태양에서, 가용성 hIL-2R

유도체를 암호화하는 cDNA 분자의 말단 뉴클레오타이드는 하기와 같다:

GCC CTT GCT AGC TAG

208 Ala Leu Ala Ser [정지].

재조합 DNA 기술의 표준방법을 이용하여, 상기된 IL-2R

또는 이의 목적하는 부분, 또는 이의 축퇴 변이체에 대한 구조적 유전자에 상응하는 cDNA 서열을 함유하며 적합한 숙주 세포를 형질전환하는 벡터를 작제할 수 있다.

적합한 벡터는, 예를 들어 플라스미드 벡터이며, IL-2R

쇄 또는 이의 일부를 암호화하는 cDNA 서열에 작동적으로 연결된 억제 및 조절 서열을 함유할 것이다.

적합한 기술이 널리 공지되어 있으며, 널리 수행되고 있으며, 유럽 특허원 공고 제 0254249호 및 0170204호에 다른 단백질과 연관되어 실시예로서 기술되어 있다.

배양물로부터 순수형태의 목적하는 단백질을 수득하기 위해서는 표준 기술로 수행할 수 있으며, 이러한 단백질은 모노클로날 항체를 제조하기에 적합한 항원을 제공한다. 따라서 IL-2R

쇄 또는 이의 목적하는 부분에 대한 특이 친화성을 갖는 모노클로날 항체를 분배할 수 있는 하이브리도마는, 사람 이외의 동물을 재조합 IL-2R

또는 이의 일부로 면역화시키고, 면역글로불린을 분비하지 않는 골수종 세포와 함께 비장 세포를 융합시킨 후, 생성된 하이브리도마로부터 목적하는 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 세포주를 선별하며, 필요한 경우 상기 하이브리도마를 아-클론화하여 제조할 수 있다.

하이브리도마를 제조하고 이로부터 순수 형태의 모노클로날 항체를 수득하는 기술은 널리 공지되어 있으며, 유럽 특허원 공고 제 0168745호에 실시예로서 기술되어 있다.

본 발명에 따른 항체는 예를들어 진단 목적 및 면역 억제 또는 활성화에 의한 치료에 유용하다. 상술한 바와 같이, 이러한 항체는 본 발명에 따른 정제된 재조합 단백질 사용하여 생성하거나, 본 발명의 cDNA를 형질 감염시키고 다량의 수용체를 발현하는 세포를 수득한 후 이 세포를 이용하여 항체를 수득한다.

상기한 바와 같이 본 발명은 IL-2R

쇄의 가용 형태 및 가용성 IL-2 수용체의 가용 형태를 포함한다. 가용 형태는 상술한 바와 같은 IL-2R

또는 이의 아부분의 세포의 부분을 암호화하는 cDNA 부분 서열에 의해 암호화되는 형태이다. 필요한 경우, IL-2R

쇄 및

-쇄 둘다 모두를 동시에 생성할 수 있다.

IL-2

쇄의 특정한 아-부분에 대한 모노클로날 항체의 이용으로 수용체쇄의 에피토프를 확인할 수 있으며, 이로써 적합한 모노클로날 항체 또는 다른 펩타이드 또는 유사펩타이드 또는 단백질 동족 물질을 사용하여 실험되는 수용체의 활성을 조절하는 방법을 개척한다.

[사람 IL-2R

쇄를 암호화하는 cDNA 클론의 분리 및 분석]

cDNa 클론의 분리시, 모노클로날 항체, Mik-

1 및 Mik-

2(참조문헌: 19) [이들은 둘다 사람 백혈병 세포주YT (참조문헌: 20)상에서 발견되는 IL-2R

쇄에 대해 생성된다]를 사용하여 발현 클로닝 방법을 적용한다.

모노클로날 항체 Mik-

1 및 Mik-

2는 모두 Fernentation Institute (Agency of Industrial Science and Technology, Japan)에 각각 기탁 제 10453호 및 제 10454호 (1988)로 기탁되었다; 일본국 특허원 제 298742호 (1988)에 기술되어 있다.

포준 공정에 따라 YT 세포로부터 폴리(A)⁺- RNA를 사용하여 수 세트의 cDNA 라이브러리를 제조한다. cDNA 라이브러리를 하기 언급되는 바와 같이 무작위 프라이머 (Amersham) 또는 올리고(dT) 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 공표된 공정(참조문헌: 21)에 따라 cDM8 벡터로 제조한다. 5.6×10⁶개의 독립 콜로니를 나타내는 플라스미드 DNA를 표준 공정으로 제조하고, DNA 1mg을 첫 번째 DNA 형질감염에 사용한다. 실질적으로, DNA를 100개의 시험관에 나누고 (따라서 각각의 시험관은 DNA 10㎍을 함유한다), 이들은 조직 배양 접시 (60mm 폴리스티렌 접시, Corning)내의 3.5×10⁵개의 원숭이 COS 세포에 형질 감염시킨다. 표준 DEAE 덱스트란 공정으로 형지감염시킨다. 이어서 형질감염된 COS 세포를 Mik-

1 및 -

2 항체의 칵테일 (각각의 항체에 대해 400배 희석시킨 복수)로 처리하고, 표준 패닝(panning) 공정을 수행한다. 패닝에 사용되는 접시는 상술한 바와 같이 항-마우스 IgG로 코팅된 FALCON 60mm 접시이다(참조문헌: 21). 첫 번째 패닝에서는, 100 IgG-코팅된 접시를 사용한다. 패닝후, 히트(Hirt) 추출을 표준방법으로 제조한다(참조문헌: 21). 이 방법에 의해 3.7×106 개의 콜로니를 수득한다. 이러한 세균 콜로니를 표준 원형질체 융합 방법으로 COS 세포와 융합시킨다(참조문헌: 21). 이 융합 실험에서, 5×10₅개의 COS 세포를 함유하는 26개 코닝(Corning) 접시를 사용한다. 융합시킨후, COS 세포를 상술한 바와 같이 패닝을 수행하여, 히트 추출물을 제조한다. 32,000개의 세균 콜로니를 히트 추출물로부터 수득한다. 융합시키고, 패닝시키는 공정을 다시 반복하고 32,000개의 세균 콜로니를 연속한 히트 추출물로부터 수득한다. 동일한 공정을 다시 반복하고, 28,000개의 세균 콜로니를 수득한다(이때, 목적 클론이 매우 풍부해야 한다). 동일한 공정을 다시 반복하고, 6,000개의 콜로니를 수득한다.이들 콜로니로부터, 30개의 콜로니를 무작위로 선택하여 cDNA 삽입체를 분석한다. 이들중에서, 단지 7개의 콜로니가 cDNA 삽입체의 제한 효소 XhoI에 의해 절단될 수 있는 플라스미드를 함유했다. 백터 유도된 XhoI 부위를 cDNA의 양측에 위치에 위치시키고, 모든 다른 플라스미드는 DNA 재배열에 의해 이러한 분해 부위를 상실시킨다; 사실, 이들 플라스미드는 최초 벡터보다 상당히 크기가 작다. 따라서, 이들은 비-특이적 생성물로 간주된다. 한편, 7개의 콜로니 모두는, 통상의 제한효소 분해 분석 및 DNA 블롯 분석으로 확인되는 바와 같이 동일한 mRNA로부터 유도된다. 이들중, pIL-2R

30으로 칭하는 하나의 플라스미드가 서로 동일한 것으로 판명된 다른 6개의 콜로니(pIL-2R

9로 칭함) 보다 긴 cDNA를 함유한다.

따라서, 이 공정에서 본 발명자는 2개의 독립적 cDNA 클론, pIL-2R

9 및 pIL-2R

30을 분리하였다; 각각의 발현 생성물은 항체와 특이적으로 반응하였다. 두 클론은 각각 1.3Kb 및 2.3Kb의 cDNA 삽입체를 함유하며, 서로 교차-하이브리드화된다. cDNA의 연속 서열 분석은 이들이 동일한 mRNA를 나타낸다는 것을 나타냈다. 사실, RNA 블로팅 분석은 mRNA가 약 4Kb 크기임을 나타냈다. 이어서, 본 발명자는 탐침으로서 클로닝된 cDNA를 사용하여 다른 YT cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, IL-2R

쇄에 대한 전체 mRNA를 포함하는 수개의독립적 cDNA 클론을 분리하였다. 따라서 pIL-2R

6 및 pIL-2R

19를 탐침으로 pIL-2R

9 cDNA 삽입체를 갖는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득한다.

에스케리키아 콜라이 MC 1061/P3 균주중의 사람 IL-2R

서열을 암호화하는 cDNA를 함유한 상술된 플라스미드들은 부다페스트 조약하의 Fermentation Research Institute에 1989년 3월 2일 하기 기탁번호로 기탁되었다:

플라스미드 기탁번호

pIL-2R

6 FERM BP-2312

pIL-2R

9 FERM BP-2313

pIL-2R

19 FERM BP-2314

pIL-2r

30 FERM BP-2315

4개의 클로닝된 cDNA의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 분석되었다(제1도).

제1도는 사람 IL-2R

쇄 cDNA의 구조를 나타낸다. 제1a도는 클로닝된 cDNAs로부터 유추된 mRNA의 도식도이다. 점이 있는 직사각형, 해치된 직사각형, 개방된 직사각형 및 폐쇄된 직사각형은 각각 mRNA의 시그날 서열, 세포의 영역, 트랜스막영역 및 세포질 영역을 나타낸다. 제1b도는 사람 IL-2R

쇄 cDNA의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 이 서열은 상술된 cDNA 클론의 완전한 DNA 서열 분석에 따라 유추되었다. 뉴클리오타이드의번호는 오른쪽 여백에 기재하였고 아미노산의 번호는 왼쪽 여백에 기재하였다. 클론 pIL-2R

19 및 pIL-2R

6의 각각 뉴클레오타이드잔기 425 및 1531에서 G-A 돌연변이 되었다. 따라서, pIL-2R

6 cDNA는 세포질 영역에 TAG 삼중자를 수득한다. 모든 다른 클론, pIL-2R

30, pIL-2R

19 및 pIL-2R

16은 이 영역에서 TGG 삼중자를 가지므로, 이는 역 전사에서의 잘못으로 생각된다.

처음에 밑줄그은 26개 아미노산 잔기는 컨센서스 서열에 의해 예측되는 바와 같이 시그날 서열을 나타낸다. 25개의 트랜스막 아미노산 잔기는 두꺼운 밑줄로 나타내었다. 시스테인 잔기는 박스로 표시하였다. 잠정적인 N-당화 위치는 개방된 직사각형으로 나타내었다. 요약하면, RNA는 NK-형 사람 림프세포주, YT로부터 제조되고, cDNA 라이브러리는 무작위 프라이머 (Amersham)(pIL-2R

6, 9 및 30의 경우) 또는 올리고(dT) 프라이머(pIL-2R

19의 경우)를 사용함을 제외하고는 발표된 공정(참조문헌: 21)에 따라 CDM8 벡터로 제조한다. 항-IL-2R

모노클로날 항체, Mik-

1, 및 Mik-

2의 칵테일에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝은 전술한 바와 같이 수행한다(참조문헌: 21). 뉴클레오타이드 서열은 디데옥시쇄 말단법과 화학적 분해 방법을 병행하여 결정한다.

제1도에서 보여지는 바와 같이, cDNA는 551개 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 커다란 개방 판독 프레임을 함유한다. 단백질 서열 데이터베이스(National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)에서의 다른 공지된 단백질 또는 보다 최근에 발표된 서열과는 동일성이 없다. 많은 다른 사이토킨 수용체와는 달리, IL-2R

및 IL-2R

쇄는 면역글로블린 초부류(superfamily)에 속하지 않는다. 단백질의 유추된 구조로부터, N-말단의 26개 아미노산은 시그날 서열을 나타내는 것으로 간주된다. 따라서 IL-2R

쇄의 상술한 형태는 계산된 분자량 58,358의 525개 아미노산으로 구성된다. 제1도에서 보여지는 바와 같이, 수용체 분자는 214개 아미노산으로 구성된 세포의 영역으로 구성된다. 이 영역은 8개의 아미노산 잔기를 함유하며, 이중 5개의 잔기는 N-말단에서 발견되며, 이들은 9 내지 12개의 아미노산에 의해 다소 주기적으로 공간을 둔다. 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합이 리간드 결합에 안정한 배위를 부여함직 하다. 사실, 많은 시스테인 잔기들이 많은 수용체의 리간드 결합 공통된 양상의 하나로 나타난다(참조문헌: 23), IL-2R

쇄의 세포외 영역내의 아미노산의 예측된 수(214개 아미노산)가 IL-2R

쇄의 세포외 영역내의 아미노산 수(219개 아미노산)와 비교된다는 것을 주목할만 하다. 이러한 크기의 유사성은 이 수용체에 대해 상당히 독특한 헤테로이량체 수용체 복합체 구조를 고려할 때 의미를 가질 수 있다;

쇄 및

쇄는 개별적으로 동일한 IL-2 분자의 다른 부위와 상호작용한다(참조문헌: 24). 215 아미노산 잔기부터 239 아미노산 잔기까지의 25개 아미노산의 소수성 영역이 수용체의 막 걸친(spanning) 영역을 구성하는 것으로 보인다(제1도 및 제2도).

제2도는 유추된 사람 IL-2R

및 IL-2R

쇄 전구체 단백질의 수치로 플롯 분석도이다. Kyte 및 Doolittle (참조문헌: 25)의 방법에 따라 분석하였다. SG 및 TM은 각각 시그날 서열 및 트랜스막 서열을 나타낸다.

쇄의 세포질 영역은 286개 아미노산으로 구성되며, 이는 단지 13개 아미노산 길이의

쇄의 세포질 영역보다 상당히 길다. 티로신 키나제의 컨센서스 서열(Gly-X-Gly-X-X-Gly)(참조문헌: 25)은

쇄의 경우 부재한다. 그러나,삼중자, Ala-Pro-Glu, Ala-Pro-Glu(293 내지 295)의 존재를 주목할 수 있다; 이는 몇몇 단백질 키나제의 촉매 영역에 대한 컨센서스 모티프임이 주장되었다. 단백질 키나제 활성을 갖는

쇄의 세포질 영역의 가능성이 이미 시험되었다. 이 영역의 1차 구조는 또다른 중요한 양상을 나타내었다. 이 영역은 프롤린(42/286) 및 세린(30/286) 잔기가 풍부하다. 흥미있게도, 프롤린 풍부 구조가 또한 CD2, T 세포의 활성화 과정에 수반되는 T세포막 항원의 세포질 영역에서 입증되었다(참조문헌: 26). 프롤린-풍부 구조는 수용체 분자와 다른 시그날 변환체(들)과의 결합에 중요할 수 있는 이 영역에 비구형 구조를 부여할 수 있다. 널리퍼진 세린 잔기는 인산화에 대한 주요 표적물일 수 있으며 이것이 수용체 작용을 조절할 수 있다(참조문헌: 27). 또한 세포질 영역은 음전화된 아미노산에 대해 현저하게 치우칠 수 있다. 사실, 이 영역은 40개의 이러한 아미노산(즉, 글루탐산 및 아스파트산)을 함유하며, 반면에 양전하된 잔기(즉, 리실 및 아르기닌) 아미노산은 단지 18개이다. 이러한 편재는 특히 세포질 영역의 중간 영역(a.a. 345 내지 390)에서 주목할 수 있다. 따라서,

쇄의 세포질 영역은 상당한 산성일 수 있다. 이러한 독특한 특성중 함께 취한 몇몇 (전체는 아님)이 추가의 하향 시그날 도입과정(들)을 이끄는데 필요할 수 있다. 수용체 단백질은 N-결합된 당화에 대한 5개의 잠정적 부위(제1b도)를 함유하며, 이중 4개는 세포외 영역에 위치된다. 이러한 해독후 변형이 측정된 성숙한 단백질 분자(70 내지 75KD)와 계산된 단백질 분자 (58KD) 사이의 차이를 설명할 수 있다.

쇄 및

쇄의 수치료 플롯 분석은 두 쇄에서 세포막에 대해 바로 인접한 소수성 영역이 존재함을 나타낸다(제2도). 이들 영역이 두 쇄 사이의 비-공유적 분자내 결합에 역할을 할 수 있다.

[사람 IL-2R

쇄 mRNA의 발현]

IL-2R

mRNA의 발현을 탐침으로 pIL-2R

30으로부터 cDNA 삽입체를 사용하여 시험한다.

제3a도는 다른 세포 유형에서 사람 IL-2R

쇄 mRNA의 발현을 설명한다. 하기 세포 공급원으로부터의 폴리(A+) RNA(레인당 2㎍)를 제조하고 표준 공정(참조문헌:14, 18, 27)에 따라 탐침으로 pIL-2R

30으로부터 유도된 XhoI-분해된 사람 IL-2R

쇄 cDNA 단편을 사용하여 RNA 블로팅 분석한다. 레인 1, YT; 레인2, Hut 101 (HTLV-1 형질전환된 사람 T 세포주); 레인 3, MT-2(HTLV-1 형질전환된 사람 T 세포주); 레인 4,ARH-77(다중 골수종 세포주); 레인 5, SKW6.4 (EBV-형질전환된 사람 B 림프아구종 세포주); 레인 6, U937 (조직구 백혈병 세포주); 레인 7, MT-1 (HTLV-형질전환된 사람 T 세포주); 레인 8L, Jurkat (사람 T 백혈병 세포주); 레인 9, HeLa (사람 경부 종양 세포주).

제3a도에서 보여지는 바와 같이, RNA 블롯 분석은 4Kb mRNA의 존재를 나타내며, 이의 발현은 IL-2R

쇄를 갖는 것으로 이전에 확인된 림프구 (즉, YT, MT2, Hut102, SKW6.4)에 한정된다(참조문헌: 12, 16, 17). 한편, mRNA 발현은 Jurkat, MT-1, U937, ARH-77 및 HeLa 세포와 같은 세포에서는 검정되지 않았다. 본질적으로, mRNA 발현 수준은 IL-2R

쇄 발현수준과 밀접히 관련된다.

제3b도는 사람 PBLs에서 IL-2R

및 IL-2R

mRNA의 발현을 설명한다. 전체 RNA (레인당 15㎍)를 각 레인에 부하시킨다. 레인1 및 레인4는 자극되지 않은 사람 말초혈 림프구 (PBLs)를 나타내며; 레인2 및 2는 24시간 동안 5㎍/ml 식물성혈구응집소(PHA)으로 자극된 PBLs를 나타내며; 레인 3 및 6은 72시간동안 5㎍/ml PHA로 자극된 PBLs를 나타낸다. RNA-블로팅된 필터를 IL-2R

탐침과 하이브리드화한다(레인 1 내지 3). IL-2R

탐침을 디하이브리드화한 후, 동일한 필터를 IL-2R

탐침(pSVIL2R-3으로부터 유도된 XbaI-BclI 단편)과 하이브리드화한다(레인4내지 6)(참조문헌: 14).

흥미있게도, IL-2R

mRNA는 자극되지 않은 PBLs에서 검정가능하며, 이의발현 수준은 유사 분열물질 자극후 일시적으로 단지2.5배 증가한다. 유동식 혈구계 분석(참조문헌: 19)으로부터 수득된 이전 데이터를 기본으로 하는 경우, mRNA 유도 양상이 다른 림프구 집단 사이에는 차이가 있는 듯 한다. 이러한 발현 양상은 세포를 발현시 반드시 유사분열물질로 자극시키는 것이 필요한 IL-2R

쇄의 발현 양상과 상당히 다르다(제3b도). 이는 두 유전자 사이의 유전자 발현에 상이한 기작이 존재함을 제시한다.

HTLV-1-형질전환된 사람 T세포주를 포함한 PBL 및 다양한 세포주로부터의 게놈성 DNA의 서던 블럿 분석은, 유전자가 단일 복제물에 존재하며 이들 세포들에서 재배열되지 않는다고 나타난다.

[cDNA-암호화된 IL-2R

쇄의 IL-2 결합 특성]

본 발명자는, cDNA 생성물이 IL-2를 결합하는가와 이전 연구에서 입증되고/되거나 제안되었던 IL-2R

쇄의 특성이 실제로 나타나는가를 시험하기위하여 일련의cDNA 발현 연구를 수행하였다. 암호화 영역 전체에 걸친 cDNA의 발현이 마우수 1ck 유전자(참조문헌: 29) 프로모터(pLCKR

)또는 몰로니(Moloney) 백혈병 비루스 LTR(참조문헌: 30)(pMLVR

)에 의해 지시되는 2개의 cDNA 발현 플라스미드를 작제하였다.

하기 공정에 따라 발현 벡터를 작제한다. pIL-2R

30을 Hind III(분해위치는 CDM8의 폴리링커 영역내에 위치된다)로 분해시키고, 양쪽 말단을 채운후, BamHI 링커를 부치고, 재결합시킨다. 이어서 생성된 플라스미드를 BanHI으로 분해시키고,

쇄의 암호화 서열 전체를 포함하는 1.8Kb DNA 단편을 BamHI-분해된 p1013 벡터에 도입하여 pLCKR

를 작제한다. BamHI-분해된 cDNA단편을 또한 레트로바이러스 벡터, pZipSV(X)(참조문헌: 30)에 도입하여 pMLVR

를 작제한다. Eco-gypt 유전자를 neo-내성 유전자로 대체시켜 사람 IL-2R

발현 벡터, pSVIL2Rneo을 pSVIL2R-3(참조문헌: 14)으로부터 수득한다.

플라스미드 pLCKR

를, 사람 IL-2를 결합하는 표면 분자가 없는 것으로 알려진 마우스 T 임파종 EL-4 및 사람 T 세포 백혈병 Jurkat 세포주에 도입한다.

Jurkat 및 EL-4 세포로의 발현 플라스미드의 형질 감염은 문헌에 기술되어 있는 전기투공법으로 수행한다(참조문헌: 39). 형질감염된 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 G418(EL-4에 대해서는 1mg/ml, Jurkat에 대해서는 1.5m/ml)을 함유한 RPMI 1640 배지중에서 선별한다. 사람 IL-2R

및 IL-2R

쇄에 대한 cDNA를 동시에 발현시키는 세포를 수득하기 위하여 pSVIL2Rneo로 형질감염된 Jurkat-유도된 클론 J

-5를 pLCKR

및 히그로마이신-내성 유전자를 함유한 플라스미드로 공동-형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 200㎍/ml 히그로마이신으로 선별한다. pMLVR

의 두 세포로의 형질감염은 이미 기술된 인산칼슘법(참조문헌: 14)으로 수행하고, 세포를 G418 700㎍/ml로 선별한다. 유동식 혈구계 분석을 수행하기 위해 5×10⁵개 세포를 30분동안 4℃에서 항체(1:500 희석된 복수)로 처리한다. 세척후, 세포를 형광-결합된 염소 항-마우스 IgG로 염색한다.

염색된 세포를 FACS440 유동식 혈구계(Beckton Dickinson)상에서 분석한다. 1-5I-IL-2 결합 분석 및 스케챠드(Scatchard) 플롯 분석을 문헌에 기술된 바와 같이 수행한다(참조문헌: 12).

제4a도는 사람 IL-2

및/또는 IL-2R

cDNA 형질감염체의 세포 표면 염색 양상에 의한 사람 IL-2R

및/또는 IL-2R

쇄 cDNAs의 발현을 나타낸다. 모세포 및 다양한 형질감염체 세포를 모노클로날 항-사람 IL-2R

항체, 항-Tac(-----), 또는 모노클로날 항-사람 IL-2R

항체, Mik-

1(

)으로 분리하여 염색한다. 점선은 형광-결합된 염소-항-마우스 IgG로만 염색된 세포의 형광프로필이다. 사용된 세포는 (1) EL

-13( 및 pLCKR

로 형질감염된 EL-4-유도된 클론), (2) J

-8(pLCKR

로 형질감염된 Jurkat-유도된 클론), (3) J

-5(pSVIL2Rneo로 형질감염된 Jurkat-유도된 클론), (4) J

-2(pLCKR

로 형질감염된 J

-5-유도된 클론), (5) J

-10(pLCKR

로 형질감염된 J

-5-유도된 클론), 및 (6) F

-3(pMLVR

로 형질감염된 NIH3T3)이다.

cDNA 생성물을 발현하는 안정한 형질전환체 클론은 FACS 분석(제4a도)에 의해 판단되는 바와 같이 EL-4(EL

-13) 및 Jurkat(J

-8) 세포에 대해 수득된다. 또한 본 발명자는 동일한 유전자를 형질감염된 사람 IL-2R

쇄 cDNA를 발현하는 Jurkat 형질전환체 클론, J

-5에 도입하였다. 생성된 2개의 형질전환체, J

-2 및 J

-10이

및

쇄 모두를 발현하는 것으로 밝혀졌다(제4a. (4)도, (5)도). 예상했던 바와 같이, 이들 형질전환체에서 발현되는 mRNA의 RNA 블로팅 분석은

및

쇄-특이적 mRNAs가 내인성 유전자가 아닌 형질 전환된 cDNA로부터 유도된다고 나타났다(참조문헌: 26). 또한, 비-림프구에서 cDNA 생성물의 특성을 조사하기 의하여, 플라스미드 pMLVR

를 NIH3T3 세포-유도된 세포주2에 도입하여(참조문헌: 30) cDNA를 발현하는 생성된 형질전환체를 수득하였다(제4a-(5)도).

IL-2 결합 연구는 125I-표지된, 재조합 사람 IL-2로 수행한다.

제4b도는 클로닝된 cDNA를 발현하는 형질전환체에 대한 125I-IL-2 결합의 스케챠드 플롯 분석으로

및

쇄의 발현을 나타낸다(Mik-

1)의 1:100-희석된 복수의 부재(-○-○-)또는 존재(-●-●-)하의 IL-2 결합 데이터의 스케챠드 플롯). 모 Jurkat 또는 EL-4 세포를 조사하는 경우 특이적인 IL-2 결합은 관측되지 않았다. 세포당 IL-2 결합 부위의 수 및 수용체 친화성은 IL-2 결합 데이터의 컴퓨터 분석으로 측정한다. (1) EL

-13, (2) J

-8, (3) J

-5, (4) J

-2, (5) J

-10.

EL-4-유도된 클론(EL

-13) 및 Jurtak-유도된 클론(J

-8)에서 볼 수 있는 바와 같이,

쇄 cDNA를 발현하는 두 클론은 모두 각각 4.0nM 및 2.7nM의 측정된 Kd 값으로 IL-2에 대해 중간-친화성을 나타낸다. 이들 세포에 대한 IL-2 결합은 Mik-

1 항체에 의해 완전히 없어진다(제4b-(1)도 및 (2)도). 사람 IL-2

및 IL-2R

cDNA를 모두를 발현하는 Jurkat-유도된 J

-2 및 J

-10 클론은 각각 J

-2에 대해서는 22pM과 15nM 및 J

-10에 대해서는 19pM과 33nM의 측정된 Kp 값을 갖는 고친화성 및 저친화성 수용체를 모두 나타낸다.

이와는 반대로,

쇄 cDNA만을 발현하는 모, Jurkat-유도된 J

-5세포는 IL-2에 대해 오직 저-친화성(Kd:19.5nM)을 나타낸다(제4b-(3)도). 고친화성 IL-2R 발현되는 J

-2 세포 및 J

-10의 수는 발현된 IL-2R

분자의수에 상응한다. 또한, 이들 세포를 Mik-

1 항체로 처리하면 세포 표면으로부터의 고-친화성 IL-2 결합 부위가 완전히 없어지나, 저-친화성 IL-2R의 발현은 보유한다(제4b-(4)도 및 (5)도). 이러한 관측은 cDNA-암호화된 IL-2R

분자가 IL-2R

쇄와 결합하여 고-친화성 수용체 복합체의 형성에 직접적으로 수반되는 것을 명백하게 증명한다. 상술된 T 세포 형질전환체와는 대조적으로, F

-3 세포는 동일한 결합조건하에서 세포 표면에 어떠한 IL-2 결합도 나타내지 않는다. 흥미있게도, 이와 동일한 관측이

쇄를 발현하는 원숭이 COS 세포에서도 관측되나 IL-2를 결합하지 못한다(참조문헌: 28). 따라서 이 결과는 작용성 IL-2R

쇄 발현에 대해 세포-유형 특이적 프로세싱 기작(들) 또는 추가의 세포 성분(들), 또는 이들 모두가 수반됨을 제시한다.

재구성된 IL-2R의 분자 구조를 더욱 특징분석하기 위하여, 본 발명자는 125 I-IL-2 및 분해되지 않은 화학적 교차링커, 디숙신이미딜수버레이트(DSS)로 화학적 교차결합 실험을 수행하였다.

제5도는 IL-2R-양성 형질전환체의 친화성 교차결합 연구 결과를 나타낸다. 세포를 표지되지 않은 IL-2(레인5 내지 7)250배 몰 과량, 친화성 컬럼-정제된 Mik-

1(레인8 내지 10)500배 몰과량 또는 친화성 컬럼-정제된 항 Tac (레인11 내지 13)500배 몰과량의 존재 또는 부재(레인1 내지 4, 14 내지 16)하에 125 I-IL-2 5nM(레인1 내지 13) 또는 100pM(레인14 내지 16)과 함께 배양한다. 이어서 세포를 문헌에 기술된 바와 같이 디숙신이미딜 수버레이트(DSS)와 화학적으로 교차 결합시킨다(참조문헌: 16). 이어서 세포를 용해 시키고, 상등액을 7.5% SDS-PAGE를 수행한다. 사용된 세포는 Jurkat(레인1); J

-5(레인2, 5, 8, 11, 14); J

-8 (레인3, 6, 9, 12, 15); J

-10(레인4, 7, 10, 13, 16)이1다. 125 I-IL-2와 교차 결합된 YT 세포를 표지물(M)로서 사용한다.

단지 IL-2R

쇄안을 발현하는 세포를 125 I- 표지된 IL-2와 교차 결합시키고 SDS PAGE로 분석하는 경우, 90KD 메이저와 85KD 마이너로 구성된 이중 밴드가 검출되며, 이의 이동 프로필은 YT 세포의 이동 프로필과 구별할 수 없다(제5도에서 화살표 참조: 참조문헌: 16, 17). 이중 밴드의 출현은 과량의 표지되지 않은 IL-2에 의해서나 Mik-

1에 의해 억제된다. 이중 밴드의 형성은 수용체-IL-2-복합체의 분해에 의할 수 있다. 또한 두 단백질 생성물은 모두 상이한 해독후 변형(들)에 의해 유도될 수도 있다. 달리는, 두 밴드중 하나가 수용체 복합체의 제 3의 성분을 나타낼 수 있다. 또한 150KD 위치 주변으로 이동하는 넓은 밴드가 형질감염체(J

-10) 및 YT 세포에서도 검출된다.

이 밴드의 출현은 표지되지 않은 IL-2 또는 Mik-

1에 의해 억제된다. 이는 IL-2 분자와 IL-2R

분자와 IL-2R

분자와의 삼중 복합체를 나타낼 수 있다. 제4도에 나타난 일련의 화학적 교차-결합 실험에서, J

-2의 표면상에 발현되는 수용체 복합체의 물리-화학적 특성은 배양된 T 세포 또는 pBLS상에서 발현되는 고-친화성 수용체의 특성과 구별되지 않는다는 것이 증명되었다(참조문헌: 12, 16 17).

비-림프구에서

및

쇄의 발현으로 고-친화성 수용체가 형성되는지를 결정하기 위한 실험의 예비적 결과는,

및

쇄 cDNA가 COS 세포에서 일시적으로 공동-발현될 때 두 쇄가 400p의 농도에서 125 I-IL-2와 교차결합할 수 있으며, 유사하게 발현된

쇄 단독으로는 교차결합할 수 없음을 나타낸다(참조문헌: 28). 이 결과는 비-림프구 세포주에서

헤테로이량체 수용체의 형성을 제시할 수 있다.

[재구성된 수용체에 의한 IL-2 내재화]

중간-친화성 IL-2 수용체 및 고-친화성 IL-2 수용체는 모두 IL-2를 내재화 할 수 있음이 보고되어 있다(참조문헌: 33 내지 35). 리간드 내재화는 통상 IL-2 시그날 도입을 수반하며, 이는 이과정이 필수적임을 제시한다.

제6도는 재구성된 수용체를 통한 IL-2 내재화를 나타낸다. IL-2 내재화는 문헌에 기술된 방법(참조문헌: 33)에 따라 실험된다. 간략하게 설명하면, 세포를 (5×10⁷)를 30분동안 0℃에서 200pM(J

-10)또는 5nM(J

-5, J

-8 및 EL

-13)의 최종 농도의¹²⁵I-IL-2로 처리한다. 세척한 후, 세포를 예비 가온된 배양 배지(37℃)로 현탁시키고, IL-2 내재화의 동력학을 문헌에 기술된 바와 같이 실험한다(참조문헌: 33). (a) EL

-13, (b) J

-8, (c) J

-10, (d) J

-5, (

), 내재화된 IL-2; (

), 세포-표면 결합된 IL-2; (

), 유리 IL-2.

제 6도에서 보여지는 바와 같이, 본 발명자는 재구성된 수용체가 IL-2를 내재화할 수 있는가를 실험하였다. 사실, IL-2R

쇄만을 발현하는 세포, 또는

및

쇄 모두를 발현하는 세포가 천연 수용체에 대해 보고된 동력학 양상과 유사한 양상에 따라 내화시킬 수 있다. 이와는 반대로 단지 IL-2R

만을 발현하는 Jurkat 세포는 문헌에 보고된 관측과유사하게 (참조문헌: 33, 34) IL-2를 내화시키지 못한다. 예비적 결과는 중간-치환성 또는 고-친화성 수용체를 발현하는 세포의 L성장이 IL-2에 의해 선택적으로 억제된다는 것을 나타내었다(참조문헌 14, 36). 본 발명자는 또한 또다른 숙주 세포주에서 발현되는

쇄가 IL-2에 대한 반응시세포 성장을 자극한다는 예비적 결과를 갖고 있다(참조문헌: 28)

[쥐 IL-2R 수용체

쇄의 클로닝]

쥐 IL-2 수용체

-쇄에 대한 특이적 항체가 존재한다는 것이 알려져 있지 않으므로, Hu IL-2R

쇄가 대한 cDNA의 분리에 사용된 스크리닝 방법을 이용할 수 없다.

cDNA 라이브러리는 콘카나발린 A 자극된 마우스 비장 세포로부터 폴리(A)⁺-RNA를 사용하여 제조한다; cDNA를 이. 콜라이에서 증식된

gt 10에 클로닝한다.

이어서 이 라이브러리를 엄격하지 않은 조건하에 탐침으로서 전술된 사람 IL-2R

쇄 cDNA를 사용하여 스크리닝한다. 양성 클론으로부터

MIL 2R

-26 클론을 선별한다. 이 클론내의 cDNA 삽입체는 전체 쥐 IL-2R

쇄 서열의 단지540bp 서열을 함유한다. 따라서, 이 서열을 Pvu 2를 사용하여

MIL-2R

-26을 분해시켜 분리시키고, 표준공정에 따라 마우스 흉선종 세포주 EL-4로부터의 폴리(A)⁺를 사용하여 제조된 또다른 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하며, CDM8 벡터의 BstXI 부위에 클로닝시킨후, 이. 콜라이를 형질 감염시킨다.

cDNA 라이브러리를 유럽 특허원 제 88 119602.9호 및 문헌(Kashina et al, Nature Vo. 313 pp 402-404, 1985)에 기술된 방법에 따라 매우 엄격한 조건하에 스크리닝한다.

양성 클론으로부터 쥐 IL-2R

에 대한 구조 유전자(제8도)를 함유하는 클론 pMIL-2R

-36을 선별한다. cDNA 클론의 제한 지도를 제7도에 나타내었다.

플라스미드 pMIL02R

-36는 이. 콜라이 MC 1061/P3 내에 부다페스트 조약하의 Fermentation Research Institute에 198년 5월 23일, 기탁번호 FERM BP-2435로 기탁되었다.

[가용성 사람 인터루킨 2 수용체

-쇄의 재조]

hIL2-R

쇄의 분비 형태(이하, 가용성

로 칭함)는 NIH 3T3 섬유아세포를 천연

-쇄의 세포질 내 영역과 트랜스막 영역을 암호화하는 DNA 서열 전체가 부족한 변형된

-쇄 cDNA (앵커 마이너스 cDNA)로 형질전환시켜 생성한다.

가용성

를 암호화하는 앵커 마이너스 cDNA를 갖는 발현

[벡터(BCMGNeo-sol.

)의 작제]

-THI cDNA (제1b도)를 가용성

를 생성하기 위해 앵커 마이너스 형태로 변형시킨다. 앵커 마이너스 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 방법이 제9도에 도시되어 있다, 먼저, CDM8 벡터내에 2.3kb

-쇄를 함유하는 플라스미드pIL-2R

30을 BssH II 및 Sma I(모든 제한 효소는 New England Biolabs, Beverly, MA, USA에서 구입함)으로 분해시키고,

-쇄의 암호화 서열 전체를 포함한 1.9kb cDAN 단편 (염기 58부터 1967까지)을 수득한다. BssH II 말단을 채운후, 1.9-kb cDNA를 pBluescript SK 벡터(Stratagene, San Diego, CA, USA)의 SmaI 제한 부위에 삽입시킨다. 이어서 pBluescript SK-

1.9 플라스미드를 Sty I (제한부위; 염기 825, 934 및 1235) 및 SmaI으로 분해시켜 세포질내 영역과 트랜스막 영역을 모두 결합시킴으로써 온전한 세포외 영역을 나타내는 염기 121부터 180까지를 남긴다. 다음 다중 종결 코돈(TAG) 및 Nhe I에 대한 인지서열을 함유하는 12개 염기 합성 링커(New England Biolabs, #1060)를 인산화시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 Sty I/Sma I-분해된 플라스미드 DNA에 결합시킨다. Nhe I으로 분해시켜 과량의 링커를 제거시킨후, DNA를 SK 벡터에 결합시켜 pBluescript SK-sol.

를 작제한다.

이 pBluescript SK-sol.

를 Sal I 및 Not I(이 제한부위는 pBluescript SK 벡터의 폴리링커 영역내에 위치한다)로 분해시키고, 가용성

를 암호화하는 생성된 0.8kb cDNA 단편을 분리시킨다. 이 cDNA 단편을 시토메갈로비투스(CMV) 프로모터 및 네오마이신-내성 유전자를 함유하는 Xho I/Not I-분해된 BCMGNeo벡터(참조: Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169: 13-25, 1989)에 도입하여 최종 발현 플라스미드 BCMGNeo-sol.

를 생성한다. BCMGNeo는 포유동물 세포에서 염색체의 복제를 확실하게 하는 69%의 소 유두종 비루스(BPV)서열을 함유하는 셔틀 벡터이다. 천연

및 가용성

에 대한 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타내는 제10도에 나타난 바와 같이, 가용성

cDNA는 26개 aa의 시그날 펩타이드를 수반한 212개 아미노산으로구성된 성숙한 단백질을 암호화하며, 천연

-쇄 cDNA는 시그날 펩타이드(26 aa), 세포의 (214 aa), 트랜스막(25 aa), 및 세포질내 (286 aa) 영역으로 구성된 막 단백질을 암호화한다. 천연

및 가용성

에 대한 뉴클레오타이드 및 상응하는 아미노산 서열이 제 10도에 나타나 있다.

[BCMGNeo-sol.

로 NIH 3T3 섬유아세포의 형질전환 및 가용성

를 분비하는 안정한 형질전환체의 생성]

cDNA 형질 전환을 문헌(참조: Karasuyama et al., 상기 참조)에 기술된 원형질체 융합 기술로 수행한다. 간략히 설명하면 BCMGNeo-sol.

를 함유하는 세균을 원형질체로 전환시킨 후, 폴리에틸렌 글리콜 2,000(Wako Chemical Industries, Osaka, Japan)을 사용하여 쥐 섬유아세포 세포주, NIH 3T3와 융합시킨다. 이어서 10,000,000원형질체-융합된 NIH 3T3 세포를 4개의 24-웰 평판에 시이딩한다. 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 750㎍/ml G418 (Geneticin; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 함유하는 RPMI 1640 배지중에서 배양한지 25일후, 형질전환체-세포 성장이 104개중 60개웰에서 관측되었다. 하기 기술되는 바와 같은 샌드위치 효소-결합된 면역 흡수 검정법(ELISA)에 의해 측정하는 경우, 60개중 18개웰로부터의 배양 상등액에 가용성

에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다. 5개의 클론이 ELISA에서 가장 높은 흡광도를 나타내는 웰로부터 제한 희석에 의해 수득되며, 이들은 가용성

를 고수준으로 분비하는 것으로 밝혀졌다(표 1). 이와는 반대로, 전 길이의

-쇄 cDNA로 형질전염된 NIH 3T3(3T3-

11로 칭함)는 어떠한 정도로는

-쇄 분자를 분비하지 않았다. 후속한 연구에서, 본 발명자는 가용성

를 가장 많이 분비하는 클론 3T3-B4-14를 사용하였다.

[가용성

를 검정하기 위한 ELISA]

형질감염된 세포의 배양 상등액을 샌드위치 효소-결합된 면역흡수 검정법(ELISA)에 의해 가용성

의 존재에 대해 스크리닝한다. 이 검정법에서는

-쇄상의 상이한 에피토프를 인지하는 2개의 모노클로날 항체 Mik-

1 및 -

3(참조 Rsudo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1982-1966, 1989)을 사용한다; 즉 Mik-

1은 IL-2 결합 부위를 인지하고, Mik-

3은 IL-2 결합에 수반되지 않은 에피토프를 인지한다. 제11도에서 설명되는 바와 같이, 샌드위치 ELISA Immulon-I 미세역가 평판(Dynatec, Chantilly, VA, USA)을 트리스-완충 식염수(10mN, Tris-HCl, pH7.4, 0.15M NaCl)중의 10㎍/mL의 Mik-

3 50㎕로 밤새 코팅시킨다. 과량의 항체를 버린후 결합되지 않은 부위를 1시간 동안 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 TBS와 함께 배양하여 차단시킨다. 0.05% 트위 20을 함유하는 TBS(T-TBS)로 세척한후, 형질전환체의 배양 상등액 50㎕를 웰에 가하고 1시간 동안 배양한다. 세척한후, 1㎕/ml의 바이오티닐화된 Mik-

1 50㎕를 평판상의 제1항체, Mik-

3에 결합된 가용성

를 검정하기 위한 제2항체로서 가한다. 배양하고 세척한지 45분후, 알칼리성 포스파타제-결합된 아비딘(Tago, Burlingame, CA, USA) 50㎕을 가한다. 배양한지 45분후, 평판을 세척하고 p-니트로페닐 포스페이트 100㎕를 가하고, 45분후 웰의 흡광도를 405nm에서 측정한다.

[분비된 가용성

의 겉보기 분자량]

가용성

의 분자크기를 정의하기 위하여, 3T3-B4-14세포를 35S-메티오닌으로 생합성적으로 표지시키고, 가용성

를 세포 상등액으로부터 Mik-

1 mAb에 의해 면역침전시킨다. 침전시키기 위해 Mik-

1 및 대조용로서 UPC 10 mAb을 사용한 다양한 양의 면역 침전물을 부하시키고 8% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동시킨다. 제12도에 나타난 바와 같이, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 실험하는 경우, Mik- 1(대조용 UPC 10mAb는 아님) 3T3-B4-14 세포의 배양 상등액중에서 겉보기분자량 37,000을 갖는 단일 종류의 단백질을 확인하였다. 분자크기는 트란스막(25 aa) 및 세포질내(286 aa)영역이 모두 부족한 잘린

-쇄에 대해 예견된 크기와 매우 일치한다.

[가용성

의 IL-2 결합능]

이어서,

쇄의 분비 형태가 IL-2를 결합할 수 있는지를 조사하였다. 마지막으로, 경쟁적 샌드위치 ELISA를 사용한다. 이 검정법에서, 배양 상등액 중의 가용성

를 IL-2 결합을 위해 Mik-

3 mAb, 비억제 mAb에 의해 고체상에 고정시켜,

-쇄상의 추정되는 IL-2 결합 부위를 차지하지 않게 한다. 이어서 IL-2 또는 표지되지 않은 Mik-

1의 연속 희석물을 바오티닐화된 Mik-

1에 대한 경쟁자로서 가한다. 제13도는 경쟁적 샌드위치 ELISA의 결과이며, 여기에서

는 표지되지 않은 Mik-

1의 연속 희석물에 대한 것이며,

는 IL-2의 연속 희석물에 대한 것이다. 제13도에 나타난 바와 같이, 표지되지 않은 Mik-

1은 용량-의존적으로 흡광도가 감소되므로, 이 시스템의 특이성을 나타낸다. 이와 마찬가지로, IL-2는 가용성

에 대한 결합에 대해 바이오티닐화된 Mik-

1과 용량-의존적으로 효과적으로 경쟁하므로, 가용성

와 IL-2 결합에 필요함을 나타낸다.

이러한 경쟁 곡선은

-쇄만을 단독으로 발현하는 YTS 세포로부터의 세제-용해된 천연

-쇄 형태에 대해 밝혀진 곡선과 상당히 유사하며, 이는 IL-2에 대한 가용성

의 친화성이 가용화된 천연

-쇄의 친화성에 상응한다는 것을 나타낸다.

IL-2R

쇄를 암호화하는 유전자의 이용가능성은 IL-2 시스템의 작용 연구에 대한 새로운 접근법을 개발할 수 있게 한다. IL-2 시스템에 작용하는 수용체 구조는 2개의 구조적으로 상이한 막 분자, IL-2R

및 IL-2R

쇄가 모두 독립적으로 IL-2를 결합한다는 것이 독특하다. 본 명세서에 기술된 일련의 cDNA 발현 실시예는

쇄 및

쇄가 분자의 비-공유적 결합을 통하여 고-친화성 IL-2R 복합체를 구성한다는 이전의 주시를 더욱 구체화한다(참조문헌: 18, 37). 따라서, 이 시스템의 특색은 하나의 리간드와 2개의 상이한 수용체 사이의 3개의 분자내 상호작용을 수반한다는 것이다. 본 발명에 의하여, 이러한 독특한 사이토킨 수용체의 작용 영역을 밝힐 수 있다. 클로닝된

쇄 cDNA의 돌연변이적 분석은 리간드 결합 및

쇄와의 결합에 수반되는 각각의 영역을 확인하는 실마리를 제공할 수 있다. 현재까지, 이들의 상동 수용체와 상호작용하는 사이토킨에 의해 개시되는 생화학적 사건의 케스케이드에 대해서는 알려져 있지 않다. 본 발명에 의해 본 발명자는 IL-2 시그날 과정(들)을 이끄는데 수반될 수 있는 커다란 세포질 영역의 IL-2R

쇄에 존재를 입증하였다. 세포질 영역에서 발견되는 특정한 산성 핵은 다른 세포질 시그날 변환기에 대한 결합을 제시할 수 있다. 달리는, 핵내에서의 IL-2의 존재에 대한 이전 보고서에 비추어(참조문헌: 33), 흥미있는 가능성은 IL-2R

세포질 성분의 산성 영역 및 프로린-풍부 영역이 유전자 프로그램의 활성화에 역할을 할 수 있다는 것이다. cDNA-암호화된

쇄가 성장 시그날을 전달할 수 있는 발현 시스템의 이용가능성이 수용체의 작용 영역을 더욱 설명할 수 있게 한다. 이제 면역계의 전개 및 조절에서 IL-2의 필수적인 역할을 할 수 있게 되었다.

가용성 분자의 결정화가 불용성 분자 보다 용이하게 성취되므로, 세포 표면 수용체

-쇄에 대한 가용성 상대물의 이용가능성은

-쇄 구조적 분석을 용이하게 한다. 또한 가용성 분자는 수용체의 생물학적 작용이 연구 또는 치료적 목적을 위해 실체 세포 표면수용체를 중화시키는데 사용될 수 있다.

[참고 문헌]

Claims (11)

1. IL-2 수용체의

   

   -쇄를 암호화하는 하기 식(I) 또는 (Ⅱ)의 재조합 DNA분자:

   

   

   

   여기에서 XXX는 GGC 또는 TGC를 의미한다. 또는 상기 DNA 분자중 어느 한 서열의 일부로서 IL-2에 결합가능한 IL-2 수용체의

   

   -쇄 단편을 암호화하는 부분.
2. 제1항에 있어서, FERM BP-2312, FERM BP-2313, FERM BP-2314, FERM BP-2315 또는 FERM BP-2435의 수탁번호로 각각 기탁된 플라스미드 중 어느 하나에 포함된 DNA 삽입체 또는 이 DNA 삽입체의 일부로서 IL-2에 결합가능한 IL-2 수용체의

   

   -쇄 단편을 암호화하는 재조합 DNA 분자.
3. 제1항 또는 제5항에 있어서, IL-2R

   

   쇄 전체 또는 그의 일부의 가용성 부분으로서 IL-2에 결합가능하고 인간 IL-2R

   

   쇄의 약 1부터 약 210까지의 아미노산으로 구성된 부분을 암호화함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
4. 제1항에 있어서, 프로모터, 인핸서, 롱터미널리피트(long terminal repeats; LTR), 업스트림 프로모터 요소(upstream promoter elements; UPE), 전사인자 결합부위, 내부조절영역(internal control regions;ICR), TATA-박스, CCAAT-박스, 억제자(repressor) 및 침묵자(silencer)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의조절서열을 추가로 함유하는 재조합 DNA 분자.
5. 제4항에 있어서, 플라스미드인 재조합 DNA 분자.
6. 제5항에 있어서, FERM BP-2312, FERM BP-2313, FERM BP-2314, FERM BP-2315 또는 FERM BP-2435의 수탁번호로 각각 기탁된 플라스미드인 재조합 DNA분자.
7. 제4항에 따른 재조합 DNA분자에 의해 형질전환된 세균세포, 효모세포 및 포유동물세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 숙주세포.
8. 적합한 벡터를 하나 이상의 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨 후 목적하는 DNA를 분리시킴을 특징으로 하여 제1항에 다른 DNA 분자를 제조하는 방법.
9. 적합한 숙주 유기체를 발현에 적합한 위치에서 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1항에 따른 서열을 함유하는 발현벡터로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체로부터 목적하는 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따른 DNA분자에 의해 암호화되는 단백질을 제조하는 방법.
10. 적합한 숙주를 제4항에 따른 DNA 분자로 형질전환시킴을 특징으로 하여, 제7항에 따른 숙주세포를 제조하는 방법.
11. 제1항에 따른 DNA 분자를 적합한 벡터에 삽입시킴을 특징으로 하여, 제4항에 따른 DNA 분자를 제조하는 방법.

Images