JP3267966B2 - 顆粒球―マクロファージコロニー刺激因子受容体およびその誘導体における改良 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は一般に、ヒト組換え体および合成の顆粒球
−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）受容
体、およびその生化学的および／または生物学的な対応
物、同族体、または誘導体に関するものである。これら
の分子は、治療薬および診断薬の製造にとりわけ有用で
あり、またGM−CSFの受容体結合に関連するアゴニスト
およびアンダコニストの産生に有用である。

顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CS
F）は、好中球、好酸球、および単球／マクロファージ
系列細胞の増殖、分化および機能活性を調節する糖タン
パク質型の増殖・分化因子である［メトカーフ（1984
年）、ゴーフおよびニコラ（1989年）、総説］。マウス
［ゴーフら（1984年）］、およびヒト［ウォングら（19
85年）］のGM−CSFを暗号化した分子クローンが単離さ
れ、組換え体タンパク質は動物モデル系［メトカーフら
（1987年）、ドナヒューら（1986年）］および種々の造
血不全患者の臨床第I/II相試験で試験された［モーステ
ィンら（1989年）、総説］。動物実験および臨床試験の
何れの場合も、GM−CSFは単球、好中球、好酸球の循環
量を増大させ、循環する細胞の機能容量を向上させ、化
学療法および／または骨髄移植に伴う造血機能の回復速
度を促進することが判明した［ゴーフおよびニコラ（19
89年）、モースティンら（1989年）］。

マウスおよびヒトのどちらの系でも、オートラジオグ
ラフィー分析で、GM−CSF受容体は単球、好中球、およ
び好酸球系列に属する細胞に少数（１細胞当たり数百）
だけ存在することが判明した［ニコラ（1987年）、ディ
ペルシオら（1988年）］。然しながら、内皮細胞［ブッ
ソリーノら（1989年）］、小細胞肺ガン細胞系およびSV
40を導入したサルCOS細胞［コシタ・ボールドウインら
（1989年）］等を含む非造血系細胞でも同様に機能的な
GM−CSF受容体が検出された。

ウォーカーおびバージェス（1985年）は、マウス系で
高親和性（K_D約30pM）および低親和性（K_D約1nM）の両
方の受容体を検出したが、パークら（1986年ａ）はK_D1
〜3nM級の単一の受容体を検出した。ヒト系では、造血
系細胞および内皮細胞で高親和性の受容体（K_D約30pM）
だけが報告されたが［ギャッソンら（1986年）、ブッソ
リーノら（1989年）、パークら（1986年ｂ）］、COS細
胞では低親和性受容体が報告された［コシタ・ボールド
ウインら（1989年）］。マウス系で、GM−CSF受容体
は、インターロイキン−３−およびその他の活性因子に
よって間接的に下方調節されるが、GM−CSF受容体（複
数もあり）はGM−CSFだけを認識する［ウォーカーら（1
985年）、ニコラ（1987年）］。

GM−CSFの生物学的効果の多くはピコモル濃度で観察
され［メトカーフ（1984年）］、発明者らは高親和性受
容体が選択的に内部化されることを見いだしたから［ゴ
ーフおよびニコラ（1989年）］、低親和性受容体が生物
学的に機能的であるのかどうかは明白でない。マウス系
では、37℃で［ウォーカーら（1985年）］、ヒト系で
は、４℃または37℃で［エリオットら（1989年）、ロペ
ツら（1989年）、パークら（1989年）］、多能性CSF
（インターロイキン−３）は、ある種の型の造血系細胞
のGM−CSF受容体を下方調節することできるが、これは
さまざまな受容体サブクラスによって仲介されるのか、
または受容体−受容体相互作用によって仲介されるのか
は明らかでない［ギアリングら（1989年）、エリオット
ら（1989年）、ロペツら（1989年）］。

本来、GM−CSFは顆粒球／マクロファージ始原細胞の
増殖刺激能によって定義されたが、最近になって、これ
がその他の造血系［メトカーフら（1980年）］の始原細
胞、および非造血系起源の細胞の増殖をも刺激すること
が明らかになった。これらは、ヒト骨髄繊維芽細胞、骨
原性肉腫細胞系、および乳ガン細胞系［デッドハーら
（1988年）］、ヒト小細胞ガン細胞系［コシタ、ポール
ドウインら（1989年）］、ヒト内皮細胞［ブッソリーノ
ら（1989年）］、およびヒト胎盤細胞［ウェグマンら
（1989年）］等である。しかもGM−CSFは、試験管内で
ヒト内皮細胞の遊走［ブッソリーノら（1989年）］、ヒ
ト骨芽球様細胞の増殖および機能［エバンスら（1989
年）］を刺激し、生体内でマウス胎盤細胞の増殖を増大
させる［ウェグマンら（1989年）］。

これらの生物学的な結果から考え、内皮細胞で高親和
性の受容体だけが検出され、繊維芽細胞および胎盤膜で
低親和性の受容体だけが検出される事実にもかかわら
ず、これらの細胞で検出されたGM−CSF受容体が機能的
であることは明白である。

造血系細胞では、低親和性hGM−CSF受容体は37℃でリ
ガンド解離速度が早く、内部化に乏しいが、高親和性受
容体は、はるかに遅いリガンド解離速度を示し効率的に
内部化されることによって鑑別される。この複雑さに加
えて、２つの型の高親和性hGM−CSF受容体が若干の造血
系細胞および細胞系（正常なものばかりではない）で報
告された。１つの型は、hGM−CSFだけを認識し、ヒト好
中球にあるGM−CSF受容体の唯一の型であるが、別の型
は、明らかにhGM−CSFおよびｈ−IL−３をほぼ同等の親
和性で認識し、好酸球にあるGM−CSF受容体の80％を占
める［ロペツら、（1989年）］。また逆にIL−３に特異
的な受容体、または交差反応性の受容体が報告された
［パークら、（1989年）］。

最後に架橋実験によって、マウスGM−CSF受容体の分
子量は51000［ウォーカーおよびバージェス（1985
年）、または130000［パークら（1986年ａ）］であるこ
とが示唆されたが、ヒト受容体の分子量は84000と概算
された［ディペルシオら（1988年）］。

GM−CSF受容体の特性の幾つかは推論されたが、受容
体はこれまで単離または精製されていない。

［発明の要旨］ この発明は、ヒトGM−CSF受容体を暗号化している遺
伝子を提供する。この遺伝子の発現によって、これまで
入手できなかった大量の組換え体受容体が提供され、そ
れによって、とりわけ受容体治療、診断、およびアゴニ
スト、アンタゴニスト等の開発を可能にする。

したがってこの発明の第１の特徴は、ヒト組換え体ま
たは合成のGM−CSF受容体、およびGM−CSFへの結合能を
有する可溶性領域（膜を伴わない）を含んだ受容体部分
を含むその誘導体に関するものである。

この発明の第２の特徴は、ヒト組換え体または合成の
GM−CSF受容体（およびその誘導体）を認識する抗体に
関するものであって、この抗体は、これらの分子の検出
および／または精製に有用なものである。

この発明の第３の特徴は、GM−CSFの細胞結合受容体
への結合をGM−CSFのアゴニストまたはアンタゴニスト
によって調節することに関する。

この発明の第４の特徴は、組換え体または合成のGM−
CSF受容体、またはその誘導体の有効量を哺乳動物へ投
与することによる哺乳動物、特にヒトにおけるGM−CSF
が関係する疾患の処置方法を提供する。そのような方法
の１つは、哺乳動物におけるGM−CSF刺激感受性細胞の
増殖、分化、または機能の活性化を調節することを含
み、この方法は、非結合型GM−CSFの量を低下させるの
に十分な期間および条件下に、組換え体または合成のGM
−CSF受容体、またはその誘導体の有効量を哺乳動物へ
投与することからなる。有効量は静脈内、筋肉内、皮
下、または経口のような最も有効で、そして／または好
都合な投与経路で投与できるように、日常的な実験によ
り容易に決定できる。徐放性製剤は特殊な目的に好都合
であり得る。好ましくは哺乳動物およびGM−CSF受容体
の起源は相同性であり、一層好ましくはその相同系はヒ
トである。

この発明の第５の特徴は、哺乳動物におけるGM−CSF
刺激感受性細胞で構成され、もしくはそれに随伴するガ
ンおよび／またはその他、GM−CSFが関係する疾患の診
断方法を提供する。この方法は、GM−CSF受容体または
その異常を検出することを含む。この特徴のため、この
発明はそのような診断目的のためのキットを包含する。
例えば放射線免疫検定、蛍光免疫検定、またはELISAを
利用する測定用診断キットが特に期待される。

この発明の第６の特徴は、GM−CSFが関係する疾患の
処置のための医薬の製造に組換え体または合成のヒトGM
−CSF受容体を利用することに関する。

この発明の第７の特徴は、異種GM−CSFに対して低親
和性の受容体をクローン化したGM−CSF依存性造血細胞
系に関する。

この発明の第８の特徴は、GM−CSF受容体を暗号化し
たcDNA断片についてcDNAライブラリーをスクリーニング
する方法に関するものであって、この方法は cDNAライブラリーを組立て、 それからcDNA断片を調製し、 この断片を哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトし、 トランスフェクトした細胞を標識したGM−CSFとイン
キュベートし、 トランスフェクトした細胞集団を同定し、 標識したGM−CSFを結合し、 標識したGM−CSFへ哺乳動物宿主細胞を結合させるこ
とができるcDNA断片を導入した宿主細胞クローンを調製
し、 このクローンを単離する からなる段階を含む。

［図面の簡単な説明］ 下記の図面により、この発明をさらに詳細に説明す
る。これらは単に例示的なものであって、発明の範囲を
限定する目的をもつものではない。

第１図は、¹²⁵I−hGM−CSFの A.1.25％（w/v）DMSOで５日間インキュベーション後のH
L60細胞、および B.精製したヒト胎盤膜 への結合の飽和結合等温線、およびスキャッチャード分
析を示す。

（Ａ）は、DMSOで処理したHL60細胞（１点当たり、５
×10⁶）を濃度を増大させた¹²⁵I−hGM−CSFとともに４
℃で３時間インキュベートし、遠心直後、あるいはリン
酸緩衝化食塩水（PBS）1mlと４℃で10分間インキュベー
ションしたのち、特異的な細胞結合型放射能を測定し
た。これらの結合データのスキャッチャード分析（下
段）を解離前または解離後について示す。未解離の細胞
について電算機処理した高親和性および低親和性結合成
分を実線で示す。（Ｂ）は、実施例１のようにして調製
したヒト胎盤膜浮遊液40μｌを濃度を増大させた¹²⁵I−
hGM−CSFとともに20℃で１時間インキュベートし、スキ
ャッチャード変形を行った特異的結合を（Ｂ）図の下段
に示す。

第２図は、ヒト胎盤膜上のhGM−CSFおよびｈ−IL−３
受容体の結合特異性を示す。未標識のhGM−CSF（500n
g）またはｈ−IL−３（100ng）を添加または添加せず、
膜（40μｌ）を¹²⁵I−hGM−CSF（HRF溶液110μｌ中、20
0000cpm）と20℃で１時間インキュベートした（二
重）。同様に上記と同量の未標識のhGM−CSF、またはIL
−３を添加または添加せず、膜（40μｌ）を¹²⁵I−ｈ−
IL−３（HRF溶液110μｌ中、220000cpm）とインキュベ
ートした。それぞれの膜標品への結合合計（平均値±範
囲）を示す。

第３図は、COS−７細胞へトランスフェクトしたhGM−
CSF受容体の検出および特異性を示す。

（ａ）cDNAライブラリーのプール138でトランスフェク
トしたCOS−７細胞1.5×10⁶で検出された単一の明らか
に陽性の細胞を示した細胞オートラジオグラフィーの顕
微鏡写真（オートラジオグラフィー粒子で覆われたCOS
細胞、倍率×20）、 （ｂ）暗視野照射下に撮影した（ａ）と同じ顕微鏡写
真、 （ｃ）純粋なhGM−CSF受容体クローン（クローンpGMR13
8）でトランスフェクトし、¹²⁵I−hGM−CSF 2nMとイン
キュベートしたCOS−７細胞の細胞オートラジオグラフ
ィーの暗視野照射（倍率×10）、 （ｄ）（ｃ）と同じ、ただし細胞を未標識のhGM−CSF受
容体20nMとインキュベートした場合。オートラジオグラ
フィー粒子が劇的に減少している点に注意。

（ｅ）COS−７細胞へトランスフェクトした胎盤hGM−CS
F受容体の特異性。純粋なクローン（pGMR138）で48時間
前にトランスフェクトしたCOS−７細胞を、未標識のhGM
−CSF、ｈ−IL−３、マウスGM−CSF、ヒトＧ−CSF、ま
たはヒトIL−6 100ngの存在または存在なしに¹²⁵I−hGM
−CSF結合能について検定した（二重）（平均値±範
囲）。トランスフェクトした細胞（１点当たり30000）
を、EDTA 20mMおよびコンドロイチン硫酸100μg/mlおよ
び¹²⁵I−hGM−CSF（100μｌ中、70000cpm）を含有するH
RF溶液中で20℃で１時間インキュベートした。

第４図は、COS−７細胞へトランスフェクトした胎盤h
GM−CSF受容体の飽和および競合結合分析を示す。純粋
なクローン（pGMR138）で48時間前にトランスフェクト
したCOS−７細胞（１点当たり、33000を、HRF 85μl/ED
TA 20mM/コンドロイチン硫酸100μg/mlの一定容量の溶
液中で濃度を増大させた¹²⁵I−hGM−CSF（200000cpm）
（Ａ図）、または一定量の¹²⁵I−hGM−CSF、および濃度
を増大させた未標識のhGM−CSFまたはｈ−IL−３（Ｂ
図）と20℃で1.5時間インキュベートした。Ａ図上段は
結合合計、非特異的結合、および特異的結合、下段は特
異的結合のスキャッチャード変形を示す。Ｂ図上段は結
合合計、下段は特異的結合データのスキャッチャード変
形を示す。

第５図は、DMSO処理したHL60細胞、およびトランスフ
ェクトしたCOS−７細胞におけるhGM−CSF受容体のSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した化学的架橋
分析を示す。レーンＡ〜Ｄでは、DMSOで９日間処理した
HL60細胞を１点当たり５×10⁶使用し、レーンＥ〜Ｊで
は、トランスフェクトしたCOS−７細胞を１点当たり７
×10⁴使用した。それぞれの場合、¹²⁵I−hGM−CSF（2n
M）と４℃で３時間結合させた。レーンＣおよびＤは、P
BS溶液1ml中で10分間解離し、または解離せずに、低親
和性結合を除去し、レーンＡおよびＢは、ＣおよびＤと
同様に、ただし結合反応の間に未標識のhGM−CSF20nMを
加えた。何れの場合も、DSS 1mMを架橋に使用した（氷
上で15分間）。レーンＥ〜Ｊは、トランスフェクトした
COS細胞を¹²⁵I−hGM−CSFと結合させ、ついで氷上で15
分間、DSS 0mM（Ｅ）、0.01mM（Ｆ）、0.05mM（Ｇ）、
0.1mM（Ｈ）、0.5mM（Ｉ）、および1mM（Ｊ）と架橋さ
せたことを表す。ゲル電気泳動を10％（w/v）SDSゲル
（Ａ〜Ｄ）、および８％（w/v）SDSゲル（Ｅ〜Ｊ）で実
施し、オートラジオグラフィーを４週間（Ａ〜Ｄ）およ
び２日間（Ｅ〜Ｊ）感光させた。分子量マーカー（ファ
ーマシア、およびバイオラド）を示す。

第６（Ａ）図はpGMR138およびpGMR29の挿入体cDNAの
制限酵素切断地図である。囲み部分は転写解読枠を表
す。斜線部分および黒塗り部分は、それぞれGM−CSF−
Ｒコード領域のシグナル配列および膜貫通領域を表す。
点描した囲み枠は上流の転写解読枠を表す。

第６（Ｂ）図はpGMR138およびpGMR29の挿入体cDNAの
ヌクレオチド配列と、推定されるアミノ酸配列を組み合
わせて示す。右端の数字はヌクレオチドの位置を示し、
配列上段の数字はアミノ酸配列を表す。＃印は可能性の
あるＮ−グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Thr）を示
す。上線を引いた区域は、それぞれ推定されるシグナル
ペプチドおよび膜貫通領域を示す。星印６個からなる組
み合わせは起こり得るポリ（Ａ）付加シグナルを確認し
たものである。クローン138におけるポリ（Ａ）尾部は6
1ヌクレオチドの鎖長であった。

第７図は、ホップおよびウッズの方法（1983年）によ
るhGM−CSF受容体配列の疎水性プロットである（スパン
の長さ＝15）。シグナルん配列および膜貫通ドメインに
それぞれ対応する２つの疎水性領域に注意。

第８図はヒトGM−CSF受容体転写産物の検出を示した
写真である。

A.実施例１で説明したノーザンブロット分析により、hG
M−CSF受容体の転写産物について、下記の供給源からの
RNAをプローブした。CEM細胞（レーン１）、HepG2細胞
（レーン２）、HL60細胞（レーン３、および４）、TPA
（100ng/ml）と３日間培養したHL60細胞（５×10⁵細胞/
ml）（レーン５）。28Sおよび18S rRNA分子の位置を示
す。別のゲルでは、同様にRNAサイズ標準（BRL）を含め
た。オートラジオグラフィーの感光時間は５日間。

B.実施例１で説明したcDNAのPCRに基づく増幅によるhGM
−CSF受容体転写産物について、下記の供給源からのRNA
をプローブした。U937細胞（レーン１）、AML193細胞
（レーン２）、HL60細胞（レーン５、および６）、CEM
細胞（レーン７）、ラジ細胞（レーン８）、HepG2細胞
（レーン９）、ヒーラー細胞（レーン10）。レーン３、
４および11は、それぞれ陰性対照として、cDNA合成およ
びPCR反応を実施した無細胞、cDNA合成を行わなかったH
L60 RNA、およびマウス160T細胞からの「RNAブランク」
を含む。

第９図は、他の成長因子受容体とhGM−CSF受容体の配
列を並列して示す。アミノ酸は当技術で標準的な１文字
略記法によって示す。

A.配列の模式図：囲み枠はコード領域を表す。斜線およ
び黒塗り枠は、それぞれシグナル配列および膜貫通領域
を表す。保存された４個のシステイン残基（Ｃ）および
保存されたトリプトファン残基（Ｗ）の位置を縦線で示
す。点線を付した枠は「WS−WS」ボックスを表す。配列
は最初の保存されたシステイン残基から揃えて並列させ
た。

B.並列させた配列の詳細：配列（ｉ〜vii）の照合位置
の上段にマーク（★）し、各配列のアミノ酸数を対応さ
せた（カッコ内の数字はそれぞれ（ｉ）〜（vii）の位
置に相当する）:hGMR（126、136、165、178、236、29
4、331i）、hIL6R（121、132、165、176、233、290、37
4）、mEPOR（52、62、90、106、165、219、NH）、hIL2R
（36、46、60、74、126、182、NH）、rPRLR（31、41、7
0、81、146、199、NH）。NH:相同性なし。Cons:造血系
受容体配列に基づく共通配列。共通配列の場合を除き、
点線は可変間隔を示し、ダッシュは配列を揃えるために
挿入したギャップを示す。

第10図はhGM−Ｒ−FD細胞におけるウイルス性組込み
体および転写産物を示す。

（ａ）FDC−P1細胞からのDNA（レーン１）、hGM−Ｒ−F
Dクローン１、６、８、10、11、13、21、24、33、34、4
9、50、52、53、54、55、56、57および58（レーン２〜2
0）、およびhGM−Ｒ−FDクローン21、21.13、21.15、2
1.17、21.21、21.22および21.23（レーン21〜27）をPst
Iで消化し、実施例１で報告したようにhGM−Ｒ配列に
ついてプローブした。hGM−Ｒウイルス組立て体から誘
導された共通な2.5Kbp断片に注意。

（ｂ）FDC−P1細胞からの全細胞質RNA（レーン１）、お
よびhGM−Ｒ−FDクローン21.13、21.15、21.17、21.2
1、21.22、21.23、21.7、21.8、21.10および21.11（レ
ーン２〜11）を、実施例１で説明したようにウイルス性
hGM−Ｒ転写産物についてプローブした。主要種は5.5Kb
の鎖長であり、完全鎖長のスプライシングされていない
ウイルス転写産物に対応する。

第11図は、クローン化したhGMR−FD細胞系からの細胞
の組換え体ｍ−またはhGM−CSFによる増殖刺激に対する
反応性を示す。ヒトGM−CSFで維持された細胞系は、ど
ちらの刺激によってもクローン原性細胞と類似の内容物
を示すが（例えばクローン54）、ｍ＋hGM−CSFで維持さ
れた細胞系（例えばクローン21）では、マウス反応性ク
ローン原性細胞は、ヒト反応性細胞より頻度が一層高
い。どちらの型の細胞系でも、クローン原性細胞はマウ
スGM−CSFに対するより、ヒトGM−CSFに対して反応性が
低い。

第12図は、hGM−CSF細胞クローンに対する¹²⁵I−hGM
−CSFの飽和結合分析およびスキャッチャード変形を示
す。

Ａ、B:h＋mGM−CSFで維持されたクローン21（１点当
たり２×10⁶細胞）、 Ｃ、D:hGM−CSFだけで維持されたクローン50（１点当
たり0.8×10⁶細胞）。

ＡおよびＣは添加量を増大させた¹²⁵I−hGM−CSFとの
特異的結合曲線、ＢおよびＤはスキャッチャード変形で
ある。スキャッチャード変形から、クローン21ではK_D＝
4nM（１細胞当たり4000受容体）、クローン50ではK_D＝6
nM（１細胞当たり20000受容体）が得られた。

第13図は、37℃でhGM−Ｒ−FDクローン33細胞（上
図）、またはhGM−Ｒ−FDクローン53細胞（下図）へ結
合させた¹²⁵I−hGM−CSFの内部化を示す曲線。前者の細
胞はマウスおよびヒトのGM−CSF混合物で維持された
が、後者はhGM−CSFだけで維持された。曲線は¹²⁵I−hG
M−CSF添加後、ニコラが報告した方法（1988年）により
測定した細胞表面に結合している放射能、および内部化
された放射能の時間的変化を示す。ニコラら（1988年）
の報告のように、実験的を結んだ曲線（重複試験管の平
均値）を電算機により当てはめた。クローン33では１点
当たり1.9×10⁶細胞を使用し、¹²⁵I−hGM−CSF濃度は13
nM、クローン53では１点当たり1.8×10⁶細胞を使用し、
¹²⁵I−hGM−CSF濃度は13nMであった。

［発明の詳細な説明］ 本明細書では下記の略号を使用する。

h,mGM−CSF ヒトまたはマウスの顆粒球−マクロフ
ァージコロニー刺激因子 Ｇ−CSF 顆粒球コロニー刺激因子 multi−CSF 多能性コロニー刺激因子 IL−２ インターロイキン−２ HRF 10％（v/v）ウシ胎児血清含有Hepes緩
衝化（10mM、pH7.4）RPMI培地 PBS リン酸緩衝化食塩水 EDTA 四酢酸エチレンジアミン FCS ウシ胎児血清 IL−３ インターロイキン−３ IL−６ インターロイキン−６ EPO エリスロポイエチン PRL プロラクチン ｈ− ヒト（の） ｍ− マウス（の） ｒ− ラット（の） LIF 白血病抑制因子 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 ORF 転写解読枠 ｈ−GM−Ｒ ヒトGM−CSF受容体 ｈ−GM−Ｒ−FD hGM−ＲでトランスフェクトしたFDC−
P1細胞 IL2R IL−２受容体（β鎖） IL6R IL−６受容体 GMR,GM−CSF−R GM−CSF受容体 K_D 平衡解離定数 EPOR EPO受容体 PRLR PRL受容体 SDS ドデシル硫酸ナトリウム SSC 標準クエン酸食塩水 dNTP デオキシヌクレオシド三リン酸 DSS スベリン酸ジスクシンイミジル 「GM−CSF受容体」とは、グリコシル化され、または
グリコシル化されないタンパク様分子（即ち、アミノ酸
を含有している）の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、
および細胞質内尾部を含んでいる分子全体をいう。受容
体分子は放射線標識したGM−CSF、またはその誘導体を
特異的に結合でき、その結合は、とりわけ未標識のGM−
CSFによって競合されるものと定義される。

「組換え体GM−CSF受容体」とは、プロモーターに対
して正しい読み取り枠で受容体またはその誘導体を好適
な発現ベクターへ暗号化し、生じた組換え体発現ベクタ
ーを好適な宿主へ導入し、組換え体受容体またはその誘
導体の発現、および必要であればその宿主からの移動に
好適な条件下でその宿主を成長させ、ついでその組換え
体受容体または誘導体を精製するcDNA分子のライゲーシ
ョンのような組換え手段によって生産され、他の関連分
子（例えば脂質）を伴い、または伴わず、グリコシル化
され、またはグリコシル化されないポリペプチド分子を
いう。

「GM−CSF刺激感受性細胞」とは、前述のようにGM−C
SFが結合でき、それによってその細胞の増殖または機能
活性化の刺激を起こすことができる受容体を保有してい
る細胞をいう。GM−CSFおよびその受容体に関連して用
いる「結合」の語は、その最も広い意味で使用され、GM
−CSFとその受容体との間の、特に細胞結合型受容体に
関連して、その受容体が局在している細胞の増殖または
機能活性化の刺激を誘発するのに十分な任意の結合を意
味する。「非結合型GM−CSF」とは、一般に循環してい
るGM−CSFを意味する。

「実質的なアミノ酸相同性」とは、約75％またはそれ
以上、好ましくは85％より大きいかまたはそれに等し
く、一層好ましくは90〜95％より大きいかまたはそれに
等しい配列相同性を有する分子を意味する。

「ガン」とは、その最も広い意味で使用され、ガン、
腫瘍、および白血病等を包括的に含み、または個々の細
胞を表す。結合型GM−CSF受容体、またはそのヌクレオ
チド配列の「異常」とは、測定された個々の相同の分
析、例えばハイブリッダイゼーション検討によって検出
可能なアミノ酸および／またはヌクレオチド配列におけ
る任意の変化を意味するのに用いられる。したがってガ
ン細胞とは、この発明によって提供されるGM−CSF受容
体、またはそれを暗号化しているヌクレオチド配列の使
用によってその変化を検出し得る変化したGM−CSF受容
体を含み得る。

cDNAをクローン化し、発現する一般的な技術は、当業
界で既知であり、例えばマニアティスら（1982年）によ
って総説されている。単に例示的な目的のため、この発
明ではCOS細胞発現ベクターπH3M［アルフォおよびシー
ド（1987年）］を使用して、COS−７細胞で発現されるh
GM−CSF受容体を暗号化しているcDNAについて説明す
る。これは、この発明がその範囲に任意のベクターおよ
び／または宿主で発現されるhGM−CSF受容体を暗号化し
ているcDNAを包含するという理解のもとに行われる。例
えば対象となるcDNAを原核系発現ベクターへ挿入し、こ
れをエシェリキア・コリ、バシラス種、またはシュード
モナス種のような細菌で発現させることは当業者にとっ
て日常的な実験の問題である。日常的な操作により、cD
NAを酵母、真菌、または昆虫細胞系、COS細胞以外の哺
乳動物細胞系、または植物細胞のような真核細胞で発現
することができる。また既知の方法により、cDNAを生殖
細胞系、または体細胞へ導入し、トランスジェニック動
物を作ることができる。

この発明は、ヌクレオチド鎖の少なくとも１つがヒト
GM−CSF受容体、またはその誘導体を暗号化し、または
それと相補的である１本鎖または２本鎖のDNA、cDNA、
またはmRNA、および任意のベクター、発現を提供し、ま
たはウイルス性ベクター等を含みこれらを包含する。

好ましい実施態様として、この発明はヒト低親和性GM
−CSF受容体を暗号化している遺伝子、またはその受容
体と少なくとも75％の配列同一性を有するポリペプチド
を暗号化し、ヒトGM−CSFに対する天然のヒト低親和性G
M−CSF受容体の相対結合親和性の少なくとも10分の１を
保持しているその相同体を含み、その遺伝子を使用可能
なようにプロモーターへ結合した組換え体DNA分子を提
供する。一層好ましくは、ポリペプチドは細胞外ドメイ
ン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。

第6B図に示した配列は、特に低親和性GM−CSF受容体
に関するものであるが、本明細書に示した証拠から、低
親和性GM−CSF受容体そのものが高親和性GM−CSF受容体
の成分を構成しており、高親和性GM−CSF受容体は低親
和性GM−CSF受容体の多量体であり得ることが判る。し
たがって高親和性GM−CSF受容体は、具体的にこの発明
の範囲に包含される。

この発明の特に好ましい実施態様では、第6B図に示し
たアミノ酸配列を有するGM−CSF受容体分子を提供す
る。この分子は約45000の分子量を有し、ただ１つの疎
水性膜貫通ドメイン、グリコシル化された細胞外ドメイ
ン、および短い（54アミノ酸）細胞質内尾部を有する40
0アミノ酸ポリペプチドである。リガンド結合ドメイン
（23〜319）は11個のシステイン残基を含む。対象とな
る受容体はトリプシンキナーゼドメインを含まず、免疫
グロブリン遺伝子スーパーファミリーグループと相同性
を示さないが、ヒトIL−６、エリスロポイエチン、およ
びIL−２（β−鎖）のようなその他の造血系成長因子の
受容体と配列相同性を共有している。このGM−CSF受容
体は、GM−CSFに特異性を有するが、IL−３には特異性
をもたない単一親和型の結合親和性（K_D＝２〜8nM）を
示す。

本明細書で説明するように、十分に確立された方法お
よび容易に入手可能な物質を使用して、第6B図に示した
受容体分子を暗号化しているcDNA配列を組立てることは
当業者の十分に可能な範囲である。

上述のアミノ酸配列および生化学的特性が示されれ
ば、確立された手法により、本明細書で確立された配列
で、アミノ酸の化学的付加によって作成された合成GM−
CSF受容体分子はこの発明の範囲に包含される。この発
明はさらに、上述の任意のまたはすべての受容体分子の
領域またはドメインへ、アミノ酸の単一または多重置
換、欠失および／または付加を保有するGM−CSF受容体
の組換え体または合成誘導体を包含する。そのような誘
導体は、GM−CSFまたはその誘導体に対する結合能の点
で機能的な（即ち生物学的な）対応物であり得、そして
／または上述のGM−CSF受容体のアミノ酸配列と実質的
なアミノ酸相同性を示し得る。GM−CSF受容体の好まし
い１誘導体は、細胞外ドメイン（可溶性部分）の全部ま
たは１部を含む。誘導体はまた、任意のまたはすべての
受容体分子を、グリコシル化され、またはグリコシル化
されない形で包含する。例えば使用した発現系および宿
主に応じて、組換え体受容体はグリコシル化され、また
はグリコシル化され得ない。組換え体または合成のGM−
CSF受容体、またはその誘導体のグリコシル化された
形、およびグリコシル化されない形は何れもこの発明の
範囲に包含される。機能的に活性なGM−CSF受容体の誘
導体または対応物は、本明細書で説明した方法を用いて
容易に同定することができる。

またこの発明は、とりわけ先に定義したようなGM−CS
F受容体を暗号化しているcDNAを提供する。このcDNAは
第6B図に示したヌクレオチド配列を含んでいる。この発
明の範囲は、上述のcDNA配列に関連するヌクレオチドの
単一または多重置換、欠失および／または付加を保有し
ているcDNA誘導体を包含する。そのような誘導体は完全
なGM−CSF受容体分子、またはアミノ酸の単一または多
重置換、欠失および／または付加を保有しているGM−CS
F受容体のようなその誘導体を暗号化し得る。この発明
はまた、対象となるヌクレオチド配列と実質的に相同で
あるヌクレオチド配列を保有する、即ち少なくとも75％
の相同性、好ましくは80〜85％の相同性、一層好ましく
は90〜95％より大きい相同性を保有するcDNAを包含す
る。そのような誘導体を、例えば部位特異的変異、ラン
ダム変異、または核酸の酵素的切断および／またはライ
ゲーションによって生産する方法は、このようにして修
飾した核酸が、対象となる配列と有意な相同性を有する
かどうかを測定する方法（例えばハイブリダイゼーショ
ンによって）と同様に当該技術上既知である。

この発明はさらに、GM−CSF受容体、またはその誘導
体、またはGM−CSF受容体暗号化配列へ隣接しているヌ
クレオチド配列へ融合したポリペプチドのような分子を
包含する。それに限定する目的のためではないが、例え
ばGM−CSF受容体、またはその誘導体、および別のポリ
ペプチドまたはタンパク質からのアミノ酸配列を含んで
いる融合配列を生産するのが望ましく、後者の例とし
て、特に原核系では、β−ガラクトシダーゼ、ホスファ
ターゼ、ウレアーゼ等のような酵素が挙げられる。多く
の融合タンパク質は、その読み取り枠が同調し合うよう
に、２つのコード配列を互いに連結させた組換え体遺伝
子の発現によって生産される。別法として、ポリペプチ
ドは化学的手段によって試験管内で連結することができ
る。GM−CSF受容体、または個々の暗号化したヌクレオ
チド配列のそのような融合またはハイブリッド誘導体
は、すべてこの発明に包含される。

したがってこの発明は、組換え体または合成のGM−CS
F受容体、およびその誘導体を、例えば受容体治療法お
よび診断法の開発に十分な量で提供する。

したがってこの発明のもう１つの特徴は、非結合型GM
−CSFの量を低下させるのに十分な期間および条件下
に、GM−CSF受容体またはその誘導体の有効量を哺乳動
物へ投与することを含む、哺乳動物におけるGM−CSF刺
激感受性細胞の増殖または機能活性化を調節する方法に
関する。対象となる方法は、リンホカインが細胞結合型
受容体へ結合できる前に、生体内で循環しているGM−CS
Fを可溶性受容体へ結合させ、それによってGM−CSF刺激
感受性細胞への結合に利用し得るGM−CSF量を低下させ
ることに基づいている。

この発明はさらに、完全な組換え体または合成のGM−
CSF受容体、またはその誘導体をGM−CSF刺激感受性細胞
の増殖または機能活性化の調節に利用することに関する
が、ただし好ましくはその可溶性の、即ち細胞外ドメイ
ンを利用する。

この方法は、白血病細胞がGM−CSF受容体を発現する
骨髄性白血病［ヤングおよびグリフィン（1986年）］の
ような疾患状態を処置するのに特に有用である。例えば
骨髄性白血病細胞の多くの型は、外来性コロニー刺激因
子が利用できなければ、試験管内で増殖をうけることが
できない［メトカーフ（1984年）］。したがって生体内
に投与された組換え体または合成のGM−CSF受容体、ま
たはその誘導体は循環しているGM−CSFへ結合し、それ
によって細胞結合型GM−CSF受容体へのGM−CSFの結合と
競合する。また対象となる方法は、動物モデル系で観察
されたGM−CSF過剰生産の毒性効果［ラングら（1987
年）、ジョンソンら（1989年）］を解消する治療手段と
して役立ち得る。

さらにこの発明は、組換え体または合成のGM−CSF受
容体、またはその誘導体に対する抗体、特にモノクロー
ナル抗体に関する。そのような抗体はGM−CSF受容体を
精製し、これを定量するのに特に有用である。またさら
にこの発明は、GM−CSF受容体の存在について、血漿、
血清、または体液、細胞表面または細胞抽出物を検定す
る目的のための上記の第１抗体に対する抗体（モノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体）に関する。上記の一
方または他方の抗体を、例えばサンドイッチ検定に使用
するリポーター分子で標識し得る。所望によりアジュバ
ントの利用を含み、ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体の生産およびスクリーニング方法、およびそ
のような抗体を放射能、蛍光、または化学標識で標識す
る方法、放射線免疫検定法、蛍光免疫検定法、および酵
素結合免疫検定法（ELISA）、抗体を固体支持体へ結合
して免疫吸着剤を作る方法は当該技術上日常的なことで
ある。

さらに組換え体または合成のGM−CSF受容体は、その
細胞結合型受容体へのGM−CSFの結合を増加し、または
減少させるアゴニストおよびアンタゴニストを開発する
のに使用できる。例えばトランスフェクトして、組換え
体GM−CSF受容体を保有している細胞系は、そのような
活性について化合物をスクリーニングするのに使用し得
る。さらにこの発明は、過剰なまたは不十分なGM−CSF
刺激感受性細胞の増殖または機能活性化によって起こる
疾患状態の処置に、そのようなアゴニストまたはアンタ
ゴニストを使用することに関する。可能性のあるアゴニ
ストまたはアンダニストとしては、天然産または合成の
GM−CSF断片、およびその他の天然産または合成の化学
的化合物等が含まれ、これらはマーカーとして細胞へ標
識したGM−CSFの結合を利用する上述の方法によってス
クリーニングし得る。

この発明はまた、GM−CSFまたはその誘導体をGM−CSF
関連疾患の処置のための医薬の製造に使用することに関
する。そのような疾患は、GM−CSF刺激感受性細胞に起
因し、またはそれに関連するガン、腫瘍、および白血病
等である。

この発明のもう１つの特徴は、GM−CSF刺激感受性細
胞で構成され、またはそれに関連するガンを診断するの
に、ガン細胞で、細胞結合型GM−CSF受容体またはその
異常、またはそれを暗号化しているヌクレオチド配列を
検出することによる組換え体または合成のGM−CSF受容
体、またはその誘導体、特にこれらを暗号化しているヌ
クレオチド配列の利用に関する。

この発明では、機能的な低親和性hGM−CSF受容体を胎
盤からクローン化し、これがGM−CSFだけを認識し、イ
ンターロイキン−３を認識しないことを明らかにした。
この受容体をCOS細胞へトランスフェクトすると、これ
は胎盤膜上の受容体とほぼ同一の低親和性および同一の
特異性を示した。しかも造血系細胞上の低親和性のhGM
−CSF受容体と同様に、トランスフェクトした受容体
は、速やかなリガンド解離速度（T1/2＝５分）と乏しい
内部化（37℃、２時間語で、約10〜20％）で示される特
徴を示した。

さらに第９図に示したように、４個のシステイン残基
の位置は、GM−CSF、IL−６、エリスロポイエチンおよ
びIL−２（β−鎖）の受容体でそれぞれ近似的に保存さ
れており、これらの残基のうちの３個が見いだされる文
脈は、４種類の受容体間で一致している。これら４個の
システイン残基は分子鎖間ジスルフィド結合対を作るも
のと思われるが、推定免疫グロブリンドメイン構造［ヤ
マサキら（1988年）］と結合するIL−６受容体の２個の
システイン残基の何れとも一致しない。

Trp236は保存されており、３種の受容体でArg残基に
近接している。４種類のすべての受容体配列間で、さら
に相同性が膜貫通ドメインの丁度Ｎ−末端で見いだされ
る（第９図）。GM−CSF受容体の294位で始まる共通配列
（「WS−WS」ボックス）が４種の受容体のすべてで認め
られる。この配列の位置は３種の受容体（GM−CSF、エ
リスロポイエチン、IL−２受容体（β−鎖））で膜貫通
ドメインで近接しているが、IL−６受容体では遥かに離
れている。

「WS−WS」ボックス（VXXRXX_{（６〜11）}WSXWS）に基
づく記号列を使用して最新のデータベース（プロテイン
・リサーチ・ファンデーション、日本、1989年４月）を
探索し、ラット・プロラクチン受容体［rPRL受容体、ブ
ーチンら（1988年）］で、その膜貫通ドメインの丁度Ｎ
−末端で、この糸と相同な領域を見いだした（第９
図）。意外なことに、rPRL受容体にある４個の細胞外シ
ステイン残基のすべて、およびLys−Trpダブレットは、
４種類の造血系受容体のそれと、ほぼ同一の相対位置で
見いだされる（第9A図）。またrPRL受容体は膜貫通シス
テイン残基を有しているが［ブーチンら（1988年）］、
その膜貫通配列はhGM−CSF受容体と相同ではない。対照
的にプロラクチン受容体の近縁物質である成長ホルモン
受容体［リューングら（1988年）］では、それ以外の領
域でプロラクチン受容体と75〜100％の配列相似性を共
有しているが［ブーチンら（1988年）］、「WS−WS」ボ
ックスは見いだされない。したがってhGM−CSF受容体
は、上記の５種類の受容体［即ち、hGM−CSF、hIL−
６、マウスEPO、hIL−２（β−鎖）およびrPRL受容体］
からなる１組の成長および分化因子受容体の新しいサブ
セットの一員であるものと思われる。

GM−CSF受容体のmRNAでは、GM−CSF受容体を暗号化し
ている長いORFに先行して短い22コドンからなるORFがあ
る。興味深いことは、そのような短いORFがヒトIL−６
受容体［ヤマサキら、（1988年）］、マウスIL−１受容
体［シムズら（1988年）］、およびヒトIL−２受容体α
−鎖およびβ−鎖［ニカイドーら（1984年）、ハテケヤ
マら（1989年）］のDNA配列にある主受容体コード領域
の5'でも見いだされ、これらは翻訳されると、作動して
主受容体コード領域の翻訳を抑制するようである。その
ような機構は、正常細胞型でこれらの受容体の発現が低
水準である理由を一部説明しているのかもしれない。

以下に実施例をあげてこの発明をさらに詳細に説明す
る。実施例は単に発明を説明するためのものであって、
発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

実施例１ 物質および方法 下記の物質または方法を以下の実施例に使用した。本
明細書で説明する生物学的な出発物質は当該技術で既知
のものである。

COS細胞発現ベクターπH3M［アルフォおよびシード
（1987年）］で組立てられ、約５×10⁶の独立したクロ
ーンからなるポリA⁺で選ばれたヒト胎盤RNA由来のcDNA
ライブラリーはB.シード博士（マサチューセッツ・ジェ
ネラル・ホスピタル、ボストン、米国）から提供され
た。MC1061/p3細胞を形質転換し、これを選別して約２
×10⁴クローンからなる500プールとし、グリセリンスト
ックを調製することにより、約10⁷クローンを作成し
た。各ストックからのミニプレプDNAを電気穿孔法によ
ってCOS−７細胞へトランスフェクトした。簡単に説明
すると、1.5×10⁶COS−７細胞のリン酸緩衝化食塩水（P
BS）（pH7.3）浮遊液180μｌをミニプレプDNA（３μ
ｇ）20μｌと混合し、氷上で５分間冷凍した。0.4cmギ
ャップのキュベット中で、細胞を300V、125μFD（t_c＝
8.2〜10.5msec）で電気穿孔し、５分間氷上へ戻し、最
後にスライドグラスでできた小型フラスコ（ラブ・テッ
ク、ヌンク社、ナパービル、米国）で、10％（v/v）ウ
シ胎児血清（FCS）を含有するダルベッコの修飾したイ
ーグル培地（DME）2mlで培養した。放射性ヨウ素化した
抗ICAMモノクローナル抗体Ｗ−CAM−１［ボイドら（198
8年）］で標識したICAM/CDM8［シモンズら（1987年）］
の対照トランスフェクションによる評価から、これらの
条件では、生存COS−７細胞で15〜20％のトランスフェ
クション頻度が得られた。48時間後、培地を除き、トラ
ンスフェクトした単層を、放射性ヨウ素化したヒトGM−
CSF［Hepes緩衝化RPMI培地（pH7.2）/10％FCS 1ml中、
¹²⁵I−GM−CSF（１〜2nM）４〜８×10⁵cpm］の結合（20
℃、60分間）によって評価した。単層を培地で２回洗浄
し、2.5％（w/v）グルタルアルデヒド/PBSで固定し、こ
れを１％（w/v）ゼラチンに浸漬した［ニコラおよびメ
トカーフ（1985年）］。スライドをコダックNTB2写真用
乳液に42℃で浸漬し、乾燥剤を含有する遮光箱中で４℃
で48時間暗所で感光させた。スライドをコダックD19現
像液（40g/水500ml）で３分間現像し、水ですすぎ、ア
グファG433C定着液で３分間定着したのち、10％ギムザ
染色水溶液（濾過）で染色した。スライドを10〜20×倍
率でスクリーニングし、２種類の陽性プール（＃29およ
び＃138）を選び出した。COS−７細胞に¹²⁵I−GM−CSF
結合を起こさせることができる単一なcDNAクローンが得
られるまで、対応するエシェリキア・コリ形質転換体の
グリセリンストックを小プール群へ分配した。

配列決定方法 クローン29および138の挿入体および種々の分子内断
片をM13ベクターへサブクローン化し、修飾したT7ポリ
メラーゼ［テーバーおよびリチャードソン（1987年）、
シークエナーゼ、USB］、およびプライマーを内部へサ
ブクローン化したセグメントを使用するジデオキシチェ
ーンターミネーター法［サンガーら（1977年）］によっ
て配列決定した。両義性についてはdITPを使用して解明
した。これらのサブクローンの幾つかに対応するプライ
マーを使用して、隣接するセグメントへ配列を伸長し
た。クローン138の２本鎖は両方とも完全にその配列を
決定した（近接する１形質当たりの平均ゲル形質は4.8
7）。サブクローン化したすへての境界領域は完全鎖長
のクローンで再び配列決定した。クローン29のmRNA−同
義語性の鎖は完全に配列を決定し、両義性については反
対鎖上のオリゴヌクレオチドを使用して解明した。

RNAおよびDNAの分析（ノーザンおよびサザンブロッテイ
ング） 主としてゴフの報告（1988年）に従って調製した細胞
質内ポリアデニル化RNA（約1.5μｇ）を、20mMモルホリ
ノプロパンスルホン酸、5mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA
（pH7.0）＋６％（v/v）ホルムアルデヒドを含有する１
％（w/v）アガロースゲルで分画して、ニトロセルロー
スへトランスフェクトした。ハイブリダイゼーションの
前に、RNA含有フィルターを、0.2％（w/v）フィコー
ル、0.2％（w/v）ポリビニルピロリドン、0.2％（w/v）
ウシ胎児血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1
mM ATP、変性させたサケ精子DNA 30〜50μg/ml、および
エシェリキア・コリtRNA 50μg/mlを含有する２×SSCに
67℃で数時間浸漬した。ハイブリダイゼーションはこれ
と同じ緩衝液＋0.1％（w/v）SDS中で67℃で実施した。
ハイブリダイゼーションプローブは、cDNAクローンpGMR
138の5'末端を伸長し、ゲル精製した1300bp Xho1−EcoR
I断片であって、任意プライミング［ファインバーグお
よびフオーゲルスタイン（1983年）］によって約10⁹cpm
/μｇの比活性まで放射線標識し、約５×10⁷cpm/mlでハ
イブリダイゼーションに加えた。フィルターを２×SS
C、0.1％（w/v）SDSで67℃で十分に洗浄し、最後に、オ
ートラジオグラフィーの前に0.2×SSCで67℃で洗浄し
た。

高分子量ゲノムDNAの10μgkアリコートをPst1で消化
し、0.8％アガロースゲルで電気泳動し、これをニトロ
セルロースへ移した。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄の条件は、上記のRNA分析と同様に行った。ハイブリ
ダイゼーションプローブは、hGM−CSF受容体コード領域
の3'末端を伸長し、ゲル精製した786bpのKpn−EcoR I断
片であって、ニックトランスレーションによって約２〜
４×10⁸cpm/μｇの比活性へ放射線標識し、約２×10⁷cp
m/mlでハイブリダイゼーションに加えた。

ポリメラーゼ連鎖反応を用いるRNA検出 RNA（約１μｇ）を、50mMトリス−Cl（42℃でpH8.
3）、20mM KCl、10mM MgCl₂、5mMジチオトレイトール、
各dNTPそれぞれ1mM、オリゴ−dT₁₅20μg/ml、およびAMV
逆転写酵素（ベーリンガー・マンハイム）20単位を含有
する反応20μｌに加え、42℃で40分間、第１鎖cDNA合成
を行った。第１鎖合成が完結したのち、蒸留水で反応を
10μｌに希釈し、これを各PCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）に５μｌずつ使用した。ポリメラーゼ連鎖反応は、
各dNTPをそれぞれ200μＭ、それぞれに特異的なプライ
マー１μＭ、ジェネAMPキットで供給された緩衝液（シ
ータス社、米国）およびTaqポリメラーゼ1.25単位を50
μｌ容量中に含有していた。PCRに使用するプライマー
は530bp断片を認識する5'−CTTCTCTCTAGACCAGCA（131〜
147位）および5'−ACATGGGTTCCTGAGTC（676〜660位）で
あった。PCR反応条件は、パーキン・エルマー・シータ
スDNA熱サイクラー中、94℃で２分、65℃で２分、72℃
で３分間で、25サイクル行った。PCR反応の１部を1.2％
（w/v）アガロースゲルで電気泳動し、これをニトロセ
ルロースへ移した。フィルターをプレハイブリッド化
し、ハイブリッド形成し、上記と同様に洗浄した。ハイ
ブリダイゼーションプローブは、ゲル精製したpGMR138
の1.9kbp cDNA挿入体を、ランダムプライミングによっ
て約10⁹cpm/μｇの比活性へ放射線標識し、約２×10⁷cp
m/mlでハイブリダイゼーションに加えた。

放射性リガンド エシェリキア・コリで、非グリコシル化型で生産し、
精製した組換え体ヒトまたはマウスGM−CSF［デラマー
ターら（1985年）］を、修飾した一塩化ヨウ素法［ニコ
ラら（1988年）］により放射性ヨウ素化した。簡単に説
明すると、タンパク質２μｇ（２μｌ）とNa¹²⁵I 1mCi
（ニューイングランド・ヌクレア、ドライアイヒ、西
独）を、トゥイーン20を0.2％（w/v）含有する0.2Mリン
酸Na緩衝液（pH7.2）40μｌ溶液中でインキュベートし
た。溶液を撹拌混合しながら、一塩化ヨウ素（2M NaCl
溶液、0.03mM）を２ロット（３μｌおよび６μｌ）に分
けて添加した。反応混合物をセファデックスＧ−25Mカ
ラム（ファーマシア、アップサラ、スエーデン）へ通
し、遊離ヨウ素から巨大分子放射能を分離した［ヒルト
ンら（1989年）］。¹²⁵I−hGM−CSFは結合能100％であ
り［カルボら（1983年）］、カルボら（1983年）の自己
置換分析により、20000〜40000cpm/ngの比放射能を示し
た。¹²⁵I−mGM−CSFは比放射能120000cpm/ngで、結合能
40〜50％であった。未標識および標識した（比放射能40
000cpm/ng）ヒトIL−３はアマーシャム（バッキンガム
シャイア、英国）から購入した。

結合実験 1.25％（w/v）ジメチルスルホキシドを含有するDME培
地/10％FCSで５日間増殖させたHL60細胞を、Hepes（10m
M、pH7.2）で緩衝化し、10％（v/v）ウシ胎児血清（HR
F）を含有するRPMI培地（HR）に、５×10⁶細胞/50μｌ
で再浮遊させた。未標識のhGM−CSF（0.3μＭ）の存在
または存在なしで、細胞の50μｌアリコートを、濃度増
大させた¹²⁵I−hGM−CSF（０〜2nM）と４℃で４時間イ
ンキュベートした。ついで細胞浮遊液を冷凍したウシ胎
児血清180μｌへ重層し、小型プラスチック製遠心用試
験管で700gで５分間遠心し、外科用メスで試験管を切断
することにより細胞ペレットを取り出した。ガンマ計数
装置で、細胞に結合した放射能および遊離放射能を重複
試験管により別々に測定した。トランスフェクション48
〜72時間後に上清を除き、コンドロイチン硫酸200μg/m
lを含有するHR中で、付着細胞を40mM EDTAとインキュベ
ートし、37℃でさらに40分間インキュベートすることに
より、トランスフェクトしたCOS−７細胞を回収した
［パドマナバンら（1988年）］。分離し、解離させた細
胞を700gで５分間遠心し、20mM EDTAおよびコンドロイ
チン硫酸100μg/mlを含有し、または含有しないHRFに再
浮遊させた。飽和結合等温線または競合実験をHL60細胞
について実施した。主としてユーングらの報告（1987
年）のように、新鮮な出産期胎盤からヒト胎盤膜を調製
した。胎盤6gから膜浮遊液4mlを得た。各結合点毎に、H
RF40μｌおよび過剰の未標識hGM−CSF（0.3μＭ）の存
在または存在なしで、膜浮遊液40μｌを、濃度増大させ
た¹²⁵I−hGM−CSFと混合した。20℃で１時間インキュベ
ーションした後、膜を30000gで５分間遠心し、精密パス
ツールピペットで上清を除き、ガンマ計数装置で膜ペレ
ットおよび上清を別々に計数した。

前記のように、20℃で１時間のインキュベーション時
間を用いて、¹²⁵I−hGM−CSFのhGM−Ｒ−FD細胞への飽
和結合およびスキャッチャード変形を実施した。mGM−C
SFによるhGM−CSF受容体の交差調節、およびhGM−CSFに
よる多能性CSFまたはmGM−CSF受容体の交差調節を、ウ
オーカーらの報告（1985年）のように37℃で30分間の前
温置時間、および０℃で３時間の結合時間により実施し
た。表示した¹²⁵I−hGM−CSF濃度で受容体内部化の研究
を実施し、データを実験点の曲線当てはめによって分析
した［ニコラら（1988年）］。

架橋実験 前記のように溶液中で¹²⁵I−hGM−CSFの細胞への結合
を４℃で実施し、細胞ペレットを、氷冷したリン酸Na緩
衝化（20mM、pH7.2）食塩水（0.15M）1mlに再浮遊し
た。スベリン酸ジスクシンイミジル（シグマ、ミズー
リ、米国）の無水アセトニトリル溶液（10μｌ）を直ち
に添加して、０〜1mMの目的濃度を得、細胞を氷上で15
分間インキュベートしたのち、細胞ペレットを13000gで
１分間遠心した。細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤の
存在でデオキシリボヌクレアーゼで処理し、前記のよう
にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動用に調製した［ニコラおよびピーターソン（1986
年）］。

結合データ分析 特異的結合を、過剰の未標識hGM−CSFが存在しない場
合、または存在する場合の結合間の差として測定した。
自己置換分析によって測定した¹²⁵I−GM−CSFの比放射
能を用い、特異的結合（cpm）をモル濃度へ変換した。
スキャッチャード変形へ変換する前に、マンソンおよび
ロドバードのリガンド・プログラム（1980年）を用いて
結合データの曲線当てはめを実施した。２つの結合部位
の当てはめは、データへの当てはめが、１結合部位の当
てはめよりも有意に改善された場合（ｐ＜0.05）に限り
採用した。

hGM−Ｒレトロウイルスの生産および選別 本明細書で説明したようにして調製したpGMR29の挿入
体cDNAを含んでいる1.7kbpのXho1断片を、多重クローニ
ング部位をpMPZenの単一のXho1部位で置き換え、1.7kbp
のネオマイシン耐性発現カセット［pDolのBamH I−EcoR
I断片（コールマン（1987年））の末端を平滑化し、Cl
a Iリンカーヘライゲーションした］をCla I部位［J.チ
ャング、O.バーナードおよびK.クリングラー、未発表デ
ータ］へ挿入したレトロウイルスベクターpMPZenの誘導
体、pJZen2（SVNeo）のXho1部位へ挿入した。以前に報
告されたように［ジョンソンら（1989年）］、ψ２パッ
ケージング細胞［マンら（1983年）］をpJZen2（SVNe
o）−hGM−RDNAともに電気泳動し、２日後に、抗生物質
G418（ゲネチシン、シグマ）400μg/mlを使用して、ト
ランスフェクトした細胞を選別した。２種類のG418耐性
クローンを¹²⁵I−hGM−CSF結合によるhGM−Ｒの高度表
面発現のため選び出した。受容体陽性ψ２クローンのレ
トロウイルス力価をNIH3T3繊維芽細胞のポリブレン媒介
感染によって試験した［チュプコら（1984年）］。さら
に検討を重ねて選び出したクローン（ψ２−GMR）は1.2
×10⁴ウイルス粒子/mlの力価を示した。

感染FDC−P1細胞系の誘導体化 付着ψ２−GMR細胞（３×10⁶/75cm²フラスコ）を照射
し（35Gy）、これを10⁶FDC−P1細胞［デクスターら（19
80年）］と一緒に、10％ウシ胎児血清（FCS）および10
％ポークウイードマイトジェン刺激した脾臓細胞ならし
培地を含有するダルベッコの修飾したイーグル培地（DM
EM）20mlで培養した。48時間の同時培養から洗浄した上
清細胞を、寒天培地で、mGM−CSFの10³U/ml、またはhGM
−CSFの６×10³U/mlの何れか、またはこの両者の組み合
わせと300細胞/mlの密度で培養した。３日間インキュベ
ーションののち、mGM−CSFで発育したクローンは50〜10
0細胞のサイズに達した。これと対照的に、hGM−CSFに
よって刺激した培養では、発育したクローン数は一層少
なかった。これらは形態学上分散しており、その多くは
10〜30細胞を含んでいるだけであった。hGM−CSFによっ
て刺激した培養で増殖した個々のクローンをミクロピペ
ットを使用して採取し、クローン化した細胞系を樹立し
て、６×10⁵U/ml hGM−CSF（12細胞系）、または６×10
³U/ml hGM−CSF＋10³U/ml mGM−CSF（36細胞系）の何れ
かを含有するDMEM（20％FCS含有）の1ml培養で維持し
た。200細胞/mlずつの寒天培地培養でコロニーを増殖
し、ついでインキュベーション７日後の個々のコロニー
を採取し、これらのコロニーの培養を浮遊液中で続ける
ことによって個々の細胞系のサブクローン化を実施し
た。

寒天培養 寒天培養は、寒天培地1ml（20％FCSおよび0.3％寒天
の最終濃度を有するDMEM）［メトカーフら（1984
年）］、および培養細胞300個を使用して35mmプラスチ
ック製ペトリ皿（ヌンク、アデレード）で実施した。

コロニー生成に使用した刺激は、エシェリキア・コリ
で、非グリコシル化型誘導体として生産した精製組換え
体mGM−CSF（タンパク質1mg当たりの比活性３×10
⁸U）、または精製組換え体hGM−CSF（タンパク質1mg当
たりの比活性10⁸U）であった。これらを寒天培養調製中
に0.1ml容量で添加し、５％FCSの0.95％食塩水溶液を使
用して２倍系列希釈法を実施した。30〜50系列のコロニ
ーをプールすることにより、７日間培養コロニー中の平
均細胞数を測定した。

実施例２ 高親和性および低親和性GM−CSF受容体の検出 本明細書で説明した方法により、高親和性および低親
和性GM−CSF受容体の両受容体を、ヒト骨髄細胞で、一
次ヒト骨髄性白血病細胞、およびヒト前骨髄球性白血病
細胞系、HL−60で検出した（第１図）。第1A図は、５日
間、1.25％（w/v）ジメチルスルホキシド（DMSO）で誘
発し、分化させたHL−60細胞へ結合した¹²⁵I−hGM−CSF
の４℃での飽和結合等温線を示す。マンソンおよびロド
バード（1980年）のリガンド・プログラムを用いた曲線
当てはめを行ったのち、このデータをスキャッチャード
の方法（1949年）により変形すると、このデータの当て
はめには、１カ所ではなく２カ所の結合部位が必要であ
ることが分かった（ｐ＜0.05）。即ち、46pMのK_Dを有す
る高親和性受容体（１細胞当たり40）および2.9nMのK_D
を有する低親和性受容体（１細胞当たり130）である。
同じ細胞で、結合型GM−CSFを４℃で10分間解離したの
ち、細胞上に残存する結合型¹²⁵I−hGM−CSFを測定する
と高親和性結合部位だけが検出できた（第1A図）。この
ことから、低親和性受容体は高親和性受容体より一層速
いリガンド解離速度を示すことが分かる。実施した結合
方法は、遊離リガンドから細胞結合型を迅速な１段階で
分離する方法からなるから、この成績は、他の実験者ら
［ギャッソンら（1988年）、パークら（1986年ｂ）、ケ
ーラーら（1988年）］が低親和性受容体を検出できなか
った理由を説明していると言える。これらの報告者は、
ヒト造血系細胞で、20〜600pMのK_Dを有する単一親和型
に属するGM−CSF受容体を報告している。

同様に精製したヒト胎盤細胞膜へのhGM−CSFの特異的
結合を検出したが（第1B図）、この結合は低親和性受容
体（胎盤1mg当たり３×10⁹受容体、K_D＝4.6M）の単一型
に属していた。ヒト胎盤GM−CSF受容体はhGM−CSFだけ
を認識し、hIL−３を認識しないようである（第２
図）。しかもhIL−３受容体はヒト胎盤膜上では検出さ
れなかった（第２図）。

実施例３ ヒトGM−CSF受容体のクローン化および発現 GM−CSF受容体をクローン化するため、発現スクリー
ニング方法をサルCOS細胞で使用した。検討した限り、
すべての細胞供給源でGM−CSF受容体愛の潤沢性が低か
ったので、大量のcDNAライブラリーのスクリーニング、
およびその後のトランスフェクト陽性の細胞の高感度の
検出が必要であった。発明者らが採用した検出方法は、
トランスフェクトしたCOS細胞を顕微鏡スライドグラス
上で増殖させ、¹²⁵I−hGM−CSFをこれへ結合させ、つい
で直接オートラジオグラフィーを行う方法である。この
スクリーニング手法は、放射性ヨウ素化したリガンドを
検出手段として使用するこれまでの受容体クローン化方
法［シムズら（1988年）、ド・アンドレアら（1989
年）］と比べて２つの主な利点を有する。第１にこの方
法は、２×10⁴クローン供給源から単一のクローンが検
出できるから極めて感度が高い［10³クローン中、１個
（ド・アンドレアら（1989年））、350クローン中、１
個（シムズら（1988年））と比較］。第２にこの方法
は、非特異的な結合に起因する人為結果を容易に確認す
ることができ、さもなければ約10⁶の陰性COS細胞を含む
スライド上でただ１個のGM−CSF受容体陽性細胞を確認
することは不可能であった。

約５×10⁶の独立した組換え体ヒト胎盤cDNAライブラ
リーを、さらにCOS細胞発現ベクター［アルフォおよび
シード（1987年）］でそれぞれ約２×10⁴クローンの500
プールへ分画し、各プールからのDNAを、電気穿孔によ
って1.5×10⁶COS細胞へ別々にトランスフェクトした。
細胞をスライドグラス上で48時間培養し、これを比較的
高濃度の¹²⁵I−hGM−CSF（約2nM）とインキュベート
し、固定し、ついで写真用乳液に浸漬した。スライドを
現像し、個々に顕微鏡で検査した。陽性細胞はオートラ
ジオグラフィー粒子の存在によって確認した。スクリー
ニングした最初の250プールのうちの２プールから、１
個または２個の陽性細胞が得られた（プール29および13
8）（第３図）。COS細胞へ高容量の¹²⁵I−hGM−CSF結合
を伝達できる単一のcDNAが得られるまで、これらのプー
ルのうちの１つ（138）を、各段階でオートラジオグラ
フィーを行うスクリーニングによってさらに小プールへ
分配した（1500組換え体からなる20プール、ついで80組
換え体からなる60プール、最後に200個の単一クロー
ン）。COS細胞での３回の選別に続き、別のDNA陽性プー
ル（プール29）中の個々のcDNAクローンを、クローンpG
MR138の1.8kbp挿入体とのコロニー・ハイブリダイゼー
ションによって、究極的にGM−CSF受容体のためのコー
ドと確認した。クローン29および138のcDNA挿入体を暗
号化しているプラスミドを、それぞれpGMR29およびpGMR
138と命名した。

実施例４ クローン化したGM−CSF受容体の分析 トランスフェクトしたCOS細胞上の受容体に対する［
¹²⁵I］hGM−CSFの結合は、未標識のhGM−CSFによって競
合されるが、マウスGM−CSF（ヒトの細胞には活性を有
しない）、またはヒトIL−３、Ｇ−CSF、またはIL−６
によって競合されないから、特異的である（第３図）。

クローン化したGM−CSF受容体（クローン138、実施例
３）をCOS細胞へトランスフェクトしたときの結合特性
を第４図に示す。トランスフェクトしたCOS細胞への¹²⁵
I−hGM−CSF結合の20℃での飽和結合等温線は、6.8nMの
平衡解離定数を有する単一型の結合部位、および１細胞
当たり600000の受容体を示した。これとは対照的に、ト
ランスフェクトしないCOS細胞、またはベクター単独で
トランスフェクトしたCOS細胞は、これらの細胞濃度
（１点当たり３〜７×10⁴細胞）で有意な結合を示さな
かった。オートラジオグラフィー分析から、トランスフ
ェクトした細胞の約20％だけが受容体陽性であり（トラ
ンスフェクション効率を反映）、したがって陽性にトラ
ンスフェクトした細胞は、トランスフェクトされないCO
S細胞で報告された１細胞当たり1700受容体［コシタ・
ボールドウインら（1989年）］の値と比較して、恐らく
１細胞当たり約３×10⁶受容体であることが分かる。ま
た未標識のhGM−CSFによる¹²⁵I−hGM−CSFの置換では、
K_D＝5.8nMの単一型に属する受容体だけが証明され、こ
の結合は未標識のhIL−３によって置換されなかった
（第4B図）。hGM−CSFを標識または未標識のものに変え
たときに観察された類似の結合親和性から、ヨウ素化
は、この受容体に対するhGM−CSFの結合親和性を有意に
変化させないことが分かる。数回の異なった実験で、ト
ランスフェクトしたCOS細胞への¹²⁵I−hGM−CSFの結合
を、浮遊液（細胞集合を防止するために20mM EDTAおよ
びコンドロイチン硫酸100μg/mlを添加または添加しな
い結合培地）、または付着細胞で測定した。見かけのK_D
は４〜8nMで変化したが、カルシウムも付着もトランス
フェクトした受容体の結合特性を有意に変えないことが
分かった。

実施例５ 分子サイズ HL60細胞およびトランスフェクトしたCOS細胞上のhGM
−CSF受容体の分子サイズを、スベリン酸ジスクシンイ
ミジル（DSS）との化学的架橋反応によって測定した
（第５図）。他の研究者「ディペルシオら（1988年）］
が観察したように、HL60細胞上のGM−CSF受容体は約850
00のMrを有するので、¹²⁵I−hGM−CSF（Mr＝15000）と
の架橋により100000のMrが得られた。速やかなリガンド
解離前および解離後のどちらの場合も［それぞれ低親和
性結合の存在または存在なしで（第１図参照）］、Mr10
0000の主架橋バンドおよびMr95000の副架橋バンド（そ
れぞれMr85000および80000の受容体を表す）が認められ
る。これらは単一の結合サブユニットの異なった糖鎖形
成変異体を表し得る。COS細胞上でトランスフェクトし
た受容体への¹²⁵I−hGM−CSFの架橋では、恐らく一層可
変性のグリコシル化を反映するためか、バンド幅はHL60
細胞で見られたものより若干広いが、類似の分子量（90
000〜110000）の主バンドが得られた。減圧条件下で実
施した類似の架橋ゲルでもこれと同一の架橋結合受容体
分子量が得られたことから、成熟受容体はジスルフィド
結合するサブユニットを含んでいないことが判明した。

実施例６ 配列分析 クローン29および138の挿入体をサブクローン化し、
標準的な手法により配列決定した。第６図に示した複合
配列で、クローン29はヌクレオチド１〜1709によって表
され、クローン138はヌクレオチド７〜1807で表され
る。この２つの配列は、クローン29で1148の位置に見ら
れる１カ所のサイレント塩基の違い（Ｇ→Ａ）以外は同
一である。各配列は、それぞれ先行する22アミノ酸から
なる短い転写解読枠（ORF）に続く400アミノ酸の大きい
ORFを暗号化している。大きい方の転写解読枠が始まる
メチオニンコドンは、翻訳開始部位のための共通配列
（RCCATGG）とよく対応する文脈にあるが［コザック（1
987年）］、短い方のCRFは文脈に乏しいメチオニンコド
ンで始まる。大きいORFは22アミノ酸の推定シグナルペ
プチド配列で始まり、残基Glu23は、標準的なシグナル
ペプチド切断部位［フォン・ハイジン（1986年）］との
比較により、成熟タンパク質の最初のアミノ酸であると
断定される。

予測される378アミノ酸の成熟GM−CSF受容体は43728
の分子量を有すると計算されるが、これはクローンpGMR
138でトランスフェクトしたHL60細胞およびCOS−７細胞
への¹²⁵I−hGM−CSFの架橋によって観察された受容体サ
イズの約半分である（第５図）。コア受容体ポリペプチ
ドの予測サイズと細胞上にある成熟受容体との間のこの
差は、先に発明者らによって、成熟受容体がジスルフィ
ド結合したサブユニットを含んでいないことを明らかに
されたことから、多分、11カ所の推定297アミノ酸の細
胞外ドメインにあるＮ−結合糖鎖形成の可能性のある部
位への炭水化物の付着に起因するのであろう。疎水性プ
ロット（第７図）は、Gly320〜Phe346へまたがる27個の
荷電されていないアミノ酸配列（第６図）が膜貫通ドメ
インを表していることを示唆している。この推定膜貫通
ドメインに続いて、多くの膜貫通タンパク質の細胞質ゾ
ル面に共通する像である、膜へつながるセグメントの次
に塩基性アミノ酸の短い連鎖で始まる554アミノ酸の細
胞内ドメインが続く。GM−CSF受容体の54アミノ酸から
なる細胞内ドメインはIL6−Ｒのそれと何ら明らかな相
同性を共有していない。

GM−CSF受容体mRNAの3'の翻訳されない領域には、ヒ
ト・ゲノムの約３％を構成する反復要素（残基1943〜17
60）からなる「Alu」ファミリー［ジェリネックおよび
シュミット（1982年）］と配列要素相同性がある。さら
にその下流にはポリＡ尾部のすぐ前に２つのポリＡ付加
シグナルがある（第６図）。

予測されたGM−CSF結合細胞外ドメイン（アミノ酸23
〜319）は11個のシステイン残基を含んでいるが、これ
らは免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の特徴で
あるジスルフィド・ループ［シムズら（1988年）、ヤマ
サキら（1988年）］を作らないようである。短い細胞内
ドメイン（54アミノ酸）はシグナル導入に役割を有し得
る。このドメインは、チロシンキナーゼであることが知
られている何れの成長因子受容体の触媒性ドメイン［ハ
ンクスら（1988年）］とも明白な配列相同性を有しな
い。ただしGM−CSF受容体をヒトIL−６受容体［ヤマサ
キら（1988年）］と直接比較すると有意な相同性が明ら
かになった（第９図）。４個のシステイン残基行の位置
は近似的に保存され（GM−CSF−R C₁₂₆、C₁₃₆、C₁₆₅、C
₁₇₈:IL6−R C₁₂₁、C₁₃₂、C₁₆₅、C₁₇₆）、これらは免疫
グロブリン様ドメインと結合するIL−６受容体［ヤマサ
キら（1988年）］の２個のシステイン残基（C₄₇およびC
₉₆）とは一致しない。さらに細胞内ドメインで相同性の
パッチ（複数）（第９図）、および２種の受容体の膜貫
通ドメイン間で、どちら場合も膜貫通システイン残基を
含んだ恐らく予想外の相似性がある（GM−CSF−R L₃₃−
L₃₄₂:IL6−R L₃₇₄−L₃₈₆）。膜貫通領域における一つ一
つの残基の保存は、それぞれ対応する膜における他の膜
貫通タンパク質または脂質と関連する共通の能力を示唆
し得る。事実、セムリキ森林熱ウイルスE1スパイクタン
パク質の膜貫通領域で、膜の内葉中央部に対応して類自
的に配置されているシステイン残基は、パルミトイル化
部位であることが判っている［シュミットら（1988
年）］。しかしながら膜の推定内面に対する膜内システ
イン残基の相対位置［R₃₈₈（IL6−Ｒ）およびK₃₄₇（GM
−CSF−Ｒ）で表される］は、２つの受容体間で異なっ
ており、したがってこの残基が機能的または構造的に重
要であるのなら、これらは各受容体で異なった役割を果
たし得るであろう。

hGM−CSF受容体の細胞外ドメインは、IL−６受容体だ
けではなく、エリスロポイエチン［ド・アンドレアら
（1989年）］、インターロイキン−２［ハテケヤマら
（1989年）］、ラット・プロラクチン［ブーチンら（19
88年）］、インターロイキン−４［モズレーら（1989
年）］、およびインターロイキン−３［イトーら（1990
年）］の受容体細胞外ドメインとも相同性を示す。相同
性の領域は、上述の４個のシステイン残基と、膜貫通領
域の近くにあるTrp−Ser−Ｘ−Trp−Ser配列を中心に取
り巻いている短いアミノ酸配列を含む（第９図）。

GM−CSF受容体を暗号化している長いORFに先行して短
いORFがある。その開始メチオニンは良好な翻訳開始の
ための共通配列（上記参照）とは無関係な文脈にあるの
で、この読み取り枠は翻訳され得ないが［コザックら
（1986年）］、多分、ポリペプチドを暗号化している。
主受容体コード領域の5'のそのような短いORFはhIL6受
容体cDNAでも見いだされ［ヤマサキら（1988年）］、事
実、これらの１つ（25ヌクレオチド上流）はhIL−６受
容体前駆物質の開始を指定する文脈より一層強い文脈で
メチオニンで始まる。この知見は、これらの短いORFが
作動して主受容体コード領域の翻訳を抑制するのかも知
れないことを示唆している。

実施例７ GM−CSF受容体の転写産物 cDNAクローンpGMR138をヒト胎盤cDNAライブラリーか
ら単離したので、発明者らは、GM−CSF受容体を発現す
ることが知られている造血系細胞でも、この転写産物に
対応するmRNAが同様に存在しているかどうかを検討し
た。

ノーザンブロット分析（例えば第8A図）から、高親和
性GM−CSF受容体を発現することが知られているHL−60
細胞は、高度緊縮でpGMR138プローブへハイブリッド形
成する2.1kbの転写産物を含んでおり（レーン３〜
５）、一方、CEM T−リンパ芽球様細胞およびHepG2肝細
胞ガン細胞は、このプローブとハイブリッド形成する何
ら検出可能な転写産物を含有していないことが判明した
（レーン１および２）。

このRNA種の低い潤沢性のため、種々のRNAに対応する
cDNAのPCRに基づく増幅を使用して、種々の造血系およ
び非造血系細胞からのRNAの一層感度のよい調査に着手
した。そのような分析（例えば第8B図）から、HL−60、
U937、およびAML193等を含む種々のヒト骨髄細胞系で、
GM−CSF受容体転写産物の存在が明らかになったが、CEM
T−リンパ系、ラジ・バーキットリンパ腫、およびHepG
2肝細胞では認められなかった。興味深いことにヒーラ
ー細胞で同様にGM−CSF受容体が認められ、このcDNAク
ローンに対応する転写産物を有することが判明した（第
8B図）。

実施例８ hGM−CSF受容体のマウス細胞への導入 前述のように胎盤細胞からクローン化したヒトGM−CS
Fに対する低親和性受容体は、レトロウイルスベクター
を使用してマウスGM−CSF依存性造血細胞系（FDC−P1）
へ導入されると、その低親和性表現型を保持するが、細
胞増殖に必要な生物学的シグナルを伝達することはやは
りできなかった。

使用したマウスFDC−P1造血細胞系はhGM−CSF 10⁶単
位/mlを含有する培養で増殖せず、そのような培養で生
存する細胞もない。hGM−CSF受容体レトロウイルスを産
生する２細胞と同時培養する４種の別々の実験で、hGM
−CSFによって刺激した寒天培養で、FDC−P1細胞の0.3
〜１％をクローン的に増殖することができた。クローン
化した細胞系（hGM−Ｒ−FD系）を個々のコロニーから
発育させ、高濃度のhGM−CSFか、またはmGM−CSFと低濃
度のhGM−CSFとの混合物の何れかを使用してこれを維持
した。

19種のそのようなhGM−Ｒ−FD系からのDNAのサザンブ
ロット分析（第10a図、レーン２〜20）によって、各ク
ローンで単一なウイルス性組込み体の存在が明らかにな
ったが、クローン57（レーン19）では２つの組込み体が
明らかに認められた。潜在的に同胞種であったクローン
50および52を除いて（レーン13および14）、ウイルス組
込み部位は、ハイブリッド形成したDNA断片の大きさが
それぞれ異なることによって明らかなように、ウイルス
組込み部位が各クローン系で異なり、系毎にそれぞれ独
立したクローン起源であることが確かめられた。

実施例９ ヒトGM−CSF:（マウス＋ヒト）GM−CSFで維持された細
胞系間の相違 クローン化した系の樹立後25〜39日に、無作為に選ん
だ19種のこれらの系の比較分析の結果、２つの型の系の
間でクローン培養における挙動に明白な違いが明らかに
なった（第11図）。

親FDC−P1細胞系をmGM−CSFによって刺激すると、寒
天培地では通常60〜100％のクローン化効率を示し、大
きく密なコロニーを形成する。hGM−CSFで維持されたhG
M−Ｒ−FD系では、通常これよりも低いクローン原性を
示し（42±17％）、コロニー数の合計は、ｈまたはmGM
−CSFで刺激された培地と類似していた（第11図）。コ
ロニーは特徴的に不規則な形を示し、あるいは全体的に
分散し、最大コロニーサイズは比較的小さかった。平行
してmGM−CSFによる刺激で行った培養では、コロニーサ
イズは標準的にこれよりも２〜４倍大きかった（９種類
の細胞系で平均コロニーサイズは、mGM−CSFの場合は53
0±340細胞、これに対してhGM−CSFの場合は240±110細
胞であった）。

（マウス＋ヒト）GM−CSFで維持したhGM−Ｒ−FD細胞
系をhGM−CSFで刺激すると、コロニーの形態は類似して
いるが、クローン原性細胞の頻度は、hGM−CSF単独で維
持した細胞系より低かった（15±15％）。ｍ＋hGM−CSF
混合物では維持期間の増大とともに、hGM−CSF単独に反
応性であるクローン原性細胞の頻度は次第に低下を来し
た。これと著しく対照的に、これらの系の細胞をmGM−C
SFで刺激すると、クローン原性細胞の頻度ははるかに高
かった（96±21％）。これらのコロニーの形態およびサ
イズは親FDC−P1細胞の場合に似ており、ｍまたはhGM−
CSFで刺激したコロニーサイズの間で10倍以上の差があ
った。10種類の細胞系で平均コロニーサイズは、mGM−C
SFの場合は1900±880細胞で、これに対してhGM−CSFの
場合は170±130であった。

実施例10 ヒトGM−CSF:（ヒト＋マウス）GM−CSFで維持された系
のGM−CSFに対する反応性 ｈまたはmGM−CSFによる刺激に反応するhGM−Ｆ−RD
系の用量−反応曲線から、hGM−CSFに対する反応性は、
mGM−CSFに対する反応性より500〜1000倍率で低いこと
が分かった（第11図、第１表）。hGM−CSFを使用して増
殖させた細胞系、およびｍ＋hGM−CSFの混合物で維持さ
れた細胞系は、両タイプともmGM−CSFに対して類似の反
応性を示したが、前者はhGM−CSFに対して後者より２倍
反応性が高かった（第11図、第１表）。

300細胞を、２倍濃度に増大させたマウスまたはヒトG
M−CSFを含有する複製培地へ添加した。７日目にコロニ
ー算定を実施し、50％最大コロニー数を刺激するGM−CS
F濃度を各滴定曲線から決定した。５×10⁶細胞を使用し
て、¹³¹I−標識ヒトGM−CSFの結合を平行して測定し
た。

実施例11 トランスフェクトしたFDC−P1細胞に対するhGM−CSF受
容体の作用特徴 種々のクローン化したhGM−Ｒ−FD系を、¹²⁵I−hGM−
CSFを特異的に結合する結合能について検討した。それ
らはすべて有意な結合を示したが、この結合の程度には
かなり変動があった（第１表）。hGM−CSF単独で連続的
に維持したクローンは、hGM−CSFおよびmGM−CSFの混合
物で維持したクローンより高い平均結合水準を示した
（第１表）。

種々のhGM−Ｒ−FDクローンに対する¹²⁵I−hGM−CSF
の結合に変動があったにもかかわらず、飽和結合分析お
よび結合データのスキャッチャード変形は、検討したす
べてのクローンで類似の結合親和性を示した（第12図）
（スキャッチャード変形の勾配、K_D＝４〜6nM）。この
結合親和性は単一低親和性型に属し、ヒト胎盤膜、トラ
ンスフェクトしたCOS−７細胞、およびレトロウイルス
感染させた２種類のクローンの受容体の場合と同一であ
った。

hGM−Ｒ−FDクローンで、トランスフェクトした受容
体に対するhGM−CSFの１μg/mlまでの濃度（37℃で30分
間）での結合は、これらの細胞で同時トランスフェクト
した天然mGM−CSF受容体に対する¹²⁵I−mGM−CSFのその
後の結合に影響しなかった。同様に、hGM−Ｒ−FD細胞
上での天然受容体に対するmGM−CSF、またはマウス多能
性CSFの0.5μg/mlまでの濃度（37℃）での結合は、トラ
ンスフェクトしたhGM−CSF受容体に対する¹²⁵I−hGM−C
SFのその後の結合に影響しなかった。

¹²⁵I−hGM−CSFをhGM−Ｒ−FD細胞と37℃でインキュ
ベートすると、速やかに細胞表面のGM−CSF受容体と結
合し、ついでゆっくりと細胞内へ内部化された。結合お
よび内部化の速度はｍまたはhGM−CSFで維持したhGM−
Ｒ−FDクローンの場合と本質的に同じであった（第13
図）。ただしリガンド結合した（occupied）hGM−CSF受
容体の内部化の速度（k_e）は、hGM−Ｒ−FD細胞（k_e＝
0.0042/分）では、ヒトHL60細胞の場合（k_e＝0.061/
分）、およびFDC−P1細胞上でリガンド結合したマウスG
M−CSF受容体の場合（k_e＝0.056/分）［ニコラら（1988
年）］よりも遅かった。

マウス造血系FDC−P1細胞を、低親和性ヒト胎盤GM−C
SF受容体を暗号化しているcDNAでレトロウイルス依存的
にトランスフェクション後、細胞表面のhGM−CSF受容体
は10⁴〜10⁵/細胞濃度で単一結合型の低親和性を示した
（K_D＝４〜6nM）。注意深い分析にもかかわらず、高親
和性結合は検出されなかったが、トランスフェクトした
細胞は、依然としてhGM−CSF受容体を内部化することが
でき（内在性mGM−CSF受容体の場合より10倍率遅い速度
ではあるが）、hGM−CSFに反応する増殖能を獲得した。
hGM−Ｒ−FD細胞のhGM−CSFに対する定量的な反応性
は、mGM−CSFに対する場合より500〜1000倍率低かった
が、結合定数の測定から、リガンド結合したhGM−CSFま
たはmGM−CSF受容体は、マウスFDC−P1細胞に増殖シグ
ナルを導入するのに同程度効率的であり得ることが示唆
される。第１に、トランスフェクトされたhGM−CSF受容
体は内在性のmGM−CSFに対する高親和性受容体（K_D＝50
pM）［ウォーカーおよびバージェス（1985年）］より10
0倍率低い親和性（K_D＝5nM）でhGM−CSFを結合する。第
２に、リガンド結合したhGM−CSF受容体の内部化速度
（37℃）が、リガンド結合したmGM−CSF受容体と比べて
10倍率遅いことは、見掛けの定常状態の「親和定数」が
さらに10倍率で異なるであろう［ニコラら（1988年）］
ことを意味している。

実施例12 再クローン化した亜系の進化 ｍ＋hGM−CSFを使用してhGM−Ｒ−FD細胞系から増殖
させたコロニーの分析では、これらがmGM−CSFだけに反
応性である主細胞集団とhGM−CSFに反応性である副集団
を含んでいることが判明した。この後者の集団では、mG
M−CSFだけを使用して１週間増殖させるとコロニーが急
速に減少した。hGM−CSFだけを使用して維持した細胞系
から増殖させたコロニーは、どちらの型のGM−CSFにも
反応するクローン原性細胞の安定な内容を保有してい
た。

mGM−CSFで刺激し、もっぱらmGM−CSFだけで維持した
系から誘導した９種の亜系（subline）からの細胞は、
通常、mGM−CSFで刺激したときだけコロニーを形成し
（クローン化効率68±24％）、生成したコロニーは一律
に大型サイズのものであった。同様にｍ＋hGM−CSFで刺
激した培養から誘導し、ただしついでヒトGM−CSFで維
持した13種の亜系からの細胞は、ｈまたはmGM−CSFで刺
激した培養で、２つの型のコロニー間で２〜４倍率の特
徴的なサイズ差を維持する中型サイズの比較的少数のコ
ロニー（クローン化効率37±25％）を形成した。

hGM−CSFで刺激した系から誘導し、hGM−CSFで維持し
た６種のクローン化した亜系の試験で、クローン原性細
胞の50±26％は、抗生物質G418 800ng/mlを含有する培
養でコロニーを形成することができた。これに反して、
mGM−CSFを使用して維持した６種のクローン化した亜系
からのクローン原性細胞は、G418の存在で一律にコロニ
ーを形成することができなかった。このことは、細胞を
もっぱらmGM−CSFだけで刺激すると、挿入したネオマシ
ン耐性遺伝子の転写産物が維持されなかったことを示唆
している。

初代系21種の一連のmGM−CSF反応性亜系およびヒト反
応性亜系からのDNAサザンブロット分析で、hGM−Ｒウイ
ルス性組込み体の内容物および文脈が、すべてのサブク
ローンで、ともに維持されていることが明らかにされ
（例えば第10A図、レーン21〜27）、分岐した生物学的
特性にもかかわらず、これらの系の共通の起源が確認さ
れた。したがって細胞表面hGM−CSF受容体のhGM−CSF反
応性およびその特徴がともに欠乏したことは、hGM−Ｒ
組立て体の喪失に起因するのではないことが示唆され
た。

mGM−CSFで維持した６種の亜系からのRNAは、hGM−CS
Fで維持された亜系で明白に潤沢なhGM−Ｒウイルス性の
転写産物（レーン８〜11、他の成績は示さず）と比べ
て、検出可能なhGM−Ｒウイルス性転写産物を何ら含有
せず（第10B図、レーン２〜７）、そのような細胞での
変化が、転写レベルまたは転写直後レベルで起こること
を示唆していた。

即ち、クローン化したhGM−Ｒ−FD細胞系の挙動は、
それらをhGM−CSF単独で維持したか、あるいはhGM−CSF
およびmGM−CSFの混合物で維持したかによって異なっ
た。前者の細胞系は、hGM−CSFまたはmGM−CSFで、同等
なクローン原性で安定な表現型を維持したが、クローン
原性は、mGM−CSFで維持した細胞系の場合よりも有意に
低かった。mGM−CSFおよび低濃度のhGM−CSFの混合物で
維持した細胞系では、hGM−CSFによる刺激に反応できる
細胞の漸増的な喪失を示した。

hGM−CSFで維持した細胞系の挙動はウイルス組込み部
位によって影響されなかった。hGM−CSF単独で培養する
ことによって働く選別ストレスは、両方のウイルス遺伝
子の発現（hGM−CSFおよびネオＲ）、受容体発現、およ
びhGM−CSFに対する定量的な反応性の一定水準を維持し
た。しかしながらこれらの細胞によって示された低いク
ローン原性およびコロニーサイズは、子孫細胞のhGM−C
SF中で維持された系内で、hGM−CSFへの反応性を喪失し
た連続的な世代を示唆している。それ以外に刺激が存在
しない場合、これらの細胞は非可逆的に増殖能を失い、
その後のmGM−CSFでの培養によって救済できなかった。
この現象は、mGM−CSFだけの存在で維持された、サブク
ローン化したhGM−Ｒ−FD系の分析によって確認され
た。そのようなサブクローン化した系はそのウイルス挿
入体を維持しているが、hGM−CSF受容体およびネオＲ遺
伝子の両方の発現は、培養時間の増大とともに次第に減
少してゼロへ近づいた。ウイルス遺伝子が比較的高頻度
で残っている理由は明らかでないが、これは明らかにウ
イルス挿入部位によって左右されるのではない。事実、
レトロウイルス発現の抑制は、マウス造血系細胞［チャ
ングら（1987年）、マグリら（1987年）、エマーマンお
よびテミン（1984年）］を含む種々の異なった細胞で観
察された。ネオマイシン耐性遺伝子を駆動するためこの
組立て体で使用したSV40早期領域プロモーターは、トラ
ンス−およびシス−作用陰性の調節因子に特に感受性で
あることが判明した［チャングら（1987年）、マグリら
（1987年）、エマーマンおよびテミン（1984年）、ゴー
マンら（1985年）、ウイリアムズら（1986年）］。

ヒト胎盤GM−CSF受容体がマウス造血系FDC−P1細胞の
増殖を刺激した知見は、この受容体サブユニットが造血
系細胞上のヒトGM−CSF受容体成分を構成し得るという
示唆に支持を与える。また非造血系起源の低親和性GM−
CSF受容体は、高親和性結合成分が存在しなくても増殖
シグナルを導入することができ、リガンド依存的な態様
で造血系細胞に内部化され得るということが証明され
た。事実、トランスフェクトしたFDC−P1細胞の生物学
的反応性は、受容体−リガンド結合の基準で、ｍまたは
hGM−CSFと殆ど同一であるから、このことはさらに、ｈ
およびmGM−CSF受容体双方のシグナル発信成分が高度に
保存され得、高親和性サブユニットの主な機能は、単に
受容体内部化の速度を増大し、低いGM−CSF外部濃度へ
の造血系細胞の反応性を増大させることであるかもしれ
ないことを示唆している。導入されたhGM−CSF受容体
の、外来性のmGM−CSFまたは多能性CSF受容体との相互
作用、または同時内部化を含むデータに関して別の解釈
は除外された。

ヒトおよびマウスGM−CSF受容体間のシグナル発信の
保存にもかかわらず、GM−CSF結合ドメインにおける機
能的保存はなく、また高親和性mGM−CSF受容体を現すマ
ウス細胞との相互作用による高親和性受容体へのhGM−C
SF受容体の保存もなかった。高親和性GM−CSF受容体に
対する、クローン化した低親和性hGM−CSF受容体の関係
は不明のまま残っている。高親和性GM−CSF受容体が低
親和性GM−CSF受容体と無関係である可能性はまだあ
る。しかしながら、発明者らが仮定したように、「アダ
プター」サブユニットとの相互作用によって低親和性サ
ブユニットが高親和性サブユニットへ変換され得るので
あれば、この相互作用はこれらの種を越えて起こらない
ように思われる。

この発明のGM−CSF受容体には、以下に挙げる治療
的、診断的、および調製用に可能性のある広範囲な応用
が期待されるが、ただしこれだけに限定されるものでは
ない。

1.GM−CSFに依存する骨髄性白血病の増殖抑制。

2.GM−CSFを過剰投与された患者の処置。

3.GM−CSF投与患者に不都合な副作用の局所的な処置。

4.過剰反応または不適当な炎症反応患者における全身的
または局所的なGM−CSF濃度の調節。

5.慢性感染症（例えば、肺真菌感染、リステリア症、結
核、急性呼吸困難症候群）、自己免疫反応、または不適
当なGM−CSF産生患者の炎症反応の軽減。

6.治療成績および治療選択のための骨髄性白血病の層化
分類。

7.GM−CSFおよび化学療法剤の併用治療を受ける患者を
選択する腫瘍（GM−CSF−Ｒのガンを除く）におけるGM
−CSF−Ｒの異常発現の検出（例えば肺ガン、乳ガン、
膀胱ガン、骨髄性白血病）。

8.再生不良性貧血および先天性好中球減少症におけるGM
−CSF反応性のある患者のスクリーニング。

9.自己免疫性抗GM−CSF−Ｒ抗体によって生じる疾患状
態の確認（例えば自己免疫性好中球減少症）。

10.臨床研究および治療的用途のためのGM−CSFの迅速精
製を行うアフィニティーマトリックスの調製。

11.GM−CSF作用の潜在的アゴニストおよびアンタゴニス
トのスクリーニング。

12.a.循環する可溶性GM−CSF−Ｒの同定および定量化、 b.治療前の評価のための骨髄細胞のスクリーニング、 c.前処置患者における保存骨髄の評価、 d.GM−CSF−Ｒの臨床試験におけるGM−CSF−Ｒの薬動学
的測定 に使用するhGM−CSF−Ｒに対する抗体の調製。

13.治療および全身性脂質濃度の低下する用途のためのG
M−CSF作用を真似る抗イディオタイプ抗体の調製。

14.骨髄性白血病のような疾患で異常GM−CSF受容体遺伝
子を同定するための核酸プローブの調製。

これらの応用は、hGM−CSFについて列挙したが、当業
者であれば、好適な動物のGM−CSFの対応する動物用診
断、治療、および調製用の応用がこの発明の範囲に包含
されることが明らかであろう。

引用した参考文献を以下の頁に列挙する。

この発明の一般的な態様は、以上説明した個々の詳細
にのみ限定されるものでないことは自明のことである。

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ド、第68巻第1178−1181頁

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ギアリング、デヴィッド・ポール アメリカ合衆国98199ワシントン州シア トル、ウエスト・ニュートン・ストリー ト ナンバー302 2324番 (72)発明者 メットカーフ、ドナルド オーストラリア連邦3103ヴィクトリア、 バルウィン、ユニオン・ロード 268番 (72)発明者 キング、ジュリー・アン アメリカ合衆国98199ワシントン州シア トル、ウエスト・ニュートン・ストリー ト ナンバー302 2324番 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85，Ｐ．487−491 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/715 C07K 6/28 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
   コードする核酸配列または当該核酸配列に相補的である
   核酸配列を有することを特徴とする、核酸： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
   ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   し、ヒトGM−CSFに結合する能力を有するタンパク質。
2. 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
   コードする核酸配列または当該核酸配列に相補的である
   核酸配列を有することを特徴とする、核酸： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
   ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   し、ヒトGM−CSFに結合する能力を有するタンパク質。
3. 【請求項３】核酸が一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNAおよび
   RNAから選択されたものである、請求項１または２記載
   の核酸。
4. 【請求項４】核酸がcDNAである、請求項１または２記載
   の核酸。
5. 【請求項５】核酸が以下の核酸配列を有するDNAであ
   る、請求項１記載の核酸：
6. 【請求項６】核酸が以下の核酸配列を有するDNAであ
   る、請求項２記載の核酸：
7. 【請求項７】核酸が以下の核酸配列を有するDNAであ
   る、請求項１または２記載の核酸：
8. 【請求項８】ヒトGM−CSF受容体をコードする核酸配列
   に隣接して更なる核酸配列を有する、請求項１〜７のい
   ずれかに記載の核酸。
9. 【請求項９】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
   コードする遺伝子を含む、DNA分子： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
   ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
   し、ヒトGM−CSFに結合する能力を有するタンパク質。
10. 【請求項１０】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
    をコードする遺伝子を含む、DNA分子： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
    ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
    し、ヒトGM−CSFに結合する能力を有するタンパク質。
11. 【請求項１１】遺伝子が作動しうるようにプロモータに
    結合している、請求項９または10記載のDNA分子。
12. 【請求項１２】請求項１〜11のいずれかに記載の核酸ま
    たはDNA分子を有する、プラスミドまたはベクター。
13. 【請求項１３】請求項１〜11のいずれかに記載の核酸ま
    たはDNA分子を有する、組換細胞。
14. 【請求項１４】原核細胞である、請求項13記載の組換細
    胞。
15. 【請求項１５】真核細胞である、請求項13記載の組換細
    胞。
16. 【請求項１６】真核細胞が哺乳類、酵母、昆虫、真菌お
    よび植物から選択されるものである、請求項15記載の組
    換細胞。
17. 【請求項１７】真核細胞がサルCOS細胞である、請求項1
    5記載の組換細胞。
18. 【請求項１８】真核細胞が造血細胞であり、核酸が異種
    GM−CSFに対する低親和性受容体をコードするものであ
    る、請求項15記載の組換細胞。
19. 【請求項１９】真核細胞がGM−CSF依存性造血細胞であ
    る、請求項15記載の組換細胞。
20. 【請求項２０】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
    質： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
    ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
    し、ヒトGM−CSF結合能を有するタンパク質。
21. 【請求項２１】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
    質： （ａ）次のアミノ酸配列を有するタンパク質： または （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１ないし数個のアミ
    ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
    し、ヒトGM−CSF結合能を有するタンパク質。
22. 【請求項２２】合成または組換タンパク質である、請求
    項20または21記載のタンパク質。
23. 【請求項２３】請求項13〜19のいずれかに記載の組換細
    胞によって産生される、GM−CSF受容体。
24. 【請求項２４】請求項20〜23のいずれかに記載のタンパ
    ク質またはGM−CSF受容体に特異的に結合する、抗体ま
    たはその抗原結合性フラグメント。
25. 【請求項２５】第6B図の核酸配列７〜1807に対応する核
    酸を有する、プラスミドpGMR138。
26. 【請求項２６】第6B図の核酸配列７〜1709に対応する核
    酸を有する、プラスミドpGMR29。