JP3415162B2 - Ｉｌ―１３受容体ポリペプチド - Google Patents
Ｉｌ―１３受容体ポリペプチドInfo
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、インターロイキン−13（IL−13）に対して
特異的な受容体活性を有する精製ポリペプチド、その生
物学的に活性なフラグメント、および相当する核酸配
列、ならびにそれらの適用に関する。
特異的な受容体活性を有する精製ポリペプチド、その生
物学的に活性なフラグメント、および相当する核酸配
列、ならびにそれらの適用に関する。
IL−13は、最近同定された（１、２）、活性化Ｔリン
パ球、活性化後のＢリンパ球および肥満細胞によって分
泌される112アミノ酸のサイトカインである。
パ球、活性化後のＢリンパ球および肥満細胞によって分
泌される112アミノ酸のサイトカインである。
IL−４と共有するその膨大な生物特性により、IL−13
はIL−４様サイトカインで説明されている。その活性
は、Ｂ−細胞（３−５）、単球（６−10）および他の非
−造血細胞（11−12）に対するIL−４の活性に実際に類
似している。一方、IL−４とは反対側に、休止または活
性化Ｔ細胞に対しては特異的な効果を何ら及ぼさないよ
うである（13）。
はIL−４様サイトカインで説明されている。その活性
は、Ｂ−細胞（３−５）、単球（６−10）および他の非
−造血細胞（11−12）に対するIL−４の活性に実際に類
似している。一方、IL−４とは反対側に、休止または活
性化Ｔ細胞に対しては特異的な効果を何ら及ぼさないよ
うである（13）。
単球／マクロファージ、Ｂリンパ球およびある種の造
血前駆体に対するIL−13の種々の生物活性はA.J.Minty
によって、ならびにIL−13の概説論文に詳記されている
（例えば14を参照されたし）。加えて、幾つかのデータ
は、このサイトカインが他の細胞型に対して多面的な効
果を有することを示している。IL−13によって直接的に
影響を受けるこれらの非−造血細胞は、内皮細胞および
小膠細胞、表皮ケラチン細胞、ならびに腎臓および小腸
のガン腫である。
血前駆体に対するIL−13の種々の生物活性はA.J.Minty
によって、ならびにIL−13の概説論文に詳記されている
（例えば14を参照されたし）。加えて、幾つかのデータ
は、このサイトカインが他の細胞型に対して多面的な効
果を有することを示している。IL−13によって直接的に
影響を受けるこれらの非−造血細胞は、内皮細胞および
小膠細胞、表皮ケラチン細胞、ならびに腎臓および小腸
のガン腫である。
IL−13の抗−炎症および免疫調節活性は、例えば、自
己免疫疾患、腫瘍およびウイルス病理の治療に有用とな
り得る。
己免疫疾患、腫瘍およびウイルス病理の治療に有用とな
り得る。
しかしながら、臨床レベルにおけるこれらの生物特性
の利用には、関連する病理において生物特性を制御およ
び変調させることができるように、それを介してこの効
果が発揮されるシグナルおよびメカニズムの完全な認識
が要求される。
の利用には、関連する病理において生物特性を制御およ
び変調させることができるように、それを介してこの効
果が発揮されるシグナルおよびメカニズムの完全な認識
が要求される。
細胞内の生物分子によって伝達されるシグナルの分析
におけるステージの１つは、その膜受容体を同定するこ
とにある。IL−13受容体のこの側面に対して行った研究
実験により、IL−13およびIL−４が共通の受容体、また
は非常に少なく見積もっても共通受容体複合体の幾つか
のコンポーネント、ならびに共通のシグナル伝達エレメ
ントを有することが示されている（15−18）。この受容
体は、考えられる細胞型によって変動し得る数で、種々
の細胞型の表面に存在する。IL−13およびIL−14受容体
の比較分布が、A.J.Minty（14）によって示されてい
る。
におけるステージの１つは、その膜受容体を同定するこ
とにある。IL−13受容体のこの側面に対して行った研究
実験により、IL−13およびIL−４が共通の受容体、また
は非常に少なく見積もっても共通受容体複合体の幾つか
のコンポーネント、ならびに共通のシグナル伝達エレメ
ントを有することが示されている（15−18）。この受容
体は、考えられる細胞型によって変動し得る数で、種々
の細胞型の表面に存在する。IL−13およびIL−14受容体
の比較分布が、A.J.Minty（14）によって示されてい
る。
Kondoら（19）は、IL−４に対して高親和性を有する
受容体の構造を記載している。この受容体は、140kDaの
糖蛋白質（IL−4R）とIL−２受容体のγ鎖（γｃ）との
会合によって形成されるダイマーである。IL−４は高親
和性（50〜100pMのKd）で140kDaの糖蛋白質サブユニッ
ト（IL−4Rまたはgp140）に結合することができる（1
5）。しかしながら、この親和性は、γｃ鎖がgp140と会
合した場合には、２〜３倍だけ上昇する。加えて、この
会合はIL−４により媒介されるある種のシグナルの伝達
にも必要である（19、20）。
受容体の構造を記載している。この受容体は、140kDaの
糖蛋白質（IL−4R）とIL−２受容体のγ鎖（γｃ）との
会合によって形成されるダイマーである。IL−４は高親
和性（50〜100pMのKd）で140kDaの糖蛋白質サブユニッ
ト（IL−4Rまたはgp140）に結合することができる（1
5）。しかしながら、この親和性は、γｃ鎖がgp140と会
合した場合には、２〜３倍だけ上昇する。加えて、この
会合はIL−４により媒介されるある種のシグナルの伝達
にも必要である（19、20）。
IL−13またはIL−４のいずれかの結合性に関する交差
−競合実験により、IL−４はIL−13の結合性を通常妨害
し得るが、IL−13は一般的にIL−４のその受容体に対す
る結合性を部分的にしか妨害できず（17、21）、IL−４
受容体の２個のサブユニットのいずれにも、またはそれ
らの会合によって形成された複合体にも結合しないこと
が立証されている。これらの知見に基づいて、本発明者
らは、IL−13に対して特異的な受容体が、もう１個のIL
−13結合性コンポーネント（IL−13Rβ）と会合した受
容体複合体IL−４よりなると予想した。
−競合実験により、IL−４はIL−13の結合性を通常妨害
し得るが、IL−13は一般的にIL−４のその受容体に対す
る結合性を部分的にしか妨害できず（17、21）、IL−４
受容体の２個のサブユニットのいずれにも、またはそれ
らの会合によって形成された複合体にも結合しないこと
が立証されている。これらの知見に基づいて、本発明者
らは、IL−13に対して特異的な受容体が、もう１個のIL
−13結合性コンポーネント（IL−13Rβ）と会合した受
容体複合体IL−４よりなると予想した。
IL−13およびIL−４に応答して増殖することができる
赤白血球細胞系統（TF−１系統）で行った研究実験によ
り、これらの２種のサイトカインがそれらの受容体に結
合した後に同様に細胞内事象を生成することが示された
（18）。平行して、交差−連結（cross−linking）実験
により、gp140が、γ鎖または新たなサブユニットのい
ずれかと分子量55〜70kDaのヘテロダイマーを形成し得
ることが示された（17、21）。
赤白血球細胞系統（TF−１系統）で行った研究実験によ
り、これらの２種のサイトカインがそれらの受容体に結
合した後に同様に細胞内事象を生成することが示された
（18）。平行して、交差−連結（cross−linking）実験
により、gp140が、γ鎖または新たなサブユニットのい
ずれかと分子量55〜70kDaのヘテロダイマーを形成し得
ることが示された（17、21）。
さらに、マウス胚幹細胞系統で最近行われた研究実験
により、424アミノ酸残基のポリペプチド（IL−13Rα）
をコードするゲノムDNAおよびcDNAを単離することが可
能となったが、これは、高親和性、すなわちその定数Kd
が約10pM〜100pMの値にある親和性を有する受容体（低
親和性受容体は、2nM〜10nMの値にある定数Kdを有して
いる）（22、23）を構成するように、IL−13受容体がIL
−４受容体と共通の鎖を分有していることを示してい
る。
により、424アミノ酸残基のポリペプチド（IL−13Rα）
をコードするゲノムDNAおよびcDNAを単離することが可
能となったが、これは、高親和性、すなわちその定数Kd
が約10pM〜100pMの値にある親和性を有する受容体（低
親和性受容体は、2nM〜10nMの値にある定数Kdを有して
いる）（22、23）を構成するように、IL−13受容体がIL
−４受容体と共通の鎖を分有していることを示してい
る。
医療レベルにおける、IL−４およびIL−13の調節の現
象の、および特にこれらの２種のサイトカインのいずれ
かによって創製される効果を分離し、別々に制御するこ
とができる可能性の明確な理解の需要性に鑑み、本発明
者らは、一方では、高親和性を有するポリペプチド特異
的結合性IL−13の特徴付けに、他方では、低親和性でIL
−13に単独で特異的に結合し、IL−４受容体と会合する
とIL−13に対する高親和性受容体を構成するもう１種の
ポリペプチドの特徴付けに関心を持った。
象の、および特にこれらの２種のサイトカインのいずれ
かによって創製される効果を分離し、別々に制御するこ
とができる可能性の明確な理解の需要性に鑑み、本発明
者らは、一方では、高親和性を有するポリペプチド特異
的結合性IL−13の特徴付けに、他方では、低親和性でIL
−13に単独で特異的に結合し、IL−４受容体と会合する
とIL−13に対する高親和性受容体を構成するもう１種の
ポリペプチドの特徴付けに関心を持った。
今回、本発明者らは、他の公知のヒト腎臓ガン腫系統
（21）よりもより多量にIL−13特異的受容体を発現して
いるヒトガン腫細胞系統を同定し、今回、IL−4/IL−13
受容体に対するIL−13の結合に寄与する、IL−13Rβと
称する一次サブユニットのクローニング、ならびに２種
のサイトカイン間の交差−競合を許容する高親和性受容
体を構成するためにIL−13受容体とIL−４受容体によっ
て分有されている、IL−13Rαと称する共通鎖のクロー
ニングを行った。しかるに、本発明はIL−13に特異的に
結合する精製ポリペプチドに関する。
（21）よりもより多量にIL−13特異的受容体を発現して
いるヒトガン腫細胞系統を同定し、今回、IL−4/IL−13
受容体に対するIL−13の結合に寄与する、IL−13Rβと
称する一次サブユニットのクローニング、ならびに２種
のサイトカイン間の交差−競合を許容する高親和性受容
体を構成するためにIL−13受容体とIL−４受容体によっ
て分有されている、IL−13Rαと称する共通鎖のクロー
ニングを行った。しかるに、本発明はIL−13に特異的に
結合する精製ポリペプチドに関する。
さらに特に、本発明の対象は、そのアミノ酸配列がIL
−13に対して特異的な受容体（IL−13RβおよびIL−13R
α）の配列に対応する精製ポリペプチド、またはその生
物学的に活性なフラグメントである。
−13に対して特異的な受容体（IL−13RβおよびIL−13R
α）の配列に対応する精製ポリペプチド、またはその生
物学的に活性なフラグメントである。
また、本発明の対象は、該ポリペプチドまたはその生
物学的に活性なフラグメントをコードする単離DNA配列
でもある。
物学的に活性なフラグメントをコードする単離DNA配列
でもある。
加えて、本発明は、前記定義のヌクレオチド配列の少
なくとも１種を含有する発現ベクター、および該ヌクレ
オチド配列のうちの１種の複製および／または発現を許
容する条件下にてこれらの発現ベクターでトランスフェ
クトした宿主細胞に関する。
なくとも１種を含有する発現ベクター、および該ヌクレ
オチド配列のうちの１種の複製および／または発現を許
容する条件下にてこれらの発現ベクターでトランスフェ
クトした宿主細胞に関する。
トランスフェクトした宿主細胞による組換えIL−13R
βおよびIL−13Rαまたはそれらの生物学的に活性なフ
ラグメントの産生方法も本発明の一部である。
βおよびIL−13Rαまたはそれらの生物学的に活性なフ
ラグメントの産生方法も本発明の一部である。
また、本発明は、IL−13によって創製される免疫およ
び炎症メカニズムを調節するための、IL−13Rβおよび
／またはIL−13Rαまたはそれらの生物学的に活性なフ
ラグメントを含む医薬組成物をも含む。加えて、本発明
は、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの活性を変調さ
せることができる剤を同定するための方法、およびこれ
らの剤をスクリーニングするためのIL−13Rβおよび／
またはIL−13Rαまたはそれらのフラグメントの使用、
ならびにIL−13受容体の活性を変調させることができる
新規な生成物の製造方法に関する。
び炎症メカニズムを調節するための、IL−13Rβおよび
／またはIL−13Rαまたはそれらの生物学的に活性なフ
ラグメントを含む医薬組成物をも含む。加えて、本発明
は、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの活性を変調さ
せることができる剤を同定するための方法、およびこれ
らの剤をスクリーニングするためのIL−13Rβおよび／
またはIL−13Rαまたはそれらのフラグメントの使用、
ならびにIL−13受容体の活性を変調させることができる
新規な生成物の製造方法に関する。
また、本発明は、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rα
に対して特異的な抗体または抗体の誘導体をも含む。
に対して特異的な抗体または抗体の誘導体をも含む。
最後に、本発明は、IL−13Rβおよび／またはIL−13R
α、それらの生物学的に活性なフラグメントのうちの１
種、またはこの受容体の活性を特異的に変調させること
ができる化合物を、医薬上許容されるビヒクルと組合せ
て患者に投与することを含む、IL−13によって媒介され
る免疫反応を変調させるための治療処理方法に関する。
α、それらの生物学的に活性なフラグメントのうちの１
種、またはこの受容体の活性を特異的に変調させること
ができる化合物を、医薬上許容されるビヒクルと組合せ
て患者に投与することを含む、IL−13によって媒介され
る免疫反応を変調させるための治療処理方法に関する。
以降の本発明の記載においては、以下の定義を使用す
る： −高親和性でIL−13に特異的に結合するポリペプチド
（IL−13Rβ）：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラ
グメントもしくは誘導体； −低親和性でIL−13に単独で特異的に結合し、IL−４受
容体と会合すると高親和性受容体を構成するポリペプチ
ド（IL−13Rα）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラ
グメントもしくは誘導体； −生物学的に活性な:IL−13に特異的に結合することが
でき、かつ／または細胞膜のレベルでIL−13によって特
異的に生成されるシグナルの伝達に関与することがで
き、かつ／またはIL−４およびIL−13に結合することが
できる複合体を形成するように、IL−４に対して特異的
な受容体（IL−4R/gp140）と相互作用することができ、
かつ／または配列番号２の配列および／または配列番号
４の配列のポリペプチドに対して特異的な抗体によって
認識され、ならびに／あるいは配列番号２の配列および
／または配列番号４の配列のポリペプチドを認識する抗
体を誘導することができること； −誘導体：配列番号２の配列および／または配列番号４
の配列のポリペプチドの変異型であるいずれかのポリペ
プチド、または配列番号２の配列または配列番号４の配
列の遺伝的および／または化学的性質の改変から得た、
すなわち１個または限定数のアミノ酸の突然変異、欠
失、付加、置換および／または化学修飾によって得たい
ずれかの分子、ならびにいずれかのイソ型配列、すなわ
ち、配列番号２の配列または配列番号４の配列、それら
を生物学的に活性とする少なくとも１種の保存された特
性を有するＤ エナンチオマー形、該変異型、修飾また
はイソ型配列中に１または２以上のアミノ酸を含有す
る、それらのフラグメントのうちの１種もしくはそれら
の修飾配列のうちの１種に等しい配列。
る： −高親和性でIL−13に特異的に結合するポリペプチド
（IL−13Rβ）：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラ
グメントもしくは誘導体； −低親和性でIL−13に単独で特異的に結合し、IL−４受
容体と会合すると高親和性受容体を構成するポリペプチ
ド（IL−13Rα）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、またはそのいずれかの生物学的に活性なフラ
グメントもしくは誘導体； −生物学的に活性な:IL−13に特異的に結合することが
でき、かつ／または細胞膜のレベルでIL−13によって特
異的に生成されるシグナルの伝達に関与することがで
き、かつ／またはIL−４およびIL−13に結合することが
できる複合体を形成するように、IL−４に対して特異的
な受容体（IL−4R/gp140）と相互作用することができ、
かつ／または配列番号２の配列および／または配列番号
４の配列のポリペプチドに対して特異的な抗体によって
認識され、ならびに／あるいは配列番号２の配列および
／または配列番号４の配列のポリペプチドを認識する抗
体を誘導することができること； −誘導体：配列番号２の配列および／または配列番号４
の配列のポリペプチドの変異型であるいずれかのポリペ
プチド、または配列番号２の配列または配列番号４の配
列の遺伝的および／または化学的性質の改変から得た、
すなわち１個または限定数のアミノ酸の突然変異、欠
失、付加、置換および／または化学修飾によって得たい
ずれかの分子、ならびにいずれかのイソ型配列、すなわ
ち、配列番号２の配列または配列番号４の配列、それら
を生物学的に活性とする少なくとも１種の保存された特
性を有するＤ エナンチオマー形、該変異型、修飾また
はイソ型配列中に１または２以上のアミノ酸を含有す
る、それらのフラグメントのうちの１種もしくはそれら
の修飾配列のうちの１種に等しい配列。
本発明の対象は、
ａ）配列番号２の配列または配列番号４の配列、および
ｂ）前記定義による、配列番号２および配列番号４由来
のいずれかの生物学的に活性な配列；から選択されるア
ミノ酸配列を含む精製ポリペプチドである。
のいずれかの生物学的に活性な配列；から選択されるア
ミノ酸配列を含む精製ポリペプチドである。
誘導体の製造は種々の対象物を有することができ、こ
れには特にIL−13に対する受容体の親和性を上昇させる
もの、IL−13とIL−４との間の交差−競合を変調させる
もの、それらの産生レベルを向上するもの、プロテアー
ゼに対するそれらの耐性を上昇させるもの、それらの生
物活性を改善するもの、あるいは新規な医薬的および／
または生物学的特性をそれらに付与するものが含まれ
る。
れには特にIL−13に対する受容体の親和性を上昇させる
もの、IL−13とIL−４との間の交差−競合を変調させる
もの、それらの産生レベルを向上するもの、プロテアー
ゼに対するそれらの耐性を上昇させるもの、それらの生
物活性を改善するもの、あるいは新規な医薬的および／
または生物学的特性をそれらに付与するものが含まれ
る。
前記定義のポリペプチドの生物学的に活性な変異型の
中では、前記のアミノ酸配列のうちの１種をコードする
遺伝子の転写物（メッセンジャーRNA）の可変スプライ
シング（alternate splicing）によって生成されたフラ
グメントが好ましい。
中では、前記のアミノ酸配列のうちの１種をコードする
遺伝子の転写物（メッセンジャーRNA）の可変スプライ
シング（alternate splicing）によって生成されたフラ
グメントが好ましい。
有利な変異型においては、配列番号２の配列のポリペ
プチドの８個のＣ−末端アミノ酸が以下の６個のアミノ
酸:VRCVTLによって置換されている。
プチドの８個のＣ−末端アミノ酸が以下の６個のアミノ
酸:VRCVTLによって置換されている。
もう１つの有利な態様により、本発明は、残基343、
好ましくは残基337まで伸長する配列番号２の配列のポ
リペプチドの細胞外ドメインを特に含む、IL−13Rβｓ
と称するIL−13Rβの可溶性形態、ならびに、残基343、
好ましくは残基336と342との間の残基まで伸長する配列
番号４の配列のポリペプチドの細胞外ドメインを特に含
む、IL−13Rαｓと称するIL−13Rαの可溶性形態に関す
る。
好ましくは残基337まで伸長する配列番号２の配列のポ
リペプチドの細胞外ドメインを特に含む、IL−13Rβｓ
と称するIL−13Rβの可溶性形態、ならびに、残基343、
好ましくは残基336と342との間の残基まで伸長する配列
番号４の配列のポリペプチドの細胞外ドメインを特に含
む、IL−13Rαｓと称するIL−13Rαの可溶性形態に関す
る。
配列番号２の配列または配列番号４の配列を含むポリ
ペプチドは、本発明の特定の具体例を表す。実施例から
明らかとなるように、このポリペプチドは、機能性IL−
13受容体を形成するようにヒト細胞の表面に発現させる
ことができ、かつ／または、IL−２受容体のγ鎖と共
に、IL−４およびIL−13に共通の受容体複合体を形成す
るようにIL−４受容体と結合させることができる。
ペプチドは、本発明の特定の具体例を表す。実施例から
明らかとなるように、このポリペプチドは、機能性IL−
13受容体を形成するようにヒト細胞の表面に発現させる
ことができ、かつ／または、IL−２受容体のγ鎖と共
に、IL−４およびIL−13に共通の受容体複合体を形成す
るようにIL−４受容体と結合させることができる。
また、本発明の対象は、
ａ）配列番号１の配列、
ｂ）配列番号３の配列、
ｃ）配列番号１の配列もしくは配列番号３の配列、また
はそれらの相補的配列にハイブリダイズすることがで
き、かつIL−13受容体活性を有するポリペプチドをコー
ドし、またはIL−13およびIL−４に対して高親和性を有
する受容体を再構成することができる核酸配列、ならび
に ｄ）遺伝コードの縮重のために、配列ａ）、ｂ）および
ｃ）由来となる核酸配列；から選択される単離核酸配列
でもある。
はそれらの相補的配列にハイブリダイズすることがで
き、かつIL−13受容体活性を有するポリペプチドをコー
ドし、またはIL−13およびIL−４に対して高親和性を有
する受容体を再構成することができる核酸配列、ならび
に ｄ）遺伝コードの縮重のために、配列ａ）、ｂ）および
ｃ）由来となる核酸配列；から選択される単離核酸配列
でもある。
より特には、本発明の対象は、記載した生物特性の少
なくとも１つを保存している。IL−13RβまたはIL−13R
αの可溶性部分をコードする配列、およびIL−13Rβま
たはIL−13Rαの転写物の可変スプライシングによって
生成されるいずれかの変異型である。
なくとも１つを保存している。IL−13RβまたはIL−13R
αの可溶性部分をコードする配列、およびIL−13Rβま
たはIL−13Rαの転写物の可変スプライシングによって
生成されるいずれかの変異型である。
好ましい具体例は、配列番号１の配列のヌクレオチド
番号１からヌクレオチド1081まで、好ましくはヌクレオ
チド1063まで伸長するヌクレオチドのストレッチを含む
か、またはそれからなる核酸配列によって表される。
番号１からヌクレオチド1081まで、好ましくはヌクレオ
チド1063まで伸長するヌクレオチドのストレッチを含む
か、またはそれからなる核酸配列によって表される。
もう１つの好ましい具体例は、配列番号３の配列のヌ
クレオチド番号１からヌクレオチド番号1059まで、好ま
しくは番号1041と1056との間のヌクレオチドまで伸長す
るヌクレオチドのストレッチを含むか、またはそれから
なる核酸配列によって表される。
クレオチド番号１からヌクレオチド番号1059まで、好ま
しくは番号1041と1056との間のヌクレオチドまで伸長す
るヌクレオチドのストレッチを含むか、またはそれから
なる核酸配列によって表される。
有利には、本発明による核酸配列は、IL−13Rβまた
はIL−13Rαの成熟形態に相当する蛋白質をコードする
配列であり、この成熟蛋白質はシグナルペプチドの放出
の結果物である。
はIL−13Rαの成熟形態に相当する蛋白質をコードする
配列であり、この成熟蛋白質はシグナルペプチドの放出
の結果物である。
本発明の種々のヌクレオチド配列は、人工的な起源ま
たは他のものとし得る。それらは、配列番号１の配列ま
たは配列番号３の配列に基づいて作製したプローブによ
り配列ライブラリーをスクリーニングすることによって
得られるDNAまたはRNA配列とし得る。かかるライブラリ
ーは、当業者に知られている慣用的な分子生物学的技術
によって調製し得る。
たは他のものとし得る。それらは、配列番号１の配列ま
たは配列番号３の配列に基づいて作製したプローブによ
り配列ライブラリーをスクリーニングすることによって
得られるDNAまたはRNA配列とし得る。かかるライブラリ
ーは、当業者に知られている慣用的な分子生物学的技術
によって調製し得る。
本発明によるヌクレオチド配列は、化学合成、または
別法としてライブラリーのスクリーニングによって得た
配列の化学的または酵素的修飾を含む方法の組合せによ
っても調製し得る。
別法としてライブラリーのスクリーニングによって得た
配列の化学的または酵素的修飾を含む方法の組合せによ
っても調製し得る。
これらのヌクレオチド配列により、本発明によるポリ
ペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントをコ
ードするヌクレオチド・プローブを調製することができ
る。適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者によ
って日常的に使用されている温度およびイオン強度条
件、好ましくはTm−５℃とTm−30℃との間の温度条件、
なおより好ましくはTm−５℃とTm−10℃との間の温度条
件（高ストリンジェンシー）であり、Tmとは50％の塩基
対形成鎖が分離する温度として定義される溶融温度であ
る。これらは、生物試料中の本発明のポリペプチドに特
異的な転写物をハイブリダイゼーション実験によって検
出するための、あるいは多形性、突然変異、または不完
全な（poor）スプライシングから生じる異常な合成また
は遺伝的異常を検出するためのイン・ビトロ（in vitr
o）診断ツールとして用いることができる。
ペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントをコ
ードするヌクレオチド・プローブを調製することができ
る。適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者によ
って日常的に使用されている温度およびイオン強度条
件、好ましくはTm−５℃とTm−30℃との間の温度条件、
なおより好ましくはTm−５℃とTm−10℃との間の温度条
件（高ストリンジェンシー）であり、Tmとは50％の塩基
対形成鎖が分離する温度として定義される溶融温度であ
る。これらは、生物試料中の本発明のポリペプチドに特
異的な転写物をハイブリダイゼーション実験によって検
出するための、あるいは多形性、突然変異、または不完
全な（poor）スプライシングから生じる異常な合成また
は遺伝的異常を検出するためのイン・ビトロ（in vitr
o）診断ツールとして用いることができる。
本発明のプローブは、少なくとも10個のヌクレオチド
を含み、最大限、配列番号１の全体のヌクレオチド配列
もしくは配列番号３の全体のヌクレオチド配列、または
それらの相補鎖を含む。
を含み、最大限、配列番号１の全体のヌクレオチド配列
もしくは配列番号３の全体のヌクレオチド配列、または
それらの相補鎖を含む。
最も短いプローブ、すなわち約10〜15ヌクレオチドの
ものの中では、適当なハイブリダイゼーション条件は当
業者により日常的に使用されている温度およびイオン強
度条件に相当する。
ものの中では、適当なハイブリダイゼーション条件は当
業者により日常的に使用されている温度およびイオン強
度条件に相当する。
好ましくは、本発明のプローブはその使用前に標識す
る。それに関しては、例えば蛍光、放射能、化学発光、
または酵素標識のごとき幾つかの技術が、当業者の能力
の範囲内に存在する。
る。それに関しては、例えば蛍光、放射能、化学発光、
または酵素標識のごとき幾つかの技術が、当業者の能力
の範囲内に存在する。
IL−13受容体ポリペプチドまたは生物学的に活性なフ
ラグメントをコードする核酸配列のレベルの異型接合性
および遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝
的異常の検出にこれらのヌクレオチドプローブを用いる
イン・ビトロ診断方法が本発明に包含される。かかるタ
イプの方法は： −所望により、後記のヌクレオチド配列を増幅させる予
備工程の後であってもよいが、本発明のヌクレオチドプ
ローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成を許容する条件下にて、該プロ
ーブを生物試料とを接触させ； −形成され得るハイブリダイゼーション複合体を検出
し；ついで −所望により、本発明のプローブとハイブリダイゼーシ
ョン複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定して
もよい； ことを含む。
ラグメントをコードする核酸配列のレベルの異型接合性
および遺伝子転移の欠失のごとき異常な合成または遺伝
的異常の検出にこれらのヌクレオチドプローブを用いる
イン・ビトロ診断方法が本発明に包含される。かかるタ
イプの方法は： −所望により、後記のヌクレオチド配列を増幅させる予
備工程の後であってもよいが、本発明のヌクレオチドプ
ローブと前記のヌクレオチド配列との間のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成を許容する条件下にて、該プロ
ーブを生物試料とを接触させ； −形成され得るハイブリダイゼーション複合体を検出
し；ついで −所望により、本発明のプローブとハイブリダイゼーシ
ョン複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定して
もよい； ことを含む。
加えて、本発明のcDNAプローブは染色体異常の検出に
も有利に用いることができる。
も有利に用いることができる。
本発明のヌクレオチド配列は、いわゆるPCR（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）技術またはそのいずれか他の変形によ
り、配列決定反応または特異的な増幅反応用のセンスお
よび／またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドプライ
マーの製造および使用にも有用である。
ラーゼ連鎖反応）技術またはそのいずれか他の変形によ
り、配列決定反応または特異的な増幅反応用のセンスお
よび／またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドプライ
マーの製造および使用にも有用である。
さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、メッセン
ジャーRNAを包含する核酸配列と特異的にハイブリダイ
ズすることができるアンチセンス配列を調製する治療分
野においても用途を有し、遺伝子治療にも使用すること
ができる。かくして、本発明の対象は、前記定義のIL−
13受容体ポリペプチドの生成を、少なくとも部分的に阻
害することができるアンチセンス配列である。かかる配
列は、有利には、転写レベルのIL−13RβまたはIL−13R
αをコードするリーディングフレームを構成するものか
らなる。
ジャーRNAを包含する核酸配列と特異的にハイブリダイ
ズすることができるアンチセンス配列を調製する治療分
野においても用途を有し、遺伝子治療にも使用すること
ができる。かくして、本発明の対象は、前記定義のIL−
13受容体ポリペプチドの生成を、少なくとも部分的に阻
害することができるアンチセンス配列である。かかる配
列は、有利には、転写レベルのIL−13RβまたはIL−13R
αをコードするリーディングフレームを構成するものか
らなる。
それらは、より特に、アレルギーまたは炎症の治療に
使用することができる。
使用することができる。
さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、IL−13受
容体活性を有する前記定義の組換えポリペプチドの生成
にも使用することができる。
容体活性を有する前記定義の組換えポリペプチドの生成
にも使用することができる。
これらのポリペプチドは、当業者に知られている組換
え産物を作製するための技術により、前記定義のヌクレ
オチド配列から作製することができる。この場合におい
ては、使用するヌクレオチド配列を、細胞性宿主中のそ
の発現を許容するシグナルの制御下に置く。使用する細
胞性宿主は、細菌のごとき原核生物系、または酵母、昆
虫細胞、CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）
または有利に商業的に入手可能ないずれかの他の系のご
とき真核生物系から選択することができる。本発明のポ
リペプチドの発現に好ましい細胞性宿主は、繊維芽細胞
系統COS−７またはCOS−３からなる。
え産物を作製するための技術により、前記定義のヌクレ
オチド配列から作製することができる。この場合におい
ては、使用するヌクレオチド配列を、細胞性宿主中のそ
の発現を許容するシグナルの制御下に置く。使用する細
胞性宿主は、細菌のごとき原核生物系、または酵母、昆
虫細胞、CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）
または有利に商業的に入手可能ないずれかの他の系のご
とき真核生物系から選択することができる。本発明のポ
リペプチドの発現に好ましい細胞性宿主は、繊維芽細胞
系統COS−７またはCOS−３からなる。
プロモーター、アクチベーターまたは末端配列のごと
きポリペプチドの発現を制御するシグナルは、使用する
細胞性宿主に従って選択する。この終了までに、本発明
によるヌクレオチド配列を、選択した宿主内の自己複製
性ベクター、または選択した宿主の組込み性ベクターに
挿入することができる。かかるベクターは、当業者によ
って日常的に使用されている方法に従って調製され、得
られたクローンは、例えばエレクトロポレーションのご
とき標準的な方法によって適当な宿主に導入することが
できるであろう。
きポリペプチドの発現を制御するシグナルは、使用する
細胞性宿主に従って選択する。この終了までに、本発明
によるヌクレオチド配列を、選択した宿主内の自己複製
性ベクター、または選択した宿主の組込み性ベクターに
挿入することができる。かかるベクターは、当業者によ
って日常的に使用されている方法に従って調製され、得
られたクローンは、例えばエレクトロポレーションのご
とき標準的な方法によって適当な宿主に導入することが
できるであろう。
前記定義のヌクレオチド配列の少なくとも１種を含む
発現ベクターも、本発明の一部である。
発現ベクターも、本発明の一部である。
COS−７またはCOS−３細胞の場合においては、（17）
に記載されているのと同様に、ベクターpSE−１を使用
してトランスフェクションを行うことができる。
に記載されているのと同様に、ベクターpSE−１を使用
してトランスフェクションを行うことができる。
加えて、本発明は、これらの発現ベクターによってト
ランスフェクトした宿主細胞にも関する。これらの細胞
は、前記定義のベクターに挿入したヌクレオチド配列を
宿主細胞に導入し、つづいてトランスフェクトしたヌク
レオチド配列の複製および／または発現を許容する条件
下にて該細胞を培養することによって得ることができ
る。
ランスフェクトした宿主細胞にも関する。これらの細胞
は、前記定義のベクターに挿入したヌクレオチド配列を
宿主細胞に導入し、つづいてトランスフェクトしたヌク
レオチド配列の複製および／または発現を許容する条件
下にて該細胞を培養することによって得ることができ
る。
これらの細胞は、配列番号２の配列または配列番号４
の配列の組換えポリペプチドあるいはその誘導体の産生
方法に使用することができ、該方法はそれ自体が本発明
に含まれ、配列番号２の配列もしくは配列番号４の配列
の組換えポリペプチドまたは誘導体の発現を許容する条
件下にて該トランスフェクトした細胞を培養し、該組換
えポリペプチドペプチドを回収することを特徴とする。
の配列の組換えポリペプチドあるいはその誘導体の産生
方法に使用することができ、該方法はそれ自体が本発明
に含まれ、配列番号２の配列もしくは配列番号４の配列
の組換えポリペプチドまたは誘導体の発現を許容する条
件下にて該トランスフェクトした細胞を培養し、該組換
えポリペプチドペプチドを回収することを特徴とする。
使用する精製工程は当業者に知られている。組換えポ
リペプチドペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、
特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体を用いるイムノアフィニティー技術のごときを独立
で、または組合せて用いる方法によって、細胞溶解物お
よび抽出物から、培養上清から精製することができる。
リペプチドペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、
特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体を用いるイムノアフィニティー技術のごときを独立
で、または組合せて用いる方法によって、細胞溶解物お
よび抽出物から、培養上清から精製することができる。
前記定義によるIL−13Rβおよび／またはIL−13Rαを
特異的に認識することができるモノ−またはポリクロー
ナル抗体も本発明の一部である。ポリクローナル抗体
は、通常の手法により、IL−13Rβおよび／またはIL−1
3Rαに対して免疫化した動物の血清から得ることができ
る。
特異的に認識することができるモノ−またはポリクロー
ナル抗体も本発明の一部である。ポリクローナル抗体
は、通常の手法により、IL−13Rβおよび／またはIL−1
3Rαに対して免疫化した動物の血清から得ることができ
る。
モノクローナル抗体は、ＫhlerおよびMilstein（Na
ture,1975,256,495−497）によって記載されている慣用
的なハイブリドーマ培養法に従って得ることができる。
ture,1975,256,495−497）によって記載されている慣用
的なハイブリドーマ培養法に従って得ることができる。
有利な抗体は、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの
細胞外ドメインに対して指向された抗体である。
細胞外ドメインに対して指向された抗体である。
本発明による抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化
（humanized）抗体、FabおよびＦ（ab'）２フラグメン
トである。それらは、標識化抗体または免疫コンジュゲ
ートの形態としても存在し得る。例えば、それらは、ジ
フテリア毒のごとき毒素と、または放射性物と会合して
いてもよい。この場合においては、これらのイムノトキ
シンは、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの過剰発現
に関与するある種の病理の治療に使用することができる
治療剤を構成し得る。
（humanized）抗体、FabおよびＦ（ab'）２フラグメン
トである。それらは、標識化抗体または免疫コンジュゲ
ートの形態としても存在し得る。例えば、それらは、ジ
フテリア毒のごとき毒素と、または放射性物と会合して
いてもよい。この場合においては、これらのイムノトキ
シンは、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの過剰発現
に関与するある種の病理の治療に使用することができる
治療剤を構成し得る。
本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は、例えば、
免疫蛍光によってか、または金もしくはペルオキシダー
ゼ標識によって、特定の組織切片上のIL−13受容体の免
疫組織化学分析にも使用することができる。
免疫蛍光によってか、または金もしくはペルオキシダー
ゼ標識によって、特定の組織切片上のIL−13受容体の免
疫組織化学分析にも使用することができる。
それらは、例えば異常な過剰発現のごときIL−13Rβ
および／またはIL−13Rαの発現を観察することが要求
されたり、または膜発現の調節をモニターするいずれの
状況においても有利に使用することができる。
および／またはIL−13Rαの発現を観察することが要求
されたり、または膜発現の調節をモニターするいずれの
状況においても有利に使用することができる。
しかるに、本発明は、異常なレベルで発現されたIL−
13Rβおよび／またはIL−13Rαを含有し得る生物試料中
の、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの異常な発現と
関連付けられる病理のイン・ビトロ診断方法にも関し、
該方法は、本発明の少なくとも１種の抗体を、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαと該抗体（群）との間の特
異的な免疫複合体の可能な形成を許容する条件下にて、
該生物試料と接触させ、形成され得る該特異的な免疫複
合体を検出することを特徴とする。
13Rβおよび／またはIL−13Rαを含有し得る生物試料中
の、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαの異常な発現と
関連付けられる病理のイン・ビトロ診断方法にも関し、
該方法は、本発明の少なくとも１種の抗体を、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαと該抗体（群）との間の特
異的な免疫複合体の可能な形成を許容する条件下にて、
該生物試料と接触させ、形成され得る該特異的な免疫複
合体を検出することを特徴とする。
また、本発明は、生物試料中のIL−13Rβおよび／ま
たはIL−13Rαの異常な発現のイン・ビトロ診断用の、
ならびに／あるいは該試料中のIL−13受容体の発現レベ
ルを測定するためのキットにも関し、該キットは、 −所望により支持体に結合されていてもよい、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαに対して特異的な少なくと
も１種の抗体、 −IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαと該抗体（群）と
の間の特異的な抗原／抗体複合体の形成を明らかにする
ための手段、および／またはこれらの複合体を定量化す
るための手段を含む。
たはIL−13Rαの異常な発現のイン・ビトロ診断用の、
ならびに／あるいは該試料中のIL−13受容体の発現レベ
ルを測定するためのキットにも関し、該キットは、 −所望により支持体に結合されていてもよい、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαに対して特異的な少なくと
も１種の抗体、 −IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαと該抗体（群）と
の間の特異的な抗原／抗体複合体の形成を明らかにする
ための手段、および／またはこれらの複合体を定量化す
るための手段を含む。
本発明のもう１つの対象は、IL−13Rβおよび／また
はIL−13Rαに特異的なリガンドまたはその活性を変調
させることができる剤を同定および／または単離するた
めの方法に関し、該方法は、所望により未同定であって
もよい、当該化合物が受容体に対する親和性を有するで
あろう場合には、化合物または種々の化合物を含有する
混合物を、IL−13受容体と該化合物との間の相互作用を
許容する条件下にて、その表面にIL−13Rβおよび／ま
たはIL−13Rαを発現している細胞と接触させ、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαに結合した化合物、または
その生物活性を変調させることができるものを検出およ
び／または単離することを特徴とする。
はIL−13Rαに特異的なリガンドまたはその活性を変調
させることができる剤を同定および／または単離するた
めの方法に関し、該方法は、所望により未同定であって
もよい、当該化合物が受容体に対する親和性を有するで
あろう場合には、化合物または種々の化合物を含有する
混合物を、IL−13受容体と該化合物との間の相互作用を
許容する条件下にて、その表面にIL−13Rβおよび／ま
たはIL−13Rαを発現している細胞と接触させ、IL−13R
βおよび／またはIL−13Rαに結合した化合物、または
その生物活性を変調させることができるものを検出およ
び／または単離することを特徴とする。
特定の具体例において、本発明のこの方法は、そのIL
−13Rβおよび／またはIL−13Rα受容体についてのIL−
13のアゴニストおよびアンタゴニストの同定および／ま
たは単離に適用される。
−13Rβおよび／またはIL−13Rα受容体についてのIL−
13のアゴニストおよびアンタゴニストの同定および／ま
たは単離に適用される。
また、本発明は、医薬上許容される担体と結合した、
有効成分として、好ましくは可溶性形態の、前記定義に
相当するポリペプチドを含む医薬組成物をも含む。
有効成分として、好ましくは可溶性形態の、前記定義に
相当するポリペプチドを含む医薬組成物をも含む。
かかるポリペプチドは、細胞表面に発現されたIL−13
Rβおよび／またはIL−13Rαと実際に競合して作用し、
それによって、IL−13のその受容体への結合性に特異的
なアンタゴニストを構成することができ、病理状態にお
いてIL−13によって媒介される反応を変調させることを
意図した医薬生成物の合成に有利に使用することができ
る。
Rβおよび／またはIL−13Rαと実際に競合して作用し、
それによって、IL−13のその受容体への結合性に特異的
なアンタゴニストを構成することができ、病理状態にお
いてIL−13によって媒介される反応を変調させることを
意図した医薬生成物の合成に有利に使用することができ
る。
最後に、本発明は、医薬上許容されるビヒクルと結合
した、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαを（またはそ
れらの生物学的に活性なフラグメントの１種を、または
その生物活性を特異的に変調させることができる化合物
を、患者に投与することを含む、IL−13によって媒介さ
れる免疫学的反応にリンクした状態の治療処理方法を含
む。
した、IL−13Rβおよび／またはIL−13Rαを（またはそ
れらの生物学的に活性なフラグメントの１種を、または
その生物活性を特異的に変調させることができる化合物
を、患者に投与することを含む、IL−13によって媒介さ
れる免疫学的反応にリンクした状態の治療処理方法を含
む。
本発明の他の特徴および利点は、以下に説明を表す実
施例および図面と残りの説明とで明らかになるであろ
う。
施例および図面と残りの説明とで明らかになるであろ
う。
図面の説明
−図1:Caki−１細胞中に存在するヒトIL−13Rβ受容体
の特徴付け ａ）［125I］で標識したIL−13の飽和曲線のスキャッチ
ャード解析（挿入図）； ｂ）上昇してゆく濃度の非標識IL−13（・）およびIL−
４（○）存在下における［125I］［Phe43］−IL−13−G
lyTyrGlyTyrの結合性； ｃ）非標識IL−13不存在下（レーンａ）、および100倍
過剰量の非IL−13（レーンｂ）またはIL−４（レーン
ｃ）存在下にて放射性IL−13を用いた交差−連結実験； ｄ）IL−4R鎖に対して特異的なモノクローナル抗体およ
びIL−４アンタゴニストY124DIL−４存在下における、I
L−13およびIL−４によって誘導されるIL−６の分泌の
阻害。
の特徴付け ａ）［125I］で標識したIL−13の飽和曲線のスキャッチ
ャード解析（挿入図）； ｂ）上昇してゆく濃度の非標識IL−13（・）およびIL−
４（○）存在下における［125I］［Phe43］−IL−13−G
lyTyrGlyTyrの結合性； ｃ）非標識IL−13不存在下（レーンａ）、および100倍
過剰量の非IL−13（レーンｂ）またはIL−４（レーン
ｃ）存在下にて放射性IL−13を用いた交差−連結実験； ｄ）IL−4R鎖に対して特異的なモノクローナル抗体およ
びIL−４アンタゴニストY124DIL−４存在下における、I
L−13およびIL−４によって誘導されるIL−６の分泌の
阻害。
−図2:IL−13RβのcDNAのヌクレオチド配列、ならびにI
L−5RおよびIL−13Rβの蛋白質配列の比較 ａ）IL−13RβのcDNAのヌクレオチド配列。核酸配列の
予想シグナルペプチドに相当するアミノ酸はイタリック
で示し、貫膜ドメインに相当するアミノ酸は太字で示
す。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Th
r）には下線を引いている； ｂ）IL−13RβおよびIL−5R配列のアミノ酸の整列。IL
−13RおよびIL−5Rの蛋白質配列を前記（24）と同様に
整列させている。受容体のこのファミリーに特徴的なシ
ステイン残基およびWSXWSモチーフは四角で囲んでい
る。
L−5RおよびIL−13Rβの蛋白質配列の比較 ａ）IL−13RβのcDNAのヌクレオチド配列。核酸配列の
予想シグナルペプチドに相当するアミノ酸はイタリック
で示し、貫膜ドメインに相当するアミノ酸は太字で示
す。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Th
r）には下線を引いている； ｂ）IL−13RβおよびIL−5R配列のアミノ酸の整列。IL
−13RおよびIL−5Rの蛋白質配列を前記（24）と同様に
整列させている。受容体のこのファミリーに特徴的なシ
ステイン残基およびWSXWSモチーフは四角で囲んでい
る。
−図3:IL−13Rβ mRNAの発現パターン。
RNAは以下の細胞から調製した:Caki−１（レーン
ａ）、A431（レーンｂ）、TF−１（レーンｃ）、U937
（レーンｄ）、Jurkat（レーンｅ）およびIM9（レーン
ｆ）。
ａ）、A431（レーンｂ）、TF−１（レーンｃ）、U937
（レーンｄ）、Jurkat（レーンｅ）およびIM9（レーン
ｆ）。
−図4:IL−13についての組換えIL−13Rβ受容体の特徴
付け。
付け。
COS−７細胞をIL−13Rβ cDNAでトランスフェクト
し： ａ）飽和曲線のスキャッチャード解析による放射性同位
元素標識化IL−13の結合性に関する実験（挿入図）； ｂ）不存在（レーンａ）、および100倍過剰量の非標識I
L−13存在（レーンｂ）下にて放射性同位元素標識化IL
−13を用いた交差−連結実験； ｃ−ｄ）クローン化IL−13Rβ、IL−4R（gp140）および
γｃ鎖を用いた同時トランスフェクション実験につづく
放射性同位元素標識化IL−13（ｃ）またはIL−４（ｄ）
の結合性。
し： ａ）飽和曲線のスキャッチャード解析による放射性同位
元素標識化IL−13の結合性に関する実験（挿入図）； ｂ）不存在（レーンａ）、および100倍過剰量の非標識I
L−13存在（レーンｂ）下にて放射性同位元素標識化IL
−13を用いた交差−連結実験； ｃ−ｄ）クローン化IL−13Rβ、IL−4R（gp140）および
γｃ鎖を用いた同時トランスフェクション実験につづく
放射性同位元素標識化IL−13（ｃ）またはIL−４（ｄ）
の結合性。
斜線棒グラフおよび白抜き棒グラフは、各々、IL−13
およびIL−４の特異的結合性を表す。
およびIL−４の特異的結合性を表す。
−図5:経時発現の可溶性形態の受容体（IL−13Rβｓ）
によるIL−13のIL−13Rβへの結合性の阻害。
によるIL−13のIL−13Rβへの結合性の阻害。
2034でトランスフェクトした細胞上清中のIL−13Rβ
ｓの発現を、IL−13Rβ（2036）でトランスフェクトし
た細胞に対するIL−13の結合性の阻害によって試験し
た。該上清は、ヨウ素化リガンド中でそれを1.5倍に希
釈することによって粗製状態で試験した。
ｓの発現を、IL−13Rβ（2036）でトランスフェクトし
た細胞に対するIL−13の結合性の阻害によって試験し
た。該上清は、ヨウ素化リガンド中でそれを1.5倍に希
釈することによって粗製状態で試験した。
2036NSB:過剰量の非標識IL−13存在下における非特異
的結合性。
的結合性。
2036BT:2036でトランスフェクトした細胞に対する合
計結合性。
計結合性。
2036＋sgt2034:2034でトランスフェクトした細胞の上
清存在下における、2036でトランスフェクトした細胞に
対する結合性。
清存在下における、2036でトランスフェクトした細胞に
対する結合性。
2036＋sgt pSE1:対照
−図6:安定系統上の可溶性形態の受容体（IL−13Rβ
ｓ）によるIL−13のIL−13Rβへの結合性の阻害。
ｓ）によるIL−13のIL−13Rβへの結合性の阻害。
T2036−22:IL−13Rβｓを分泌するクローン上清不存
在下における、IL−13Rβ（2036−22）に対する合計結
合性（参照 100％） 2034−４ 2034−６ 2034−19 ４種のクローンIL−13Rβｓ 2034−21 1274−20:IL−13Rβｓを発現していないCHO細胞の上
清存在下（対照）。
在下における、IL−13Rβ（2036−22）に対する合計結
合性（参照 100％） 2034−４ 2034−６ 2034−19 ４種のクローンIL−13Rβｓ 2034−21 1274−20:IL−13Rβｓを発現していないCHO細胞の上
清存在下（対照）。
−図7:IL−13Rα cDNAのヌクレオチド配列、およびヒ
トIL−13Rαおよびげっ歯類IL−13Rαの蛋白質配列の比
較。
トIL−13Rαおよびげっ歯類IL−13Rαの蛋白質配列の比
較。
ａ）IL−13Rα cDNAのヌクレオチド配列。核酸配列か
ら予想されるシグナルペプチドに相当するアミノ酸には
点線の下線が引かれており、貫膜ドメインに相当するア
ミノ酸には二重線の下線が引かれている。潜在的なＮ−
グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Thr）は四角で囲んで
いる。
ら予想されるシグナルペプチドに相当するアミノ酸には
点線の下線が引かれており、貫膜ドメインに相当するア
ミノ酸には二重線の下線が引かれている。潜在的なＮ−
グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Thr）は四角で囲んで
いる。
ｂ）ヒトIL−13Rαおよびげっ歯類IL−13Rαのアミノ酸
の整列。ヒトIL−13Rαおよびげっ歯類IL−13Rαの蛋白
質配列を前記（24）と同様に整列している。受容体のこ
のファミリーに特徴的なシステイン残基およびモチーフ
WSXWSは四角で囲んでいる。
の整列。ヒトIL−13Rαおよびげっ歯類IL−13Rαの蛋白
質配列を前記（24）と同様に整列している。受容体のこ
のファミリーに特徴的なシステイン残基およびモチーフ
WSXWSは四角で囲んでいる。
−図8:IL−13についての組換えIL−13Rα受容体の特徴
付け。
付け。
CHOまたはCOS−３細胞をIL−13Rαおよび／またはIL
−4R cDNAでトランスフェクトし： ａ）IL−13Rβ cDNAでトランスフェクトした（図
Ａ）、IL−13Rβ cDNAおよびIL−4R cDNAでトランス
フェクトした（図Ｂ）、IL−13Rα cDNAでトランスフ
ェクトした（図Ｃ）、およびIL−13Rα cDNAおよびIL
−4R cDNAでトランスフェクトした（図Ｄ）CHO細胞を
用いた飽和曲線のスキャッチャード解析による、ヨウ素
−125標識化IL−13の結合性の実験、 ｂ）IL−13Rβ cDNAでトランスフェクトした（図
Ｅ）、IL−13Rβ cDNAおよびIL−4R cDNAでトランス
フェクトした（図Ｆ）、IL−13Rα cDNAでトランスフ
ェクトした（図Ｇ）、およびIL−13Rα cDNAおよびIL
−4R cDNAでトランスフェクトした（図Ｈ）CHO細胞に
対する［125I］−IL−13の結合性の競合実験。白抜きお
よび横線棒グラフは、各々、過剰量（1,000倍多い）のI
L−13またはIL−４存在下の放射性同位元素標識化IL−1
3の特異的結合性を表し、黒塗り棒グラフは合計結合性
を表している。
−4R cDNAでトランスフェクトし： ａ）IL−13Rβ cDNAでトランスフェクトした（図
Ａ）、IL−13Rβ cDNAおよびIL−4R cDNAでトランス
フェクトした（図Ｂ）、IL−13Rα cDNAでトランスフ
ェクトした（図Ｃ）、およびIL−13Rα cDNAおよびIL
−4R cDNAでトランスフェクトした（図Ｄ）CHO細胞を
用いた飽和曲線のスキャッチャード解析による、ヨウ素
−125標識化IL−13の結合性の実験、 ｂ）IL−13Rβ cDNAでトランスフェクトした（図
Ｅ）、IL−13Rβ cDNAおよびIL−4R cDNAでトランス
フェクトした（図Ｆ）、IL−13Rα cDNAでトランスフ
ェクトした（図Ｇ）、およびIL−13Rα cDNAおよびIL
−4R cDNAでトランスフェクトした（図Ｈ）CHO細胞に
対する［125I］−IL−13の結合性の競合実験。白抜きお
よび横線棒グラフは、各々、過剰量（1,000倍多い）のI
L−13またはIL−４存在下の放射性同位元素標識化IL−1
3の特異的結合性を表し、黒塗り棒グラフは合計結合性
を表している。
−図9:IL−4RまたはIL−13存在下にてCHO細胞を活性化
した後の（４または13）IL−４単独に対する受容体を
（CHO−４）、IL−13Rα単独に対する受容体を（CHO−1
3）、または結合受容体IL−13RαおよびIL−4Rを（CHO
−４−13）発現している細胞抽出物のEMSAにおける電気
泳動移動度の比較。ｃは非活性化対照を表している。
した後の（４または13）IL−４単独に対する受容体を
（CHO−４）、IL−13Rα単独に対する受容体を（CHO−1
3）、または結合受容体IL−13RαおよびIL−4Rを（CHO
−４−13）発現している細胞抽出物のEMSAにおける電気
泳動移動度の比較。ｃは非活性化対照を表している。
材料および方法
結合性および交差−連結実験：
結合性および交差−連結実験は、［125I］［Phe43］
−IL−13−GlyTyrGlyTyrについて記載されている（17）
のと同様にして行った。
−IL−13−GlyTyrGlyTyrについて記載されている（17）
のと同様にして行った。
IL−６の分泌の誘導：
Caki−１細胞（ATCC HTB46）を５×104細胞／ウェル
の密度で24−ウェルプレートに入れ、培養３日後に、密
集した単層を無ウシ胎児血清DMEM培地で３回洗浄した。
Caki−１細胞の刺激は、Y124DIL−４または抗−gp140モ
ノクローナル抗体の不存在または存在下にて、30ng/ml
のIL−４またはIL−13を用いて行った。24時間培養した
後に培養培地に放出されたIL−６の量を、ELISA技術
（フランス,Innotest社製）によって測定した。
の密度で24−ウェルプレートに入れ、培養３日後に、密
集した単層を無ウシ胎児血清DMEM培地で３回洗浄した。
Caki−１細胞の刺激は、Y124DIL−４または抗−gp140モ
ノクローナル抗体の不存在または存在下にて、30ng/ml
のIL−４またはIL−13を用いて行った。24時間培養した
後に培養培地に放出されたIL−６の量を、ELISA技術
（フランス,Innotest社製）によって測定した。
ヒトIL−13Rβ cDNAの単離および分析
前記（25）と同様にして、合計RNAをCaki−１細胞か
ら抽出した。ポリ（Ａ）RNAは、オリゴ（dT）25で被覆
した磁気ビーズ（Dynal社製）を用いて合計RNAから単離
した。２×105クローンを含有するcDNAライブラリー
は、プライマー−アダプター法（26）およびベクターpS
E−１（27）を用いて構築した。用いた発現用のクロー
ニング戦略は、以前に記載されている（17）。
ら抽出した。ポリ（Ａ）RNAは、オリゴ（dT）25で被覆
した磁気ビーズ（Dynal社製）を用いて合計RNAから単離
した。２×105クローンを含有するcDNAライブラリー
は、プライマー−アダプター法（26）およびベクターpS
E−１（27）を用いて構築した。用いた発現用のクロー
ニング戦略は、以前に記載されている（17）。
ヒトIL−13Rβ cDNAの調製：
RNA試料を逆転写酵素でコピーし、それを、配列＋52
〜＋71に相当するセンスプライマーおよび＋489〜＋470
に相当するアンチセンスプライマー（番号付けは図２に
示すcDNA配列に基いて行った）を用いるPCR（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）に付した。PCR−増幅産物は、cDNAの配
列＋445〜＋461に相補的なプローブとハイブリダイズし
た。サイズマーカーを図の左に示す。
〜＋71に相当するセンスプライマーおよび＋489〜＋470
に相当するアンチセンスプライマー（番号付けは図２に
示すcDNA配列に基いて行った）を用いるPCR（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）に付した。PCR−増幅産物は、cDNAの配
列＋445〜＋461に相補的なプローブとハイブリダイズし
た。サイズマーカーを図の左に示す。
ヒトIL−13Rα cDNAの単離および分析
１）げっ歯類IL−13Rαプローブの調製
ａ）B9細胞の培養（28）
B9細胞は、10％ウシ胎児血清および50μg/mlのゲンタ
マイシンを補充したRPMI培地（Gibco社製）中で培養し
た。
マイシンを補充したRPMI培地（Gibco社製）中で培養し
た。
ｂ）B9細胞のRNAの調製
該細胞を、PBS緩衝液（GIBCO−BRL社製、生理リン酸
緩衝液、参照04104040）で２回洗浄した。1,000rpmで10
分間遠心分離した後に、細胞ペレットを以下の組成の溶
解緩衝液中に懸濁した:4M グアニジン−チオシアネー
ト;25mMクエン酸ナトリウム pH7;0.5％サルコシル;0.1
M β２−メルカプトエタノール。
緩衝液、参照04104040）で２回洗浄した。1,000rpmで10
分間遠心分離した後に、細胞ペレットを以下の組成の溶
解緩衝液中に懸濁した:4M グアニジン−チオシアネー
ト;25mMクエン酸ナトリウム pH7;0.5％サルコシル;0.1
M β２−メルカプトエタノール。
その懸濁液を、UltraturaxソニケーターNo.231256（J
ANKE and KUNDEL社製）を用い、最大出力にて１分間超
音波処理した。pH4の酢酸ナトリウムを添加して0.2Mと
した。その溶液を１容量のフェノール／クロロホルム混
合液（v/v:5/1）で抽出した。
ANKE and KUNDEL社製）を用い、最大出力にて１分間超
音波処理した。pH4の酢酸ナトリウムを添加して0.2Mと
した。その溶液を１容量のフェノール／クロロホルム混
合液（v/v:5/1）で抽出した。
水性相に含まれるRNAを１容量のイソプロパノールの
援助で−20℃にて沈殿させた。そのペレットを溶解緩衝
液中に再懸濁した。その溶液をフェノール／クロロホル
ム混合液で再度抽出し、イソプロパノールでRNAを沈殿
させた。そのペレットを70％ついで100％エタノールで
洗浄した後に、RNAを水中に再懸濁させた。
援助で−20℃にて沈殿させた。そのペレットを溶解緩衝
液中に再懸濁した。その溶液をフェノール／クロロホル
ム混合液で再度抽出し、イソプロパノールでRNAを沈殿
させた。そのペレットを70％ついで100％エタノールで
洗浄した後に、RNAを水中に再懸濁させた。
ｃ）相補的DNAの調製
cDNAは、ポリT12プライマーを用いて合計RNA5μｇか
ら調製した。合計RNAを、30μｌ容量の緩衝液:0.5mM
各デオキシヌクレオチド三リン酸および30単位のRNアシ
ン（Promega社製）を含有する50mM トリス−HCl pH8.
3、6mM MgCl2、10mM DTT、40mM KCl中、37℃にて１
時間、ついで50℃にて10分間、さらに37℃にて10分間、
逆転写酵素RNエースＨ（Gibco−BRL社製、参照8064A）2
00単位と共にインキュベートした。65℃にて10分間加熱
することによって反応を終結させた。
ら調製した。合計RNAを、30μｌ容量の緩衝液:0.5mM
各デオキシヌクレオチド三リン酸および30単位のRNアシ
ン（Promega社製）を含有する50mM トリス−HCl pH8.
3、6mM MgCl2、10mM DTT、40mM KCl中、37℃にて１
時間、ついで50℃にて10分間、さらに37℃にて10分間、
逆転写酵素RNエースＨ（Gibco−BRL社製、参照8064A）2
00単位と共にインキュベートした。65℃にて10分間加熱
することによって反応を終結させた。
ｄ）PCR技術によるマウスIL−13Rα cDNAフラグメント
の特異的増幅 重合は、以下の組成10mM トリス−HCl pH8.3、2.5m
M MgCl2、50mM KCl、0.2mM ４種のdNTP、２種の核酸
プライマー各２μg/ml、および2.5U TAQ−DNAポリメラ
ーゼ（Beckman社製）；の緩衝液50μｌ最終容量中、cDN
A6μｌを用いて行った。プライマーのペアは、Hilton
（22）によって公開されている配列上で選択した。
の特異的増幅 重合は、以下の組成10mM トリス−HCl pH8.3、2.5m
M MgCl2、50mM KCl、0.2mM ４種のdNTP、２種の核酸
プライマー各２μg/ml、および2.5U TAQ−DNAポリメラ
ーゼ（Beckman社製）；の緩衝液50μｌ最終容量中、cDN
A6μｌを用いて行った。プライマーのペアは、Hilton
（22）によって公開されている配列上で選択した。
センス・プライマー：ヌクレオチド249〜268
アンチセンス・プライマー：ヌクレオチド1256〜1275
反応は、94℃にて１分間、58℃にて１分間、72℃にて
４分間の30サイクルにつづいて、72℃にて10分間の最終
サイクル行った。
４分間の30サイクルにつづいて、72℃にて10分間の最終
サイクル行った。
ｅ）PCR増幅産物の精製
TAE緩衝液（40mM、トリス−HCl、1mM EDTA pH7.9）
中の１％アガロースゲル（Sigma社製）上、100ボルトに
て１時間流した後に、同緩衝液中の１μg/ml臭化エチジ
ウム存在下にてゲルを染色した。増幅産物（1027塩基対
（bp）のIL−13RαのcDNAフラグメント）に相当するバ
ンドをGlass Maxキット（Gibco社製）を用いて抽出し
た。
中の１％アガロースゲル（Sigma社製）上、100ボルトに
て１時間流した後に、同緩衝液中の１μg/ml臭化エチジ
ウム存在下にてゲルを染色した。増幅産物（1027塩基対
（bp）のIL−13RαのcDNAフラグメント）に相当するバ
ンドをGlass Maxキット（Gibco社製）を用いて抽出し
た。
ｆ）プローブの調製
マウスIL−13Rα受容体に相当する1027bpの精製cDNA
フラグメント25ngを、BRL Random Primers DNA 標
識化システムキットを用いて、2.4×109dpm/μｇの比活
性で32Pで標識するか；別法として、100ngを４×108dpm
/μｇの比活性でBoeringherキットを用いたニックトラ
ンスレーションによって標識した。
フラグメント25ngを、BRL Random Primers DNA 標
識化システムキットを用いて、2.4×109dpm/μｇの比活
性で32Pで標識するか；別法として、100ngを４×108dpm
/μｇの比活性でBoeringherキットを用いたニックトラ
ンスレーションによって標識した。
２）ヒトIL−13Rα cDNAの単離および分析
ａ）合計RNAの調製
合計RNAは、1b章で前記したのと同様にしてCaki−１
細胞から抽出した。
細胞から抽出した。
ｂ）メッセンジャーRNA（ポリＡ＋画分）の精製
RNAのポリＡ＋画分の精製は、製造業者により推奨さ
れている手法に従ってDYNALオリゴ（dT）25Dynabeadsキ
ット（参照610.05）を用いて行った。原理は、それにポ
リ（dT）25オリゴヌクレオチドが結合している超常磁性
ポリスチレンビーズの使用に基く。ポリＡ＋画分は、磁
性支持体に捕捉されたビーズに結合したオリゴ（dT）25
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。
れている手法に従ってDYNALオリゴ（dT）25Dynabeadsキ
ット（参照610.05）を用いて行った。原理は、それにポ
リ（dT）25オリゴヌクレオチドが結合している超常磁性
ポリスチレンビーズの使用に基く。ポリＡ＋画分は、磁
性支持体に捕捉されたビーズに結合したオリゴ（dT）25
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。
ｃ）ノザンブロット
ポリＡ＋メッセンジャーRNA5μｇを、MOPS緩衝液（10
mM pH7.4、0.5mM EDTA）中の１％アガロース、８％ホ
ルムアルデヒド変性ゲル上に負荷した。移動させ、20×
SSC緩衝液中のＮ＋Hybondメンブレン（Amersham社製）
上に転移させた後に、そのRNAを真空下、80℃にてオー
ブン中で加熱することによって固定化させた。ついでそ
のメンブレンを、以下の緩衝液:1M NaCl、30％ホルム
アミド;1％SDS、５×デンハート溶液;100μg/mlサケ精
子DNA中、42℃にて２時間、プレハイブリダイズさせ
た。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメ
ンブレンを2.5×106dpm/mlのランダム・プライマー法に
よって調製した一定濃度のマウスIL−13Rαプローブと
同緩衝液中にて16時間ハイブリダイズさせた。ついでそ
のメンブレンを２×SSC緩衝液、0.1％SDS中、室温にて3
0分間、ついで同緩衝液中、50℃にて２時間、２回洗浄
した。カセット（Molecular Dynamics社製）中で４日
間感光させた後に、ノザンブロットをInstant Imager
（Molecular Dynamics社製）で分析した。4200bpの優
勢な転写物、および1500bpと2000bpとの二重バンド（do
ublet）がCaki−１細胞、U373およびU937で検出され
た。
mM pH7.4、0.5mM EDTA）中の１％アガロース、８％ホ
ルムアルデヒド変性ゲル上に負荷した。移動させ、20×
SSC緩衝液中のＮ＋Hybondメンブレン（Amersham社製）
上に転移させた後に、そのRNAを真空下、80℃にてオー
ブン中で加熱することによって固定化させた。ついでそ
のメンブレンを、以下の緩衝液:1M NaCl、30％ホルム
アミド;1％SDS、５×デンハート溶液;100μg/mlサケ精
子DNA中、42℃にて２時間、プレハイブリダイズさせ
た。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメ
ンブレンを2.5×106dpm/mlのランダム・プライマー法に
よって調製した一定濃度のマウスIL−13Rαプローブと
同緩衝液中にて16時間ハイブリダイズさせた。ついでそ
のメンブレンを２×SSC緩衝液、0.1％SDS中、室温にて3
0分間、ついで同緩衝液中、50℃にて２時間、２回洗浄
した。カセット（Molecular Dynamics社製）中で４日
間感光させた後に、ノザンブロットをInstant Imager
（Molecular Dynamics社製）で分析した。4200bpの優
勢な転写物、および1500bpと2000bpとの二重バンド（do
ublet）がCaki−１細胞、U373およびU937で検出され
た。
ヒトIL−13RαおよびIL−13Rβの特性の特徴付け：
COS−７またはCHO細胞を前記（17）と同様にしてペト
リ皿中でトランスフェクトした。24時間後に、その細胞
をトリプシン処理し、８×104細胞／ウェルの密度で24
−ウェルプレート中で培養した。37℃にて48時間培養さ
せた後に、その細胞を、前記（17）と同様のヨウ素化IL
−13を用いる結合性実験（３回行ったアッセイは、10％
未満の変動を示した）に用いた。トランスフェクション
に関しては、COS−７またはCHO細胞を、種々のプラスミ
ド0.6mgを用いて25−cm2プレート中でトランスフェクト
した。24時間後に、細胞単層をトリプシン処理し、８×
104細胞／ウェルにて12−ウェルプレート中で培養し
た。３日後に、標識IL−13、ならびに非標識IL−13およ
び／またはIL−４を用いて結合性および競合実験を行っ
た。結果は、別々に行った少なくとも３回の実験の代表
なものである。
リ皿中でトランスフェクトした。24時間後に、その細胞
をトリプシン処理し、８×104細胞／ウェルの密度で24
−ウェルプレート中で培養した。37℃にて48時間培養さ
せた後に、その細胞を、前記（17）と同様のヨウ素化IL
−13を用いる結合性実験（３回行ったアッセイは、10％
未満の変動を示した）に用いた。トランスフェクション
に関しては、COS−７またはCHO細胞を、種々のプラスミ
ド0.6mgを用いて25−cm2プレート中でトランスフェクト
した。24時間後に、細胞単層をトリプシン処理し、８×
104細胞／ウェルにて12−ウェルプレート中で培養し
た。３日後に、標識IL−13、ならびに非標識IL−13およ
び／またはIL−４を用いて結合性および競合実験を行っ
た。結果は、別々に行った少なくとも３回の実験の代表
なものである。
ヒトIL−13RαおよびまたはIL−4Rを発現している細胞
の核抽出物のEMSAにおける電気泳動移動度の比較： ２×106のCHO細胞を10cmペトリ皿に入れた。24時間後
に、その細胞をプラスミドDNA（34）６μｇでトランス
フェクトした。48時間後に、その細胞を、100ng/ml濃度
のIL−13またはIL−４を含むか、または含まない培地3m
l中、37℃にて30分間インキュベートした。ついで、そ
の細胞をPBS−0.5mM EDTA緩衝液で２回濯ぎ、ついでPB
S1.2ml中に採取した。ついで、その細胞を遠心分離し、
細胞抽出物を（35）記載の同様にして調製した。つい
で、細胞抽出物10〜20μｇ、および32Pで放射性同位元
素標識化したオリゴヌクレオチド・プローブ（50,000−
100,000cpm）を用いて、（36）記載と同様にしてEMSAを
行った。ここに該プローブはヒトＣεプロモーターのＣ
εエレメントに相当する（37）。合成したオリゴヌクレ
オチド・プローブは以下の配列を有する： 実施例 実施例1: Caki−１細胞表面におけるヒトIL−13Rβの発現の分析 最近、ヒト腎臓ガン腫細胞が、IL−４およびIL−13に
より分有されている受容体に加えて、大過剰量の特異的
なIL−13受容体を発現していることが発見された（2
1）。これらの結果に基づいて、ヒトガン腫細胞系統の
試料を前記（17）と同様にしてIL−13の結合について実
験した。IL−13に対する結合部位を特に多数発現する特
定の系統Caki−１（ATCC HTB46）をより詳細に分析し
た。飽和実験から得たスキャッチャード曲線は、446±5
0pMのKdおよび7.2×104受容体／細胞の結合能力を有す
る結合部位が存在することを示した（図1a）。競合実験
においては、非標識IL−13は用量−依存的な様式で標識
化IL−13を完全に置換したが、IL−４は高親和性で標識
化IL−13の約10％を置換した。より高濃度のIL−４（10
0nMよりも高い濃度）でも、残りの90％の結合IL−13を
置換しなかった（図1b）。
の核抽出物のEMSAにおける電気泳動移動度の比較： ２×106のCHO細胞を10cmペトリ皿に入れた。24時間後
に、その細胞をプラスミドDNA（34）６μｇでトランス
フェクトした。48時間後に、その細胞を、100ng/ml濃度
のIL−13またはIL−４を含むか、または含まない培地3m
l中、37℃にて30分間インキュベートした。ついで、そ
の細胞をPBS−0.5mM EDTA緩衝液で２回濯ぎ、ついでPB
S1.2ml中に採取した。ついで、その細胞を遠心分離し、
細胞抽出物を（35）記載の同様にして調製した。つい
で、細胞抽出物10〜20μｇ、および32Pで放射性同位元
素標識化したオリゴヌクレオチド・プローブ（50,000−
100,000cpm）を用いて、（36）記載と同様にしてEMSAを
行った。ここに該プローブはヒトＣεプロモーターのＣ
εエレメントに相当する（37）。合成したオリゴヌクレ
オチド・プローブは以下の配列を有する： 実施例 実施例1: Caki−１細胞表面におけるヒトIL−13Rβの発現の分析 最近、ヒト腎臓ガン腫細胞が、IL−４およびIL−13に
より分有されている受容体に加えて、大過剰量の特異的
なIL−13受容体を発現していることが発見された（2
1）。これらの結果に基づいて、ヒトガン腫細胞系統の
試料を前記（17）と同様にしてIL−13の結合について実
験した。IL−13に対する結合部位を特に多数発現する特
定の系統Caki−１（ATCC HTB46）をより詳細に分析し
た。飽和実験から得たスキャッチャード曲線は、446±5
0pMのKdおよび7.2×104受容体／細胞の結合能力を有す
る結合部位が存在することを示した（図1a）。競合実験
においては、非標識IL−13は用量−依存的な様式で標識
化IL−13を完全に置換したが、IL−４は高親和性で標識
化IL−13の約10％を置換した。より高濃度のIL−４（10
0nMよりも高い濃度）でも、残りの90％の結合IL−13を
置換しなかった（図1b）。
これらの結果は、２種の部位、すなわち２種のサイト
カインによって分有されている１種と、IL−13に特異的
なもう１種；が存在することと合致した。IL−13に対す
る親和性による交差−連結に対する実験は、約70kDaの
複合体を示し、これは、種々の細胞型においてIL−13を
用いた同様の交差−連結実験において認められた複合体
（17、21）と一致した。標識化IL−13はIL−13によって
複合体から完全に置換されたが、IL−４によっては置換
されなかった。このことは競合実験と合致した（図1
C）。
カインによって分有されている１種と、IL−13に特異的
なもう１種；が存在することと合致した。IL−13に対す
る親和性による交差−連結に対する実験は、約70kDaの
複合体を示し、これは、種々の細胞型においてIL−13を
用いた同様の交差−連結実験において認められた複合体
（17、21）と一致した。標識化IL−13はIL−13によって
複合体から完全に置換されたが、IL−４によっては置換
されなかった。このことは競合実験と合致した（図1
C）。
実施例2:
IL−４またはIL−13により誘導されるIL−６の分泌の分
析 本発明者らは、Caki−１細胞でIL−４またはIL−13に
よって誘導される分泌を分析した。２種のサイトカイン
は、同様なレベルのIL−６の分泌を誘導し、該分泌はIL
−4Rのα鎖に特異的な抗体によって、およびアンタゴニ
ストY124DIL−４によって阻害された（図1d）。ことこ
とは、Caki−１細胞中の２種のサイトカイトによって分
有されている受容体がIL−６の分泌の誘導に寄与してい
ることを示している。IL−４およびIL−13によって誘導
される蛋白質複合体IRS1/4PS（18）のリン酸化を抗−IL
−4R抗体およびIL−４アンタゴニストの存在または不存
在下にて分析した場合にも、同様の結果が認められた。
析 本発明者らは、Caki−１細胞でIL−４またはIL−13に
よって誘導される分泌を分析した。２種のサイトカイン
は、同様なレベルのIL−６の分泌を誘導し、該分泌はIL
−4Rのα鎖に特異的な抗体によって、およびアンタゴニ
ストY124DIL−４によって阻害された（図1d）。ことこ
とは、Caki−１細胞中の２種のサイトカイトによって分
有されている受容体がIL−６の分泌の誘導に寄与してい
ることを示している。IL−４およびIL−13によって誘導
される蛋白質複合体IRS1/4PS（18）のリン酸化を抗−IL
−4R抗体およびIL−４アンタゴニストの存在または不存
在下にて分析した場合にも、同様の結果が認められた。
これらの結果は、全体として考慮すると、Caki細胞中
で発現された受容体複合体IL−4/IL−13が以前に記載さ
れているものと同一であること、および過剰発現してい
るIL−13に結合する蛋白質（IL−13Rβ）がIL−4Rを含
む機能性複合体中のIL−13の認識に寄与する受容体のコ
ンポーネントであることを示している。従って、このIL
−13結合基をクローニングするためのメッセンジャーRN
Aの供給源として、これらの細胞を使用した。
で発現された受容体複合体IL−4/IL−13が以前に記載さ
れているものと同一であること、および過剰発現してい
るIL−13に結合する蛋白質（IL−13Rβ）がIL−4Rを含
む機能性複合体中のIL−13の認識に寄与する受容体のコ
ンポーネントであることを示している。従って、このIL
−13結合基をクローニングするためのメッセンジャーRN
Aの供給源として、これらの細胞を使用した。
実施例3:
IL−13受容体の一次サブユニット（IL−13Rβ）のクロ
ーニング クローニングおよび発現のストラテジーは以前に記載
されているもの（17）を用いた。２×105組換えクロー
ンを含有するcDNAライブラリーは、Caki−１細胞を用い
て構築した（26）。該ライブラリーを、各バッチのDNA
がプラスミド形態であって、COS−７細胞に導入されて
いる（29）1000のcDNAのバッチに分けた。トランスフェ
クトしたCOS−７細胞に対する標識化IL−13の結合性に
より、IL−13受容体をコードするクローンのバッチを同
定することが可能となった。陽性バッチを分配し、IL−
13に結合することができる細胞表面蛋白質の合成を行う
ことができる単一クローンが同定されるまで再スクリー
ニングした。２種の独立したIL−13Rβ cDNAを最後に
単離した。IL−13Rβ cDNAの完全ヌクレオチド配列お
よびそれから予想されるアミノ酸配列を図2aに示す。該
cDNAはポリ−Ａテイルを除く1298塩基長、および106塩
基の短い3'非翻訳領域を有する。典型的な（canonica
l）AATAAAポリアデニル化シグナルは予想された部位に
存在している。ヌクレオチド53と1192との間のオープン
リーディングフレームは380アミノ酸のポリペプチドを
規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチド、単一
の貫膜ドメイン、および短い細胞質内テイルと共に膜蛋
白質をコードする。
ーニング クローニングおよび発現のストラテジーは以前に記載
されているもの（17）を用いた。２×105組換えクロー
ンを含有するcDNAライブラリーは、Caki−１細胞を用い
て構築した（26）。該ライブラリーを、各バッチのDNA
がプラスミド形態であって、COS−７細胞に導入されて
いる（29）1000のcDNAのバッチに分けた。トランスフェ
クトしたCOS−７細胞に対する標識化IL−13の結合性に
より、IL−13受容体をコードするクローンのバッチを同
定することが可能となった。陽性バッチを分配し、IL−
13に結合することができる細胞表面蛋白質の合成を行う
ことができる単一クローンが同定されるまで再スクリー
ニングした。２種の独立したIL−13Rβ cDNAを最後に
単離した。IL−13Rβ cDNAの完全ヌクレオチド配列お
よびそれから予想されるアミノ酸配列を図2aに示す。該
cDNAはポリ−Ａテイルを除く1298塩基長、および106塩
基の短い3'非翻訳領域を有する。典型的な（canonica
l）AATAAAポリアデニル化シグナルは予想された部位に
存在している。ヌクレオチド53と1192との間のオープン
リーディングフレームは380アミノ酸のポリペプチドを
規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチド、単一
の貫膜ドメイン、および短い細胞質内テイルと共に膜蛋
白質をコードする。
４箇所の潜在的なＮ−グリコシル化部位は細胞外領域
に位置する。II型ファミリーのサイトカイン受容体の特
徴として考えられている２種の共通モチーフ（30）；第
１のものはＮ−末端ジスルフィド架橋ループ構造由来で
あり、第２のものは細胞外領域のＣ−末端に位置するWS
XWSタイプのモチーフである；も存在していることは重
要である。非常に短い細胞質配列は、なぜ細胞内のシグ
ナルを伝達するものがCaki細胞中のIL−４およびIL−13
によって分有されている受容体複合体のみであるのかを
説明しているのかも知れない。
に位置する。II型ファミリーのサイトカイン受容体の特
徴として考えられている２種の共通モチーフ（30）；第
１のものはＮ−末端ジスルフィド架橋ループ構造由来で
あり、第２のものは細胞外領域のＣ−末端に位置するWS
XWSタイプのモチーフである；も存在していることは重
要である。非常に短い細胞質配列は、なぜ細胞内のシグ
ナルを伝達するものがCaki細胞中のIL−４およびIL−13
によって分有されている受容体複合体のみであるのかを
説明しているのかも知れない。
整列実験により、ヒトIL−5Rα鎖との相同性（51％類
似および27％同一、図2b）および、より低い程度で、プ
ロラクチン受容体との相同性が立証された。IL−5R複合
体が、IL−５に結合するがもう１つの蛋白質を要するα
鎖と、IL−３およびGM−CSF受容体に共有されているβ
鎖とからなり、シグナルを伝達することができる高親和
性受容体を形成することは興味深い（31）。
似および27％同一、図2b）および、より低い程度で、プ
ロラクチン受容体との相同性が立証された。IL−5R複合
体が、IL−５に結合するがもう１つの蛋白質を要するα
鎖と、IL−３およびGM−CSF受容体に共有されているβ
鎖とからなり、シグナルを伝達することができる高親和
性受容体を形成することは興味深い（31）。
実施例4:
種々の細胞系統におけるヒトIL−13RβメッセンジャーR
NAの検出 驚くべきことには、Caki−１細胞中においては、大過
剰量のIL−13Rβが発現されているのだが、IL−13Rβお
よびIL−4Rに対する同様の量のメッセンジャーRNAがノ
ザンブロットによって検出された。この知見は、IL−4R
転写物と比較してこのmRNAのより多量の翻訳が存在する
ことを示しており、少数のIL−13結合部位しか発現して
いない細胞系統におけるIL−13Rβ mRNAの検出の欠如
を説明している。RT−PCR分析（図３）は、Caki−１細
胞で見出された転写物が、表皮ケラチン細胞系統A431、
前骨髄細胞TF−１、プレモサイティック細胞（premocyt
ic cell）U937、および細胞系統Ｂ IM9においてもよ
り低いレベルで存在することを示した。JurkatT細胞系
統またはプレ−Ｂ NALM6細胞系統において全く転写物
が検出されなかった。これらの結果は、本発明者らによ
って以前に記載されたこれらと同一の系統で行ったIL−
13結合性実験（17）、およびIL−13の知られている生物
学的標的と合致した。
NAの検出 驚くべきことには、Caki−１細胞中においては、大過
剰量のIL−13Rβが発現されているのだが、IL−13Rβお
よびIL−4Rに対する同様の量のメッセンジャーRNAがノ
ザンブロットによって検出された。この知見は、IL−4R
転写物と比較してこのmRNAのより多量の翻訳が存在する
ことを示しており、少数のIL−13結合部位しか発現して
いない細胞系統におけるIL−13Rβ mRNAの検出の欠如
を説明している。RT−PCR分析（図３）は、Caki−１細
胞で見出された転写物が、表皮ケラチン細胞系統A431、
前骨髄細胞TF−１、プレモサイティック細胞（premocyt
ic cell）U937、および細胞系統Ｂ IM9においてもよ
り低いレベルで存在することを示した。JurkatT細胞系
統またはプレ−Ｂ NALM6細胞系統において全く転写物
が検出されなかった。これらの結果は、本発明者らによ
って以前に記載されたこれらと同一の系統で行ったIL−
13結合性実験（17）、およびIL−13の知られている生物
学的標的と合致した。
実施例5:
ヒトIL−13Rβ cDNAでトランスフェクトしたCOS−７細
胞で行った結合性分析 IL−13Rβをコードする単離cDNAでトランスフェクト
したCOS−７細胞は、標識化IL−13に特異的に結合し
た。飽和曲線のスキャッチャード解析は、250±30pMのK
d値と5.6×106受容体／細胞の最大結合能力とを有する
単一のコンポーネント部位を示した（図4a）。
胞で行った結合性分析 IL−13Rβをコードする単離cDNAでトランスフェクト
したCOS−７細胞は、標識化IL−13に特異的に結合し
た。飽和曲線のスキャッチャード解析は、250±30pMのK
d値と5.6×106受容体／細胞の最大結合能力とを有する
単一のコンポーネント部位を示した（図4a）。
組換え受容体の親和性は、Caki−１細胞中のIL−13R
βについての446pMのKd値および幾つかの他の細胞にお
いて記載されているもの（17）とよく一致した。その結
果、IL−5Rのα鎖との配列相同性にも拘わらず、クロー
ン化受容体は高親和性の結合部位を再構成するために第
２の鎖を必要としないため、それは異なる挙動をする。
βについての446pMのKd値および幾つかの他の細胞にお
いて記載されているもの（17）とよく一致した。その結
果、IL−5Rのα鎖との配列相同性にも拘わらず、クロー
ン化受容体は高親和性の結合部位を再構成するために第
２の鎖を必要としないため、それは異なる挙動をする。
同様に最近記載されたIL−15に結合する蛋白質（32）
が、IL−15R複合体の他の２種のコンポーネント不存在
下にて、高親和性でIL−15に結合する特徴を有すること
は興味深い。
が、IL−15R複合体の他の２種のコンポーネント不存在
下にて、高親和性でIL−15に結合する特徴を有すること
は興味深い。
競合実験においては、IL−13は、1.5±0.5nMの阻害定
数（Ki）で、クローン化受容体に対する標識化IL−13の
結合性を阻害することができたが、IL−４は該結合性を
阻害できなかった。したがって、クローン化受容体の薬
理学は、Caki−１細胞中に存在するIL−13Rβのものと
同様であった。交差−連結実験により、70kDaの放射性
同位体標識化バンドが示された。このバンドは、Caki細
胞ならびに他の細胞（17）で認められたものと同一の移
動度を有する。この複合体は、恐らくは、標識化IL−４
を用いて行った交差−連結実験におけるIL−4Rの140kDa
バンドに加えて認められた60−70kDaのバンドに相当す
る。また、このことは、機能性受容体複合体における２
種の蛋白質間に強い相互作用が存在することも示してい
る。しかるに、本発明者らは、IL−13RβとIL−4Rとが
細胞膜中で相互作用し、２種のサイトカイン間の交差−
競合を許容する受容体を再構成するのかをチェックし
た。同時発現実験の結果を図4cおよびｄに示す。
数（Ki）で、クローン化受容体に対する標識化IL−13の
結合性を阻害することができたが、IL−４は該結合性を
阻害できなかった。したがって、クローン化受容体の薬
理学は、Caki−１細胞中に存在するIL−13Rβのものと
同様であった。交差−連結実験により、70kDaの放射性
同位体標識化バンドが示された。このバンドは、Caki細
胞ならびに他の細胞（17）で認められたものと同一の移
動度を有する。この複合体は、恐らくは、標識化IL−４
を用いて行った交差−連結実験におけるIL−4Rの140kDa
バンドに加えて認められた60−70kDaのバンドに相当す
る。また、このことは、機能性受容体複合体における２
種の蛋白質間に強い相互作用が存在することも示してい
る。しかるに、本発明者らは、IL−13RβとIL−4Rとが
細胞膜中で相互作用し、２種のサイトカイン間の交差−
競合を許容する受容体を再構成するのかをチェックし
た。同時発現実験の結果を図4cおよびｄに示す。
別々か同時かのいずれかの２種の受容体の発現が、２
種とサイトカインのいずれかを特異的に認識する多数の
受容体を生じたことは明らかなようである。しかしなが
ら、それらが一緒に発現した場合には、少数の受容体し
か（５〜10％）２種のサイトカインを認識することがで
きなかった。IL−4RおよびIL−13Rβとのγｃ鎖の同時
トランスフェクションは、分有される結合部位の数の増
加を引き起こさなかった。これらの結果は、IL−13Rβ
およびIL−4R鎖が細胞膜中で互いに相互作用して、IL−
13とIL−４とが競合関係になり得る受容体を再構成し得
ることを示している。再構成受容体の低い％は、IL−13
およびIL−４が競合的に結合する受容体複合体の再構成
に必要であるCOS細胞中に限定量でもう１つの蛋白質（I
L−13Rα）が存在することに賛同する論拠である。
種とサイトカインのいずれかを特異的に認識する多数の
受容体を生じたことは明らかなようである。しかしなが
ら、それらが一緒に発現した場合には、少数の受容体し
か（５〜10％）２種のサイトカインを認識することがで
きなかった。IL−4RおよびIL−13Rβとのγｃ鎖の同時
トランスフェクションは、分有される結合部位の数の増
加を引き起こさなかった。これらの結果は、IL−13Rβ
およびIL−4R鎖が細胞膜中で互いに相互作用して、IL−
13とIL−４とが競合関係になり得る受容体を再構成し得
ることを示している。再構成受容体の低い％は、IL−13
およびIL−４が競合的に結合する受容体複合体の再構成
に必要であるCOS細胞中に限定量でもう１つの蛋白質（I
L−13Rα）が存在することに賛同する論拠である。
γｃ鎖でのトランスフェクション実験で得られた結果
は、この蛋白質が以前に示された（15）限定因子ではな
いことを立証した。この結論は、Caki−１細胞中にγｃ
メッセンジャーRNAが存在しないこと（21）によっても
支持された。
は、この蛋白質が以前に示された（15）限定因子ではな
いことを立証した。この結論は、Caki−１細胞中にγｃ
メッセンジャーRNAが存在しないこと（21）によっても
支持された。
再構成受容体の少ない数を説明するもう１つの可能な
論拠は、不適当な化学量論の２種の蛋白質が細胞膜中に
存在することである。しかしながら、異なる相対量のIL
−4RおよびIL−13Rβを用いた同時トランスフェクショ
ンは、再構成受容体の数における大きな相違は示さなか
った。IL−4Rと相互作用するより大きな結合能力を有す
るもう１つのIL−13Rが存在するという可能性が、IL−1
3Rα cDNAの単離によってマウス（22）およびヒトで確
認された（実施例７を参照されたし）。γｃの発現が、
前記されている（19）のと同様にIL−４の結合性を向上
したが、IL−13の結合性は低下させたことは注意すべき
であり、このことは、異なる鎖の間の複合体相互作用を
示している。
論拠は、不適当な化学量論の２種の蛋白質が細胞膜中に
存在することである。しかしながら、異なる相対量のIL
−4RおよびIL−13Rβを用いた同時トランスフェクショ
ンは、再構成受容体の数における大きな相違は示さなか
った。IL−4Rと相互作用するより大きな結合能力を有す
るもう１つのIL−13Rが存在するという可能性が、IL−1
3Rα cDNAの単離によってマウス（22）およびヒトで確
認された（実施例７を参照されたし）。γｃの発現が、
前記されている（19）のと同様にIL−４の結合性を向上
したが、IL−13の結合性は低下させたことは注意すべき
であり、このことは、異なる鎖の間の複合体相互作用を
示している。
実施例6:
可溶性形態の受容体によるIL−13のその膜受容体への結
合性の阻害の実験 経時的発現（図５）または安定系統（図６）における
結果を説明する。
合性の阻害の実験 経時的発現（図５）または安定系統（図６）における
結果を説明する。
IL−13RβおよびIL−13Rβｓをコードする２種のcDNA
配列を、IL−２ cDNAの代りにベクターp7055に挿入し
た（33）。得られたプラスミドは、各々、2036および20
34と称する。
配列を、IL−２ cDNAの代りにベクターp7055に挿入し
た（33）。得られたプラスミドは、各々、2036および20
34と称する。
ａ）経時的発現
CHO細胞を３×105細胞／ウェルで12−ウェルプレート
に接種し、翌日、COS細胞についてと同様にDEAE−デキ
ストラン法によって、プラスミド2036もしくは2034、ま
たは対照としての空プラスミドpSE−１のいずれかでト
ランスフェクトした。
に接種し、翌日、COS細胞についてと同様にDEAE−デキ
ストラン法によって、プラスミド2036もしくは2034、ま
たは対照としての空プラスミドpSE−１のいずれかでト
ランスフェクトした。
該細胞は、プラスミド2034でトランスフェクトした細
胞の上清にIL−13Rβｓが蓄積され、プラスミド2036で
トランスフェクトした細胞の膜中においてIL−13Rβが
良好に発現されるように、３日間培養した。
胞の上清にIL−13Rβｓが蓄積され、プラスミド2036で
トランスフェクトした細胞の膜中においてIL−13Rβが
良好に発現されるように、３日間培養した。
ついで、IL−13Rβｓ（2034）または陰性対照（空pSE
−１）でトランスフェクトした細胞の上清を回収し、IL
−13Rβでトランスフェクトした細胞を用いてIL−13の
結合性の阻害を実験した。
−１）でトランスフェクトした細胞の上清を回収し、IL
−13Rβでトランスフェクトした細胞を用いてIL−13の
結合性の阻害を実験した。
IL−13Rβを発現しているCHO細胞（2036）の表面に対
するIL−13の結合性は、放射性リガンドで1.5倍に希釈
したこれらの粗製上清の存在下または不存在下で測定
し、あるいは過剰量の非−放射性同位元素標識化IL−13
（NSB）存在下にて測定した。結合性は、300pMの放射性
リガンドを含む最終容量500ml中の全細胞に対して３回
行った。
するIL−13の結合性は、放射性リガンドで1.5倍に希釈
したこれらの粗製上清の存在下または不存在下で測定
し、あるいは過剰量の非−放射性同位元素標識化IL−13
（NSB）存在下にて測定した。結合性は、300pMの放射性
リガンドを含む最終容量500ml中の全細胞に対して３回
行った。
ｂ）安定系統
２種の安定な形質転換CHO系統は完全IL−13Rβ（380
残基のポリペプチド）または可溶性形態のIL−13Rβ（I
L−13Rβｓ、IL−13Rβの残基１〜337に相当する切頭ポ
リペプチド）のコード配列でのトランスフェクションに
よって得た。これらの配列をベクターp7055に挿入し
た。
残基のポリペプチド）または可溶性形態のIL−13Rβ（I
L−13Rβｓ、IL−13Rβの残基１〜337に相当する切頭ポ
リペプチド）のコード配列でのトランスフェクションに
よって得た。これらの配列をベクターp7055に挿入し
た。
CHO−DHFR-細胞をプラスミド2036（IL−13Rβ）およ
び2034（IL−13Rβｓ）でトランスフェクトし、組換え
クローンを以前に記載されている（33）のと同様にして
選抜した。
び2034（IL−13Rβｓ）でトランスフェクトし、組換え
クローンを以前に記載されている（33）のと同様にして
選抜した。
細胞当たり２〜５×105部位を有する、得られたクロ
ーンのうちの１種CHO−IL−13Rβ（CHO2036）をウェル
当たり105細胞の密度にて12−ウェルプレートに接種
し、２日後に、その細胞をIL−13Rβｓ存在または不存
在下の結合性実験に用いた。
ーンのうちの１種CHO−IL−13Rβ（CHO2036）をウェル
当たり105細胞の密度にて12−ウェルプレートに接種
し、２日後に、その細胞をIL−13Rβｓ存在または不存
在下の結合性実験に用いた。
それに関しては、CHO−IL−13Rβｓ（CHO2034）クロ
ーンを皿当たり５×105細胞にて6cm皿に３回接種した。
培養培地中に３日間蓄積させた後に、CHO2036クローン
のIL−13Rβに対するIL−13結合阻害実験用に培地（皿
当たり5ml）を収集した。同様にして、可溶性IL−13Rβ
を発現していないCHO細胞の上清を収集した。
ーンを皿当たり５×105細胞にて6cm皿に３回接種した。
培養培地中に３日間蓄積させた後に、CHO2036クローン
のIL−13Rβに対するIL−13結合阻害実験用に培地（皿
当たり5ml）を収集した。同様にして、可溶性IL−13Rβ
を発現していないCHO細胞の上清を収集した。
CHO2036−22クローンの表面のIL−13の結合性は、放
射性リガンドで1.5倍に希釈したこれらの粗製上清の存
在下または不存在下にて、あるいは過剰量の非−放射性
同位元素標識化IL−13（NSB）の存在下にて測定した。
結合性は、300pMの放射性リガンドを含む500ml容量中、
全細胞に対して３回行った。
射性リガンドで1.5倍に希釈したこれらの粗製上清の存
在下または不存在下にて、あるいは過剰量の非−放射性
同位元素標識化IL−13（NSB）の存在下にて測定した。
結合性は、300pMの放射性リガンドを含む500ml容量中、
全細胞に対して３回行った。
図５および６の柱状グラフは、IL−13Rβに対するIL
−13の結合性のIL−13Rβｓによる阻害を表す。IL−13
のその受容体に対する結合性の阻害は、幾つかのクロー
ンで認めることができた。
−13の結合性のIL−13Rβｓによる阻害を表す。IL−13
のその受容体に対する結合性の阻害は、幾つかのクロー
ンで認めることができた。
実施例７
ヒトIL−13Rα受容体のクローニング
ａ）Caki−１細胞のポリＡ＋メッセンジャーRNAからのc
DNAライブラリーの調製 ［32P］dCTPで標識した一本鎖相補的DNA（得られた相
補的DNAは3000dpm/ngの比活性を有する）は、ポリＡ＋
メッセンジャーRNA0.5μｇで出発し、30μｌ容量の以下
の緩衝液： 0.5mMの各種デオキシヌクレオチド三リン酸、［α32P］
dCTP 30μCi、およびRNアシン（Promega社製）30Uを含
有する50mM トリス−HCl pH8.3、6mM MgCl2、10mM
DTT、40mM KCl中にて、以下の配列（BamH I部位を含
む）： を有する合成プライマーを用いて調製した。逆転写酵素
RNエースＨ（Giboco−BRL社製）200単位と共に37℃にて
１時間、ついで50℃にて10分間、さらに37℃にて10分間
インキュベートした後に、EDTA4μｌを添加した。つい
で、2N NaOH溶液６μｌを添加し、65℃にて５分間イン
キュベートすることによって、RNA鋳型を分解した。
DNAライブラリーの調製 ［32P］dCTPで標識した一本鎖相補的DNA（得られた相
補的DNAは3000dpm/ngの比活性を有する）は、ポリＡ＋
メッセンジャーRNA0.5μｇで出発し、30μｌ容量の以下
の緩衝液： 0.5mMの各種デオキシヌクレオチド三リン酸、［α32P］
dCTP 30μCi、およびRNアシン（Promega社製）30Uを含
有する50mM トリス−HCl pH8.3、6mM MgCl2、10mM
DTT、40mM KCl中にて、以下の配列（BamH I部位を含
む）： を有する合成プライマーを用いて調製した。逆転写酵素
RNエースＨ（Giboco−BRL社製）200単位と共に37℃にて
１時間、ついで50℃にて10分間、さらに37℃にて10分間
インキュベートした後に、EDTA4μｌを添加した。つい
で、2N NaOH溶液６μｌを添加し、65℃にて５分間イン
キュベートすることによって、RNA鋳型を分解した。
合成プライマーを除去するために、TE緩衝液中で平衡
化したSephacryl S400カラム（Pharmacia社製）1ml上で
相補的DNAを精製した。最初の２つの放射性画分を合
し、クロロホルムで抽出した後に、10M酢酸アンモニウ
ム溶液1/10容量およびエタノール2.5容量で沈殿させ
た。ついで、ターミナルトランスフェラーゼ酵素（Phar
macia社製 27073001）20単位と共にdGホモポリマー性
テイルを添加することによってcDNAを5'において伸長さ
せた。つぎに、以下の組成:30mMトリス−HCl pH7.6:1m
M 塩化コバルト;140mM カコジル酸;0.1mM DTT;1mM
dGTP;を有する緩衝液20μｌ中、37℃にて15分間インキ
ュベーションを行い、ついで0.5M EDTA2μｌを添加し
た。水酸化ナトリウムでのさらなる処理を加熱すること
なく行い、つづいてS400カラム上で再精製し、クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。そのペレット
をTE緩衝液33μｌ中に溶解した。つぎのステージは、Ps
t Iで切断した後にホモポリマー性dCテイルが予めそれ
に加えられているクローニングベクターpT7T3−18、cDN
Aおよびアダプターを組合わせることにあった。cDNA（3
3μｌ）を、ベクターpT7/T3−18 75ng（５μｌ）、以
下の配列（Apa1部位を含む）： のアダプター120ng（１μｌ）、200mM NaCl溶液10μｌ
と接触させ、その混合物を65℃にて５分間インキュベー
トし、ついでその反応物を室温まで放冷させた。つぎの
ステージは、以下の組成:50mM トリス−HCl pH7.5;10
mM MgCl2、1mM ATP;を有する緩衝液中、酵素T4ファー
ジDNAリガーゼ（Pharmacia社製）32.5単位を用いて、反
応容量100μｌ中のクローニングベクターと一本鎖cDNA
とを15℃にて一晩連結させることにあった。ついで、フ
ェノールでの抽出につづいてクロロホルムで抽出するこ
とによって蛋白質を除去し、ついで10mM酢酸アンモニウ
ム溶液1/10容量およびエタノール2.5容量を添加した。
その混合物を遠心分離し、ペレットを以下の組成:33mM
トリス−酢酸 pH7.9、62.5mM 酢酸カリウム、1mM
酢酸マグネシウムおよび1mM DTT;を有する緩衝液中に
採取し、酵素T4ファージDNAポリメラーゼ（Pharmacia社
製）30単位および1mMの４種のデオキシヌクレオチド三
リン酸の混合物ならびにT4ファージ遺伝子32の蛋白質
（Pharmacia社製）２単位を含む30μｌ容量中、37℃に
て１時間、第２のcDNA鎖を合成した。その混合物をフェ
ノールで抽出し、P10カラム（Biogel P10−200−400メ
ッシュ−参照15011050−Biorad社製）上に沈殿させるこ
とによって痕跡を除去した。
化したSephacryl S400カラム（Pharmacia社製）1ml上で
相補的DNAを精製した。最初の２つの放射性画分を合
し、クロロホルムで抽出した後に、10M酢酸アンモニウ
ム溶液1/10容量およびエタノール2.5容量で沈殿させ
た。ついで、ターミナルトランスフェラーゼ酵素（Phar
macia社製 27073001）20単位と共にdGホモポリマー性
テイルを添加することによってcDNAを5'において伸長さ
せた。つぎに、以下の組成:30mMトリス−HCl pH7.6:1m
M 塩化コバルト;140mM カコジル酸;0.1mM DTT;1mM
dGTP;を有する緩衝液20μｌ中、37℃にて15分間インキ
ュベーションを行い、ついで0.5M EDTA2μｌを添加し
た。水酸化ナトリウムでのさらなる処理を加熱すること
なく行い、つづいてS400カラム上で再精製し、クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。そのペレット
をTE緩衝液33μｌ中に溶解した。つぎのステージは、Ps
t Iで切断した後にホモポリマー性dCテイルが予めそれ
に加えられているクローニングベクターpT7T3−18、cDN
Aおよびアダプターを組合わせることにあった。cDNA（3
3μｌ）を、ベクターpT7/T3−18 75ng（５μｌ）、以
下の配列（Apa1部位を含む）： のアダプター120ng（１μｌ）、200mM NaCl溶液10μｌ
と接触させ、その混合物を65℃にて５分間インキュベー
トし、ついでその反応物を室温まで放冷させた。つぎの
ステージは、以下の組成:50mM トリス−HCl pH7.5;10
mM MgCl2、1mM ATP;を有する緩衝液中、酵素T4ファー
ジDNAリガーゼ（Pharmacia社製）32.5単位を用いて、反
応容量100μｌ中のクローニングベクターと一本鎖cDNA
とを15℃にて一晩連結させることにあった。ついで、フ
ェノールでの抽出につづいてクロロホルムで抽出するこ
とによって蛋白質を除去し、ついで10mM酢酸アンモニウ
ム溶液1/10容量およびエタノール2.5容量を添加した。
その混合物を遠心分離し、ペレットを以下の組成:33mM
トリス−酢酸 pH7.9、62.5mM 酢酸カリウム、1mM
酢酸マグネシウムおよび1mM DTT;を有する緩衝液中に
採取し、酵素T4ファージDNAポリメラーゼ（Pharmacia社
製）30単位および1mMの４種のデオキシヌクレオチド三
リン酸の混合物ならびにT4ファージ遺伝子32の蛋白質
（Pharmacia社製）２単位を含む30μｌ容量中、37℃に
て１時間、第２のcDNA鎖を合成した。その混合物をフェ
ノールで抽出し、P10カラム（Biogel P10−200−400メ
ッシュ−参照15011050−Biorad社製）上に沈殿させるこ
とによって痕跡を除去した。
最終ステージは、製造業者により推奨されている条件
下、2.5kVで使用するBiorad Gene Pulser装置を用いた
組換えDNAのエレクトロポレーションによってE.coli M
C1061細胞を形質転換し、ついでその細菌を以下の組
成：バクトトリプトン10g/l;酵母エキストラクト5g/l;N
aCl 10g/l;を有するLB培地中で１時間培養することに
あった。
下、2.5kVで使用するBiorad Gene Pulser装置を用いた
組換えDNAのエレクトロポレーションによってE.coli M
C1061細胞を形質転換し、ついでその細菌を以下の組
成：バクトトリプトン10g/l;酵母エキストラクト5g/l;N
aCl 10g/l;を有するLB培地中で１時間培養することに
あった。
得られた独立クローンの数は、1.5％寒天（w/v）およ
び100μg/mlアンピシリンを補充したLB培地（以後、LB
寒天培地と称する）を入れた皿上で１時間インキュベー
ションした後の形質転換体からの1/1000希釈液を平板す
ることによって測定した。
び100μg/mlアンピシリンを補充したLB培地（以後、LB
寒天培地と称する）を入れた皿上で１時間インキュベー
ションした後の形質転換体からの1/1000希釈液を平板す
ることによって測定した。
得られた独立クローンの数は1,000,000であった。
ｂ）cDNAライブラリーのスクリーニング
全体ライブラリーをBiodyne Aメンブレン（PALL社
製、参照BNNG 132）で被覆した寒天培地（直径150mmの
ペトリ皿）上に平板した。37℃にて一晩放置した後に、
新たなメンブレン上に接触させることによってクローン
を転移させた。その新たなメンブレンを、下記の組成の
溶液に浸漬させたWathman 3MMペーパー上にそれを置く
ことによって処理した:0.5N NaOH、1.5M NaCl、５分
間、ついで0.5M トリス−HCl pH8、1.5M NaCl、５分
間。以下の緩衝液:10mM トリス−HCl pH8、10mM EDT
A、50mM NaCl、0.1％ SDS、100μg/ml プロテインキ
ナーゼK;中、37℃にて30分間、プロテインキナーゼＫで
処理した後に、そのメンブレンを２×SSC緩衝液（クエ
ン酸ナトリウム−NaCl）で完全に洗浄し、ついで真空
下、オーブン中、80℃にて20分間乾燥した。
製、参照BNNG 132）で被覆した寒天培地（直径150mmの
ペトリ皿）上に平板した。37℃にて一晩放置した後に、
新たなメンブレン上に接触させることによってクローン
を転移させた。その新たなメンブレンを、下記の組成の
溶液に浸漬させたWathman 3MMペーパー上にそれを置く
ことによって処理した:0.5N NaOH、1.5M NaCl、５分
間、ついで0.5M トリス−HCl pH8、1.5M NaCl、５分
間。以下の緩衝液:10mM トリス−HCl pH8、10mM EDT
A、50mM NaCl、0.1％ SDS、100μg/ml プロテインキ
ナーゼK;中、37℃にて30分間、プロテインキナーゼＫで
処理した後に、そのメンブレンを２×SSC緩衝液（クエ
ン酸ナトリウム−NaCl）で完全に洗浄し、ついで真空
下、オーブン中、80℃にて20分間乾燥した。
ｃ）メンブレンのプレハイブリダイゼーションおよびハ
イブリダイゼーション ついで、そのメンブレンを以下の緩衝液:1M NaCl;30％
ホルムアミド;1％SDS;5×デンハート溶液;100μg/mlサ
ケ精子DNA;中、42℃にて２時間プレハイブリダイズさせ
た。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメ
ンブレンを、2.5×106dpm/mlのニックトランスレーショ
ンによって調製した一定濃度のマウスIL−13Rαプロー
ブを含む同緩衝液中にて16時間ハイブリダイズさせた。
そのメンブレンを２×SSC、0.1％SDS緩衝液中、室温に
て30分間、２回洗浄し、ついで同緩衝液中、50℃にて２
時間洗浄した。Kodak X−OMATフィルム存在下、−80℃
にて一晩感光させた後に、数個の陽性クローンが検出さ
れた。
イブリダイゼーション ついで、そのメンブレンを以下の緩衝液:1M NaCl;30％
ホルムアミド;1％SDS;5×デンハート溶液;100μg/mlサ
ケ精子DNA;中、42℃にて２時間プレハイブリダイズさせ
た。２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのメ
ンブレンを、2.5×106dpm/mlのニックトランスレーショ
ンによって調製した一定濃度のマウスIL−13Rαプロー
ブを含む同緩衝液中にて16時間ハイブリダイズさせた。
そのメンブレンを２×SSC、0.1％SDS緩衝液中、室温に
て30分間、２回洗浄し、ついで同緩衝液中、50℃にて２
時間洗浄した。Kodak X−OMATフィルム存在下、−80℃
にて一晩感光させた後に、数個の陽性クローンが検出さ
れた。
ｄ）ヒトIL−13Rαクローンの配列決定および該配列の
分析 配列は、Applied Biosystem社製キット（参照40162
8）を用いて得た。IL−13Rα cDNAの完全核酸配列およ
びそれから予想されるアミノ酸配列を図７に示す。cDNA
はポリ−Ａテイルを除く3999塩基長であり、2145塩基の
長い非翻訳3'領域を有している。
分析 配列は、Applied Biosystem社製キット（参照40162
8）を用いて得た。IL−13Rα cDNAの完全核酸配列およ
びそれから予想されるアミノ酸配列を図７に示す。cDNA
はポリ−Ａテイルを除く3999塩基長であり、2145塩基の
長い非翻訳3'領域を有している。
典型的なポリアデニル化シグナルが予想された部位に
存在している。ヌクレオチド34と1851との間のオープン
リーディングフレームは、427アミノ酸のポリペプチド
を規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチドなら
びに単一の貫膜ドメインおよび短い細胞質外領域と共に
膜蛋白質をコードしている。
存在している。ヌクレオチド34と1851との間のオープン
リーディングフレームは、427アミノ酸のポリペプチド
を規定する。該配列は、潜在的なシグナルペプチドなら
びに単一の貫膜ドメインおよび短い細胞質外領域と共に
膜蛋白質をコードしている。
10箇所の潜在的なグリコシル化部位は、細胞外領域に
位置する。サイトカイン受容体のII型ファミリーの特徴
と考えられる２種の共通モチーフ:1番目のものはＮ−末
端ジスルフィド架橋ループ構造由来のもので、２番目の
ものは細胞外領域のＣ−末端に位置するWSXWS型のモチ
ーフである；も存在することは重要である。
位置する。サイトカイン受容体のII型ファミリーの特徴
と考えられる２種の共通モチーフ:1番目のものはＮ−末
端ジスルフィド架橋ループ構造由来のもので、２番目の
ものは細胞外領域のＣ−末端に位置するWSXWS型のモチ
ーフである；も存在することは重要である。
実施例８
ヒトIL−13Rα cDNAでトランスフェクトしたCOS−３ま
たはCHO細胞に対して行った結合性分析 IL−13Rαをコードする単離したcDNAでトランスフェ
クトしたCHO細胞は、標識化IL−13に特異的に結合し
た。飽和曲線のスキャッチャード解析は、4.5±0.4nMの
Kd値と26000受容体／細胞の最大結合能力とを有する単
一のコンポーネント部位を示した（図8Cおよび8G）。
たはCHO細胞に対して行った結合性分析 IL−13Rαをコードする単離したcDNAでトランスフェ
クトしたCHO細胞は、標識化IL−13に特異的に結合し
た。飽和曲線のスキャッチャード解析は、4.5±0.4nMの
Kd値と26000受容体／細胞の最大結合能力とを有する単
一のコンポーネント部位を示した（図8Cおよび8G）。
同時発現実験の結果を図8Dおよび8Hに示す。
図8Cの結果の分析により、CHO細胞のクローン2036に
おいてIL−13Rαが良好に発現されていることが示され
た。IL−4Rは、IL−4RおよびIL−13Rα cDNAで同時ト
ランスフェクトしたCHO細胞におけるIL−13の結合性の6
0％を置換した（図8H）が、IL−13Rαに対する7.5nMのK
dを考慮すると、IL−4R部位よりもIL−13Rα部位が10倍
も多く存在するようであることは注意し得る。
おいてIL−13Rαが良好に発現されていることが示され
た。IL−4Rは、IL−4RおよびIL−13Rα cDNAで同時ト
ランスフェクトしたCHO細胞におけるIL−13の結合性の6
0％を置換した（図8H）が、IL−13Rαに対する7.5nMのK
dを考慮すると、IL−4R部位よりもIL−13Rα部位が10倍
も多く存在するようであることは注意し得る。
hIL−13RαをコードするcDNAでトランスフェクトした
hIL−4Rを発現しているCHO−hIL4R細胞（ヒトIL−4R）
は、標識化IL−13に特異的に結合した。
hIL−4Rを発現しているCHO−hIL4R細胞（ヒトIL−4R）
は、標識化IL−13に特異的に結合した。
飽和曲線のスキャッチャード解析は、２種のコンポー
ネント部位;23±8.9pMのKd値と28000部位／細胞の最大
結合能力とを有する高親和性の１種、および4.2±1.4nM
のKd値と150000部位／細胞の最大結合能力とを有する低
親和性のもう１種；を明らかに示した（図8D）。
ネント部位;23±8.9pMのKd値と28000部位／細胞の最大
結合能力とを有する高親和性の１種、および4.2±1.4nM
のKd値と150000部位／細胞の最大結合能力とを有する低
親和性のもう１種；を明らかに示した（図8D）。
特徴付けした２番目の部位は、単独で発現させたhIL
−13Rα（ヒトIL−13Rα）と同一の親和性を有し、非会
合IL−13Rα鎖に相当した。なぜならば、それらはhIL−
4Rよりも多量に発現されていたからである。
−13Rα（ヒトIL−13Rα）と同一の親和性を有し、非会
合IL−13Rα鎖に相当した。なぜならば、それらはhIL−
4Rよりも多量に発現されていたからである。
２種のhIL−13RαおよびhIL−4R鎖存在下にて再構成
したこれらの高親和性受容体は、２種のサイトカインを
認識することができた（図8Dおよび8H）。このことは、
IL−４が全ての結合性IL−13を置換する匹敵量で２種の
hIL−13RαおよびhIL−4R鎖を同時発現しているCOS/pSE
1細胞でさえより明らかであった。
したこれらの高親和性受容体は、２種のサイトカインを
認識することができた（図8Dおよび8H）。このことは、
IL−４が全ての結合性IL−13を置換する匹敵量で２種の
hIL−13RαおよびhIL−4R鎖を同時発現しているCOS/pSE
1細胞でさえより明らかであった。
組換えヒトIL−13Rαの親和性は、マウスIL−13Rα受
容体について記載されているもの（２−10nM）（参照2
2）に匹敵した。
容体について記載されているもの（２−10nM）（参照2
2）に匹敵した。
以前に記載されたhIL−13Rβ鎖とは反対に、ヒトIL−
13Rαはそれ自体の上に高親和性結合部位を構成しなか
った。
13Rαはそれ自体の上に高親和性結合部位を構成しなか
った。
したがって、IL−13RαおよびIL−4Rは、細胞膜中で
相互作用して高親和性受容体を再構成する。
相互作用して高親和性受容体を再構成する。
実施例９
hIL−13RαおよびhIL−4Rを同時発現しているCHO細胞に
おけるIL−13およびIL−４によるSTAT蛋白質の活性化 ヒトPBMC細胞において、hIL−４およびIL−13は、後
期転写因子であるSTAT6をリン酸化するJAK（janus）フ
ァミリーの２種のチロシンキナーゼ、Jak1およびJak2を
活性化した。この活性化された因子は核に入り、IL−４
によって調節された遺伝子のプロモーター中の特異的エ
レメントに結合した。
おけるIL−13およびIL−４によるSTAT蛋白質の活性化 ヒトPBMC細胞において、hIL−４およびIL−13は、後
期転写因子であるSTAT6をリン酸化するJAK（janus）フ
ァミリーの２種のチロシンキナーゼ、Jak1およびJak2を
活性化した。この活性化された因子は核に入り、IL−４
によって調節された遺伝子のプロモーター中の特異的エ
レメントに結合した。
本発明者らは、電気泳動移動度スイッチアッセイ（EM
SA）におけるプローブとしてヒトＣεプロモーターのＣ
εエレメントを選択して、STAT6と同様な結合因子のIL
−13による活性化を立証した。
SA）におけるプローブとしてヒトＣεプロモーターのＣ
εエレメントを選択して、STAT6と同様な結合因子のIL
−13による活性化を立証した。
100ng/ml IL−13またはIL−４で、37℃にて10分間刺
激した、IL−13R単独、IL−4R単独、または２種の鎖を
一緒に発現しているCHO細胞の核抽出物を、放射性同位
元素標識化Ｃεエレメントと共にインキュベートした。
激した、IL−13R単独、IL−4R単独、または２種の鎖を
一緒に発現しているCHO細胞の核抽出物を、放射性同位
元素標識化Ｃεエレメントと共にインキュベートした。
hIL−13RαおよびhIL−4Rを同時発現している細胞の
核抽出物は、当該細胞がIL−４またはIL−13のいずれで
誘導されていようが、EMSAにおいて同一の移動度を有す
る複合体を形成した（図９を参照されたし）。一方、い
ずれかの鎖を単独で発現している細胞を用いると、複合
体は全く検出されなかった。
核抽出物は、当該細胞がIL−４またはIL−13のいずれで
誘導されていようが、EMSAにおいて同一の移動度を有す
る複合体を形成した（図９を参照されたし）。一方、い
ずれかの鎖を単独で発現している細胞を用いると、複合
体は全く検出されなかった。
したがって、hIL−13RαおよびhIL−4Rαを発現して
いるCHO細胞においては、IL−13およびIL−４が同一の
シグナリング経路を始動させる。
いるCHO細胞においては、IL−13およびIL−４が同一の
シグナリング経路を始動させる。
本明細書に記載したIL−13RβおよびIL−13Rαのクロ
ーニングにより、IL−４によって誘導される応答に匹敵
する、IL−13によって特異的に誘導される応答に関与す
る因子の知識を改善することができる。加えて、IL−13
がキーとなる役割を演ずる正常および病理状態下の受容
体の発現の調節を研究するためのツールを有することが
できた。
ーニングにより、IL−４によって誘導される応答に匹敵
する、IL−13によって特異的に誘導される応答に関与す
る因子の知識を改善することができる。加えて、IL−13
がキーとなる役割を演ずる正常および病理状態下の受容
体の発現の調節を研究するためのツールを有することが
できた。
さらに、cDNAの入手可能性により、IL−4/IL−13受容
体複合体の再構成に必要な他の蛋白質を容易にクローニ
ングすることができ、また、IL−13の活性の特異的なア
ンタゴニストとなり得る新規な医薬生成物の製造または
合理的なモデリングにも有用である。
体複合体の再構成に必要な他の蛋白質を容易にクローニ
ングすることができ、また、IL−13の活性の特異的なア
ンタゴニストとなり得る新規な医薬生成物の製造または
合理的なモデリングにも有用である。
参照：
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2.McKenzie,A.N.らによるProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1
993,90,3735−3739. 3.Defrance,T.らによるJ.Exp.Med.,1994,179,135−143. 4.Punnonen,J.らによるProc.Natl.Acad.Sci.（USA）,19
93,90,3730−3734. 5.Fior,R.らによるEur.Cytokine Network,1994,5,593−
600. 6.Muzio,M.R.F.らによるBlood,1994,83,1738−1743. 7.De Waal Malefyt,R.らによるJ.Immunol.,1993,151,
6370−6381. 8.Doyle,A.らによるEur.J.Immunol.,1994,24,1441−144
5. 9.Montaner,L.J.らによるJ.Exp.Med.,1993,178,743−74
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088. 11.Herbert,J.M.らによるFebs Lett.,1993,328,268−2
70. 12.Derocq,J.M.らによるFebs Lett.,1994,343,32−36. 13.Zurawski,G.らによるImmunol.Today,1994,15,19−2
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d Disease.D.G.RemickおよびJ.S.Frie編,Marcel Deck
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−2670. 16.Aversa,G.らによるJ.Exp.Med.,1993,178,2213−221
8. 17.Vita,N.らによるBiol.Chem.,1995,270,3512−3517. 18.Lefort,S.らによるFebs Lett.,1995,366,122−126. 19.Kondo,M.らによるScience,1993,262,1874−1883. 20.Russell,S.M.らによるScience,1993,262,1880−188
3. 21.Obiri,N.らによるJ.Biol.Chem.,1995,270,8797−880
4. 22.Hilton,D.J.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,
93,497−501. 23.Callard,R.E.らによるImmunology Today,1996,17,3
108−110. 24.Devereux,J.らによるNucleic Acids Res.,1984,1
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1670−1674. 27.Minty,A.らによるEur.Cytokine Network,1993,4,99
−110. 28.Labit Le Bouteiller,C.らによるJ.of Immunol.M
ethods,1995,181,1,29−36. 29.Seed,B.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,3
365−3369. 30.Bazan,J.F.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,8
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logy,1991,1,201−203. 32.Giri,J.G.らによるEmbo Journal,1993,14,3654−36
63. 33.Miloux,B.らによるGene,1994,149,341−344. 34.Sampayrac,L.M.らによるPNAS USA,1981,78,7575−7
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3607−3608. 36.Khler,IらによるFEBS Letters,1994,345,187−19
2. 37.Seidel,H.M.らによるPNAS USA,1995,92,3041−304
5. 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：サノフィ （Ｂ）通り：リュ・マルブフ 32−34 （Ｃ）都市：パリ （Ｅ）国籍：フランス （Ｆ）郵便番号（ZIP）:75374 （Ｇ）電話番号:0153774000 （Ｈ）ファックス番号:0153774133 （ii）発明の名称:IL−13受容体 （iii）配列の数:4 （iv）コンピュータ判読形態： （Ａ）媒質型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC compatible （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
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rsion＃1.25（EPO） （２）配列番号:1に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1539塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｈ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:1; （２）配列番号:2に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:380アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｈ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:4009塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル:NO （iii）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｇ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:427アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｇ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:4
993,90,3735−3739. 3.Defrance,T.らによるJ.Exp.Med.,1994,179,135−143. 4.Punnonen,J.らによるProc.Natl.Acad.Sci.（USA）,19
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4. 22.Hilton,D.J.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,
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ethods,1995,181,1,29−36. 29.Seed,B.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,3
365−3369. 30.Bazan,J.F.らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,8
7,6934−6938. 31.Honjo,T.らによるCurrent Opinion in Cell Bio
logy,1991,1,201−203. 32.Giri,J.G.らによるEmbo Journal,1993,14,3654−36
63. 33.Miloux,B.らによるGene,1994,149,341−344. 34.Sampayrac,L.M.らによるPNAS USA,1981,78,7575−7
578. 35.Jiang,S−ＷらによるNucleic Acid Res.,1995,23,
3607−3608. 36.Khler,IらによるFEBS Letters,1994,345,187−19
2. 37.Seidel,H.M.らによるPNAS USA,1995,92,3041−304
5. 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：サノフィ （Ｂ）通り：リュ・マルブフ 32−34 （Ｃ）都市：パリ （Ｅ）国籍：フランス （Ｆ）郵便番号（ZIP）:75374 （Ｇ）電話番号:0153774000 （Ｈ）ファックス番号:0153774133 （ii）発明の名称:IL−13受容体 （iii）配列の数:4 （iv）コンピュータ判読形態： （Ａ）媒質型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC compatible （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウエア:PatentIn Release ＃1.0,Ve
rsion＃1.25（EPO） （２）配列番号:1に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1539塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｈ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:1; （２）配列番号:2に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:380アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｈ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:4009塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル:NO （iii）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｇ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:427アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （Ｆ）組織の種類：ガン腫 （Ｇ）細胞の種類：腎臓 （Ｇ）セルライン:Caki−１ （xi）配列：配列番号:4
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91
// Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ロラン，パトリック
フランス、エフ―31190オテリーヴ、
“クロシェート”、シュマン・カルモン
テ
(72)発明者 ヴィータ，ナタリオ
フランス、エフ―31450モンジスカール、
シュマン・アル―セール45ビス番
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
A61K 38/00
C07K 14/715
C12N 5/10
C12P 21/02 - 21/08
C12Q 1/68
G01N 33/566
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】配列番号:2のアミノ酸配列からなる精製ポ
リペプチド。 - 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードする
単離核酸。 - 【請求項３】配列番号:1の配列であることを特徴とする
請求項２記載の単離核酸。 - 【請求項４】請求項２または３記載の核酸配列を含むク
ローニングおよび／または発現ベクター。 - 【請求項５】プラスミドpSE−１であることを特徴とす
る請求項４記載のベクター。 - 【請求項６】請求項４または記載のベクターでトランス
フェクトした宿主細胞。 - 【請求項７】COS−７、COS−３またはCHO系統の細胞で
あることを特徴とする請求項６記載のトランスフェクト
した宿主細胞。 - 【請求項８】配列番号:1の配列またはその相補鎖からな
ることを特徴とするヌクレオチド・プローブ。 - 【請求項９】生物試料中の、請求項１記載のポリペプチ
ドをコードする核酸配列をストリンジェント条件下での
ハイブリダイゼーションによって検出するための、ある
いは、異型接合性または遺伝子転移の欠失のごとき異常
な合成または遺伝的異常を明らかにするための、請求項
８記載のプローブを含むことを特徴とするイン・ビトロ
（in vitro）診断ツール。 - 【請求項１０】染色体異常を検出するための、請求項８
記載のプローブを含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項１１】請求項１記載のポリペプチドをコードす
る核酸配列のレベルの異常な合成または遺伝子的異常を
検出するためのイン・ビトロ検出方法であって、 −所望により、前記ヌクレオチド配列の増幅の予備段階
後であってもよいが、請求項８記載のヌクレオチド・プ
ローブを、該プローブと前記ヌクレオチド配列との間の
ハイブリダイゼーション複合体の形成を許容するストリ
ンジェント条件下にて、生物試料と接触させ； −形成され得るハイブリダイゼーション複合体を検出
し；ついで −所望により、本発明のプローブとハイブリダイゼーシ
ョン複合体を形成するヌクレオチド配列を配列決定して
もよいことを含むことを特徴とする該検出方法。 - 【請求項１２】請求項２または３記載の核酸配列を使用
することを特徴とする、請求項１記載の組換えポリペプ
チドの産生方法。 - 【請求項１３】配列番号:2の配列の組換えポリペプチド
または誘導体の発現を許容する条件下にて、請求項６ま
たは７記載のトランスフェクトした細胞を培養し、つい
で該組換えポリペプチドを回収することを特徴とするIL
−13受容体組換えポリペプチドの産生方法。 - 【請求項１４】請求項１記載のポリペプチドを特異的に
認識することができることを特徴とするモノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体、コンジュゲート抗体、また
はそれらのフラグメント。 - 【請求項１５】請求項14記載の抗体を含むことを特徴と
する、生物試料中の請求項１記載のポリペプチドを精製
または検出するための組成物。 - 【請求項１６】異常なレベルで発現されたIL−13受容体
を含み得る生物試料中のIL−13受容体の異常な発現と関
連付られる病理のイン・ビトロ検出方法であって、請求
項14記載の少なくとも１種の抗体を、IL−13受容体と該
抗体（群）との間の特異的な免疫複合体の可能な形成を
許容する条件下にて、該生物試料と接触させ、ついで形
成され得る特異的な免疫複合体を検出することを特徴と
する該検出方法。 - 【請求項１７】生物試料中のIL−13受容体の異常な発現
をイン・ビトロ診断し、および／または該試料中のIL−
13受容体の発現のレベルを測定するためのキットであっ
て： −支持体に結合された請求項18記載のIL−13受容体に対
して特異的な少なくとも１種の抗体、および −IL−13受容体と該抗体（群）との間の特異的な抗原／
抗体複合体の形成を明らかにするための手段、および／
またはこれらの複合体を定量化するための手段を含む該
キット。 - 【請求項１８】請求項１記載のポリペプチドまたはその
活性を変調させることができる剤を同定および／または
単離するための方法であって、所望により未同定であっ
てもよい化合物または種々の化合物を含有する混合物
を、該化合物が請求項１記載のポリペプチドに対して親
和性を有するであろう場合には、該ポリペプチドと該化
合物との間の相互作用を許容する条件下にて、その表面
に該ポリペプチドを発現している細胞と接触させ、つい
で、ポリペプチドに結合した化合物、またはポリペプチ
ドの生物活性を変調させることができる化合物を検出お
よび／または単離することを特徴とする該方法。 - 【請求項１９】有効成分として請求項１記載のポリペプ
チドを含むことを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項２０】請求項１記載のポリペプチドを含むこと
を特徴とする、IL−13Rβの活性を変調させることがで
きる剤をスクリーニングするための組成物。 - 【請求項２１】請求項１記載のポリペプチドを使用する
ことを特徴とする、IL−13Rβの活性を変調させること
ができる生成物の製造法。 - 【請求項２２】請求項１記載のポリペプチドを使用する
ことを特徴とする、IL−13拮抗作用を有する医薬生成物
の合成法。
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