NO328197B1 - Anvendelse av en probe, anvendelse av en sekvens og fremgangsmate for in vitro diagnose. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av prober; anvendelse av en nukleinsyresekvens; anvendelse av et monoklonalt eller polyklonalt antistoff; fremgangsmåte og kit for in vitro diagnose; samt fremgangsmåte for å identifisere og/eller isolere midler i stand til å modifisere aktiviteten av polypeptider.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av prober, anvendelse av en nukleinsyresekvens, og en fremgangsmåte for in vitro diagnose. IL-13 er et nylig identifisert (1,2) cytokin med 112 aminosyrer utskilt ved de aktiverte T lymfocyttene, B lymfocyttene og mastocyttene etter aktivering.

I kraft av sine mange biologiske egenskaper som deles med IL-4, er IL-13 blitt beskrevet som et IL-4 lignende cytokin. Dets aktiviteter er faktisk lignende dem til IL-4 på B cellene (3-5), monocyttene (6-10) og andre ikke-hematopoietiske celler (11-12). På den annen side, i motsetning til IL-4, vil det ikke utvise en spesifikk effekt på hvilende eller aktiverte T celler (13).

Forskjellige biologiske aktiviteter av IL-13 på monocytter/- makrofager, B lymfocytter og visse hematopoietiske forløpere er blitt beskrevet detaljert av A.,J. Minty, så vel som i oversiktsartikler på IL-13 (se for eksempel 14). En rekke data indikerer i tillegg at dette cytokin har en pleiotropisk effekt på andre celletyper. Disse ikke-hematopoietiske celler som direkte påvirkes ved IL-13 er endotel- og mikro-gliaceller, keratinocytter og nyre- og kolonkarsinomer.

De anti-inflammatoriske og immunoregulerende aktiviteter av IL-13 kan for eksempel anvendes i behandlingen av autoimmune, tumor og virale patologier.

En utnyttelse av disse biologiske egenskaper på et klinisk nivå krever imidlertid en inngående kunnskap om de signaler og mekanismer via hvilke disse effekter utvises, slik at man kan være i stand til å styre og modulere dem i de relevante patologier.

Ett av trinnene i analysen av signalet som transmitteres ved et biologisk molekyl i en celle omfatter identifikasjon av membranreseptoren derav. De studier som til nå er gjennom-ført på IL-13 reseptoren har vist at IL-13 og IL-4 hadde en felles reseptor, eller i det minste noen av komponentene av et reseptorkompleks, så vel som signal-transduksjonselementer (15-18). Denne reseptor er til stede på overflaten av en rekke celletyper, i et variabelt antall i henhold til den celletypen som man betrakter. En sammenlignbar fordeling av IL-13 og IL-14 reseptorene er blitt indikert av A.J. Minty (14) .

Kondo et al. (19) har beskrevet strukturen av en reseptor med en høy affinitet for IL-4. Denne reseptor er en dimer, dannet ved foreningen av et glykoprotein på 140 kDa (IL-4R) og y kjeden i IL-2 reseptoren (yc). IL-4 kan binde til glykoprotein-subenheten på 140 kDa (IL-4R eller gp 140) med en høy affinitet (Kd mellom 50 og 100 pM) (15). Denne affinitet økes imidlertid med en faktor på fra 2 til 3 når yc kjeden forenes med gp 140. Denne forening er i tillegg nødvendig for transmisjonen av visse signaler mediert ved IL-4 (19,20) .

Kryss-konkurranseforsøk for binding av enten IL-13 eller IL-4 har vist at IL-4 normalt kan forhindre bindingen av IL-13, mens IL-13 kan generelt bare delvis forhindre bindingen av IL-4 til dets reseptor (17, 21) og binder seg ikke til noen av de to subenheter av IL-4 reseptoren eller til komplekset dannet ved foreningen derav. På grunnlag av disse observa-sjoner, har man antatt at reseptoren som er spesifikk for IL-13 besto av reseptorkomplekset IL-4 assosiert med en annen

IL-13 bindingskomponent (IL-13RP).

Forsøksstudier gjennomført på en erytro-leukemicellelinje i stand til proliferasjon som svar på IL-13 og IL-4 (TF-1 linje) har vist at disse to cytokiner ga lignende intra-cellulære virkninger etter binding til deres reseptor (18) . Parallelt, har kryssbindingsforsøk gjort at man har kunnet vise at gp 14 0 kan danne heterodimerer med enten y kjeden eller med en ny subenhet med en molekylvekt på 55 til 70 kDa (17, 21) : Forsøksstudier som nylig er gjennomført på en embryonisk stamcellelinje fra mus har gjort det mulig å isolere genomisk DNA og cDNA som koder for et polypeptid med 424 aminosyre-rester (IL-13Ra), noe som foreslår at IL-13 reseptoren delte en felles kjede med IL-4 reseptoren til å utgjøre en høy-affinitetsreseptor (22, 23), dvs. som har en affinitet hvis konstante Kd ligger mellom verdier på mellom omtrent 10 pm og 10 0 pm (en lavaffinitetsreseptor har en konstant Kd som ligger mellom en verdi på mellom 2 nM og 10 nM) .

I og med viktigheten, på et medisinsk nivå, av en nærmere forståelse av fenomenet for regulering av IL-4 og av IL-13, og særlig muligheten av å kunne separere og kontrollere separat effektene som dannes ved begge disse to cytokiner, har man på den ene side vært interessert i karakteriseringen av et polypeptid som spesifikt binder IL-13 med en høy affinitet og på en annen side i karakteriseringen av et annet polypeptid som alene spesifikt binder IL-13 med en lav affinitet og som, dersom det er forenet med IL-4 reseptoren, utgjør en høyaffinitetsreseptor for IL-13.

Man har nå identifisert en human karsinomcellelinje som uttrykker den IL-13 spesifikke reseptor i en mengde som er større enn andre kjente humane renale karsinomlinjer (21), og man har nå gjennomført kloning av den primære subenhet som er ansvarlig for bindingen av IL-13 til IL-4/IL-13 reseptoren, betegnet IL-13Rp, så vel som kloningen av den felles kjede som deles av IL-13 og IL-4 for å gi en høyaffinitetsreseptor som tillater kryss-konkurranse mellom de to cytokiner, betegnet IL-13Rcc. Rensede polypeptider som spesifikt binder IL-13 er således oppnådd.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en probe som omfatter fra 10 til 1298 nukleotider som spesifikt hybridiserer under svært stringente betingelser med (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2; (b) . en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 restene: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og

(e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 337; eller (ii) de komplementære sekvensene derav eller de tilsvarende messenger RNA1 er, for in vitro deteksjon av spesifikke transkripter av nevnte polypeptid.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en probe som spesifikt hybridiserer med en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342, og som er kjennetegnet ved å inkludere hele sekvensen SEQ ID No. 3 eller den komplementære tråden derav, for in vitro deteksjon av spesifikke transkripter av det nevnte polypeptid.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en sekvens valgt fra gruppen som består av: (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2;

(b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No.

2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon

og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme

biologiske aktiviteten som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 restene: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og

(e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7;

(ii) (a) sekvensen SEQ ID No. 1; (b) nukleinsyresekvensene er i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptoraktivitet; (c) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvenser a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (d) en sekvens som består av eller omfatter en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, og foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1; (iii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342; (iv) (a) sekvensen SEQ ID No. 3; (b) nukleinsyresekvensen avledet fra sekvens SEQ ID No.

3 som et resultat av degenereringen av den genetiske

koden;

(v) en nukleinsyre som omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1059, og foretrukket til nukleotidene

mellom 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3;

for fremstilling av diagnostiske nukleotide prober eller antisense-sekvenser som kan anvendes innen genterapi.

Endelig vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for in vitro diagnose for å detektere aberrante synteser eller genetiske avvik i nukleinsyresekvensene som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2;

(b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No.

2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon

og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktiviteten som polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 rester: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og

(e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7;

(f) SEQ ID No. 4; og

(g) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, foretrukket opp til rester mellom 336 og 342,

som er kjennetegnet ved at den omfatter:

å bringe en nukleotid probe valgt fra gruppen som består: (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2;

(b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No.

2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon

og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyrene med sekvens SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale rester er substituert med de etterfølgende 6 rester: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og

(e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ

ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7;

(ii) (a) sekvensen SEQ ID No. 1; (b) nukleinsyresekvensene som er i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptoraktivitet; (c) nukleinsyresekvensene avledet av sekvens a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (d) en sekvens som består av eller omfatter en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1; (iii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som omfatter SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342; (iv) (a) sekvensen SEQ ID No. 3; (b) nukleinsyresekvensen avledet fra sekvens SEQ ID No.

3 som et resultat av degenereringen av den genetiske

koden;

(v) en nukleinsyre som omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1059, foretrukket til nukleotidene mellom 1041

og 1056 på sekvensen SEQ ID No.3; 0

i kontakt med en biologisk prøve under betingelser som tillater dannelsen av et hybridiseringskompleks mellom den nevnte probe og den nevnte nukleotidsekvens, eventuelt etter et innledende trinn med amplifikasjon av den nevnte nukleotidsekvens;

å detektere hybridiseringskomplekset som kan være dannet; å eventuelt sekvensere nukleotidsekvensen som danner

hybridiseringskomplekset med den nevnte proben.

Utførelsesformer av anvendelsene i henhold til oppfinnelsen fremgår av de uselvstendige patentkravene.

I den etterfølgende beskrivelse av oppfinnelsen, anvendes følgende definisjoner: - polypeptid som spesifikt binder IL-13 med en høy affinitet (IL-13RP): et polypeptid omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2 eller ethvert biologisk aktivt fragment eller derivat derav, - polypeptid som alene spesifikt binder IL-13 med en lav affinitet og som, dersom det er assosiert med IL-4 reseptoren, utgjør en høyaf f initetsreseptor (IL-13Rcc) : et polypeptid omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 4 eller ethvert biologisk aktivt fragment eller derivat derav, - biologisk aktivt: i stand til å binde spesifikt til IL-13 og/eller delta i transduksjonene av signalet spesifikt dannet ved IL-13 på cellemembrannivået, og/eller i stand til å interagere reseptoren spesifikk for IL-4 (IL-4R/gp 140) for å danne et kompleks i stand til å binde IL-4 og IL-13, og/eller som gjenkjennes ved hjelp av antistoffer spesifikke for polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller med sekvens SEQ ID No. 4, og/eller kan indusere antistoffer som gjenkjenner polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller sekvens SEQ ID No. 4, - derivat: ethvert polypeptid som er en variant av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller sekvens SEQ ID No. 4, eller ethvert molekyl resulterende fra en modifikasjon av en genetisk og/eller kjemisk natur av sekvensen SEQ ID No. 2 eller av sekvensen SEQ ID No. 4 som oppnås ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller ved kjemisk modifikasjon av et begrenset antall aminosyrer, så vel som enhver isoform sekvens, dvs. en sekvens som er identisk med sekvensen SEQ ID No. 2 eller med sekvensen SEQ ID No. 4, med ett av deres fragmenter eller en av deres modifiserte sekvenser, inneholdende en eller flere aminosyrer i D-enantiomer formen, idet nevnte variant, modifiserte eller isoforme sekvenser har bibeholdt minst en av egenskapene som gjør dem biologisk aktive.

Et renset polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra:

a) sekvensen SEQ ID No. 2 eller sekvensen SEQ ID No. 4,

b) enhver biologisk aktiv sekvens avledet fra SEQ ID No. 2

eller SEQ ID No. 4, i henhold til definisjonen gitt i det

foregående, er beskrevet.

Fremstillingen av derivater kan ha en rekke formål inkluderende spesielt økning av affiniteten av reseptoren for IL-13, modulering av kryss-konkurransen mellom IL-13 og IL-4, øking av produksjonsnivået, økning av deres resistens overfor proteaser, modifikasjon av deres biologisk aktivitet eller gi dem nye farmasøytiske og/eller biologiske egenskaper.

Blant biologisk aktive varianter av polypeptidene som definert over, er fragmenter dannet ved alternerende spleising av transkriptene (messenger RNAer) av genet som koder for en av aminosyresekvensene beskrevet over, foretrukne.

I en fordelaktig variant, blir de 8 C-terminale aminosyrer i polypeptiden med sekvens SEQ ID No. 2 substituert med følg-ende 6 aminosyrer: VRCVTL.

En oppløselig form av IL-13Rp, betegnet IL-13Ps, omfattende særlig det ekstracellulære domenet av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til rest 337 så vel som en oppløselig form av IL<1>13Ra, betegnet IL-13Rocs, omfattende særlig det ekstracellulære domenet av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til restene mellom 336 og 342, er fordelaktig.

Polypeptidet som omfatter sekvensen SEQ ID No. 2 eller sekvensen SEQ ID No. 4 kan, som det vil fremgå fra eksemp-lene, uttrykkes på overflaten av humane celler til å danne en funksjonell IL-13 reseptor og/eller kombinere med IL-4 reseptoren til å danne, med y-kjeden av IL-2 reseptoren, reseptorkomplekset felles for IL-4 og IL-13.

En isolert nukleinsyresekvens valgt fra:

a) sekvensen SEQ ID No. 1,

b) sekvensen SEQ ID No. 3,

c) nukleinsyresekvensen i stand til å hybridisere til sekvensen SEQ ID No. 1 eller til sekvensen SEQ ID No. 3,

eller til deres komplementære sekvenser og kode for polypeptider med en IL-13 reseptoraktivitet, eller tillate rekonstitusjonen av en reseptor med en høy affinitet for

IL-13 og IL-4,

d) nukleinsyresekvensen avledet fra sekvensene a) og b) og c) på grunn av degenerasjonen av den genetiske kode, er

beskrevet.

En sekvens er også beskrevet som koder for den oppløselige del av IL-13Rp eller av IL-13Ra og enhver variant dannet ved alternerende spleising av transkriptene av IL-13RP eller av IL-13Roc, med konservering av minst en av de biologiske egenskaper som er beskrevet.

En nukleinsyresekvens er foretrukket som omfatter eller som utgjøres av kjeden av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 opp til nukleotid 1081, og foretrukket opp til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1.

En nukleinsyresekvens er også foretrukket som omfatter eller som utgjøres av kjeden av nukleotider som strekker fra nukleotid nr. 1 opp til nukleotid nr. 1059, og foretrukket opp til nukleotidene mellom nr. 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3.

Nukleinsyresekvensen er fordelaktig en sekvens som koder for et protein svarende til den modne form av IL-13Rp eller av IL-13Ra, idet dette modne protein er resultatet av frigivel-sen av signalpeptider.

De forskjellige nukleotidsekvenser kan være av kunstig opp-rinnelse eller annet. De kan være DNA eller RNA sekvenser oppnådd ved screening av sekvensbiblioteker ved hjelp av prober dannet på grunnlag av sekvensen SEQ ID No. 1 eller av sekvensen SEQ ID No. 3. Slike biblioteker kan fremstilles ved konvensjonelle biologiske molekylære teknikker som er kj ent for fagkyndige på området.

Nukleotidsekvensene kan også fremstilles ved kjemisk syntese eller alternativt ved en kombinasjon av metoder som omfatter kjemisk eller enzymatisk modifikasjon av sekvenser oppnådd ved å screene bibliotekene.

Disse nukleotidsekvenser tillater fremstillingen av nukleo-tidprober som koder for polypeptidet eller et biologisk

aktivt fragment derav. De passende hybridiseringsbetingelser svarer til de temperatur- og ionestyrkebetingelser som vanlig anvendes av fagkyndige på området, foretrukket temperaturforhold mellom Tm - 5°C og Tm - 3 0°C og ytterligere fortrukket

temperaturforhold mellom Tm - 5°C og Tm - 10°C (høy strin-gens) , idet Tra er smeltetemperaturen, definert som den temperatur hvorved 50% av de base-parede tråder separerer. Slike prober kan anvendes som et in vitro diagnostisk verktøy for deteksjonen, ved hybridiseringsforsøk, av transkripter som er spesifikke for polypeptidene i biologiske prøver eller for deteksjon av aberrante synteser eller av genetiske avvik resulterende fra en polymorfisme, fra mutasjoner eller fra en dårlig spleising.

Probene omfatter minst 10 nukleotider og omfatter høyst hele nukleotidsekvensen SEQ ID No. 1 eller hele nukleotidsekvensen SEQ ID No. 3 eller deres komplementærtråd.

Blant de korteste prober, dvs. med fra omtrent 10 til 15 nukleotider, svarer de passende hybridiseringsbetingelser til de temperatur- og ionestyrkebetingelser som vanlig anvendes av fagkyndige på området.

Probene merkes foretrukket før bruk. For dette er det for fagkyndige tilgjengelig en rekke teknikker, som for eksempel fluorescensmerking, radioaktiv merking, kjemiluminescens-merking eller enzymatisk merking.

En fremgangsmåte for in vitro diagnose hvor disse nukleotid-prober anvendes for deteksjon av variantsynteser eller av genetiske avvik, slik som tap av heterozygositet og genetisk rearrangering, på nivået av nukleinsyresekvenser kodende for et IL-13 reseptorpolypeptid eller et biologisk aktivt fragment, er som nevnt ovenfor omfattet av den foreliggende oppfinnelse. En slik type av metode omfatter: - en nukleotid probe bringes i kontakt med en biologisk prøve under betingelser som tillater dannelsen av et hybridiseringskompleks mellom nevnte probe og den ovennevnte nukleotidsekvens, eventuelt etter et innledende amplifikasjonstrinn av den ovennevnte nukleotidsekvens,

deteksjon av hybridiseringskomplekset som kan være dannet, eventuelt sekvensering av nukleotidsekvensen som

danner hybridiseringskomplekset med proben.

cDNA proben kan i tillegg fordelaktig anvendes for deteksjon av kromosomavvik.

Nukleotidsekvensene er også anvendbare for fremstillingen av og anvendelsen av sense- og/eller antisense-oligonukleotid-primere for sekvenseringsreaksjoner eller for spesifikke amplifikasjonsreaksjoner i henhold til den såkalte PCR (polymerasekjedereaksjon) teknikk eller enhver annen variant derav.

Nukleotidsekvensene anvendes anvendes som nevnt for fremstilling av antisense-sekvenser. Antisense-sekvensene er i stand til spesifikk hybridisering med en nukleinsyresekvens, inkluderende en messenger RNA, og kan anvendes innen genterapi. Antisense-sekvensene er i stand til å inhibere, i det minste delvis, dannelsen av IL-13 reseptor polypeptider som definert ovenfor. Slike sekvenser utgjøres fordelaktig av dem som omfatter leserammen som koder for IL-13RP eller IL-13Rcc på transkriptnivået.

De kan mere fordelaktig anvendes i behandling av allergier og av inflammasjon.

Nukleotidsekvensene kan dessuten anvendes for fremstilling av rekombinante polypeptider, som definert over, med en IL-13 reseptor aktivitet.

Disse polypeptider kan fremstilles fra nukleotidsekvensene som definert over i henhold til teknikker for fremstillingen av rekombinante produkter som er kjent for fagkyndige på området. I dette tilfellet anbringes den anvendte nukleotidsekvens under styring av signaler som tillater ekspresjon derav i en cellulær vert. Den cellulære vert som anvendes kan velges fra prokaryotiske systemer, slik som bakterier, eller fra eukaryotiske systemer, slik som gjær, insektceller, CHO celler (ovarieceller fra kinesisk hamster) eller fra ethvert annet system som fordelaktig er kommersielt tilgjengelig. En cellulær vert som er foretrukket for ekspresjonen av polypeptidene utgjøres av fibroblastlinjen COS-7 eller COS-3.

Signalene som styrer ekspresjonen av polypeptidene, slik som promoterene, aktivatorene eller terminalsekvensene, velges i henhold til den vertscelle som anvendes. For dette formål kan nukleotidsekvensen innføres i vektorer med autonom replikasjon i den valgte vert, eller integrerende vektorer av den valgte vert. Slike vektorer vil fremstilles i henhold til metoder som er vanlig anvendt av fagkyndige på området, og de oppnådde kloner kan innføres i en passende vert ved standard-metoder som for eksempel elektroporering.

Ekspresjonsvektorene som omfatter en av nukleotidsekvensene som definert i det foregående er også beskrevet.

I tilfellet av COS-7 eller COS-3 celler, kan transfeksjonen gjennomføres ved anvendelse av vektoren pSE-1, som beskrevet i (17) .

Vertscellene kan transfekteres med. disse ekspresjonsvektorer. Disse celler kan oppnås ved innføring, i vertscellene, av en nukleotidsekvens innført i en vektor som definert over, etterfulgt av dyrking av de nevnte celler under betingelser som tillater replikasjon og/eller ekspresjon av den transfekterte nukleotidsekvens.

Disse celler kan anvendes i en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No. 4 eller et derivat, hvor de transfekterte cellene dyrkes under betingelser som tillater ekspresjon av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No.

4, eller et derivat, og hvor det nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

Renseprosesser som anvendes er kjente for fagkyndige på området. Det rekombinante polypeptid kan renses fra celle-lysater og ekstrakter, fra kultursupernatanten, ved hjelp av fremgangsmåter som anvendes individuelt eller i kombinasjon, som fraksjonering, kromatografimetoder, immunaffinitetstek-nikker ved anvendelse av spesifikke mono- eller polyklonale antistoffer.

De mono- eller polyklonale antistoffer som er i stand til spesifikt å gjenkjenne IL-13RP og/eller IL-13Ra i henhold til den definisjon som er angitt ovenfor er også beskrevet. Polyklonale antistoffer kan oppnås fra serum fra et dyr som er immunisert mot IL-13RP og/eller IL-13Ra i henhold til vanlig anvendte prosedyrer.

De monoklonale antistoffer kan oppnås i henhold til den konvensjonelle hybridom-dyrkingsmetode som beskrevet av Kohler og Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497).

Fordelaktige antistoffer er antistoffer rettet mot det ekstracellulære domenet av IL-13RP og/eller IL-13Ra.

Antistoffene er for eksempel kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, Fab og F(ab')2 fragmenter. De kan også eksistere i form av merkede antistoffer eller immunokonju-gater. De kan for eksempel være assosiert med toksin som difteritoksinet eller med et radioaktivt produkt. Disse immunotoksiner kan i dette tilfelle utgjøre terapeutiske midler som kan anvendes for behandling av visse patologier som involverer en overekspresjon av IL-13RP og/eller IL-13Ra.

Antistoffene, særlig de monoklonale antistoffer, kan også anvendes for immunocytokjemisk analyse av IL-13 reseptorene på spesifikke vevssnitt, for eksempel ved immunofluorescens eller ved gullmerking eller peroksidasemerking.

De kan fordelaktig anvendes i enhver situasjon hvor ekspresjonen av IL-13RP og/eller IL-13Ra skal observeres, som for eksempel en unormal overekspresjon eller måling av reguleringen av membranekspresjon.

En fremgangsmåte for in vitro diagnose av patologier forbundet med en unormal ekspresjon av IL-13Rp og/eller IL-13Ra, i biologiske prøver som kan inneholde IL-13RP og/eller IL-13Rcc i en unormal mengde er også beskrevet, som omfatter at minst ett antistoff bringes i kontakt med den nevnte biologiske prøve, under betingelser som tillater den eventuelle dannelse av spesifikke immunologiske komplekser mellom IL-13Rp og/eller IL-13Ra og det eller de nevnte antistoffer og ved at de spesifikke immunologiske komplekser som kan dannes, detekteres .

Et kit for in vitro diagnose av en unormal ekspresjon av IL-13RP og/eller av IL-13R<x i en biologisk prøve og/eller for å måle nivået av ekspresjon av IL-13R reseptoren i den nevnte prøve er også beskrevet, omfattende: - minst et antistoff spesifikt for IL-13RP og/eller IL-13Rcc, eventuelt bundet på en bærer, - midler for å vise dannelsen av spesifikke antigen/antistoff komplekser mellom IL-13RP og/eller IL-13Ra og det eller de nevnte antistoffer og/eller midler for å kvantifisere disse komplekser.

Videre er en fremgangsmåte for identifikasjon og/eller isolasjon av ligander som er spesifikke for IL-13Rp og/eller IL-i3Ra eller midler i stand til å modulere aktiviteten derav beskrevet, som omfatter at en forbindelse eller en blanding inneholdende forskjellige forbindelser, eventuelt uidentifi-serte, bringes i kontakt med celler som uttrykker IL-13RP og/eller IL-13Ra på deres overflate, under betingelser som tillater interaksjon mellom IL-13 reseptoren og den nevnte forbindelse, i det tilfellet hvor den sistnevnte ville ha en affinitet for reseptoren, og ved at forbindelsene bundet til IL-13RP og/eller IL-13Ra, eller dem i stand til å modulere den biologiske aktivitet derav, detekteres og/eller isoleres.

Denne fremgangsmåte er særlig tilpasset identifikasjon og/eller isolasjon av agonister og av antagonister av IL-13 for IL-13RP og/eller IL-13Ra reseptoren derav.

Et farmasøytiske preparat omfattende, som aktiv bestanddel, et polypeptid svarende til de ovennevnte definisjoner, foretrukket i en oppløselig form, kombinert med en farmasøytisk aksepterbar vehikkel, er også beskrevet.

Et slikt polypeptid kan faktisk virke i konkurranse med IL-13RP og/eller IL-13Ra uttrykt på celleoverflaten, og derved utgjøre en antagonist som er spesifikk for bindingen av IL-13 til dens reseptor, som fordelaktig kan anvendes for syntese av et medisinsk produkt som er egnet for å modulere reaksjonene mediert ved IL-13 i patologiske situasjoner.

En fremgangsmåte for den terapeutiske behandling av tilstand-er som er forbundet med immunologiske reaksjoner mediert ved IL-13 er også beskrevet, som omfatter administrering, til en pasient, av IL-13RP og/eller IL-13Rcc (eller ett av de biologiske aktive fragmenter derav), eller av en forbindelse i stand til spesifikt å modulere den biologiske aktivitet derav, i kombinasjon med en farmasøytisk aksepterbar vehikkel.

Den etterfølgende beskrivelse omfatter eksempler og figurer, hvor forklaringene er angitt i det etterfølgende.

Forklaring til figurene

Fig. 1: karakterisering av den humane IL-13RP reseptor til-stede i Caki-1 celler. a) Scatchard analyse (innføyd) av metningskurven av IL-13 merket med [125I]; b) binding av [12<5>I] [Phe43] IL-13-GlyTyrGlyTyr i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket IL-13

(• ) og av IL-4 (o) ;

c) kryssbindingsforsøk ved anvendelse av radioaktiv IL-13 i fravær (spor a) og i nærvær av ett hundre

ganger overskudd av umerket IL-13 (spor b) eller av IL-4 (spor c);

d) inhibering av sekresjonen av IL-6 indusert ved IL-13 og IL-4 i nærvær av et monoklonalt antistoff

spesifikt for IL-4R kjeden og IL-4 antagonisten Y124DIL-4.

Fig. 2: Nukleotidsekvens av cDNA av IL-13Rp, og sammenligning av proteinsekvensen av IL-5R og IL-13Rp.

a) nukleotidsekvens av cDNA av IL-13RP. Aminosyrer svarende til signalpeptidet utledet av nukleinsyresekvensen er indikert i kursiv, og dem svarende til transmembrandomenet er indikert med uthevet skrift. De potensielle N-glykosyleringssteder

(Asn-X-Ser/Thr) er understreket,

b) oppstilling av aminosyrene av IL-13RP og IL-5R sekvensene. Proteinsekvensene av IL-13R og IL-5R er

oppstilt som beskrevet over (24). Cysteinrestene og WSXWS motivet som er karakteristisk for denne familie av reseptorer er angitt i bokser.

Fig. 3: ekspresejonsmønster for IL-13RP mRNA.

RNA ble fremstilt fra følgende celler: Caki-1 (spor

a), A431 (spor b), TF-1 (spor c), U937 (spor d), Jurkat (spor e) og IM9 (spor f). Fig. 4: karakterisering av den rekombinante IL-13RP reseptoren for IL-13. COS-7 cellene er transfektert med IL-13RP cDNA og anvendt for: a) studier for bindingen av radioaktivt merket IL-13 (innføyd) ved Scatchard analyse av metningskurven; b) kryssbindingsforsøk ved anvendelse av radioaktivt merket IL-13 i fravær (spor a) og i nærvær av ett

hundre ganger overskudd av umerket IL-13 (spor b);

c-d) kotransfeksjonsforsøk ved anvendelse av klonet IL-13RP, IL-4R (gpl40) og yc kjeden etterfulgt av bindingen av radioaktivt merket IL-13 (c) eller av IL-4 (d). De mørke og lyse kolonner representerer den spesifikke binding av henholdsvis IL-13 og av IL-4.

Fig. 5: inhibering av bindingen av IL-13 til IL-13Rp ved den oppløselige form av reseptoren (IL-13RPs) i transient ekspresjon.

Ekspresjonen av IL-13RPs i supernatanten av cellene transfektert med 2 034 testes ved inhibering av bindingen av IL-13 på celler transfektert med IL-13RP

(2036). Supernatantene testes i den urene tilstand

ved at de fortynnes 1/2 i den joderte ligand.

2036 NSB: ikke-spesifikk binding i nærvær av et overskudd av umerket IL-13.

2 03 6 BT: total binding på celler transfektert med

2036

2036 + sgt 2034: binding til celler transfektert med 2 03 6 i nærvær av supernatant av celler transfektert

med 2034.

2036 + sgt pSEl: kontroll.

Fig. 6: inhibering av bindingen av IL-13 til IL-13RP ved den oppløselige form av reseptoren (IL-13RPs) på stabile linjer.

T2036-22: Total binding på klonet IL-13Rp (2036-22) i fravær av supernatant av klon som utskiller IL-13RPs (referanse 100%)

2034-4 2034-6 2034-19 4 kloner IL-13RPs 2034-21 1274-20: i nærvær av supernatant av CHO celler som ikke uttrykker IL-13Rps (kontroll).

Fig. 7: nukleotidsekvens av IL-13Ra cDNA og sammenligning av proteinsekvensene av human IL-13Ra og murin IL-13Ra. a) Nukleotidsekvens av IL-l3Rcc cDNA. Aminosyrene svarende til signalpeptidet utledet fra nukleinsyresekvensen er understreket med en prikket linje og dem svarende til transmembrandomenet er understreket med en dobbel linje. De potensielle N-glykosyleringssteder (Asn-X-Ser/Thr) er angitt i bokser. b) Oppstilling av aminosyrene av human IL-13Ra og av murin IL-13Roc. Proteinsekvensene av human IL-13Ra

og av murin IL-13Ra er oppstilt som beskrevet over (24). Cysteinrestene og motivet WSXWS som er

karakteristisk for denne familie av reseptorer er angitt i bokser.

Fig. 8: karakterisering av den rekombinante IL-13Roc reseptoren for IL-13.

CHO eller COS-3 cellene transfektert med IL-13Ra og/eller IL-4R cDNA og anvendt for: a) studier av bindingen av jod-125 merket IL-13 ved Scatchard analyse av metningskurven med CHO celler transfektert med IL-13Rp cDNA (fig. A), transfektert med IL-13Rp cDNA og IL-4R cDNA (fig. B), transfektert med IL-13Ra cDNA (fig. C) og transfektert med IL-13R0C cDNA og IL-4R cDNA (fig. D) , b) konkurranseforsøk av binding av [12 51] -IL-13 på CHO celler transfektert med IL-13Rp cDNA (fig. E),

transfektert med IL-13RP cDNA og IL-4R cDNA (fig. F), transfektert med IL-13Ra cDNA (fig. G) og transfektert med IL-13Ra cDNA og IL-4R cDNA (fig. H). De klare og skraverte kolonner representerer henholdsvis den spesifikke binding av radioaktivt merket IL-13 i nærvær av et overskudd (1.000 ganger mere) av IL-13 eller IL-4, de sorte kolonner representerer total binding.

Fig. 9: sammenligning av elektroforesemobiliteten i EMSA for cellulære ekstrakter som uttrykker IL-4 reseptoren alene (CHO-4), IL-13Ra reseptoren alene (CHO-13) eller de kombinerte reseptorer IL-13Rcc og IL-4R (CHO-4-13) etter aktivering av CHO cellene i nærvær av IL-4 eller IL-13 (4 eller 13), idet c representerer den ikke-aktiverte kontroll.

Materialer og metoder

Bindings- og kryssbindings! orsøk:

Bindings- og kryssbindingsforsøkene gjennomføres som beskrevet for [125I] [Phe43] -IL-13-GlyTyrGlyTyr (17).

Induksjon av sekresjon av IL- 6:

Caki-1 celler (ATCC HTB46) anbringes i 24 brønns plater i en densitet på 5xl0<4> celler/brønn og etter 3 døgns dyrking blir konfluente monolag vasket tre ganger med DMEM medium uten føtalt kalveserum. Stimuleringen av Caki-1 cellene gjennom-føres med 3 0 ng/ml IL-4 eller IL-13 i fravær eller i nærvær av Y124DIL-4 eller av et anti-gpl40 monoklonalt antistoff. Mengden av IL-6 frigitt inn i kulturmediumet etter inkubasjon i 24 timer måles ved en ELISA teknikk (Innotest, Frankrike).

Isolering og analyse av det humane IL- 13RØ cDNA:

Total RNA ble ekstrahert fra Caki-1 cellene som beskrevet over (25) . Poly(A) RNA isoleres fra de totale RNA-er med magnetiske kuler belagt med oligo(dT)25 (Dynal). Et cDNA bibliotek inneholdende 2xl0<5> kloner ble konstruert ved anvendelse av en primer-adaptorprosedyre (26) og vektoren pSE-1 (27). Kloningsstrategien for ekspresjonen som ble anvendt er beskrevet tidligere (17).

Fremstilling av human IL- 13RØ cDNA:

RNA prøvene kopieres med revers transkriptase underkastet PCR (polymerasekjedereaksjon) ved anvendelse av en sense primer svarende til sekvensen + 52 til + 71 og en antisense primer svarende til + 489 til 470 (nummereringen er gjort på grunnlag av den cDNA sekvens som er vist i fig. 2). De PCR-ampli-fiserte produkter hybridiseres med en probe som er komplemen-tær til sekvensene + 445-til + 461 av cDNA.

Størrelsesmarkørene er indikert på venstre side av figuren.

Isolering og analyse av det humane IL- 13Roc cDNA.

1) Fremstilling av den murine IL-13Ra probe.

a) Dyrking av B9 cellene (28).

B9 cellene dyrkes i RPMI medium (Gibco) supplert med 10%

føtalt kalveserum og 50 /xg/ml gentamycin.

b) Fremstilling av RNA av B9 cellene.

Cellene vaskes to ganger med PBS buffer (fosfatbufret salt-oppløsning, referanse 04104040-GIBCO-BRL). Etter sentrifu-gering i 10 minutter ved 1.000 rpm suspenderes cellepelleten i lysisbuffer med følgende sammensetning: 4M guanidin-tio-cyanat, 25 mM natriumcitrat pH 7, 0,5% sarkosyl, 0,1 M P2-merkaptoetanol.

Suspensjonen ultralydbehandles ved anvendelse av en Ultra-turax sonikator nr. 231256 (DANKE og KUNDEL) ved maksimal kraft i ett minutt. Natriumacetat pH 4 tilsettes til 0,2 M. Oppløsningen ektraneres med en volumdel av en fenol/kloro-formblanding (volum/volum:5/1).

RNA inneholdt i den vandige fase presipiteres ved -2 0°C ved hjelp av en volumdel isopropanol. Pelleten resuspenderes i lysisbuffer. Oppløsningen ekstraheres igjen med en fenol/- kloroformblanding og RNA presipiteres med isopropanol Etter vasking av pelleten med 70% og deretter med 100% etanol resuspenderes RNA i vann.

c) Fremstilling av det komplementære DNA.

cDNA fremstilles fra 5 /zg total RNA ved anvendelse av en poly

T12 primer. Det totale RNA inkuberes i en volumdel på 3 0 /il buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KC1, inneholdende 0,5 mM av hver av deoksynukleotid-trifos-fåtene og 3 0 enheter Rnasin (Promega), i en time ved 37°C, og deretter i 10 minutter ved 50°C, og deretter i ytterligere 10 minutter ved 37°C, med 2 00 enheter av det reverse transkrip-taseenzym Rnase H (Gibco-BRL referanse 8064A). Reaksjonen stanses ved oppvarming i 10 minutter ved 65°C. d) Spesifikk amplifikasjon av et IL-l3Ra cDNA fragment fra mus ved PCR teknikken.

Polymeriseringen gjennomføres med 6 fil cDNA i 50 /il sluttvolum med bufferen med følgende sammensetning: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 4 dNTP 0,2 mM, 2 /xg/ml av hver av de to nukleinsyreprimere og 2,5 U TAQ DNA polymerase (Beckman). Primerparene velges på sekvensen publisert av Hilton (22).

Reaksjonen gjennomføres i 30 sykluser av 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 58°C, 4 minutter ved 72°C, etterfulgt av en endelig syklus på 10 minutter ved 72°C.

e) Rensing av PCR amplifikasjonsproduktet.

Etter kjøring på en 1% agarosegel (Sigma) i TAE buffer

(40 mM, Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,9) il time ved 100 volt, farges gelen i nærvær av 1 /xg/ml etidiumbromid i den samme buffer. Båndet svarende til amplifikasjonsproduktet (cDNA fragment på 1027 basepar (bp) av IL-13Rcc) ekstraheres ved anvendelse av et Glass Max kit (Gibco).

f) Fremstilling av proben.

25 ng av det rensede cDNA fragment på 1027 bp svarende til IL-13Roc musereseptoren merkes med fosfor-32 med BRL random primere DNA merkesystemkit ved en spesifikk aktivitet på 2,4xl0<9> dpm//xg og alternativt merkes 100 ng ved nicktrans-lasjon ved anvendelse av Boeringher kitet ved en spesifikk aktivitet på 4xl0<8> dpm//xg.

2) Isolering og analyse av det humane IL-13Rcc cDNA.

a) Fremstilling av total RNA.

Det totale RNA ble ekstrahert fra Caki-1 celler som beskrevet over i avsnitt lb.

b) Rensing av messenger RNA (polyA+ fraksjon). Rensingen av polyA+ fraksjonen av RNA gjennomføres ved anvendelse av DYNAL

oligo (dT)25 Dynabeads kitet (referanse 610.05) idet man følger prosedyren som er anbefalt av produsenten. Prinsippet er basert på bruk av superparamagnetiske polystyrenkuler på hvilke et poly(dT)25 oligonukleotid er festet. PolyA+ fraksjonen hybridiseres med oligo(dT)25 oligonukleotidet koblet til kulene som er fanget på en magnetisk bærer.

c) Northern blott.

5 ug av polyA+ messenger RNA anbringes på en 1% agarose, 8%

formaldehyd-denatureringsgel i MOPS buffer (10 mM pH 7,4,

0,5 mM EDTA) . Etter migrering og overføring på en N+ Hybond membran (Amersham) i en 20X SSC buffer, fikseres RNAet ved oppvarming i en ovn ved 80°C under vakuum. Membranen prehybridiseres deretter i 2 timer ved 42°C i følgende buffer: 1 M NaCl, 30% formamid, 1% SDS, 5X Denharfs, 100 fig/ml laksesperma DNA. Etter 2 timers prehybridisering hybridiseres membranen i den samme buffer med en konsentrasjon av IL-13Rcc museprobe fremstilt ved random priming av 2,5xl0<e> dpm/ml i 16 timer. Membranen vaskes deretter to ganger i 30 minutter i 2X SSC 0,1% SDS buffer ved romtemperatur og deretter i 2 timer ved 50°C i den samme buffer. Etter 4 døgns eksponering i en kassett (Molecular Dynamics), analyseres Northern blottet med et Instant Imager (Molecular Dynamics). Et dominerende transkript på 4.200 bp og en dublett på 1.500 bp og 2.000 bp detekteres i Caki-1 cellene, U373 og U937.

Karakterisering av egenskapene av det humane IL-13Ra og IL-13Rp: COS-7 eller CHO cellene transfekteres i Petri skåler som beskrevet over (17). 24 timer senere trypsinbehandles cellene og dyrkes i 24 brønns plater ved en densitet på 8xl0<4 >celler/brønn. Etter dyrking i 48 timer ved 37°C, anvendes cellene for bindingsforsøk (analyser gjennomført in triplo viser en variasjon på mindre enn 10%) med jodert IL-13 som beskrevet (17). For transfeksjon, ble denne bevirket på COS-7 eller CHO cellene i 25 cm<2> plater ved anvendelse av 0,6 mg av forskjellige plasmider. Etter 24 timer trypsinbehandles cellemonolagene og dyrkes i 12 brønns plater ved 8xl0<4 >celler/brønn. Tre døgn senere ble bindings- og konkurranse-forsøk gjennomført med merket IL-13 og med umerket IL-13 og/eller IL-4. Resultatene er representative for minst tre forsøk gjennomført uavhengig av hverandre.

Sammenligning av elektroforetiske mobiliteter i EMSA for nukleærekstraktene av celler som uttrykker human IL-13Ra og/eller IL-4R: 2xl0<6> CHO celler ble platet ut på 10 cm Petri skåler. 24 timer senere transfekteres cellene med 6 /xg plasmid DNA (34) . Etter 48 timer inkuberes cellene ved 3 7°C i 30 minutter i 3 ml medium med eller uten IL-13 eller IL-4 i en konsentrasjon på 10 0 ng pr. ml. Cellene blir deretter vasket to ganger med en PBS-0,5 mM EDTA buffer og deretter høstet i 1,2 ml PBS. Cellene sentrifugeres deretter og celleekstraktene fremstilles som beskrevet i (35). EMSA gjennomføres deretter som beskrevet i (36) med 10 til 20 /ig celleekstrakter og med en oligonukleotidprobe radioaktivt merket med 32p (50.000-100.000 cpm), en probe svarende til CE elementet av den humane CE promoter (37). Oligonukleotidproben som syntetiseres har følgende sekvens:

5'-GATCCACTTCCCAAGAACAGA-3'.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Analyse av ekspresjonen av human IL- 13RP på overflaten av Caki- 1 celler

Man har nylig funnet at humane renale karsinomceller uttrykte, i tillegg til reseptorene delt med IL-4 og IL-13, et stort overskudd av spesifikke IL-13 reseptorer (21). På grunnlag av disse resultater, ble en prøve av humane karsi-nomcellelinjer studert for bindingen av IL-13 som beskrevet over (17). En spesifikk linje, Caki-1 (ATCC HTB46), som uttrykker et særlig høyt antall bindingsseter for IL-13, ble analysert i større detalj. Scatchard kurvene oppnådd fra metningsforsøk viste tilstedeværelsen av bindingsseter med en Kd på 446+50 pM og en kapasitet på 7,2xl0<4> reseptorer/celle (fig. la). I konkurrerende forsøk deplasserer umerket IL-13 fullstendig merket IL-13 på en doseavhengig måte, mens IL-4 deplasserer, med en høy affinitet, omtrent 10% av merket IL-13. Høyere konsentrasjoner av IL-4 (mere enn 100 nM) deplasserer ikke de resterende 90% av bundet IL-13 (fig. lb).

Disse resultater er i overensstemmelse med eksistensen av to seter, ett som deles av de to cytokiner, det andre spesifikt for IL-13. Forsøkene på kryssbinding med affinitet for IL-13 viste et kompleks på omtrent 70 kDa, som stemmer overens med komplekset observert i lignende kryssbindingsforsøk med IL-13 i forskjellige celletyper (17, 21). Merket IL-13 deplasseres fullstendig fra komplekset ved IL-13 men ikke ved IL-4, som er i overensstemmelse med de konkurrerende forsøk (fig. lc).

Eksempel 2

Analyse av sekresjon av IL- 6 indusert ved IL- 4 eller IL- 13 De foreliggende oppfinnere har også analysert sekresjonen indusert ved IL-4 eller IL-13 på Caki-l celler. De to cytokiner induserer sekresjonen av lignende nivåer av IL-6, og sekresjonen inhiberes ved antistoffer som er spesifikke for a kjeden av IL-4R og ved antagonisten Y124DIL-4 (fig. id). Dette foreslår at reseptorene som deles av de to cytokiner i Caki-1 cellene er ansvarlig for induksjonen av sekresjonen av IL-6. Lignende resultater observeres når fosforyleringen av proteinkomplekset IRS1/4PS (18) indusert ved IL-4 og IL-13 analyseres i nærvær eller i fravær av anti-IL-4R antistoffer og av IL-4 antagonist.

Disse resultater, sett under ett, foreslår at reseptorkomplekset IL-4/IL-13 uttrykt i Caki cellene er identisk med det som er beskrevet tidligere og at proteinet som binder IL-13 (IL-13RP) som er over-uttrykt, er en komponent av reseptoren ansvarlig for gjenkjennelsen av IL-13 i et funk-sjonelt kompleks som inkluderer IL-4R. Disse celler blir derfor anvendt som en messenger RNA kilde for kloningen av denne IL-13 bindingsentitet.

Eksempel 3

Kloning av den primære subenhet av IL- 13 reseptoren ( IL- 13RP) Strategien for kloningen og ekspresjonen som ble anvendt er beskrevet tidligere (17). Et cDNA bibliotek inneholdende 2xl0<5> rekombinante kloner ble konstruert (26) ved anvendelse av Caki-1 celler. Biblioteket ble oppdelt i batcher på 1.000 cDNAer hvor DNA i hver batch, i plasmidform, ble innført i COS-7 celler (29). Bindingen av merket IL-13 til de transfekterte COS-7 celler gjør det mulig å identifisere batchene av kloner som koder for en IL-13 reseptor. De positive batcher ble fordelt på nytt og rescreenet inntil et enkelt klon i stand til å gjennomføre syntesen av et celleoverflate-protein i stand til binding av IL-13 er identifisert. To uavhengige IL-13RP cDNAer ble til slutt isolert. Den full-stendige nukleotidsekvens for IL-13Rp cDNA og aminosyresekvensen utledet derfra er vist i fig. 2a. cDNA har en lengde på 12 98 baser som utelukker poly-A halen og har en kort 3' ikke-translatert region på 106 baser. Et kanonisk AATAAA polyadenyleringssignal er på forventet sted. Den åpne leseramme mellom nukleotider 53 og 1192 definerer et polypeptid på 380 aminosyrer. Sekvensen koder for et membranprotein med et potensielt signalpeptid, et enkelt transmembrandomene og en kort intracytoplasmatisk hale.

Fire potensielle N-glykosyleringssteder er lokalisert i den ekstracellulære region. Det er viktig å merke seg at to konsensusmotiver som er betraktet som signaturer for type II familien av cytokinreseptorer (3 0) også er til stede, hvor det første er avledet fra en N-terminal disulfidbro-sløyfe-struktur, og det andre er WSXWS type motivet lokalisert i den C-terminale ende av den ekstracellulære region. Den svært korte cytoplasmatiske sekvens vil kunne forklare hvorfor det kun er reseptorkomplekset som deles av IL-4 og av IL-13 i Caki cellene som transduserer et signal i cellen. Oppstillingsstudier viser homologier med den humane IL-5R a kjeden (51% likhet og 27% identitet, fig. 2b) og, i mindre grad, med prolaktinreseptoren. Det er interessant å merke seg at IL-5R komplekset utgjøres av en a kjede som binder IL-5 men som behøver et annet protein, (3 kjeden delt med IL-3 og GM-CSF reseptorene, for å danne en høyaffinitets-reseptor som er i stand til å transdusere et signal (31).

Eksempel 4

Deteksjon av humane IL- 13RP messenger RNAer i forskjellige cellelinjer

I Caki-1 cellene ble lignende mengder messenger RNAer for IL-13RP og IL-4R overraskende detektert ved hjelp av Northern analyser skjønt et stort overskudd av IL-13RP er uttrykt. Denne observasjon foreslår at det er en større translasjon av dette mRNA sammenlignet med IL-4R transkriptet og forklarer mangelen på deteksjon av IL-13RP mRNA i cellelinjene som uttrykte et lite antall IL-13R bindingssteder. RT-PCR analyser (fig. 3) viser at transkriptet funnet i Caki-i cellene også er til stede i mindre mengder i den keratinocytiske linje A431, premyeloidcellene TF-1, de premocytiske celler U93 7 og cellelinjen B IM9. Intet transkript ble detektert i Jurkat T cellelinjen eller i pre-B NALM6 cellelinjen. Disse resultatene er i overensstemmelse med IL-13 bindingsstudiene utført på de samme linjer som beskrevet tidligere av forfåt-terene av den foreliggende oppfinnelse (17), og med de kjente biologiske IL-13 targeter.

Eksempel 5

Bindingsanalyser gjennomført på COS- 7 celler transfektert med human IL- 13RP cDNA

COS-7 cellene transfektert med det isolerte cDNA som koder for IL-13Rp binder spesifikt merket IL-13. Scatchard analysen av metningskurven viser et enkelt komponentsete med en Kd verdi på 250+3 0 pM og en maksimal bindingskapasitet på 5,6xl0<5> reseptorer/celle (fig. 4a).

Affiniteten av den rekombinante reseptor er i god overensstemmelse med Kd verdien på 44 6 pM for IL-13RP i Caki-1 cellene og det som er blitt beskrevet for en rekke andre celler (17). Følgelig, til tross for en sekvenshomologi med a kjeden av IL-5R, opptrer den klonede reseptor annerledes da den ikke behøver en andre kjede for å rekonstituere et høy-af f initets-bindingssete .

Det er interessant å merke seg at proteinet som binder IL-15 og som nylig er blitt beskrevet likeledes har egenskapen med binding av IL-15 med en høy affinitet i fravær av de to andre komponenter av IL-15R komplekset (32).

I konkurrerende forsøke er IL-13 i stand til å inhibere bindingen av merket IL-13 til den klonede reseptor, med en inhi-beringskonstant (Ki) på 1,5±0,5 nM, mens IL-4 ikke inhiberer bindingen. Farmakologien for den klonede reseptor er derfor lik den for IL-13RP til stede i Caki-1 celler. Kryssbindings-forsøk viser et radioaktivt merket bånd på 70 kDa. Dette bånd har den samme mobilitet som det som observeres i Caki celler så vel som i andre celler (17). Dette kompleks svarer mest sannsynlig til 60-70 kDa båndet observert i tillegg til IL-4R 140 kDa båndet i kryssbindingsforsøk gjennomført med merket IL-4. Dette vil også kunne foreslå at der eksisterer en sterk interaksjon mellom de to proteiner i det funksjo-nelle reseptorkompleks. Forfatterne av den foreliggende oppfinnelse undersøkte derfor om IL-13RP og IL-4R interagerer i cellemembranen for å rekonstituere en reseptor som tillater kryss-konkurrering mellom de to cytokiner. Resultatene av et koekspresjonsforsøk er vist i fig. 4 c og d.

Det fremgår klart at ekspresjonen av de to reseptorer, enten separat eller samtidig, resulterer i et stort antall reseptorer som spesifikt gjenkjenner den ene eller den andre av de to cytokiner. Når de uttrykkes sammen, er imidlertid et lite antall reseptorer (5 til 10%) i stand til å gjenkjenne de to cytokinene. Kotransfeksjonen av yc kjeden med IL-4R og IL-13Rp bevirker ikke en økning i antallet delte bindingsseter. Disse resultater foreslår at IL-13RP og IL-4R kjeden kan interagere med hverandre i cellemembranen for å rekonstituere en reseptor for hvilken IL-13 og IL-4 kan være i konkurranse. Den lave prosentandel rekonstituerte reseptorer er et argument som favoriserer tilstedeværelsen av et annet protein (IL-13Ra) i begrensede mengder i COS cellene som er nødvendig for rekonstitueringen av reseptorkomplekset hvortil IL-13 og IL-4 binder på konkurrerende måte.

De resultater som oppnås i transfeksjonsforsøkene med yc kjeden viser at dette protein ikke er den begrensende faktor som foreslått tidligere (15). Denne konklusjon er også understøttet av fraværet av yc messenger RNA i Caki-l cellene (21) .

En annen mulig grunn som forklarer det lave antallet rekonstituerte reseptorer er forekomsten av en ukorrekt støkio-metri av de to proteiner i cellemembranen. Kotransfeksjoner ved anvendelse av forskjellige relative mengder av IL-4R og IL-13Rp viser imidlertid ikke en stor forskjell i antallet rekonstituerte reseptorer. Muligheten av at en annen IL-13R med en større kapasitet til å interagere med IL-4R eksisterer ble bekreftet i mus (22) og i menneske ved isolering av IL-13Roc cDNA (konf. eksempel 7). Det skal bemerkes at ekspresjonen av yc øker bindingen av IL-4 som beskrevet tidligere (19) men reduserer bindingen av IL-13, noe som foreslår en kompleks interaksjon mellom de forskjellige kjeder.

Eksempel 6

Studium av inhiberingen av bindingen av IL- 13 til dens membranreseptor ved en reseptor i oppløselig form Resultatene i transient ekspresjon (fig. 5) eller på stabile linjer (fig. 6) er beskrevet.

De to cDNA sekvenser som koder for IL-13RP og IL-13Rps inn-føres i vektoren p7055 i stedet for IL-2 cDNA (33) . De oppnådde plasmider betegnes henholdsvis 2036 og 2034.

a) Transient ekspresjon.

CHO cellene inokuleres i 12 brønns plater ved 3xl0<5> celler/- brønn og transfekteres den neste dag ved hjelp av DERE-Dextran metoden som for COS cellene, enten med plasmid 2036 eller 2034, eller med det tomme plasmid pSE-1 som kontroll.

Cellene dyrkes i tre døgn for å tillate akkumulering av IL-13Rps i supernatanten til cellene transfektert med plasmidet 2 034 og god ekspresjon av IL-l3Rp i membranen til cellene transfektert med plasmidet 2036.

Supernatanten til cellene transfektert med IL-13Rps (2034) eller den negative kontroll (tom pSE-1) samles deretter og cellene transfektert med IL-13RP anvendes til å studere inhiberingen av bindingen av IL-13.

Bindingen av IL-13 til overflaten av CHO cellene som uttrykker IL-13Rp (2 03 6) måles i nærvær eller fravær av disse urene supernatanter fortynnet en til to med radioliganden eller i nærvær av overskudd av ikke-radioaktivt IL-13 (NSB). Bindingen gjennomføres på hele celler i et sluttvolum på 500 ml med 3 00 pM radioligand, in triplo.

b) Stabile linjer.

To stabile transformerte CHO linjer oppnås ved transfeksjon

med kodesekvensene av den komplette IL-13RP (polypeptid på 380 rester) eller av IL-13RP i oppløselig form (IL-13RPs, trunkert polypeptid svarende til rester 1 til 337 i IL-13RP). Disse sekvenser innføres i vektoren p7055.

CHO-DHFR" cellene transfekteres med plasmidene 2036 (IL-13RP) og 2 034 (IL-13RPs) og de rekombinante kloner velges som beskrevet tidligere (33).

Ett av klonene CHO-IL-13Rp (CHO 2 036) som oppnås med 2 til 5xl0<5> seter pr. celle, inokuleres i en 12 brønns plate med en densitet på 105 celler pr. brønn og cellene anvendes to døgn senere for bindingsforsøk i nærvær eller fravær av IL-13RPs. For dette inokuleres CH0-IL-13R<p>s (CHO 2034) kloner i 6 cm skåler, in triplo, ved 5xl0<5> celler pr. skål. Etter 3 døgns akkumulering i dyrkingsmediumet, samles mediumet (5 ml pr. skål) for IL-13 bindingsinhiberingstudier på IL-13RP av CHO 2036 klonet. På samme måte blir supernatanten fra CHO celler som ikke uttrykker det oppløselige IL-13Rp samlet.

Bindingen av IL-13 på overflaten av CHO 2 03 6-22 klonet måles i nærvær eller fravær av disse urene supernatanter fortynnet en til to med radioliganden, eller i nærvær av et overskudd av ikke-radioaktivt merket IL-13 (NSB). Bindingen gjennom-føres in triplo, på hele celler, i et volum på 500 ml med 300 pM radioligand.

Histogrammene i figurene 5 og 6 representerer inhiberingen av bindingen av IL-13 på IL-13RP ved IL-13RPs. Inhibering av bindingen av IL-13 til dets reseptor kan observeres på en rekke kloner.

Eksempel 7

Kloning av den humane IL- 13Ra reseptor

a) Fremstilling av cDNA biblioteket fra polyA+ messenger RNAer av Caki-1 celler.

Med utgangspunkt i 0,5 /ig polyA+ messenger RNA, fremstilles enkelttrådet komplementært DNA merket med [<32>P]dCTP (det komplementære DNA som oppnås har en spesifikk aktivitet på 3.000 dpm/ng) med den syntetiske primer som har følgende sekvens (omfattende et BamHI sete):

i et volum på 30 /il av følgende buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 0 mM KC1, inneholdende 0,5 mM av hver av deoksynukleinsyretrifosfåtene, 30 /iCi [oc<32>P]dCTP og 30 U Rnasin (Promega). Etter inkubasjon i en time ved 37°C og deretter 10 minutter ved 50°C og deretter i ytterligere 10 minutter ved 3 7°C med 200 enheter av det reverse transkrip-taseenzym Rnase H (Gibco -BRL) , tilsettes 4 /il EDTA. RNA templatet nedbrytes deretter ved tilsetning av 6 /il av en 2 N NaOH oppløsning og man inkuberer i 5 minutter ved 65C. For å fjerne den syntetiske primer, blir det komplementære DNA renset på en 1 ml Sephacryl S400 kolonne (Pharmacia), ekvilibrert i TE buffer. De første to radioaktive fraksjoner kombineres og presipiteres med en 1/10 volumdel av en 10 M ammoniumacetatoppløsning og 2,5 volumdeler etanol, dette etter ekstraksjon med kloroform. cDNA utvides deretter i 5' retningen ved tilsetning av en dG homopolymer hale med 2 0 enheter av enzymet terminal transferase (Pharmacia 27073001). Deretter gjennomføres inkubasjon i 20 /il buffer med følgende sammensetning: 30 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM koboltklorid, 140 mM kakodylsyre, 0,1 mM DTT, 1 mM dGTP, i 15 minutter ved 37°C, og deretter tilsettes 2 /il 0,5 M EDTA. En videre behandling med natriumhydroksyd gjennomføres uten oppvarming, etterfulgt av en ny rensing på en 5400 kolonne, ekstraksjon med kloroform og presipitering med etanol. Pelleten oppløses i 33 /il TE buffer. Det neste trinn omfatter paring av kloningsvektoren pT7T3-18 til hvilken en homopolymer dC hale er blitt addert på forhånd etter kutting med Pstl, cDNA og adapteren. cDNA (33 /il) bringes i kontakt med 75 ng av vektoren pT7/T3-18 (5 /il), 120 ng adapter (1 /il) med følgende sekvens (omfattende et Apal sete), 10 /il av en 200 mM NaCl oppløsning og blandingen inkuberes deretter i 5 minutter ved 65°C og deretter avkjøles reak-sjonsblandingen til romtemperatur. Det neste trinn omfatter ligeringen av kloningsvektoren og den enkelttrådede cDNA i et reaksjonsvolum på 100 /il med 32,5 enheter av enzymet T4 fag DNA ligase (Pharmacia) over natten ved 15°C i en buffer med sammensetning: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP. Proteinene fjernes deretter ved ekstraksjon med fenol etterfulgt av ekstraksjon med kloroform og deretter tilsettes en 1/10 volumdel av 10 mM ammoniumacetatoppløsning og 2,5 volumdeler etanol. Blandingen sentrifugeres, pelleten tas opp i bufferen med sammensetningen: 33 mM Tris-acetat pH 7,9, 62,5 mM kaliumacetat, 1 mM magnesiumacetat og 1 mM DTT, den andre cDNA tråd syntetiseres i et volum på 3 0 /il med 3 0 enheter av enzymet T4 fag DNA polymerase (Pharmacia) og en blanding av 1 mM av de fire deoksynukleotidtrifosfater så vel som to enheter av proteinet av T4 fag genet 32 (Pharmacia) i en time ved 37°C. Blandingen ekstraheres med fenol og spor fjernes ved avsetning på en P10 kolonne (Biogel P10-200-400 mesh - referanse 15011050 - Biorad).

Det siste trinn omfatter transformering av E. Coli MC 1061 celler ved elektroporering av det rekombinante DNA ved anvendelse av et Biorad Gene Pulser apparat anvendt ved 2,5 kV under de betingelser som anbefales av produsenten, og deretter dyrkes bakteriene i en time i LB medium med sammensetningen: baktotrypton 10 g/l, gjærekstrakt 5 g/l, NaCl 10 g/i.

Antallet oppnådde uavhengige kloner bestemmes ved utplating av en l/l.000 fortynning fra transformasjonen etter en times inkubasjon på en plate av LB medium supplert med 1,5% agar (vekt/volum) og med 100 /ig/ml ampicillin i det etterfølgende betegnet LB agarmedium.

Antallet oppnådde uavhengige kloner er 1 million,

b) Screening av cDNA biblioteket.

Hele biblioteket ble utplatet på agarmedium (Petri skåler med

diameter 150 mm) belagt med Biodyne A membraner (PALL referanse BNNG 132). Etter henstand over natten ved 3 7°C over-føres klonene ved kontakt på de nye membraner. De sistnevnte behandles ved at de anbringes på et Wathman 3 MM papir som er impregnert med følgende oppløsninger: 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter og deretter 0,5 Tris-HCl pH 8, 1,5 M NaCl i 5 minutter. Etter behandling med proteinase K i den følgende buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% SDS, 10 0 /xg/ml proteinase K i 30 minutter ved 3 7°C, vaskes membranene inngående i 2X SSC buffer (natriumcitrat-NaCl), og tørkes deretter i en ovn under vakuum ved 80°C i 20 minutter.

c) Prehybridisering og hybridisering av membranene. Membranene prehybridiseres i 2 timer ved 42°C i følgende

buffer: 1 mM NaCl, 3 0% formamid, 1% SDS, 5X Denharfs 100 /ig/ml laksesperma DNA. Etter 2 timers prehybridisering, hybridiseres membranene i den samme buffer med en konsentrasjon av IL-13Ra probe fra mus fremstilt ved nicktrans-lasjon av 2,5X10<6> dpm/ml, i 16 timer. Membranene vaskes to ganger i 30 minutter i 2X SSC, 0,1% SDS buffer ved romtemperatur og deretter i to timer ved 50°C i den samme buffer. Etter eksponering ved -8°C i nærvær av en Kodak X-OMAT film over natten, detekteres en rekke positive kloner. d) Sekvensering av et humant IL-13Ra klon og analyse av sekvensen.

Sekvensen oppnås ved anvendelse av et kit fra Applied Biosystem (referanse 401628). Den komplette nukleinsyresekvens av lL-13Ra cDNA og aminosyresekvensen utledet derfra er vist i fig. 7. cDNA har 3 999 baser med utelukkelse av poly-A halen og har en lang ikke-translatert 3' region på 2145 baser.

Et kanonisk polyadenyleringssignal eksisterer på det forvent-ede sted. Den åpne leseramme mellom nukleotidet 34 og 1851 definerer et polypeptid på 427 aminosyrer. Sekvensen koder for et membranprotein med et potensielt signalpeptid og et enkelt transmembrandomene og en kort intracytoplasmatisk region. 10 potensielle glykosyleringssteder er lokalisert i den ekstracellulære region. Det er viktig å merke seg at to konsensusmotiver betraktet som signaturer av type II familien av cytokinreseptorer også er til stede, idet det første er avledet fra en N-terminal disulfidbro-sløyfestruktur, og den andre er WSXWS type motivet lokalisert i den C-terminale ende av den ekstracellulære region.

Eksempel 8

Bindingsanalyse gjennomført på COS- 3 eller CHO celler transfektert med human IL- 13Roc cDNA

CHO cellene transfektert med det isolerte cDNA som koder for IL-13Ra binder spesifikt merket IL-13. Scatchard analyse av metningskurven viser et enkelkomponentsete med en Kd verdi på 4,5+0,4 nM og en maksimum bindingskapasitet på 26.000 reseptorer/celle (figurene 8C og 8G).

Resultatene av koekspresjonsforsøkene er vist i figurene 8D og 8H.

Analyse av resultatene i fig. 8C viser at IL-13Roc er godt uttrykt i klonet 2 03 6 av CHO cellene. Det skal bemerkes at IL-4R deplasserer 60% av bindingen av IL-13 i CHO cellene kotransfektert med IL-4R og IL-13Ra cDNA (fig. 8H), men under hensyntagen til en Kd på 7,5 nM for IL-13Roc vil der være 10 ganger så mange IL-13Rcc seter som IL-4R seter.

CHO-hIL4R cellene (human IL-4R) som uttrykker hIL-4R som er transfektert med det cDNA som koder for hIL-13Ra binder spesifikt merket IL-13.

Scatchard analysen av metningskurven viser klart 2 komponen-tseter, ett med høy affinitet med en Kd verdi på 23+8,9 pM og en maksimal bindingskapasitet på 2 8.00 0 seter/celle og den andre med lav affinitet med en Kd verdi på 4,2+1,4 nM og en maksimal bindingskapasitet på 150.000 seter/celle (fig. 8D).

Det andre sete som er karakterisert har den samme affinitet som hIL-l3Ra (human IL-13Ra) uttrykt alene og svarer til de ikke-assosierte IL-13Ra kjeder fordi de er uttrykt i en større mengde enn hIL-4R.

Disse høyaffinitets-reseptorer som er rekonstituert i nærvær av 2 hIL-13Ra og hIL-4R kjedene er i stand til å gjenkjenne de 2 cytokiner (figurer 8D og 8H). Dette er enda klarere på COS/pSEl cellene som ko-uttrykker 2 hIL-13Ra og hIL-4R kjedene i en sammenlignbar mengde hvor IL-4 deplasserer all IL-13 bindingen.

Affiniteten av den rekombinante humane IL-13Roc er sammenlignbar med den som er beskrevet for IL-13Rcc musereseptoren (2-10 nM) (ref. 22).

I motsetning til hIL-13Rp som er beskrevet tidligere, utgjør human IL-13Rcc ikke alene et høyaf f initets-bindingssete. IL-13Ra og IL-4R interagerer derfor i cellemembranen for å rekonstituere en høyaffinitets-reseptor.

Eksempel 9

Aktivering av STAT proteinene ved IL- 13 og IL- 4 i CHO cellene som ko- uttrykker hIL- 13Rg og hIL- 4R

I humane PBMC celler aktiverer hIL-4 og IL-13 2 tryosinki-naser av janusfamilien, Jakl og Jak2 som fosforylerer en latent transkripsjonsfaktor, STAT6. Denne aktiverte faktor går inn i kjernen og binder til spesifikke elementer i pro-motorene til gener regulert ved IL-4.

Man velger Ce elementet av den humane Ce promotoren som probe i en elektroforese-mobilitets-svitsj-analyse (EMSA) for å demonstrere aktiveringen, ved IL-13, av en bindningsfaktor som er lik STAT6.

Kjerneekstraktene fra CHO cellene som uttrykker IL-13R alene, IL-4R alene eller de 2 kjedene sammen, stimulert med 10 0 ng/ml IL-13 eller IL-4 i 30 min ved 3 7°C, inkuberes med det radioaktivt merkede Ce elementet.

Kjerneekstraktene av cellene som ko-uttrykker hIL-13Ra og hIL-4R danner et kompleks med den samme mobilitet i EMSA enten cellene er indusert med IL-4 eller IL-13 (se fig. 9). På den annen side, med de cellene som uttrykker den ene eller den andre kjede alene, detekteres intet kompleks.

I CHO cellene som uttrykker hIL-13Ra og hIL-4Ra, initierer derfor IL-13 og IL-4 den samme signalkaskade.

Kloningen av IL-13R(3 og IL-13Rcc som beskrevet her gjør det mulig å forbedre kunnskapen vedrørende de faktorer som er involvert i responsene spesifikt indusert ved IL-13 sammenlignet med responsene indusert ved IL-4. Den gjør det i tillegg mulig å ha et verktøy for å studere reguleringen av ekspresjonen av reseptoren under normale og patologiske forhold hvor IL-13 spiller en nøkkelrolle.

Dessuten gjør tilgjengeligheten av cDNA det mulig å forenkle kloningen av andre proteiner som er nødvendige for rekonstitueringen av et IL-4/IL-13 reseptorkompleks og er også anvendbar for fremstillingen eller den rasjonelle utforming av nye medisinske produkter i stand til å være spesifikke antagonister av aktivitetene av IL-13.

REFERANSER:

1. Minty, A. at al., Natura, 1993, 362, 248-250.

2. McKanzia, A.N. et al., Proe. Nati. Ac ad. Sei. U.S. A, 1993, 90, 3735-3739. 3. Defranca, T. at al., J. Zxp. Med., 1994, 179, 135-143. 4. Punnonan, J. at al., Proe. Nati. Acad.Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734. 5. Pior, R. et al., Sur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600. 6. Huzio, M. R. F. at al., Blood, 1994, 83, 1738-1743. 7. Da Waal Malefyt, R. et al., J. Immuno1, 1993, 151, 6370-6381. 8. Doyle, A. at al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445. 9. Mont anar, L.J. at al., J. Zxp. Med., 1993, 178, 743-747. 10. Sozzani, P. at al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088. 11. Herbert, J.H. at al., Feba Lett., 1993, 328, 268-270. 12. Derocq, J.H. et al., Feba Lett. 1994, 343, 32-36. 13. Zurawski, Q. at al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26. 14. Interleukin-13 for Cytokines in Health and Diaease.

Eds D.Q. Remick and J.S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996. 15. Zurawaki S.M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670. 16. Aversa, G. at al., J. Exp. Med., 1993, 170, 2213-2218. 17. Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517. 18. Lefort, S. at al., Feba Lett., 1995, 366, 122-126. 19. Kondo, M. et al., Science, 1993, 262, 1874-1883. 20. Russell, S.M. at al., Science, 1993, 262, 1880-1883. 21. Obiri, N. at al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 8797-8804. 22. Hilton, D.J. at al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 497-501. 23. Caliard, R.E. et al., Immunology Today, 1996, 17, 3 108-110. 24. Devereux, J. et al., Nucleic Ac ida Res., 1984, 12, 387-395. 25. Chomczynski, P. et al., N. Anal. Biocham., 1987, 162, 156-159. 26. Caput, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1986, 83, 1670-1674. 27. Minty, A. et al., Eur. Cytokine Network, 1993, 4, 99-110 28. Lab it Le Boutailler, C. et al., J. of Immunol.

Metnods, 1995, 181, 1, 29-36. 29. Seed, B. at al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1987, 84, 3365-3369. 30. Bazan, J.F. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 6934-6938. 31. Honjo, T. et al., Currant Opinion in Cell Biology, 1991, 1, 201-203. 32. Giri, J.G. et al., Embo Journal, 1993, 14, 3654-3663.

33. Miloux, B. et al., Gene, 1994, 149, 341-344.

34. Sampayrac, L.M. et al., PNAS USA, 1981, 78, 7575-7578. 35. Jiang, S-W et al., Nucleic Ac id Res., 1995, 23, 3607-3608. 36. Kohler, I. et al., FEBS Letters, 1994, 345, 187-192. 37. Seidel, H.M. et al., PNAS USA, 1995, 92, 3041-3045.

Claims (9)

1. Anvendelse av en probe som omfatter fra 10 til 1298 nukleotider som spesifikt hybridiserer under svært stringente betingelser med (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2; (b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 restene: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og (e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7; eller (ii) de komplementære sekvensene derav eller de tilsvarende messenger RNA<1>er, for in vitro deteksjon av spesifikke transkripter av nevnte polypeptid.

2. Anvendelse av en probe som angitt i krav 1, hvor nevnte probe hybridiseres spesifikt under svært stringente betingelser med: (a) sekvensen SEQ ID No. 1; (b) nukleinsyresekvensene i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptoraktivitet; (c) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvenser a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (d) en sekvens som består av eller omfatter en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1.

3 . Anvendelse av en probe som spesifikt hybridiserer med en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342, og som er kjennetegnet ved å inkludere hele sekvensen SEQ ID No. 3 eller den komplementære tråden derav, for in vitro deteksjon av spesifikke transkripter av det nevnte polypeptid.

4. Anvendelse som angitt i krav 3, hvor nevnte probe hybridiserer spesifikt under svært stringente betingelser med: (a) sekvensen SEQ ID No. 3; (b) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvens SEQ ID No. 3 som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (c) en nukleinsyre som omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1059, og foretrukket til nukleotidene mellom 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3.

5. Anvendelse av en sekvens valgt fra gruppen som består av: (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2; (b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktiviteten som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 restene: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og (e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7; (ii) (a) sekvensen SEQ ID No. 1; (b) nukleinsyresekvensene er i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptoraktivitet; (c) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvenser a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (d) en sekvens som består av eller omfatter en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, og foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1; (iii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid omfattende SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342; (iv) (a) sekvensen SEQ ID No. 3; (b) nukleinsyresekvensen avledet fra sekvens SEQ ID No. 3 som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (v) en nukleinsyre som omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1059, og foretrukket til nukleotidene mellom 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3; for fremstilling av diagnostiske nukleotide prober eller antisense-sekvenser som kan anvendes innen genterapi.

6. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori den nevnte proben inkluderer hele sekvensen SEQ ID No. 1 eller den komplementære tråden derav.

7. Anvendelse som angitt i krav 3, hvori den nevnte proben inkluderer hele sekvensen SEQ No. 3 eller den komplementære tråden derav.

8. Anvendelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, 6 og 7, hvori den nevnte in vitro deteksjonen av spesifikke transkripter av polypeptidet gjennomføres for å detektere aberrante syntese eller genetiske avvik slik som tap av heterozygositet eller genetisk rearrangering.

9. Fremgangsmåte for in vitro diagnose for å detektere aberrante synteser eller genetiske avvik i nukleinsyresekvensene som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2; (b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktiviteten som polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 rester: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og (e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 33 7; (f) SEQ ID No. 4; og (g) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, foretrukket opp til rester mellom 336 og 342, karakterisert ved at den omfatter: å bringe en nukleotid probe valgt fra gruppen som består: (i) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: (a) sekvensen SEQ ID No. 2; (b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvor nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyrene med sekvens SEQ ID No. 2; (c) polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvor de 8 C-terminale rester er substituert med de etterfølgende 6 rester: VRCVTL; (d) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343; og (e) en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 3 37; (ii) (a) sekvensen SEQ ID No. 1; (b) nukleinsyresekvensene som er i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptoraktivitet; (c) nukleinsyresekvensene avledet av sekvens a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (d) en sekvens som består av eller omfatter en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1; (iii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som omfatter SEQ ID No. 4 eller for et polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343, og foretrukket opp til rester mellom 336 og 342; (iv) (a) sekvensen SEQ ID No. 3; (b) nukleinsyresekvensen avledet fra sekvens SEQ ID No. 3 som et resultat av degenereringen av den genetiske koden; (v) en nukleinsyre som omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1059, foretrukket til nukleotidene mellom 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No.3; i kontakt med en biologisk prøve under betingelser som tillater dannelsen av et hybridiseringskompleks mellom den nevnte probe og den nevnte nukleotidsekvens, eventuelt etter et innledende trinn med amplifikasjon av den nevnte nukleotidsekvens; å detektere hybridiseringskomplekset som kan være dannet; å eventuelt sekvensere nukleotidsekvensen som danner hybridiseringskomplekset med den nevnte proben.