NO323285B1 - Renset polypeptid, isolert nukleinsyresekvens, anvendelse derav samt fremgangsmate for diagnose. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye nukleinsyresekvenser av familien av tumor-suppressive gener relatert til genet for p53 proteinet, og den vedrører de tilsvarende proteinsekvenser.

Disse sekvenser er særlig anvendbare innen området av patologier som er forbundet med fenomenet apoptose eller celletransformasjon.

Tumor-supprimerende gener spiller en nøkkelrolle i beskytt-elsen mot fenomenet med karsinogenese, og enhver modifikasjon som er i stand til å frembringe tap av ett av disse gener, deres inaktivering eller dysfunksjon kan ha onkogen karakter og gir derfor gunstige betingelser for utvikling av en malign tumor.

Man har i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse iden-tifisert transkripsjonsprodukter av et nytt gen, så vel som de tilsvarende proteiner. Dette gen, SR-p70, er relatert til det tumor-supprimerende p53 gen, hvis antitumoraktivitet er forbundet med dets transkripsjonsfaktoraktivitet, og mere spesifikt med de kontroller som utøves på aktiviteten av Bax og Bcl-2 genene som er redskap i forbindelse med celledød-mekanismene.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således rensede SR-p70 proteiner.

Oppfinnelsen vedrører også isolerte nukleinsyresekvenser som koder for de nevnte proteiner og den vedrører spesifikke oligonukleotider oppnådd fra disse sekvenser. Oppfinnelsen vedrører også deres anvendelse.

I tillegg vedrører oppfinnelsen klonings- og/eller ekspresjonsvektorer som inneholder minst en av disse nukleotidsekvenser som definert i det foregående, og vedrører også vertscellene som er transfektert med disse klonings- og/eller ekspresjonsvektorer under betingelser som tillater replikasjon og/eller ekspresjon av en av de nevnte nukleotidsekvenser.

Oppfinnelsen vedrører også en nukleotid probe eller nukleotid primer samt deres anvendelse og vedrører også nukleotid primerpar.

En fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante SR-p70 proteiner eller deres biologisk aktive fragmenter ved hjelp av de transfekterte vertscellene utgjør også en del. av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også antistoffer eller antistoffderi-vater som er spesifikke for de ovenfor angitte proteiner.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for in vitro diagnose for deteksjon av variantsynteser eller av genetiske abnormiteter i nukleinsyresekvensene som koder for. et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedører også en fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet, en mutasjon, en delesjon, et innskudd, et tap av heterozygotisitet eller en genetisk abnormitet i SR-p70 genet, samt en fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet i SR-p70 genet i posisjon -30 og -20 i forhold til initierings ATG av exon 2 som kan være involvert i patologier.

Endelig vedrører oppfinnelsen et farmasøytisk preparat.

Ved å måle akkumuleringen av SR-p70 proteiner i tumorene i overensstemmelse med immunhistokjemiske teknikker, eller ved å vise auto-antistoffer rettet mot disse proteiner i serumet til pasienter kan cancere detekteres.

Inhibitor eller aktivåtor av SR-p70 aktivitet, for eksempel av protein-protein interaksjon, som involverer SR-p70 er også beskrevet, samt antisense-oligonukleotidsekvenser som er spesifikke for de ovennevnte nukleinsyresekvenser, og i stand til in vivo modulering av ekspresjonen av SR-p70 genet.

En metode for genterapi, hvor vektorer slik som for eksempel inaktiverte virale vektorer i stand til å overføre kode-sekvenser for ét protein! henhold til oppfinnelsen injiseres inn i celler som mangler dette protein, for det formål å regulere fenomenet med apoptose eller for reversjon av transformasjon er likeledes beskrevet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører likeledes et renset polypeptid; en isolert nukleinsyresekvens/nukléotidsekvens og dens anvendelse;

en klonings- og/eller ekspresjonsvektor samt vertscelle;

en nukleotid probe eller primer og deres anvendelse samt et nukleotid primerpar;

mono- og polyklonale antistoffer eller deres fragmenter, kimaere antistoffer eller immunkonjugater;

en fremgangsmåte for in vitro diagnose for deteksjon av variantsynteser eller av genetiske abnormiteter i nukleinsyre sekvensene som koder for et polypeptid;

en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant SR-p70 protein;

en fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet, en mutasjon, en delesjon, et innskudd, et tap av heterozygotisitet eller en genetisk abnormitet i SR-p70 genet;

en fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet i SR-p70 genet i posisjon -30 og -20 i forhold til initierings ATG av exon 2 som kan være involvert i patologier; og

et farmasøytisk preparat, slik de er definert med de i kravene anførte trekk.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er et renset polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen:

a) sekvensen SEQ ID No. 2,

b) sekvensen SEQ ID No. 4,

c) sekvensen SEQ ID No. 6,

d) sekvensen SEQ ID No. 8,

e) sekvensen' SEQ ID No. 10,

£) sekvensen SEQ ID No. 13,

g) sekvensen SEQ ID No. 15,

h) sekvensen SEQ ID No. 17, og

i) sekvensen SEQ ID No. 19.

I den foreliggende beskrivelsen anvendes følgende definisjoner: - SR-p70 protein: et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra sekvensene SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID NO. 17 eller SEQ ID No. 19, - derivat: et hvilket som helst variant-polypeptid av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19, eller et hvilket som helst molekyl resulterende fra en modifikasjon av genetisk og/eller kjemisk natur av sekvensen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19, dvs. oppnådd ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en enkelt aminosyre eller av et begrenset antall aminosyrer, så vel som en hvilken som helst isoform sekvens, dvs. sekvens identisk med sekvensen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19, eller med et av fragmentene derav eller modifiserte sekvenser derav, inneholdende en eller flere aminosyrer i form av D enanti-omeren, hvor nevnte variant, modifiserte eller isoforme sekvenser har bibeholdt minst en av de egenskaper som gjør dem biologisk aktive, - biologisk aktiv: i stand til å binde til DNA og/eller utvise transkripsjonsfaktoraktivitet og/eller delta i reguleringen av cellesyklusen, av differensiering og av apoptose og/eller i stand til å bli gjenkjent av antistoffene som er spesifikke for polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID No. 8, SEQ. ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19, og/eller i stand til å indusere antistoffer som gjenkjenner dette polypeptid.

Fremstillingen av derivater kan ha ulike formål, som særlig omfatter økningen av affiniteten av polypeptidet for DNA eller transkripsjonsfaktoraktivitet derav, forbedring av pro-duksjonsnivåene derav, økning av resistensen derav overfor protease, modifisering av de biologiske aktiviteter eller å utstyre polypeptidet med nye farmasøytiske og/eller biologiske egenskaper.

Blant polypeptidene i henhold til oppfinnelsen, omfatter det foretrukne polypeptid aminosyresekvensen valgt fra gruppen SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 og SEQ ID No. 19. Polypeptidet er særlig av human opprinnelse. Polypeptidet med 636 aminosyrer svarende til sekvensen SEQ ID No. 6 har mer enn 97% identitet med polypeptidet med SEQ ID No. 2.

Polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og det med sekvens SEQ ID No. 4 er to ekspresjonsprodukter av det samme gen, og det samme gjelder for sekvensene SEQ ID No. 8 og SEQ ID No. 10 og for sekvensene SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19.

Som det vil bli forklart i eksemplene, svarer polypeptidet med SEQ ID No. 4 til en prematur terminering av peptidet med sekvens SEQ ID No. 2, knyttet til en alternativ spleising av det lengre transkript (messenger RNA), kodende for polypeptidet med SEQ ID No. 2, av det tilsvarende gen. Likeledes, i mennesker, divergerer polypeptidene svarende til sekvensene SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 og SEQ ID No. 19, i deres sammensetning med hensyn til de

N- og/eller c-terminale deler, idet dette er utfallet av alternativ spleising av det samme primære transkript. Den N-terminale peptidsekvens av sekvensen SEQ ID No. 10 dele-teres, idet dette er knyttet til en alternativ spleising av det kodende transkript derav.

Oppfinnelsen vedrører fordelaktig et polypeptid svarende til DNA bindingsdomenet av ett av de ovennevnte polypeptider. Dette domene svarer til sekvensen som ligger mellom rest 110 og rest 310 for sekvensene SEQ ID No. 2 eller 6, og mellom rest 60 og rest 260 for sekvensen SEQ ID No. 8.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er også isolerte nukleinsyresekvenser som koder for et SR-p70 protein.

Mere foretrukket er et formål med den foreliggende oppfinnelse en isolert nukleinsyresekvens valgt fra:

a) sekvensen SEQ ID No. 1,

b) sekvensen SEQ ID No. 3,

c) sekvensen SEQ ID No. 5,

d) sekvensen SEQ ID No. 7,

e) sekvensen SEQ ID No. 9,

f) sekvensen SEQ ID No. 11,

g) sekvensen SEQ ID No. 12,

h) sekvensen SEQ ID No. 14,

i) sekvensen SEQ ID No. 16, og

j) sekvensen SEQ ID No. 18.

I henhold til en foretrukket utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse nukleotidsekvenser SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16 og SEQ ID No. 18, svarende henholdsvis til cDNA'ene av de humane proteiner med sekvensene SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 og SEQ ID No. 19.

De forskjellige nukleotidsekvenser i henhold til oppfinnelsen kan være av artifisiell opprinnelse eller annet. De kan være DNA eller RNA sekvenser oppnådd ved screening av biblioteker av sekvenser ved hjelp av prober fremstilt på grunnlag av sekvensene SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16 eller 18. Slike biblioteker kan fremstilles ved tradisjonelle teknikker for molekylær biologi som er kjent for fagkyndige på området.

Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan også fremstilles ved kjemiske synteser, eller alternativt ved blandede metoder som omfatter den kjemiske eller enzymatiske modifikasjon av sekvenser oppnådd ved screening av biblioteker. Disse nukleotidsekvenser muliggjør dannelse av nukleotidprober som er i stand til å hybridisere sterkt og spesifikt med en nukleinsyresekvens av et genomisk DNA eller av et messenger RNA, kodende for et polypeptid i henhold til oppfinnelsen. Slike prober utgjør også en del av oppfinnelsen. De kan anvendes som et in vitro diagnostisk redskap for deteksjonen, ved hybridiseringsforsøk, av transkripter som er spesifikke for polypeptidene i henhold til oppfinnelsen i biologiske prøver, eller for demonstrasjon av variantsynteser eller av genetiske abnormiteter slik som tap av heterozygosi-tet eller genetisk rearrangering resulterende fra en polymorfisme, fra mutasjoner eller fra en annen spleising.

I en utførelsesform inneholder probene i henhold til oppfinnelsen minst IS nukleotider. I en ytterligere utførelses-form omfatter probene hele sekvensen av SR-p70 genet eller av dets cDNA inneholdt for eksempel i et kosmid.

Blant de korteste prober, dvs. med omtrent 10 til 20 nukleotider, svarer de passende hybridiseringsbetingelser til de stringente betingelser som normalt anvendes av de fagkyndige på området.

Temperaturen som anvendes er foretrukket mellom Tm -5°C og

Tm -3 0°C, og er ytterligere foretrukket mellom Tm -5°C og

Tm -10°C, hvor Tm er smeltetemperaturen, dvs. den temperatur hvor 50% av de parede DNA kjeder separerer.

Hybridiseringen utføres foretrukket i en oppløsning med høy ionestyrke, som spesielt 6 x SSC oppløsninger.

Hybridiseringsbetingelsene som fordelaktig anvendes er som følger:

- temperatur: 42°C,

- hybridiseringsbuf f er: 6 x SSC, 5 x Denharfs, 0,1% SDS, som beskrevet i eksempel III.

Disse prober ifølge oppfinnelsen er representert ved følgende oligonukleotider eller sekvenser som er komplementære til dem:

Probene i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig merket før anvendelse derav. Til nå er en rekke teknikker kjent for én fagkyndig på området (fluorescerende merking, radioaktiv merking, kjemoluminescensmerking, enzymmerking og lignende).

De in vitro diagnostiske metoder hvor disse nukleotidprober anvendes er innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse.

Disse metoder vedrører for eksempel deteksjon av unormale synteser, (f.eks. akkumulering av transkripsjonsprodukter) eller av genetiske abnormiteter, som tap av heterozygotisitet og genetisk rearrangering, og punktmutasjoner i nukleotidsekvensene av nukleinsyrer kodende for et SR-p70 protein, i henhold til den definisjon som er angitt i det foregående. Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan også anvendes for fremstilling og anvendelse av oligonukleotidprimere for sekvenseringsreaksjoner eller spesifikke amplifikasjonsreaksjoner i henhold til den såkalte PCR teknikken eller en hvilken som helst variant av denne sistnevnte (ligase-kjedereaksjon (LCR) osv.).

Foretrukne primerpar utgjøres av primere valgt fra nukleotidsekvensene: SEQ ID No. 1: apesekvens med 2.874 nukleotider, og SEQ ID No. 5: human SR-p70a cDNA, særlig oppstrøms av ATG translasjons-initeringskodonet og nedstrøms av TGA translasjons -stoppkodonet .

Disse nukleotid primerpar ifølge oppfinnelsen omfatter primere valgt fra gruppen som utgjøres av følgende sekvenser:

par nr. 1:

sense primer: GCG AGC TGC CCT CGG AG (SEQ ID No. 20)

antisense primer: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G (SEQ ID No. 21)

par nr. 2 :

sense primer: GCC ATG CCT GTC TAC AAG (SEQ ID No. 22)

antisense primer: ACC AGC TGG TTG ACG GAG (SEQ ID No. 23)

par nr. 3 :

sense primer: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG SEQ ID No. 24) antisense primer: GTG GAT CTC GGC CTC C (SEQ ID No. 25)

par nr. 4:

sense primer: AGG CCG GCG TGG GGA AG (SEQ ID No. 26)

antisense primer: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID No. 27)

par nr. 5:

sense primer: GCG GCC ACG ACC GTG A (SEQ ID No. 28)

antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID No. 29)

par nr. 6:

sense primer: CTG TAC GTC GGT GAC CCC (SEQ ID No. 30)

antisense primer: TCA GTG GAT CTC GGC CTC (SEQ ID No. 31)

par nr. 7:

sense primer: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (SEQ ID No. 32)

antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID No. 29)

par nr. 8:

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T)

antisense primer: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C (SEQ ID No. 33)

par nr. 9:

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T)

antisense primer: CCA GGA CAG GCG CAG ATG (SEQ ID Nb. 34)

par nr. 10:

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T) antisense primer: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID No. 27)

par nr. 11:

sense primer: CAG CTA CTC CAG GGA TGC (SEQ ID No. 37) antisense primer: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC (SEQ ID No. 38)

og par nr. 12:

sense primer: CAG GCC CAC TTG CCT GCC (SEQ ID No. 39)

antisense primer: CTG TCC CCA AGC TGA TGA G (SEQ ID No. 40).

Disse primere svarer til sekvensene som henholdsvis ekstend-erer: - fra nukleotid nr. 124 til nukleotid nr. 140 på SEQ ID No. 1 og fra nukleotid nr. 1 til nukleotid nr. 17 på SEQ ID No. 5

for SEQ ID No. 20

- fra nukleotid nr. 2280 til nukleotid nr. 2262 på SEQ ID No.

1 og fra nukleotid nr. 2156 til nukleotid nr. 2138 på SEQ

ID No..5 for SEQ ID No. 21

- fra nukleotid nr. 684 til nukleotid nr. 701 på SEQ ID No. 1 for SEQ ID No. 22

fra nukleotid nr. 1447 til nukleotid nr. 1430 på SEQ ID No.

1 og fra nukleotid 1324 til nukleotid 1307 på SEQ ID No. 5 for SEQ ID No. 23 - fra nukleotid 1434 til nukleotid 1454 på SEQ ID No. 1 og fra nukleotid 1311 til nukleotid 1331 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 24

- fra nukleotid 2066 til nukleotid 2051 på SEQ ID No. 1 og fra nukleotid 1940 til nukleotid 1925 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 25

- fra nukleotid 16 til nukleotid 32 på SEQ ID No. 5 for SEQ

ID No. 2 6

- fra nukleotid 503 til nukleotid 485 på SEQ ID No. 5 for SEQ

ID No. 27

- fra nukleotid 160 til nukleotid 176 på SEQ ID No. 11 for

SEQ ID No. 28

- fra nukleotid 1993 til nukleotid 1976 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 29

- fra nukleotid 263 til nukleotid 280 på SEQ ID No. 11 for

SEQ ID No. 3 0

- fra nukleotid 1943 til nukleotid 192 6 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 31

- fra nukleotid 12 8 til nukleotid 145 på nukleotidsekvensen angitt i fig. 22 for SEQ ID No. 32 - fra nukleotid 1167 til nukleotid 1149 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 33

- fra nukleotid 92 8 til nukleotid 911 på SEQ ID No. 5 for SEQ

ID NO. 34

- fra nukleotid 677 til nukleotid 659 på SEQ ID No. 5 for SEQ

ID No. 35

- fra nukleotid 1605 til nukleotid 1587 på SEQ ID No. 5 for

SEQ ID No. 36

- fra nukleotid 1 til nukleotid 18 på nukleotidsekvensen vist i fig. 13 for SEQ ID No. 37 - fra nukleotid 833 til nukleotid 813 på nukleotidsekvensen vist i fig. 13 for SEQ ID No. 38

frå nukleotid 2 5 til nukleotid 42 på nukleotidsekvensen

vist i fig. 13 for SEQ ID No. 39

- fra nukleotid 506 til nukleotid 488 på nukleotidsekvensen vist i fig. 13 for SEQ ID No. 40.

Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan dessuten anvendes i genterapi, særlig for å styre fenomenet med apoptose og reversering av transformasjon.

Nukleotidsekvensen i henhold til oppfinnelsen kan dessuten anvendes for fremstilling av rekombinante SR-p70 proteiner i henhold til den definisjon som er gitt til denne betegnelse.

Disse proteiner kan fremstilles fra nukleotidsekvensene definert i det foregående i henhold til teknikker for fremstil-linger av rekombinante produkter som er kjent for fagkyndige på området. I denne forbindelse er den anvendte nukleotidsekvens bragt under kontroll av signaler som tillater ekspresjonen derav i en vertscelle.

Et effektivt system for fremstilling av et rekombinant protein nødvendiggjør at man har en vektor til disposisjon for eksempel av plasmid eller viral opprinnelse, og en kompatibel . vertscelle.

Vertscellen kan velges fra prokaryote systemer som bakterier, eller eukaryote systemer som for eksempel gjær, insekts-celler, CHO celler (ovarieceller fra kinesisk hamster) eller et hvilket som helst annet system som fordelaktig er til-gjengelig. En foretrukket vertscelle for ekspresjon av proteiner i henhold til oppfinnelsen utgjøres av E. coli bakterier, særlig stammen MC 1061 (Clontec).

Vektoren må inneholde en promoter, translasjonsinitierings-

og termineringssignaler og også de passende transkripsjons-régulerende regioner. Den må kunne bibeholdes stabilt i cellen og kan, der det er passende, ha spesielle signaler som spesifiserer sekresjonen av det translaterte protein.

Disse forskjellige kontrollsignaler velges i overensstemmelse med den anvendte vertscelle. Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan innføres i vektorer som er autonomt replik-erende i den valgte vert, eller vektorer som er integrative for den valgte vert. Slike vektorer vil fremstilles i henhold til metoder som er vanlig kjent for en fagkyndig på området, og klonene resulterende derfra kan innføres i en passende vert ved standard metoder som for eksempel elektroporering.

Klonings- og/eller ekspresjonsvektorene som inneholder minst en av nukleotidsekvensene definert i det foregående utgjør også en del av den foreliggende oppfinnelse.

En foretrukket klonings- og ekspresjonsvektor er plasmidet pSEl, som inneholder elementene som er nødvendige for anvendelsen derav både som en kloningsvektor i E. coli (replikasjons-origo i E. coli og ampicillinresistensgen stammende fra plasmidet pTZ 18R) og som en ekspresjonsvektor i dyreceller {promoter, intron, polyadenyleringssete, replikasjons-origo av SV40 viruset) , så vel som elementene som muliggjør kopi-ering derav som en enkelttråd med formålet av sekvensering (replikasjons-origo av fag fl).

Egenskapene til dette plasmid er beskrevet i EP patentsøknad 0.506.574.

Sammensetningen derav og også integreringen av cDNA'ene som stammer fra nukleinsyresekvensene i henhold til oppfinnelsen er dessuten beskrevet i de etterfølgende eksempler.

I henhold til en foretrukket utførelsesform er proteinene i henhold til oppfinnelsen i form av fusjonsproteiner, særlig i form av et protein fusjonert med glutation S-transferase (6ST). En designert ekspresjonsvektor i dette tilfelle er representert ved plasmidvektoren pGEX-4T-3 (Pharmacia ref-27.4583).

Oppfinnelsen vedrører i tillegg vertscellene som er transfektert med disse ovennevnte vektorer. Disse cellene kan oppnås ved innføring, i vertscellene, av en nukleotidsekvens som er innskutt i en vektor som definert i det foregående, etterfulgt av dyrking av de nevnte celler under betingelser som tillater replikasjon og/eller ekspresjon av den transfekterte nukleotidsekvens.

Disse celler kan anvendes i en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19 eller ethvert biologisk aktivt fragment.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et polypeptid i rekombinant form er kjennetegnet ved at de transfekterte cellene dyrkes under betingelser som tillater ekspresjon av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No.. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID NO. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19 eller ethvert biologisk aktivt fragment og ved at nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

Rensemetodene som anvendes er kjente for en fagkyndig på området. Det rekombinante polypeptid kan renses fra lysater og celleekstrakter eller fra dyrkingsmediumsupernatanten, ved metoder anvendt individuelt eller i kombinasjon, som fraksjo-nering, kromatografiske metoder, immunaffinitetsteknikker ved anvendelse av spesifikke mono- eller polyklonale antistoffer og lignende. En foretrukket variant omfatter fremstilling av et rekombinant polypeptid fusjonert til et "bærer" protein (kimært protein). Fordelen med dette system er at det tillater en stabilisering og en nedsettelse av proteolyse av det rekombinante produkt, en økning i oppløselighet under in vitro renaturering og/eller en forenkling av rensingen når fusjonspartneren har en affinitet for en spesifikk ligand.

Fordelaktig fusjoneres polypeptidene i henhold til oppfinnelsen med glutation S-transferase i den N-terminale.del (Pharmacia "GST" system)'. Fusjonsproduktet blir i dette tilfelle detektert og kvantifisert ved hjelp av enzymaktiviteten til GST. Det kolorimetriske reagens som anvendes er en glutationakseptor, et substrat for GST. Det rekombinante produkt renses på en kromatografisk bærer hvortil glutation-molekylene på forhånd er blitt koblet.

De mono- eller polyklonale antistoffer som er i stand til spesifikt å gjenkjenne et SR-p70 protein i henhold til den definisjon som er angitt i det foregående utgjør også en del

av oppfinnelsen. Polyklonale antistoffer kan oppnås fra

i serum fra et dyr som er immunisert overfor protein, fremstilt for eksempel ved genetisk rekombinering i henhold til den metode som er beskrevet over, i henhold til standard prose-dyrer .

) De monoklonale antistoffer kan oppnås i henhold til den tradisjonellé hybridom-dyrkingsmetode beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497.

Fordelaktige antistoffer er antistoffer rettet mot den midtre i region som ligger mellom rest 110 og rest 310 for sekvensene SEQ ID No. 2 eller 6, eller mellom rest 60 og rest 260 for sekvensen SEQ ID No. 8.

Antistoffene i henhold til oppfinnelsen er for eksempel

) kimære antistoffer, humaniserte antistoffer eller Fab og F (ab1) 2 fragmenter. De kan også ha form av immunkonjugater eller merkede antistoffer.

Dessuten, foruten deres anvendelse for rensing av de rekombi-> nante polypeptider, kan antistoffene i henhold til oppfinnelsen, særlig de monoklonale antistoffer, også anvendes for å detektere disse polypeptider i en biologisk prøve.

De utgjør således et middel for immunocytokjetniske eller

) immunohistokjemiske analyser av ekspresjonen av SR-p70 proteiner på snitt av spesifikke vev, for eksempel ved hjelp av immunfluorescens, gullmerking ellér enzymimmunokonjugater.

De gjør det spesielt mulig å demonstrere en uvanlig akkumu-

5 lering av SR-p70 proteiner i bestemte vev eller biologiske prøver, noe som gjør dem anvendbare for å detektere cancere eller måle progresjon eller remisjon av pre-eksisterende cancere.

Mere generelt kan antistoffene i henhold til oppfinnelsen fordelaktig anvendes i enhver situasjon hvor ekspresjonen av SR-p70 protein skal observeres.

En fremgangsmåte for in vitro diagnose av patologier forbundet med en ekspresjon eller uvanlig akkumulering av SR-p70 proteiner, særlig fenomenet med karsiogenese, i en biologisk prøve, er beskrevet. Den omfatter at minst ett antistoff i henhold til oppfinnelsen bringes i kontakt med den nevnte biologiske prøve under betingelser som tillater den mulige dannelse av spesifikke immunologiske komplekser mellom et SR-p70 protein og det nevnte antistoff eller antistoffer, og at de spesifikke immunologiske komplekser som eventuelt dannes detekteres.

Et kit for in vitro diagnose av en uvanlig ekspresjon eller akkumulering av SR-p70 proteiner i en biologisk prøve og/eller for å måle ekspresjonsnivået av dette protein i nevnte prøve er også beskrevet. Kitet omfatter: - minst ett antistoff som er spesifikt for et SR-p70 protein, eventuelt bundet til en bærer, - midler for visualisering av dannelsen av de spesifikke antigen-antistoffkomplekser mellom et SR-p70 protein og det nevnte antistoff, og/eller midler for kvantifisering av disse komplekser.

Det kan også gjennomføres tidlig diagnose av tumordannelse, ved deteksjon av auto-antistoffer som er.rettet mot et SR-p70 protein i et serum fra et individ.

En slik tidlig diagnose er kjennetegnet ved at en serumprøve som er tatt fra et individ bringes i kontakt med et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, eventuelt bundet til en bærer, under betingelser som tillater dannelsen av spesifikke immunologiske komplekser mellom det nevnte polypeptid og auto-antistoffene som eventuelt er til stede i serumprøven, og ved at de spesifikke immunologiske komplekser som eventuelt dannes detekteres.

Et formål med den foreliggende oppfinnelsen er også en fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet, en mutasjon, en delesjon, et innskudd, et tap av heterozygotisitet eller en genetisk abnormitet i SR-p70 genet som kan være involvert i patologier, og som er kjennetegnet ved at man anvender minst en nukleotidsekvens som beskrevet i det foregående. Blant fremgangsmåter for å bestemme en allelisk variabilitet, en mutasjon, en delesjon, et innskudd, et tap av heterozygotisitet eller en genetisk abnormitet i SR-p70 genet, foretrekkes den metode som er kjennetegnet ved at den omfatter minst ett trinn med PCR amplifikasjon av target nukleinsyresekvensen av SR-p70 som er tilbøyelig til å utvise en polymorfisme, en mutasjon, en delesjon eller et innskudd, ved anvendelse av et par av primere av nukleotidsekvensen som definert i det foregående, et trinn hvor de amplifiserte produkter behandles ved anvendelse av et passende restriksjonsenzym og et trinn hvor minst ett av produktene fra enzymreaksjonen detekteres eller måles.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som omfatter, som aktiv bestanddel, et polypeptid svarende til de ovennevnte definisjoner, foretrukket i oppløselig form, i kombinasjon med en farmasøytisk aksepterbar vehikkel.

Slike preparater tilveiebringer en ny fremgangsmåte for behandling av fenomenet karsinogenese på nivået for kontroll av formering og celledifferensiering.

Disse preparater kan foretrukket administreres systemisk, foretrukket intravenøst, intramuskulært, intradermalt eller oralt.

Deres optimale administreringsmåter, doseringer og farmasøyt-iske doseformer kan bestemmes i henhold til de kriterier som man generelt tar hensyn til ved etablering av en terapeutisk behandling egnet for en pasient, som for eksempel pasientens alder eller kroppsvekt, alvorligheten av hans eller hennes generelle tilstand, tolererbarheten av behandlingen og de observerte bivirkninger og lignende.

Ved genterapi kan nukleotidsekvenser som koder for et SR-p70 protein overføres til targetceller ved hjelp av inaktiverte virale vektorer.

Andre trekk og fordeler med den foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra resten av beskrivelsen, sammen med eksemplene og figurene for hvilke teksten er angitt i det etterfølgende.

Tekst til figurene

Fig. l: Nukleinsyresammenligning av ape SR-p70a cDNA (svarende til SEQ ID No. 1) med nukleinsyresekvens for ape p53 cDNA. Fig. 2: Proteinsammenligning av ape SR-p70a med ape p53

protein (sw: p53-cerae).

Fig. 3: Sammenligning av nukleinsyre sekvens en for ape SR-p70a og b cDNA (svarende henholdsvis til SEQ ID No. 1 og SEQ ID No. 3). Fig. 4: Nukleinsyresekvens og utledet proteinsekvens for

ape SR-p70a.

Fig. 5: Delvis nukleinsyresekvens og fullstendig utledet

proteinsekvens for ape SR-p70b.

Fig. 6: Delvis nukleinsyresekvens og utledet fullstendig proteinsekvens for human SR-p70a (svarende til SEQ ID No. 5). Fig. 7: Delvis nukleinsyresekvens og fullstendig utledet proteinsekvens for mus SR-p70c (svarende til SEQ ID No. 7). Fig. 8: Delvis nukleinsyresekvens og delvis utledet proteinsekvens for mus SR-p70a (svarende til SEQ ID No. 9).

Fig. 9: Multi-sammenstilling av proteinene utledet fra ape

(a og b), human (a) bg mus (a og c) SR-p70 cDNA1 er.

Fig. 10a: Immunoblot av SR-p70 protein.

Fig. 10b: Deteksjon av endogent SR-p70 protein.

Fig. 11: Kromosomal lokalisering av det humane SR-p70 gen.

Signalet fremkommer på kromosom 1 i p36 regionen.

Fig. 12: Genomisk struktur av SR-p70 genet sammenlignet med den for p53 genet. De humane proteinsekvenser av SR-p70a (øvre rad i oppstillingen) og av p53 (nedre rad) er oppdelt i peptider på grunnlag av de res-pektive exoner hvorfra de er kodet. Taliene ved siden av pilene svarer til nummereringen av de tilsvarende exoner. Fig. 13: Human genomisk sekvens av SR-p70 fra 3' enden av intron 1 til 5• enden av exon 3. Intronene er angitt i bokser. I posisjoner 123 og 133, er to variable nukléinsyreposisjoner lokalisert (G - A i 123 og C T i 133). Restriksjonssetene for enzymet Styl er understreket (posisjon 130 i det tilfellet hvor en T er til stede i stedet for en C i posisjon 133, posisjon 542 og posisjon 610). Pilene indikerer posisjonen av nukleinsyreprimerne anvendt i eksempel XI. Fig. 14: Nukleinsyresammenligning av 5<*> regionen av de

humane cDNA'er av SR-p70d og SR-p70a.

Fig. 15: Multi-sammenstilling av nukleinsyresekvensene svar ende til human SR-p70a, b, d, e og f. Fig. 16: Multi-sammenstilling av proteinene utledet fra

human SR-p70 (a, b, d, e og f) cDNA'er.

Fig. 17: Delvis nukleinsyresekvens og delvis utledet proteinsekvens fra human SR-p70a. De to baser med ut-hevet skrift svarer til to variable posisjoner (se fig. 6). Denne sekvens har en mere komplett ikke-kodende 5<1> region enn den som er angitt i fig.6. Fig. 18: Analyse av SR-p70a transkriptene etter PCR amplifikasjon.

spor M: 1 kb stige (GIBCO-BRL) molekylvektmarkører spor l: linje HT29

spor 3: linje SK-N-AS

spor 5: linje UMR-32

spor 7: linje U-373 MG

spor 9: linje SW 480

spor 11: linje CHP 212

spor 13: linje SK-N-MC.

Spor 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: negative kontroller svarende til henholdsvis spor 1, 3, 5, 7, 9, 11 og 13 (fravær av invers transkriptase i RT-PCR reaksjonen) .

Fig. 19: A: Analyse ved agarosegelelektroforese av genomiske fragmenter amplifisert ved hjelp av PCR (fra 3' enden av intron 1 til 5' enden av exon 3) . Nummereringen av sporene svarer til nummereringen av kontrollpopulasjonen. Spor M:

molekylvektmarkører (1 kb stige).

B: Analyse identisk med den i del A: etter spalting av de samme prøver med restriksjonsenzymet Styl.

Fig. 20: Skjematisk representasjon, med et partielt restrik-sjonskart, av plasmidet pCDNA3 inneholdende human SR-p70a.

Eksempel I

Kloning av SR- p70 cDNA fra COS- 3 celler

1. Dyrking av COS- 3 celler

COS-3 celler (nyreceller fra afrikansk grønnape transformert med SV 4 0 virus T antigenet) dyrkes i DMEM medium (GIBCO-BRL referanse 41 965-047) inneholdende 2 mM L-glutamin og supplert med 50 mg/l gentamicin og 5% føtalt bovint serum (GIBCO-BRL referanse 10231-074) til semi-konfluens.

2. Fremstilling av messenger RNA

a) Ekstraksjon av messenger RNA.

Cellene utvinnes på følgende måte:

- de adherente celler vaskes to ganger med PBS buffer (fos-fatbufret saltoppløsning, referanse 04104040-GIBCO-BRL), og skrapes deretter av med en gummispatel og sentrifugeres.

Cellepelleten suspenderes i lysisbuffer med følgende sammensetning.- 4 M guanidintiocyanat, 25 mM natriumsitrat pH 7, 0,5% sarkosyl, 0,1 M p-mekaptoetanol. Suspensjonen lydbehandles ved anvendelse av en Ultra-Turrax nr. 231256 sonikator (Janke og Kundel) ved maksimal styrke i ett minutt. Natriumacetat pH 4 tilsettes til en konsentrasjon på 0,2 M. Oppløsningen ekstraheres med en volumdel av en fenol/kloro-. form (5/1 volum/volum) blanding. RNA inneholdt i den vandige fase presipiteres ved -2 0°C ved anvendelse av en volumdel isopropanol. Pelleten resuspenderes i lysisbufferen. Oppløs-ningen ekstraheres igjen med en fenol/kloroformblanding og RNA presipiteres med isopropanol. Etter vasking av pelleten med 70% og deretter 100% etanol resuspenderes RNA i vann.

b) Rensing av poly(A)<+> fraksjonen av RNA.

Rensing av poly(A)<+> fraksjonen av RNA gjennomføres ved anvendelse av DYNAL Dynabeads oligo(dT)25 kitet (referanse 610.05) i henhold til den prosedyre som er anbefalt av produsenten. Prinsippet er basert på bruk av superparamagnetiske poly-styrenkuler hvortil et oligonukleotid poly(dT)25 er festet. Poly(A)<+> fraksjonen av RNA hybridiseres med oligo(dT)25 koplet til kulene, som er fanget på en magnetisk bærer.

3. Fremstilling av det komplementære DNA bibliotek

a) Fremstilling av komplementært DNA.

Fra 0,5 /ig av Poly(A)<+> RNA fra COS-3 celler oppnådd på slutten

av trinn 2, blir [<32>P]dCTP-merket enkelttrådet komplementært DNA fremstilt (det komplementære DNA som oppnås har en spesifikk aktivitet på 3.000 dpm/ng) med den syntetiske primer med følgende sekvens (omfattende et BamHI sete):

5'<GATCCGGGCC CTTTTTTTTT TTT<3<1>

i en volumdel på 30 jil buffer med sammensetning: 50 mM Tris-HC1 pH 8,3, 6 mM MgCl2, 10 mM DDT, 40 mM KC1, inneholdende 0,5 mM av hver av deoksynukleotidtrifosfåtene, 30/iCi [oc-<32>P]dCTP og 30 U RNasin (Promega). Etter en times inkubasjon ved 37°C, deretter 10 minutter ved 50°C, deretter igjen 10 minutter ved 3 7°C, med 200 enheter av enzymet revers transkriptase RNase H"

(GIBCO BRL referanse 8064A) , tilsettes 4 [ il EDTA.

b) Alkalisk hydrolyse av RNA templatet.

6 /il av en 2N NaOH oppløsning tilsettes og blandingen blir

deretter inkubert i 5 minutter ved 65°C.

c) Rensing på en Sephacryl S-400 kolonne.

For å fjerne den syntetiske primer, blir det komplementære

DNA renset på en kolonne av 1 ml Sephacryl S-400 (Pharmacia) ekvilibrert i TE buffer. De første to radioaktive fraksjoner samles og presipiteres med 1/10 volumdel 10 M ammoniumacetat-oppløsning og 2,5 volumdel etanol, idet dette gjennomføres etter ekstraksjon med en volumdel kloroform.

d) Homopolymer addisjon av dG.

Det komplementære DNA elongeres i 3<1> enden med en dG hale med 20 enheter av enzymet terminal transferase (Pharmacia 27073 001) . Blandingen inkuberes i 20 |il buffer med sammensetning: 3 0 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM koboltklorid, 14 0 mM kakodylsyre, 0,1 mM DTT, 1 mM dGTP, i 15 minutter ved 37°C, og 2 [ il 0,5 M EDTA tilsettes deretter.

e) Trinn b) og c) repeteres.

f) Kloningsvektoren pSEl (EP 506.574) og det komplementære

DNA pares i nærvær av adaptoren.

Blandingen sentrifugeres, pelleten oppløses i 33 [ il TE buffer, 5 [ il (125 ng) kloningsvektor pSEl, 1 [ il (120 ng) av adaptoren med følgende sekvens (omfattende et Apal sete):

5'AAAAAAAAAAAAAGGGCCCG3'

og 10 iil av en 2 00 mM NaCl oppløsning tilsettes, og reak-sjonsblandingen inkuberes i 5 minutter ved 65°C og avkjøles deretter til romtemperatur.

g) Ligering.

Kloningsvektoren og den enkelttrådede cDNA ligeres i et volum

på 100 [ il med 32,5 enheter av enzymet fag T4 DNA ligase (Pharmacia referanse 270 87002) over natten ved 15°C i en buffer med sammensetning: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP.

h) Syntese av den andre tråd av cDNA.

Proteinene fjernes ved fenolekstraksjon etterfulgt av kloro-formekstraksjon, og 1/10 volumdel av en 10 mM ammoniumacetat-oppløsning og deretter 2,5 volumdeler etanol tilsettes. Blandingen sentrifugeres, pelleten oppløses i en buffer med sammensetning 33 mM Tris-acetat pH 7,9, 62,5 mM kaliumacetat, 1 mM magnesiumacetat og 1 mM ditiotreitol (DTT), og den andre tråd av komplementær DNA syntetiseres i et volum på 30 fil med 30 enheter av enzymet fag T4 DNA polymerase {Pharmacia referanse 270718) og en blanding av 1 mM av de fire deoksynukleo-tidtrifosfater dATP, dCTP, dGTP og dTTP så vel som to enheter .av fag T4 gen 32 protein {Pharmacia referanse 27-0213) i en time ved 37°C. Blandingen ekstraheres med fenol og spor av fenol fjernes med en polyakrylamidkolonne P10 (Biogel P10-200-400 mesh - referanse 15011050 - Biorad).

i) Transformasjon ved elektroporering.

E. coli MC 1061 celler transformeres med den rekombinante DNA oppnådd over ved elektroporering ved anvendelse av et Biorad Gene Pulser apparat (Biorad) anvendt ved 2,5 kV under de betingelser som er spesifisert av produsenten, og bakteriene dyrkes deretter i en time i mediet kjent som LB medium

(Sambrook op. eit.) med sammensetning: baktotrypton 10 g/l, gjærekstrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l. Antallet uavhengige kloner bestemmer ved utplating av en 1/1000 fortynning av transfor-masjonen etter den første time med inkubasjon på en plate av LB medium med tilsetning av 1,5% agar (vekt/volum) og

100 fil/ ml ampicillin, heretter omtalt som LB agarmedium. Antallet uavhengige kloner er 1 million.

j) Analyse av cDNA'ene i biblioteket.

I forbindelse med analysen av individuelle kloner i biblioteket ved nukleinsyresekvensering av 5' regionen av cDNA'ene, ble ett klon, betegnet SR-p70a, vist til å utvise en partiell homologi med cDNA fra det allerede kjente protein, p53 proteinet (Genbank X 02469 og X 16384) (fig. 1). Sekvensene ble dannet med the United States Biochemical kit (referanse

70770) og/eller the Applied Biosystems kit (referanser 401434 og/eller 401628), som anvender metoden ifølge Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1977, 14, 5463-5467. Plasmid DNA fremstilles fra WIZARD minipreparat-kitet (Promega referanse A7510). Primerene som anvendes er 16 til 20-mer olgionukleo-tider, enten komplementære til vektoren pSEl i regionen umid-delbart i 5' enden av cDNA, eller til sekvensen av cDNA. Et andre cDNA ble isolert fra det samme bibliotek ved screening, på en måte som er lik teknikken beskrevet i eksempel III.3 i

det etterfølgende, med et fragment av SR-p70a hvor DNA er merket med <32>P med BRL "Random Primers DNA labelling systems" kitet {referanse 18187-013). Hybridiserings- og vaske-bufferene behandles med tilsetning av 50% formamid. Den siste vasking blir gjennomført i 0,1 x SSC/0,1% SDS ved 60°C. Denne andre sekvens {SR-p70b cDNA) er identisk med den første men et internt fragment er blitt deletert derfra (fig. 3).

De to SR-p70 cDNA'er med lengde 2874 nukleotider (SR-p7Qa) og 2780 nukleotider (SR-p70b), svarer til produktene av et enkelt gen, idet en alternativ spleising frembringer en delesjon av 894 baser mellom nukleotider 1637 og 1732 og en prematur terminering av det tilsvarende kodede protein. Proteinene utledet fra de to cDNA<1>er har henholdsvis 637 og 499 aminosyrer (figurer 4 og 5).

Eksempel II

O<p>pnåelse av sekvensen oa klonin<g> av cDNA1 et av SR-p70a proteinet fra HT-5 9 celler fhuman kolon-adenokarsinoml

1) Dyrking av HT- 29 celler

Cellene dyrkes i McCoy's 5 medium (GIBCO 26600-023) med tilsetning av 10% føtalt kalveserum (GIBCO 10081-23) og 5 0 mg/l gentamicin, til semikonfluens.

2) Fremstilling av det komplementære DNA

Messenger RNA ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1.2. cDNA fremstilles på en måte som er lik den beskrevet i eksempel 1.3, med 5 fig total messenger RNA, ved anvendelse av en poly(T)12 primer. Reaksjonen avbrytes ikke med EDTA.

3) Spesifikk amplifikasjon av human cDNA ved den såkalte PCR

teknikk

Polymeriseringen gjennomføres med 4 /il cDNA i 50 /il slutt-blanding med bufferen med følgende sammensetning: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KC1 i nærvær av 10% DMSO, 0,5 mM dNTP, 4 /ig/ml av hver av de to nukleinsyrepr ime rene og 2,5 enheter TAQ DNA polymerase (Boehringer). Primerparene ble valgt på grunnlag av nukleinsyresekvensen av COS-3 SR-p70 klonet, særlig oppstrøms av translasjonsinitierings ATG og nedstrøms av translasjons-stopp TGA, og har følgende sammensetning:

sense primer: ACT GGT ACC GCG AGC TGC CCT CGG AG

Kpn I restriksjonssete

antisense primer: GAC TCT AGA GGT TCT GCA GGT GAC TCA G.

Xba I restriksjonssete

Reaksjonen gjennomføres i 30 sykluser med 94°C/l minutt, 54-60°C/l minutt og 3 0 sekunder og 72°C/1 minutt og 3 0 sekunder, etterfulgt av en sluttsyklus på 72°C/6 minutter.

4) Oppnåelse av sekvensen av det humane cDNA

I et første trinn fjernes PCR produktet fra oligonukleotidene på en kolonne av Sephacryl S-400, og avsaltes deretter ved eksklusjonskromatografi på en polyakrylamidkolonne P10 (Biorad referanse 1504144). Sekvenseringsreaksjonene gjen-nomføres ved anvendelse av kitet fra Applied Biosystems (referanse 401628) med oligonukleotider spesifikke for cDNA. Den oppnådde sekvens er svært lik den til ape SR-p70a, og det utledede protein inneholder 636 aminosyrer (fig. 6).

På en lignende måte ble andre sekvenser som stammer fra humane linjer eller vev oppnådd for kodedelen av human SR-p70, særlig fra lunge eller pankreas. Proteinene utledet fra disse sekvenser er identiske med dem oppnådd for HT-29 linjen.

5) Kloning av det humane cDNA inn i plasmid pCDNA3 ( Invitro-gen V 790- 20)

PCR produktet oppnådd i 3) og også plasmidet kuttes med to restriksjonsenzymer Kpn I og Xba I og renses deretter etter migrering på en 1% agarosegel ved anvendelse av Geneclean kitet (Bio 101 referanse 3105). Etter ligering med 100 ng innskudd og 10 ng vektor og transformasjon (teknikk beskrevet i eksempel I.3.g og i), blir de rekombinante kloner verifi-sert ved sekvensering ved anvendelse av kitet fra Applied Biosystems som nevnt i det foregående.

Eksempel III

Kloning av mus SR- p70 cDNA fra AtT- 20 ( pituitær tumor) celler

1) Celledyrking av linjen AtT- 20

Cellene dyrkes i Ham F10 medium (GIBCO 31550-023) med tilsetning av 15% hesteserum (GIBCO 26050-047), 2,5% føtalt kalveserum (GIBCO 10081-073) og 50 mg/l gentamicin, inntil semikonfluens. 2) Fremstilling av det komplementære DNA bibliotek Biblioteket fremstilles som beskrevet i eksempel 1.2 og 3 fra cellene dyrket i det foregående.

3) Screening av biblioteket

a) Fremstilling av membranene.

Klonene av biblioteket utplates på LB agarmedium (Petriskåler

med diameter 150 mm) belagt med Biodyne A membraner (PALL referanse BNNG 132). Etter en natt ved 37°C overføres klonene på nye membraner ved kontakt. De sistnevnte behandles ved at de anbringes på 3 mm Whatman papir som er gjennombløtt med følgende oppløsninger: 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter, deretter 0,5 M Tris-HCl pH 8, 1,5 M NaCl i 5 minutter. Etter behandling med proteinase K i den følgende buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% SDS, 100 /zg/ml proteinase K, i en time ved romtemperatur, vaskes membranene rikelig i 2 x SSC (natriumsitrat, NaCl), tørkes og inkuberes deretter i en ovn under vakuum ved 80°C i 20 minutter.

b) Fremstilling av proben.

På grunnlag av ape og human SR-p70 cDNA sekvenser, ble en

første sekvens dannet på et fragment amplifisert fra linje AtT-20 mRNA som beskrevet i eksempel II.3 og 4, med oligo-merene med følgende sammensetning:

sense primer: GCC ATG CCT GTC TAC AAG

antisense primer: ACC AGC TGG TTG ACG GAG.

På grunnlag av denne sekvens, ble en oligomer probe spesifikk for mus valgt og med følgende sammensetning:

GAG CAT GTG ACC GAC ATT G.

100 ng av proben merkes i 3" enden med 10 enheter terminal transferase (Pharmacia) og 100 /iCi [a-<32>P]dCTP 3.000 Ci/mmol (Amersham referanse PB 10205) i 10 /il av følgende buffer: 3 0 mM Tris-HCl pH 7,6, 140 mM kakodylsyre, 1 mM CoCl2, 0,1 mM DTT i 15 minutter ved 3 7°C. De radioaktivt merkede nukleotider som ikke er inkorporert fjernes på en P10 polyakrylamidkolonne (Biorad, referanse 1504144). Den oppnådde probe har en spesifikk aktivitet på omtrent 5 x IO<8> dpm//jg.

c) Prehybridisering og hybridisering.

Membranene fremstilt i a) prehybridiseres i 30 minutter ved

42°C i 6 x SSC, 5 x Denharfs, 0,1% SDS, og hybridiseres deretter i noen få timer i den samme buffer med tilsetning åv proben fremstilt i b) i mengdeandelen IO<6> dpm/ml.

d) Vasking og eksponering av membranene.

Membranene'vaskes to ganger ved romtemperatur i 2 x SSC/0,1%

SDS buffer og deretter i en time ved 56°C i 6 x SSC/0,1% SDS. De hybridiserte kloner visualiseres med KODAK XOMAT filmer. Et positivt klon som inneholder mus SR-p70 selekteres og betegnes i det etterfølgende som SR-p70c. 4) Sekvensering av mus SR-p70 og analyse av sekvensen Sekvensen oppnås ved anvendelse av. kitet fra Applied Biosystem (referanse 401628). Proteinsekvensen utledet fra mus SR-p70c cDNA (fig. 7) utviser en svært sterk homologi med humane sekvenser og apesekvenser, unntatt i den N-terminale del som divergerer sterkt (se fig. 9). Ved anvendelse av den såkalte PCR teknikk på lignende måte som beskrevet i eksempel II.3 og 4, ble en andre 5' sekvens (som skriver seg fra det samme AtT-2 0 bibliotek) oppnådd (fig. 8). Den utledede N-terminale proteinsekvens (sekvens betegnet SR-p70a) er svært lik den som er utledet fra human og ape SR-p70 cDNA<1>er (SR-p70a) (fig. 9). Linjen AtT-20 gir således minst to SR-p70 transkripter. De sistnevnte 2 divergerer i den N-terminale del gjennom ulike spleisinger.

Eksempel IV

1) Fremstilling av rekombinant SR- p70 protein i E. coli

a) Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet.

Dette omfatter å anbringe den COOH-terminale del av ape

SR-p70a proteinet, fra valin i posisjon 427 til det COOH-terminale histidin i posisjon 637, i fusjon med glutation S-transferasen (GST) av plasmidvektoren pGEX-4T-3 (Pharmacia referanse 2 7-4583). For dette formål ble det tilsvarende SR-p70a innskudd (posisjon 1434 til 2066) amplifisert ved hjelp av PCR med 10 ng plasmid inneholdende ape SR-p70a cDNA. Nukleinsyreprimerene har følgende sammensetning:

sense primer: TTT GGA TCC GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG

BamHI restriksjonssete

antisense primer: AAA GTC GAC GTG GAT CTC GGC CTC C.

Sal I sete

Det oppnådde fragment og også vektoren kuttes med restriksjonsenzymene BamHI og Sal I og kloning gjennomføres som beskrevet i eksempel II.5. Det valgte klon omtales som pG SR-p70.

b) Ekspresjon og rensing av GST-SR-p70 fusjonsproteinet. Dette trinn ble gjennomført ved anvendelse av "the bulk GST

pufification module" kit (Pharmacia referanse 27-4570-01). Generelt, ble det rekombinante klon dyrket ved 37°C i en liter 2 x YTA medium + 100 /tg/ml ampicillin. Ved OD 0,8, induseres ekspresjonen med 0,5 mM IPTG i 2 timer ved 37°C. Etter sentrifugering tas cellepelleten opp i kald PBS og lydbehandles deretter med ultralyd. Etter tilsetning av 1% Triton X-100, inkuberes preparatet i 30 minutter ved omrøring ved romtemperatur.- Etter sentrifugering med 12.000 g i 10 minutter ved 4°C, utvinnes supernatanten. Rensing gjennomføres deretter på en glutation-Sepharose 4B affinitetskromatografikolonne. Binding og vasking gjennomføres i PBS buffer og eluering gjennomføres ved konkurranse med et redusert glutation. Sluttkonsentrasjonene bringes til 300 ( tg/ ml fusjonsprotein.

2) Fremstilling av SR- <p>70a protein i COS- 3 celler

COS-3 celler transfereres med pSEl plasmid DNA inn i hvilket ape SR-p70a cDNA er blitt klonet (eksempel 1.1), eller med vektor pSEl plasmid DNA som kontroll, ved hjelp av DEAE-dekstranteknikken: COS-3 cellene inokulers i 5 x IO<5> celler pr. 6 cm skål i kulturmedium inneholdende 5% fatalt bovint serum (eksempel I.l). Etter dyrking, vaskes cellene med PBS. 1 ml av følgende blanding tilsettes: medium inneholdende 6,5 fig DNA, 250 fi/ xal DEAE-dekstran og 100 ( M kloroguin. Cellene inkuberes ved 37°C i 5% C02 i 4 til 5 timer. Mediet suges av, 2 ml PBS inneholdende 10% DMSO tilsettes og cellene inkuberes i ett minutt, idet skålene rystes forsiktig.

Mediet suges av på nytt og cellene vaskes to ganger med PBS. Cellene inkuberes deretter ved 37°C med medium inneholdende 2% føtalt bovint serum i en periode under hvilken ekspresjon finner sted, som generelt er 3 døgn.

SR-p70a proteinet analyseres deretter som beskrevet i eksempel IV ved immunblotting.

Eksempel V

Fremstilling av spesifikke antistoffer

150 fig proteiner av prøven fremstilt i henhold til eksempel IV anvendes for å immunisere en kanin (New Zealand hannkjønn med vekt fra omtrent 1,5 til 2 kg). Immuniseringene utføres hvert 15. døgn i henhold til den prosedyre som er beskrevet av Vaitukaitis, Methods in Enzymology, 1981, 73, 46. Ved den første injeksjon ble en volumdel antigenoppløsning emulgert med en volumdel Freund's komplette adjuvans (Sigma referanse 4258). Fem boostere administreres i Freunds inkomplette adjuvans (Sigma referanse 5506).

Eksempel VI

Deteks-ion av SR-p70 proteinet: Western immunblotting

1) Materialer anvendt for immunblotting

a) Cellelinjer anvendt for immunblotting.

De følgende cellelinjer ble dyrket som beskrevet i katalogen

"Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" i ATCC (American Type Culture Collection): COS-3, CV-1 (ape-nyrecellelinje), HT-29, U-373MG (human glioblastom) , MCF7 (human mamma-adenokarsinom), SKNAS (human neuroblastom dyrket under de samme betingelser som COS-3), SK-N-MC (human neuro-

blastom), IMR-32 (human neuroblastom), CHP212 (human neuroblastom dyrket under de samme betingelser som CV-1), Saos-2 (osteosarkom) , SK-OV-3 (ovarie-adenokarsinom) og SW 480

(human kolon-adenokarsinom).

b) COS-celler transfektert med SR-p70a cDNA.

COS-3 celler ble transfektert som beskrevet i eksempel IV.2.

Som en kontroll ble cellene transfektert med pSEl plasmid DNA som ikke inneholdt rekombinant SR-p70a cDNA. 2) Fremstilling av proteinprøver fra en eukaryot cellekultur eller fra transfekterte celler.

Etter dyrking vaskes cellene med PBS og tas deretter opp i RIPA buffer (PBS med 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,5% SDS) supplert med 10 fig/ ml RNAse A, 20 fig/ ml DNAse 1, 2 fig/ ml aprotinin, 0,5 ug/ ml leupeptin, 0,7 fig/ xdL pepstatin og 170 fig/ ml PMSF. Cellene lydbehandles med ultralyd ved 4°C og får stå i 30 min. ved 4°C. Etter mikrosentrifugering ved 12.000 opm, utvinnes supernatanten. Proteinkonsentrasjonen måles ved Bradford metoden.

3) Western blotting

5 eller 50 fig proteiner (50 fig for cellelinjene og 5 fig for transfekterte celler) anbringes i 0,2 volumdel av følgende 6

x elektroforesebuffer: 0,35 mM tris-HCl pH 6,8, 10,3% SDS,

36% glyserol, 0,6 mM DTT, 0,012% bromfenolblått. Prøvene påføres og kjøres i en 10% SDS-PAGE gel (30:0,8 Bis) og elektro-overføres deretter på en nitrocellulosemembran.

4) Visualisering med antistoffet

Membranen inkuberes i 30 min. i TBST blokkeringsbuffer (10 mM tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,2% Tween 20) med tilsetning av 5% melk (GIBCO - SKIM MILK) ved romtemperatur. Membranen bringes suksessivt i kontakt med anti-SR-p70 («SR-p70) antistoffet i den samme buffer i 16 timer ved 4°C, vaskes 3 ganger . i 10 min. med TBST og inkuberes deretter i l time ved 37°C med et annet, anti-kanin immunglobulinantistoff koblet til peroksidase (SIGMA A055). Etter tre vaskinger av 15 min., gjennomføres visualiseringen med ECL kitet (Amersham RPN2106) ved kjemiluminescens.

Parallelt ble de samme prøver underkastet visualisering med et anti-p53 (ap53) antistoff (Sigma BP5312) etterfulgt av et andre, anti-mus immunglobulin antistoff.

5) Figurer og resultater

Fig. 10: Immunblott av SR-p70 proteinet

Fig. 10a: Deteksjon av det rekombinante SR-p70 protein

- kolonner l og 3: COS-3 transfektert med vektoren pSEl.

- kolonner 2 og 4: COS-3 transfektert med plasmid pSEl inneholdende SR-p70a cDNA. - kolonner 1 og 2: visualisering med anti-SR-p70 (aSR-p70) antistoffet.

kolonner 3 og 4: visualisering med anti-p53 (ccp53) antistoffet .

Fig. 10b: Deteksjon av det endogene SR-p70 protein

- kolonner 1: COS-3, 2: CV-1, 3: HT-29, 4: U-373 MG, 5: MCF7, 6: SKNAS, 7: SK-N-MC, 8: IMR-32, 9: CHP212, 10: Saos-2, 11:

SK-OV-3 og 12: SW480.

A: Visualisering med ccSR-p70 antistoffet

B: Visualisering med ap53 antistoffet

aSR-p70 antistoffet gjenkjenner spesifikt de rekombinante proteiner (fig. 10a) og de endogene proteiner (fig. 10b) og krysser ikke med p53. Analyse av humane cellelinjer eller apecellelinjer viser at SR-p70 proteinet, som p53, er generelt svakt detekterbart. I motsetning til dette, når en akkumulering av p53 eksisterer, blir SR-p70, for sin del også, lettere detekterbart (fig. 10b). Et studium med RT-PCR av fordelingen av SR-p70 transkripter viser at genet er uttrykt i alle de testede celletypene.

Eksempel VII

Kloning av SR-p70 genet og kromosomal lokalisering

1) Kloning av SR- p70 genet

Biblioteket som anvendes er et kosmidbibliotek fremstilt i eksempel III.3, med et SR-p70 DNA fragment merket med <32>p med BRL "Random Primers DNA Labelling Systems" kitet (referanse 18187-013). Hybridiserings- og vaskebufrene er behandlet ved tilsetning av 50% formaldehyd. Den siste vasking gjennom-føres i 0,1 x SSC/0,1% SDS ved 60°C. På liknende måte ble SR-p70 genet isolert fra et bibliotek fremstilt med C57 svartmus genomisk DNA.

En analyse og en partiell sekvensering av klonene viser tilstedeværelse av 14 exoner med en struktur som er nær den av p53 genet, særlig i den sentrale del hvor størrelsen og posisjonering av exonene er konservert i stor grad (fig. 12). Denne struktur var delvis definert i mus og i menneske.

Som et eksempel er de humane genomiske sekvenser av 3<1> regionen av intron 1, av exon 2, av intron 3 og av 5<1> regionen av exon 3 angitt i fig. 13. 2) Kromosomal lokalisering av SR-p70 genet i menneske Dette ble gjennomført med humant SR-70 gen DNA ved anvendelse av teknikken beskrevet av R. Slim et al., Hum. Genet., 1991, 88, 21-26. Femti mitoser ble analysert, av hvilke mere enn 80% hadde doble flekker lokalisert i lp36 på begge kromosomer og mer spesielt i lp36.2-lp36.3 (fig. 11). identifikasjonen av kromosom 1 og dets orientering er basert på heterokroma-tinet fra den sekundære konstriksjon. Bildene ble oppnådd på et Zeiss Axiophot mikroskop, tatt med et LHESA avkjølt CCD kamera og behandlet med Optilab.

Eksempel VIII

A) Demonstrasjon av et mRNA som koder for et utledet humant SR-p70 protein som innehar både en kortere N-terminal ende og en divergens. 1) Dyrking av IMR- 32 ( human neuroblastom) celler Cellene ble dyrket som beskrevet i katalogen "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" fra ATCC (American Type Culture Collection).

2) Fremstilling av cDNA

RNA ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1.2.a. cDNA fremstilles på en måte som er lik den som er beskrevet i eksempel 1.3, med 5 ( tg total RNA i et sluttvolum på 20 fil ved anvendelse av poly(T)12 primer og med kalde nukleotider. Reaksjonen avbrytes ikke med EDTA.

3) Spesifikk amplifikasjon av SR- p70 cDNA ved den såkalte PCR teknikk

Polymeriseringen gjennomføres med 2 /il cDNA i 50 /il sluttopp-løsning med bufferen med følgende sammensetning: 50 mM tris-HCl pH 9,2, 16 mM (NH4)2S04, 1,75 mM MgCl2, i nærvær av 10% DMSO, 0,4 mM NTP, 100 ng av hver av de to nukleinsyreprimerne og 3,5 enheter av blandingen av TAQ og PWO polymeraser (Boehringer Mannheim, ref. 1681 842).

Primerparet har følgende sammensetning:

sense primer: AGGCCGGCGTGGGGAAG (posisjon 16 til 32, figur 6) antisense primer: CTTGGCGATCTGGCAGTAG (posisjon 503 til 485, fig..6).

Reaksjonen gjennomføres i 30 sykluser av 95°C/30 sek., 58°C/1 min. og 68°C/2 min. og 30 sek., etterfulgt av en siste syklus på 68°C/10 min.

PCR produktet underkastes elektroforese på en 1% agarosegel (TAE buffer). Etter farging med etidiumbromid, fremkommer to hovedbånd: et bånd med størrelse omtrent 490 bp (forventet størrelse (se fig. 6)) og et ytterligere bånd med størrelse omtrent 700 bp. Det sistnevnte ekstraheres fra gelen ved anvendelse av "Genclean" kitet (Bio 101, ref 1001 400) . Etter en avsalting på en P10 polyakrylamidkolonne (Biorad, ref 15011050), underkastes fragmentet en ytterligere PCR amplifikasjon i 10 sykluser som beskrevet over.

4) Bestemmelse av sekvensen av det amplifiserte produkt I et første trinn fjernes PCR produktet fra oligonukleotidene på en S-400 Sephacrylkolonne (Pharmacia 17-0609-01) og avsaltes deretter på en Pio kolonne. Sekvenseringsreaksjonen gjennomføres ved anvendelse av kitet fra Applied Biosystems {ref. 401 628) (373 DNA sekvensator) med antisense primeren.

Den oppnådde sekvens er identisk med SR-p70 cDNA sekvensen (eksempel II.4) med et innskudd på 198 bp mellom posisjon 217 og 218 (fig. 14). Den utledede N-terminale proteinsekvens (sekvens betegnet SR-p70d) er 49 aminosyrer kortere, med en divergens av de første 13 aminosyrer (sekvens ID No. 13). Der er følgelig koeksistens av minst to ulike SR-p70 transkripter som allerede beskrevet for AtT-20 linjen fra mus. B) Kloning av human SR-p70 og demonstrasjon av en mRNA koding for et utledet humant SR-p70 protein med den samme N-terminale ende som SR-p70d og en divergens i den C-terminale del. 1) Spesifikk amplifikasjon av SR- p70 cDNA ved den såkalte PCR teknikk.

Amplifikasjon ble gjennomført som beskrevet i eksempel VIII. A fra renset RNA fra IMR-32 celler med primerparet med følg-ende sammensetning: sense primer: GCG GCC ACG ACC GTG AC {posisjon 160 til 176, sekvens ID No. 11)

antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (posisjon 1993 til 1976, figur 6).

Etter fjerning av overskuddet av primere på en S400 kolonne og avsalting på en P10 kolonne, blir 1 /il av prøven på nytt underkastet en PCR med primerparet med følgende sammensetning :

sense primer: TAT CTC GAG CTG TAC GTC GGT GAC CCC

Xhol (posisjon 263 til 280, sekvens ID No. 11)

antisense primer: ATA TCT AGA TCA GTG GAT CTC GGC CTC

Xbal (posisjon 1943 til 1926, figur 6). 2) Kloning av det amplifiserte produkt inn i plasmid pCDNA3 PCR produktet oppnådd i l) avsaltes på en P10 kolonne, kuttes med restriksjonsenzymene Xhol og Xbal og klones deretter inn i plasmid pCDNA3 som beskrevet i eksempel II.5. To rekombinante kloner sekvenseres ved anvendelse av kitet fra Applied Biosystems med oligonukleotidene som er spesifikke for SR-p70 cDNA.

Den første sekvens som oppnås svarer til den komplette sekvens av mRNA som koder for SR-p70 beskrevet i eksempel VIII.a. Det utledede protein inneholder 587 aminosyrer (sekvens ID No. 13 og figur 16).

Den andre sekvens som oppnås er identisk med SR-p70d cDNA sekvensen beskrevet i det foregående, men med to delesjoner, på 149 bp og 94 bp mellom posisjoner 1049 og 1050 på den ene side, og mellom posisjoner 1188 og 1189 på den annen side (sekvens ID No. 14 og fig. 15). Proteinsekvensen utledet fra denne andre sekvens viser et protein med en N-terminal del som er 49 aminosyrer kortere, med en divergens i de første 13 aminosyrer såvel som en divergens i proteinsekvens mellom aminosyrer 350 og 397 (sekvens ID No. 15 og fig. 16) (sekvens betegnet SR-p70e). Det utledede protein inneholder 506 aminosyrer . C) Demonstrasjon av et mRNA som koder for et utledet humant SR-p70 protein med en kortere N-terminal ende. 1) Dyrking av SK- N- SH ( human neuroblastom) celler Cellene dyrkes som beskrevet i "the Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" fra ATCC (American Type Culture Collection). 2) Fremstilling av cDNA og amplifikasjon av SR- p70 cDNA ved den såkalte PCR teknikk

Disse trinn gjennomføres som beskrevet i eksempel VIII.A med primerparet med følgende sammensetning: sense primer: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (posisjon 128 til 145, figur 17) antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (posisjon 1993 til 1976, figur 6).

Sekvenseringen gjennomføres med kitet fra Applied Biosystems med primere som er spesifikke for SR-p70 cDNA, og viser to cDNAer: - en første cDNA svarende til den mRNA som koder for SR-p70a - en andre cDNA med en delesjon på 98 bp mellom posisjoner 24 og 25 (sekvens ID No. 16 og figur 15).

Denne delesjon omfatter trånslasjonsinitierings ATG i SR-p70a. Proteinet som utledes (betegnet SR-p70f) fra denne andre cDNA har et trånslasjonsinitierings ATG nedstrøms svarende til et internt ATG i SR-p70a. Det utledede protein inneholder således 588 aminosyrer (sekvens ID No. 17 og figur 16) og er avkuttet hva angår de 48 N-terminale aminosyrer i SR-p70a.

D) Demonstrasjon av et mRNA som koder for human SR-p70b.

1) Dyrking av K562 celler

Cellene dyrkes som beskrevet i "the Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" fra ATCC (American Type Culture Collection).

2) Fremstilling av cDNA, amplifikasjon av SR- plO cDNA ved den såkalte PCR teknikk og sekvensering

Disse trinn gjennomføres som beskrevet i eksempel VIII.C. Sekvenseringen viser to cDNAer: Et første cDNA svarende til den mRNA som koder for SR-p70a, og et andre cDNA med en delesjon på 94 bp mellom posisjoner 1516 og 1517 (sekvens ID No. 18 og figur 15). Det utledede protein (betegnet SR-p70b) inneholder 199 aminosyrer og har en C-terminal sekvens som er avkortet med 13 7 aminosyrer i forhold til SR-p70a, og med de siste 4 aminosyrer diverger-ende (sekvens ID No. 19 og fig. 21).

Denne cDNA er lik den som er beskrevet i eksempel I som relaterer til ape SR-p70b.

Molekylene beskrevet i dette eksempel (eksempel VIII.A, B, C og D) viser SR-p70 varianter som er resultatet av differen-sielle spleisinger av det primære mRNA, transkribert ved SR-p70 genet.

SR-p70a er kodet for av et mRNA som utgjøres av 14 exoner (se eksempel VII). Dette er referanseproteinet. SR-p70b er resultatet av et innskudd mellom exoner 3 og 4 og av fraværet av exoner 11 og 13. SR-p70f er resultatet av fraværet av exon 2. Dette eksempelet beskriver i ikke-uttømmende grad eksistensen av SR-p70 varianter, mens det er sannsynlighet for eksistens av andre varianter. Likeledes er eksistensen av disse varianter beskrevet i dette eksempel, såvel som SR-p7 0a, ikke begrenset til linjene hvori de er blitt demonstrert. Faktisk viser studier utført med RT-PCR at disse varianter kan bli funnet i forskjellige linjer som studeres.

Videre vil initierings-metionin i SR-p70f svare til et internt metionin i SR-p70a, noe som foreslår muligheten av initiering nedstrøms på det mRNA som koder for SR-p70a.

EKSEMPEL IX

Oppnåelse av en 5<1> sekvens av human SR-p70a mRNA

1) Amplifikasjon av 5' enden av SR- plO cDNA ved PCR Celledyrking og fremstilling av total RNA og av cDNA gjennomføres som beskrevet i eksempel VIII.l og 2. RNA templatet hydrolyseres ved inkubasjon i 5 min. ved 65°C etter tilsetning av 4 /il 500 mM EDTA og 4 fil 2 N NaOH. Prøven avsaltes deretter på en P10 kolonne. cDNA elongeres i 3' enden med en dG hale som beskrevet i eksempel I.3.d, i et sluttvolum på 40 /il. Etter tilsetning av 4 /il 500 mM EDTA og 4 /il 2 N NaOH, inkuberes cDNAet ved 65°C i 3 min. og avsaltes deretter på en P10 kolonne. PCR amplifikasjonen gjennomføres som beskrevet i eksempel VIII.3 med 8 /il cDNA og i 30

sykluser med primerparet med følgende.sammensetning:

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er lik G, A eller T) antisense primer: CCATCAGCTCCAGGCTCTC (posisjon 1167 til 1149, figur 6).

Etter fjerning av overskuddet av primere på en S-400 kolonne og avsalting på en Pio kolonne, blir 1 ( il av prøven under7 kastet på nytt for en PCR med paret med følgende sammensetning :

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN

antisense primer: CCAGGACAGGCGCAGATG (posisjon 928 til 911, figur 6).

Prøven som igjen er ført gjennom en S-400 kolonne og en PIO kolonne underkastes en tredje amplifikasjon av 20 sykluser med følgende par:

sense primer: CCCCCCCCCCCCCCCN

antisense primer: CTTGGCGATCTGGCAGTAG (posisjon 503 til 485, figur 6).

2) Bestemmelse av SR- p70 cDNA 5' sekvensen

Sekvensen fremstilles som beskrevet i eksempel VIII.4. Denne sekvens avslører en ikke-kodende 5' region på minst 237 baser oppstrøms av initierings ATG i SR-p70a (figur 17). Ved sammenligning av denne sekvens (oppnådd fra linjen IHR-32) med en som spesielt er oppnådd fra linjen HT-29 (fig. 6), fremkommer to punkt-forskjeller (fig. 17: se fete skrifttyper) (G - A og C - T), som er plassert henholdsvis ved -20 og -30 fra initierings ATG av SR-p70a (figurene 6 og 17). Denne variabilitet er lokalisert i exon 2 (fig. 13). Det er ikke ute-lukket at denne variabilitet også vil finnes i en koderamme som resultatet av en alternativ spleising som beskrevet i eksempler III i mus og VIII i mennesker, eller alternativt som resultatet av en translasjonsinitiering på en CTG (som demonstrert for FGFb (Proe. Nati. Acad. Sei USA, 1989, 86, 1836-1840)) .

Likeledes skal det ikke utelukkes at denne variabilitet har en ettervirkning på translasjonen av SR-p70 eller på spleis-ingen av det primære RNA.

I alle tilfeller kan denne variabilitet, sannsynligvis av allelisk opprinnelse, tjene som en markør, enten på et geno-ttiisk nivå (se eksempel XI} eller på mRNA nivå (se eksempel

X) .

EKSEMPEL X

1) Analyse ved PCR av den transkripsjonene ekspresjon av SR-plOa i celleprøver ( RT- PCR)

Celledyrking (SK-N-AS, SK-N-MC, HT-29, U-373MG, SW480, I-MR-32, CHP212) gjennomføres som beskrevet i eksempel VI.l.a (med referanse til katalogen "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition 1992" i ATCC).

Fremstillingen av cDNA og PCR ampiifikasjonen gjennomføres som beskrevet i eksempel VIII.2 og 3. Primerparet som anvendes har følgende sammensetning: sense primer: AGGGGACGCAGCGAAACC (posisjon 12 8 til 14 5, fig.

17)

antisense primer: GGCAGCTTGGGTCTCTGG (posisjon 1993 til 1976, fig. 6).

Prøvene analyseres ved elektroforese på en 1% agarosegel og visualiseres med etidiumbromid (fig. 18).

Størrelsen på båndet som oppnås i prøvene svarer til den forventede størrelse (omtrent 2 kb, figurene 6 og 17). Intensiteten på båndene som oppnås er reproduserbar. En reamplifikasjon av 1 fil av prøven under de samme betingelser i 20 sykluser viser et bånd i hver av prøvene.

2) Bestemmelse av sekvensen av de amplifiserte produkter Etter at prøvene er ført gjennom S-400 og P10 kolonner, gjennomføres sekvensering på' en Applied Biosystems sekvensator 373 med referansekitet 401 628. De primerne som anvendes er blant annet de følgende:

Ingen proteinforskjell i SR-p70a ble detektert. Oppnådde sekvenser viste imidlertid en dobbel variabilitet i posisjoner -20 og -3 0 oppstrøms av initierings ATG av SR-p70a (figurer 6 og 17). Denne-variabilitet, sannsynligvis av allelisk opprinnelse, muliggjør definering av to klasser av transkripter: første klasse som har en en G i posisjon -30 og en C i posisjon -20 (klasse G"30/C"<20>) og en andre klasse som har en forskjell i to posisjoner: en A i -30 og en T -20 (klasse A"30/^20) .

Første klasse: SK-N-AS, SK-N-MC, HT-29, U-373MG, SW480. Andre klasse: IMR-32, CHP212.

Eksempel XI

Analytisk metode for bestemmelse av den alleiiske fordeling av SR-p70 genet i en populasjon på 10 personer.

Denne alleliske fordeling er basert på den alleliske variabilitet demonstrert i eksemplene IX og X: - G"30/C"<20> allel med henholdsvis en G og en C i posisjoner

-3 0 og -20 oppstrøms av initierings ATG i SR-p70a.

- A"30/T"<20> allel med henholdsvis en A og en T i de samme posisjoner.

Denne variabilitet kan bestemmes ved anvendelsen av restriksjonsenzymer som differensierer de to alleler (fig.

13). Som et eksempel:

- Enzym Bpl I med et spaltingssete kun på G"<30>/C"20 allelet i området av interesse (dette sete omfatter begge variable

posisjoner).

- Enzym styl med et spaltingssete kun på A"30/T"<20> allelet i området av interesse.

1) Genomisk amplifikasjon av exon 2 ved PCR

Polymerisasjonsreaksjonen gjennomføres med 50 0 mg renset genomisk DNA, i 50 /il sluttvolum med de betingelser som er beskrevet i eksempel VIII.3.

Primerparet har følgende posisjon:

Sense primer: CACCTACTCCAGGGATGC (posisjon 1 til 18, fig. 13) Antisense primer: AGGAAAATAGAAGCGTCAGTC (posisjon 833 til 813, fig. 13).

Reaksjonen gjennomføres med 3 0 sykluser som beskrevet i eksempel VIII.3.

Etter fjerning av overskuddet av primer på en S-400 kolonne og avsalting på en P10 kolonne, amplifiseres 1 /il av prøven igjen i 25 sykluser under de samme betingelser med følgende primerpar: Sense primer: CAGGCCCACTTGCCTGCC (posisjon 25 til 32, fig.13) Antisense primer: CTGTCCCCAAGCTGATGAG (posisjon 506 til 488, fig. 13).

De amplifiserte produkter underkastes elektroforese på en 1% agarosegel (fig. 19-A).

2) Kutting med restriksjonsenzymet Styl

Prøvene avsaltes først på en P10 kolonne og kuttes deretter med restriksjonsenzymet Styl (BRL 15442-015) i bufferen med følgende sammensetning: 50 mM tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, ved 37°C i 30 min. Kuttingsproduktene analyseres ved elektroforese på en 1% agarosegel (TAE buffer). Visualisering gjennomføres ved etidiumbromidfarging (fig. 19-B).

Et bånd på 482 basepar karakteriserer G"30/C-20 allelet (figurer 13 og 19). Tilstedeværelsen av et bånd av 3 76 basepar og en bånd av 106 basepar karakteriserer A"30/T"20 allelet (allel som har et Styl kuttingssete).

I populasjonen av 10 personer utviste to personer G"<30>/C"20 og A"30/T"<20> allelene, de andre 8 personer var homozygote med G" <30>/C"<20> allelet. Studiet av en frisk populasjon på 9 personer viste 3 heterozygote personer som utviste G"30/C-2<0> og A"30/T"<20> allelene, idet de andre 6 personene var homozygote med G<_3>0/C"2<0> allelet.

Eksempel XII

Test for reversjon av transformasjon av linjen SK-N-AS ved transfeksjon med SR-p70 cDNA.

Ekspresjonvektoren som anvendes er beskrevet i eksempel II.5 og er vist skjematisk i fig. 15. Metoden som anvendes er den såkalte kalsiumfosfatmetode som beskrevet av Graham et al.

(Virology 1973, 54, 2, 536-536). Linjen inokuleres i for-holdet 5 x IO<5> celler pr. skål med diameter 6 cm i 5 ml medium beskrevet i eksempel 1.1. Cellene dyrkes ved 3 7°C og med 5% C02 over natten. Transfeksjonsmediet fremstilles på følgende måte: følgende blanding fremstilles ved tilsetning, i nevnte rekkefølge, av 1 ml HEBS buffer (8 mg/ml NaCl,

370 fig/ ml KC1, 125 /xg/ml Na2HP04 -2H20, 1 mg/ml dekstrose, 5 mg/ml Hepes pH 7,05), 10 /ig av plasmidet som skal transfereres og 50 [ il 2,5 M CaCl2 tilsatt dråpevis. Transf eksjons-mediet får stå i 30 min. ved romtemperatur og tilsettes deretter dråpevis til mediet i dyrkingsskålen. Cellene inkuberes i 5 til 6 timer ved 37°C/5% C02. Etter at mediet er avsugd, blir 5 ml nylaget medium inneholdende 2% føtalt bovint serum tilsatt. Etter 48 timer ved 37°C/5% C02 vaskes

cellene med PBS, de løsnes ved trypsinbehandling, fortynnes i 10 ml dyrkingsmedium (5% føtalt bovint serum) og plates ut på en skål med diameter 10 cm (fortynningen kan justeres i overensstemmelse med effektiviteten av transfeksjon). Etter en

ytterligere inkubasjon i 10 timer (tiden anvendt for adherer-ing av cellene), underkastes cellene seleksjon ved tilsetning av G418 til en sluttkonsentrasjon på 600 jig/ml Geneticin ekvivalent i 15 til 21 døgn (mediet byttes hver dag). De oppnådde kloner vaskes deretter med PBS, fikseres i 7 0% etanol, tørkes, farges med 1% krystallfiolett og telles deretter.

Fire plasmidtransfeksjoner ble gjennomført i duplikat:

- plasmid pCDNA3 uten innskudd

- plasmid pCDNA3/SR-p70 inneholdende human SR-p70a cDNA

- plasmid pCDNA3/SR-p70 Mut inneholdende SR-p70a cDNA med en mutasjon i stilling 2 93 AA (R - H) som er analog med muta-sjonen 273 (R - H)i DNA bindingsdomenet av p53

- kontroll uten plasmid.

Resultatene er uttrykt som antallet kloner pr. skål.

Fraværet av kloner oppnådd ved transfeksjon med plasmid pCDNA3/SR-p70 er 25 ganger mindre enn antallet kloner oppnådd med kontrollen pCDNA3 og 9 ganger mindre enn antallet kloner oppnådd med pCDNA3/SR-p70 Mut, noe som indikerer en mortali-tet eller en stans i celledeling av cellene transfektert med SR-p70 cDNA. Dette resultat er ikke følgen av en toksisitet med henblikk på klonene oppnådd med den muterte SR-p70 cDNA, men sannsynligvis en konsekvens av en apoptose noe som er vist for p53 proteinet (Koshland et al., Sciences, 1993, 262, 1953-1981) .

Eksempel XIII

Den biologiske rolle for SR-p70 proteinet.

Den strukturelle homologi mellom DNA-bindingsdomenét av p53 og den sentrale region i SR-p70 proteinet muliggjør at man kan slutte at SR-p70 er en transkripsjonsfaktor (se figurer 1 og 2). p53 (3 93 aminosyrer) utgjøres faktisk av flere funk-sjonelle domener. Den N-terminale region (1-91 aminosyrer) er involvert i aktiveringen av transkripsjon og inneholder seter for interaksjon med forskjellige cellulære og virale proteiner. Den sentrale del (aminosyrer 92-292) tillater binding til spesifikke DNA sekvenser lokalisert i promoter-regionene hos bestemte gener (den største delen av punktmutasjoner som inaktiverer p53 er lokalisert i denne region), og den har også en rekke seter for interaksjon med virale proteiner som inhiberer aktiviteten derav. Endelig er de siste 100 aminosyrer i p53 ansvarlige for dens oligomerisering såvel som for reguleringen av-denne sistnevnte (Hainaut P., Current Opinion in Oncology, 1995, 7, 76-82, Prokocimer M., Blood, 1994, 84 nr. 8, 2191-2411).

Sekvenshomologien mellom p53 og SR-p70 er signifikant, særlig med hensyn til aminosyrene involvert direkte i interaksjon med DNA, noe som foreslår at SR-p70 binder til p53 setene på DNA. Disse aminosyrer svarer svært nøyaktig til det som omtales som "the hot spots", aminosyrer som hyppig er mutert i humane tumorer (SWISS PROT: SW: P53_human and Prokocimer M., Blood, 1994, 84 nr. 8, 2391-2411). Ut fra denne homologi kan det utledes at SR-p70 proteinet utviser en kontroll over aktiviteten av genene regulert ved p53, enten uavhengig av den sistnevnte eller ved å danne heterooligomerer med denne.

Følgelig, som p53, må produktene av SR-p70 genet være involvert i kontroll og regulering av cellesyklusen, og bevirker at syklusen stopper (forbigående eller permanent), og i gjen-nomføring av programmer som DNA reparasjon, differensiering eller celledød. Man hadde en sterk følelse av sannsynlig-heten for eksistensen av "p53-liknende" aktiviteter med demonstrasjonen, i p53~'~ mus, av aktiviteter som DNA reparasjon og celledød som svar på ioniserende stråler (Strasser et al., Cell, 1994, 79, 329-339). Forfatterne av den foreliggende oppfinnelse har lokalisert det humane SR-p70 gen i den telomere region på den korte arm av kromosom 1, nøyaktig i lp36.2-36.3, den minste deleterte region (SRO) felles for et flertall av neuroblastomer <p>g andre typer tumorer (melanomer og sarkomer) (White et al., PNAS, 1995, 92, 5520-5524). Denne "tap av heterozygotisitet" (LOH) region definerer locuset av et tumor-supprimerende gen hvis tap av aktivitet betraktes til å være årsak til tumordannelse. Det er viktig å minne om at denne region også er underkastet "maternal imprinting", idet det maternale allel foretrukket er tapt i neuroblastomer med lp36 delesjon (uten amplifikasjon av N-Myc) (Caron et al.. Hum. Mol. Gen., 1995, 4, 535-539). Det bred-type SR-p70 genet innført i neuroblastomceller og uttrykt deri tillater reversjon av deres transformasjon. Tapet av denne anti-onkogene aktivitet er således forbundet med utviklingen av tumoren. Ip36 regionen har en syngeneisk homologi med det diståle segment i musekromosom 4. I denne region, er "curly tail" (ct) genet (Beier et al., Mammalian Genome, 1995, 6, 269-272) involvert i kongenitale malformasjoner av nevralrøret (NTM: spina bifidia, anencefali, osv.). ct musen er den beste dyremodell for å studere disse målfor-mas joner. Det er akseptert at disse malformasjoner resulterer fra unormalheter i celleproliferasjon. Med tanke på naturen til SR-p70 genet og dets kromosomale lokalisering, er en av hypotesene at SR-p70 kunne være den humane homolog av ct og at, på dette grunnlag, kunne deteksjonen av tidligere mutasjoner og kromosomale avvik som påvirker dette gen til-late f.eks., som en anvendelsesmulighet, identifikasjonen av risikopersoner (0,5-1% av nyfødte spedbarn rammet av NTM) og iverksettingen av preventive behandlinger (Neumann et al., Nature Genetics, 1994, 6, 357-362; Di Vinci et al., Int. J. Cancer, 1994, 59, 422-426; Moll et al., PNAS, 1995, 92, 4407-4411; Chen et al., Development, 1995, 121, 681-691).

Eksempel XIV

Allelisk studium av SR-p70 genet.

GC og AT allelene identifiseres lett ved Styl restriksjon av PCR produktene av exon 2 (se eksempel XI). Det var således mulig å bestemme, på denne måte, i GC/AT heterozygote indi-vider som bærer neuroblastomtumorer, det tapte SR-p70 allel

(GC eller AT), til tross for tilstedeværelsen av kontaminerende friskt vev.

Overraskende, når den samme analyse gjennomføres på RNA,

vises et enkelt allel uavhengig av tilstedeværelsen, eller

. annet, av en delesjon, og enda mere overraskende til tross for tilstedeværelsen av friskt vev. Dette foreslår at

avtrykket (differensiell ekspresjon av de to allelene) også ville eksistere i det kontaminerende vev.

Por å bekrefte dette, ble de samme analyser gjentatt på RNA stammene fra blodceller fra friske GC/AT heterozygote indi-vider. Kun en av de to typer transkripter ble detektert også i disse celler. Dette resultat bekrefter den observasjon som er gjort på tumorprøver med hensyn til eksistensen av et generalisert genetisk avtrykk ("imprint") for SR-p70 genet.

Betydningene av dette funn er viktig, da det muliggjør at man kan postulere at enkel sporadisk mutasjon som inaktiverer det aktive SR-p70 allel vil føre til et tap i aktivitet, idet dette eventuelt forekommer i alle vevene.

Fravær av nøyaktige data for den biologiske funksjon av SR-p7 0 gjør det ikke mulig å måle følgene av dette tap av SR-p70 aktivitet for cellen. Uansett, dets sterke homologi med det p53 tumor-supprimerende protein, såvel som demonstrasjonen om at SR-p70 er en transkripsjonsfaktor istand til å benytte P21<waf> promoteren, foreslår at dette proteinet spiller en rolle i kontrollen av cellesyklus og i differensiering.

Knudson og Meadows, 1980 (New Eng. J. Med. 302: 1254-56), anser IV-S neuroblastomer for å være en samling av ikke-maligne celler fra nervevevet ("the neural crest") som bærer en mutasjon som interfererer med deres normale differensiering.

Det er tenkelig at tapet av SR-p70 aktivitet, som tapet av p53 kontroll over cellesyklusen, favoriserer forekomsten av cellulære avvik som aneuploidi, amplifikasjon (beskrevet i tilfellet av neuroblastomer) og andre genetiske reorgani-seringer istand til å føre til celletransformasjon (Livingstone et al., 1992, Cell 71:923-25; Yin et al. 1992, Cell 72:937-48; Cross et al. 1995, Science 267:1353-56; Fukasawa et al. 1996, Science 271:1744-47). Neuroblastomer kan følgelig opprinnelig oppstå fra et temporært eller permanent tap av aktivitet av SR-p70, noe som derved favoriserer forekomsten av onkogene hendelser og følgelig tumorprogre-sjon.

I tilfellet av lp36 konstitusjonell delesjon beskrevet av Biegel et al., 1993 (Am. J. Hum. Genet. 52:176-82), forekommer faktisk IV-S neuroblastom og genet som berøres er NBS-1 (SR-p70) .

Som en konklusjon kan man si at det som er beskrevet for neuroblastomer også vil kunne gjelde for andre typer av tumorer, særlig dem forbundet med reorganisering av enden av den korte arm av kromosom 1 (Report 2 international workshop on human chr 1 mapping 1995, Cytogenetics and Cell Genet. 72:113-154). Fra et terapeutisk standpunkt, bør involver-ingen av SR-p70 i forekomsten av tumorer føre til unngåelse av bruk av mutageniske midler innen kjemoterapi, idet man bør huske på risikoen for celletransformasjon med disse produkter, og føre til bruk, fremfor disse produkter, av ikke-muta-gene substanser som stimulerer differensiering.

Hyppigheten av forekomst av GC og AT allelene er dessuten som følger: i befolkningen, hyppighet (AT) = 0,15, og for en prøve av 25 (neuroblastom) pasienter, F (AT) = 0,30. Denne statistikk indikerer at AT allelet vil kunne være en predis-poneringsfaktor.

Claims (29)

1. Renset polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen: a) sekvensen SEQ ID No. 2; b) sekvensen SEQ ID No. 4; c) sekvensen SEQ ID No. 6; d) sekvensen SEQ ID No. 8; e) sekvensen SEQ ID No. 10; f) sekvensen SEQ ID No. 13; g) sekvensen SEQ lp No. 15; h) sekvensen SEQ ID No. 17; og i) sekvensen SEQ ID No. 19.

2. Polypeptid som angitt i krav 1, som omfatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 og SEQ ID No. 19.

3. Polypeptid som angitt i krav 1, som omfatter sekvensen som ligger mellom: - rest 110 og rest 310 i SEQ ID No. 2 eller 6, - rest 60 og rest 2 60 i SEQ ID No. 8.

4. Polypeptid som angitt i krav 1, som resulterer fra en alternativ spleising av messenger RNA av det tilsvarende gen.

5. Polypeptid som angitt i ett eller flere av de foregående krav, som er et rekombinant polypeptid fremstilt i form av et fusjonsprotein.

6., Isolert nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av de foregående krav.

7. Nukleinsyresekvens som angitt i krav 6, som er valgt fra gruppen: a) sekvensen SEQ ID No. 1; b) sekvensen SEQ ID No. 3; c) sekvensen SEQ ID No. 5; d) sekvensen SEQ ID No. 7; e) sekvensen SEQ ID No. 9; f) sekvensen SEQ ID No. 11; g) sekvensen SEQ ID No. 12; h) sekvensen SEQ ID No. 14; i) sekvensen SEQ ID No. 16; og j) sekvensen SEQ ID No. 18.

8. Nukleotidsekvens som angitt i krav 6, som er en sekvens valgt fra SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16 og SEQ ID No. 18 som henholdsvis koder for polypeptidet med sekvenser SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID NO. 17 og SEQ ID No. 19.

9. Klonings- og/eller ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyresekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8.

10. Vektor som angitt i krav 9, som er plasmidet pSEl.

11. Vertscelle, karakterisert ved at den er transfektert med en vektor som angitt i krav 9 eller 10.

12. Vertscelle som angitt i krav 11, som er E. coli MC .1061.

13. Nukleotid probe eller nukleotid primer, karakterisert ved at den hybridiserer spesifikt, under stringente betingelser, med hvilken som helst av sekvensene som er angitt i krav 6 til 8 eller sekvensene komplementære til dem eller de tilsvarende messenger RNAer eller de tilsvarende genene.

14. Probe eller primer som angitt i krav 13, som inneholder minst 16 nukleotider.

15. Probe eller primer som angitt i krav 13, som omfatter hele sekvensen av genet som koder for ett av polypeptidene i krav l.

16. Nukleotid probe eller nukleotid primer, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen av følgende oligonukleotider eller sekvenser som er komplementære til dem:

17. Anvendelse av en sekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 for fremstilling av oligonukleotidprimere for sekvenseringsreaksjoner eller spesifikke amplifikasjonsreaksjoner i henhold til PCR teknikken eller en hvilken som helst variant av denne sistnevnte.

18. Nukleotid primerpar, karakterisert ved at det omfatter primere valgt fra gruppen som utgjøres av følgende sekvenser: a) sense primer: GCG AGC TGC CCT CGG AG (SEQ ID No. 20) antisense primer: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G (SEQ ID No. 21) b) sense primer: GCC ATG CCT GTC TAC AAG (SEQ ID No. 22) antisense primer: ACC AGC TGG TTG ACG GAG (SEQ ID No. 23) c) sense primer: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG SEQ ID No. 24) antisense primer: GTG GAT CTC GGC CTC C (SEQ ID No. 25) d) sense primer: AGG CCG GCG TGG GGA.AG (SEQ ID No. 26) antisense primer: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID No. 27) e) sense primer: GCG GCC ACG ACC GTG A (SEQ ID No. 28) antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID No. 29) f) sense primer: CTG TAC GTC GGT GAC CCC (SEQ ID No. 30) antisense primer: TCA GTG GAT CTC GGC CTC (SEQ ID No. 31) g) sense primer: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (SEQ ID No. 32) antisense primer: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID No. 29) h) sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T) antisense primer: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C (SEQ ID No. 33) i) sense primer: CCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T) antisense primer: CCA GGA CAG GCG CAG ATG (SEQ ID No. 34) j) sense primer: CCCCCCCCCCCCCCCN (hvor N er G, A eller T) antisense primer: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G. (SEQ ID No. 27) k) senseprimer: CAG CTA CTC CAG GGA TGC (SEQ ID No. 37) antisense primer: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC (SEQ ID No. 38) og 1) sense primer: CAG GCC CAC TTG CCT GCC (SEQ ID No. 39) antisense primer: CTG TCC CCA AGC TGA TGA G (SEQ ID No. 40) .

19. Anvendelse av en sekvens som er angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8- for fremstilling av diagnostiske nukleotid prober eller primere, eller av antisense frekvenser som er anvendbare innen genterapi.

20. Anvendelse av nukleotid primere som angitt i ett eller flere av kravene 13 til 16 for sekvensering.

21. Anvendelse av en probe eller primer som er angitt i ett eller flere av kravene 13 til 16 som et in vitro diagnostisk verktøy for deteksjonen, ved hybridiseringsforsøk, av nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, i biologiske prøver, eller for demonstrering av variantsynteser eller av genetiske abnormiteter.

22. Fremgangsmåte for in vitro diagnose for deteksjon av variantsynteser eller av genetisk abnormiteter i nukleinsyresekvensene som koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den omfatter: - en nukleotid probe som er angitt i ett eller flere av kravene 13 til 16 bringes i kontakt med en biologisk prøve under betingelser som tillater dannelsen av et hybridiseringskompleks mellom den nevnte probe og den ovennevnte nukleotidsekvens, om passende etter et innledende trinn med amplifikasjon av den ovennevnte nukleinsyresekvens, - det eventuelt dannede hybridiseringskompleks detekteres, - om passende, gjennomføres sekvensering av nukleotidsekvensen som danner hybridiseringskomplekset med proben i henhold til oppfinnelsen.

23. Anvendelse av en sekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 for fremstilling av et rekombinant polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5.

24. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant SR-p7 0 protein, karakterisert ved at transfekterte celler som angitt i krav 11 eller 12 dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 eller SEQ ID No. 19, ellér ethvert biologisk aktivt fragment, og ved at det nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

25. Mono- og polyklonale antistoffer eller deres fragmenter, kimære antistoffer eller immunkonjugater, karakterisert ved at de er istand til spesifikt å gjenkjenne et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4.

26. Fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet, en mutasjon, en delesjon, et innskudd, et tap av heterozygotisitet eller en genetisk abnormitet i SR-p70 genet, karakterisert ved at det anvendes minst en nukleotidsekvens som er angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8.

27. Fremgangsmåte for å bestemme en allelisk variabilitet i SR-p70 genet i posisjon -3 0 og -20 i forhold til initierings ATG av exon 2 som kan være involvert i patologier, karakterisert ved at den i det minste omfatter: - et trinn hvorunder exon 2 av SR-p70 genet som bærer targetsekvensen amplifiseres ved PCR ved anvendelse av et par av oligonukleotid primere som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8, - et trinn under hvilket de amplifiserte produkter behandles med et restriksjonsenzym hvis spaltingssete svarer til det søkte allel, - et trinn under hvilket minst ett av produktene fra enzymreaksjonen detekteres eller måles.

28. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at som aktiv bestanddel omfatter et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4.

29. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 28 som omfatter et polypeptid som angitt i krav 2.