JP3447301B2

JP3447301B2 - 精製ＳＲ―ｐ７０タンパク質

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Publication number: JP3447301B2
Application number: JP52738097A
Authority: JP
Inventors: カピュ，ダニエル; フェララ，パスクアル; カガ，アーメ・ムウラ
Original assignee: サノフィーサンテラボ
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2003-09-16
Anticipated expiration: 2017-02-03
Also published as: US7838648B2; US20050202016A1; FR2744455A1; DE69739346D1; US7557187B2; EP0877758A2; NO983537L; MX9806041A; AU1727597A; TW515802B; EP0877758B1; FR2744455B1; ES2322971T3; ZA97835B; NO983537D0; BR9710919A; US20110020951A1; PT877758E; WO1997028186A1; NO323285B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、p53タンパク質の遺伝子に関連した腫瘍−
抑制遺伝子ファミリーの新規な核酸配列、およびその対
応するタンパク質配列に関する。

本発明はまた、特にアポトーシスまたは細胞形質転換
の現象に連関した病理学の分野において、これらの配列
の予防、治療および診断上の適用にも関する。

腫瘍−抑制遺伝子は、発癌現象に対する保護において
鍵となる役割を果たし、これらの遺伝子のうち１つの喪
失、その不活性化またはその機能不全を引き起こすこと
が可能ないずれかの修飾は、腫瘍形成特性を有し、それ
により悪性腫瘍の発達に都合のよい条件を創造する。

本発明の発明者らは、新規な遺伝子の転写産物、なら
びにその対応するタンパク質を同定した。該遺伝子、SR
−p70は、その抗腫瘍活性がその転写因子活性に関係す
るp53腫瘍−抑制遺伝子および、さらにとりわけ細胞死
のメカニズムにおける手段となるBaxならびにBcl−２遺
伝子の活性上で働く制御に関係する。

したがって、本発明は、精製されたSR−p70タンパク
質、またはその生物学的に活性なフラグメントに関す
る。

本発明はまた、該タンパク質またはそれらの生物学的
に活性なフラグメントをコードする単離された核酸配
列、およびこれらの配列から得られた特異的オリゴヌク
レオチドにも関する。

さらに、それは、前記で定義されたヌクレオチド配列
の少なくとも１つを含むクローニングおよび／または発
現ベクター、および該ヌクレオチド配列のうち１つの複
製および／または発現を可能にする条件下で該クローニ
ングおよび／または発現ベクターによってトランスフェ
クトされる宿主細胞に関する。

トランスフェクトされた宿主細胞による組換えSR−p7
0タンパク質またはそれらの生物学的に活性なフラグメ
ントの製造方法もまた、本発明の一部を成す。

本発明はまた、前記で定義されたタンパク質に特異的
な抗体または抗体誘導体も含む。

さらに、それは、免疫組織化学的技法によって腫瘍中
のSR−p70タンパク質の蓄積を測定すること、または患
者の血清中の該タンパク質に向けられた自己抗体を明ら
かにすることのいずれかによる癌の検出方法に関する。

本発明はまた、SR−p70活性、例えばSR−p70を巻き込
むタンパク質−タンパク質相互作用のいずれかの阻害剤
または活性剤にも関する。

また、イン・ビボでSR−p70遺伝子の発現を調節でき
る、前記の核酸配列に特異的なアンチセンスオリゴヌク
レオチド配列にも関する。

最後に、本発明は、アポトーシス現象または形質転換
の復帰現象を調節する目的で、例えば本発明によるタン
パク質のコーディング配列を運搬することが可能な不活
性化されたウイルスベクターのごときベクターを該タン
パク質に関して不完全な細胞中へ注入する遺伝子治療の
方法を含む。

本発明の主題は：ａ）配列番号２の配列；ｂ）配列番号４の配列；ｃ）配列番号６の配列；ｄ）配列番号８の配列；ｅ）配列番号10の配列；ｆ）配列番号13の配列；ｇ）配列番号15の配列；ｈ）配列番号17の配列；ｉ）配列番号19の配列；ｊ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８、配列番号10、配列番号13、配列番号15、配列番号17
または配列番号19から導き出される生物学的に活性な配
列から選択されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプ
チドである。

本発明の記載において、以下の定義： −SR−p70タンパク質：配列番号２、配列番号４、配列
番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号13、配列番
号15、配列番号17または配列番号19の配列から選択され
るアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは該ポリペ
プチドのいずれかの生物学的に活性なフラグメントまた
は誘導体； −誘導体：配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８、配列番号10、配列番号13、配列番号15、配列番
号17または配列番号19の配列のポリペプチドのいずれか
の変異ポリペプチド、あるいは配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号1
3、配列番号15、配列番号17または配列番号19の配列の
遺伝学的および／または化学的性質の修飾の結果生じ
る、すなわち、１個のアミノ酸または限定数のアミノ酸
の突然変異、欠失、付加、置換および／または化学的修
飾によって得られるいずれかの分子、ならびにＤエナン
チオマーの形態において１またはそれ以上のアミノ酸を
含有する、いずれかのイソ型配列、すなわち、配列番号
２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号1
0、配列番号13、配列番号15、配列番号17または配列番
号19の配列と、あるいはそのフラグメントまたは修飾さ
れた配列のうちの１つと同一の配列、生物学的活性を与
える性質のうち少なくとも１つを保持している該変異、
修飾またはイソ型配列； −生物学的活性:DNAへの結合および／または転写因子活
性を働かせることおよび／または分化およびアポトーシ
スの細胞サイクルの制御に関係することが可能であり、
および／または配列番号２、配列番号４、配列番号６、
配列番号８、配列番号10、配列番号13、配列番号15、配
列番号17または配列番号19の配列のポリペプチドに特異
的な抗体による認識が可能であり、および／または該ポ
リペプチドを認識する抗体を誘発することが可能なことが用いられる。

誘導体の製造は異なる目的を有してもよく、特に、DN
Aに対するポリペプチドの親和性またはその転写活性因
子を増大させること、およびその生産レベルを改善する
こと、プロテアーゼに対するその耐性を増大させるこ
と、その生物学的活性を修飾することまたは、それに新
規な薬剤および／または生物学的特性を賦与することを
包含する。

本発明のポリペプチドのなかでも、配列番号６、配列
番号13、配列番号15、配列番号17または配列番号19の配
列を含むヒト起源のポリペプチドが好ましい。配列番号
６の配列に相当する636アミノ酸のポリペプチドは、配
列番号２のポリペプチドに対して97％より大きく同一で
ある。

配列番号２のポリペプチドおよび配列番号４のポリペ
プチドは、同一遺伝子の２個の発現産物であって、同じ
ことが配列番号８および配列番号10に、ならびに配列番
号６、配列番号13、配列番号15、配列番号17または配列
番号19にあてはまる。

実施例に説明するように、配列番号４のポリペプチド
は、配列番号２のポリペプチドをコードする、対応する
遺伝子のより長い転写産物（メッセンジャーRNA）の選
択的スプライシングに関連した配列番号２のペプチドの
プレ成熟末端に相当する。同様に、ヒトにおいて、配列
番号６、配列番号13、配列番号15、配列番号17および配
列番号19に相当するポリペプチドは、Ｎ−および／また
はＣ−末端部分に関してそれらの組成物中で異なり、こ
れは、同じ第１転写産物の選択的スプライシングの結果
である。配列番号10のＮ−末端ペプチド配列は欠失さ
れ、これはそのコーディング転写産物の選択的スプライ
シングに関係している。

有利なことに、本発明は、前記のポリペプチドのうち
１個のDNA結合ドメインに対応するポリペプチドに関す
る。

該ドメインは、配列番号２または６の残基110〜残基3
10、および配列番号８の残基60〜残基260に位置する配
列に相当する。

また本発明の主題は、SR−p70タンパク質をコードす
る核酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントも
しくは誘導体にも関する。

さらに好ましくは、本発明の主題は：ａ）配列番号１の配列；ｂ）配列番号３の配列；ｃ）配列番号５の配列；ｄ）配列番号７の配列；ｅ）配列番号９の配列；ｆ）配列番号11の配列；ｇ）配列番号12の配列；ｈ）配列番号14の配列；ｉ）配列番号16の配列；ｊ）配列番号18の配列；ｋ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号
７、配列番号９、配列番号11、配列番号12、配列番号1
4、配列番号16または配列番号18またはそれらに相補的
な配列と特異的にハイブリダイズすること、あるいはそ
れらの近位配列と特異的にハイブリダイズすることが可
能な核酸配列；ｌ）遺伝コードの縮重の結果として配列ａ）、ｂ）、
ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）また
はｋ）から誘導される配列から選択される単離された核酸配列である。

好ましい具体例によると、本発明の主題は、各々、配
列番号６、配列番号13、配列番号15、配列番号17および
配列番号19のヒトタンパク質のcDNAに対応する配列番号
５、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番
号18のヌクレオチド配列である。

本発明の異なるヌクレオチド配列は、人工のものかま
たはそうでないものであってもよい。それらは、配列番
号１、３、５、７、９、11、12、14、16または18の配列
に基づいて調製されたプローブを用いる、配列のライブ
ラリーのスクリーニングによって得られるDNAまたはRNA
配列であり得る。かかるライブラリーは、当業者に既知
の分子生物学の伝統的方法によって調製され得る。

また、本発明によるヌクレオチド配列は、化学的合成
によってか、または別法でライブラリーのスクリーニン
グによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を
包含する混合の方法によっても調製され得る。

これらのヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチド
もしくはその生物学的に活性なフラグメントをコードす
るゲノムDNAまたはメッセンジャーRNAの核酸配列に強力
におよび特異的にハイブリダイズすることが可能なヌク
レオチドプローブの製造を可能にする。かかるプローブ
もまた、本発明の一部を成す。それらは、ハイブリダイ
ゼーション実験により、生物学的試料における本発明の
ポリペプチドに特異的な転写産物の検出のための、ある
いは異常型合成のまたは、ヘテロ接合性の喪失または多
形、突然変異もしくは異なるスプライシングの結果生じ
る遺伝子再配列のごとき遺伝子異常の証明のためのイン
・ビトロでの診断道具として使用され得る。

本発明のプローブは、少なくとも10ヌクレオチドを含
み、最も多くは、SR−p70遺伝子のまたは例えばコスミ
ド中に含まれるそのcDNAの配列全体を含む。

最短プローブ、すなわちおよそ10〜20ヌクレオチドの
プローブのなかでも、適するハイブリダイゼーション条
件は、当業者によって通常使用されるストリンジェント
な条件に一致する。

使用される温度は、好ましくはT_m−５℃〜T_m−30℃で
あって、さらに好ましいものとしてT_m−５℃〜T_m−10℃
であり、T_mは融解温度であり、対になったDNA鎖の50％
が分離する温度である。

ハイブリダイゼーションは、好ましくは、詳細には6x
SSC溶液のごとき高イオン強度の溶液中で処する。

有利には、使用されるハイブリダイゼーション条件は
以下の通りである： −温度:42℃、 −ハイブリダイゼーションバッファー：実施例IIIに記
載のように、6xSSC、5xデンハルト0.1％SDS。

有利には、これらのプローブは以下のオリゴヌクレオ
チドまたはそれらに相補的な配列によって表される：好ましくは、本発明のプローブは使用前に標識化す
る。このために、いくつかの技法は当業者の能力内であ
る（蛍光、放射能、化学発光、酵素等の標識化）。

これらのヌクレオチドプローブが使用されるイン・ビ
トロでの診断方法は、本発明の主題に包含される。

これらの方法は、前記で与えられた定義にしたがっ
て、例えば、SR−p70タンパク質をコードする核酸のヌ
クレオチド配列における、異常な合成（例えば、転写産
物の蓄積）、またはヘテロ接合性の喪失および遺伝子再
配列のごとき遺伝子異常ならびに点突然変異の検出に関
連する。

また、本発明のヌクレオチド配列は、配列決定反応ま
たはいわゆるPCR技法もしくはそのいずれかの変法（リ
ガーゼ鎖反応（LCR）等）による特異的増幅反応のため
のオリゴヌクレオチドプライマーの製造および使用にも
有用である。

好ましいプライマー対は、ヌクレオチド配列：配列番
号1:2874個のヌクレオチドのサル配列、および配列番号
5:ヒトSR−p70a cDNA、詳細にはATG翻訳開始コドンの上
流およびTGA翻訳終止コドンの下流から選択されるプラ
イマーから成る。

有利には、これらのプライマーは以下の対によって表
される：これらのプライマーは、各々： −配列番号20の場合、配列番号１のヌクレオチド番号12
4〜ヌクレオチド番号140および配列番号５のヌクレオチ
ド番号１〜ヌクレオチド番号17、 −配列番号21の場合、配列番号１のヌクレオチド番号22
80〜ヌクレオチド番号2262および配列番号５のヌクレオ
チド番号2156〜ヌクレオチド番号2138、 −配列番号22の場合、配列番号１のヌクレオチド番号68
4〜ヌクレオチド番号701、 −配列番号23の場合、配列番号１のヌクレオチド番号14
47〜ヌクレオチド番号1430および配列番号５のヌクレオ
チド番号1324〜ヌクレオチド番号1307、 −配列番号24の場合、配列番号１のヌクレオチド1434〜
ヌクレオチド1454および配列番号５のヌクレオチド1311
〜ヌクレオチド1331、 −配列番号25の場合、配列番号１のヌクレオチド2066〜
ヌクレオチド2051および配列番号５のヌクレオチド1940
〜ヌクレオチド1925、 −配列番号26の場合、配列番号５のヌクレオチド16〜ヌ
クレオチド32、 −配列番号27の場合、配列番号５のヌクレオチド503〜
ヌクレオチド485、 −配列番号28の場合、配列番号11のヌクレオチド160〜
ヌクレオチド176、 −配列番号29の場合、配列番号５のヌクレオチド1993〜
ヌクレオチド1976、 −配列番号30の場合、配列番号11のヌクレオチド263〜
ヌクレオチド280、 −配列番号31の場合、配列番号５のヌクレオチド1943〜
ヌクレオチド1926、 −配列番号32の場合、図22に記載されたヌクレオチド配
列のヌクレオチド128〜ヌクレオチド145、 −配列番号33の場合、配列番号５のヌクレオチド1167〜
ヌクレオチド1149、 −配列番号34の場合、配列番号５のヌクレオチド928〜
ヌクレオチド911、 −配列番号35の場合、配列番号５のヌクレオチド677〜
ヌクレオチド659、 −配列番号36の場合、配列番号５のヌクレオチド1605〜
ヌクレオチド1587、 −配列番号37の場合、図13に記載のヌクレオチド配列の
ヌクレオチド１〜ヌクレオチド18、 −配列番号38の場合、図13に記載のヌクレオチド配列の
ヌクレオチド833〜ヌクレオチド813、 −配列番号39の場合、図13に記載のヌクレオチド配列の
ヌクレオチド25〜ヌクレオチド42、 −配列番号40の場合、図13に記載のヌクレオチド配列の
ヌクレオチド506〜ヌクレオチド488 に及ぶ配列に相当する。

さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、遺伝子治
療における用途、詳細にはアポトーシスのおよび形質転
換の逆転の現象を制御するための用途を有し得る。

さらに、本発明によるヌクレオチド配列は、SR−p70
タンパク質なる語に与えられた定義にしたがって、組換
えSR−p70タンパク質の製造のために使用してもよい。

これらのタンパク質は、当業者に既知の組換え産物製
法の技術によって、前記で定義されたヌクレオチドから
製造してもよい。この場合、使用されるヌクレオチド配
列は、宿主細胞内でのその発現を可能にするシグナルの
制御下に置かれる。

組換えタンパク質の製造に有効なシステムは、例えば
プラスミドまたはウイルス起源のベクターおよび適合性
宿主細胞を自由にできる必要がある。

細胞宿主は、バクテリアのごとき原核生物系、または
例えば酵母、昆虫細胞、CHO細胞（チャイニーズハムス
ター卵巣細胞）のごとき真核細胞系あるいは有利に使用
できるいずれかの他の系から選択され得る。本発明のタ
ンパク質の発現のための好ましい細胞宿主は、イー・コ
リ（E.coli）細菌、詳細にはMC 1061株（Clontec）から
成る。

ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終止シグ
ナルならびに適当な転写調節領域も含まなければならな
い。それは細胞中に安定に維持されることが可能でなけ
ればならず、適当には翻訳されたタンパク質の分泌を規
定する特別のシグナルを有する。

これらの種々の制御シグナルは、使用される細胞宿主
にしたがって選択される。そのために、本発明によるヌ
クレオチド配列を、選択された宿主内で自主的に複製し
ているベクターまたは選択された宿主に組み込まれるベ
クター中に挿入してもよい。かかるベクターは、当業者
によって一般的に使用される方法によって調製され、そ
れから得られるクローンは、例えばエレクトロポーレー
ションのごとき標準的な方法によって適当な宿主中へ導
入され得る。

少なくとも１個の前記で定義したヌクレオチド配列を
含有するクローニングおよび／または発現ベクターもま
た、本発明の一部を成す。

好ましいクローニングおよび発現ベクターは、イー・
コリにおけるクローニングベクター（イー・コリにおけ
る複製起点およびプラスミドpTZ 18Rから生じるアンピ
シリン耐性遺伝子）としておよび動物細胞における発現
ベクター（プロモーター、イントロン、ポリアデニル化
部位、SV40ウイルスの複製起点）としての両方の使用に
必要なエレメント、ならびに配列決定の目的でそれを一
本鎖としてコピーできるエレメント（ファージf1の複製
起点）を含有するプラスミドpSE1である。

該プラスミドの特徴は、ヨーロッパ特許出願第050657
4号において記載されている。

その構造およびまた本発明の核酸配列から生じるcDNA
の組み込みは、さらに、下記の実施例に記載する。

好ましい具体例によると、本発明のタンパク質は融合
タンパク質の形態、詳細にはグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（GST）と融合したタンパク質の形態であ
る。この場合に指定される発現ベクターは、プラスミド
ベクターpGEX−4T−３（Pharmacia ref−27.4583）が代
表的である。

さらに、本発明は、これら前記のベクターによってト
ランスフェクトされる宿主細胞に関する。これらの細胞
は、前記で定義されたようにベクター中へ挿入されたヌ
クレオチド配列を宿主細胞中に導入し、次いでトランス
フェクトしたヌクレオチド配列の複製および／または発
現を可能にする条件下で該細胞を培養することによって
得られ得る。

これらの細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号
６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号1
4、配列番号16または配列番号18の組換えポリペプチ
ド、あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは
誘導体の製造方法において使用できる。

組換え形態における本発明のポリペプチドに製造方法
は、それ自体が本発明に包含され、トランスフェクトさ
れた細胞を配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番
号16または配列番号18の組換えポリペプチドあるいはそ
の生物学的に活性なフラグメントまたは誘導体の発現を
可能にする条件下で培養すること、および該組換えポリ
ペプチドを回収することを特徴とする。

使用される精製方法は、当業者にとって既知である。
組換えポリペプチドは、ライゼートおよび細胞抽出物か
らあるいは培養培地上清から、分画、クロマトグラフィ
ー法、特異的モノ−またはポリクローナル抗体を用いる
免疫アフィニティー技法等のごとき、個々でまたは組み
合わせて用いられる方法によって精製され得る。好まし
い変法は、「担体」タンパク質に融合された組換えポリ
ペプチド（キメラタンパク質）を製造することから成
る。該システムの利点は、組換え産物のタンパク質分解
における安定化および減少、イン・ビトロでの再中和の
間の溶解性における増加および／または融合相手が特異
的リガンドに対するアフィニティーを有する場合の精製
の簡略化を可能にすることである。

有利なことに、本発明のポリペプチドはグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼとＮ末端位置で融合される（Ph
armacia“GST"system）。この場合、融合産物をGSTの酵
素活性法によって検出し、定量する。使用される比色試
薬は、グルタチオンアクセプター、GSTの基質である。
組換え産物をグルタチオン分子を予め結合させたクロマ
トグラフィー支持体上で精製する。

前記で与えられた定義によりSR−p70タンパク質を特
異的に認識可能なモノ−またはポリクローナル抗体もま
た、本発明の一部を成す。ポリクローナル抗体は、標準
法により、例えば、前記の方法にしたがう遺伝子組換え
によって製造されたタンパク質に対して免疫した動物の
血清から得てもよい。

モノクローナル抗体は、ＫhlerおよびMilstein、Na
ture、1975、256,495−497によって記載された伝統的な
ハイブリドーマ培養法によって得てもよい。

有利な抗体は、配列番号２または６の残基110〜残基3
10、あるいは配列番号８の残基60〜残基260に位置する
中央領域に向けられた抗体である。

本発明による抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体
またはFabおよびＦ（ab'）_２フラグメントである。ま
た、それらはイムノコンジュゲートまたは標識化抗体の
形態をとる。

さらに、組換えポリペプチドの精製のためのそれらの
使用のほかにも、本発明の抗体、特にモノクローナル抗
体は、生物試料においてこれらのポリペプチドを検出す
るためにも使用し得る。

よって、それらは、例えば免疫蛍光法、金標識（gold
labelling）または酵素イムノコンジュゲート法によっ
て、特異的組織のセクション上でのSR−p70タンパク質
の発現の免疫細胞化学的または免疫組織化学的分析の方
法を構成する。

詳細には、それらは、特定の組織または生物試料にお
けるSR−p70タンパク質の異常な蓄積を明らかにするこ
とを可能にし、それらを癌を検出することあるいは既存
の癌の進行または緩解をモニターするのに有用にする。

より一般的には、本発明の抗体は、SR−p70タンパク
質の発現が観察されなければならないいずれかの状況に
おいて有利に従事され得る。

したがって、本発明はまた、生物試料由来のSR−p70
タンパク質の発現または異常な蓄積と相関した病状、詳
細には発癌現象のイン・ビトロでの診断方法であって、
少なくとも１個の本発明の抗体を、SR−p70タンパク質
と該抗体または複数の抗体間の特異的免疫学的複合体の
可能な形成をさせる条件下で該生物試料に接触させるこ
と、およびおそらく形成される特異的免疫学的複合体を
検出することを特徴とする方法にも関する。

本発明はまた、生物学的試料におけるSR−p70タンパ
ク質の異常な発現または蓄積のイン・ビトロでの診断の
ための、および／または該試料中の該タンパク質の発現
レベルの測定のためのキットであって： −支持体に結合されていてもよい、少なくとも１個のSR
−p70タンパク質に特異的な抗体、 −SR−p70タンパク質および該抗体間の特異的抗原−抗
体複合体の形成の視覚化の方法、および／またはこれら
の複合体の定量化の方法を含むキットにも関する。

本発明はまた、個体の血清中のSR−p70タンパク質に
向けられた自己抗体を検出することによる腫瘍形成の初
期診断の方法にも関する。

初期診断のかかる方法は、個体から得られた血清試料
を、本発明のポリペプチドと血清試料中におそらく存在
する自己抗体間の特異的免疫学的複合体の形成を可能に
する条件下で、支持体に結合されていてもよい該ポリペ
プチドに接触させること、およびおそらく形成される特
異的免疫学的複合体を検出することを特徴とする。

本発明の主題はまた、病状に伴われ得る対立遺伝子変
異性、突然変異、欠失、挿入、ヘテロ接合性の喪失また
はSR−p70遺伝子の遺伝子異常の決定方法であって、少
なくとも１個の前記のヌクレオチド配列を利用する方法
でもある。対立遺伝子変異性、突然変異、欠失、挿入、
ヘテロ接合性の喪失またはSR−p70遺伝子の遺伝子異常
の決定方法のなかでも、好ましいものは、前記で定義し
たヌクレオチド配列の１対のプライマーを用いる、おそ
らく多形、突然変異、欠失または挿入を示すSR−p70の
標的核酸配列のPCR増幅の少なくとも１工程、増幅産物
が適当な制限酵素を用いて処理される工程および少なく
とも１個の酵素反応産物を検出またはアッセイする工程
を含むことを特徴とする方法である。

本発明はまた、活性成分として前記の定義に対応する
ポリペプチドを、好ましくは可溶形態で、医薬上許容さ
れるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物も含む。

かかる組成物は、増殖および細胞分化の制御のレベル
で発癌現象を処理することに対する新規なアプローチを
提供する。

好ましくは、これらの組成物は全身投与、好ましくは
静脈、筋内、皮膚内または経口投与できる。

それらの最適な投与様式、投与用量および医薬投与形
態は、患者に適当な治療的処理を確立するにあたり一般
的に憶えられた基準、例えば患者の年齢または体重、症
状の重さ、治療に対する許容および観察される副作用等
にしたがって決定され得る。

最後に、本発明は、不活性化ウイルスベクター法によ
ってSR−p70タンパク質をコードするヌクレオチド配列
を標的細胞へトランスフェクトする遺伝子治療の方法を
含む。

本発明の他の特徴および利点は、説明は下記される実
施例および図面とともに残りの記載に見られる。

図面の説明図1:サルSR−p70a cDNA（配列番号１に相当する）のサ
ルp53 cDNAの核酸配列との核酸比較。

図2:サルSR−p70aのサルp53タンパク質とのタンパク質
比較。（sw:p53−cerae）図3:サルSR−p70aおよびb cDNA（各々、配列番号１およ
び配列番号３に相当する）の核酸配列比較。

図4:サルSR−p70aの核酸配列および推定タンパク質配
列。

図5:サルSR−p70bの部分核酸配列および完全な推定タン
パク質配列。

図6:ヒトSR−p70aの部分核酸配列および推定の完全タン
パク質配列（配列番号５に相当する）。

図7:マウスSR−p70cの部分核酸配列および完全な推定タ
ンパク質配列（配列番号７に相当する）。

図8:マウスSR−p70aの部分核酸配列および部分的な推定
タンパク質配列（配列番号９に相当する）。

図9:サル（ａおよびｂ）、ヒト（ａ）およびマウス（ａ
およびｃ）SR−p70 cDNAから推定したタンパク質の複数
の配列。

図10a:SR−p70タンパク質のイムノブロット。

図10b:内在性SR−p70タンパク質の検出。

図11:ヒトSR−p70遺伝子の染色体位置。p36領域におい
て、シグナルが染色体１上に現れる。

図12:SR−p70遺伝子のゲノム構造およびp53遺伝子のゲ
ノム構造との比較。SR−p70a（配列の上段）およびp53
（下段）のヒトタンパク質配列は、それらがコードされ
ている各々のエキソンに基づくペプチドに分けられる。
矢印のそばの数字は、対応するエキソンの番号付に相当
する。

図13:SR−p70イントロン１の3'末端からエキソン３の5'
末端のヒトゲノム配列。イントロンをボックスで囲む。
123および133位置に、２つの可変核酸位置を配置する
（123にてＧ→Ａおよび133にてＣ→Ｔ）。Sty I酵素の
制限部位に下線を付す（133位置、542位置および610位
置にてＣの代わりにＴがある場合、130位置）。矢印は
実施例XIに使用される核酸プライマーを示す。

図14:SR−p70dおよびSR−p70aのヒトcDNAの5'領域の核
酸比較。

図15:ヒトSR−p70a、ｂ、ｄ、ｅおよびｆに対応する核
酸配列の複数の配列。

図16:ヒトSR−p70（ａ、ｂ、ｄ、ｅおよびｆ）から推定
されるタンパク質の複数の配列。

図17:ヒトSR−p70aの部分核酸配列および部分推定タン
パク質配列。太字の２個の塩基は、２個の可変位置に対
応して特徴付けられる（図６参照）。該配列は、図６に
存在するよりも多くの完全非コーディング5'領域を有す
る。

図18:PCR増幅後のSR−p70a転写産物の分析。

レーンM:1kbはしご状（GIBCO−BRL）分子量マーカーレーン1:HT29系統レーン3:SK−Ｎ−AS系統レーン5:UMR−32系統レーン7:U−373MG系統レーン9:SW480系統レーン11:CHP212系統レーン13:SK−Ｎ−MC系統レーン２、４、６、８、10、12、14:各々レーン１、
３、５、７、９、11および13に対応する負の対照（RT−
PCR反応における逆転写の欠如）図19:A:PCRによって増幅されたゲノムフラグメントのア
ガロースゲル電気泳動による分析（イントロン１の3'末
端からエキソン３の5'末端まで）。レーンの番号は、対
照の番号に対応する。レーンM:分子量マーカー（1kbは
しご状）。

B:制限酵素Sty IでＡ部分と同じ試料を消化後、Ａ
部分と同様の分析。

図20:ヒトSR−p70aを含有するプラスミドpCDNA3の部分
制限地図での図式表示。

実施例Ｉ COS−３細胞からのSR−p70 cDNAのクローニング 1.COS−３細胞の培養 COS−３細胞（SV40ウイルスＴ抗原で形質転換したア
フリカングリーンモンキー腎細胞）を、2mML−グルタミ
ンを含有し、50mg/lのゲンタマイシンおよび５％の胎児
ウシ血清（GIBCO−BRLリファレンス10231−074）で補足
されたDMEM培地（GIBCO−BRLリファレンス41 965−04
7）中で、やや集密するまで培養する。

2.メッセンジャーRNAの調製ａ）メッセンジャーRNAの抽出細胞を以下の方法：付着細胞を２回PBSバッファー（リン酸緩衝化セーラ
イン、リファレンス04104040−GIBCO−BRL）で洗浄し、
次いでゴムスクレーパーでこすり落とし、遠心分離するにおいて回収する。

細胞ペレットを以下の組成:4Mチオシアン酸グアニジ
ン;25mMクエン酸ナトリウムpH7;0.5％サルコシル;0.1M
β−メルカプトエタノールの溶菌バッファー中に懸濁す
る。懸濁液をUltra−Turrax No.231256ソニケーター（J
anke and Kundel）を用いて最大出力で１分間音波処理
する。酢酸ナトリウムpH4を0.2Mの濃度まで加える。溶
液を１容量のフェノール／クロロホルム（5/1 v/v）混
合液で抽出する。水層に含まれたRNAを１容量のイソプ
ロパノールを用いて−20℃で沈殿させる。ペレットを溶
菌バッファーに再懸濁する。溶液をフェノール／クロロ
ホルム混合液で再度抽出し、RNAをイソプロパノールで
沈殿させる。ペレットを70％および次いで100％エタノ
ールで洗浄後、RNAを水中に再懸濁する。

ｂ）RNAのポリ（Ａ）^＋フラクションの精製 RNAのポリ（Ａ）^＋フラクションの精製をDYNAL Dynab
eads oligo（dT）₂₅キット（リファレンス610.05）を用
いて製造者推奨のプロトコールにしたがって行う。原理
は、オリゴヌクレオチドポリ（dT）₂₅が結合する超磁性
ポリスチレンビーズの使用に基づく。RNAのポリ（Ａ）
^＋フラクションをビーズに結合したオリゴ（dT）₂₅とハ
イブリダイズさせ、それを磁性支持体上にトラップす
る。

3.相補的DNAライブラリーの作成ａ）相補的DNAの調製工程２の最後に得られたCOS−３細胞由来のポリ
（Ａ）⁺RNA0.5μｇから、［³²P］dCTP−標識化１本鎖相
補的DNAを以下の配列（BamH I部位を含む）：の合成プライマーを用いて、デオキシヌクレオチド三リ
ン酸の各0.5mM、30μCiの［α−³²P］dCTPおよび30UのR
Nasin（Promega）を含有する組成:50mMトリス−HCl pH
8.3、6mM MgCl₂、10mM DDT、40mM KClのバッファー30μ
ｌ容量中で調製する（得られた相補的DNAは、3000dpm/n
gの比活性を有する）。37℃にて１時間、次いで50℃に
て10分、次いで再度37℃にて10分、200ユニットの逆転
写酵素RNAaseH^-（GIBCO−BRLリファレンス8064A）とと
もにインキュベーション後、４μｌのEDTAを加える。

ｂ）RNA鋳型のアルカリ加水分解６μｌの2N NaOH溶液を加え、次いで混合物を65℃に
て５分インキュベートする。

ｃ）Sephacryl S−400カラムでの精製合成プライマーを除去するために、相補的DNAをTEバ
ッファー中で平衡化したSephacryl S−400（Pharmaci
a）の1mlのカラムに付して精製する。

１容量のクロロホルムで抽出後、最初の２個の放射性
フラクションをプールし、1/10容量の10M酢酸アンモニ
ウム溶液および2.5容量のエタノールで沈殿させる。

ｄ）dGのホモポリマー添加相補的DNAを20ユニットのターミナルトランスフェラ
ーゼ酵素（Pharmacia 27073001）を用いてdG尾部を有す
る3'末端にて伸長させる。混合物を20μｌの組成:30mM
トリス−HCl pH7.6、1mM塩化コバルト、140mMカコジル
酸、0.1mM DTT、1mM dGTPのバッファー中で37℃にて15
分間インキュベートし、次いで２μｌの0.5M EDTAを加
える。

ｅ）工程ｂ）およびｃ）を再び繰り返す。

ｆ）アダプター存在下でのクローニングベクターpSE1
（EP506,574）および相補的DNAの対合混合物を遠心分離し、ペレットを33μｌのTEバッファ
ー中に溶解し、５μｌ（125ng）のクローニングベクタ
ーpSE1、１μｌ（120ng）の以下の配列（Apa I部位を含
む）：のアダプターおよび10μｌの200mM NaCl溶液を加え、反
応混合物を65℃にて５分間インキュベートし、次いで室
温まで冷却させる。

ｇ）連結反応クローニングベクターおよび１本鎖cDNAを32.5ユニッ
トのファージT4 DNAリガーゼ酵素（Pharmaciaリファレ
ンス27087002）とともに100μｌの容量中で15℃にて一
晩、組成:50mMトリス−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、1mM AT
Pのバッファー中で連結反応させる。

ｈ）cDNAの第２鎖の合成タンパク質をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽
出によって除去し、1/10容量の10mM酢酸アンモニウム溶
液および次いで2.5容量のエタノールを加える。混合物
を遠心分離し、ペレットを組成33mMトリス−酢酸塩pH7.
9、62.5mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウムおよび1m
Mジチオトレイトール（DTT）のバッファー中に溶解し、
相補的DNAの第２鎖を30ユニットのファージT4 DNAポリ
メラーゼ酵素（Pharmaciaリファレンス270718）および1
mMの４デオキシヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP
およびdTTPの混合物ならびに２ユニットのファージT4遺
伝子32タンパク質（Pharmaciaリファレンス27−0213）
を有する30μｌの容量中で37℃にて１時間合成する。混
合物をフェノールで抽出し、フェノールの痕跡をポリア
クリルアミドP10（Biogel P10−200−400メッシュ−リ
ファレンス15011050−Biorad）のカラムを用いて除去す
る。

ｉ）エレクトロポーレーションによる形質転換イー・コリMC 1061細胞を前記で得られた組換えDNA
で、製造者により明示された条件下2.5kVにてBiorad Ge
ne Pulser装置（Biorad）を用いるエレクトロポーレー
ションによって形質転換し、次いでバクテリアを１時
間、組成：バクトトリプトン10g/l;酵母抽出物5g/l;NaC
l10g/lのLB培地（Sambrook op.cit.）として知られる培
地中で生育させる。

独立クローンの数は、1.5％寒天（w/v）および100μg
/mlアンピシリンを加えたLB培地（以後LB寒天培地とい
う）の皿上でのインキュベーションの最初の１時間後、
形質転換の1/1000希釈をプレートに播くことによって測
定する。独立クローンの数は百万である。

ｊ）ライブラリーのcDNAの分析 cDNAの5'領域の核酸配列決定によるライブラリーの個
々のクローンの分析の状況において、SR−p70aと称され
る１クローンは、すでに知られるタンパク質、p53タン
パク質（Genbank X 02469およびX 16384）のcDNAと部分
的ホモロジーを示すことが明らかとなった（図１）。配
列をSangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA;1977,14,5463
−5467の方法を用いるUnited States Biochemicalキッ
ト（リファレンス70770）および／またはApplied Biosy
stemsキット（リファレンス401434および／または40162
8）で作製した。プラスミドDNAをWIZARD minipreparati
onキット（PromegaリファレンスA7510）から調製する。
使用されるプライマーは、cDNAの5'末端に隣接する領域
においてベクターpSE1に対してかまたはcDNAの配列に対
して相補的な16〜22merオリゴヌクレオチドである。第
２のcDNAを下記実施例III.3に記載される技法に類似し
た方法において、BRL“Random Primers DNA labelling
systems"キット（リファレンス18187−013）を用いて³²
Pで標識したSR−p70a DNAを用いて、同じライブラリー
からスクリーニングによって単離した。ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄バッファーを50％ホルムアミドの添
加によって処理する。最後の洗浄を0.1xSSC/0.1％SDS中
で60℃にて行う。該第２配列（SR−p70b cDNA）は第１
配列と同一であるが、内部フラグメントがそれから欠失
されていた（図３）。

2874ヌクレオチド（SR−p70a）および2780ヌクレオチ
ド（SR−p70b）の長さの２個のSR−p70 cDNAは、単一遺
伝子、ヌクレオチド1637および1732間の94塩基の欠失お
よび対応するコードされたタンパク質のプレ成熟末端を
引き起こす選択的スプライシングの産物に相当する。２
個のcDNAから推定されたタンパク質は、各々637アミノ
酸および499アミノ酸を有する（図４および５）。

実施例II HT−29（ヒト結腸腺癌）細胞由来のSR−p70aタンパク質
の配列の獲得およびcDNAのクローニング１）HT−29細胞の培養細胞を10％の胎児コウシ血清（GIBCO 10081−23）お
よび50mg/lのゲンタマイシンを加えたMcCoy's5培地（GI
BCO 26600−023）中でやや集密するまで培養する。

２）相補的DNAの調製メッセンジャーRNAを実施例I.2における記載の通りに
調製する。cDNAを実施例I.3における記載に類似の方法
で、５μｇの全メッセンジャーRNAでポリ（Ｔ）₁₂プラ
イマーを用いて調製する。EDTAで反応を中断させない。

３）いわゆるPCR技法によるヒトcDNAの特異的増幅重合を10％DMSO、0.5mM dNTP、２個の核酸プライマー
を各４μg/mlおよび2.5ユニットのTAQ DNAポリメラーゼ
（Boehringer）の存在下で以下の組成:10mMトリス−HCl
pH8.3、2.5mM MgCl₂、50mM KClのバッファーで最終容
量50μｌ中４μｌのcDNAを用いて行う。プライマー対
は、COS−3 SR−p70クローンの核酸配列、詳細には翻訳
開始ATGの上流および翻訳終止TGAの下流に基づいて選択
し、以下の組成：である。

反応は、94℃/1分、54−60℃/1分30秒および72℃/1分
30秒の30サイクル、次いで72℃/6分の最終サイクルで行
う。

４）ヒトcDNAの配列の獲得第１工程において、PCR産物をSephacryl S−400カラ
ムに付してオリゴヌクレオチドから除去し、次いでポリ
アクリルアミドP10（Bioradリファレンス1504144）カラ
ム上の排除クロマトグラフィーによって脱塩する。配列
決定反応は、cDNAに特異的なオリゴヌクレオチドととも
にApplied Biosystemsキット（リファレンス401628）を
用いて行う。得られた配列は、サルSR−p70aの配列に非
常に類似し、推定タンパク質は636アミノ酸を含む（図
６）。

同様の方法において、ヒト系統または組織から由来の
他の配列をヒトSR−p70のコーディング部分のために、
特に肺または膵臓から得た。これらの配列から推定され
るタンパク質は、HT−29系統の場合に得たものと同一で
ある。

５）プラスミドpCDNA3（Invitrogen V 790−20）中への
ヒトcDNAのクローニング３）で得られたPCR産物およびまたプラスミドを２つ
の制限酵素Kpn IおよびXba Iで消化し、次いでGeneclea
nキット（Bio 101リファレンス3105）を用いる１％アガ
ロースゲル上での移動後に精製する。100ngの挿入断片
および10ngのベクターで連結反応および形質転換（実施
例I.3.gおよびｉに記載された技法）後、組換えクロー
ンを前記のApplied Biosystemsキットを用いる配列決定
によって証明する。

実施例III AtT−20（下垂体腫瘍）細胞由来のマウスSR−p70 cDNA
のクローニング１）AtT−20系統の細胞培養細胞を15％のウマ血清（GIBCO 26050−047）、2.5％
の胎児コウシ血清（GIBCO 10081−073）および50mg/lの
ゲンタマイシンを加えたHam F10培地（GIBCO 31550−02
3）中で、やや集密するまで培養する。

２）相補的DNAライブラリーの調製ライブラリーを実施例I.2および３に記載の通りに前
記で培養された細胞から作製する。

３）ライブラリーのスクリーニングａ）膜の調製ライブラリーのクローンをBiodyne A membranes（PAL
LリファレンスBNNG 132）で被覆したLB寒天培地（ペト
リ皿150mm直径）上に播く。37℃にて一晩後、クローン
を新しい膜上へ接触させることにより転写する。後者を
以下の溶液:0.5N NaOH、1.5M NaClで５分間、次いで0.5
Mトリス−HCl pH8、1.5M NaClで５分間浸漬させた3mm W
hatmanろ紙上に置くことにより処理する。以下のバッフ
ァー:10mMトリス−HCl pH8、10mM EDTA、50mM NaCl、0.
1％SDS、100μg/mlプロテイナーゼＫ中においてプロテ
イナーゼＫで室温にて１時間処理後、膜を2xSSC（クエ
ン酸ナトリウム、NaCl）中で十分に洗浄し、乾燥し、次
いで真空下オーブン中で80℃にて20分間インキュベート
する。

ｂ）プローブの調製サルおよびヒトSR−p70 cDNA配列に基づいて、以下の
組成：のオリゴマーを用いて、第１配列を実施例II.3および４
に記載の通りにAtT−20 mRNA系統から増幅したフラグメ
ント上に製造した。

該配列に基づいて、マウスに特異的なオリゴマーのプ
ローブを選択し、該プローブは以下の組成：を有する。

100ngのプローブを3'末端にて10μｌの以下のバッフ
ァー:30mMトリス−HCl pH7.6、140mMカコジル酸、1mM C
oCl₂、0.1mM DTT中における10ユニットのターミナルト
ランスフェラーゼ（Pharmacia）および100μCiの［α−
³²P］dCTP 3000Ci/ミリモル（AmershamリファレンスPB1
0205）で37℃にて15分間標識化する。取り込まれない放
射能標識化ヌクレオチドをポリアクリルアミドP10（Bio
rad,リファレンス1504144）のカラムに付して除去す
る。得られたプローブは、およそ5x10⁸dpm/μｇの比活
性を有する。

ｃ）プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼ
ーションａ）で調製された膜を6xSSC、5xデンハルト、0.1％SD
S中42℃にて30分間プレハイブリダイズし、次いでｂ）
で調製したプローブの10⁶dpm/ml部分を加えた同じバッ
ファー中で２、３時間ハイブリダイズする。

ｄ）膜の洗浄および曝露膜を室温にて2xSSC/0.1％SDSバッファー中で２度、次
いで56℃にて6xSSC/0.1％SDS中１時間洗浄する。ハイブ
リダイズしたクローンをKODAK XOMATフィルムで視覚化
する。マウスSR−p70を含有する陽性クローンを選択
し、以後SR−p70cと称する。

４）マウスSR−p70の配列決定および該配列の分析配列をApplied Biosystemキット（リファレンス40162
8）を用いて得る。マウスSR−p70c cDNAから推定された
タンパク質配列（図７）は、非常に異なるＮ−末端部分
以外はヒトおよびサル配列と非常に強いホモロジーを示
す（図９参照）。実施例II.3および４に記載の方法と類
似の方法においていわゆるPCR技法を用いて、第２の5'
配列（同じAtT−20ライブラリーから生じる）を得た
（図８）。推定Ｎ−末端タンパク質配列（SR−p70aと称
する配列）は、ヒトおよびサルSR−p70 cDNA（SR−p70
a）から推定された配列に非常に類似する（図９）。よ
ってAtT−20系統は、少なくとも２個のSR−p70転写産物
を提供する。その２つの転写産物は、異なるスプライシ
ングによってＮ−末端部分において異なる。

実施例IV １）イー・コリにおける組換えSR−p70タンパク質の製
造ａ）発現プラスミドの構築これは、サルSR−p70aタンパク質のCOOH−末端部分、
427位置のバリン〜637位置のCOOH−末端のヒスチジンを
プラスミドベクターpGEX−4T−３（Pharmaciaリファレ
ンス27−4583）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（GST）との融合に置くことによる。この目的のため
に、SR−p70aの対応する挿入断片（位置1434〜2066）を
サルSR−p70a cDNAを含有する10ngのプラスミドを用い
るPCRによって増幅した。核酸プライマーは、以下の組
成である：得られたフラグメントおよびまたベクターを制限酵素
BamH IおよびSal Iで消化し、クローニングを実施例II.
5の記載の通りに行う。選択されたクローンをpG SR−p7
0と称する。

ｂ）GST−pSR−p70融合タンパク質の発現および精製該工程を“bulk GST purification module"キット（P
harmaciaリファレンス27−4570−01）を用いて行った。

概略は、組換えクローンを37℃にて１リットルの2xYT
A培地＋100μg/mlアンピシリン中で培養した。OD0.8に
て、発現を0.5mM IPTGで37℃にて２時間誘導する。遠心
分離後、細胞ペレットを冷PBS中で拾い上げ、次いで超
音波で音波処理する。１％Triton X−100を添加後、調
製物を室温にて撹拌しながら30分間インキュベートす
る。４℃にて12,000gで10分間遠心分離後、上清を回収
する。次いで、精製をグルタチオン−セファロース（gl
utathione−Sepharose）4Bアフィニティークロマトグラ
フィーカラムに付して行う。結合および洗浄をPBSバッ
ファー中で行い、溶出を減少させたグルタチオンとの競
合によって行う。最終濃度は、融合タンパク質300μg/m
lになる。

２）COS−３細胞におけるSR−p70aタンパク質の製造 COS−３細胞を、サルSR−p70a cDNAがクローン化され
たpSE1プラスミドDNAを用いて（実施例I.1）、または対
照としてベクターpSE1プラスミドDNAを用いて、DEAE−
デキストラン技法によってトランスフェクトする:COS−
３細胞を5x10⁵細胞/6cm皿にて５％胎児ウシ血清を含有
する培地中で接種する（実施例I.1）。培養後、細胞をP
BSでリンスする。1mlの以下の混合物:6.5μｇのDNA、25
0μg/mlのDEAE−デキストランおよび100μＭクロロキノ
ンを含有する培地を加える。細胞を37℃にて５％CO
₂中、４〜５時間インキュベートする。培地を吸引し、1
0％DMSOを含有するPBS2mlを加え、皿を静かに振盪しな
がら細胞を１分間インキュベートする。培地を再度吸引
し、細胞をPBSで二度リンスする。次いで、37℃にて３
％胎児ウシ血清を含む培地を用いて発現が行われる間の
期間、一般的には三日間インキュベートする。

次いでSR−p70aタンパク質を実施例IVの記載の通りに
イムノブロッティングによって分析する。

実施例Ｖ特異的抗体の調製実施例IVにしたがって調製した試料のタンパク質150
μｇを用いて、ウサギ（およそ1.5〜2kg重量のニュージ
ーランド雄）を免疫した。免疫はVaitukaitis,Methods
in Enzymology,1981,73,46によって記載されたプロトコ
ールにしたがって、15日毎に行われた。最初の注射で、
１容量の抗原溶液を１容量のフロイントの完全アジュバ
ント（Sigmaリファレンス4258）でエマルジョン化す
る。５ブースターをフロイントの不完全アジュバント
（Sigmaリファレンス5506）中で投与した。

実施例VI SR−p70タンパク質の検出：ウェスタンイムノブロッテ
ィング１）イムノブロッティングに使用した材料ａ）イムノブロッティングに使用した細胞系統以下の細胞系統をATCC（American Type Culture Coll
ection）のカタログ“Catalogue of cell lines and hy
bridomas,7th edition,1992"における記載の通りに培養
した:COS−３、CV−１（サル腎細胞系統）、HT−29、Ｕ
−373MG（ヒト膠芽腫）、MCF7（ヒト乳腺癌）、SKNAS
（COS−３と同じ条件下で培養したヒト神経芽腫）、SK
−Ｎ−MC（ヒト神経芽腫）、IMR−32（ヒト神経芽
腫）、CHP212（CV−１と同じ条件下で培養したヒト神経
芽腫）、Saos−２（骨肉腫）、SK−OV−３（卵巣腺癌）
およびSW 480（ヒト結腸腺癌）。

ｂ）SR−p70a cDNAによってトランスフェクトされたCOS
−３細胞 COS−３細胞を実施例IV.2に記載の通りにトランスフ
ェクトした。対照として、細胞を組換えSR−p70a cDNA
を含まないpSE1プラスミドDNAでトランスフェクトし
た。

２）真核細胞培養体からまたはトランスフェクト細胞か
らのタンパク質試料の調製培養後、細胞をPBSで洗浄し、次いで10μg/ml RNAse
A、20μg/ml DNAsel、２μg/mlアプロチニン、0.5μg/m
lロイペプチン、0.7μg/mlペプスタチンおよび170μg/m
l PMSFを補ったRIPAバッファー（１％NP40、0.5％デオ
キシコール酸ナトリウム、0.5％SDSを有するPBS）中で
拾い上げる。細胞を４℃にて超音波によって音波処理
し、４℃にて30分間放置する。12,000rpmにて微量遠心
分離後、上清を回収する。タンパク質濃度をブラッドフ
ォード（Bradford）法によって測定する。

３）ウェスタンブロッティング５または50μｇのタンパク質（細胞系統の場合50μｇ
およびトランスフェクト細胞の場合５μｇ）を0.2容量
の以下の6x電気泳動バッファー:0.35mMトリス−HCl pH
6.8、10.3％SDS、36％グリセロール、0.6mM DTT、0.012
％ブロモフェノールブルー中に置く。試料をアプライ
し、10％SDS−PAGEゲル（30:0.8ビス）中で泳動し、次
いでニトロセルロース膜上へエレクトロトランスファー
する。

４）抗体を用いる視覚化膜を室温にて30分間、５％ミルク（GIBCO−SKIM MIL
K）を加えたTBSTブロッキングバッファー（10mMトリス
−HCl pH8、150mM NaCl、0.2％Tween20）中でインキュ
ベートする。引き続いて、膜を同じバッファー中で抗−
SR−p70（αSR−p70）抗体と４℃にて16時間接触させ、
TBSTで10分間三回洗浄し、次いで37℃にて１時間ペルオ
キシダーゼに結合した２次抗−ウサギ免疫グロブリン抗
体（SIGMA A055）とインキュベートする。15分間三回洗
浄後、ECLキット（Amersham RPN2106）を用いて化学ル
ミネセンスによって視覚化を行う。

同時に、同じ試料を抗−p53（αp53）抗体（Sigma BP
5312）、次いで２次抗−マウス免疫グロブリン抗体での
視覚化に処した。

５）図および結果図10:SR−p70タンパク質のイムノブロット図10a:組換えSR−p70タンパク質の検出 −カラム１および3:ベクターpSE1によってトランスフェ
クトされたCOS−３。

−カラム２および4:SR−p70a cDNAを含有するプラスミ
ドpSE1によってトランスフェクトされたCOS−3. −カラム１および2:抗−SR−p70（αSR−p70）抗体での
視覚化。

カラム３および4:抗−p53（αp53）抗体での視覚化。

図10b:内在性SR−p70タンパク質の検出 −カラム1:COS−3;2:CV−1;3:HT−29;4:U−373MG;5:MCF
7;6:SKNAS;7:SK−Ｎ−MC;8:IMR−32;9:CHP212;10:Saos
−2;11:SK−OV−３および12:SW480。

A:αSR−p70抗体での視覚化。

B:αp53抗体での視覚化。

αSR−p70抗体は特異的に組換えタンパク質（図10a）
および内在性タンパク質（図10b）を認識し、p53と交差
しない。ヒトまたはサル細胞系統の分析は、SR−p70タ
ンパク質、p53様が一般に弱く検出できることを示す。
対照的に、p53の蓄積が存在する場合、SR−p70は、その
一部の場合でも、直ちに検出可能になる（図10b）。SR
−p70転写産物の分布のRT−PCRによる研究は、遺伝子が
試験される全ての細胞型において発現することを示す。

実施例VII SR−p70遺伝子のクローニングおよび染色体位置測定１）SR−p70遺伝子のクローニング使用したライブラリーは、BRL“Random Primers DNA
Labelling Systems"キット（リファレンス18187−013）
を用いて³²Pで標識したSR−p70 DNAフラグメントを有す
る、実施例III.3において調製したコスミドライブラリ
ーである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファ
ーを50％のホルムアルデヒドを加えることによって処理
する。最後の洗浄を0.1xSSC/0.1％SDS中で60℃にて行
う。同様な方法において、SR−p70遺伝子をC57ブラック
マウスゲノムDNAで調製したライブラリーから単離し
た。

クローンの分析および部分配列決定は、p53遺伝子の
構造に近い構造を特にエキソンのサイズおよび位置が高
く保持された中央部分において有する14個のエキソンの
存在を明らかにする（図12）。該構造は、部分的はマウ
スおよびヒトにおいて決定された。

例として、イントロン１の、エキソン２の、イントロ
ン３の3'領域およびエキソン３の5'領域のヒトゲノム配
列を図13に示す。

２）ヒトにおけるSR−p70遺伝子の染色体位置測定これは、R.Slimら、Hum.Genet.,1991,88,21−26によ
って記載された技法を用いてヒトSR−p70遺伝子DNAを用
いて行われた。50有糸分裂を分析し、その80％以上が両
方の染色体上の1p36およびより特には1p36.2−1p36.3に
位置したダブルスポットを有した（図11）。染色体１の
同定およびその位置付けは、二次凝縮のヘテロクロマチ
ンに基づく。写真は、Zeiss Axiophot顕微鏡上で作製さ
れ、LHESA冷却CCDカメラを用いて撮られ、Optilabで処
理した。

実施例VIII Ａ）短Ｎ−末端および分岐の両方を有する推定ヒトSR−
p70タンパク質をコードするmRNAの証明１）IMR−32（ヒト神経芽腫）細胞の培養細胞をATCC（American Type Culture Collection）の
カタログ“catalogue of cell lines and hybridomas,7
th edition,1992"に記載の通りに培養した。

２）cDNAの調製 RNAを実施例I.2.aに記載の通りに培養する。cDNAを実
施例I.3に記載の方法に類似の方法で、ポリ（Ｔ）₁₂プ
ライマーを用いる20μｌの最終容量における５μｇ全RN
Aを用いておよび冷却ヌクレオチド用いて調製する。反
応をEDTAで中断させない。

３）いわゆるPCR技法によるSR−p70 cDNAの特異的増幅重合は、以下の組成:50mMトリス−CHl pH9.2、16mM
（NH₄）₂SO₄、1.75mM MgCl₂のバッファーを用いる最終5
0μｌ中２μｌのcDNAを用いて、10％DMSO、0.4mM NTP、
２個の核酸プライマーを各100ngおよび3.5ユニットのTA
QおよびPWOポリメラーゼの混合物（Boehringer Mannhei
m,リファレンス1681 842）の存在下で行う。

プライマー対は、以下の組成：である。

反応は、95℃/30秒、58℃/1分および68℃/2分30秒に
て30サイクル、次いで68℃/10分の最終サイクルを行
う。

PCR産物を１％アガロースゲル（TAEバッファー）上の
電気泳動に処する。エチジウムブロミド染色後、２個の
主要なバンドが示される：およそ490bpサイズのバンド
（予想サイズ（図６参照））およびおよそ700bpサイズ
のさらなるバンド。後者は、“Geneclean"キット（Bio
101、リファレンス1001 400）を用いるゲルから予想さ
れる。ポリアクリルアミドP10（Biorad,リファレンス15
011050）のカラム上で脱塩後、フラグメントを前記のよ
うに10サイクルのさらなるPCR増幅に処する。

４）増幅産物の配列の決定第１の工程において、PCR産物をSephacryl S−400（P
harmacia 17−0609−01）のカラムに付してオリゴヌク
レオチドから除去し、次いでP10のカラムに付して脱塩
する。配列決定反応をApplied Biosystemsキット（リフ
ァレンス401 628）（373DNAシークエンサー）を用いて
アンチセンスプライマーで行う。

得られた配列は、217〜218位置に198bpの挿入を有す
るSR−p70 cDNA配列（実施例II.4）に対して同一である
（図14）。推定Ｎ−末端タンパク質配列（SR−p70dと称
される配列）は、49アミノ酸短く、最初の13アミノ酸の
分岐を有する（配列番号13）。したがって、マウスAtT
−20系統に関してすでに記載したように、少なくとも２
個の異なるSR−p70転写産物が同時に存在する。

Ｂ）ヒトSR−p70のクローニングならびにSR−p70dと同
じＮ−末端およびＣ−末端部分に分岐を有する推定ヒト
SR−p70タンパク質をコードするmRNAの証明１）いわゆるPCR技法によるSR−p70 cDNAの特異的増幅増幅は、以下の組成：のプライマー対を用いて、IMR−32細胞の精製RNAから実
施例VIII.Aに記載のように行われた。

S400カラム上での過剰なプライマーの除去およびP10
カラム上での脱塩後、１μｇの試料を以下の組成：のプライマー対を用いて再度PCRに処する。

２）プラスミドpCDNA3への増幅産物のクローニング１）で得られたPCR産物を実施例II.5の記載のよう
に、P10カラム上で脱塩し、制限酵素Xho IおよびXba I
で消化し、次いでプラスミドpCDNA3中へクローン化す
る。２個の組換えクローンをApplied Biosystemsキット
を用いてSR−p70 cDNAに特異的なオリゴヌクレオチドで
配列決定する。

得られた第１配列は、実施例VIII.aに記載のSR−p70
をコードするmRNAの完全配列に相当する。推定タンパク
質は、587個のアミノ酸を含む（配列番号13および図1
6）。

得られた第２配列は、前記のSR−p70d cDNA配列と同
一であるが、一方では1049〜1050位置に、他方では1188
〜1189位置に149bpおよび94bpの２個の欠失を有する
（配列番号14および図15）。該第２配列から推定された
タンパク質配列は、Ｎ−末端部分が49アミノ酸短く、最
初の13アミノ酸における分岐ならびにアミノ酸350〜397
の間のタンパク質配列の分岐を有するタンパク質を示す
（配列番号15および図16）（SR−p70eと称される配
列）。推定タンパク質は、506個のアミノ酸を含む。

Ｃ）より短いＮ−末端を有する推定ヒトSR−p70タンパ
ク質をコードするmRNAの証明１）SK−Ｎ−SH（ヒト神経芽腫）細胞の培養細胞をATCC（American Type Culture Collection）の
カタログ“Catalogue of cell lines and hybridomas,7
th edition,1992"における記載の通りに培養する。

２）cDNAの調製およびいわゆるPCR技法によるSR−p70 c
DNAの増幅これらの工程を以下の組成：のプライマー対を用いて実施例VIII.Aに記載のように行
う。

配列決定は、Applied Biosystemsキットを用いてSR−
p70 cDNAに特異的なプライマーを用いて行い、２個のcD
NA: −SR−p70aをコードするmRNAに対応する第1cDNA −24〜25位置の間に98bpの欠失を有する第2cDNA を示す（配列番号16および図15）。

該欠失は、SR−p70aの翻訳開始ATGを含む。該第2cDNA
から推定されたタンパク質（SR−p70fと称する）は、SR
−p70aの内部ATGに対応する下流に翻訳開始ATGを有す
る。したがって、推定タンパク質は、588個のアミノ酸
を含み（配列番号17および図16）、SR−p70aの48個のＮ
−末端アミノ酸に関して末端切断（truncated）され
る。

Ｄ）ヒトSR−p70bをコードするmRNAの証明１）K562細胞の培養細胞をATCC（American Type Culture Collection）の
カタログ“Catalogue of cell lines and hybridomas,7
th edition,1992"における記載の通りに培養する。

２）cDNAの調製、いわゆるPCR技法によるSR−p70 cDNA
の増幅および配列決定これらの工程を実施例III.Cに記載のように行う。

配列決定は、２個のcDNA: SR−p70aをコードするmRNAに対応する第1cDNA、および1
516〜1517位置に94bpの欠失を有する第2cDNA を示す（配列番号18および図15）。推定タンパク質（SR
−p70bと称する）は、199個のアミノ酸を含み、SR−p70
aに関して137個のアミノ酸によって末端切断されたＣ−
末端配列を有し、少なくとも４アミノ酸分岐を有する
（配列番号19および図21）。

該cDNAは、サルSR−p70bに関連する実施例Ｉにおいて
記載されたcDNAに類似する。

該実施例（実施例VIII.A、Ｂ、ＣおよびＤ）に記載さ
れた分子は、SR−p70遺伝子によって転写された一次mRN
Aの異なるスプライシングの結果であるSR−p70変異体を
表す。

SR−p70aは、14エキソンの構成のmRNAによってコード
される（実施例VII参照）。これは、対照タンパク質で
ある。SR−p70bは、エキソン３〜４での挿入ならびにエ
キソン11および13の不存在の結果である。SR−p70fは、
エキソン２の不存在の結果である。該実施例は、SR−p7
0変異体の存在を非徹底的に、他の変異体の存在の強い
可能性とともに記載する。同様に、該実施例に記載され
たこれらの変異体の存在、ならびにSR−p70aは、それら
が証明された系統に限定されない。実際、RT−PCRによ
って行われた研究は、これらの変種を研究される種々の
系統において発見できることを示した。

さらに、SR−p70fの開始メチオニンは、SR−p70aの内
部メチオニンに対応し、SR−p70aをコードするmRNA上の
下流での開始の可能性を示す。

実施例IX ヒトSR−p70a mRNAの5'配列の獲得１）PCRによるSR−p70 cDNAの5'末端の増幅細胞培養ならびに全RNAおよびcDNAの調製は、実施例V
III.1および２に記載のように行う。RNA鋳型を４μｌの
500mM EDTAおよび４μｌの2N NaOHの添加後、65℃にて
５分間インキュベートによって加水分解する。次で試料
をP10カラムに付して脱塩する。cDNAを実施例I.3.dに記
載のように、dG尾部を用いて3'末端にて最終容量40μｌ
中で伸長する。４μｌの500mM EDTAおよび４μｌの2N N
aOHの添加後、cDNAを65℃にて３分間インキュベート
し、次いでP10カラムに付して脱塩する。PCR増幅を実施
例VIII.3のように、８μｌのcDNAを用いて、および以下
の組成：のプライマー対で30サイクル行う。

Ｓ−400カラム上で過剰なプライマーの除去およびP10
カラム上での脱塩後、１μｌの試料を再度、以下の組
成：のプライマー対を用いるPCRに処する。

Ｓ−400カラムおよびP10カラムに再度付した試料を以
下の対：を用いる20サイクルで３回目の増幅に処する。

２）SR−p70 cDNA5'配列の決定配列を実施例VIII.4のように製造する。該配列は、SR
−p70aの開始ATGの上流の少なくとも237塩基の非−コー
ディング5'領域を示す（図17）。特に、該配列（IMR−3
2系統から得られた）とHT−29系統から得られた配列を
比較することによって（図６）、２点の相違（図17:太
字を参照）が示され（Ｇ→ＡおよびＣ→Ｔ）、各々、SR
−p70aの開始ATGから−20および−30に位置する（図６
および17）。該変異性は、エキソン２中に位置する（図
13）。また、該変異性がマウスにおける実施例IIIおよ
びヒトにおける実施例VIIIに記載のように別法のスプラ
イシングの結果として、または別法で、CTGでの翻訳開
始での結果として（FGFbのために証明したように（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,1836−1840）、コーディ
ングフレーム内で見られることも除外できない。

同様に、該変異性がSR−p70の翻訳にまたは一次RNAの
スプライシングに影響を有することも、除外できない。

全ての事象にて、おそらく対立遺伝子起源の該変異性
は、マーカーとして、ゲノムレベル（実施例XI参照）か
またはmRNAレベル（実施例Ｘ参照）にて役立ち得る。

実施例Ｘ１）細胞試料におけるSR−p70aの転写発現のPCRによる
分析（RT−PCR）細胞培養（SK−Ｎ−AS,SK−Ｎ−MC,HT−29,U−373MG,
SW480,IMR−32,CHP212）を実施例VI.1.aのように行う
（ATCCのカタログ“Catalogue of cell lines and hybr
idomas,7th edition,1992"に言及される）。

cDNAの調製およびPCR増幅を実施例VIII.2および３の
ように行う。使用されるプライマー対は、以下の組成：である。

試料を１％アガロースゲル上で電気泳動によって分析
し、エチジウムブロミドで視覚化する（図18）。

試料において得られたバンドのサイズは、予想サイズ
に一致する（およそ2kb、図６および17）。得られたバ
ンドの強度は、再現される。同じ条件下で20サイクルの
試料１μｌの再増幅は、各試料においてバンドを示す。

２）増幅産物の配列の決定Ｓ−400およびP10カラムに試料を通過させた後、配列
決定をリファレンスキット401 628を用いるApplied Bio
systems sequencer 373で行う。使用されるプライマー
は、とりわけ、以下：である。

SR−p70aにおけるタンパク質相違は、検出されなかっ
た。しかしながら、得られた配列は、SR−p70aの開始AT
Gの上流−20および−30位置にて２重の変異性を示す
（図６および17）。おそらく対立遺伝子起源の該変異性
は、転写産物の２クラスを定義付させる：−30位置にＧ
および−20位置にＣを有する第１クラス（クラスG^-30/C
^-20）ならびに２個の位置で変異：−30位置でＡおよび
−20位置でＴを有する第２クラス（クラスA^-30/
T^-20）。

第１クラス:SK−Ｎ−AS,SK−Ｎ−MC,HT−29,U−373MG,S
W480 第２クラス:IMR−32,CHP212 実施例XI 10人の集団におけるSR−p70遺伝子の対立遺伝子分布の
決定の分析的方法該対立遺伝子分布は、実施例IXおよびＸで証明された
対立遺伝子変異性：・各々、SR−p70aの開始ATGの上流の−30および−20位
置にＧおよびＣを有するG^-30/C^-20対立遺伝子・各々、同じ位置にＡおよびＴを有するA^-30/T^-20対立
遺伝子に基づく。

該変異性は、２個の対立遺伝子を区別する制限酵素の
使用によって証明され得る（図13）。例として：・関連する領域におけるG^-30/C^-20対立遺伝子にのみ切
断部位を有するBpl I酵素（該部位は両方の可変位置を
含む）・関連する領域におけるA^-30/T^-20対立遺伝子にのみ切
断部位を有するSty I酵素１）PCRによるエキソン２のゲノム増幅重合反応は、実施例VIII.3に記載の条件で最終50μｌ
中、精製されたゲノムDNAの500ngを用いて行う。

プライマー対は、以下の位置：である。反応は、実施例VIII.3に記載のように30サイク
ルで行う。

Ｓ−400上で過剰なプライマーを除去およびP10カラム
上で脱塩後、１μｌの試料を同じ条件下で、以下のプラ
イマー対：を用いて再度25サイクル増幅する。

増幅産物を１％アガロースゲル上での電気泳動に処す
る（図19−Ａ）。

２）制限酵素Sty Iでの消化試料を予めP10カラムで脱塩し、次いで制限酵素Sty I
（BRL 15442−015）を用いて、以下の組成:50mMトリス
−HCl pH8、100mM NaCl、10mM MgCl₂のバッファー中37
℃にて30分間消化する。消化産物を１％アガロースゲル
上での電気泳動（TAEバッファー）によって分析する。
エチジウムブロミド染色によって視覚化を行う（図19−
Ｂ）。

482塩基対のバンドは、G^-30/C^-20対立遺伝子を特徴付
ける（図13および19）。376塩基対のバンドおよび106塩
基対のバンドの存在は、A^-30/T^-20対立遺伝子（Sty I切
断部位を有する対立遺伝子）を特徴付ける。

10人の集団にて、２人はG^-30/C^-20およびA^-30/T^-20対
立遺伝子を示し、他の８人はG^-30/C^-20対立遺伝子を有
するホモ接合体である。９人の新たな集団の研究は、３
人のヘテロ接合体がG^-30/C^-20およびA^-30/T^-20対立遺伝
子を示し、他の６人がG^-30/C^-20対立遺伝子に関してホ
モ接合体であることを証明した。

実施例XII SR−p70 cDNAでのトランスフェクションによるSK−Ｎ−
AS系統の形質転換の復帰試験使用される発現ベクターは実施例II.5に記載されてお
り、図15において図式で示される。使用される方法は、
Grahamら（Virology 1973,54,2,536−539）によって記
載されたいわゆるリン酸カルシウム法である。該系統を
5mlの実施例I.1に記載の培地中5x10⁵細胞／皿6cm直径の
群に接種する。細胞を37℃にて、５％CO₂で一晩培養す
る。トランスフェクション培地を以下の方法：順に、1m
lのHEBSバッファー（8mg/ml NaCl、370μg/ml KCl、125
μg/ml Na₂HPO₄・2H₂O、1mg/mlデキストロース、5mg/ml
Hepes pH7.05）、10μｇのトランスフェクトされるべ
きプラスミドおよび滴下で50μｌの2.5M CaCl₂を加える
ことによって、混合物を調製するにおいて調製する。トランスフェクション培地を室温に
て30分間放置し、次いで培養皿中に含まれた培地に滴下
する。細胞を37℃/5％CO₂にて５〜６時間インキュベー
トする。培地を吸引後、２％の胎児ウシ血清を含有する
新たな培地の5mlを加える。37℃/5％CO₂にて48時間後、
細胞をPBSでリンスし、トリプシン処理によって分離
し、10mlの培養培地（５％胎児ウシ血清）中に希釈し、
直径10cmの皿に播く（希釈はトランスフェクションの能
率にしたがって調整する）。さらに10時間（細胞が付着
する時間）培養後、細胞を最終濃度600μg/mlジェネテ
ィシン等量にてG148を加えることによって15〜20日間、
選択に処する（培地は毎日取り替える）。次いで、得ら
れたクローンをPBSでリンスし、70％エタノール中で固
定し、乾燥し、１％クリスタルバイオレットで染色し、
次いでカウントする。

４プラスミドトランスフェクションが全く同一に行わ
れた： −挿入断片なしのプラスミドpCDNA3 −ヒトSR−p70a cDNAを含むプラスミドpCDNA3/SR−p70 −p53のDNA−結合ドメインにおける突然変異273（Ｒ→
Ｈ）に類似する293AA位置での突然変異（Ｒ→Ｈ）有す
るSR−p70a cDNAを含むプラスミドpCDNA3/SR−p70Mut −プラスミド無しの対照。

結果は、皿あたりのクローン数として表す。

プラスミドpCDNA3/SR−p70でのトランスフェクション
によって得られたクローンの数は、対照pCDNA3で得られ
たクローン数より25倍少なく、pCDNA3/SR−p70Mutで得
られたクローン数より９倍少なく、SR−p70 cDNAでトラ
ンスフェクトした細胞の細胞分裂の死滅率または阻止を
示す。該結果は、突然変異したSR−p70 cDNAで得られた
クローンを考慮して毒性の結果ではないが、p53タンパ
ク質に関して証明されたように、おそらくアポトーシス
の結果である（Koshland et al.,1993,262,1953−198
1）。

実施例XIII SR−p70タンパク質の生物学的役割 p53のDNA−結合ドメインとSR−p70タンパク質の中央
領域の間の構造的ホモロジーは、SR−p70が転写因子で
あることを推断させる（図１および２参照）。実際、p5
3（393アミノ酸）は、数個の機能的ドメインよりなる。
Ｎ−末端領域（１−91アミノ酸）は、転写の活性化に関
連し、異なる細胞性およびウイルス性タンパク質との相
互反応のための部位を含む。中央部分（アミノ酸92〜29
2）は、特定の遺伝子のプロモーター領域に位置する特
異的DNA配列への結合を可能にし（p53を不活性にする大
部分の点突然変異は、該領域に位置される）、また、そ
の活性を阻害するウイルス性タンパク質との相互作用の
ための非常に多くの部位を有する。最後に、p53の少な
くとも100個のアミノ酸は、そのオリゴマー化ならびに
後者のレギュレーションの原因となる（Hainaut P.,Cur
rent Opinion in Oncology,1995,7,76−82;Prokocimer
M.,Blood,1994,84 No.8,2391−2411）。

p53およびSR−p70の間の配列ホモロジーは、特にDNA
との相互作用において直接関係のあるアミノ酸に関して
有意であり、SR−p70がDNA上のp53部位に結合すること
を示す。これらのアミノ酸は、非常に正確に「ホットス
ポット（hot spots）」と称されるアミノ酸、ヒト腫瘍
においてしばしば突然変異されるアミノ酸に相当する
（SWISS PROT:SW:p53_human and Prokocimer M.,Blood,
1994,84 No.8,2391−2411）。該ホモロジーから、SR−p
70タンパク質が、後者とは無関係にp53によって、また
はそれとともにヘテロオリゴマーを形成することによっ
て調節された遺伝子の活性に対する制御を行うことが推
定され得る。

それゆえ、p53様、SR−p70遺伝子の産物、サイクルを
終了させる（直ちにまたは永久に）細胞サイクルの制御
およびレギュレーション、およびDNA修復、分化または
細胞死のごときプログラムの手段に関連するにちがいな
い。「p53−様」活性の存在の見込みは、電離放射線に
応じるDNA修復および細胞死の活性のp53^-/^-マウスにお
ける証明によって、強く感じられた（Strasser et al.,
Cell,1994,79,329−339）。本発明の発明者らは、染色
体１の短いアーム（arm）のテロメア領域において、ヒ
トSR−p70遺伝子を正確に1p36.2−36.3、神経芽腫およ
び他の型の腫瘍（黒色腫および肉腫）の大部分にありが
ちな最小の欠失領域（SRO）に位置決定した（White et
al.,PNAS,1995,92,5520−5524）。ヘテロ接合性の喪失
領域（LOH）は、その活性の喪失が腫瘍形成の原因であ
ると考えられる腫瘍−抑制遺伝子の位置を決定する。ま
た、該領域が「母方のインプリンティング（maternal i
mprinting）」；（母方対立遺伝子が、好ましくは、1p3
6欠失を有する神経芽腫において失われている（Ｎ−Myc
の増幅無しに））に従属することを思い出すことが重要
である（Caron et al.,Hum.Mol.Gen.,1995,4,535−53
9）。神経芽腫細胞に組み込まれ、そこで発現された野
生型SR−p70遺伝子は、それらの形質転換の復帰を可能
にする。したがって、該抗−腫瘍形成活性の喪失は、腫
瘍の発達に関係する。1p36領域は、マウス染色体４の末
端セグメントと同系のホモロジーを有する。該領域にお
いて、カーリー尾部（ct）遺伝子（Beier et al.,Mamma
lian Genome,1995,6,269−272）は、神経管の先天的奇
形（NTM:脊椎破裂、無脳症など）に関係した。ctマウス
は、これらの奇形を研究するための最も良い動物モデル
である。これらの奇形は細胞増殖の異常が原因であると
されている。SR−p70遺伝子の性質およびその染色体位
置決定を考慮すると、仮定の１つは、SR−p70がctのヒ
ト相同物であり、これに基づいて、該遺伝子に影響を及
ぼす初期の突然変異の欠失および染色体異常が、例え
ば、応用として、危険な状態のヒトの同定（NTMによっ
て影響される新生児の0.5−１％）および予防処理の手
段を可能にすることである（Neumann et al.,Nature Ge
nentics,1994,6,357−362;Di Vinci et al.,Int.J.Canc
er,1994,59,422−426;Moll et al.,PNAS,1995,92,4407
−4411;Chen et al.,Development,1995,121,681−69
1）。

実施例XIV SR−p70遺伝子の対立遺伝子研究 GCおよびAT対立遺伝子は、エキソン２のPCR産物のSty
I切断によって容易に同定される（実施例XI参照）。し
たがって、該方法で、混入する健康な組織の存在にもか
かわらず、GC/ATヘテロ接合体において神経芽腫腫瘍、S
R−p70対立遺伝子（GCまたはAT）の喪失を有する個体を
決定することが可能であった。

驚くべきことに、同じ分析をRNAで行うと、１つの対
立遺伝子が欠失の存在または別の方法に無関係に、まだ
驚くべきことに、健康な組織の存在のにもかかわらず証
明される。これは、インプリント（２個の対立遺伝子の
異なる発現）も混入組織に存在するであろうことを示
す。

これを証明するために、同じ分析を健康なGC/ATヘテ
ロ接合個体の血液細胞から生じるRNAで繰り返した。ま
た、転写産物の２つの型のうちたった１つがこれらの細
胞において検出された。該結果は、SR−p70遺伝子のた
めの全身の遺伝子インプリントの存在に関して腫瘍試料
で行われた観察を確認する。

活性SR−p70対立遺伝子を不活性化する１つのときど
き起こる突然変異は、活性の喪失を生じ、これは潜在的
に全組織で起こるであろうことが仮定されるので、該発
見の含蓄は重要である。

SR−p70の生物学的機能における正確なデータが存在
しないことは、細胞に関するSR−p70活性の喪失の結果
を測定できなくする。それにもかかわらず、p53腫瘍抑
制タンパク質との強いホモロジー、ならびにSR−p70がP
21^Wafプロモーターを利用できる転写因子であることの
証明は、細胞サイクルの制御および分化における該タン
パク質の役割を示す。

KnudsonおよびMeadows,1980（New Eng.J.Med.302:125
4−56）は、IV−Ｓ神経芽腫を通常の分化を妨害する突
然変異を有する神経冠由来の非−悪性細胞の集合物であ
ると考えている。

SR−p70活性の喪失、細胞サイクルに対するp53制御の
喪失が異数体、増幅（神経芽腫の場合に記載された）お
よび細胞形質転換を引き起こすことのできる他の遺伝認
識のごとき細胞の異常の出現を助力することが考えられ
る（Livingstone et al.,1992,Cell 71:923−25;Yin et
al.,1992,Cell 72:937−48;Cross et al.,1995,Scienc
e 267:1353−56;Fukusawa et al.,1996,Science 271:17
44−47）。したがって、神経芽腫は、本来SR−p70の活
性の一時的または恒久的な喪失から生じ、それにより腫
瘍形成事象の発生およびしたがって腫瘍進行を助力し得
る。

Biegel et al.,1993（Am.J.Hum.Genet.52:176−82）
によって記載された1p36構成上の欠失の場合、IV−Ｓ神
経芽腫は本当に起こり、影響される遺伝子はNBS−１（S
R−p70）である。

結論として、神経芽腫に関して記載されることは、ま
た他の型の腫瘍、特に、染色体１の短いアームの末端の
再編成に関連するものにも応用し得る（Report 2 inter
national workshop on human chr 1 mapping 1995,Cyto
genetics and Cell Genet.72:113−154）。治療的見地
から、腫瘍の発生におけるSR−p70のかかわりは、突然
変異誘発性試薬の産物による細胞形質転換の危険性を考
慮に入れて、化学治療における突然変異誘発性試薬の使
用の回避および、これらの産物よりはむしろ、分化を刺
激する非−突然変異誘発性物質の使用へ導くであろう。

さらに、GCおよびAT突然変異の発生頻度は、以下のよ
うである：集団において、頻度（AT）＝0.15、および25
（神経芽腫）患者の試料、Ｆ（AT）＝0.30。これらの統
計は、AT対立遺伝子が素因を作る因子であり得ることを
示す。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：サノフィ（Ｂ）通り名：リュ・マルボォー32−34 （Ｃ）都市名：パリ（Ｄ）国名：フランス（Ｆ）郵便番号（ZIP）:75008 （Ｇ）電話番号:01 53 77 40 00 （Ｈ）テレファックス:01 53 77 41 33 （ii）発名の名称:SR−p70 （iii）配列の数:40 （iv）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0、バー
ジョン＃1.25（EPO）（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2874塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Cebus apella （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:156..2066 （ix）配列の記載：配列番号1: （２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:637アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号2: （２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2034塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Cebus apella （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:156..1652 （ix）配列の記載：配列番号3: （２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:499アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号4: （２）配列番号５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2156塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:33..1940 （ix）配列の記載：配列番号5: （２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:636アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号6: （２）配列番号７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2040塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Mus musculus （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:124..1890 （ix）配列の記載：配列番号7: （２）配列番号８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:589アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号8: （２）配列番号９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:758塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Mus musculus （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:389..757 （ix）配列の記載：配列番号9: （２）配列番号10の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:123アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号10: （２）配列番号11の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:559塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）配列の記載：配列番号11: （２）配列番号12の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1764塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）配列の記載：配列番号12: （２）配列番号13の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:587アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号13: （２）配列番号14の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1521塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）配列の記載：配列番号14: （２）配列番号15の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:506アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号15: （２）配列番号16の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1870塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）特徴：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:104..1867 （ix）配列の記載：配列番号16: （２）配列番号17の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:588アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号17: （２）配列番号18の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1817塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:2本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:cDNA （vi）起源：（Ａ）生物:Homo sapiens （ix）配列の記載：配列番号18: （２）配列番号19の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:499アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号19: （２）配列番号20の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:17塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）ハイポセティカル：いいえ（iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号20: （２）配列番号21の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号21: （２）配列番号22の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号22: （２）配列番号23の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号23: （２）配列番号24の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:21塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号24: （２）配列番号25の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:16塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号25: （２）配列番号26の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:17塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号26: （２）配列番号27の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号27: （２）配列番号28の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:17塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号28: （２）配列番号29の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号29: （２）配列番号30の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号30: （２）配列番号31の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号31: （２）配列番号32の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号32: （２）配列番号33の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号33: （２）配列番号34の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号34: （２）配列番号35の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号35: （２）配列番号36の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号36: （２）配列番号37の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号37: （２）配列番号38の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:21塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号38: （２）配列番号39の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：いいえ（ix）配列の記載：配列番号39: （２）配列番号40の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖:1本（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の型:DNA （iii）アンチ−センス：はい（ix）配列の記載：配列番号40:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/47 C07K 16/18 C12N 1/21 C12Q 1/68 G01N 33/53 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）配列番号２の配列；ｂ）配列番号４の配列；ｃ）配列番号６の配列；ｄ）配列番号８の配列；ｅ）配列番号10の配列；ｆ）配列番号13の配列；ｇ）配列番号15の配列；ｈ）配列番号17の配列；およびｉ）配列番号19の配列よりなる群から選択されたアミノ酸配列からなる精製さ
れたポリペプチド。
【請求項２】配列番号６、配列番号13、配列番号15、配
列番号17および配列番号19から選択されたアミノ酸配列
からなることを特徴とする請求項１記載のポリペプチ
ド。
【請求項３】対応する遺伝子のメッセンジャーRNAの選
択的スプライシングから生じることを特徴とする請求項
１記載のポリペプチド。
【請求項４】融合タンパク質の形態で製造される組換え
ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜３の
いずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペ
プチドをコードする単離された核酸。
【請求項６】請求項５記載の単離された核酸であって；
その配列がａ）配列番号１の配列；ｂ）配列番号３の配列；ｃ）配列番号５の配列；ｄ）配列番号７の配列；ｅ）配列番号９の配列；ｆ）配列番号11の配列；ｇ）配列番号12の配列；ｈ）配列番号14の配列；ｉ）配列番号16の配列；ｊ）配列番号18の配列；およびｋ）対立遺伝子変異性により、配列ｃ）から得ら
れた、配列番号５のヌクレオチド３および13が各々Ａお
よびＴである配列よりなる群から選択される核酸。
【請求項７】請求項５記載の単離された核酸であって、
その配列が、各々、配列番号６、配列番号13、配列番号
15、配列番号17および配列番号19の配列のポリペプチド
をコードする配列番号５、配列番号12、配列番号14、配
列番号16および配列番号18よりなる群から選択される核
酸。
【請求項８】請求項５〜７のいずれか１項記載の核酸を
含むクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項９】プラスミドpSE1であることを特徴とする請
求項８記載のベクター。
【請求項１０】請求項８または９記載のベクターによっ
てトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１１】イー・コリMC 1061であることを特徴と
する請求項10記載のトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１２】請求項５〜７のいずれか１項記載の核酸
を増幅または検出するための、請求項５〜７記載の核酸
配列またはそれらに相補的な配列のうちいずれか１つ
と、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイ
ズすることを特徴とする、16〜20ヌクレオチドを含有す
るプローブまたはプライマー。
【請求項１３】で示されるオリゴヌクレオチドまたはそれらに相補的な
配列よりなる群から選択される、請求項５〜７いずれか
１項記載の核酸を増幅または検出するためのプローブま
たはプライマー。
【請求項１４】配列決定反応用あるいはPCR技法または
そのいずれかの変法による特異的増幅反応用のオリゴヌ
クレオチドプライマーの製造のための請求項５〜７のい
ずれか１項記載の核酸。
【請求項１５】以下の配列：よりなる群から選択される核酸対。
【請求項１６】生物学的試料における請求項１〜３のい
ずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸配列の
ハイブリダイゼーション実験における検出のための、ま
たは異常型の合成もしくは遺伝子異常の証明のための請
求項12または13記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１７】請求項１〜３のいずれか１項記載のポリ
ペプチドをコードする核酸配列における異常型の合成ま
たは遺伝子異常の検出のための請求項12または13記載の
プローブまたはプライマーであって、該ヌクレオチドプ
ローブが該プローブと前記ヌクレオチド配列との間のハ
イブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下
で、生物学的試料へ接触させられ、適当には、上記ヌク
レオチド配列の増幅の前工程後に、おそらく形成される
ハイブリダイゼーション複合体を検出し、適当には、該
プローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌ
クレオチド配列が配列決定されることを特徴とするプロ
ーブまたはプライマー。
【請求項１８】請求項１〜４のいずれか１項記載の組換
えポリペプチドの製造用の請求項５〜７のいずれか１項
記載の核酸。
【請求項１９】組換えポリペプチドの製造方法であっ
て、請求項10または11に記載のトランスフェクト細胞
を、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８、配列番号10、配列番号13、配列番号15、配列番号17
または配列番号19で示される組換えポリペプチドの発現
を可能にする条件下で培養すること、および該組換えポ
リペプチドを回収することを特徴とする方法。
【請求項２０】請求項１〜３のいずれか１項記載のポリ
ペプチドを特異的に認識できることを特徴とする、モノ
−またはポリクローナル抗体またはそれらのフラグメン
ト、キメラ抗体またはイムノコンジュゲート。
【請求項２１】請求項20記載の抗体を用いることを特徴
とする、生物学的試料における請求項１〜３のいずれか
１項記載のポリペプチドの精製または検出方法。
【請求項２２】生物学的試料由来の請求項１〜３のいず
れか１項記載の配列のポリペプチドの発現または異常な
蓄積に相関する病状、特に発癌現象の検出用の請求項20
記載の抗体であって、少なくとも１つの該抗体を、該ポ
リペプチドと該抗体または複数の抗体との間の特異的免
疫学的複合体の可能な形成をさせる条件下で該生物学的
試料に接触させること、およびおそらく形成される特異
的免疫学的複合体を検出することを特徴とする検出のた
めの抗体。
【請求項２３】支持体に結合されていてもよい請求項20
記載の抗体であって、請求項１〜３のいずれか１項記載
の配列のポリペプチドと該抗体との間の特異的抗原−抗
体複合体の形成の視覚化手段、および／または生物学的
試料における該ポリペプチドの発現または異常な蓄積の
検出および／または該試料におけるこれらのタンパク質
の発現レベルの測定のためのこれらの複合体の定量化手
段を付随する抗体。
【請求項２４】個体から得られた血清試料中の請求項１
〜３のいずれか１項記載の配列のタンパク質に向けられ
た自己抗体の検出であって、ポリペプチドと該血清試料
中におそらく存在する自己抗体との間の特異的免疫学的
複合体の形成を可能にする条件下で個体から得られた血
清試料と該ポリペプチドとを接触させ、おそらく形成さ
れる特異的免疫学的複合体を検出することを特徴とする
検出のための、支持体に結合していてもよい請求項１〜
４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２５】対立遺伝子変異性、突然変異、欠失、挿
入、ヘテロ接合性の喪失または遺伝子異常の決定のため
の、請求項５〜７のいずれか１項記載の核酸。
【請求項２６】病理に関連し得る配列番号５の配列の３
および13位置での対立遺伝子変異性の決定方法であっ
て、少なくとも、請求項15記載の核酸対を用いるPCRによるゲノムDNAの増
幅工程；切断部位が目的の対立遺伝子に対応する制限酵素で増幅
産物を処理する工程；酵素反応の産物の少なくとも１つを検出またはアッセイ
する工程を含むことを特徴とする方法。