PT877758E

PT877758E - Proteína sr-p70 purificada

Info

Publication number: PT877758E
Application number: PT97904481T
Authority: PT
Inventors: Pascual Ferrara; Daniel Caput; Ahmed Mourad Kaghad
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2009-07-10
Also published as: FR2744455B1; NO983537L; EP0877758B1; MX9806041A; TW515802B; US7557187B2; ZA97835B; NO323285B1; US20090258409A1; ES2322971T3; NO983537D0; US20050202016A1; BR9710919A; US7838648B2; AU1727597A; FR2744455A1; DE69739346D1; DK0877758T3; EP0877758A2; JP3447301B2

Description

ΡΕ0877758 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNA SR-p70 PURIFICADA" O invento está relacionado com novas sequências de ácidos nucleicos da família dos genes supressores de tumores relacionados com o gene da proteína p53 e com as sequências proteicas correspondentes. 0 invento está igualmente relacionado com aplicações profiláticas, terapêuticas e de diagnóstico das mesmas, principalmente no domínio das patologias associadas a fenómenos de apoptose ou de transformação celular.

Os genes supressores de tumores desempenham um papel chave na protecção contra os fenómenos de cance-rização e contra qualquer modificação susceptível de induzir a perda de um destes genes, sua inactivação ou mau funcionamento, podendo ter um carácter oncogénico e criando assim condições favoráveis ao desenvolvimento de um cancro.

Os autores do presente invento identificaram produtos da transcrição de um novo gene, assim como as proteínas correspondentes. 0 gene SR-p70 está relacionado com o gene supressor de tumores p53, cuja actividade anti-tumoral está ligada à sua actividade de factor de transcrição e, mais especificamente, aos controlos exercidos 2 ΡΕ0877758 sobre a actividade dos genes Bax e Bcl-2, fundamentais para os mecanismos de morte celular. 0 presente invento está assim relacionado com proteínas SR-p70 purificadas. 0 invento está igualmente relacionado com sequências de ácido nucleico isoladas codificadoras das referidas proteínas e oligonucleótidos específicos obtidos a partir destas sequências. O invento tem ainda como objectivo outros vectores de clonagem e/ou de expressão contendo pelo menos uma das sequências nucleotídicas definidas abaixo e células hospedeiras transfectadas com estes vectores de clonagem e/ou expressão nas condições que permitem a replicação e/ou expressão de uma das referidas sequências nucleotídicas.

Os métodos de produção de proteínas recombinantes SR-p70 pelas células hospedeiras transfectadas fazem igualmente parte do invento. 0 invento compreende igualmente anticorpos ou derivados de anticorpos específicos das proteínas aqui definidas. 0 invento tem ainda como objectivos outros métodos de detecção de cancros, seja através da medição da acumulação das proteínas SR-p70 em tumores de acordo com técnicas de imuno-histoquímica, seja através da detecção de anticorpos dirigidos contra estas proteínas no soro de doentes. 3 ΡΕ0877758

Este pedido de patente descreve igualmente qualquer inibidor ou activador da actividade de SR-p70, por exemplo, da interacção proteina-proteina em que intervenha SR-p70. Descreve também sequências oligonucleotidicas complementares das sequências codificadoras, especificas de sequências de ácidos nucleicos atrás, podendo modular a expressão in vivo do gene SR-p70.

Finalmente, este pedido de patente descreve um método de terapia génica no qual estes vectores, como sejam, por exemplo, vectores virais inactivados capazes de transferir as sequências codificadoras de uma proteina de acordo com o invento, são injectados em células deficientes para esta proteina, com a finalidade de regular os fenómenos de apoptose ou de reversão da transformação. O presente invento tem por objectivo um polipéptido purificado compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre: a) a sequência SEQ ID n° 2; b) a sequência SEQ ID n° 4; c) a sequência SEQ ID n° 6; d) a sequência SEQ ID n° 8; e) a sequência SEQ ID n° 10; f) a sequência SEQ ID n° 13; g) a sequência SEQ ID n° 15; h) a sequência SEQ ID n° 17; i) a sequência SEQ ID n° 19. 4 ΡΕ0877758

Este pedido de patente descreve ainda uma sequência biologicamente activa derivada de SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19.

Na descrição utilizam-se as seguintes definições: - proteína SR-p70: um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19. derivado: qualquer polipéptido variante da sequência SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19 ou qualquer molécula resultante de uma modificação de natureza genética e/ou química da sequência SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19 obtida por mutação, deleção, adição, substituição e/ou modificação química de um único aminoácido ou de uma série limitada de aminoácidos, assim como qualquer sequência de isoforma, ou seja uma sequência idêntica à sequência SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19, a um dos seus fragmentos ou sequências modificadas, contendo um ou mais aminoácidos sob a forma de enantiómetro D, as referidas sequências variantes, modificadas ou isoformas tendo conservada pelo menos uma das propriedades que as tornam biologicamente activas. 5 ΡΕ0877758 - biologicamente activo: capaz de se ligar a um DNA e/ou exercer uma actividade de factor de transcrição e/ou participar no controlo do ciclo celular, da diferenciação e da apoptose e/ou capaz de ser reconhecido pelos anticorpos específicos do polipéptido com a sequência SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19 e/ou capaz de induzir anticorpos que reconhecem este polipéptido. A produção de derivados pode ter diferentes objectivos, em particular aumentar a afinidade do polipéptido para DNA ou a sua actividade de factor de transcrição, melhorar as suas taxas de produção, ou aumentar a sua resistência a proteases, modificar as suas actividades biológicas ou conferir novas propriedades farmacêuticas e/ou biológicas.

Entre os polipéptidos do invento, prefere-se o polipéptido de origem humana, compreendendo a sequência SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19. O polipéptido de 636 aminoácidos correspondendo à sequência SEQ ID n° 6 é idêntico em mais de 97% ao polipéptido da sequência SEQ ID n° 2. O polipéptido da sequência SEQ ID n°2 e o da sequência SEQ ID n°4 são dois produtos de expressão de um mesmo gene, o mesmo para as sequências SEQ ID n°8 e SEQ ID n°10 e para as sequências SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19. 6 ΡΕ0877758

Como será explicado nos exemplos, o polipéptido da sequência SEQ ID n° 4 corresponde a uma terminação prematura do péptido da sequência SEQ ID n°2, ligado a um "splicing" alternativo do transcrito codificador do polipéptido de SEQ ID n°2, o RNA mensageiro mais longo do gene correspondente. 0 mesmo acontece para o ser humano, os polipéptidos correspondentes às sequências SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 e SEQ ID n° 19 divergem na sua composição ao nível das regiões N- e/ou C-terminal e resultam de "splicing" alternativos de um mesmo transcrito primário. A sequência peptídica N-terminal tem a sequência SEQ ID n° 10 deletada, isto devido a um "splicing" alternativo do seu transcrito codificador.

De preferência, o invento tem por objectivo um polipéptido correspondente ao domínio de ligação ao DNA de um dos polipéptidos referidos.

Este domínio corresponde à sequência compreendida entre o resíduo 110 e o resíduo 310 para as sequências SEQ ID n° 2 ou 6, e entre o resíduo 60 e o resíduo 260 para a sequência SEQ ID n°8. O presente invento tem igualmente como objectivo sequências de ácidos nucleicos codificadoras de uma proteína SR-p70. 7 ΡΕ0877758

Mais de preferência, o invento tem por objectivo uma sequência de ácidos nucleicos isolada entre: a) a sequência SEQ ID n° i; b) a sequência SEQ ID n° 3; c) a sequência SEQ ID n° 5; d) a sequência SEQ ID n° 7; e) a sequência SEQ ID n° 9; f) a sequência SEQ ID n° li; g) a sequência SEQ ID n° 12; h) a sequência SEQ ID n° 14; i) a sequência SEQ ID n° 16; j) a sequência SEQ ID n° 18.

Este pedido de patente descreve igualmente sequências de ácidos nucleicos capazes de hibridarem especificamente com a sequência SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9, SEQ ID n° 11, SEQ ID n° 12, SEQ ID n° 14 ou SEQ ID n° 16 ou SEQ ID n° 18, ou com as suas sequências complementares, ou de hibridarem especificamente com as sequências de maior similaridade; e sequências derivadas das sequências a), b), c), d), e), f), g), h) , i), j) ou k) devido à degenerescência do código genético.

De acordo com um modo de realização preferido, o invento tem por objectivo sequências nucleotídicas SEQ ID n°5, SEQ ID n° 12, SEQ ID n° 14, SEQ ID n° 16 e SEQ ID n° 18 correspondendo respectivamente aos cDNAs de proteínas ΡΕ0877758 humanas com as sequências SEQ ID n° 6, SEQ ID n°13, SEQ ID n°15, SEQ ID n°17 e SEQ ID n°19.

As diferentes sequências nucleotidicas do invento podem ser de oriqem artificial ou não. Pode-se tratar de sequências de DNA ou de RNA, obtidas através do rastreio de bancos de sequências usando sondas elaboradas com base nas sequências SEQ ID n° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16 ou 18. Tais bancos podem ser preparados por técnicas clássicas de biologia molecular, conhecidas dos familiarizados com a matéria.

As sequências nucleotidicas de acordo com o invento podem igualmente ser preparadas através de síntese química ou ainda por métodos mistos incluindo a modificação química ou enzimática de sequências obtidas através do rastreio de bancos. Estas sequências nucleotidicas permitem a produção de sondas nucleotidicas, capazes de hibridar fortemente e especificamente com uma sequência de ácido nucleico, de um DNA genómico ou de um RNA mensageiro, codificadora de um polipéptido de acordo com o invento. Tais sondas podem ser produzidas como instrumento de diagnóstico in vitro para a detecção, através de experiências de hibridação, de transcritos específicos dos polipéptidos do invento em amostras biológicas ou para detectar sínteses aberrantes ou anomalias genéticas, como sejam a heterozigotia ou o rearranjo genético, resultantes de um polimorfismo ou de "splicing" diferencial. 9 ΡΕ0877758

As sondas do invento compreendem a totalidade da sequência do gene SR-p70 ou do seu cDNA contido, por exemplo, num cosmideo.

Entre as sondas mais curtas, ou seja com cerca de 10 a 20 nucleótidos, as condições de hibridação adequadas correspondem às condições restringentes geralmente utilizadas pelos familiarizados com a matéria.

A temperatura utilizada está de preferência compreendida entre Tm -5°C até Tm -30°C, de preferência ainda entre Tm -5°C e Tm -10°C, Tm sendo a temperatura de fusão, temperatura à qual se separam 50% das cadeias de DNA emparelhadas. A hibridação é de preferência realizada em soluções de força iónica elevada, como sejam as soluções de SSC 6X.

De forma vantajosa, as condições de hibridação utilizadas são as seguintes: - temperatura: 42°C, - tampão de hibridação: SSC 6X, Denhart 5X, 0,1% SDS, tal como descrito no exemplo III.

Estas sondas de acordo com o invento são representadas pelos oligonucleótidos que se seguem ou suas sequências complementares: 10 - ΡΕ0877758

SEQ ID n° 20: GCG AGC TGC CCT CGG AG SEQ ID n° 21: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G SEQ ID n° 22: GCC ATG CCT GTC TAC AAG SEQ ID n° 23: ACC AGC TGG TTG ACG GAG SEQ ID n° 24: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG SEQ ID n° 25: GTG GAT CTC GGC CTC C SEQ ID n° 26 : AGG CCG GCG TGG GGA AG SEQ ID n° 27: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G SEQ ID n° 28: GCG GCC ACG ACC GTG AC SEQ ID n° 29: GGC AGC TTG GGT CTC TGG SEQ ID n° 30: CTG TAC GTC GGT GAC CCC SEQ ID n° 31: TCA GTG GAT CTC GGC CTC SEQ ID n° 32: AGG GGA CGC AGC GAA ACC SEQ ID n° 33: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C SEQ ID n° 34: CCA GGA CAG GCG CAG ATG SEQ ID n° 35: GAT GAG GTG GCT GGC TGG A SEQ ID n° 36: TGG TCA GGT TCT GCA GGT G SEQ ID n° 37: CAC CTA CTC CAG GGA TGC SEQ ID n° 38: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC SEQ ID n° 39: CAG GCC CAC TTG CCT GCC SEQ ID n° 40: CTG TCC CCA AGC TGA TGA G

Preferencialmente, as sondas do invento são marcadas, antes da sua utilização. Para tal, estão disponíveis aos familiarizados com a matéria numerosas técnicas (marcação fluorescente, radioactiva, quimioluminescente, enzimática, etc). 11 ΡΕ0877758

Os métodos de diagnóstico in vitro nos quais as sondas nucleotidicas são utilizadas, estão incluidos no objectivo do presente invento.

Estes métodos dizem respeito, por exemplo, à detecção de sínteses anormais (ex. acumulação de produtos de transcrição) ou anomalias genéticas, tais como a perda de heterozigotia e o rearranjo genético e as mutações pontuais ao nível de sequências nucleotidicas de ácidos nucleicos codificadores de uma proteína SR-p70, de acordo com a definição anteriormente dada.

As sequências nucleotidicas do invento são igualmente úteis para a produção e utilização de sequências iniciadoras oligonucleotídicas para as reacções de sequen-ciação ou de amplificação específicas de acordo com a técnica de PCR ou qualquer variante desta (Reacção em cadeia da ligase (LCR), ...) .

Os pares de sequências iniciadoras preferidos são constituídos por sequências iniciadoras escolhidas entre as sequências nucleotidicas: SEQ ID n°l: sequência símia de 2874 nucleótidos e SEQ ID n° 5: cDNA de SR-p70a humano, nomeadamente a montante do codão de iniciação ATG e a jusante do codão TGA de paragem da tradução.

Vantajosamente, estas sequências iniciadoras estão representadas pelos seguintes pares: 12 ΡΕ0877758 - par n°l: sequência iniciadora directa: GCG AGC TGC CCT CGG AG (SEQ ID n°20) sequência iniciadora reversa: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G (SEQ ID n°21) - par n°2: sequência iniciadora directa: GCC ATG CCT GTC tac AAG (SEQ ID n°22) sequência iniciadora reversa: ACC AGC TGG TTG ACG GAG (SEQ ID n°23) - par n°3: sequência iniciadora directa: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG (SEQ ID n°24) sequência iniciadora reversa: GTG GAT CTC GGC CTC C (SEQ ID n°25) - par n°4: sequência iniciadora directa: AGG CCG GCG TGG GGA AG (SEQ ID n°26) sequência iniciadora reversa: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID n°27) - par n°5: sequência iniciadora directa: GCG GCC ACG ACC GTG A (SEQ ID n°28) sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID n°29) 13 ΡΕ0877758 - par n°6: sequência iniciadora directa: CTG TAC GTC GGT GAC CCC (SEQ ID n°30) sequência iniciadora reversa: TCA GTG GAT CTC GGC CTC (SEQ ID n°31) - par n°7: sequência iniciadora directa: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (SEQ ID n°32) sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID n°29) - par n°8: sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C (SEQ ID n°33) - par n°9: sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CCA GGA CAG GCG CAG ATG (SEQ ID n°34) - par n°10: sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID n°27) 14 ΡΕ0877758 - par n°ll: sequência iniciadora directa: CAC CTA CTC CAG GGA TGC (SEQ ID n°37) sequência iniciadora reversa: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC (SEQ ID n°38) - par n°12: sequência iniciadora directa: CAG GCC CAC TTG CCT GCC (SEQ ID n°39) sequência iniciadora reversa: CTG TCC CCA AGC tga TGA g (SEQ ID n°40)

Estas sequências iniciadoras correspondem às sequências tendo respectivamente: - do nucleótido n°124 ao nucleótido n°140 em SEQ ID n°l e do nucleótido n°l ao nucleótido n°17 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°20 - do nucleótido n°2280 ao nucleótido n°2262 em SEQ ID n°l e do nucleótido n°2156 ao nucleótido n°2138 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°21 - do nucleótido n°684 ao nucleótido n°701 em SEQ ID n°l para SEQ ID n°22 - do nucleótido n°1447 ao nucleótido n°1430 em SEQ ID n°l e do nucleótido n°1324 ao nucleótido n°1307 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°23 15 ΡΕ0877758 - do nucleótido n°1434 ao nucleótido n°1454 em SEQ ID n°l e do nucleótido n°1311 ao nucleótido n°1331 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°24 - do nucleótido n°2066 ao nucleótido n°2051 em SEQ ID n°l e do nucleótido n°1940 ao nucleótido n°1925 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°25 - do nucleótido n°16 ao nucleótido n°32 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°26 - do nucleótido n°503 ao nucleótido n°485 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°27 - do nucleótido n°160 ao nucleótido n°176 em SEQ ID n°ll para SEQ ID n° 28 - do nucleótido n°1993 ao nucleótido n°1976 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°29 - do nucleótido n°263 ao nucleótido n°280 em SEQ ID n°ll para SEQ ID n°30 - do nucleótido n°1943 ao nucleótido n°1926 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°31 - do nucleótido n°128 ao nucleótido n°145 na sequência nucleotidica representada na figura 22 para SEQ ID n°32 16 ΡΕ0877758 - do nucleótido n°1167 ao nucleótido n°1149 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°33 - do nucleótido n°928 ao nucleótido n°911 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°34 - do nucleótido n°677 ao nucleótido n°659 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°35 - do nucleótido n°1605 ao nucleótido n°1587 em SEQ ID n°5 para SEQ ID n°36 do nucleótido 1 ao nucleótido 18 na sequência nucleotidica representada na figura 13 para SEQ ID n°37 do nucleótido 833 ao nucleótido 813 na sequência nucleotidica representada na figura 13 para SEQ ID n°38 do nucleótido 25 ao nucleótido 42 na sequência nucleotidica representada na figura 13 para SEQ ID n°39 do nucleótido 508 ao nucleótido 488 na sequência nucleotidica representada na figura 13 para SEQ ID n°40

As sequências nucleotidicas de acordo com o invento podem, por outro lado, ser utilizadas para a produção de proteínas recombinantes SR-p70, de acordo com a definição dada para este termo. 17 ΡΕ0877758

Estas proteínas podem ser produzidas a partir de sequências nucleotídicas definidas atrás, de acordo com as técnicas de produção dos produtos recombinantes conhecidos dos familiarizados com a matéria. Neste caso, a sequência nucleotídica utilizada é colocada sob o controlo de sinais que permitem a sua expressão numa célula hospedeira.

Um sistema eficaz de produção de uma proteína recombinante necessita de dispor de um vector, por exemplo de origem plasmídica ou virai, e de uma célula hospedeira compatível. A célula hospedeira pode ser escolhida entre sistemas procarióticos, como sejam bactérias, ou eucarió-ticos, como por exemplo leveduras, células de insectos, CHO (células de ovário de hamster chinês) ou qualquer outro sistema disponível. Uma célula hospedeira preferida para a expressão de proteínas do invento consiste na bactéria E. coli, principalmente a estirpe MC 1061 (Clontec). O vector deverá comportar um promotor, sinais de iniciação e de terminação da tradução, assim como regiões adequadas de regulação da transcrição. Deve poder ser mantido estavelmente na célula e pode eventualmente possuir sinais particulares especificadores da secreção da proteína traduzida.

Estes diferentes sinais de controlo são esco- 18 ΡΕ0877758 lhidos em função da célula hospedeira utilizada. Para este fim, as sequências nucleotidicas de acordo com o invento podem ser inseridas em vectores de replicação autónoma no hospedeiro escolhido ou vectores que se integram no hospedeiro escolhido. Tais vectores serão preparados de acordo com os métodos normalmente utilizados pelos familiarizados com a matéria e os clones resultantes podem ser introduzidos num hospedeiro adequado por métodos convencionais, como seja, por exemplo, por electroporação.

Os vectores de clonagem e/ou de expressão contendo pelo menos uma das sequências nucleotidicas definidas atrás fazem igualmente parte do presente invento. Um vector de clonagem e de expressão preferido é o plasmídeo pSEl que, por sua vez, possui os elementos necessários para a sua utilização como vector de clonagem em E. coli (origem de replicação de E. coli e gene de resistência à ampicili-na, proveniente do plasmideo pTZ 18R) e como vector de expressão nas células animais (promotor, intrão, local de poliadenilação, origem de replicação do virus SV40), assim como elementos que permitem a sua cópia em cadeia simples num alvo de sequenciação (origem de replicação do fago fl).

As caracteristicas deste plasmideo estão descritas no pedido de patente EP 0 506 574. A sua construção, assim como a integração dos cDNAs provenientes de sequências de ácidos nucleicos do invento estão descritas nos exemplos que se seguem. 19 ΡΕ0877758

De acordo com um modo de realização preferido, as proteínas do invento são sob a forma de proteínas de fusão, principalmente sob a forma de proteínas fundidas com a glutationa-S-transferase (GST). Um vector de expressão escolhido neste caso é representado pelo vector plasmídico pGEX-4T-3 (Pharmacia ref-27.45B3) 0 invento tem ainda como objectivo outras células hospedeiras transfectadas com estes vectores referidos. Estas células podem ser obtidas através da introdução em células hospedeiras de uma sequência nucleotídica inserida num vector como definido atrás, seguido da cultura das referidas células em condições que permitem a replicação e/ou a expressão da sequência nucleotídica transfectada.

Estas células são utilizáveis num método de produção de um polipéptido recombinante da sequência SEQ ID n°2, SEQ ID n°4, SEQ ID n°6, SEQ ID n°8, SEQ ID n°10, SEQ ID n°12, SEQ ID n°14, SEQ ID n°16 ou SEQ ID n°18. 0 método de produção de um polipéptido do invento sob a forma recombinante está, ele próprio, contido no presente invento, e caracteriza-se pela cultura das células transfectadas em condições que permitem a expressão de um polipéptido recombinante com a sequência SEQ ID n°2, SEQ ID n°4, SEQ ID n°6, SEQ ID n°8, SEQ ID n°10, SEQ ID n°12, SEQ ID n°l4, SEQ ID n°16 ou SEQ ID n°18 e recuperação do referido polipéptido recombinante. 20 ΡΕ0877758

Os processos de purificação utilizados são conhecidos dos familiarizados com a matéria. O polipéptido recombinante pode ser purificado a partir de lisados e de extractos celulares ou do meio de cultura do sobrenadante, por métodos utilizados individualmente ou em combinação, como seja o fraccionamento, os métodos de cromatografia, as técnicas de imunoafinidade com a ajuda de anticorpos específicos, monoclonais ou policlonais, etc. Uma variante preferida consiste em produzir um polipéptido recombinante fundido com uma proteína "veículo" (proteína quimérica). A vantagem deste sistema é que permite a estabilização e a diminuição da proteólise do produto recombinante, o aumento da solubilidade no decurso da renaturação in vitro e/ou a simplificação da purificação quando o parceiro de fusão possui afinidade para um ligando específico.

De preferência, os polipéptidos do invento são fundidos com a glutationa-S-transferase na posição N-terminal (sistema "GST" Pharmacia). O produto de fusão é neste caso detectado e quantificado graças à actividade enzimática da GST. O reagente colorimétrico utilizado é um aceitador do glutatião, substrato da GST. O produto recombinante é purificado num suporte de cromatografia ao qual foram previamente acopladas moléculas de glutatião.

Os anticorpos monoclonais ou policlonais capazes de reconhecer especificamente uma proteína SR-p70, de acordo com a definição dada anteriormente, fazem igualmente parte do invento. Os anticorpos policlonais podem ser 21 ΡΕ0877758 obtidos a partir de soro de um animal imunizado contra a proteina, produzida por exemplo através de recombinação genética seguindo o método atrás descrito, de acordo com métodos convencionais. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de acordo com o método clássico de cultura de hibridomas descrito por Kohler e Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497.

Os anticorpos preferidos são os dirigidos contra a região central compreendida entre o resíduo 110 e o resíduo 310 para as sequências SEQ ID n°2 ou 6 ou entre o resíduo 60 e o resíduo 260 para a sequência SEQ ID n°8.

Os anticorpos de acordo com o invento são, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fragmentos Fab e F(ab')2. Podem igualmente apresentar-se sob a forma de imunoconjugados ou de anticorpos marcados. Ainda, para além da sua utilização na purificação de polipéptidos recombinantes, os anticorpos do invento, em particular os anticorpos monoclonais, podem ser igualmente usados na detecção destes polipéptidos numa amostra biológica.

Eles constituem assim um meio de análise imunocitoquíca da expressão de proteínas SR-p70 em cortes de tecidos específicos, por exemplo por imunofluorescência, marcação com ouro, imunoconjugados enzimáticos. Eles permitem designadamente detectar uma acumulação anormal de proteínas SR-p70 em determinados tecidos ou amostras 22 ΡΕ0877758 biológicas, o que os torna úteis para a detecção de cancros ou acompanhamento da evolução ou remissão de cancros pré- existentes .

De um modo mais geral, os anticorpos do invento podem ser preferencialmente usados em qualquer situação em que a expressão de uma proteína SR-p70 deve ser observada. Igualmente, o invento diz respeito a um processo de diagnóstico in vitro de patologias relacionadas com a expressão ou com a acumulação anormal de proteínas SR-p70, principalmente nos fenómenos de cancerização, a partir de uma amostra biológica, caracterizado por colocar em contacto pelo menos um anticorpo do invento com a referida amostra biológica, em condições que permitem a eventual formação de complexos imunológicos específicos entre uma proteína SR-p70 e o ou os referidos anticorpos e detecção dos complexos imunológicos específicos eventualmente formados. 0 invento diz igualmente respeito a um kit de diagnóstico in vitro para detectar a expressão ou a acumulação anormal de proteínas SR-p70 numa amostra biológica e/ou para medição de taxas de expressão desta na referida amostra compreendendo: - pelo menos um anticorpo específico de uma proteína SR-p70, eventualmente fixado num suporte, - meios de detecção da formação de complexos antigénio/anticorpo específicos entre uma proteína SR-p70 e 23 ΡΕ0877758 o referido anticorpo e/ou meios de quantificação específicos destes complexos. 0 invento tem igualmente como objectivo um método de diagnóstico precoce da formação de tumores, através da detecção no soro de um indivíduo de auto-anticorpos dirigidos contra uma proteína SR-p70. 0 referido método de diagnóstico precoce é caracterizado por se colocar em contacto uma amostra de soro colhido de um indivíduo com um polipéptido do invento, eventualmente fixado num suporte, nas condições que permitem a formação de complexos imunológicos entre o referido polipéptido e os auto-anticorpos eventualmente presentes na amostra de soro e por se detectar os complexos imunológicos específicos eventualmente formados. 0 invento tem também como objectivo um método para determinação de uma variação alélica, mutação, deleção, inserção, perda de heterozigotia ou anomalia genética do gene SR-p70 que possam estar implicadas nas patologias, caracterizado por ser usada pelo menos uma sequência nucleotídica atrás descrita. Entre os métodos de detecção de variação alélica, mutação, deleção, inserção, perda de heterozigotia ou anomalia genética do gene SR-p70, prefere-se o método caracterizado por compreender pelo menos um passo de amplificação por PCR da sequência de ácido nucleico alvo de SR-p70, susceptível de apresentar um polimorfismo, uma mutação, uma deleção ou uma inserção, com a ajuda de sequências iniciadoras tendo as sequências 24 ΡΕ0877758 nucleotídicas definidas atrás, um passo no decurso do qual se procede ao tratamento dos produtos amplificados com a ajuda da enzima de restrição adequada e um passo no decurso do qual se procede à detecção ou ao doseamento de pelo menos um dos produtos da reacção enzimática. 0 invento compreende igualmente composições farmacêuticas compreendendo como principio activo um polipéptido correspondente às definições anteriores, de preferência sob a forma solúvel, associado a um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Tais composições oferecem uma nova abordagem para tratar os fenómenos de cancerização ao nível do controlo da multiplicação e da diferenciação celular. De preferência, estas composições podem ser administradas por via sistémica, de preferência por via intravenosa, por via intramuscular, intradérmica ou por via oral.

Os modos de administração, posologias e formas galénicas óptimas podem ser determinados de acordo com critérios geralmente considerados quando do estabelecimento de um tratamento terapêutico adaptado a um doente, como por exemplo, a idade, o peso corporal do doente, a gravidade do seu estado geral, a tolerância ao tratamento e efeitos secundários constatados, etc.

Outras características e vantagens do invento são apresentadas, após a descrição, com os exemplos e figuras cujas legendas estão a seguir apresentadas. 25 ΡΕ0877758

LEGENDA DAS FIGURAS

Figura 1: Comparação da sequência do cDNA de SR-p70a de simio (correspondente a SEQ ID n°l) com a sequência do cDNA de p53 de simio.

Figura 2: Comparação da sequência proteica de SR-p70a de simio com a proteina p53 de simio (sw: p53-cerae).

Figura 3: Comparação da sequência do cDNA de SR-p70a e b de simio (correspondendo respectivamente a SEQ ID n°1 e a SEQ ID n°3).

Figura 4: Sequência de ácido nucleico e proteica deduzida para SR-p70a de simio.

Figura 5: Sequência de ácido nucleico parcial e sequência proteica da referida SR-p70a de simio.

Figura 6: Sequência de ácido nucleico parcial e sequência proteica completa deduzida de SR-p70a humana (correspondendo a SEQ ID n°5).

Figura 7: Sequência de ácido nucleico parcial e sequência proteica completa deduzida de SR-p70c de ratinho (correspondendo a SEQ ID n°7).

Figura 8: Sequência de ácido nucleico parcial e 26 ΡΕ0877758 sequência proteica parcial deduzida de SR-p70c de ratinho (correspondendo a SEQ ID n°9) .

Figura 9: Alinhamento de múltiplas sequências de proteínas deduzidas de cDNA de SR-p70 de símio (a e b), humano (a) e de ratinho (a e c).

Figura 10a: Imunotransferência da proteína SR- p70 .

Figura 10b: Detecção da proteína endógena SR-p70.

Figura 11: Localização cromossómica do gene SR-p70 humana. O sinal surge no cromossoma 1, na região p36.

Figura 12: Estrutura genómica do gene SR-p70 e comparação com a do gene p53. As sequências proteicas humanas de SR-p70a (linha superior do alinhamento) e da p53 (linha inferior) estão divididas em péptidos em função dos respectivos exões a partir dos quais são codificados. Os números ao nível das setas correspondem à numeração dos exões correspondentes.

Figura 13: Sequência genómica humana de SR-p70 entre o extremo 3' do intrão 1 e o extremo 5' do exão 3. Os intrões estão enquadrados. Nas posições 123 e 133 estão localizadas duas posições nucleotídicas variáveis (G->A em 123 e C->T em 133). Os locais de restrição da enzima Styl estão sublinhados (posição 130 no caso em que existe uma 27 ΡΕ0877758 presença de um T em lugar de um C na posição 133, posição 542 e posição 610) . As setas posicionam as sequências iniciadoras utilizadas no exemplo XI.

Figura 14: Comparação da sequência de ácido nucleico dos extremos 5' dos cDNAs humanos de SR-p70d e de SR-p70a.

Figura 15: Alinhamento de múltiplas sequências de ácido nucleico correspondendo a SR-p70 humana a, b, d, e, e f.

Figura 16: Alinhamento de múltiplas sequências proteicas deduzidas dos cDNAs de SR-p70 humanos (a, b, d, e e f) .

Figura 17: Sequência de ácido nucleico parcial e sequência proteica deduzida parcial de SR-p70a humana. As duas bases a negrito correspondem a duas posições variáveis (ver figura 6). Esta sequência apresenta uma região 5' não codificadora mais completa que a apresentada na figura 6.

Figura 18: Análise dos transcritos SR-p70a após amplificação por PCR. pista M: marcadores de pesos moleculares "escada de 1 kb" (GIBCO-BRL) pista 1: linha HT29 pista 3: linha SK-N-AS pista 5: linha UMR-32 28 ΡΕ0877758

pista 7: linha U-373 MG pista 9: linha SW 480 pista 11: linha CHP 212 pista 13: linha SK-N-MC pistas 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: testemunhas negativas correspondentes às pistas 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13, respec-tivamente (ausência de transcriptase reversa na reacção de RT-PCR).

Figura 19: A: Análise por electroforese em gel de agarose dos fragmentos genómicos amplificados por PCR (entre o extremo 3' do intrão 1 e o extremo 5' do exão 3). A numeração das pistas corresponde à numeração da amostra testemunha. Pista M: marcadores de pesos moleculares ("escada de 1 Kb"). B: Análise idêntica à da parte A após a digestão com a enzima de restrição Styl das mesmas amostras.

Figura 20: Representação esquemática com um mapa de restrição parcial do plasmideo pCDN3 contendo a SR-p70a humana.

EXEMPLO I

Clonagem do cDNA de SP-p70 de células COS-3 1. Cultura das células COS-3

As células COS-3 (células de rim de macaco verde 29 ΡΕ0877758 africano transformadas com o antigénio T do vírus SV40) são cultivadas no meio DMEM (GIBCO-BRL) referência 41 965-047) contendo L-glutamina 2 mM e suplementado com 5 0 mg/1 de gentamicina e 5% de soro fetal bovino (GIBCO-BRL referência 10231-074) até semi-confluência. 2. Preparação do RNA mensageiro a) extracção do RNA mensageiro

As células foram recuperadas da seguinte forma: - as células aderentes foram lavadas duas vezes com tampão PBS (soro fisiológico tamponado com fosfatos, referência 04104040-GIBCO-BRL) raspadas com um raspador de borracha e centrifugadas. O sedimento celular foi suspenso em tampão de lise com a seguinte composição: guanidina-tiocianato 4M; citrato de sódio 25 mM pH 7; sarcosil 0,5 %; β-mercaptoetanol 0,1 Μ. A suspensão foi sonicada com a ajuda de um sonicador Ultra-Turrax n°231256 (Janke e Kundel) na potência máxima durante um minuto. Adicionou-se acetato de sódio pH 4 até 0,2 Μ. A solução foi extraída com igual volume de mistura de fenol/clorofórmio (v/v 5/1). Precipitou-se a -20°C o RNA presente na fase aquosa com a ajuda de um volume de isopropanol. O sedimento foi ressuspenso no tampão de lise. A solução foi novamente extraída com uma mistura de fenol/clorofórmio e o RNA foi precipitado com o isopropanol. Após lavagem do sedimento com etanol a 70% seguido de 100%, o RNA foi ressupenso em água. 30 ΡΕ0877758

b) Purificação da fracção poli A+ do RNA A purificação da fracção poli A+ do RNA foi realizada com a ajuda do kit Dynabeads oligo(dT)25 da DYNAL (referência 610.05) seguindo o protocolo preconizado pelo fabricante. O principio baseia-se na utilização de esferas de polistireno superparamagnéticas às quais está ligado um oligonucleótido poli(dT) 25. A fracção poli A+ do RNA híbrida com o oligo(dT)25 acoplado às esferas que são colocadas sobre um suporte magnético. 3. Constituição do banco de DNA complementar a) preparação do DNA complementar A partir de 0,5 pg do RNA poli A+ de células COS-3 obtidas no final do passo 2, prepara-se DNA complementar de cadeia simples marcado com 32PdCTP (o DNA complementar obtido apresenta uma actividade específica de 3000 dpm/ng) com a sequência iniciadora sintética que se segue (compreendendo um local BamHI): 5'<GATCCGGGCC CTTTTTTTT TTT<3' num volume de 30 μΐ de tampão com a composição: Tris HC1 50 mM pH 8,3, MgCl2 6 mM, DTT 10 mM; KC1 40 mM, contendo0,5 mM de cada um dos trifosfatos de desoxinucleótidos, 30 pCi de dCTP a32P e 30 U de RNasina (Promega) . Após uma hora de incubação a 37°C, seguiu-se 10 minutos a 50°C, depois novamente 10 minutos a 37°C, com 200 unidades da enzima 31 ΡΕ0877758 transcriptase reversa RNase H (GIBCO-BRL referência 8064a) e adição de 4 μΐ de EDTA. b) Hidrólise alcalina do RNA matriz

Adicionou-se 6 μΐ de uma solução de NaOH 2N, seguido de incubação durante 5 minutos a 65°C. c) Purificação em coluna de Sephacryl S400

Para eliminar a sequência iniciadora, purificou-se o DNA complementar numa coluna de 1 ml de Sephacryl S400 (Pharmacia) equilibrada em tampão TE. As duas primeiras fracções radioactivas foram reagrupadas e precipitadas com 1/10 do volume de uma solução de acetato de amónio 10 M e 2,5 volumes de etanol, neste caso após uma extracção, com um volume de clorofórmio.

d) Adição homopolimérica de dG

Prolongou-se o DNA complementar no extremo 3' com uma cauda de dG com 20 unidades da enzima transferase terminal (Pharmacia 27073001) . Incubou-se em 20 μΐ de tampão com a composição: Tris HC1 30 mM pH 7,6; cloreto de cobalto 1 mM, ácido cacodilico 140 mM, DTT 0,1 mM, dGTP 1 mM, durante 15 minutos a 37°C, em seguida adicionou-se 2 μΐ de EDTA 0,5 M. e) repetiu-se novamente os passos b) e c) f) emparelhou-se o vector de clonagem pSEl (EP 506 574) com 32 ΡΕ0877758 o DNA complementar na presença do adaptador. Centrifugou-se, o sedimento foi dissolvido em 33 μΐ de tampão te, adicionou-se 5 μΐ ( 125 ng) do vector de clonagem pSEl, 1 μΐ (120 ng) do adaptador com a seguinte sequência (compreendendo um local Apal): 5'AAAAAAAAAAAAAAGGGCCCG3' 10 μΐ de uma solução de NaCl 200 mM, incubou-se durante 5 minutos a 65°C, depois deixou-se arrefecer a mistura de reacção até à temperatura ambiente. g) Ligação

Ligou-se o vector de clonagem e o cDNA de cadeia simples num volume de 100 μΐ com 32,5 unidades da DNA-ligase do fago T4 (Pharmacia referência 270 87002) durante a noite a 15°C num tampão de composição: Tris HC1 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM.

h) Síntese da segunda cadeia do cDNA

Eliminaram-se as proteínas por extracção com fenol, seguida de uma extracção com clorofórmio, depois adicionou-se 1/10 do volume de uma solução de acetato de amónio 10 mM, seguido de 2,5 volumes de etanol. Centrifugou-se, o sedimento foi dissolvido no tampão com a composição Tris acetato 33 mM pH 7,9, acetato de potássio 62,5 mM, acetato de magnésio 1 mM e ditiotreitol (DTT) 1 mM, a segunda cadeia do DNA complementar foi sintetizada num volume de 30 μΐ com 30 unidades da enzima DNA-polimerase do fago T4 (Pharmacia, referência 270718) e uma mistura dos quatro trifosfatos de desoxinucleótidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP 1 mM, assim como duas unidades da proteína do gene 32 do fago T4 (Pharmacia, referência 27-0213)) durante uma hora a 33 ΡΕ0877758 37°C. Extraiu-se com fenol e removeu-se os vestígios de fenol através de uma coluna de poliacrilamida PIO (Biogel P10-200-400 mesh - referência 1501 1050 - Biorad). i) Transformação por electroporação

Transformaram-se as células E. coli MC 1061, com DNA recombinante obtido anteriormente, por electroporação com a ajuda de um aparelho Biorad Gene Pulser (Biorad) utilizado a 2,5 KV nas condições descritas pelo fabricante, seguido de recuperação das bactérias durante uma hora em meio LB (Sambrook op cite) com a composição: bactotriptona 10 g/1; extracto de levedura 5g/l; NaCl 10 g/1.

Determinou-se o número de clones independentes semeando uma diluição de 1/1000 da mistura de transformação, após a primeira hora de incubação, numa placa de meio LB a que se adicionou 1,5% de agar (p/v) e 100 μρ/ιηΐ de ampicilina, designado daqui em diante como meio LB gelosado. O número de clones independentes foi de 1 milhão.

j) Análise do banco de cDNA

No contexto da análise de clones individuais do banco por sequenciação dos ácidos nucleicos do extremo 5' do cDNA, um clone, designado SR-p70a, mostrou possuir homologia parcial com o cDNA da proteína já conhecida, a proteína p53 (Genbank X 02469 e X 16384) (Figura 1). As sequências foram feitas com o kit United States Biochemical 34 ΡΕ0877758 (referência 70770) e/ou com o kit Applied Biosystems (referências 401434 e/ou 401628) que utiliza o método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 1977, 14, 5463— 546 7. O DNA plasmidico foi preparado a partir do kit de minipreparações WIZARD (Promega referência A7510). As sequências iniciadoras usadas foram os oligonucleótidos 16 a 22 meros, complementares do vector pSEl na região imediatamente 5' relativamente ao cDNA ou da sequência do cDNA.

Um segundo cDNA foi isolado a partir do mesmo banco testado, de forma semelhante à técnica descrita no Exemplo III 3) a seguir, com um fragmento do DNA de SR-p70a marcado com 32P usando o kit BRL "Random Primers DNA labelling systems" (referência 18187-013) . Os tampões de hibridação e de lavagem foram suplementados com 50% de formamida. A última lavagem foi realizada em SSC 0,1X/ 0,1% SDS a 60°C. Esta segunda sequência (cDNA SR-p70b) é idêntica à primeira mas possui um fragmento interno deletado (Figura 3).

Os dois cDNAs de SR-p70, com um comprimento de 2874 nucleótidos (SR-p70a) e de 2780 nucleótidos (SR-p70b) correspondendo aos produtos de um único gene, um "splicing" alternativo dando origem a uma deleção de 94 bases entre os nucleótidos 1637 e 1732 e uma terminação prematura da proteina codificada correspondente. As proteínas deduzidas destes dois cDNAs apresentam respectivamente 637 amino-ácidos e 499 aminoácidos (Figuras 4 e 5) . ΡΕ0877758 35

EXEMPLO II

Obtenção da sequência e clonagem do cDNA da proteína SR-p70a a partir de células HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano). 1) Cultura de células HT-29

As células foram cultivadas em meio McCoy 5 (GIBCO 2660-023), a que se adicionou 10% de soro fetal de vitela (GIBCO 10081-23) e 50 mg/ml de gentamicina, até à semi-confluência. 2) Preparação do DNA complementar O RNA mensageiro foi preparado como descrito no Exemplo 1.2. O cDNA foi preparado de forma semelhante ao descrito no Exemplo 1.3 com 5 μρ de RNA mensageiro total usando uma sequência iniciadora de poli(dT)i2. A reacção não foi parada com EDTA.

3) Amplificação específica do cDNA humano pela técnica de PCR A polimerização foi realizada com 4 μΐ do cDNA em 50 μΐ final com um tampão tendo a seguinte composição: Tris HC1 10 mM pH 8,3, MgCl2 2,5 mM, KC1 50 mM, na presença de 10% de DMSO, dNTPs 0,5 mM, 4 μρ/ιηΐ de cada uma das 36 ΡΕ0877758 sequências iniciadoras e 2,5 unidades de DNA-polimerase Taq (Boehringer). Os pares de sequências iniciadoras foram escolhidos com base na sequência de ácido nucleico do clone SR-p70 de COS-3, particularmente a montante do codão de iniciação ATG e a jusante do TGA de paragem da tradução têm as seguintes composições:

Sequência iniciadora directa: ACT GGT ACC GCG AGC TGC CCT CGG AG local de restrição Kpnl

Sequência iniciadora reversa: GAC TCT AGA GGT TCT GCA GGT GAC TCA G Local de restrição Xbal A reacção foi realizada durante 30 ciclos a 94°C/1 minuto, 54-60°C/l minuto 30 segundos e 72°C/1 minuto 30 segundos, seguido de um último ciclo de 72°C/6 minutos. 4) Obtenção da sequência de cDNA humano

Numa primeira fase, o produto de PCR foi separado dos oligonucleótidos numa coluna de Sephacryl S400, depois removido o sal através de cromatografia de exclusão numa coluna de poliacrilamida PIO (Biorad referência 1504144). As reacções de sequenciação foram efectuadas com a ajuda do kit Applied Biosystems (referência 401628) com os oligonucleótidos específicos do cDNA. A sequência obtida é muito semelhante à de SR-p70 de macaco e a proteina deduzida contem 636 aminoácidos (Figura 6). 37 ΡΕ0877758

De forma semelhante, outras sequências derivadas de linhas ou de tecidos humanos foram obtidas para a parte codificadora de SR-p70 humana, principalmente a partir de pulmão ou de pâncreas. As proteínas deduzidas destas sequências são idênticas às obtidas para a linha HT-29. 5) Clonagem do cDNA humano no plasmídeo pCDN3 (Invitrogen V 790-20) 0 produto de PCR obtido em 3) assim como o plasmideo foram digeridos pelas duas enzimas de restrição Kpnl e Xbal, depois purificados após migração em gel de agarose a 1% com a ajuda do kit Geneclean (Bio 101 referência 3105). Após ligação de 100 ng do inserto com 10 ng do vector e transformação (técnica descrita no Exemplo I.3g e i, os clones recombinantes foram confirmados por sequenciação com a ajuda do kit Applied Biosystems referido atrás.

EXEMPLO III

Clonagem do cDNA de SR-p70 de ratinho a partir de células AtT-20 (tumor hipofisário) 1) Cultura de células da linha AtT-20

As células foram cultivadas em meio Ham F10 (GIBCO 31550-023), suplementado com 15% de soro de cavalo 38 ΡΕ0877758 (GIBCO 26050-047) e 2,5% de soro fetal de vitela (GIBCO 10081-073) e 50 mg/1 de gentamicina, até à semi-confluên-cia. 2) Preparação do banco de cDNA complementar O banco foi preparado como descrito no Exemplo I, 2) e 3) a partir das células atrás cultivadas. 3) Rastrelo do banco a) Preparação das membranas

Os clones do banco foram crescidos no meio LB gelosado (caixas de Petri de 150 mm de diâmetro) revestido com membrana Biodyne A (PALL referência BNNG 132). Após uma noite a 37°C, os clones foram transferidos por contacto para a superfície de novas membranas. Estas últimas foram tratadas através da sua colocação sobre papel Whatman 3 mm embebido nas seguintes soluções: NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M durante 5 minutos, depois Tris HC1 0,5M pH 8,0, NaCl 1,5M durante 5 minutos. Após um tratamento com proteinase K no tampão seguinte: Tris HC1 10 mM pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 50 mM, SDS 0,1%, proteinase K 100 μρ/πιΐ durante uma hora à temperatura ambiente, as membranas foram lavadas abundantemente em SSC 2X (citrato de sódio NaCl), secas, depois incubadas numa estufa sob vácuo a 80°C durante 20 minutos. 39 ΡΕ0877758 b) Preparação da sonda

Com base nas sequências dos cDNAs de SR-p70 de macaco e humano, foi obtida uma primeira sequência de um fragmento amplificado a partir de mRNA da linha AtT-20 como descrito no Exemplo II. 3 e 4 com os oligómeros com as seguintes composições:

Sequência iniciadora directa: GCC ATG CCT GTC TAC AAG Sequência iniciadora reversa: ACC AGC TGG TTG ACG GAG.

Com base nesta sequência, foi escolhida uma sonda oligomérica especifica de ratinho tendo a seguinte composição : GAG CAT GTG ACC GAC ATT G. 100 ng da sonda foram marcados no extremo 3' com 10 unidades de transferase terminal (Pharmacia) e 100 μCi de dCTP a32P 3000 Ci/mmole (Amersham referência PB 10205) em 10 μΐ do seguinte tampão: Tris HC1 30 mM pH 7,6, ácido cacodílico 140 mM, C0CI2 1 mM, DTT 0,1 mM, durante 15 minutos a 37°C. Os nucleótidos marcados radioactivamente não incorporados foram eliminados numa coluna de poli-acrilamida P10 (Biorad, referência 1504144). A sonda obtida tinha uma actividade especifica à volta de 5.108 dpm/^g. c) Pré-hibridação e hibridação

As membranas preparadas em a) foram pré-hibri- 40 ΡΕ0877758 dadas 30 minutos a 42°C em SSC6X, Denhart 5X, 0,1% SDS, depois hibridadas algumas horas no mesmo tampão a que se adicionou a sonda preparada em b) na proporção de 106 dpm/ml. d) Lavagem e exposição das membranas

As membranas foram lavadas duas vezes à temperatura ambiente em tampão SSC 2X/0,1% SDS, depois uma hora a 56°C em SSC 6X/0,1% SDS. Os clones hibridados foram identificados com os filmes KODAK xomat. Um clone positivo contendo a SR-p70 de ratinho foi seleccionado e designado daqui em diante SR-p70c. 4) Sequenciação de SR-p70 de ratinho e análise da sequência A sequência foi obtida com a ajuda do kit Applied Biosystem (referência 401628) . A sequência proteica deduzida do cDNA de SR-p70c de ratinho (Figura 7) apresenta uma homologia muito forte com a humana e com a de macaco, excepto na parte N-terminal que diverge fortemente (ver Figura 9). Com a ajuda da técnica de PCR, de forma semelhante à descrita no Exemplo II.3 e 4, foi obtida uma segunda sequência 5' (saída do mesmo banco AtT-20) (Figura 8) . A sequência proteica N-terminal deduzida (sequência designada SR-p70a) é muito semelhante à deduzida dos cDNAs de SR-p70 humano e de macaco (SR-p70a) (Figura 9). A linha AtT-20 apresenta portanto pelo menos dois transcritos 41 ΡΕ0877758 SRp70. Estes 2 últimos divergem na parte N-terminal por "splicing" diferencial.

EXEMPLO IV 1) Produção da proteína recombinante SR-p70 em E. coli a) Construção do plasmideo de expressão

Consistiu em colocar a parte -COOH terminal da proteina SR-p70a de macaco a seguir à valina na posição 427 até à histidina -COOH terminal na posição 637, fundida com a glutationa S-transferase (GST) do vector plasmidico pGEX-4T-3 (Pharmacia referência 27-4583). Para tal, o inserto correspondente a SR-p70a (posição 1434 a 2066) foi amplificado por PCR com 10 ng do plasmideo contendo o cDNA SR-p70a de macaco. As sequências iniciadoras têm a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: TTT GGA TCC GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG Local de restrição BamHI Sequência iniciadora reversa: AAA GTC GAC GTG GAT CTC GGC CTC C local Sall O fragmento obtido atrás assim como o vector foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Sall e 42 ΡΕ0877758 a clonagem foi realizada como descrito no Exemplo II.5. 0 clone seleccionado foi designado pG SR-p70. b) Expressão e purificação da proteína de fusão GST-pSR-p70

Este passo foi realizado usando o kit "bulk GST purification module" (Pharmacia Referência 27-4570-01).

De forma esquemática, o clone recombinante foi colocado em cultura a 37°C num litro de meio 2X YTA + ampicilina 100 pg/ml. A uma DO de 0,8, a expressão foi induzida com IPTG 0,5 mM, durante 2 horas a 37°C. Após centrifugação, o sedimento celular foi ressuspenso em PBS frio, depois sonicado com ultra-sons. Após adição de 1% de Triton X-100, incubou-se 30 minutos sob agitação à temperatura ambiente. Após centrifugação a 12000 g, 10 minutos a 4°C, recuperou-se o sobrenadante. A purificação foi em seguida realizada numa coluna de cromatografia de afinidade de glutatião Sepharose 4B. A fixação e a lavagem foram realizadas em tampão PBS e a eluição foi realizada por competição com glutatião reduzido. A concentração final foi ajustada a 300 g/ml de proteina de fusão. 2) Produção da proteína SR-p70a em células COS-3.

As células COS-3 foram transfectadas com o DNA plasmidico pSEl no qual foi clonado cDNA de SR-p70 de 43 ΡΕ0877758 macaco (Exemplo 1.1), ou com o DNA plasmídico do vector pSEl como testemunha, pela técnica de DEAE dextrano: as células COS-3 foram semeadas a 5 x 105 células por caixa de Petri de 6 cm em meio de cultura contendo 5% de soro fetal bovino (Exemplo 1.1). Após cultura, as células foram lavadas com BPS. Adicionou-se 1 ml da seguinte mistura: meio contendo 6,5 μς de DNA, 250 pg/ml de DEAE dextrano e cloroquina 100 μΜ. As células foram incubadas a 37°C em 5% CCg durante 4 a 5 horas. O meio foi aspirado, adicionou-se 2 ml de PBS, ao qual se adicionou 10% de DMSO, e as células foram incubadas durante um minuto agitando ligeiramente as placas. O meio foi novamente aspirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram então incubadas a 37°C em meio contendo 2% de soro fetal bovino durante a duração da expressão que é, geralmente, de 3 dias. A proteína SR-p70a foi então analisada como descrito no Exemplo VI por imunotransferência.

EXEMPLO V

Preparação de anticorpos específicos 150 pg de proteínas da amostra preparada se acordo com o Exemplo IV foram utilizados para imunizar um coelho (macho com cerca de 1,5 a 2 Kg, Nova Zelândia). As imunizações foram efectuadas de 15 em 15 dias, de acordo 44 ΡΕ0877758 com o protocolo descrito por Vaitukaitis, Methods in Enzymology, 1981, 73, 46. Para a primeira injecção, um volume de solução antigénica foi emulsionado com um volume de adjuvante completo de Freund (Sigma referência 4258). Cinco reforços foram administrados em adjuvante incompleto de Freund (Sigma referência 5506).

EXEMPLO VI

Detecção da proteína SR-p70 "Western immuno-blotting" (imunotransferência) 1) Materiais utilizados para a imunoprecipitação a) Linhas celulares usadas para a imunotrans- ferência.

As linhas celulares que se seguem foram cultivadas, como descrito no catálogo "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" da ATCC (American Type Culture Collection): COS-3, CV-1 (linha de células de rim de macaco), HT-29, U-373MG (glioblastoma humano), MCF7 (adenocarcinoma mamário humano), SKNAS (neuroblastoma humano cultivado nas mesmas condições que COS-3), SK-N-MC (neuroblastoma humano), IMR-32 (neuroblastoma humano), CHP212 (neuroblastoma humano cultivado nas mesmas condições que CV-1), Sãos-2 (osteoassarcoma), SKOV-3 (adenocarcinoma de ovário) e SW 480 (adenocarcinoma de cólon humano). ΡΕ0877758 45 b) células COS-3 transfectadas com o cDNA de SR- p70a.

As células COS-3 foram transfectadas como descrito no Exemplo IV.2. Para as testemunhas as células foram transfectadas com o dna plasmídico pSEl sem o cDNA recombinante de SR-p70a. 2) Preparação de amostras proteicas a partir da cultura de células eucarióticas ou de células transfectadas.

Após cultura, as células foram lavadas com PBS, depois ressuspensas em tampão RIPA (PBS com 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,5% de SDS) complementado com 10 μς/ιηΐ de RNAse A, 20 μς/ιηΐ de DNAse 1,2 μς/ιηΐ de aprotinina, 0,5 μς/ιτιΐ de leupeptina, 0,7 μς/ιτιΐ de pepstatina e 170 pg/ml de PMSF. As células foram sonicadas com ultra-sons a 4°C e deixadas 30 minutos a 4°C. Após microcentrifugação a 12000 rpm, recuperou-se o sobrenadan-te. A concentração proteica foi medida pelo método de Bradford. 3) "Transferência Western" 5 ou 50 μρ de proteínas (50 pg para as linhas celulares e 5 μρ para as células transfectadas) foram suspensas em 0,2 volumes de tampão de electroforese 6X que se segue: Tris HC1 0,35 mM pH 6,8, 10,3% de SDS, 36% de glicerol, DTT 0,6 mM, 0,012% de azul de bromofenol. As -46 - ΡΕ0877758 amostras foram aplicadas e migradas num gel de SDS-PAGE 10% (30/0,8 Bis) depois electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose. 4) Revelação com anticorpos A membrana foi incubada 30 minutos no tampão de bloqueio TBST (Tris HC1 10 mM pH 8, NaCl 150 mM, 0,2% de Tween 20) a que se adicionou 5% de leite (GIBCO-SKIM MILK) à temperatura ambiente. A membrana foi sucessivamente incubada com os anticorpos anti-SR-p70 (aSR-p70) no mesmo tampão 16 horas a 4°C, lavada 3 vezes durante 10 minutos com TBST, depois incubada uma hora a 37°C com um segundo anticorpo anti-imunoglobulina de coelho acoplado a peroxidase (SIGMA A055). Após três lavagens de 15 minutos, a revelação foi efectuada usando o kit ECL (Amersham RPN2106) por quimioluminescência. Paralelamente, as mesmas amostras foram reveladas com um anticorpo anti-p53 (ap53) (Sigma BP5312) seguido de um segundo anticorpo anti-imunoglobulina de ratinho. 5) Figuras e resultados

Figura 10: Imunotransferência da proteina SR-p70 Figura 10a: Detecção da proteina recombinante SR- p70 - pistas 1 e 3: COS-3 transfectadas com o vector pSEl. - pistas 2 e 4: COS-3 transfectadas com o plasmideo pSEl contendo o cDNA de SR-p70a. 47 ΡΕ0877758 pistas 1 e 2: revelação com o anticorpo anti-SR-p70 (aSR-p70). - pistas 3 e 4: revelação com o anticorpo anti-p53 (ap53).

Figura 10b: Detecção da proteina endógena SR-p70 - pistas 1: COS-3; 2: CV-1; 3: HT-29; 4: U-3 73 MG; 5: MCF7; 6: SKNAS: 7; SK-N-MC; 8: IMR-32; 9: CHP212; 10: Saos-2; 11: SK-OV-3 e 12: SW480. A: Revelação com os anticorpos aSR-p70. B: Revelação com o anticorpo ap53. O anticorpo aSR-p70 reconhece especificamente as proteínas recombinantes (Figura 10a) e endógenas (Figura 10b) e não reage com p53. A análise de linhas celulares humanas ou de macaco mostra que a proteina SR-p70, tal como a p53, é geralmente fracamente detectável. Contrariamente, quando da acumulação de p53, a SR-p70 torna-se ela própria mais facilmente detectável (Figura 10b). Um estudo por RT-PCR da distribuição dos transcritos SR-p70 mostra que o gene é expresso em todos os tipos celulares testados.

EXEMPLO VII

Clonagem do gene de SR-p70 e localização cromos- sómica. 1) Clonagem do gene SR-p70 O banco utilizado é um banco de cosmídeos, 48 ΡΕ0877758 preparado com o DNA genómico humano purificado de placenta, e comercializado pela Stratagene (referência 95 1202) . O rastreio do gene foi realizado como descrito no Exemplo III.3 com um fragmento de DNA SR-p70 marcado com 32P com o kit BRL "Random Primers DNA Labelling Systems" (referência 18187-013). Os tampões de hibridação e de lavagem foram suplementados com 50% de formamida. A última lavagem foi realizada em SSC 0,1X/0,1% de SDS a 60°C. De forma semelhante, o gene SR-p70 foi isolado a partir de um banco preparado com o DNA genómico de ratinho negro C57.

Uma análise e uma sequenciação parcial dos clones evidenciam a presença de 14 exões com uma estrutura próxima da do gene p53, principalmente na parte central onde o tamanho e o posicionamento dos exões estão muito conservados (Figura 12). Esta estrutura foi definida parcialmente no ratinho e no homem. A título de exemplo, as sequências genómicas humanas do extremo 3' do intrão 1, do exão 2, do intrão 2 e do extremo 5' do exão 3 estão apresentadas na figura 13. 2) Localização cromossómica do gene SR-p70 no homem

Foi realizada com o DNA do gene SR-p70 humano usando a técnica descrita por R. Slim et al., Hum. Genet., 1991, 88, 21-26. Foram analisadas cinquenta mitoses em que mais de 80% tinham manchas duplas localizadas em lp36 nos dois cromossomas e mais particularmente em lp36.2-lp36.3 (Figura 11) . A identificação do cromossoma 1 e a sua 49 ΡΕ0877758 orientação foram baseadas na heterocromatina da constrição secundária. As imagens foram feitas com um microscópio Zeiss Axiophot, usando uma câmara CCD arrefecida LHESA e tratadas por Optilab.

EXEMPLO VIII A) Detecção de um mRNA codificador de uma proteína SR-p70 humana deduzida apresentando a extremidade N-terminal mais curta e uma divergência. 1) Cultura das células IMR-32 (neuroblastoma humano)

As células foram cultivadas como descrito no catálogo "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" da ATCC (American Type Culture Collection) .

2) Preparação do cDNA 0 RNA foi preparado como descrito no exemplo 1.2.a. 0 cDNA foi preparado de forma semelhante ao descrito no exemplo 1.3 com 5 μρ de RNA total, num volume final de 20 μΐ, usando uma sequência iniciadora poli(T)12 e nucleótidos frios. A reacção não foi parada com EDTA.

3) Amplificação específica do cDNA de SR-p70 pela técnica de PCR A polimerização foi realizada com 2 μΐ do cDNA em 50 ΡΕ0877758 50 μΐ final com o tampão da composição: Tris HC1 50 mM pH 9,2, (NH4)2S04 16 mM, MgCl2 1,75 mM, na presença de DMSO a 10%, dNTP 0,4 mM, 100 ng de cada uma das duas sequências iniciadoras e 3,5 unidades de mistura das polimerases Taq e PWO (Boehringer Mannheim, ref. 1681 842). O par de sequências iniciadoras tem a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: AGGCCGGCGTGGGGAAG (posição 16 a 32, Figura 6)

Sequência iniciadora reversa: CTTGGCGATCTGGCAGTAG (posição 503 a 485, Figura 6). A reacção foi realizada durante 30 ciclos a 95°C/30 segundos, 58°C/1 minuto e 68°C/2 minutos 30 segundos, seguidos de um último ciclo de 68°C/10 minutos. O produto de PCR foi submetido a uma electroforese em gel de 1% de agarose (tampão TAE). Após coloração com brometo de etidio, foram reveladas duas bandas principais: uma banda com um tamanho de aproximadamente 490 pb (tamanho esperado (ver Figura 6)) e uma banda suplementar com um tamanho de aproximadamente 700 pb. Esta última foi extraída do gel com a ajuda do kit "Geneclean" (Bio 101, ref 1001 400) . Após remoção do sal numa coluna de poliacrilamida P10 (Biorad, ref. 15011050), o fragmento foi submetido a uma nova amplificação por PCR durante 10 ciclos como atrás descrito. 51 ΡΕ0877758 4) Determinação da sequência do produto amplificado

Numa primeira fase, o produto de PCR foi separado dos oligonucleótidos numa coluna de Sephacryl S400 (Pharmacia 17-0609-01), depois removido o sal através de cromatografia de exclusão numa coluna de PIO. A reacção de sequenciação foi efectuada com a ajuda do kit Applied Biosystems (referência 401628) (sequenciador de DNA 373) com a sequência iniciadora reversa. A sequência obtida é idêntica à sequência do cDNA de SR-p70 (exemplo II. 4) com uma inserção de 198 pb entre as posições 217 e 218 (Figura 14). A sequência proteica N-terminal deduzida (sequência designada SR-p70d) é mais curta em 49 aminoácidos, com uma divergência dos 13 primeiros aminoácidos (sequência ID N°13). Regista-se pois a co-existência de pelo menos dois transcritos diferentes SR-p70 como já descrito para a linha AtT-20 de ratinho. B) Clonagem de SR-p70 humano e detecção de um mRNA codificador de uma proteína SR-p70 humana deduzida apresentando a mesma extremidade N-terminal que SR-p70d e uma divergência na parte C-terminal.

1) Amplificação específica do cDNA de SR-p70 pela técnica de PCR A amplificação foi realizada como descrito no 52 ΡΕ0877758

Exemplo VIII.A a partir de RNA purificado das células IMR-32 com o par de sequências iniciadoras com a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: GCG GCC ACG ACC GTG AC (posição 160 a 176, sequência ID N° 11) . Sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (posição 1993 a 1976, Figura 6).

Após eliminação do excesso de sequências iniciadoras numa coluna S400 e remoção do sal numa coluna PIO, 1 μΐ da amostra foi novamente submetido a um PCR com o par de sequências iniciadoras com a composição seguinte:

Sequência iniciadora directa:

TAT CTC GAG CTG TAC GTC GGT GAC CCC

Xhol (posição 263 a 280, sequência ID N° 11)

Sequência iniciadora reversa:

ATA TCT AGA TCA GTG GAT CTC GGC CTC

Xbal (posição 1943 a 1926, Figura 6). 2) Clonagem do produto amplificado no plasmideo pCDNA3 O produto de PCR obtido em 1) foi dessalinizado numa coluna PIO, digerido com as enzimas de restrição Xhol e Xbal, depois clonado no plasmideo pCDNA3 como descrito no Exemplo II.5. Dois clones recombinantes foram sequenciados 53 ΡΕ0877758 com a ajuda do kit Applied Biosystems com os oligo-nucleótidos específicos do cDNA de SR-p70. A primeira sequência obtida corresponde à sequência completa do mRNA codificador de SR-p70 descrito no Exemplo VIII.a. A proteína deduzida possui 587 aminoácidos (sequência ID N° 13 e Figura 16) . A segunda sequência é idêntica à sequência do cDNA de SR-p70d descrita atrás mas com duas deleções de 149 pb e de 94 pb entre as posições 1049 e 1050 por um lado e entre as posições 1188 e 1189 por outro lado (sequência id N° 14 e Figura 15) . A sequência proteica deduzida desta segunda sequência revela uma proteína tendo uma parte N-terminal mais curta em 49 aminoácidos, com uma divergência nos 13 primeiros aminoácidos, assim como uma divergência da sequência proteica entre os aminoácidos 350 e 397 (sequência ID N° 15 e Figura 16) (sequência denominada SR-p70e). A proteína deduzida possui 506 aminoácidos. C) Detecção de um mRNA codificador de uma proteína SR-p70 humana deduzida apresentando uma extremidade N-terminal mais curta 1) Cultura de células SK-N-SH (neuroblastoma humano)

As células foram cultivadas como descrito no catálogo "catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" da ATCC (American Type Culture Collection). 54 ΡΕ0877758

2) Preparação do cDNA e amplificação do cDNA de SR-p70 pela técnica de PCR

Estas etapas foram realizadas como descrito no Exemplo VIII.A com o par de sequências iniciadoras com a composição seguinte:

Sequência iniciadora directa: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (posição 128 a 145, Figura 17)

Sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (posição 1993 a 1976, Figura 6). A sequenciação foi realizada com o kit Applied Biosystem com sequências iniciadoras do cDNA de SR-p70 e revela dois cDNAs. - um primeiro cDNA corresponde ao mRNA codificador de SR-p70a - um segundo cDNA tem uma deleção de 98 pb entre as posições 24 e 25 (sequências ID N° 16 e Figura 15).

Esta deleção compreende o ATG de iniciação da tradução de SR-p70a. A proteína deduzida (designada SR-p70) deste segundo cDNA apresenta um ATG iniciador da tradução a montante de um ATG interno do SR-p70a. A proteína deduzida inclui assim 588 aminoácidos (sequência ID N° 17 e Figura 16) e está truncada nos 48 aminoácidos N-terminais de SR-p70a. 55 ΡΕ0877758 D) Detecção de um mRNA codificador de SR-p70b humano. 1) Cultura das células K562

As células foram cultivadas como descrito no catálogo "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" da ATCC (American Type Culture Collection). 2) Preparação do cDNA, amplificação do cDNA de SR-p70 pela técnica de PCR e sequenciação.

Estas etapas foram realizadas como descrito no Exemplo VIII.C. A sequenciação revela dois cDNAs:

Um primeiro cDNA correspondendo ao mRNA codificador de SR-p70a e um segundo cDNA apresentando uma deleção de 94 pb entre as posições 1516 e 1517 (sequência ID N°18 e Figura 15) . A proteína deduzida (designada SR-p70) possui 199 aminoácidos e apresenta uma sequência C-terminal truncada em 137 aminoácidos relativamente a SR-p70a com os últimos 4 aminoácidos divergentes (sequência ID N°19 e Figura 21) . Este cDNA é semelhante ao descrito no Exemplo I relativo a SR-p70b de macaco.

As moléculas descritas neste exemplo (Exemplo VIII. A. B. C. e D.) demonstram a existência de variantes de SR-p70 consecutivas com "splicing" diferencial dos 56 ΡΕ0877758 transcritos primários de mRNA pelo gene SR-p70. A SR-p70a é codificada por um mRNA composto por 14 exões (ver Exemplo VII). É a proteína de referência. A SR-p70b é consecutiva com uma inserção entre os exões 3 e 4 e ausência dos exões 11 e 13. A SR-p70 é consecutiva com ausência do exão 2. Este exemplo descreve a existência de variantes da SR-p70 de forma não exaustiva, com uma grande probabilidade da existência de outras variantes. Por outro lado, a existência das variantes descritas neste exemplo assim como a SR-p70 não se limita às linhas nas quais foram detectadas. Com efeito, estudos efectuados por rt-pcr demonstraram que estas variantes são encontradas nas diversas linhas estudadas.

Ainda, a metionina iniciadora de SR-p70f corresponde a uma metionina interna de SR-p70a, sugerindo a possibilidade da iniciação a jusante no mRNA codificador de SR-p70a.

EXEMPLO IX

Obtenção de uma sequência 5' do mRNA de SR-p70a humana.

1) Amplificação da extremidade 5' do cDNA de SR-p70 por PCR A cultura celular e as preparações de RNA total e de cDNA foram efectuadas como descrito no Exemplo VIII.1 e 57 ΡΕ0877758 2. 0 molde de RNA foi hidrolisado por incubação 5 minutos a 65°C após adição de 4 μΐ de NaOH 2N. Em seguida retirou-se o sal da amostra numa coluna PIO. o cDNA foi prolongado no extremo 3' com uma "cauda" dG como descrito no Exemplo 1.3.d, num volume final de 40 μΐ. Após adição de 4 μΐ de EDTA 500 mM e 4 μΐ de NaOH 2N, o cDNA foi incubado a 65°C durante 3 minutos, depois removido o sal numa coluna PIO. A amplificação por PCR foi realizada como descrito no Exemplo VIII.3 com 8 μΐ de cDNA e durante 30 ciclos com o par de sequências iniciadoras com a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (onde N é igual a G, A ou T)

Sequência iniciadora reversa: CCATCAGCTCCAGGCTCTC (posição 1167 a 1149, Figura 6).

Após eliminação do excesso de sequências iniciadoras na coluna S400 e remoção do sal através de coluna PIO, 1 μΐ da amostra foi novamente submetido a um PCR com o par tendo a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN

Sequência iniciadora reversa: CCAGGACAGGCGCAGATG (posição 928 a 911, Figura 6). A amostra, novamente passada numa coluna S400 e numa coluna PIO, foi submetida a uma terceira amplificação durante 20 ciclos com o seguinte par:

Sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN

Sequência iniciadora reversa: CTTGGCGATCTGGCAGTAG (posição 503 a 485, Figura 6) 58 ΡΕ0877758 2) Determinação da sequência 5' do cDNA de SR-p70 A sequenciação foi realizada como descrito no Exemplo VIII 4). Esta sequenciação revelou um extremo 5' não codificante com menos 237 bases a montante do ATG de iniciação de SR-p70 (Figura 17). Através da comparação desta sequência (obtida a partir da linha IMR-32) com a obtida nomeadamente a partir da linha HT-29 (Figura 6), foram postas em evidência duas diferenças pontuais (Figura 17: ver caracteres a negrito) (G-»A e C-»T) respectivamente posicionadas em -20 e -30 relativamente ao ATG de iniciação de SR-p70a (Figuras 6 e 17). Esta variabilidade situa-se ao nivel do exão 2 (Figura 13). Não se exclui que esta variabilidade se encontre igualmente no interior de uma grelha de leitura consecutivamente a um "splicing" alternativo como descrito nos Exemplos III no ratinho e VIII no ser humano ou ainda consecutivamente a uma iniciação da tradução num CTG (conforme foi demonstrado para FGFb (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 1836-1840) . Igualmente não se pode excluir que esta variabilidade tenha uma implicação na tradução de SR-p70 ou no "splicing" do RNA primário.

De qualquer forma, esta variabilidade, provavelmente de origem alélica, pode servir de marca seja ao nível genómico (ver Exemplo XI), seja ao nível do mRNA (ver Exemplo X). ΡΕ0877758 59

EXEMPLO X 1) Análise por PCR da expressão transcricional de SR-p70 nas amostras celulares (RT-PCR)

As culturas celulares (SK-N-AS, SK-N-MC, HT-29, U-373MG, SW480, IMR-32, CHP212) foram efectuadas como descrito no exemplo vi.1.a (referido no catálogo "Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" da ATCC). A preparação do cDNA e a amplificação por PCR foram realizadas como descrito no exemplo vm.2 e 3. A sequência iniciadora utilizada tem a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: AGGGGACGCAGCGAAACC (posição 128 a 145, Figura 17)

Sequência iniciadora reversa: GGCAGCTTGGGTCTCTGG (posição 1993 a 1976, Figura 6).

As amostras foram analisadas por electroforese em gel de agarose a 1% e coloração com brometo de etidio (Figura 18). 0 tamanho da banda obtida nas amostras corresponde a um tamanho esperado (cerca de 2 Kb, Figuras 6 e 17). A intensidade das bandas obtidas é reprodutível. Uma reamplificação de 1 μΐ da amostra nas mesmas condições, durante 20 ciclos, fez surgir uma banda em cada uma das amostras. 60 ΡΕ0877758 2) Determinação da sequência dos produtos amplificados

Após passagem das amostras em colunas S400 e PIO, a sequenciação foi realizada no sequenciador 373 da Applied Biosystems com o kit de referência 401 628. As sequências iniciadoras utilizadas foram, entre outras, as seguintes:

Posição Figura AGGGGACGCAGCGAAACC 128 a 145 22 CTTGGCGATCTGGCAGTAG 503 a 485 6 GATGAGGTGGCTGGCTGGA 677 a 659 6 CCATCAGCTCCAGGCTCTC 1167 a 1149 6 TGGTCAGGTTCTGCAGGTG 1605 a 1587 6 GGCAGCTTGGGTCTCTGG 1993 a 1976 6 Não foi identificada qualquer diferença ao nivel da proteina SR-p70a. No entanto, as sequências obtidas revelam uma dupla variabilidade nas posições -20 e -30 a montante do ATG de iniciação de SR-p70a (Figuras 6 e 17) . Esta variabilidade, provavelmente de origem alélica, permite definir duas classes de transcritos: uma primeira classe que apresenta um G na posição -30 e um C na posição -20 (classe G~30/C~20) e uma segunda classe que apresenta uma diferença nas duas posições: um A em -30 e um T em -20 (classe a~30/:t20) .

Primeira classe: SK-N-AS, SK-N-MC, HT-29, U-373MG, SW480. Segunda classe: IMR-32, CHP212. 61 ΡΕ0877758

EXEMPLO XI Método de análise para determinação da distribuição alélica do gene SR-p70 numa amostra de 10 pessoas.

Esta distribuição alélica baseia-se na variabilidade alélica posta em evidência nos exemplos IX e X: - O alelo G30/CT20 apresenta respectivamente um G e um C nas posições -30 e -20 a montante do ATG de iniciação de SR-p70a. - O alelo α~30/τγ20 apresenta respectivamente um A e um T nas mesmas posições. Esta variabilidade pode ser evidenciada pela utilização de enzimas de restrição que distingam os dois alelos (Figura 13). Como exemplo: - A enzima Bpl I apresenta um local de corte unicamente no alelo G_30/C·20 na zona de interesse (este local inclui as duas posições variáveis' ) . - A enzima Sty I apresenta um local de corte unicamente no alelo a~30/T“20 na zona de interesse.

1) Amplificação genómica do exão 2 por PCR A reacção de polimerização foi efectuada, com 500 ng de cDNA genómico purificado, em 50 μΐ final com as 62 ΡΕ0877758 condições descritas no exemplo VIII.3. 0 par de sequências iniciadoras tem a seguinte composição:

Sequência iniciadora directa: CACCTACTCCAGGGATGC (posição 1 a 18, Figura 13)

Sequência iniciadora reversa: AGGAAAATAGAAGCGTCAGTC (posição 833 a 813, Figura 13). A reacção foi realizada durante 30 ciclos como descrito no Exemplo VIII.3. Após eliminação do excesso de sequências iniciadoras numa coluna S400 e removido o sal numa coluna PIO, 1 μΐ da amostra foi amplificado novamente durante 25 ciclos nas mesmas condições com o par de sequências iniciadoras seguinte:

Sequência iniciadora directa: CAGGCCCACTTGCCTGCC (posição 25 a 32, Figura 13)

Sequência iniciadora reversa: CTGTCCCCAAGCTGATGAG (posição 506 a 488, Figura 13) .

Os produtos amplificados foram submetidos a uma electroforese num gel de 1% de agarose (Figura 19-A). 2) Digestão com a enzima de restrição Styl

Foi primeiro efectuada a remoção do sal das amostras numa coluna PIO, depois foram digeridas pela enzima de restrição Styl (BRL 15442-015) no tampão com a composição seguinte: Tris HC1 pH 8, 50 mM, NaCl 100 mM, 63 ΡΕ0877758

MgCl2 10 mM, a 37°C durante 30 min. Os produtos de digestão foram analisados por electroforese num gel de 1% de agarose (tampão TAE). A revelação foi realizada por coloração com brometo de etidio (Figura 19-B).

Uma banda de 482 pares de bases caracteriza o alelo G“30/C“20 (Figuras 13 e 19) . A presença de uma banda de 376 pares de bases e de uma banda de 106 pares de bases caracterizam o alelo a_30/t_2° (o alelo apresenta um local de corte Styl). Numa amostra de 10 pessoas, 2 pessoas apresentam os alelos G~30/CT20 e Α~30/ΊΓ20, as outras 8 pessoas eram homozigóticas com o alelo G~30/C~20. o estudo de uma nova amostragem de 9 pessoas pôs em evidência 3 pessoas hetero-zigóticas apresentando os alelos G“30/C“20 e A“30/T“20, as outras 6 pessoas eram homozigóticas para o alelo G”30/C~20.

EXEMPLO XII

Teste da reversão de transformação da linha SK-N-AS por transfecção com o cDNA SR-p70. O vector de expressão utilizado está descrito no Exemplo II.5. e esquematizado na figura 15. O método utilizado foi o do fosfato de cálcio descrito por Graham et ai., (Virology 1973, 54, 2, 536-539). A linha foi semeada na proporção de 5.105 células por caixa de 6 cm de diâmetro em 5 ml do meio descrito no exemplo 1.1. As células foram colocadas em cultura a 37°C e 5% de CO2 durante uma noite. O meio de transfecção foi preparado da seguinte forma: a 64 ΡΕ0877758 mistura seguinte foi obtida adicionando pela ordem indicada 1 ml de tampão HEBS (NaCl 8 mg/ml, KC1 370 μg/ml, Na2HPC>4-2H20 125 μg/ml, dextrose 1 mg/ml, Hepes pH 7,05 5 mg/ml), 10 μg do plasmideo a transfectar e 50 μΐ de CaCl2 2,5 M adicionado gota a gota. O meio de transfecção foi deixado 30 mn à temperatura ambiente, depois adicionado gota a gota ao meio da caixa de cultura. As células foram incubadas 5 a 6 horas a 37°C/5% C02. Após aspiração do meio, foram adicionados 5 ml de meio de fresco contendo 2% de soro fetal bovino. Após 48 horas a 37°C/5% C02, as células foram lavadas com PBS, descoladas por tripsinização, diluídas em 10 ml de meio de cultura (5% de soro fetal bovino) e semeadas numa caixa de 10 cm de diâmetro (a diluição pode ser ajustada em função da eficácia de transfecção) . Após uma nova incubação durante 10 horas (o tempo para as células aderirem), as células foram passadas em meio selectivo através da adição de G418 para uma concentração final de 600 pg/ml equivalentes de geneticina, durante 15 a 21 dias (o meio foi trocado diariamente). Os clones obtidos foram então lavados com PBS, fixados em etanol a 70%, secos, corados com 1% de violeta de cristal, depois contados. Quatro transfecções com plasmideos foram realizadas em duplicado: - plasmideo pCDNA3 sem inserto - plasmideo pCDNA3/SR-p70 contendo o cDNA de SR-p70a humano - plasmideo pCDNA3/SR-p70 Mut contendo o cDNA de SR-p70a apresentando uma mutação na posição 293 AA (R—>H) que é análoga à mutação 273 (R->H) no dominio de fixação do DNA da p53 - testemunha sem plasmideo. ΡΕ0877758 65 0 resultado é expresso em número de clones por caixa.

Experiência 1 Experiência 2 Média pCDNA3 172 353 262 pCDNA3/SR-p70 13 8 10 pCDNA3/SR-p70 mut 92 87 89 Ausência de plasmídeo 1 3 2 0 número de clones obtido por transfecção com o plasmídeo pCDNA3/SR-p70 é 25 vezes inferior ao número de clones obtido com a testemunha pCDNA3 e 9 vezes inferior ao número de clones obtido com o pCDNA3/SR-p70 Mut, indicando uma mortalidade ou uma paragem da divisão celular das células transfectadas pelo cDNA de SR-p70. Este resultado não tem a consequência duma toxicidade face aos clones obtidos com o cDNA de SR-p70 mutado mas, provavelmente, uma apoptose como a observada para a proteina p53 (Koshland et al., Sciences, 1993, 262, 1953-1981).

EXEMPLO XIII

Papel biológico da proteina SR-p70. A homologia estrutural entre o domínio de fixação ao DNA da p53 e a região central da proteína SR-p70 permite inferir que a SR-p70 é um factor de transcrição (cf. Figuras 1 e 2) . Com efeito, a p53 (393 aminoácidos) é constituída por vários domínios funcionais. A região N- 66 ΡΕ0877758 terminal (1-91 aminoácidos) foi implicada na activação da transcrição e possui locais de interacção com diferentes proteínas celulares e virais. A parte central (aminoácidos 92 a 292) permite a fixação a sequências de DNA específicas situadas nas regiões dos promotores de determinados genes (a maioria das mutações pontuais que inactivam a p53 estão localizadas nesta região), apresenta igualmente numerosos locais de interacção com as proteínas virais que inibem a sua actividade. Finalmente, os últimos 100 aminoácidos da p53 são responsáveis pela sua oligomerização assim como pela sua regulação (Hainaut P., Current Opinion in Oncology, 1995, 7, 76-82; Prokocimer M., Blood, 84 n°8, 2391-2411). A homologia de sequências entre p53 e SR-p70 é significativa, principalmente no que respeita aos aminoácidos implicados directamente na interacção com DNA, sugerindo que a SR-p70 se fixa aos mesmos locais da p53 no DNA. Estes aminoácidos correspondem exactamente ao que se chama "hot spot" (ponto quente), os aminoácidos frequentemente mutados em numerosos tumores humanos (SWISS PROT: SW: p53_humana e Prokocimer M., Blood, 1994, 84 n°8, 2391-2411). Desta homologia, pode-se deduzir que a proteína SR-p70 exerce um controlo da actividade dos genes regulados pela p53, seja independentemente desta, seja formando hetero-oligómeros com esta última.

Consequentemente, à semelhança de p53, os produtos do gene SR-p70 devem ser implicados no controlo e na regulação do ciclo celular provocando paragens do ciclo (momentâneos ou definitivos) e na estimulação de programas tais como: reparação do DNA, diferenciação ou morte 67 ΡΕ0877758 celular. A existência de actividades "tipo p53" foi fortemente prevista com a demonstração, em ratinhos p53_/“, da actividade de reparação do DNA e morte celular como resposta a radiações ionisantes (Strasser et al., Cell, 1994, 79, 329-339). Os autores do presente invento localizaram o gene SR-p70 humano na região telomérica do braço curto do cromossoma 1, precisamente em lp36.2-36.3, a região mais pequena deletada (SRO) comum a uma maioria dos neuroblastomas e a outros tipos de tumores (melanomas e carcinomas) (White et al., PNAS, 1995, 92, 5520-5524). Esta região de perda de heterozigotia (LOH) delimita o locus de um gene supressor de tumores, pelo que a perda de actividade será a causa da formação de tumores. É importante notar que esta região é igualmente considerada "marca materna"; o alelo materno é preferencialmente perdido nos neuroblastomas que apresentam a deleção lp36 (sem amplificação de N-Myc) (Caron et al., Hum. Mol. Gen., 1995, 4, 535-539). O gene selvagem SR-p70 introduzido e expresso nestas células de neuroblastoma permite a reversão da sua transformação. A perda desta actividade anti-oncogénica está assim associada ao desenvolvimento do tumor. A região lp38 apresenta uma homologia singeneica com o segmento distai do cromossoma 4 de ratinho. Nesta região foi localizado o gene curly tail (ct) (Beier et al., Mammalian Genome, 1995, 6, 269-272) implicado nas malformações congénitas do tubo neuronal (MTN: spina bífida, anencefalia...) . O ratinho ct é o melhor modelo animal para estudo destas malformações. Admite-se que estas malformações resultem de anomalias da proliferação celular. Tendo em conta a natureza do gene SR-p70 e a sua localização no cromossoma, 68 ΡΕ0877758 uma das hipóteses é que a SR-p70 possa ser o homólogo humano de ct e que, assim, a detecção das mutações precoces e das anomalias cromossómicas respeitantes ao gene deverão permitir, por exemplo de aplicação, a identificação de pessoas em risco (0,5-1% de recém-nascidos atingidos por MTN) e o accionamento de tratamentos preventivos (Neumann et ai., Nature Genetics, 1994, 6, 357-362; Di Vinci et al., Int. J. Câncer, 1994, 59, 422-426; Moll et al., PNAS, 1995, 92, 4407-4411; Chen et al., Development, 1995, 121, 681-691) .

EXEMPLO XIV

Estudo alélico do gene SR-p70.

Os alelos GC e AT foram identificados facilmente por restrição com Styl dos produtos de PCR do exão 2 (ver exemplo XI). Pode-se assim determinar, nos indivíduos heterozigóticos GC/AT e portadores de tumores neuroblas-toma, o alelo SR-p70 perdido (GC ou AT) apesar da presença do tecido contaminante são. De forma surpreendente, quando a mesma análise foi realizada com RNA, foi posto em evidência um único alelo independentemente da presença ou não de uma deleção e, mais surpreendente ainda, apesar do tecido são. Isto sugere que a marca (expressão diferencial dos dois alelos) existirá igualmente no tecido contaminante.

Para o confirmar, repetiu-se a mesma análise em RNA proveniente de células sanguíneas de indivíduos sãos 69 ΡΕ0877758 heterozigóticos GC/AT. Um único dos dois tipos de transcritos foi detectado igualmente nestas células. 0 resultado confirma a observação feita em amostras tumorais quanto à existência de uma marca genética generalizada para o gene SR-p70.

As implicações desta descoberta são importantes uma vez que permitem postular que uma única mutação esporádica, que inactive o alelo activo SR-p70, causará uma perda de actividade potencialmente em todos os tecidos. A ausência de dados precisos sobre a função biológica de SR-p70 não permite avaliar as consequências desta perda de actividade de SR-p70 para a célula. Ainda, a sua forte homologia com a proteína supressora de tumores p53, assim como a demonstração de que SR-p70 é um factor de transcrição capaz de utilizar o promotor p21waf, sugere um papel desta proteína no controlo do ciclo celular e na diferenciação.

Knudson e Meadows 1980 (New Eng. Jd. 302:1254-589) consideram os neuroblastomas IV-S como uma colecção de células não malignas da cristã neural, portadoras de uma mutação que interfere com a sua diferenciação normal. É possível que a perda da actividade de SR-p70, assim como a perda do controlo de p53 sobre o ciclo celular, favoreça o aparecimento de anomalias celulares tais como a aneuploi-dia, amplificação (descrita no caso dos neuroblastomas) e outras alterações genéticas podendo provocar a transformação celular (Livingstone et ai., 1992, Cell 71:923-25; 70 ΡΕ0877758

Yin et al., 1992, Cell 72:937-48; Cross et al. 1995, Science 267:1353-56; Fukasawa et al., 1996, Science 271:1744-47). Os neuroblastomas poderão portanto derivar de uma perda de actividade temporária ou definitiva da SR-p70, favorecendo assim o aparecimento de acontecimentos oncogénicos e portanto a progressão tumoral.

No caso da deleção constitutiva lp36 descrita por Biegel et al., 1993 (Am. j. Hum. Genet. 52:176-82) surge o neuroblastoma IV-S e o gene em questão é NBS-1 (SR-p70).

Resumindo, o que está descrito para os neuroblastomas poderá igualmente aplicar-se a outros tipos de tumores, principalmente os associados a alterações da extremidade do braço curto do cromossoma 1 (resumo 2 do workshop internacional sobre o mapeamento do cromossoma 1 humano 1995, Cytogenetics and Cell Genet. 72:113-154). No plano terapêutico, a implicação de SR-p70 no aparecimento de tumores deverá contribuir para evitar a utilização de agentes mutagénicos em quimioterapia, tendo em conta os riscos de transformação celular por estes produtos e a preferência de substâncias não mutagénicas que estimulem a diferenciação.

Por outro lado, a frequência do aparecimento de alelos GC e AT é a seguinte: na população, frequência (AT) = 0,15 e numa amostra de 25 doentes (neuroblastomas), F(T) = 0,30. Estas estatísticas indicam que o alelo AT poderá ser um factor de predisposição. 71 ΡΕ0877758

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) DEPOSITANTE (A) NOME: Sanofi (B) RUA: 32-34 Rue Marbeuf

(C) CIDADE: PARIS

(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 75008 (G) TELEFONE: 01 53 77 40 0 (H) FAX: 01 53 77 41 33 (ii) TÍTULO DO INVENTO: SR-p70 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 40 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2874 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Cebus apella (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 156..2066 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: m 120 173 2S1 417 iGccTCvces í-secccsAss csrstacíte. tsçgwwksô®· ãcsowksaa.

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(A) COMPRIMENTO: 2034 pares i (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO : linear TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Cebus apella (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 156..1652 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: tgcctccccs ecescscacc cscgcçgagg cctctgcícc tgcgaasgô® Mmímmn. ¢0 GCCGGSGCCC Qcmmxcc ÇGCCQÇÇACG GAÇSÇÇGAXG CÇCGGAGCTG CGWIGSCTGC 12.0 AGA&CGASCI GCCCTCGGAS GCCG5TST6A. GSAftG ATS OCC CAS TCC A£C ACC 1^3

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 156..2066 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: (xi) pppAacTecc i CTC&SAíSGCC OCCeTâOGGA AO MO CCC CM TCC MC GCC ACC S3 Het Ms Gin Ser l TM Ma TAr tcc CCT SAf ggg gsc MC MO ΠΤ GAO CAC CTÇ TGG ACC TCT CT© CAA 101 Ser Prs Asp Gly siy Th* th* Ph« 0i« Mi» fc*w tm Ser Set Leu filtt 10 15 ío ees, GftC- ÃSC ACÇ fAC nc sac CTT CCS CAG tCA AGC CSG CSC AAT AAT U9 A»| Ser f&r tyr ppe Asse 30 Leu Pr» Gin Ser Ser Aro n siy λιη Aan «ag oro soe CCC SSA ACC CAT tçe ACC AIO OAC otc TTC CAC cto GAO ÍS3 cia V*1 Vai 01 y Gly Tfee Asp Ser Ser Met Asp Vai Phe His Leú Olu 1 4$ 55 ss QGC ATGr ACT ACA TCt GTC Ato sce cm rse AA* CfO CEO ÍWJC ACC ACC 241 eiy 'Thr TH» âat v«i Mae Ala 61» Phe Asa Leu Leu ser Ser Th.r m £5 70 AtC SM MO ÃSC MC CSC OCO ccc tço ccc Ase ccc TAC ACC CCA m ««£ Aip Slli Het Ser Ser Aag Ala Ala Ser Ala ser Pr» tyr mc Pr» n 00 SI SAS cm cee oc c mc «to CCC «SC CAC TCO CCC ΓΜ OCA CAA ccc ASO 34 Ϊ Glv ms Aia. ai* ser vai Pr» tur Kl» ser Pt» tyr Ai» Gin Pt» Ser os 100 TCC MC tTC OR£ ACC jm tcc CCC OCO CCT ctc AfC CCC tcc AM MC 309 ser Th* Phe Aap Tbr «•t ser P*e Ala Pr» Vai ile Pr» ser Asa thr tm no ΠΪ 6M tm. ccc SGA CCC C AC CM ITT OAS orç ACt TtC CAS CAC tcc ACC 437 Aap Tyr Pre Sly f se His His ?he Glu Vai fftx Phe Gin Oln Ser Ser m m ISO m AOS $eç jyws TCA ÔCC MC TOO MS ΪΜ tCC CCG ete tto JlAÇ AftA cfç 4flS «w Ala Lya ser Ala TA* T*p Th* Tyr ser Pr» lev Leu ly» Lya Leu 140 ns ISO TAC TS£ CAC Ate CCC ASG ACA TOC CCC ATC CM Ate AM OfG tcc MC 533 tyt cy» Gie Ile Ala Lya Thr cy» Pt» lie Gin ile Lys Vai Ser th* CCS cm ccc ISO ISO 1SS AM AAA CCA CSC MT GCC Ate CSG GCC ATO CCt OTT tm 501 r*« Pr» Pt# Pte Gly Th* Aia tie Aro AIO Pt o v*i tyr iys Lya m 17S 100 6C« Ala «A® CÃO «TO ACC SÃC «TC «to ARA CSC TGC CCC MC CAC gag etc 6*9 01« Kl» Vai th* Asp vai Vai ty* Arf cya Pr». Asn HÍ3: Giu Leu 10S 100 m SGC AOS CAC tTC AA£ CAA OCA CAC TCT Gcr CCA CC C MC CM ctc AtC 677 325ΡΕ0877758 81

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 124..1890 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: TOWfCTCCCT GTSGCCTGCA SGGGA£T9A9 eOtóSSASSA «ΑΪΟΟΚΙΪδΑ CACCCCAASÇ gacacccaaií eAAAcertsc tesestteAe AaAcssAtec tciatcttct (^ccmgaga scc AT9 W* AfS 909 «St 97« TAt SAA TCC tto SCO CAC GCC CA9 TIC «ee t Cys M«Ç oay Pr» vai $ tyr Sl» Ser Leu lô Oiy 91» Ala 91» Phe 15 AAT fta ETC ASC AST 9CC A7G GAC CAS ATG GQC ÃÕC CGt GCG 9CC CC9 Aon Leu ÍAU Ser Ser 20 Ala ttet Aap 91» Mae 25 Oly Ser Arg Ala Ala 30 0*e SC9 asc ccc tAC ACC ççç * CAC OCC ÊCÇ AfiC 9CG ccc ACC CAC tee AÍS Ser Pró tyr 33 thr Ore slu Ki* Ala «6 Ãls ser Ala or» thr «S «is Ser CCC tftC «CG CACr cçç AOC KC AC€ tTC SAC ACC AT6 ter CC9 9CG CÇT p£9 tyr AI» $0 Cln Pró Ser $er thr 5$ Ohe Asyt thr »et see «0 ore Ai» Or«t «o 120i«a 85 ΡΕ0877758

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 389..757 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: TôGTCCCGCT TCGMCAMA CTCÇGGCThC CAGCTTGOSÇ GCCCCGCGGh 5GftSGMA.CC «0 CCOCTGGSGC TAGCTGGGCG ACSCGCGCCÃ, AGCGGCGGCC GGAASGMSC GÕGÁÍWMCG 1Z0 GGGCCCGMA CCCCCACfCG CGCMAGCCA «CWWçaSMe CGGGGCCCGC GIGGGAfiCCA 18« 89 ΡΕ0877758 ggôccccccg «eeeecKcc icckwcca ccceacsoe crrcececee OTCCGCCAAC AAACCCGCTA ASCCTSGGSC ASTCCCCTCC teSCCeCCSC ÇCTCCTCCGC 3Ô0 ACCCTTATAA CCCGÊtCTCC CCOttCCAGS CQA5GA05CA AGGCtQCMSC CCA6CCCTCG JÊ& CCGACGCCGA CGCCCCGCCC CfiACCÁGA ATG AGC CCC ASC CTT SGG GA6 ATS 412

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Pr» Gly Pse (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: M»r 5«r Gly Ser vai Cly Glu Ket Al* Gin Tfer 5«r se* Ser Ser Ser 1 $ 10 15 S*í Tíir Phe GiU si* Leu fxf Cer ser teu Glu ?** Asp ser TAr Tyr 20 25 30 PAs Asp Leu Pre sin Pr© Ser GlS eiy th* Ser Glu AU 8er Gly Ser 35 40 «5 G1U Slu Sar Aen Mat Asp Vai Phe Ma Leu Cln Gly Mat Ala Cln The 50 55 60 Asn Leu LPU Ser Sax Ala Met Arp Un Hfct «ly 75 Ser MC Ala Ala Pr» 61 7® i8 Me 5er Pr© Tyr Thí Pr» Glu «ia Ma Ma Ser Ala Pr» Tftr His Se* 85 00 05 90 ΡΕ0877758

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(A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: .ATeCTffíACS XCSSTfiACee CôCACÔdCAC CÍCí*XA.C<36 COCASmM TCTSCISèMC AGCAÇCATGO ACCASATSftS CACCCSCCCG GCCTCGGCGA SCCCCTACAC CftÇASASCAC «CCSCCAGCS TGCCCACCCA CTCGCCCTAC GCAqWCÇ» SCtCCACcrr CGACACCÃT5 TCSCCescsc CTÍÍÍCAÍCCC CtCCAACACC GACtACCCCG StóCCCACCA CTTTCAÇCTC ACTOtÇftSC AStCCAfíCAÇ GCÇÇAAGTCA CCCACCTQGA GGTMTÇÇeC SCTCnffiWW» ' MRCTCtACt GCCAGATCGC OASXCXtGC CCCATOCAfiA TCAAS6TCTC CACCCCGCCA eccGCAjsecA ciraeftWcas ooccAiâcct ·®πτμαλεα AAeeosASCA cgicaccsaç €6 123 193 243 3ÔÔ 3«0 423 490 540 $3» 00 120 190 240 300 300 420 91 ΡΕ0877758 GTfiítCAAAC GCTSCCCCM CCACÓASCTC QmaaSACf TCMCGAft&í ACAOTCÍGCT 4i® CCftGGCASCC ACCÍCAlCCG CSKÍGAAMC ÀAtAAfCfCf ceCjMSTATOT GGàtGACCCT 5«

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Ly» 61« 61« Phe Tfte 61« Ala 61« 11· Hia 500 505 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1870 pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupl, (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens 96 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 104..1867 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: Técccoeeoc tocsacgoct scaçscaacc agacagcacc tastksacc rrccccAere

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590 MS (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 100 ΡΕ0877758 (A) COMPRIMENTO: 1817 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: aiescceAST ccaccbccac cKccerew ©smôcacca esmsAsot ectcT«Gnsc m TCTfit&SAAC SASACAGCAC CTACTTCGAC ÇfTCCCCÃÓT CAAÇCCOGOS GMíAAfOAG Ufl ST&STW0C5 (SMCSiSAm ZWÇtâmM GteTTCCACC fmvSWSkT OACXACAtCT lea GTCAtGGCCC WTtZAMCt GCTBACÇAGÇ ACCàfSJàSCC ASJWTíSASCAíJ CGGC8COÍSCÇ ?« tC&SC<MSC.C CCTACACCCC AGAGCAÇOCe GÇCAôCGTeC CCWXCWTÍC OCCCTACGCA 300 CAACCCASet1 CCACerrCCÂ CAGÇMSTÇS CÇ&SÇGCÇTÇ tCATCCCCtC CAACACCCAC 360 meeees&e eceaecACTr tsasçíoíç-t τχοομκμϊ comcacosc caactcagcc m ACCTSGACer ACTCCCÇGCT çmSAtSRftA CTCWrtOCC MATCGCCAA CftCATSCCCC 4#Ô ATCCASAXCA ASSTGTCÇAC CCCSCCACCC CCAOeCAÇTO CCATCC-W&C «fOGCtGXt $40 ÍÂOWiAAAG CGGAOCACOT OÁCOSACSÍfC βΐΰλΜΜΚΐ CCCOCMCCA CGASCTCOSÔ 600 asgsagttca ac&aaggaca. otciGctecA sseoAoccjuss foaceecoií os*&sea&í $«3 AATCTCTCGC AGTATGTGGA TGJUXCXSTC AÇtqfiPMWÇ AGASCGTCS? GCTOCCafAt 120 SASCCACCAC A^SGGGAí: GGMJfCACC AÇCjaCCWS AOACTtCAT CTCTAACASC ?*Ô AOCtGTOXAG SGSGCAtSAA CCOOCfiGCCG ATCCTCAtCA ?ÍATÇ*£ÇCT 340 6AíSSGçá5g tecTesGces ccestecTit qasggccgca pctqcgcotç fcçseerasc soe GAtCSÁAAAG CTGATG&SíiA CfACTACCCtS S*jSe*âCAGG CCCfCJUtóXA GAGCTCCOeç 960 mimtGrns CCÇÇPAOÇM GCGTGCCTXC AAGCASÍOCC CCCCfSGCGt CGCCGCCCTT 1520 ©STGCCâCtC TGAAáJytóCG GeGGCAfGGA GJ^GaôGACA, cetsetscet XCAGGJGCGA 1386 OÇÇCGOGAGA ACTTfOACAÍ CGXGAXGAAS CtGARAGftCA SCOSGAGCT GATOGAGXTG· 1143 GXGCCGCAÚC CACTGí*f®5A CTCCEAtCGG CAGCAGCASÇ AGCTCCtACA 6»®Κ6βί®ϊ 1300 CACCtACAGC ÍCCCGXeem CGGGCCGGTC CtCtCGCCCA tOAACAftGGt ®CÃC«SÔfiÇC ií$o AXcAAEAsee tgcgcxccgt swfis*ecre ereeeççASc ctcccccgca cMtroôscA 1333 «GTACACeCA ACCteeefiCÇ CSXGGSCCCC CgeWGCTCA ÃCAACCATGG CÇAeSCACW 1180 CCACCCARCG OCGAGATGWS OWJCASOCAC AQCOQCCMSr CCAteGICFÇ GQGGXCCÇAC 1440 TGGÃCtCCGC CftCCCCCCT* CCACSCCCOfi CCÇAfiCCXCG TOÈSACCXG GOOSCcCXCA ÍS00 ASRÍGCCCGA ÍCAGftóCCG AÍSAeCATCT GGCGGÔSCeX ÕCãeôACCtO AÁSÇAOÒQÒO 1633 ftCOACXAOUS CAGCGCOCAG CAOCTGCTCC SCTCTAGCM CGCGSCCACC AtWCAXCG 1630 SCOGCTCAGG GGMCTGCAG CGÇCASCGGS TCftXOSASSC çexSCACTXC CGCCtCCOCÇ 14*3 ÀCACCATCAC ÇATCCÇCMC CGCGGCGGCG OVWCôSCGG CCÇTGACGRG TGSOCCGACT 1?40 tcsgctxgga cct-gcccgac xocaasgcgc «caagcaoco catcaagsag m&tttmzi iáõo 101 ΡΕ0877758 A6GCC0A5AT caiem isn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 499 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi .) DESCRIÇÃO DA , SEQUÊNCIA : SEQ ID NC ): 19 Het Ai* 51 n Ser 17» Ala T'hr Ser Pre Aap 51 y 51 y Tlw Thr PM 1 $ 10 15 Kts Leu s«r Ser leu GU Pr® Asp ser thr 7yr PHe Aap leu Pre 20 25 30' Gla Sei 5*c Mf 5i y ASft Aaa Glu V*1 Vai ay ®ly thr Aap ser Ser 3S 40 45 Vai Phe Ris Leu 51 u 51 y Tlr Tftr Ser Vai M*S Ala Gin 5» 15 «0 Phe Mn L«u Leu Sefi s«x th* «et Asp Glft K«e 5*x S*r ATf Ala Ala €5 70 75 50 s«r AU ser Pt© fy* es th* Pr* Glu Ai* Ale Ser Vai ff» Th* Hi» 90 95 Pre ?yr Ai* 51« Fr© ser Ser thx Pite Mp thr «et Ser Pre Ala lòs 195 110 Pr® v»2 Lie Pre Ser Mn ffer A»p Tyr Pr© Giy Pr» Kl» Hi* Phe Glu LIS 120 125 va.i mt P&0 Gin Gl» ser ser TI» Ala Lys ser Ale íAr t*p Tftr Tyr 130 133 149 s*r Píô Leu Léu Lys Lya Leu fye cys GjL» Ue Ai* Lys th* Cys Pre »*f 155 ISO ttf 61« Ue Ly* V*l Ser ífer Pr® Pm f*9 Pre Gly tfcur Ala n* Arf Í«S 179 175 Ala Mee »í Vai fyr Ly« tys Ala Glu Kl» Vai 71» Aap Vai Vai Ly* m l#5 199 Ãrf Cy* Pxe Mn Kiã Glu Leu Gly A*f Mp Phe A»n Glu Gly 51« ser 19S 200 205 Ala Pr* M* te* Ri* Leu ile Mg Vai Glu Sly Ara Ma Leu Ser Gin 219 215 220 tyr vai Asp ASf Pr* vai ffer Gif Aro Gin Ser Vai vai vai Pre Ty* 225 230 05 240 eiu Fte Fro Glft v*i Gly fhr «ltt PM ti» TAr fie Leu Tyr Mn Phe tei ISO 2SS Het 5y* Mn Ser $ex Cys Vai Gly ei y Hat A»fi Arf Arg Pr© Ué Leu m 205 270 li® tlí rht teu Glu mt Art* Aap Siy Gin vai Leu oly Àrò Mf m ZM 295 S«r íh« <Uu 52 y Axg lie cys Ala çy» »r» Giy Arf Asp Arf tyâ AXft 253 J9S 300 102 ΡΕ0877758

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Trp 5iy Pr» (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: GCGAGCTGCC CTCGGAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DMA

(iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO 103 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:21: GGTTCTGCAG GTGACTCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

GCCATGCCTG TCTACAAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: ACCAGCTGGT TGACGGAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24:

GTCAACCAGC TGGTGGGCCA G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM 104 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25: GTGGATCTCG GCCTCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: AGGCCGGCGT GGGGAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27:

CTTGGCGATC TGGCAGTAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

GCGGCCACGA CCGTGAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM 105 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: GGCAGCTTGG GTCTCTGG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30: CTGTACGTCG GTGACCCC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31: TCAGTGGATC TCGGCCTC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32: AGGGGACGCA GCGAAACC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM 19 19 106 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:33: CCATCAGCTC VAGGCTCTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA 18 (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34: CCAGGACAGG CGCAGATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA 19 (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35: GATGAGGTGG CTGGCTGGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: TGGTCAGGTT CTGCAGGTG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO 19 107 ΡΕ0877758 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:37: CACCTACTCC AGGGATGC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38: AGGAAAATAG AAGCGTCAGT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: CAGGCCCACT TGCCTGCC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) COMPLEMENTAR DA CADEIA CODIFICANTE: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40: CTGTCCCCAA GCTGATGAG 19

Lisboa, 3 de Julho de 2009

Claims

ΡΕ0877758 1 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido purificado, compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre: a) a sequência SEQ ID n° 2; b) a sequência SEQ ID n° 4; c) a sequência SEQ ID n° 6; d) a sequência SEQ ID n° 8; e) a sequência SEQ ID n° 10; f) a sequência SEQ ID n° 13; g) a sequência SEQ ID n° 15; h) a sequência SEQ ID n° 17; i) a sequência SEQ ID n° 19. 2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos escolhida entre SEQ ID n°6, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 e SEQ ID n° 19. 3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência compreendida entre: - o resíduo 110 e o resíduo 310 de SEQ ID n° 2 ou - o resíduo 60 e o resíduo 260 de SEQ ID n°8. 6; 2 ΡΕ0877758 4. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por resultar de um "splicing" alternativo do RNA mensageiro do gene correspondente. 5. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se tratar de um polipéptido recombinante produzido sob a forma de uma proteína de fusão. 6. Sequência de ácidos nucleico isolada codificadora de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores. 7. Sequência de aminoácidos isolada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por ser escolhida entre: a) a sequência SEQ ID n° i; b) a sequência SEQ ID n° 3; c) a sequência SEQ ID n° 5; d) a sequência SEQ ID n° 7; e) a sequência SEQ ID n° 9; f) a sequência SEQ ID n° 11; g) a sequência SEQ ID n° 12; h) a sequência SEQ ID n° 14; i) a sequência SEQ ID n° 16; j) a sequência SEQ ID n° 18. 8. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por se tratar de uma 3 ΡΕ0877758 sequência escolhida entre SEQ ID n°5, SEQ ID n° 12, SEQ ID n° 14, SEQ ID n° 16 e SEQ ID n° 18 codificadora respectivamente do polipéptido com a sequência SEQ ID n°6, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 e SEQ ID n° 19. 9. Vector de clonagem e/ou expressão contendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8. 10. Vector de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se tratar do plasmídeo pSEl. 11. Célula hospedeira transformada por um vector de acordo com a reivindicação 9 ou 10. 12. Célula hospedeira transfectada de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por se tratar de E. coli MC 1061. 13. Sonda ou sequência iniciadora compreendendo a totalidade da sequência do gene codificador de um dos polipéptidos da reivindicação 1. 14. Sonda ou sequência iniciadora escolhida entre os oligonucleótidos seguintes ou entre as suas sequência complementares: SEQ ID n° 20: GCG AGC TGC CCT CGG AG SEQ ID n° 21: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G 4 - ΡΕ0877758 SEQ ID n° 22: GCC ATG CCT GTC TAC AAG SEQ ID n° 23: ACC AGC TGG TTG ACG GAG SEQ ID n° 24: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG SEQ ID n° 25: GTG GAT CTC GGC CTC C SEQ ID n° 26 : AGG CCG GCG TGG GGA AG SEQ ID n° 27: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G SEQ ID n° 28: GCG GCC ACG ACC GTG AC SEQ ID n° 29: GGC AGC TTG GGT CTC TGG SEQ ID n° 30: CTG TAC GTC GGT GAC CCC SEQ ID n° 31: TCA GTG GAT CTC GGC CTC SEQ ID n° 32: AGG GGA CGC AGC GAA ACC SEQ ID n° 33: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C SEQ ID n° 34: CCA GGA CAG GCG CAG ATG SEQ ID n° 35: GAT GAG GTG GCT GGC TGG A SEQ ID n° 36 : TGG TCA GGT TCT GCA GGT G SEQ ID n° 37: CAC CTA CTC CAG GGA TGC SEQ ID n° 38: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC SEQ ID n° 39: CAG GCC CAC TTG CCT GCC SEQ ID n° 40: CTG TCC CCA AGC TGA TGA G 15. Utilização de uma sequência de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8 para a produção de sequências iniciadoras oligonucleotidicas para reacções de sequenciação ou de amplificação especifica de acordo com a técnica de PCR ou qualquer variante desta. 16. Par de sequências iniciadoras nucleotidicas, caracterizado por compreender as sequências iniciadoras escolhidas entre as seguintes sequências: 5 ΡΕ0877758 a) sequência iniciadora directa: GCG AGC TGC CCT CGG AG (SEQ ID n°20) sequência iniciadora reversa: GGT TCT GCA GGT GAC TCA G (SEQ ID n°21) b) sequência iniciadora directa: GCC ATG CCT GTC TAC AAG (SEQ ID n°22) sequência iniciadora reversa: ACC AGC TGG TTG ACG GAG (SEQ ID n°23) c) sequência iniciadora directa: GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG (SEQ ID n°24) sequência iniciadora reversa: GTG GAT CTC GGC CTC C (SEQ ID n°25) d) sequência iniciadora directa: AGG CCG GCG TGG GGA AG (SEQ ID n°26) sequência iniciadora reversa: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID n°27) e) sequência iniciadora directa: GCG GCC ACG ACC GTG A (SEQ ID n°28) sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID n°29) f) sequência iniciadora directa: CTG TAC GTC GGT GAC CCC (SEQ ID n°30) sequência iniciadora reversa: TCA GTG GAT CTC GGC CTC (SEQ ID n°31) 6 ΡΕ0877758 g) sequência iniciadora directa: AGG GGA CGC AGC GAA ACC (SEQ ID n°32) sequência iniciadora reversa: GGC AGC TTG GGT CTC TGG (SEQ ID n°29) h) sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CCA TCA GCT CCA GGC TCT C (SEQ ID n°33) i) sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CCA GGA CAG GCG CAG ATG (SEQ ID n°34) j) sequência iniciadora directa: CCCCCCCCCCCCCCN (em que N é igual a G, A ou T) sequência iniciadora reversa: CTT GGC GAT CTG GCA GTA G (SEQ ID n°27) k) sequência iniciadora directa: CAC CTA CTC CAG GGA TGC (SEQ ID n°37) sequência iniciadora reversa: AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC (SEQ ID n°38) e 1) sequência iniciadora directa: CAG GCC CAC TTG CCT GCC (SEQ ID n°39) sequência iniciadora reversa: CTG TCC CCA AGC TGA TGA G (SEQ ID n°40) 7 ΡΕ0877758 17. Utilização de sequências iniciadoras nucleo-tidicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8 para a sequenciação. 18. Utilização de uma sonda ou sequência iniciadora de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, como instrumento de diagnóstico in vitro para a detecção, através de experiências de hibridação, de sequências de ácidos nucleicos codificadoras de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em amostras biológicas, ou para detectar síntese aberrantes ou anomalias genéticas. 19. Método de diagnóstico in vitro para a detecção de sínteses aberrantes ou de anomalias genéticas ao nível de sequências de ácido nucleico codificadoras de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender: contacto de uma sonda nucleotídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, com uma amostra nas condições que permitem a formação de um complexo de hibridação entre a referida sonda e a referida sequência nucleotídica, eventualmente após um passo prévio de amplificação da referida sequência nucleotídica; - detecção do complexo de hibridação eventualmente formado; - eventualmente a sequenciação da sequência nucleotídica que forma o complexo de hibridação com a sonda do invento. ΡΕ0877758 20. Utilização de uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, para a produção de um polipéptido recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5. 21. Método de produção de uma proteína recombinante SR-p70, caracterizado por se cultivar as células transfectadas de acordo com a reivindicação 10 ou 11 em condições que permitem a expressão de um polipéptido recombinante com a sequência SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19 e recuperação do referido polipéptido recombinante. 22. Anticorpos monoclonais ou policlonais ou seus fragmentos, anticorpos quiméricos ou imunoconjugados, caracterizados por serem capazes de reconhecer especifica-mente um polipéptido tendo uma sequência escolhida entre SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 e SEQ ID n° 19. 23. Utilização de anticorpos de acordo com a reivindicação 22, para a purificação ou detecção de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 numa amostra biológica. 24. Processo de diagnóstico in vitro de patologias relacionadas com a expressão ou acumulação anormal de 9 ΡΕ0877758 proteínas SRR-p70 compreendendo uma sequência de amino-ácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19, principalmente os fenómenos de cancerização, a partir de uma amostra biológica, caracterizado por se pôr em contacto pelo menos um anticorpo de acordo com a reivindicação 22 com a referida amostra biológica, em condições que permitem a eventual formação de complexos imunológicos específicos entre uma proteína SR-p70 e o ou os referidos anticorpos e por se detectar os complexos imunológicos específicos eventualmente formados. 25. Kit para o diagnóstico in vitro da expressão ou acumulação anormal de proteínas SR-p70 compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19 na amostra biológica e/ou para a medida das taxas de expressão destas na referida amostra compreendendo: - pelo menos um anticorpo de acordo com a reivindicação 22, eventualmente fixado num suporte, - meios de revelação da formação de complexos antigé-nio/anticorpo específicos entre uma proteina SR-p70 e o referido anticorpo e/ou meios de quantificação destes complexos . 26. Método para o diagnóstico precoce da formação de tumores caracterizado por se detectar, numa amostra de soro colhida de um indivíduo, auto-anticorpos 10 ΡΕ0877758 dirigidos contra uma proteína SR-p70 compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID nc ’ 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n 10, SEQ ID nc ' 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 OU SEQ ID n 19, de acordo com passos que consistem em pôr em contacto uma amostra de soro colhido de um indivíduo com um polipéptido do invento, eventualmente fixado num suporte, em condições que permitem a formação de complexos imuno-lógicos específicos entre o referido polipéptido e os auto-anticorpos eventualmente presentes na amostra de soro e detecção dos complexos imunológicos específicos eventualmente formados. 27. Método in vítro para a determinação de uma variação alélica, mutação, deleção, inserção, perda de heterozigotia ou anomalia genética do gene codificador de uma proteína SR-p70 compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19, caracterizado por se usar pelo menos uma sequência nucleo-tídica de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8. 28. Método para determinação de uma variação alélica do gene codificador de uma proteína SR-p70 compreendendo uma sequência de aminoácidos escolhida entre as sequências SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 4, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 13, SEQ ID n° 15, SEQ ID n° 17 ou SEQ ID n° 19, a referida variação alélica, situada ao nível da posição -30 e -20 relativamente ao ATG de 11 ΡΕ0877758 iniciação do exão 2, podendo estar implicada nas patologias e caracterizado por compreender pelo menos: - um passo no decurso do qual se procede à amplificação, por PCR, do exão 2 do gene codificador de uma proteína SR-p70 tendo a sequência alvo, com a ajuda de um par de sequências iniciadoras oligonucleotídicas, seleccionado dentro do grupo constituído por SEQ ID n° 32 e SEQ ID n° 29, SEQ ID n° 37 e SEQ ID n° 38, e SEQ ID n° 39 e SEQ ID n° 40; - um passo no decurso da qual se procede ao tratamento dos produtos amplificados com uma enzima de restrição cujo local de corte corresponde ao alelo pesquisado; - um passo no decurso do qual se procede à detecção ou ao doseamento de pelo menos um dos produtos da reacção enzimática. 29. Composição farmacêutica compreendendo, como princípio activo, um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4. 30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por compreender um polipéptido de acordo com a reivindicação 2. Lisboa, 3 de Julho de 2009 1/36 ΡΕ0877758 ι TOccTcccí£eecacGíA.tt^ se !? ΙίΠ 1 ..................................,. .í^séCTccGcse ϊ2 ιβδ π ι ι π π! ιι i j ι ι η ι 1.3 ACACmGCet«S^StSlAAG«^^ £3 101 aXSfflWSCTeCBfcÇOSCreCSfflHSM^^ 350 III III Μ Π I Μ 1 I Μ Π; Ε I 53 eCCTOAÍ^reOGCAi^C*J^^ , ,, ttSCOAKSSASC 100 ι%% &&AWfssaKxxxtètáX&a&^^ 200 1 ! Μ I ΙΙΜΙ ί Μ Μ I II ΠΙ 13δ AGcecosia*5ATOec«^ m 201 áfiSCACCTCItjGÃSCIOinSiQiMiCEJii^ 250 ΗΝ ΠΙΕ η ΜΗ I | Η HU I 150 TCA0ACCTA?SSAAACrMsCTTCCT6Aà&M3AAC.. 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Poftadapia^r 2: 1 ΡΕ0877758 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • EP 0506574 A * EP5SS574Â Literatura que não é de patentes citada na Descrição *: KÇiHtiESí KSILSIEM. 'mm, ' 1975, 'M, 2S% : 485-497 SAHGER et aí. íW7, vcl 14,S4SS-5467 * VAfniKAiTÍS< Afefwais irj Enzymatag?! ISSi, ws£ 73. m * R. SUS5 « aí. Mm -émàs, * ;4íM:S©vsAf ísss, ‘M. * GRXHAMetsi 1373, 539-509 ' KOSHLA*® st ái: 49S3; vc<i. 262. 195J-T3E1 HA8IÂUT P< tSS5: vei 7 7S-52 PRGKQCtteí 1-5, :Bk'ò% *K*, M. m :331-2431 * STRASSEfi et aí. Ce8 1S94. vai 79,325-33$ *. WMiíE et aí. PUAS, 1385, ΛΚ.

§2.5520-5524 - CASÒiieitai Hum Uai Se«,, 1955. voi 4 r 535-533 > BESEFt et, ái>; 1S§S,í voi 259-272 * NEtiNtAíft -«·: ai: .ffs&s»· 4fe»ií* % 357-362 Dí VSí-íCS atai Ííií: 2 Csí?eeKlSS4; ^59^422428- * MQELaM,Ρϊψψ,rímS, vá. 92,4407-4431 * CHEJ4 st ai. Oevetopwet#. 539S, vai 121 €81^1 * míBSON; ϊ§#> vai. WZ- 1251-55 UH84SSTOÍÍE «í.si £M IMS, M. 77. S23-25: * ¥JftsíaiCM vai 72. §57-48 .· SRQS& et ®i Science: 1SSS, vbí, 2S7. 13:53-56 > FUKASAWA «iai Síííf-Oi. 1S1>3. vcsi 241.1744-47 * BtEGEL et ai Am J. Htm. Smei, 1993. vói 52. 176-82 .» rsfscst 2 iaterxsfcexsi msteivcsp m fimm s&r' íaap-psgg. Cyfe%?er»$cs svâ Céi õemt, 199S, «i.‘ 72, .113-154