ES2322971T3 - Proteina sr-p70 purificada. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS DE LA FAMILIA DE LOS GENES SUPRESORES DE TUMORES EMPARENTADA CON EL GEN DE LA PROTEINA P53, Y LAS SECUENCIAS PROTEICAS CORRESPONDIENTES.
Description
Proteína SR-p70 purificada.
La invención se refiere a nuevas secuencias de
ácidos nucleicos del grupo de los genes supresores de tumores,
afines al gen de la proteína p53, y a las secuencias proteicas
correspondientes.
La invención se refiere además las aplicaciones
profilácticas, terapéuticas y diagnósticas de de las mismas, en
especial en el ámbito de las patologías asociadas a los fenómenos de
apóptosis o de transformación celular.
Les genes supresores de tumores desempeñan un
rol calve en la protección contra los fenómenos de cancerización y
cualquier modificación susceptible de implicar la pérdida de un de
estos genes, su inactivación o su mal funcionamiento, puede tener
un carácter oncogénico, creando de este modo condiciones favorables
para el desarrollo del cáncer.
Los autores de la presente invención han
identificado los productos de transcripción de un nuevo gen así como
las proteínas correspondientes. Este gen SR-p70 es
afín al gen supresor de tumor p53, cuya actividad antitumoral está
asociada a su actividad de factor de transcripción y de modo más
específico a los controles ejercidos en la actividad de los genes
Bax y Bcl-2, que son instrumentales en los
mecanismos de muerte celular.
La presente invención se refiere, pues, a
proteínas SR-p70 purificadas.
La invención se refiere también a secuencias de
ácidos nucleicos aislados que codifican a dichas proteínas y
oligonucleótidos específicos obtenidos a partir de estas
secuencias.
Se refiere además a vectores de clonación y/o de
expresión que contengan por lo menos una de las secuencias de
nucleótidos definidas anteriormente, y las células hospedantes
transfectadas con estos vectores de clonación y/o de expresión en
condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de una de
dichas secuencias de nucleóti-
dos.
dos.
Los métodos de producción de proteínas
recombinantes SR-p70 en células hospedantes
transfectadas constituyen otro objeto de esta invención.
La invención se refiere también a anticuerpos o
derivados de anticuerpos específicos de las proteínas definidas
anteriormente.
Se refiere además a métodos de detección del
cáncer, ya sea midiendo la acumulación de proteínas
SR-p70 en los tumores por técnicas
inmuno-químicas, ya sea detectando en el suero de
los pacientes los auto-anticuerpos dirigidos contra
estas proteínas.
Esta solicitud describe además cualquier
inhibidor o activador de la actividad del SR-p70,
por ejemplo de la interacción proteína-proteína en
la que intervenga la SR-p70.
Describe además secuencias de oligonucleótidos
antisentido, específicas de las secuencias de los ácidos nucleicos
anteriores, que pueden modular "in vivo" la expresión
del gen SR-p70.
Esta demanda describe finalmente un método de
terapia genética, en la que los vectores, por ejemplo los vectores
víricos inactivados capaces de transferir estas secuencias
codificantes de una proteína según la invención, se inyectan a
células deficientes en esta proteína, con el fin de regular los
fenómenos de apóptosis y de inversión de la transformación.
La presente invención tiene por objeto un
polipéptido purificado que tenga una secuencia de aminoácidos
elegida entre:
a) la secuencia SEQ ID nº 2;
b) la secuencia SEQ ID nº 4;
c) la secuencia SEQ ID nº 6;
d) la secuencia SEQ ID nº 8;
e) la secuencia SEQ ID nº 10;
f) la secuencia SEQ ID nº 13;
g) la secuencia SEQ ID nº 15;
h) la secuencia SEQ ID nº 17;
i) la secuencia SEQ ID nº 19.
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Esta solicitud describe además una secuencia
biológicamente activa derivada de la SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ
ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ
ID nº 17 o SEQ ID nº 19.
En la descripción se emplean las definiciones
siguientes:
- proteína SR-p70: un
polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre
las secuencias SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8,
SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 y SEQ ID nº
19.
- derivado: cualquier polipéptido que sea una
variante del polipéptido de secuencia SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ
ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ
ID nº 17 o SEQ ID nº 19 o cualquier molécula que resulte de una
modificación de naturaleza genética y/o química de la secuencia SEQ
ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ
ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19 es decir, que
se haya obtenido por mutación, deleción, adición, sustitución y/o
modificación química de un solo aminoácido o de un número limitado
de aminoácidos, y también cualquier secuencia isoforme, es decir,
una secuencia idéntica a la secuencia SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ
ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ
ID nº 17 o SEQ ID nº 19 en uno de sus fragmentos o secuencias
modificadas, que contiene uno o varios aminoácidos en forma de
enantiómero D, dichas secuencias variantes, modificadas o isoformas
mantienen conservada por lo menos una de las propiedades que las
convierte en biológicamente activas.
- biológicamente activo: capaz de unirse al ADN
y/o de ejercer una actividad de factor de transcripción y/o de
participar en el control del ciclo celular, de la diferenciación y
de a apóptosis y/o capaz de ser reconocido por los anticuerpos
específicos del polipéptido de secuencia SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4,
SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15,
SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19 y/o capaz de inducir anticuerpos que
reconozcan a este polipéptido.
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La fabricación de derivados puede tener
diferentes objetivos, entre ellos en especial el de aumentar la
afinidad del polipéptido con el ADN o su actividad de factor de
transcripción, el de mejorar el porcentaje de producción, el de
aumentar la resistencia a las proteasas, el de modificar las
actividades biológicas o el de conferirles nuevas propiedades
farmacéuticas y/o biológicas.
Entre los polipéptidos de la invención se
prefiere al polipéptido de origen humano, que contiene la secuencia
SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº
19. El polipéptido de 636 aminoácidos correspondiente a la
secuencia SEQ ID nº 6 es idéntico en más de un 97% al polipéptido de
secuencia SEQ ID nº 2. El polipéptido de secuencia SEQ ID nº 2 y el
de la secuencia SEQ ID nº 4 son dos productos de expresión de un
mismo gen, lo mismo se diga de las secuencias SEQ ID nº 8 y SEQ ID
nº 10 y de las secuencias SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15,
SEQ ID nº 17 y SEQ ID nº 19.
Tal como se explicará en los ejemplos, el
polipéptido de secuencia SEQ ID nº 4 corresponde a una terminación
prematura del péptido de secuencia SEQ ID nº 2, ligada a un empalme
alternativo del transcrito que codifica al polipéptido de SEQ ID nº
2 más largo (ARN mensajero) del gen correspondiente. Incluso en el
hombre, los polipéptidos que corresponden a las secuencias SEQ ID
nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 y SEQ ID nº 19
difieren en su composición a nivel de las partes N- y/o
C-terminales y como consecuencia de empalmes
alternativos de un mismo transcrito primario. La secuencia peptídica
N-terminal de la secuencia SEQ ID nº 10 sufre
deleción, lo cual va asociado a un empalme alternativo de su
transcrito codificador. De modo ventajoso, la invención se refiere
a un polipéptido correspondiente al dominio de fijación al ADN de
uno de los polipéptidos precedentes.
Este dominio corresponde a la secuencia
comprendida entre el resto 110 y el resto 310 para las secuencias
SEQ ID nº 2 ó 6, y entre el resto 60 y el resto 260 para la
secuencia SEQ ID nº 8.
La presente invención tiene por objeto además
las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a una proteína
SR-p70.
Con mayor preferencia, la invención tiene por
objeto una secuencia de ácidos nucleicos aislados, elegida
entre:
a) la secuencia SEQ ID nº 1;
b) la secuencia SEQ ID nº 3;
c) la secuencia SEQ ID nº 5;
d) la secuencia SEQ ID nº 7;
e) la secuencia SEQ ID nº 9;
f) la secuencia SEQ ID nº 11;
g) la secuencia SEQ ID nº 12;
h) la secuencia SEQ ID nº 14;
i) la secuencia SEQ ID nº 16; y
j) la secuencia SEQ ID nº 18.
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La solicitud describe además secuencias de
ácidos nucleicos capaces de hibridarse de modo específico con la
secuencia SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 3, SEQ ID nº 5, SEQ ID nº 7, SEQ ID
nº 9, SEQ ID nº 11, SEQ ID nº 12, SEQ ID nº 14 o SEQ ID nº 16 o SEQ
ID nº 18 o con sus secuencias complementarias, o de hibridarse de
modo específico con sus secuencias adyacentes; y secuencias
derivadas de las secuencias a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) o
k) debido a la degeneración del código genético.
Según un modo de realización preferido, la
invención tiene por objeto las secuencias de nucleótidos SEQ ID nº
5, SEQ ID nº 12, SEQ ID nº 14, SEQ ID nº 16 y SEQ ID nº 18 que
corresponden respectivamente a los ADNc de proteínas humanas de las
secuencias SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 y
SEQ ID nº 19.
Las diferentes secuencias de nucleótidos de la
invención pueden ser de origen artificial o no. Pueden ser
secuencias de ADN o de ARN, obtenidas selección dentro de bancos de
secuencias mediante sondas elaboradas en base a las secuencias SEQ
ID nº 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16 ó 18. Estos bancos pueden
prepararse aplicando técnicas clásicas de biología molecular, que
los expertos ya conocen.
Las secuencias de nucleótidos según la invención
pueden prepararse también por síntesis química o incluso por métodos
mixtos, que incluyen la modificación química o enzimática de las
secuencias obtenidas por selección de los bancos.
Estas secuencias de nucleótidos permiten la
realización de sondas nucleótidas, capaces de hibridarse
intensamente y de modo específico con una secuencia de ácidos
nucleicos, de un ADN genómico o de un ARN mensajero, que codifica a
un polipéptido según la invención. Estas sondas pueden utilizarse
como herramienta de diagnóstico "in vitro" para la
detección, mediante ensayos de hibridación, de transcritos
específicos de polipéptidos de la invención en las muestras
biológicas o para la detección de síntesis aberrantes o de anomalías
genéticas, por ejemplo la pérdida del carácter heterocigótico o el
reordenamiento genético, resultante de un polimorfismo, de
mutaciones o de un empalme diferente.
Las sondas de la invención contienen la
totalidad de la secuencia del gen SR-p70 o de su
ADNc, contenido por ejemplo en un cósmido.
Entre las sondas más cortas, es decir,
comprendidas aprox. entre 10 y 20 nucleótidos, las condiciones de
hibridación apropiadas corresponden a las condiciones limitantes
(estringentes) aplicadas normalmente por los expertos.
La temperatura empleada se sitúa con preferencia
entre una T_{m} de -5ºC y una T_{m} de -30ºC, con mayor
preferencia entre una T_{m} de -5ºC y una T_{m} de -10ºC;
T_{m} es la temperatura de fusión, temperatura en la que se separa
el 50% de las hebras de ADN apareadas.
La hibridación se lleva a cabo con preferencia
en una solución de fuerza iónica elevada, por ejemplo una solución 6
x SSC.
De modo ventajoso, las condiciones de
hibridación empleadas son las siguientes:
- temperatura: 42ºC,
- tampón de hibridación: 6 x SSC, 5 x Denhart's,
0,1% SDS,
como las descritas en el ejemplo III.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas según la invención se representan
mediante los oligonucleótidos siguientes o sus complementarios:
- SEQ ID nº 20:
- GCG AGC TGC CCT CGG AG
- SEQ ID nº 21:
- GGT TCT GCA GGT GAC TCA G
- SEQ ID nº 22:
- GCC ATG CCT GTC TAC AAG
- SEQ ID nº 23:
- ACC AGC TGG TTG ACG GAG
- SEQ ID nº 24:
- GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG
- SEQ ID nº 25:
- GTG GAT CTC GGC CTC C
- SEQ ID nº 26:
- AGG CCG GCG TGG GGA AG
- SEQ ID nº 27:
- CTT GGC GAT CTG GCA GTA G
- SEQ ID nº 28:
- GCG GCC ACG ACC GTG AC
- SEQ ID nº 29:
- GGC AGC TTG GGT CTC TGG
- SEQ ID nº 30:
- CTG TAC GTC GGT GAC CCC
- SEQ ID nº 31:
- TCA GTG GAT CTC GGC CTC
- SEQ ID nº 32:
- AGG GGA CGC AGC GAA ACC
- SEQ ID nº 33:
- CCA TCA GCT CCA GGC TCT C
- SEQ ID nº 34:
- CCA GGA CAG GCG CAG ATG
- SEQ ID nº 35:
- GAT GAG GTG GCT GGC TGG A
- SEQ ID nº 36:
- TGG TCA GGT TCT GCA GGT G
- SEQ ID nº 37:
- CAC CTA CTC CAG GGA TGC
- SEQ ID nº 38:
- AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC
- SEQ ID nº 39:
- CAG GCC CAC TTG CCT GCC
- SEQ ID nº 40:
- CTG TCC CCA AGC TGA TGA G
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas de la invención se marcan con
preferencia antes de su utilización. Para ello, los expertos
disponen de varias técnicas (marcado fluorescente, radioactivo,
quimioluminiscente, enzimático, etc.).
Los métodos de diagnóstico "in
vitro", en los que se emplean estas sondas nucleótidas, se
incluyen en el objeto de la presente invención.
Estos métodos se refieren por ejemplo a la
detección de síntesis anormales (ej. acumulación de productos de
transcripción) o de anomalías genéticas, por ejemplo la pérdida del
carácter heterocigótico y el reordenamiento genético, y las
mutaciones puntuales a nivel de las secuencias de nucleótidos de
ácidos nucleicos que codifican a una proteína
SR-p70, según la definición establecida
anteriormente.
Las secuencias de nucleótidos de la invención
son también útiles para la fabricación y la utilización de cebos
oligonucleótidos para las reacciones de secuenciación o de
amplificación específicas según la técnica llamada PCR o cualquier
variante de la misma (reacción en cadena de ligasa (LCR),...).
Los pares de cebos preferidos están constituido
por cebos elegidos entre las secuencias de nucleótidos: la SEQ ID
nº 1: secuencia de mono de 2 874 nucleótidos y la SEQ ID nº 5: ADNc
SR-p70a humana, por ejemplo en una posición
anterior (upstream) del codón ATG de iniciación y en posición
posterior (downstream) del codón TGA de paro de la traducción.
De modo ventajoso, estos cebos se representan
mediante los pares siguientes:
- par nº 1:
| cebo sentido: | GCG AGC TGC CCT CGG AG | (SEQ ID nº 20) |
| cebo antisentido: | GGT TCT GCA GGT GAC TCA G | (SEQ ID nº 21) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 2:
| cebo sentido: | GCC ATG CCT GTC TAC AAG | (SEQ ID nº 22) |
| cebo antisentido: | ACC AGC TGG TTG ACG GAG | (SEQ ID nº 23) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 3:
| cebo sentido: | GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG | (SEQ ID nº 24) |
| cebo antisentido: | GTG GAT CTC GGC CTC C | (SEQ ID nº 25) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 4:
| cebo sentido: | AGG CCG GCG TGG GGA AG | (SEQ ID nº 26) |
| cebo antisentido: | CTT GGC GAT CTG GCA GTA G | (SEQ ID nº 27) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 5:
| cebo sentido: | GCG GCC ACG ACC GTG A | (SEQ ID nº 28) |
| cebo antisentido: | GGC AGC TTG GGT CTC TGG | (SEQ ID nº29) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 6:
| cebo sentido: | CTG TAC GTC GGT GAC CCC | (SEQ ID nº 30) |
| cebo antisentido: | TCA GTG GAT CTC GGC CTC | (SEQ ID nº 31) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 7:
| cebo sentido: | AGG GGA CGC AGC GAA ACC | (SEQ ID nº 32) |
| cebo antisentido: | GGC AGC TTG GGT CTC TGG | (SEQ ID nº 29) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 8:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCN | (en el que N es igual a G, A o T) |
| cebo antisentido: | CCA TCA GCT CCA GGC TCT C | (SEQ ID nº 33) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 9:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCN | (en el que N es igual a G, A o T) |
| cebo antisentido: | CCA GGA CAG GCG CAG ATG | (SEQ ID nº 34) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 10:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCCN | (en el que N es igual a G, A o T) |
| cebo antisentido: | CTT GGC GAT CTG GCA GTA G | (SEQ ID nº 27) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 11:
| cebo sentido: | CAC CTA CTC CAG GGA TGC | (SEQ ID nº 37) |
| cebo antisentido: | AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC | (SEQ ID nº 38) |
\vskip1.000000\baselineskip
- par nº 12:
| cebo sentido: | CAG GCC CAC TTG CCT GCC | (SEQ ID nº 39) |
| cebo antisentido: | CTG TCC CCA AGC TGA TGA G | (SEQ ID nº 40) |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebos corresponden a secuencias que van
respectivamente:
- del nucleótido nº 124 al nucleótido nº 140 de
la SEQ ID nº 1 y del nucleótido nº 1 al nucleótido nº 17 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 20
- del nucleótido nº 2280 al nucleótido nº 2262
de la SEQ ID nº 1 y del nucleótido nº 2156 al nucleótido 2138 de la
SEQ ID nº 5 para la SEQ ID nº 21
- del nucleótido nº 684 al nucleótido nº 701 de
la SEQ ID nº 1 para la SEQ ID nº 22
- del nucleótido nº 1447 al nucleótido nº 1430
de la SEQ ID nº 1 y del nucleótido 1324 al nucleótido 1307 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 23
- del nucleótido 1434 al nucleótido 1454 de la
SEQ ID nº 1 y del nucleótido 1311 al nucleótido 1331 de la SEQ ID nº
5 para la SEQ ID nº 24
- del nucleótido 2066 al nucleótido 2051 de la
SEQ ID nº 1 y del nucleótido 1940 al nucleótido 1925 de la SEQ ID nº
5 para la SEQ ID nº 25.
- del nucleótido 16 al nucleótido 32 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 26
- del nucleótido 503 al nucleótido 485 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 27
- del nucleótido 160 al nucleótido 176 de la SEQ
ID nº 11 para la SEQ ID nº 28
- del nucleótido 1993 al nucleótido 1976 de la
SEQ ID nº 5 para la SEQ ID nº 29
- del nucleótido 263 al nucleótido 280 de la SEQ
ID nº 11 para la SEQ ID nº 30
- del nucleótido 1943 al nucleótido 1926 de la
SEQ ID nº 5 para la SEQ ID nº 31
- del nucleótido 128 al nucleótido 145 de la la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 17 para la SEQ ID
nº 32
- del nucleótido 1167 al nucleótido 1149 de la
SEQ ID nº 5 para la SEQ ID nº 33
- del nucleótido 928 al nucleótido 911 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 34
- del nucleótido 677 al nucleótido 659 de la SEQ
ID nº 5 para la SEQ ID nº 35
- del nucleótido 1605 al nucleótido 1587 de la
SEQ ID nº 5 para la SEQ ID nº 36
- del nucleótido 1 al nucleótido 18 de la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 13 para la SEQ ID
nº 37
- del nucleótido 833 al nucleótido 813 de la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 13 para la SEQ ID
nº 38
- del nucleótido 25 al nucleótido 42 de la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 13 para la SEQ ID
nº 39
- del nucleótido 508 al nucleótido 488 de la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 13 para la SEQ ID
nº 40.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de nucleótidos según la invención
pueden utilizarse además para la producción de proteínas
recombinantes SR-p70, según la definición dada a
este término.
Se pueden producir estas proteínas a partir de
las secuencias de nucleótidos definidas anteriormente, según des
técnicas de obtención de productos recombinantes que los expertos ya
conocen. En este caso, la secuencia de nucleótidos utilizada se
sitúa bajo el control de señales que permiten su expresión en un
hospedante celular.
Un sistema eficaz de producción de una proteína
recombinante necesita disponer de un vector, por ejemplo de origen
plasmídico o vírico, y de una célula hospedante compatible.
El hospedante celular puede elegirse entre
sistemas procariotas, como las bacterias, o eucariotas, como por
ejemplo las levaduras, células de insectos, CHO (células de ovarios
de hámster chino) o cualquier otro sistema de modo ventajoso
disponible. Un hospedante celular preferido para la expresión de las
proteínas de la invención está constituido por la bacteria E.
coli, en especial la cepa MC 1061 (Clontec).
El vector debe llevar un promotor, señales de
inicio y de terminación de la traducción y regiones apropiadas de
regulación de la transcripción. Debe poder mantenerse de modo
estable en la célula y eventualmente puede poseer señales
particulares que especifiquen la secreción de la proteína
traducida.
Las diferentes señales de control se eligen en
función del hospedante celular utilizado. A este efecto, las
secuencias de nucleótidos según la invención pueden insertarse en
vectores de replicación autónoma dentro del hospedante elegido, o
vectores integrantes del hospedante elegido. Estos vectores se
preparan por los métodos que los expertos emplean habitualmente, y
se pueden introducir los clones resultantes en un hospedante
apropiado por métodos estándar, por ejemplo por electroporación.
Les vectores de clonación y/o de expresión que
contienen por lo menos una de las secuencias de nucleótidos
definidas anteriormente forman también parte de la presente
invención.
Un vector de clonación y de expresión preferido
es el plásmido pSE1 que lleva a su vez los elementos necesarios
para la utilización como vector de clonación en la E. coli
(origen de replicación en E. coli y gen de resistencia a la
ampicilina, procedente del plásmido pTZ18R), y como vector de
expresión en células animales (promotor, intrón, sitio de
poliadenilación, origen de replicación del virus SV40), así como
elementos que permiten su copia en la hebra simple de un extremo de
secuenciación (origen de replicación del fago (1).
Las características de este plásmido se
describen en la solicitud EP 0 506 574.
Su construcción, así como la integración de los
ADNc procedentes de las secuencias de ácidos nucleicos de la
invención se describen además en los ejemplos que siguen.
Según un modo preferido de realización, las
proteínas de la invención están en forma de proteínas de fusión,
sobre todo en forma de proteína fusionada con la
glutationa-S-transferasa (GST). Un
vector de expresión diseñado para este caso es el representado por
el vector plasmídico pGEX-4T-3
(Pharmacia, ref. 27.4583).
La invención se refiere además a células
hospedantes transfectadas con los vectores anteriores.
Estas células pueden obtenerse por introducción
en células hospedantes de una secuencia de nucleótidos insertada en
un vector como los definidos anteriormente y posterior cultivo de
las células en condiciones que permitan la replicación y/o la
expresión de la secuencia de nucleótidos transfectada.
Estas células pueden utilizarse en un método de
producción de un polipéptido recombinante de secuencia SEQ ID nº 2,
SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 12,
SEQ ID nº 14, SEQ ID nº 16 o SEQ ID nº 18.
El método de producción de un polipéptido de la
invención en forma recombinante está también contemplado en la
presente invención y se caracteriza porque se cultivas las células
transfectadas en condiciones que permiten la expresión de un
polipéptido recombinante de secuencia SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ
ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 12, SEQ ID nº 14, SEQ
ID nº 16 o SEQ ID nº 18, y porque se recupera dicho polipéptido
recombinante.
Los procedimientos de purificación utilizados ya
son conocidos de los expertos. El polipéptido recombinante puede
purificarse a partir de lisados y extractos celulares, del líquido
sobrenadante del medio de cultivo, por métodos utilizados a título
individual o en combinación, como son el fraccionamiento, los
métodos cromatográficos, las técnicas de inmunoafinidad con
anticuerpos mono- o policlonales específicos, etc. Una variante
preferida consiste en producir un polipéptido recombinante
fusionado con una proteína "portadora" (proteína quimérica).
La ventaja de este sistema estriba en que permite la estabilización
y la disminución de la proteólisis del producto recombinante, el
aumento de la solubilidad en el curso de la renaturalización
"in vitro" y/o la simplificación de la purificación
cuando el reactivo empleado para la fusión posee afinidad con un
ligando específico.
De modo ventajoso, los polipéptidos de la
invención se fusionan con la
glutationa-S-transferasa en posición
N-terminal (sistema "GST" de Pharmacia). El
producto de la fusión se detecta en este caso y se cuantifica
gracias a la actividad enzimática de la GST. El reactivo
colorimétrico empleado es un aceptor de glutationa, sustrato de la
GST. Se purifica el producto recombinante sobre un soporte de
cromatografía, sobre el que se han fijado previamente las moléculas
de la glutationa.
Los anticuerpos mono- o policlonales capaces de
reconocer de modo específico una proteína SR-p70
según la definición dada anteriormente forman también parte de esta
invención. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse a partir
del suero de un animal inmunizado contra la proteína, producida por
ejemplo por recombinación genética con arreglo al método descrito
anteriormente, según los modos operativos habituales. Los
anticuerpos monoclonales pueden obtenerse según el método clásico
de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y Milstein, Nature
256, 495-497, 1975.
Los anticuerpos ventajosos son los anticuerpos
dirigidos contra la región central, comprendida entre el resto 110
y el resto 310 para las secuencias SEQ ID nº 2 ó 6 o entre el resto
60 y el resto 260 para la secuencia SEQ ID nº 8.
Los anticuerpos según la invención son por
ejemplo anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos
Fab y F(ab')2. Pueden presentarse también en forma de
inmunoconjugados o de anticuerpos marcados.
Además, aparte de su utilización para la
purificación de polipéptidos recombinantes, los anticuerpos de la
invención, en particular los anticuerpos monoclonales, pueden
utilizarse también para la detección de estos polipéptidos en una
muestra biológica.
Constituyen, pues, un medio de análisis
inmunocitoquímico o inmunohistoquímico de la expresión de proteínas
SR-p70 en cortes de tejidos específicos, por ejemplo
por inmunofluorescencia, por marcado con oro, inmunoconjugados
enzimáticos.
Permiten sobre todo detectar la acumulación
anormal de proteínas SR-p70 en ciertos tejidos o
extractos biológicos, por lo cual son útiles para la detección del
cáncer o para hacer el seguimiento de la evolución o de la remisión
de cánceres preexistentes.
De modo más general, los anticuerpos de la
invención pueden utilizarse de modo ventajoso en cualquier situación
en la que tenga que observarse la expresión de una proteína
SR-p70. Por tanto, la invención se refiere también
a un procedimiento de diagnóstico "in vitro" de
patologías relacionadas con una expresión o una acumulación anormal
de proteínas SR-p70, sobre todo los fenómenos de
cancerización, a partir de un extracto biológico, caracterizado
porque se pone en contacto por lo menos un anticuerpo de la
invención con dicho extracto biológico, en condiciones que permiten
la formación eventual de complejos inmunológicos específicos entre
una proteína SR-p70 y dicho o dichos anticuerpos y
porque se detectan los complejos inmunológicos específicos
eventualmente formados.
La invención se refiere también a un kit para el
diagnóstico "in vitro" de una expresión o una
acumulación anormal de proteínas SR-p70 en un
extracto biológico y/o para la medición del grado de expresión de
esta en dicho extractos, que consta de:
- por lo menos un anticuerpo específico de una
proteína SR-p70, fijado eventualmente sobre un
soporte,
- medios de revelado de la formación de
complejos antígenos/anticuerpos específicos entre una proteína SRp70
y dicho anticuerpo y/o medios para cuantificar estos complejos.
La invención se refiere además a un método de
diagnóstico precoz de la formación des tumores, mediante la
detección en el suero de un individuo de los
auto-anticuerpos dirigidos contra una proteína
SR-p70.
Dicho método de diagnóstico precoz está
caracterizado porque se pone en contacto una muestra de suero
extraído a un individuo con un polipéptido de la invención,
eventualmente fijado sobre un soporte, en condiciones que permiten
la formación de complejos inmunológicos específicos entre dicho
polipéptido y los auto-anticuerpos eventualmente
presentes en la muestra de suero, y porque se detectan los complejos
inmunológicos específicos eventualmente formados. La invención se
refiere además a un método de determinación de una variabilidad
alélica, de una mutación, de una deleción, de una inserción, de una
pérdida del carácter heterocigótico o de una anomalía genética del
gen SRp70, que pudieran estar implicadas en las patologías,
caracterizado porque emplea por lo menos una secuencia de
nucleótidos descrita a continuación. Entre los métodos de
determinación de la variabilidad alélica, de una mutación, de una
deleción, de una inserción, de una pérdida del carácter
heterocigótico o de una anomalía genética del gen
SR-p70, se prefiere el método caracterizado porque
consiste por lo menos en un paso de amplificación por PCR de la
secuencia nucleica diana de la SR-p70 susceptible de
presentar un polimorfismo, una mutación, una deleción o una
inserción mediante un par de cebos de secuencias de nucleótidos
definidas anteriormente, un paso en el curso del cual se procede al
tratamiento de los productos amplificados mediante una enzima de
restricción apropiada y un paso en el que se procede a la detección
o a la dosificación de por lo menos uno de los productos de la
reacción enzimática.
La invención se refiere también a composiciones
farmacéuticas que, como principio activo, contienen un polipéptido
que se ajusta a las definiciones anteriores, con preferencia en
forma soluble, asociado a un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Estas composiciones permiten abordar una nueva
estrategia de tratamiento de fenómenos de cancerización a nivel de
control de la multiplicación y la diferenciación celular.
Con preferencia, estas composiciones pueden
administrarse por vía sistémica, con preferencia por vía
intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica o por vía oral.
Sus modos de administración, posologías y formas
galénicas óptimas podrán determinarse según los criterios generales
que se toman en consideración para establecer un tratamiento
terapéutico adaptado a un paciente, por ejemplo la edad y el peso
corporal del paciente, la gravedad de su estado de salud, la
tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados,
etc.
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes después de la descripción de los ejemplos y las
figuras, cuyas leyendas se reproducen a continuación.
Figura 1: Comparación nucleica del ADNc de la
SR-p70a de mono (correspondiente a la SEQ ID nº 1)
con la secuencia nucleica del ADNc de p53 de mono.
Figura 2: Comparación proteica de
SR-p70a de mono con la proteína p53 de mono (sw:
p53-cerae).
Figura 3: Comparación de la secuencia nucleica
del ADNc de SR-p70a y b de mono (correspondientes
respectivamente a la SEQ ID nº 1 y SEQ ID nº 3).
Figura 4: Secuencia nucleica y secuencia
proteica deducida de SR-p70a de mono.
Figura 5: Secuencia nucleica parcial y secuencia
proteica deducida completa de SR-p70b de mono.
Figura 6: Secuencia nucleica parcial y secuencia
proteica completa deducida de SR-p70a humana
(correspondiente a la SEQ ID nº 5).
Figura 7: Secuencia nucleica parcial y secuencia
proteica deducida completa de SR-p70c de ratón
(correspondiente a la SEQ ID nº 7).
Figura 8: Secuencia nucleica parcial y secuencia
proteica deducida parcial de SR-p70a de ratón
(correspondiente a la SEQ ID nº 9).
Figura 9: Multialineamiento de proteínas
deducidas del ADNc SR-p70 de mono (a y b), humano
(a) y de ratón (a y c).
Figura 10a: Inmunohuella de la proteína
SR-p70.
Figura 10b: Detección de la proteína endógena
SR-p70.
Figura 11: Localización cromosómica del gen
SR-p70 humano. La señal aparece en el cromosoma 1,
en la región p36.
Figura 12: Estructura genómica del gen
SR-p70 y comparación con la del gen p53. Las
secuencias proteicas humanas del SR-p70a (línea
superior del alineamiento) y de la p53 (línea inferior) están
fragmentadas en péptidos en función los exones respectivos a partir
a partir de los que se han codificado. Las cifras al nivel de
flechas corresponden a la numeración de los exones
correspondientes.
Figura 13: Secuencia genómica humana del
SR-p70 desde el 3' del intrón 1 hasta el 5' del exón
3. Los intrones están encuadrados. En las posiciones 123 y 133 se
localizan dos posiciones nucleicas variables (G \rightarrow A en
123 y
C \rightarrow T en 133). Los sitios de restricción de la enzima Styl están subrayados (posición 130 en el caso de presencia de un T en lugar de un C en la posición 133, posición 542 y posición 610). Las flechas indican la posición de los cebos nucleicos utilizados en el ejemplo XI.
C \rightarrow T en 133). Los sitios de restricción de la enzima Styl están subrayados (posición 130 en el caso de presencia de un T en lugar de un C en la posición 133, posición 542 y posición 610). Las flechas indican la posición de los cebos nucleicos utilizados en el ejemplo XI.
Figura 14: Comparación nucleica del 5' de los
ADNc humanos del SR-p70d y del
SR-p70a.
Figura 15: Multialineamiento de secuencias
nucleicas correspondiente al SR-p70 humano a, b, d,
e y f.
Figura 16: Multialineamiento de proteínas
deducidas del ADNc SR-p70 humano (a, b, d, e y
f).
Figura 17: Secuencia nucleica parcial y
secuencia proteica deducida parcial del SR-p70a
humano. Las dos bases en negrita corresponden a dos posiciones
variables (ver figura 6). Esta secuencia presenta una región 5' no
codificado más completa que la representada en la figura 6.
Figura 18: Análisis de transcritos
SR-p70a después de la amplificación por PCR.
pista M: marcadores de pesos moleculares "1 kb
ladder" (GIBCO-BRL)
pista 1: línea HT29
pista 3: línea
SK-N-AS
pista 5: línea UMR-32
pista 7: línea U-373 MG
pista 9: línea SW 480
pista 11: línea CHP 212
pista 13: línea
SK-N-MC
pistas 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: blancos negativos
correspondientes a las pistas 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 respectivamente
(ausencia de la transcriptasa inversa en la reacción
RT-PCR).
Figura 19: A: Análisis por electroforesis a
través de gel de agarosa de los fragmentos genómicos amplificados
por PCR (desde el 3' del intrón 1 hasta el 5' del exón 3). La
numeración de las pistas corresponde a la numeración de las muestras
en blanco. Pista M: marcadores de pesos moleculares ("1 kb
ladder").
B: Análisis idéntico al del apartado A después
de la digestión con la enzima de restricción Styl de las mismas
muestras.
Figura 20: representación esquemática con un
mapa de restricción parcial del plásmido pCDNA3 que contiene al
SR-p70a humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan células COS-3
(células renales de mono verde de África transformadas con el
antígeno T del virus SV 40) en un medio DMEM
(GIBCO-BRL, referencia 41 965-047)
que contiene 2 mM de L-glutamina y se ha
suplementado con 50 mg/l de gentamicina y con un 5% de suero fetal
bovino (GIBCO-BRL, referencia
10231-074) hasta semiconfluencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperan las células del modo siguiente:
- Se lavan las células adheridas dos veces con
tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato, referencia
04104040 de GIBCO-BRL), después se raspan con un
rascador de caucho y se centrifugan.
Se suspende el culote celular en el tampón de
lisis de la composición siguiente:
guanidina-tiocianato 4M; citrato sódico 25 mM, pH
7; sarcosilo 0,5%; \beta-mercaptoetanol 0,1 M. Se
trata la suspensión con ultrasonidos en un aparato
Ultra-Turrax nº 231256 (Janke & Kundel) en su
potencia máxima durante un minuto. Se añade acetato sódico de pH 4,
hasta 0,2 M. Se extrae la solución con un volumen de una mezcla
fenol/cloroformo (v/v; 5/1). Se precipita a -20ºC el ARN contenido
en la fase acuosa mediante un volumen de isopropanol. Se suspende de
nuevo el culote en el tampón de lisis. Se extrae de nuevo la
solución con una mezcla de fenol/cloroformo y se precipita el ARN
con isopropanol. Se lava el culote con etanol del 70% después del
100%, se suspende de nuevo el ARN en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación de la fracción poli A^{+} del
ARN se realiza con el kit Dynabeads oligo (dT)_{25} de
DYNAL (referencia 610.05) con arreglo a las instrucciones del
fabricante. El principio se basa en la utilización de esferillas de
poliestireno super-paramagnético, sobre las que se
ha fijado un oligonucleótido poli(dT)_{25}. Se
hibrida la fracción poli A+ del ARN con el
oligo(dT)_{25} fijado sobre las esferillas, que se
sujetan sobre un soporte magnético.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de 0,5 \mug de
ARN-poli A+ de células COS-3
obtenido al término del paso 2, se prepara el ADN complementario de
hebra simple, marcado con dCTP-P^{32} (el ADN
complementario obtenido presenta una actividad específica de 3000
dpm/ng) con el cebo sintético de la secuencia siguiente (que
contiene un sitio BamHI):
- 5'<GATCCGGGCC CTTTTTTTTT TTT<3'
en un volumen de 30 \mul de
tampón de composición: Tris HCl 50 mM, de pH 8,3, MgCl_{2} 6 mM,
DTT 10 mM, KCl 40 mM, que contiene 0,5 mM de cada uno de los
desoxinucleótidos-trifosfatos, 30 \muCi de
dCTP-\alphaP^{32} y 30 U de RNasin
(Promega).
Después de una hora de incubación a 37ºC, luego
10 minutos a 50ºC, luego otra vez 10 minutos a 37ºC, con 200
unidades de la enzima transcriptasa inversa RNasa H^{-}
(GIBCO-BRL, referencia 8064A), se añaden 4 \mul de
EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 6 \mul de una solución de NaOH 2N,
después se incuba a 65ºC durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de eliminar el cebo sintético, se
purifica el ADN complementario en una columna de 1 ml de Sephacryl
S400 (Pharmacia), equilibrada con tampón TE.
Se reúnen las dos primeras fracciones
radiactivas y se precipitan con 1/10 de volumen de una solución de
acetato amónico 10 M y 2,5 volúmenes de etanol, después de haber
realizado una extracción con un volumen de cloroformo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prolonga el ADN complementario en 3' con una
"cola" de dG con 20 unidades del enzima terminal transferasa
(Pharmacia, 27073001). Se incuba en 20 \mul de tampón de
composición: Tris HCl 30 mM, de pH 7,6; cloruro de cobalto 1 mM,
ácido cacodílico 140 mM, DTT 0,1 mM, dGTP 1 mM, a 37ºC durante 15
minutos, después se añaden 2 \mul de EDTA 0,5 M.
\vskip1.000000\baselineskip
e) Se repiten de nuevo los pasos b) y c)
\vskip1.000000\baselineskip
Se centrifuga, se disuelve el culote en 33
\mul de tampón TE, se añaden 5 \mul (125 ng) de vector de
clonación pSE1, 1 \mul (120 ng) del adaptador de secuencia
siguiente (que contiene un sitio Apal):
- 5'AAAAAAAAAAAAAGGGCCCG3'.
10 \mul de una solución de NaCl 200 mM, se
incuba a 65ºC durante 5 minutos, se deja enfriar la mezcla
reaccionante a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se liga el vector de clonación y el ADNc de
hebra simple en un volumen de 100 \mul con 32,5 unidades de la
enzima ADN ligasa del fago T4 (Pharmacia, referencia 270 87002) a
15ºC durante una noche en un tampón de composición:
- Tris HCl 50 mM, de pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eliminan las proteínas por extracción con
fenol y posterior extracción con cloroformo, después se añade 1/10
de volumen de una solución de acetato amónico 10 mM, después 2,5
volúmenes de etanol. Se centrifuga, se disuelve el culote en el
tampón de composición Tris-acetato 33 mM, de pH 7,9,
acetato potásico 62,5 mM, acetato magnésico 1 mM y ditiotreitol
(DTT) 1 mM. Se sintetiza la segunda hebra del ADN complementario en
un volumen de 30 \mul con 30 unidades de la enzima
ADN-polimerasa del fago T4 (Pharmacia, referencia
270718) y una mezcla de 1 mM de los cuatro
desoxinucleótidos-trifosfatos de dATP, dCTP, dGTP y
dTTP, así como dos unidades de la proteína del gen 32 del fago T4
(Pharmacia, referencia 27-0213)) a 37ºC durante una
hora. Se extrae con fenol y se separan las trazas de fenol en una
columna de poliacrilamida P10 (Biogel P10; 200-400
mesh; referencia 15011050, Biorad).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman las células E. coli MC
1061 con el ADN recombinante obtenido anteriormente por
electroporación mediante un aparato Biorad Gene Pulser (Biorad)
trabajando a 2,5 kV en las condiciones recomendadas por el
fabricante, después se cultivan las bacterias durante una hora con
el medio llamado LB (Sambrook, obra citada) de composición;
bactotriptona 10 g/l; extracto de levadura 5 g/l; NaCl 10 g/l.
Se determina el número de clones independiente
efectuando una dilución de 1/1000 de la transformación después de
la primera hora de incubación en una cubeta con medio LB al que se
han añadido un 1,5% de agar (p/v) y 100 \mug/ml de ampicilina,
llamado a continuación medio LB gelosado. El número de clones
independientes es de 1 millón.
\vskip1.000000\baselineskip
En el cuadro del análisis de clones
individualizados del banco por un secuenciación nucleica del 5' de
los ADNc, se pone de manifiesto que un clon, denominado
SR-p70a, presenta una homología parcial con el ADNc
de la proteína ya conocida, la proteína p53 (Genbank X 02469 y X
16384) (figura 1). Las secuencias se realizan con el kit United
States Biochemical (referencia 70770) y/o el kit Applied Biosystems
(referencias 401434 y/o 401628) que utilizan el método de Sanger y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14,
5463-5467, 1977. El ADN plasmídico se prepara a
partir del kit WIZARD mini-preparación (Promega,
referencia A7510). Los cebos utilizados son oligonucleótidos de 16
a 22-meros, complementarios del vector pSE1 de la
región contigua al 5' del ADNc, o de la secuencia del ADNc.
Se aísla un segundo ADNc del mismo banco
seleccionando de manera similar a la técnica descrita en el
siguiente ejemplo III 3) con un fragmento del ADN
SR-p70a marcado con P^{32} con el kit BRL
"Random Primers DNA labelling systems" (referencia
18187-013). Se añaden a los tampones de hibridación
y de lavado un 50% de formamida. El último lavado se realiza con 0,1
x SSC/SDS 0,1% a 60ºC. Esta segunda secuencia (ADNc
SR-p70b) es idéntica a la primera, pero presenta un
fragmento interno que ha sufrido deleción (figura 3).
Los dos ADNc SR-p70, de una
longitud de 2874 nucleótidos (SR-p70a) y de 2780
nucleótidos (SR-p70b), corresponden a productos de
un solo gen, un empalme alternativo implica una deleción de 94 bases
entre les nucleótidos 1637 y 1732 y una terminación prematura de la
proteína codificada correspondiente. Las proteínas deducidas de los
dos ADNc presentan respectivamente 637 aminoácidos y 499 aminoácidos
(figuras 4 y 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las células en un medio McCoy 5
(GIBCO, 26600-023) al que se ha añadido un 10% de
suero fetal bovino (GIBCO, 10081-23) y 50 mg/l de
gentamicina hasta semi-confluencia.
\newpage
Se prepara el ARN mensajero del modo descrito en
el ejemplo I.2. Se prepara el ADNc de modo similar al descrito en el
ejemplo I.3 con 5 \mug de ARN mensajero total empleando un cebo
poli(T)_{12}. No se interrumpe la reacción con
EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza polimerización con 4 \mul de ADNc
en 50 \mul finales con un tampón de la composición siguiente: Tris
HCl 10 mM, de pH 8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, KCl 50 mM, en presencia de
10% DMSO, dNTP 0,5 mM, 4 \mug/ml de cada uno de los dos cebos
nucleicos y de 2,5 unidades de
Taq-ADN-polimerasa (Boehringer). Se
eligen los pares de cebos de la secuencia nucleica del clon
SR-p70 de COS-3, a saber, en una
posición anterior (upstream) al ATG de inicio y en una posición
posterior (downstream) del TGA de paro de la traducción y tienen las
composiciones siguientes:
- cebo sentido:
- ACT \underline{GGT \ ACC} GCG AGC TGC CCT CGG AG
sitio de restricción Kpn I
\vskip1.000000\baselineskip
- cebo antisentido:
- GAC \underline{TCT \ AGA} GGT TCT GCA GGT GAC TCA G
sitio de restricción Xba I
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se realiza durante 30 ciclos de
94ºC/1 minuto, 54-60ºC/1 minuto 30 segundos y 72ºC/1
minuto 30 segundos, con un último ciclo de 72ºC/6 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se separan los oligonucleótidos
del producto de PCR en una columna de Sephacryl S400, después se
desaliniza por cromatografía de exclusión en una columna de
poliacrilamida P10 (Biorad, referencia 1504144). Se efectúan las
reacciones de secuenciación con un kit Applied Biosystems
(referencia 401628) que lleva los oligonucleótidos específicos del
ADNc. La secuencia obtenida es muy similar a la del
SR-p70a de mono y la proteína deducida contiene 636
aminoácidos (figura 6).
De manera similar se obtienen otras secuencias
procedentes de líneas celulares o de tejidos humanos para la parte
codificante del SR-p70 humano, sobre todo a partir
del pulmón o del páncreas. Las proteínas deducidas de estas
secuencias son idénticas a las obtenidas de la línea
HT-29.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digieren el producto de la PCR obtenido en 3)
y el plásmido con dos enzimas de restricción Kpn I y Xba I y
después se purifican por migración a través de un gel de agarosa 1%
con un kit Geneclean (Bio 101, referencia 3105). Después de la
ligación con 100 ng de inserto y 10 ng de vector y transformación
(técnica descrita en el ejemplo I.3.g e i, se verifican os clones
recombinantes por secuenciación con el kit Applied Biosystems ya
mencionado antes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las células en un medio Ham F10
(GIBCO, 31550-023) al que se ha añadido un 15% de
suero de caballo (GIBCO, 26050-047) y un 2,5% de
suero fetal bovino (GIBCO, 10081-073) y 50 mg/l de
gentamicina hasta semi-confluencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza este banco del modo descrito en el
ejemplo 1, 2) y 3) a partir de células cultivadas antes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones del banco se distribuyen en un medio
LB gelosado (cápsulas petri de diámetro 150) revestido con
membranas Biodyne A (PALL, referencia BNNG 132). Después de una
noche a 37ºC se transfieren los clones por contacto a las nuevas
membranas. Se tratan estas últimas depositándolas sobre un papel
Whatman 3 mm impregnado con las soluciones siguientes: NaOH 0,5 N,
NaCl 1,5 M durante 5 minutos, después Tris HCl 0,5 M, de pH 8, NaCl
1,5 M durante 5 minutos. Después del tratamiento con la proteinasa K
en el tampón siguiente: Tris HCl 10 mM, de pH 8, EDTA 10 mM, NaCl
50 mM, SDS 0,1%, proteinasa K 100 \mug/ml a temperatura ambiente
durante una hora, se lavan las membranas copiosamente con 2 x SSC
(citrato sódico-NaCl), se secan, se incuban en una
estufa conectada al vacío a 80ºC durante 20 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre la base de las secuencias de ADNc
SR-p70 de mono y de humano, se realiza una primera
secuencia sobre un fragmento amplificado a partir del ARNm de la
línea AtT-20 del modo descrito en el ejemplo II.3 y
4 con los oligómeros de las composiciones siguientes:
- cebo sentido:
- GCC ATG CCT GTC TAC AAG
- cebo antisentido:
- ACC AGC TGG TTG ACG GAG.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre la base de esta secuencia, se elige una
sonda oligomérica específica de ratón que presenta la composición
siguiente:
- GAG CAT GTG ACC GAC ATT G.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcan 100 ng de la sonda en 3' con 10
unidades de transferasa terminal (Pharmacia) y 100 \muCi de
dCTP-\alphaP^{32} 3000 Ci/mmol (Amersham,
referencia PB 10205) en 10 \mul del tampón siguiente: Tris HCl 30
mM, de pH 7,6, ácido cacodílico 140 mM, COCl_{2} 1 mM, DTT 0,1 mM,
a 37ºC durante 15 minutos. Se separan los nucleótidos radiomarcados
no incorporados en una columna de poliacrilamida P10 (Biorad,
referencia 1504144). La sonda obtenida tiene una actividad
específica de aprox. 5x10^{8} dpm/\mug.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prehibridan las membranas preparadas en a) a
42ºC durante 30 minutos en 6 x SSC, 5 x Denhart's, 0,1% SDS y
después se hibridan durante varias horas en el mismo tampón al que
se ha añadido la sonda preparada en b) a razón de 10^{6}
dpm/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavan las membranas dos veces a temperatura
ambiente con el tampón 2 x SSC/SDS 0,1%, después a 56ºC durante una
hora en 6 x SSC/SDS 0,1%. Se revelan los clones hibridados en
películas KODAK XOMAT. Se selecciona un clon positivo que contiene
el SR-p70, que a continuación se llamará
SR-p70c.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene la secuencia con un kit Applied
Biosystem (referencia 401628). La secuencia proteica deducida del
ADNc SR-p70c de ratón (figura 7) presenta una
homología muy fuerte con las del humano y de mono, excepto en la
parte N-terminal que diverge mucho (ver figura 9).
Mediante la técnica llamada PCR, de manera similar a la descrita en
el ejemplo II.3 y 4, se obtiene una segunda secuencia 5' (procedente
del mismo banco AtT-20) (figura 8). La secuencia
proteica N-terminal derivada (secuencia llamada
SR-p70a) es muy similar a la derivada del ADNc
SR-p70 humano y de mono (SR-p70a)
(figura 9). La línea celular AtT-20 presenta, pues,
por lo menos dos transcritos SR-p70. Estos 2 últimos
divergen en la parte N-terminal por tener empalmes
diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Consiste en poner la parte -COOH terminal de la
proteína SR-p70a de mono, después la valina en
posición 427 en la histidina -COOH terminal en posición 637, en
fusión con la
glutationa-S-transferasa (GST) del
vector plasmídico pGEX-4T-3
(Pharmacia, referencia 27-4583). Para ello se
amplifica el inserto correspondiente de la SR-p70a
(posición de 1434 a 2066) por PCR con 10 ng de plásmido que contiene
el ADNc SR-p70a de mono. Les cebos nucleicos tienen
la composición siguiente:
- cebo sentido:
- TTT \underline{GGA \ TCC} GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG
sitio de restricción BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
- cebo antisentido:
- AAA \underline{GTC \ GAC} GTG GAT CTC GGC CTC C
sitio Sal I
\vskip1.000000\baselineskip
Se digieren tanto el fragmento obtenido como el
vector con enzimas de restricción BamHI y Sal I y se realiza la
clonación del modo descrito en el ejemplo II.5. El clon seleccionado
se llama pG-SR-p70.
\vskip1.000000\baselineskip
Este paso se realiza empleando un kit "bulk
GST purification module" (Pharmacia, referencia
27-4570-01).
De manera esquemática, se cultiva el clon
recombinante a 37ºC en un litro de medio 2x YTA + ampicilina 100
\mug/ml. A DO 0,8, se induce la expresión con 0,5 mM de IPTG a
37ºC durante 2 horas. Después de la centrifugación, se recoge el
culote celular en PBS frío y después se trata con ultrasonidos. Se
le añade un 1% Triton X-100, se incuba a
temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Se centrifuga
a 12000 g, a 4ºC durante 10 minutos, y se recupera el líquido
sobrenadante. A continuación se efectúa la purificación en una
columna de cromatografía de afinidad de
glutationa-Sepharose 4B. Se realizan la fijación y
el lavado en un tampón PBS y se efectúa la elución por competición
con la glutationa reducida. Se ajusta la concentración final a 300
\mug/ml de proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectan las células COS-3
con ADN plasmídico pSE1, en el que se ha clonado el ADNc de
SR-p70a de mono (ejemplo I.1) o con ADN plasmídico
del vector pSE1 tomado como material en blanco para la técnica del
DEAE dextrano: se siembran las células COS-3 5 x
10^{5} células por cápsula de 6 cm en un medio de cultivo que
contiene un 5% de suero fetal bovino (ejemplo I.1). Después del
cultivo, se enjuagan las células con PBS. Se añade 1 ml de la
mezcla siguiente: un medio que contiene 6,5 \mug de ADN, 250
\mug/ml de DEAE dextrano y 100 \muM de cloroquina. Se incuban
las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante 4-5
horas. Se aspira el medio, se añaden 2 ml de PBS al que se ha
agregado un 10% DMSO y se incuban las células durante una minuto
agitando ligeramente las cápsulas. Se aspira de nuevo el medio y se
enjuagan las células dos veces con PBS. Seguidamente se incuban las
células a 37ºC con un medio que contiene un 2% de suero fetal bovino
mientras dura la expresión, período que por lo general es de 3
días.
Después se analiza la proteína
SR-p70a del modo descrito en el ejemplo VI por
inmunohuella.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplean 150 \mug de proteínas de la muestra
preparada en el ejemplo IV para inmunizar un conejo (macho, de
aprox. 1,5-2 kg, Nueva Zelanda). Se efectúan las
inmunizaciones cada 15 días con arreglo al método descrito por
Vaitukaitis, Methods in Enzymology 73, 46, 1981. Para la
primera inyección se emulsiona un volumen de solución de antígeno
con un volumen de adyuvante completo de Freund (Sigma, referencia
4258). Se administran cinco dosis de recordatorio en adyuvante
incompleto de Freund (Sigma, referencia 5506).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las líneas celulares siguientes del
modo descrito en el catálogo "Catalogue of cell lines and
hibridomas", 7ª edición, 1992 de la ATCC (American Type Culture
Collection): COS-3, CV-1 (línea
celular renal de mono), HT-29,
U-373MG (glioblastoma humano), MCF7 (adenocarcinoma
de mama humano), SKNAS (neuroblastoma humano cultivado en las
mismas condiciones que COS-3),
SK-N-MC (neuroblastoma humano),
IMR-32 (neuroblastoma humano), CHP212
(neuroblastoma humano cultivado en las mismas condiciones que
CV-1), Saos-2 (osteosarcoma),
SK-OV-3 (adenocarcinoma de ovario) y
SW 480 (adenocarcinoma de colon humano).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectan las células COS-3
del modo descrito en el ejemplo IV.2. Como material de control, se
transfectan células con el ADN plasmídico pSE1 que no contiene al
ADNc recombinante SR-p70a.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del cultivo se lavan las células con PBS
y se recogen en un tampón RIPA (PBS con 1% de NP40, 0,5% de
desoxicolato sódico, 0,5% SDS) complementado con 10 \mug/ml de
RNAsa A, 20 \mug/ml de DNAsa 1, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5
\mug/ml de leupeptina, 0,7 \mug/ml de pepstatina y 170 \mug/ml
de PMSF. Se tratan las células con ultrasonidos a 4ºC y se dejan en
reposo a 4ºC durante 30 minutos. Se someten a microcentrifugación a
12 000 rpm y se recupera el líquido sobrenadante. Se mide la
concentración de proteína por el método de Bradford.
\vskip1.000000\baselineskip
Se depositan 5 ó 50 \mug de proteínas (50
\mug para las líneas celulares y 5 \mug para las células
transfectadas) en 0,2 volúmenes del tampón de electroforesis 6X
siguiente: Tris HCl 0,35 mM, de pH 6,8, 10,3% SDS, 36% glicerina,
0,6 mM DTT, 0,012% azul de bromofenol. Se depositan las muestras y
se infiltran a través de un gel SDS-Page 10%
(30/0,8 Bis) y después se electrotransfieren a través de una
membrana de nitrocelulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuba la membrana durante 30 minutos en
tampón de bloqueo TBST (Tris-HCl 10 mM, de pH 8,
NaCl 150 mM, 0,2% Tween 20) al que se ha añadido un 5% de leche
(GIBCO, SKIM MILK) a temperatura ambiente. Se pone en contacto la
membrana sucesivamente con el anticuerpo
anti-SR-p70
(\alphaSR-p70) en el mismo tampón a 4ºC durante
16 horas, se lava 3 veces durante 10 minutos con TBST, se incuba a
37ºC durante una hora con un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina de conejo conjugado con
peroxidasa (SIGMA, A055). Después de tres lavados de 15 minutos, se
realiza el revelado empleando un kit ECL (Amersham, RPN2106) por
quimioluminiscencia.
Se revelan paralelamente las mismas muestras con
un anticuerpo anti-p53 (\alphap53) (Sigma, BP5312)
y después con un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10: Inmunohuella de la proteína
SR-p70
Figura 10a: Detección de la proteína
recombinante SR-p70
- columnas 1 y 3: COS-3
transfectado con el vector pSE1.
- columnas 2 y 4: COS-3
transfectado con el plásmido pSE1 que contiene el ADNc del
SR-p70a.
- columnas 1 y 2: revelado con el anticuerpo
anti-SR-p70
(\alphaSR-pT0).
- columnas 3 y 4: revelado con el anticuerpo
anti-P53 (ap53).
\newpage
Figura 10b: Detección de la proteína endógena
SR-p70
- columnas 1: COS-3; 2:
CV-1; 3: HT-29; 4:
U-373 MG; 5; MCF7; 6: SKNAS; 7:
SK-N-MC; 8: IMR-32;
9: CHP212; 10: Saos-2; 11:
SK-OV-3 y 12: SW480.
A: revelado con el anticuerpo
\alphaSR-p70.
B: revelado con el anticuerpo \alphap53.
El anticuerpo \alphaSR-p70
reconoce de modo específico las proteínas recombinantes (figura 10a)
y endógenas (figura 10b) y no crece con la p53. El análisis de las
líneas celulares humanos o de mono pone de manifiesto que tanto la
proteína SRp70 como la p53 son por lo general difíciles de detectar.
En cambio, cuando existe una acumulación de p53, la SRp70 se
convierte en más fácilmente detectable (figura 10b). Un estudio
realizado por RT-PCR de la distribución de los
transcritos SR-p70 pone de manifiesto que el gen se
expresa en todos los tipos celulares ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
El banco utilizado es un banco de cósmidos,
preparado con el ADN genómico humano purificado de placenta, y
comercializado por Stratagene (referencia 95 1202).
La exploración (selección) del gen se realiza
del modo descrito en el ejemplo III.3 con un fragmento de ADN
SR-p70 marcado con P^{32} con el kit BRL "Random
Primers DNA Labelling Systems" (referencia
18187-013). A los tampones de hibridación y de
lavado se les añade un 50% de formamida. Se realiza el último lavado
en 0,1 x SSC/SDS 0,1% a 60ºC. De manera similar, se aísla el gen
SR-p70 a partir de un banco preparado con el ADN
genómico de ratón negro C57.
El análisis y secuenciación parcial de los
clones ponen de manifiesto la presencia de 14 exones de una
estructura similar a la del gen p53, sobre todo en la parte
central, donde el tamaño y el posicionamiento de los exones están
muy conservados (figura 12). Esta estructura se ha definido
parcialmente en el ratón y en el hombre.
A título de ejemplo, en la figura 13 se
presentan las secuencias genómicas humanas del 3' del intrón 1, del
exón 2, del intrón 2, y del 5' del exón 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza con el ADN del gen
SR-70 humano aplicando la técnica descrita por R.
Slim y col., Hum. Genet. 88, 21-26, 1991. Se
analizan cincuenta mitosis, de las que más del 80% tenían manchas
dobles (spots) localizadas en 1p36 de los dos cromosomas y más en
concreto en 1p36.2-1p36.3 (figura 11). La
identificación del cromosoma 1 y su orientación se basan en la
heterocromatina de constricción secundaria. Las imágenes se han
obtenido en un microscopio Zeiss Axiophot, capturadas con una cámara
CCD enfriada LHESA y tratadas por Optilab.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las células del modo descrito en el
catálogo "Catalogue of cell lines and hibridomas", 7ª edición,
1992, de la ATCC (American Type Culture Collection).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara el ARN del modo descrito en el
ejemplo I.2.a. Se prepara el ADNc de manera similar a la descrita
en el ejemplo I.3 con 5 \mug de ARN total en un volumen final de
20 \mul empleando un cebo poli(T)_{12} y
nucleótidos fríos. La reacción no se interrumpe con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la polimerización con 2 \mul de
ADNc en 50 \mul finales con el tampón de composición siguiente:
Tris HCl 50 mM, de pH 9,2, 16 mM (NH_{4})_{2}SO_{4},
1,75 mM MgCl_{2}, en presencia de DMSO 10%, de NTP 0,4 mM, de 100
ng de cada uno de los dos cebos nucleicos y de 3,5 unidades de la
mezcla de Taq- y PWO-polimerasas (Boehringer
Mannheim, ref. 1681 842).
El par de cebos tiene la composición
siguiente:
| cebo sentido: | AGGCCGGCGTGGGGAAG | (posición 16-32, figura 6) |
| cebo antisentido: | CTTGGCGATCTGGCAGTAG | (posición 503-485, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la reacción durante 30 ciclos de
95ºC/30 segundos, 58ºC/1 minuto y 68ºC/2 minutos 30 segundos y un
último ciclo de 68ºC/10 minutos.
Se somete el producto de la PCR a una
electroforesis a través de un gel de agarosa 1% (tampón TAE).
Después de la tinción con bromuro de etidio se revelan dos bandas
principales: una banda de un tamaño aprox. de 490 pb (tamaño
esperado (ver figura 6)) y una banda suplementaria de un tamaño
aprox. de 700 pb. Se extrae esta última del gel mediante un kit
"geneclean" (Bio 101, ref. 1001 400). Después de la
desalinización en una columna de poliacrilamida P10 (Biorad, ref.
15011050), se somete el fragmento a una nueva amplificación por PCR
que tiene una duración de 10 ciclos, del modo descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se separan los oligonucleótidos
del producto PCR en una columna Sephacryl S400 (Pharmacia,
17-0609-01), después se desaliniza
en una columna P10. Se realiza la reacción de secuenciación con un
kit Applied Biosystems (ref. 401 628) (373 DNA sequencer) con el
cebo antisentido.
La secuencia obtenida es idéntica a la secuencia
del ADNc SR-p70 (ejemplo II.4) con una inserción de
198 pb entre las posiciones 217 y 218 (figura 14). La secuencia
proteica N-terminal derivada (secuencia llamada
SRp70d) es más corta, tiene 49 aminoácidos menos y una divergencia
en los 13 primeros aminoácidos (secuencia ID nº 13). Hay, pues,
co-existencia por lo menos de dos transcritos
diferentes SR-p70, tal como se ha descrito ya para
la línea celular AtT-20 de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la amplificación del modo descrito en
el ejemplo VIII.A a partir de ARN purificado de las células
IMR-32 con el par de cebos de la composición
siguiente:
| cebo sentido: | GCG GCC ACG ACC GTG AC | (posición 160-176, secuencia ID nº 11) |
| cebo antisentido: | GGC AGC TTG GGT CTC TGG | (posición 1993-1976, ver figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el exceso de cebo en una
columna S400 y desalinizar en una columna P10, se somete de nuevo 1
\mul de la muestra a una PCR con el par de cebos de la composición
siguiente:
- cebo sentido:
- TAT \underline{CTC \ GAG} CTG TAC GTC GGT GAC CCC
Xho I (posición 263-280,
secuencia ID nº 11)
\vskip1.000000\baselineskip
- cebo antisentido:
- ATA \underline{TCT \ AGA} TCA GTG GAT CTC GGC CTC
Xba I (posición 1943-1926,
figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desaliniza el producto de la PCR obtenido en
1) en una columna P10, se digiere con las enzimas de restricción
Xho I y Xba I, después se clona en el plásmido pCDNA3 del modo
descrito en el ejemplo II.5. Se secuencian dos clones recombinantes
mediante un kit de Applied Biosystems con los oligonucleótidos
específicos del ADNc del SR-p70.
La primera secuencia obtenida corresponde a la
secuencia completa del ARNm que codifica al SR-p70
descrito en el ejemplo VIII.a. La proteína derivada contiene 587
aminoácidos (secuencia ID nº 13 y figura 16).
La segunda secuencia obtenida es idéntica a la
secuencia del ADNc de SR-p70d descrita antes, pero
con dos deleciones de 149 pb y de 94 pb entre las posiciones 1049 y
1050 por un lado y entre las posiciones 1188 y 1189 por otro lado
(secuencia ID nº 14 y figura 15). La secuencia proteica derivada de
esta segunda secuencia muestra una proteína que tiene una parte
N-terminal más corta, con 49 aminoácidos menos, y
una divergencia en les 13 primeros aminoácidos así como una
divergencia de secuencia proteica entre los aminoácidos 350 y 397
(secuencia ID nº 15 y figura 16) (secuencia llamada
SR-p70e). La proteína derivada contiene 506
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las células del modo descrito en el
"Catalogue of cell lines and hibridomas", 7ª edición, 1992, de
la ATCC (American Type Culture Collection).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan estas etapas del modo descrito en el
ejemplo VIII.A con el par de cebos de la composición siguiente:
| cebo sentido: | AGG GGA CGC AGC GAA ACC | (posición 128-145, figura 17) |
| cebo antisentido: | GGC AGC TTG GGT CTC TGG | (posición 1993-1976, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectúa la secuenciación con el kit de
Applied Biosystem con cebos específicos del ADNc del
SR-p70 y con él se detectan dos ADNc:
- un primer ADNc correspondiente al ARNm que
codifica al SR-p70a
- un segundo ADNc que presenta una deleción de
98 pb entre las posiciones 24 y 25 (secuencia ID nº 16 y figura
15).
Esta deleción abarca al ATG de inicio de
traducción del SR-p70a. La proteína derivada
(llamada SR-p70f) de este segundo ADNc presenta un
ATG iniciador de traducción en posición posterior (downstream),
correspondiente a un ATG interno del SR-p70a. La
proteína derivada contiene, pues, 588 aminoácidos (secuencia ID nº
17 y figura 16) y se le han quitado 48 aminoácidos
N-terminales del SR-p70a.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las células del modo descrito en el
"Catalogue of cell lines and hibridomas", 7ª edición, 1992 de
la ATCC (American Type Culture Collection).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos pasos se realizan del modo descrito en el
ejemplo VIII.C.
Le secuenciación pone de manifiesto dos
ADNc:
Un primer ADNc correspondiente al ARNm que
codifica al SR-p70a y un segundo ADNc que presenta
una deleción de 94 pb entre las posiciones 1516 y 1517 (secuencia
ID nº 18 y figura 15). La proteína derivada (denominada SRp70b)
contiene 199 aminoácidos y presenta una secuencia
C-terminal de la que se han amputado 137 aminoácidos
con respecto al SR-p70a y los 4 últimos aminoácidos
son divergentes (secuencias ID nº 19 y figura 21). Este ADNc es
similar al descrito en el ejemplo I relativo al
SR-p70b del mono.
Las moléculas descritas en este ejemplo (ejemplo
VIII, A, B, C, y D) ponen de manifiesto variantes del
SR-p70, consecuencia de los empalmes diferenciales
del ARNm primario transcritos por el gen SR-p70.
El SR-p70a se codifica con un
ARNm compuesto por 14 exones (véase ejemplo VII). Es la proteína de
referencia.
El SR-p70b es consecuencia de
una inserción entre les exones 3 y 4 y de la ausencia de los exones
11 y 13. El SR-p70f es consecuencia de la ausencia
del exón 2. En este ejemplo se describe la existencia de variantes
del SR-p70 de manera no exhaustiva, con gran
probabilidad de que existan otras variantes. Además, la existencia
de las variantes descritas en este ejemplo y del
SR-p70a no se limita a las líneas celulares, en las
que se detectan. En efecto, los estudios realizados por
RT-PCR han demostrado que estas variantes se
encuentran en las diversas líneas celulares estudiadas.
Por otro lado, la metionina de inicio del
SR-p70f corresponde a una metionina interna del
SR-p70a, lo cual sugiere la posibilidad de inicio en
una posición posterior (downstream) del ARNm que codifica al
SR-p70a.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo celular y las preparaciones de ARN
total y de ADNc se realizan del modo descrito en el ejemplo VIII.1
y 2. La matriz ARN se hidroliza por incubación a 65ºC durante 5
minutos después de añadir 4 \mul de EDTA 500 mM y 4 \mul de
NaOH 2N. A continuación se desaliniza la muestra en una columna P10.
El ADNc se prolonga en 3' con una "cola" de dG del modo
descrito en el ejemplo I.3.d, en un volumen final de 40 \mul.
Después de la adición de 4 \mul de EDTA 500 mM y 4 \mul de NaOH
2N, se incuba el ADNc a 65ºC durante 3 minutos y después se
desaliniza en una columna P10. La amplificación por PCR se realiza
del modo descrito en el ejemplo VIII.3 con 8 \mul de ADNc y
durante 30 ciclos con el par de cebos de la composición
siguiente:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCN | (en el que N es igual a G, A o T) |
| cebo antisentido: | CCATCAGCTCCAGGCTCTC | (posición 1167-1149, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de eliminar el exceso de cebo en una
columna S400 y desalinizar en una columna P10, se somete de nuevo 1
\mul de la muestra a una PCR con el par de la composición
siguiente:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCN | |
| cebo antisentido: | CCAGGACAGGCGCAGATG | (posición 928-911, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se pasa de nuevo la muestra por una columna S400
y una columna P10 se somete a una tercera amplificación de 20 ciclos
con el par siguiente:
| cebo sentido: | CCCCCCCCCCCCCCCN | |
| cebo antisentido: | CTTGGCGATCTGGCAGTAG | (posición 503-485, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la secuenciación del modo descrito en
el ejemplo VIII.4). Esta secuencia muestra un 5' no codificante de
por lo menos 237 bases en posición anterior (upstream) del ATG de
inicio del SR-p70a (figura 17). Por comparación de
esta secuencia (obtenida a partir de la línea
IMR-32) con la obtenida a partir de la línea
HT-29 en especial (figura 6), se ponen de
manifiesto dos diferencias puntuales (figura 17: ver letras en
negrita) (G \rightarrow A y C \rightarrow T), posicionadas
respectivamente a -20 y -30 del ATG de inicio del
SR-p70a (figuras 6 y 17). Esta variabilidad se
sitúa a nivel del exón 2 (figura 13). No se excluye que variabilidad
se pueda encontrar también en el interior de la fase codificadora a
consecuencia de un empalme alternativo, tal como se describe en los
ejemplos III para el ratón y VIII para el hombre o bien como
consecuencia de un inicio de la traducción en un CTG (como se ha
demostrado para el FGFb (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
1836-1840, 1989).
Por otro lado, no se excluye que esta
variabilidad tenga una implicación en la traducción del
SR-p70 o en el empalme del ARN primario.
En este contexto, esta variabilidad,
probablemente de origen alélico, puede servir como marcador, ya sea
a nivel genómico (ver ejemplo XI), ya sea a nivel de ARNm (ver
ejemplo X).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan los cultivos celulares
(SK-N-AS,
SK-N-MC, HT-29,
U-373MG, SW480, IMR-32, CHP212) del
modo descrito en el ejemplo VI.1.a (con arreglo al catálogo
"Catalogue of cell lines and hibridomas", 7ª edición, 1992, de
la ATCC).
La preparación del ADNc y la amplificación por
PCR se realizan del modo descrito en el ejemplo VIII.2 y 3. El par
de cebos empleado tiene la composición siguiente:
| cebo sentido: | AGGGGACGCAGCGAAACC | (posición 128-145, figura 17) |
| cebo antisentido: | GGCAGCTTGGGTCTCTGG | (posición 1993-1976, figura 6). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizan las muestras por electroforesis a
través de un gel de agarosa 1% y se revelan con bromuro de etidio
(figura 18).
El tamaño de la banda obtenida con estas
muestras corresponda al tamaño esperado (aprox. 2 kb, figuras 6 y
17). La intensidad de las bandas obtenidas es reproductible. La
reamplificación de 1 \mul de la muestra en las mismas condiciones
a lo largo de 20 ciclos hace que aparezca una banda en cada una de
las muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de pasar las muestras por las columnas
S400 y P10, se realiza la secuenciación con el secuenciador 373 de
Applied Biosystems con el kit de referencia 401 628. Entre otros se
utilizan los cebos siguientes:
No se ha descubierto ninguna diferencia proteica
del SR-p70a. Sin embargo, las secuencias obtenidas
dejan entrever una doble variabilidad en las posiciones -20 y -30
anteriores (upstream) del ATG de inicio del SR-p70a
(figuras 6 y 17). Esta variabilidad, probablemente de origen
alélico, permite definir dos clases de transcritos: una primera
clase que presenta un G en la posición -30 y un C en la posición -20
(clase G^{-30}/C^{-20}) y una segunda clase que presenta una
diferencia en dos posiciones: un A en -30 y un T en -20 (clase
A^{-30}/T^{-20})
Primera clase:
SK-N-AS,
SK-N-MC, HT-29,
U-373MG, SW480.
Segunda clase: IMR-32,
CHP212.
\vskip1.000000\baselineskip
Este reparto alélico se basa en la variabilidad
alélica puesta de manifiesto en los ejemplos IX y X:
\bullet alelo G^{-30}/C^{-20} que presenta
respectivamente un G y un C en las posiciones -30 y -20
\bullet en posición anterior (upstream) del
ATG de inicio del SR-p70a.
\bullet alelo A^{-30}/T^{-20} que presenta
respectivamente un A y un T en las mismas posiciones. Esta
variabilidad puede detectarse con la utilización de enzimas de
restricción que distingan entre los dos alelos (figura 13). A título
de ejemplo:
\bullet la enzima Bpl I que presenta un sitio
de corte únicamente en el alelo G^{-30}/C^{-20} en la zona de
interés (este sitio abarca las dos posiciones admisibles).
\bullet enzima Styl que presenta un sitio de
corte únicamente en el alelo A^{-30}/T^{-20} en la zona de
interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la reacción de polimerización con 500
ng de ADN genómico purificado, en 50 \mul finales en las
condiciones descritas para el ejemplo VIII.3. El par de cebos tiene
la composición siguiente:
| cebo sentido: | CACCTACTCCAGGGATGC | (posición 1 a 18, figura 13) |
| cebo antisentido: | AGGAAAATAGAAGCGTCAGTC | (posición 833-813, figura 13). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la reacción durante 30 ciclos del
modo descrito en el ejemplo VIII.3.
Después de eliminar el exceso de cebo en una
columna S400 y desalinizar en una columna P10, se amplifica de nuevo
1 \mul de la muestra durante 25 ciclos en las mismas condiciones
con el par de cebos siguiente:
| cebo sentido: | CAGGCCCACTTGCCTGCC | (posición 25-32, figura 13) |
| cebo antisentido: | CTGTCCCCAAGCTGATGAG | (posición 506-488, figura 13). |
\vskip1.000000\baselineskip
Se someten los productos amplificados a una
electroforesis a través de un gel de agarosa 1% (figura
19-A).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desalinizan previamente las muestras en una
columna P10 y después se digieren con la enzima de restricción Styl
(BRL, 15442-015) en un tampón de la composición
siguiente:
Tris-HCl, de pH 8, 50 mM, NaCl
100 mM, MgCl_{2} 10 mM, a 37ºC durante 30 min. Se analizan los
productos de digestión por electroforesis a través de un gel de
agarosa 1% (tampón TAE). Se realiza el revelado por tinción con
bromuro de etidio (figura 19-B).
Una banda de 482 pares de bases caracteriza al
alelo G^{-30}/C^{-20} (figuras 13 y 19). La presencia de una
banda de 378 pares de bases y de una banda de 106 pares de bases
caracteriza al alelo A^{-30}/T^{-20} (alelo que presenta un
sitio de corte Styl). Con el muestreo realizado en 10 personas, 2
personas presentan los alelos G^{-30}/C^{-20} y
A^{-30}/T^{-20}, las 8 personas restantes son homocigotos que
tienen el alelo G^{-30}/C^{-20}. El estudio de un nuevo
muestreo realizado con 9 personas pone de manifiesto que existen 3
personas heterocigotos que presentan los alelos G^{-30}/C^{-20}
y A^{-30}/T^{-20}. Las 6 personas restantes son homocigotos
respecto al alelo G^{-30}/C^{-20}.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión que se emplea se describe
en el ejemplo II.5 y se representa esquemáticamente en la figura
15. El método empleado es el llamado del fosfato cálcico, descrito
por Graham y col. (Virology 54, 2, 536-539, 1973).
Se siembra la línea celular a razón de 5x10^{5} células por
cápsula de 6 cm de diámetro en 5 ml del medio descrito en el
ejemplo I.1. Se cultivan las células a 37ºC y con un 5% de CO_{2}
durante una noche. Se prepara el medio de transfección de la manera
siguiente: se realiza el mezclado siguiente añadiendo aprox. 1 ml
de tampón HEBS (NaCl 8 mg/ml, KCl 370 \mug/ml,
Na_{2}HPO_{4}-2H_{2}O 125 \mug/ml, dextrosa
1 mg/ml, Hepes, de pH 7,05, 5 mg/ml), 10 \mug del plásmido a
transfectar y 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M que se añade por goteo.
Se deja en reposo el medio de transfección a temperatura ambiente
durante 30 min y después se añade por goteo al medio contenido en
la cápsula de cultivo. Se incuban las células a 37ºC/5% de CO_{2}
durante 5-6 horas. Después de aspirar el medio se
añaden 5 ml de medio fresco que contiene un 2% de suero fetal
bovino. Pasadas 48 horas a 37ºC/5% de CO_{2}, se enjuagan las
células con PBS, se disgregan por tripsinización, se diluyen en 10
ml de medio de cultivo (5% suero fetal bovino) y se extienden en una
cápsula de 10 cm de diámetro (la dilución puede ajustarse en
función de la eficacia de la transfección). Después de una nueva
incubación de 10 horas (el tiempo que tardan las células a
adherirse), se someten las células a selección por adición de G418
en la concentración final de 600 \mug/ml de equivalente geneticina
durante 15-21 días (se cambia el medio cada día).
Se enjuagan los clones obtenidos con PBS, se fijan con etanol del
70%, se secan, se tiñen con 1% de violeta cristal, y se cuentan.
Se realizan por duplicado cuatro transfecciones
plasmídicas:
- plásmido pCDNA3 sin inserto
- plásmido pCONA3/SR-p70 que
contiene el ADNc SR-p70a humano
- plásmido pCDNA3/SR-p70 mut que
contiene el ADNc - SR-p70a que presenta una mutación
en la posición 293 AA (R \rightarrow H) que es análoga a la
mutación 273 (R \rightarrow H) del dominio de fijación del ADN de
la p53
- control sin plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se expresa en número de clones por
cápsula.
El número de clones obtenidos por transfección
con el plásmido pCDNA3/SR-p70 es 25 veces menor que
el número de clones obtenidos con el control pCDNA3 y 9 veces
inferior al número de clones obtenidos con el pcDNA3/SRp70 mut, lo
cual indica una mortalidad o un paro de la división celular de las
células transfectadas con el ADNc SR-p70. Este
resultado no es consecuencia de la toxicidad en vista de los clones
obtenidos con el ADNc SR-p70 mutado, sino
probablemente de una apóptosis como se ha demostrado en el caso de
la proteína p53 (Koshland y col., Sciences 262,
1953-1981, 1993).
\vskip1.000000\baselineskip
La homología estructural entre el dominio de
fijación al ADN de la p53 y la región central de la proteína
SR-p70 permite deducir que la SR-p70
es un factor de transcripción (ver figuras 1 y 2). En efecto, la p53
(393 aminoácidos) está formada por varios dominios funcionales. La
región N-terminal (1-91 aminoácidos)
está implicada en la activación de la transcripción y contiene
sitios de interacción con diferentes proteínas celulares y víricas.
La parte central (aminoácidos 92-292) permite la
fijación sobre las secuencias de ADN específicas situadas en
regiones promotoras de ciertos genes (la mayoría de mutaciones
puntuales que inactivan la p53 están localizadas en esta región) y
presenta además numerosos sitios de interacción con proteínas
víricas que inhiben su actividad. En fin, los 100 últimos
aminoácidos de la p53 son los que causan su oligomerización y
además la regulación de esta última (Hainaut, P., Current Opinion in
Oncology 7, 76-82, 1995; Prokocimer, M.,
Blood 84, nº 8, 2391-2411, 1994).
La homología de secuencias entre p53 y
SR-p70 es significativa sobre todo en lo referente a
los aminoácidos implicados directamente en la interacción con el
ADN, lo cual sugiere que la SR-p70 se fija sobre los
sitios p53 del ADN. Estos aminoácidos corresponden exactamente a lo
que se llama "hot spot" (sitio caliente), aminoácidos mutados
con frecuencia en los tumores humanos (SWISS PROT: SW: P53 human y
Prokocimer, M., Blood 84, nº 8. 2391-2411,
1994). De esta homología se puede deducir que la proteína
SR-p70 ejerce un control sobre la actividad de los
genes regulados por la p53, ya sea con independencia de esta, ya sea
formando heterooligómeros con esta última.
En consecuencia, a semejanza de la p53, los
productos del gen SR-p70 deberán estar implicados en
el control y en la regulación del ciclo celular, provocando paros
del ciclo (transitorios o definitivos) y la puesta en marcha de
programas tales como: la reparación del ADN, la diferenciación o la
muerte celular. La existencia de actividades "de tipo p53" ya
se había presentido con fuerza cuando se detectaron en los ratones
p53^{-/-} actividades de reparación del ADN y de muerte celular
como respuesta a las radiaciones ionizantes (Strasser y col., Cell
79, 329-339, 1994). Los autores de la
presente invención han localizado el gen SR-p70
humano en la región telomérica del brazo corto del cromosoma 1,
precisamente en 1p36.2-36.3, la región más pequeña
que sufre deleción (SRD) común en la mayoría de neuroblastomas y de
otros tipos de tumores (melanomas y carcinomas) (White y col., PNAS
92, 5520-5524, 1995). Esta región de pérdida
del carácter heterocigótico (LOH) delimita el lugar de un gen
supresor de tumor, cuya pérdida de actividad sería la causa de la
formación de los tumores. Es importante recordar que esta región
está también sometida a "la huella materna"; el alelo materno
está perdido con preferencia en los neuroblastomas que presentan la
deleción 1p36 (sin amplificación de N-Myc) (Caron y
col., Hum. Mol. Gen. 4, 535-539, 1995). El
gen salvaje SR-p70 introducido y expresado en las
células de neuroblastoma permite invertir su transformación. La
pérdida de esta actividad anti-oncogénica va
asociada por tanto con el desarrollo del tumor. La región 1p38
presenta una homología singénica con el segmento distal del
cromosoma 4 del ratón. En esta región se ha localizado el gen
"curly tail" (ct, cola rizada) (Beier y col., Mammalian Genome
6, 269-272, 1995) al que se atribuyen las
malformaciones congénitas del tubo neural (MTN: spina
bifida, anencefalia, etc.). El ratón ct es el mejor modelo
animal para el estudio de estas malformaciones. Ce acepta que estas
malformaciones resultan de anomalías de la proliferación celular.
Teniendo en cuenta la naturaleza del gen SR-p70 y
de su localización cromosómica, una de las hipótesis es que el
SR-p70 podría ser el homólogo humano del ct y, por
tanto, la detección de las mutaciones precoces y de las anomalías
cromosómicas relativas a esta gen debería permitir, por ejemplo como
aplicación, la identificación de las personas en riesgo (un
0,5-1% de los recién nacidos afectados por MTN) y la
puesta en práctica de tratamientos preventivos (Neumann y col.,
Nature Genetics 6, 357-362, 1994; Di Vinci y
col., Int. J. Cancer 59, 422-426, 1994; Moll
y col., PNAS 92, 4407-4411, 1995; Chen y
col., Development 121, 681-691, 1995).
\vskip1.000000\baselineskip
Los alelos GC y AT se identifican fácilmente por
restricción Styl de los productos de PCR del exón 2 (ver ejemplo
XI). De este modo se puede determinar, pues, en los individuos
heterocigotos GC/AT y portadores de tumores neuroblastomas, el
alelo SR-p70 perdido (GC o AT) y a pesar de la
presencia de tejido contaminante sano.
De modo sorprendente, cuando se aplica el mismo
análisis al ARN, se detecta un solo alelo con independencia de la
presencia o no de una deleción y de modo más sorprendente todavía, a
pesar de la presencia de tejido sano. Esto sugiere que la huella
(expresión diferencial de dos alelos) existiría igualmente en el
tejido contaminante.
Para verificarlo se ha repetido el mismo
análisis en el ARN procedente de células sanguíneas de individuos
sanos heterocigotos GC/AT. En estas células se ha detectado también
uno solo de los dos tipos de transcrito. Este resultado confirma la
observación realizada en las muestras tumorales de la existencia de
una huella genética generalizada del gen SR-p70.
Las implicaciones de este descubrimiento son
importantes porque permiten postular que una sola mutación
esporádica que inactive el alelo activo SR-p70
acarrearía la pérdida de actividad potencialmente en todos los
tejidos.
La falta de datos precisos sobre la función
biológica de la SR-p70 no permite estimar las
consecuencias de esta pérdida de actividad de la
SR-p70 en la célula. Sin embargo, su gran homología
con la proteína supresora de tumores p53, y la demostración de que
la SR-p70 es un factor de transcripción capaz de
utilizar el promotor P21^{wsf} sugieren que esta proteína
desempeña un rol en el control del ciclo celular y en la
diferenciación.
Knudson y Meadows, New Eng. J. Med. 302,
1254-56, 1980, consideran los neuroblastomas
IV-S como un conjunto de células no malignas de la
cresta neural que llevan una mutación que interfiere en su
diferenciación normal.
Cabe imaginar que la pérdida de actividad de la
SR-p70 así como la pérdida del control de p53 sobre
el ciclo celular favorecen la aparición de anomalías celulares,
como son la aneuploidía, la amplificación (descritas en el caso de
los neuroblastomas) y otras modificaciones genéticas que pueden
provocar la transformación celular (Livingstone y col., Cell
71, 923-25, 1992; Yin y col., Cell 72,
937-48, 1992; Cross y col., Science 267,
1353-56, 1995; Fukasawa y col., Science 211,
1744-47, 1996). Los neuroblastomas podrían tener,
pues, su origen en la pérdida de actividad temporal o definitiva de
la SR-p70, que de este modo favorecería la aparición
de sucesos oncogénicos y, después, la progresión tumoral.
En caso de deleción constitucional 1p36 descrita
por Biegel y col. (Am. J. Hum. Genet. 52,
176-82, 1993), se produce la aparición del
neuroblastoma IV-S y el gen afectado es el
NBS-1 (SR-p70).
En conclusión, lo que se ha descrito para los
neuroblastomas se puede aplicar también a otros tipos de tumores,
sobre todo los asociados a modificaciones del extremo del brazo
corto del cromosoma 1 (véase el informe del 2º convenio
internacional sobre el mapeo del cromosoma 1 humano, Cytogenetics
and Cell. Genet. 72, 113-154, 1995). En el
plano terapéutico, la implicación de la SR-p70 en la
aparición de tumores debería conducir a evitar la utilización de
agentes mutagénicos en quimioterapia, habida cuenta de los riesgos
de transformación celular causada por estos productos y, antes que
a ellos, dar preferencia a sustancias no mutagénicas que estimulen
la diferenciación.
Por otro lado, la frecuencia de aparición de los
alelos GC y AT es la siguiente: en la copulación, la frecuencia (AT)
= 0,15 y en una muestra de 25 pacientes (neuroblastomas), F (AT) =
0,30. Estas estadísticas indican que el alelo AT podría ser un
factor de predisposición.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sanofi
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 32-34 rue Marbeuf
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARÍS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75008
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 01 53 77 40 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 01 53 77 41 33
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SR-p70
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE (floppy disk)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2874 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cebus apella
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 156..2066
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 637 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2034 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cebus apella
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 156..1652
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 499 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2156 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 33..1940
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 636 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2040 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mus musculus
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 124..1890
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 589 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 758 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mus musculus
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 389..757
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 559 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1764 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 587 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1521 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 506 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1870 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 104..1867
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 588 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 499 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGAGCTGCC CTCGGAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTTCTGCAG GTGACTCAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATGCCTG TCTACAAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGCTGGT TGACGGAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAACCAGC TGGTGGGCCA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCTCG GCCTCC
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCCGGCGT GGGGAAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGCGATC TGGCAGTAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGCCACGA CCGTGAC
\hfill17
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAGCTTGG GTCTCTGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
(1) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTACGTCG GTGACCCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGTGGATC TCGGCCTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGGACGCA GCGAAACC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCAGCTC CAGGCTCTC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGGACAGG CGCAGATG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGGTGG CTGGCTGGA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTCAGGTT CTGCAGGTG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCTACTCC AGGGATGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAAAATAG AAGCGTCAGT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGCCCACT TGCCTGCC
\hfill18
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTCCCCAA GCTGATGAG
\hfill19
Claims (30)
1. Polipéptido purificado, que contiene una
secuencia de aminoácidos elegida entre:
a) la secuencia SEQ ID nº 2;
b) la secuencia SEQ ID nº 4;
c) la secuencia SEQ ID nº 6;
d) la secuencia SEQ ID nº 8;
e) la secuencia SEQ ID nº 10;
f) la secuencia SEQ ID nº 13;
g) la secuencia SEQ ID nº 15;
h) la secuencia SEQ ID nº 17;
i) la secuencia SEQ ID nº 19.
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene la secuencia de aminoácidos
elegida entre SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17
y SEQ ID nº 19.
3. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene la secuencia comprendida
entre:
- el resto 110 y el resto 310 de la SEQ ID nº 2
ó 6;
- el resto 60 y el resto 260 de la SEQ ID nº
8.
4. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque resulta de un empalme alternativo del
ARN mensajero del gen correspondiente.
5. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por ser un
polipéptido recombinante producido en forma de una proteína de
fusión.
6. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
codifica a un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
7. Secuencia de ácidos nucleicos aislada según
la reivindicación 6, caracterizada porque se elige entre:
a) la secuencia SEQ ID nº 1;
b) la secuencia SEQ ID nº 3;
c) la secuencia SEQ ID nº 5;
d) la secuencia SEQ ID nº 7;
e) la secuencia SEQ ID nº 9;
f) la secuencia SEQ ID nº 11;
g) la secuencia SEQ ID nº 12;
h) la secuencia SEQ ID nº 14;
i) la secuencia SEQ ID nº 16;
j) la secuencia SEQ ID nº 18.
8. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 6, caracterizada por ser una secuencia elegida
entre la SEQ ID nº 5, SEQ ID nº 12, SEQ ID nº 14, SEQ ID nº 16 y SEQ
ID nº 18 que codifican respectivamente al polipéptido de las
secuencias SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 y
SEQ ID nº 19.
\newpage
9. Vector de clonación y/o de expresión que
contiene una secuencia de ácidos nucleicos según una cualquiera de
las reivindicaciones de 6 a 8.
10. Vector según la reivindicación 9,
caracterizado por ser un plásmido pSE1.
11. Célula hospedante transfectada con un vector
según la reivindicación 9 ó 10.
12. Célula hospedante transfectada según la
reivindicación 11, caracterizada por ser de E. coli MC
1061.
13. Sonda o cebo de nucleótidos que contienen la
totalidad de la secuencia del gen que codifica a un los polipéptidos
de la reivindicación 1.
14. Sonda o cebo de nucleótidos elegidos entre
los oligonucleótidos siguientes o sus complementarios:
- SEQ ID nº 20:
- GCG AGC TGC CCT CGG AG
- SEQ ID nº 21:
- GGT TCT GCA GGT GAC TCA G
- SEQ ID nº 22:
- GCC ATG CCT GTC TAC AAG
- SEQ ID nº 23:
- ACC AGC TGG TTG ACG GAG
- SEQ ID nº 24:
- GTC AAC CAG CTG GTG GGC CAG
- SEQ ID nº 25:
- GTG GAT CTC GGC CTC C
- SEQ ID nº 26:
- AGG CCG GCG TGG GGA AG
- SEQ ID nº 27:
- CTT GGC GAT CTG GCA GTA G
- SEQ ID nº 28:
- GCG GCC ACG ACC GTG AC
- SEQ ID nº 29:
- GGC AGC TTG GGT CTC TGG
- SEQ ID nº 30:
- CTG TAC GTC GGT GAC CCC
- SEQ ID nº 31:
- TCA GTG GAT CTC GGC CTC
- SEQ ID nº 32:
- AGG GGA CGC AGC GAA ACC
- SEQ ID nº 33:
- CCA TCA GCT CCA GGC TCT C
- SEQ ID nº 34:
- CCA GGA CAG GCG CAG ATG
- SEQ ID nº 35:
- GAT GAG GTG GCT GGC TGG A
- SEQ ID nº 36:
- TGG TCA GGT TCT GCA GGT G
- SEQ ID nº 37:
- CAC CTA CTC CAG GGA TGC
- SEQ ID nº 38:
- AGG AAA ATA GAA GCG TCA GTC
- SEQ ID nº 39:
- CAG GCC CAC TTG CCT GCC y
- SEQ ID nº 40:
- CTG TCC CCA AGC TGA TGA G.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Utilización de una secuencia según una
cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 8 para la fabricación de
cebos oligonucleótidos para reacciones de secuenciación o de
amplificación específicas según la técnica PCR o cualquier variante
de la misma.
16. Par de cebos nucleótidos,
caracterizado porque contiene los cebos elegidos entre las
secuencias siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
17. Utilización de cebos nucleótidos según una
cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 8 para la
secuenciación.
18. Utilización de una sonda o cebo según una
cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 14, como herramienta de
diagnóstico "in vitro" para la detección, mediante
ensayos de hibridación, de secuencias de ácidos nucleicos que
codifican a un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4, en las muestras biológicas, o para
detectar síntesis aberrantes o anomalías genéticas.
19. Método de diagnóstico "in vitro"
para la detección de síntesis aberrantes o de anomalías genéticas a
nivel de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4,
caracterizado porque consiste en:
- poner en contacto una sonda nucleótida según
una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 14 con una muestra
biológica en condiciones que permitan la formación de un complejo de
hibridación entre dicha sonda y dicha secuencia nucleótida,
eventualmente después de un paso previo de amplificación de dicha
secuencia nucleótida;
- detectar el complejo de hibridación
eventualmente formado;
- eventualmente secuenciar la secuencia
nucleótida que forma el complejo de hibridación con la sonda de la
invención.
20. Utilización de una secuencia de ácidos
nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 8,
para la producción de un polipéptido recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5.
21. Método de producción de una proteína
recombinante SR-p70, caracterizada porque se
cultivan células transfectadas según la reivindicación 10 ú 11 en
condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante
de secuencia SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ
ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19, y
se recupera dicho polipéptido recombinante.
22. Anticuerpos mono- o policlonales o sus
fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados,
caracterizados porque son capaces de reconocer de modo
específico un polipéptido que tiene una secuencia elegida entre la
SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10,
SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 y SEQ ID nº 19.
23. Utilización de los anticuerpos según la
reivindicación 22 para la purificación o la detección de un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 en
una muestra biológica.
24. Procedimiento de diagnóstico "in
vitro" de patologías relacionadas con una expresión o una
acumulación anormal de proteínas SR-p70 que
contienen una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias
SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10,
SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19, sobre todo
con los fenómenos de cancerización, a partir de un extracto
biológico, caracterizado porque se pone en contacto por lo
menos un anticuerpo según la reivindicación 22 con dicho extracto
biológico, en condiciones que permitan la formación eventual de
complejos inmunológicos específicos entre una proteína
SR-p70 y dicho o dichos anticuerpos y porque se
detectan los complejos inmunológicos específicos eventualmente
formados.
25. Kit para el diagnóstico "in
vitro" de una expresión o una acumulación anormal de
proteínas SR-p70 que contienen una secuencia de
aminoácidos elegida entre las secuencias SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4,
SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15,
SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19 en un extracto biológico y/o medir el
grado de expresión de las mismas en dicho extracto, que
contiene:
- por lo menos un anticuerpo según la
reivindicación 22, eventualmente fijado sobre un soporte,
- medios de revelado de la formación de
complejos antígenos/anticuerpos específicos entre una proteína
SR-p70 y dichos anticuerpos y/o medios para
cuantificar estos complejos.
26. Método para el diagnóstico precoz de la
formación de tumores caracterizado porque en una muestra de
suero extraída de un individuo se detectan los
auto-anticuerpos dirigidos contra una proteína
SR-p70 que contiene una secuencia de aminoácidos
elegida entre las secuencias SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6,
SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17
o SEQ ID nº 19, según los pasos que consisten en poner en contacto
una muestra de suero extraída de un individuo con un polipéptido de
la invención, eventualmente fijado sobre un soporte, en condiciones
que permitan la formación de complejos inmunológicos específicos
entre dicho polipéptido y los auto-anticuerpos
eventualmente presentes en la muestra de suero y porque se detectan
los complejos inmunológicos específicos eventualmente formados.
27. Método "in vitro" de
determinación de una variabilidad alélica, de una mutación, de una
deleción, de una inserción, de una pérdida del carácter
heterocigótico o de una anomalía genética del gen que codifica a una
proteína SR-p70 que contiene una secuencia de
aminoácidos elegida entre las secuencias SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4,
SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15,
SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19, caracterizado porque utiliza por
lo menos una secuencia nucleótida según una cualquiera de las
reivindicaciones de 6 a 8.
\newpage
28. Método de determinación de una variabilidad
alélica del gen que codifica a una proteína SR-p70
que contiene una secuencia de aminoácidos elegida entre las
secuencias SEQ ID nº 2, SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, SEQ ID nº 8, SEQ
ID nº 10, SEQ ID nº 13, SEQ ID nº 15, SEQ ID nº 17 o SEQ ID nº 19,
dicha variabilidad alélica está situada a nivel de la posición -30 y
-20 con respecto al ATG de inicio del exón 2 que puede estar
implicada en patologías y está caracterizado porque consta
por lo menos de:
- un paso, en el que se procede a la
amplificación por PCR del exón 2 del gen que codifica a una proteína
SR-p70 que lleva la secuencia diana mediante un par
de cebos oligonucleótidos elegido entre el grupo formado por la SEQ
ID nº 32 y SEQ ID nº 29, SEQ ID nº 37 y SEQ ID nº 38, y SEQ ID nº 39
y SEQ ID nº 40;
- un paso, en el que se procede al tratamiento
de los productos amplificados con una enzima de restricción cuyo
sitio de corte corresponde al alelo investigado;
- un paso, en el que se procede a la detección o
a la dosificación por lo menos de uno de los productos de la
reacción enzimática.
29. Composición farmacéutica que, como principio
activo, contiene un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4.
30. Composición farmacéutica según la
reivindicación anterior, caracterizada porque contiene un
polipéptido según la reivindicación 2.
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